JP2006526998A - 胃癌および転移性胃癌診断キット - Google Patents
胃癌および転移性胃癌診断キット Download PDFInfo
- Publication number
- JP2006526998A JP2006526998A JP2006516902A JP2006516902A JP2006526998A JP 2006526998 A JP2006526998 A JP 2006526998A JP 2006516902 A JP2006516902 A JP 2006516902A JP 2006516902 A JP2006516902 A JP 2006516902A JP 2006526998 A JP2006526998 A JP 2006526998A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gastric cancer
- genes
- expression
- metastatic
- group
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 title claims abstract description 261
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 261
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 261
- 206010063916 Metastatic gastric cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 143
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 title claims abstract description 33
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 384
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 231
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims abstract description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 53
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 48
- -1 PLK Proteins 0.000 claims description 46
- 102100027913 Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Human genes 0.000 claims description 39
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 38
- 102100023972 Keratin, type II cytoskeletal 8 Human genes 0.000 claims description 37
- 102100034911 Pyruvate kinase PKM Human genes 0.000 claims description 36
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 claims description 36
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 36
- 101000658157 Homo sapiens Thymosin beta-4 Proteins 0.000 claims description 35
- 102100035000 Thymosin beta-4 Human genes 0.000 claims description 35
- 101000975496 Homo sapiens Keratin, type II cytoskeletal 8 Proteins 0.000 claims description 33
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 claims description 30
- 101000868273 Homo sapiens CD44 antigen Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 23
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 23
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 claims description 22
- 102100032912 CD44 antigen Human genes 0.000 claims description 21
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 claims description 21
- 102100032510 Heat shock protein HSP 90-beta Human genes 0.000 claims description 20
- 101001016856 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-beta Proteins 0.000 claims description 20
- 102100030943 Glutathione S-transferase P Human genes 0.000 claims description 19
- 101000936262 Homo sapiens ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Proteins 0.000 claims description 19
- 101001003584 Homo sapiens Prelamin-A/C Proteins 0.000 claims description 19
- 102100034671 L-lactate dehydrogenase A chain Human genes 0.000 claims description 19
- 102100026531 Prelamin-A/C Human genes 0.000 claims description 19
- 102100036832 Steroid hormone receptor ERR1 Human genes 0.000 claims description 19
- 102100027573 ATP synthase subunit alpha, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 18
- 102100025579 Calmodulin-2 Human genes 0.000 claims description 18
- 101001082627 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Proteins 0.000 claims description 18
- 101000891848 Homo sapiens Protein FAM3D Proteins 0.000 claims description 18
- 102100040821 Protein FAM3D Human genes 0.000 claims description 18
- 102100037925 Prothymosin alpha Human genes 0.000 claims description 18
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 18
- 102100026926 60S ribosomal protein L4 Human genes 0.000 claims description 17
- 108010016281 ADP-Ribosylation Factor 1 Proteins 0.000 claims description 17
- 102100034341 ADP-ribosylation factor 1 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100023580 Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100020760 Ferritin heavy chain Human genes 0.000 claims description 17
- 102100027421 Heat shock cognate 71 kDa protein Human genes 0.000 claims description 17
- 102100034051 Heat shock protein HSP 90-alpha Human genes 0.000 claims description 17
- 101000984150 Homo sapiens Calmodulin-2 Proteins 0.000 claims description 17
- 101001002987 Homo sapiens Ferritin heavy chain Proteins 0.000 claims description 17
- 101001080568 Homo sapiens Heat shock cognate 71 kDa protein Proteins 0.000 claims description 17
- 101001016865 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha Proteins 0.000 claims description 17
- 101000738322 Homo sapiens Prothymosin alpha Proteins 0.000 claims description 17
- 102100029572 Immunoglobulin kappa constant Human genes 0.000 claims description 17
- 102100028251 Phosphoglycerate kinase 1 Human genes 0.000 claims description 17
- 102100039407 Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, mitochondrial Human genes 0.000 claims description 17
- OKKRPWIIYQTPQF-UHFFFAOYSA-N Trimethylolpropane trimethacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC(CC)(COC(=O)C(C)=C)COC(=O)C(C)=C OKKRPWIIYQTPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 102100028985 Tubulin alpha-1C chain Human genes 0.000 claims description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 17
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 16
- 102100030595 HLA class II histocompatibility antigen gamma chain Human genes 0.000 claims description 16
- 102100039165 Heat shock protein beta-1 Human genes 0.000 claims description 16
- 101001066164 Homo sapiens Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD45 beta Proteins 0.000 claims description 16
- 101000630717 Homo sapiens Surfeit locus protein 4 Proteins 0.000 claims description 16
- 101000838456 Homo sapiens Tubulin alpha-1B chain Proteins 0.000 claims description 16
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 16
- 102100039652 Pepsin A-5 Human genes 0.000 claims description 16
- 102100026355 Surfeit locus protein 4 Human genes 0.000 claims description 16
- 102100028969 Tubulin alpha-1B chain Human genes 0.000 claims description 16
- 229940066716 pepsin a Drugs 0.000 claims description 16
- 102100029009 High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Human genes 0.000 claims description 14
- 101000986380 Homo sapiens High mobility group protein HMG-I/HMG-Y Proteins 0.000 claims description 14
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 14
- 102100031153 Growth arrest and DNA damage-inducible protein GADD45 beta Human genes 0.000 claims description 13
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 11
- 102100032699 Endophilin-B2 Human genes 0.000 claims description 7
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 6
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 4
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 101001060744 Homo sapiens Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase FKBP1A Proteins 0.000 claims 13
- 101001091538 Homo sapiens Pyruvate kinase PKM Proteins 0.000 claims 13
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims 8
- 101001010139 Homo sapiens Glutathione S-transferase P Proteins 0.000 claims 7
- 101001044927 Homo sapiens Insulin-like growth factor-binding protein 3 Proteins 0.000 claims 7
- 101000927793 Homo sapiens Neuroepithelial cell-transforming gene 1 protein Proteins 0.000 claims 7
- 101001124937 Homo sapiens Pre-mRNA-splicing factor 38B Proteins 0.000 claims 7
- 101000631937 Homo sapiens Sodium- and chloride-dependent glycine transporter 2 Proteins 0.000 claims 7
- 101000639975 Homo sapiens Sodium-dependent noradrenaline transporter Proteins 0.000 claims 7
- 101000851700 Homo sapiens Steroid hormone receptor ERR1 Proteins 0.000 claims 7
- 102100022708 Insulin-like growth factor-binding protein 3 Human genes 0.000 claims 7
- 102100029436 Pre-mRNA-splicing factor 38B Human genes 0.000 claims 7
- 102100031936 Anterior gradient protein 2 homolog Human genes 0.000 claims 6
- 101150096895 HSPB1 gene Proteins 0.000 claims 6
- 101000691203 Homo sapiens 60S ribosomal protein L4 Proteins 0.000 claims 6
- 101000775021 Homo sapiens Anterior gradient protein 2 homolog Proteins 0.000 claims 6
- 101000905743 Homo sapiens Cyclic AMP-dependent transcription factor ATF-4 Proteins 0.000 claims 6
- 101000654627 Homo sapiens Endophilin-B2 Proteins 0.000 claims 6
- 101001078626 Homo sapiens Heat shock protein HSP 90-alpha A2 Proteins 0.000 claims 6
- 101000840257 Homo sapiens Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 claims 6
- 101001090713 Homo sapiens L-lactate dehydrogenase A chain Proteins 0.000 claims 6
- 101000579123 Homo sapiens Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 claims 6
- 101000609335 Homo sapiens Pyrroline-5-carboxylate reductase 1, mitochondrial Proteins 0.000 claims 6
- 101000838350 Homo sapiens Tubulin alpha-1C chain Proteins 0.000 claims 6
- KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N PGK1 Chemical compound CCCCC[C@H](O)\C=C\[C@@H]1[C@@H](CCCCCCC(O)=O)C(=O)CC1=O KJWZYMMLVHIVSU-IYCNHOCDSA-N 0.000 claims 6
- 230000005945 translocation Effects 0.000 claims 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 78
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 77
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 abstract description 30
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 abstract description 29
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 abstract description 12
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 90
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 84
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 41
- 239000000439 tumor marker Substances 0.000 description 30
- 108010006877 Tacrolimus Binding Protein 1A Proteins 0.000 description 26
- 101710152724 Pyruvate kinase PKM Proteins 0.000 description 24
- 239000000047 product Substances 0.000 description 23
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 102100027314 Beta-2-microglobulin Human genes 0.000 description 15
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 14
- 108091060211 Expressed sequence tag Proteins 0.000 description 13
- 101710112368 Glutathione S-transferase P 1 Proteins 0.000 description 13
- 108010088350 Lactate Dehydrogenase 5 Proteins 0.000 description 13
- 101710139965 Immunoglobulin kappa constant Proteins 0.000 description 12
- 102000004374 Insulin-like growth factor binding protein 3 Human genes 0.000 description 12
- 108090000965 Insulin-like growth factor binding protein 3 Proteins 0.000 description 12
- 101710106373 Tubulin alpha-1C chain Proteins 0.000 description 12
- 101710179754 Tubulin alpha-6 chain Proteins 0.000 description 12
- 108091008559 estrogen-related receptor alpha Proteins 0.000 description 12
- 108010085376 Activating Transcription Factor 4 Proteins 0.000 description 11
- 101710139464 Phosphoglycerate kinase 1 Proteins 0.000 description 11
- 101710142338 Pyrroline-5-carboxylate reductase 1 Proteins 0.000 description 11
- 108090000893 ribosomal protein L4 Proteins 0.000 description 11
- 101000582926 Dictyostelium discoideum Probable serine/threonine-protein kinase PLK Proteins 0.000 description 10
- 101001036709 Homo sapiens Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 10
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 9
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 9
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 5
- 108010070511 Keratin-8 Proteins 0.000 description 5
- 102000048850 Neoplasm Genes Human genes 0.000 description 5
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 5
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 4
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 4
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 4
- 231100000315 carcinogenic Toxicity 0.000 description 4
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 4
- 101150076800 B2M gene Proteins 0.000 description 3
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 3
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 3
- 102000008817 Trefoil Factor-1 Human genes 0.000 description 3
- 108010088412 Trefoil Factor-1 Proteins 0.000 description 3
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 2
- 241000593245 Bionia Species 0.000 description 2
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000000905 Cadherin Human genes 0.000 description 2
- 108050007957 Cadherin Proteins 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102100030801 Elongation factor 1-alpha 1 Human genes 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010061967 Gastric cancer stage IV Diseases 0.000 description 2
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 2
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 2
- 101000920078 Homo sapiens Elongation factor 1-alpha 1 Proteins 0.000 description 2
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 2
- 102000014429 Insulin-like growth factor Human genes 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108010049358 Oncogene Protein p65(gag-jun) Proteins 0.000 description 2
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 2
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 2
- 108700020978 Proto-Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 102000052575 Proto-Oncogene Human genes 0.000 description 2
- CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N SYBR Green I Chemical compound CN(C)CCCN(CCC)C1=CC(C=C2N(C3=CC=CC=C3S2)C)=C2C=CC=CC2=[N+]1C1=CC=CC=C1 CGNLCCVKSWNSDG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100331535 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) DIB1 gene Proteins 0.000 description 2
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 108010088411 Trefoil Factor-2 Proteins 0.000 description 2
- 102000008816 Trefoil Factor-2 Human genes 0.000 description 2
- 102000007641 Trefoil Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010007389 Trefoil Factors Proteins 0.000 description 2
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000003436 cytoskeletal effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 2
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 2
- 230000034659 glycolysis Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 2
- 208000037819 metastatic cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000011575 metastatic malignant neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 230000011278 mitosis Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000045222 parkin Human genes 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000008844 regulatory mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 108091027075 5S-rRNA precursor Proteins 0.000 description 1
- 102100021546 60S ribosomal protein L10 Human genes 0.000 description 1
- 108091006112 ATPases Proteins 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 102000057290 Adenosine Triphosphatases Human genes 0.000 description 1
- 102000005369 Aldehyde Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108020002663 Aldehyde Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 102000003730 Alpha-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108090000020 Alpha-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102000015735 Beta-catenin Human genes 0.000 description 1
- 108060000903 Beta-catenin Proteins 0.000 description 1
- 102100037904 CD9 antigen Human genes 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710164734 Calmodulin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100033029 Carbonic anhydrase-related protein 11 Human genes 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000016362 Catenins Human genes 0.000 description 1
- 108010067316 Catenins Proteins 0.000 description 1
- 101710121755 Cell death protein 3 Proteins 0.000 description 1
- 241000195649 Chlorella <Chlorellales> Species 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 235000004035 Cryptotaenia japonica Nutrition 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 101710197290 Endophilin-B2 Proteins 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 102000030782 GTP binding Human genes 0.000 description 1
- 108091000058 GTP-Binding Proteins 0.000 description 1
- 206010017764 Gastric cancer stage II Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 101710100504 Heat shock protein beta-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000018802 High Mobility Group Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101710176246 High mobility group protein Proteins 0.000 description 1
- 101001108634 Homo sapiens 60S ribosomal protein L10 Proteins 0.000 description 1
- 101001117935 Homo sapiens 60S ribosomal protein L15 Proteins 0.000 description 1
- 101000738354 Homo sapiens CD9 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000867841 Homo sapiens Carbonic anhydrase-related protein 11 Proteins 0.000 description 1
- 101001075218 Homo sapiens Gastrokine-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000667595 Homo sapiens Ribonuclease pancreatic Proteins 0.000 description 1
- 101000826387 Homo sapiens Signal transducer and activator of transcription 6 Proteins 0.000 description 1
- 108091008585 IP3 receptors Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102000007640 Inositol 1,4,5-Trisphosphate Receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000010789 Interleukin-2 Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010038453 Interleukin-2 Receptors Proteins 0.000 description 1
- 102100040445 Keratin, type I cytoskeletal 14 Human genes 0.000 description 1
- 102100023974 Keratin, type II cytoskeletal 7 Human genes 0.000 description 1
- 108010066321 Keratin-14 Proteins 0.000 description 1
- 108010070507 Keratin-7 Proteins 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 1
- 206010064912 Malignant transformation Diseases 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 description 1
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 description 1
- 101150115539 Net1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000009004 PCR Kit Methods 0.000 description 1
- 101000708315 Paracoccus denitrificans Uncharacterized 26.9 kDa protein in nqo8 5'region Proteins 0.000 description 1
- 101001037768 Plasmodium berghei 58 kDa phosphoprotein Proteins 0.000 description 1
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 102100028588 Protein ZNRD2 Human genes 0.000 description 1
- 102000009609 Pyrophosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108010009413 Pyrophosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 101710086015 RNA ligase Proteins 0.000 description 1
- 239000012979 RPMI medium Substances 0.000 description 1
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 1
- 101710100968 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000845641 Rhodospirillum rubrum Uncharacterized transcriptional regulator in ATPase CF(0) region Proteins 0.000 description 1
- 102100039832 Ribonuclease pancreatic Human genes 0.000 description 1
- 102000001424 Ryanodine receptors Human genes 0.000 description 1
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 1
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 1
- 102100023980 Signal transducer and activator of transcription 6 Human genes 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 101000591220 Synechococcus sp. (strain PCC 6716) Mini-ribonuclease 3 Proteins 0.000 description 1
- 101150042818 TUBA6 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 description 1
- 108050008367 Transmembrane emp24 domain-containing protein 7 Proteins 0.000 description 1
- 235000015724 Trifolium pratense Nutrition 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 108700025716 Tumor Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 102000044209 Tumor Suppressor Genes Human genes 0.000 description 1
- 241000269368 Xenopus laevis Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 108010013985 adhesion receptor Proteins 0.000 description 1
- 102000019997 adhesion receptor Human genes 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 201000004444 benign mesenchymoma Diseases 0.000 description 1
- 102000015736 beta 2-Microglobulin Human genes 0.000 description 1
- 108010081355 beta 2-Microglobulin Proteins 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000028956 calcium-mediated signaling Effects 0.000 description 1
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 1
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004709 cell invasion Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000032459 dedifferentiation Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 108700020302 erbB-2 Genes Proteins 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 201000010536 head and neck cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014829 head and neck neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000005787 hematologic cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000024200 hematopoietic and lymphoid system neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000031146 intracellular signal transduction Effects 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 108010025821 lamin C Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 230000036212 malign transformation Effects 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 102000006240 membrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020004084 membrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000009456 molecular mechanism Effects 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 210000000461 neuroepithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000633 nuclear envelope Anatomy 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 201000008968 osteosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 108010014750 prothymosin alpha Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000034394 regulation of mitosis Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091052345 ryanodine receptor (TC 1.A.3.1) family Proteins 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 210000001908 sarcoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000009962 secretion pathway Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000007727 signaling mechanism Effects 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 239000013076 target substance Substances 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 108091006106 transcriptional activators Proteins 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000005760 tumorsuppression Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/136—Screening for pharmacological compounds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/158—Expression markers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
【課題】 胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた胃癌診断方法および診断キット、並びに転移性胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた転移性胃癌診断方法および診断キットを提供する。
【解決手段】 本発明は、胃癌および転移性胃癌診断キットに関し、さらに詳しくは、胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する胃癌診断キットと、転移性胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して癌転移を通じての癌の悪性診断に非常に有効に使用できるように開発された転移性胃癌診断キットに関する。
【解決手段】 本発明は、胃癌および転移性胃癌診断キットに関し、さらに詳しくは、胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する胃癌診断キットと、転移性胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して癌転移を通じての癌の悪性診断に非常に有効に使用できるように開発された転移性胃癌診断キットに関する。
Description
本発明は、胃癌および転移性胃癌診断キットに関し、さらに詳しくは、胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する胃癌診断キットと、転移性胃癌に対する高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現程度を測定して癌転移を通じての癌の悪性診断に非常に有効に使用できるように開発された転移性胃癌診断キットに関する。
胃癌は、韓国および日本などのアジアにおいて最も頻繁に発生する癌であって、死亡率１位を占める癌である［Parkinら、Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugutら、Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996］。しかし、現在まで胃癌関連遺伝子についてはさほど多くの報告がされていない。既存の研究によれば、癌の発生および癌の転移（metastasis）は、いくつかの特定遺伝子の役割によって行われるのではなく、癌の悪性化が進行するにつれて発生する細胞中の様々な信号伝達と調節機構に関与する多くの遺伝子の複合的な相互作用によるものであることが分かる［Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001］。したがって、いくつかの特定な遺伝子に重点を置いて胃癌発生機構および胃癌転移機構を研究するよりは、正常の胃組織と胃癌細胞株／胃癌組織との間または原発癌性胃癌と転移性胃癌細胞株との間の多量の遺伝子発現程度を比較分析して胃癌発生および胃癌転移に係わる新しい遺伝子を発見する研究は非常に重要な意味があるであろう。このように癌の発生および癌の転移は様々な遺伝子とこれらの遺伝子の発現および調節機構が複合的に係わって進行され、現在まで胃癌機構および胃癌転移機構については明確に明らかにされていない。
胃癌は、韓国および日本などのアジアにおいて最も頻繁に発生する癌であって、死亡率１位を占める癌である［Parkinら、Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugutら、Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996］。しかし、現在まで胃癌関連遺伝子についてはさほど多くの報告がされていない。既存の研究によれば、癌の発生および癌の転移（metastasis）は、いくつかの特定遺伝子の役割によって行われるのではなく、癌の悪性化が進行するにつれて発生する細胞中の様々な信号伝達と調節機構に関与する多くの遺伝子の複合的な相互作用によるものであることが分かる［Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001］。したがって、いくつかの特定な遺伝子に重点を置いて胃癌発生機構および胃癌転移機構を研究するよりは、正常の胃組織と胃癌細胞株／胃癌組織との間または原発癌性胃癌と転移性胃癌細胞株との間の多量の遺伝子発現程度を比較分析して胃癌発生および胃癌転移に係わる新しい遺伝子を発見する研究は非常に重要な意味があるであろう。このように癌の発生および癌の転移は様々な遺伝子とこれらの遺伝子の発現および調節機構が複合的に係わって進行され、現在まで胃癌機構および胃癌転移機構については明確に明らかにされていない。
最近の分子生物学的分析方法によれば、ｐ５３［Ｙｏｋｏｚａｋｉら、Ｉｎｔ． Ｒｅｖ． Ｃｙｔｏｌ． ２０４: 49-95, 2001］、β−カテニン［Parkら、Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999］、Ｅ−カドヘリン［Ｂｅｒｘら、Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998］、トレフォイル（三つ葉状）因子１（trefoil factor 1）［Parkら、Gastroenterology 119: 691-698, 2000］、ｃ−ｍｅｔ［李ら、Oncogene 19: 4947-4953, 2000］のような遺伝子の遺伝的変異が胃癌において多発すると報告されている。そして、ＣＡ１１［Yoshikawaら、Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000; Shiozakiら、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001］と胃腸粘膜で合成されるトレフォイル因子であるＴＦＦ１とＴＦＦ２［Shiozakiら、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001; KirikoshiとKatohKirikoshi、Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002］のような遺伝子が胃癌で低発現されると報告されている。また、Hasegawaらは、消火器癌で発現される２３，０４０個の遺伝子からなるｃＤＮＡマイクロアレイーを用いてＲＰＬ１０，ＨＳＰＣＢ，ＬＯＣ５６２８７，ＩＧＨＭ，ＰＧＣ，ＲＥＧＩＡ，ＲＮＡＳＥ１，ＴＦＦ１，ＴＦＦ２遺伝子の発現が胃癌の転移に関与すると報告している［Hasegawaら、Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002］。しかし、このような遺伝子のみで胃癌を診断するのにはまだ不十分である。
なお、実際の癌患者のうち、約９０％程度の患者は原発癌（primary tumor）状態で死亡するよりも転移癌に悪化した後死亡に至っている。しかし、胃漿膜まで浸潤が起こった転移性胃癌の診断に関する研究はまだ不十分である［Yamazakiら、Cancer 63: 613-617, 1989; Shimadaら、Cancer 1: 1657-1668, 1999］。近来、原発癌性胃癌から転移されて悪性腫瘍に進行する一連の過程に関与する遺伝子を発見するため、多量の遺伝子を含むｃＤＮＡマイクロアレイーや遺伝子チップを用いて転移に係わる遺伝子の発現率を比較し、これから胃癌転移の新しい診断や治療のマーカーを発見するための研究が行われている［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002; Wangら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002］。既存の報告によれば、癌細胞の移動（migration）、浸潤（invasion）、そして転移（metastasis）に重要な役割を果す付着レセプター（adhesion receptor）であるＥ−カドヘリン（cadherin）レセプターとα−カテニン（catenin）タンパク質の減少が胃癌の脱分化とリンパ節転移に関与するという報告があり［Streitら、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996］、ＣＤ４４レセプターの様々な変異体のうちＣＤ４４−６ｖ変異体の過発現は胃癌細胞がリンパ節へ転移されるのに重要な役割を果すと報告されている［Streitら、Recent Results Cancer Res. 142: 19-50, 1996］。細胞の成長因子として知られているＥＧＦ（epidermal growth factor）とＥＧＦ−レセプター（ＥＧＦＲ）、そしてｃ−ｅｒｂＢ−２の過発現は、胃癌組織において病理学的に胃癌細胞の胃壁浸潤とリンパ節転移に関与すると報告されている［Tokunagaら、Cancer 75: 1418-1425, 1995］。また、Sakakuraらは、２１，１６８個の遺伝子からなる高密度のｃＤＮＡマイクロアレイーを用いて原発癌性胃癌細胞と転移がなされた複数の細胞に由来する細胞株との間の発現形態を比較、分析した後、ＣＤ４４、ケラチン７、ケラチン８、ケラチン１４、アルデヒドデヒドロゲナーゼ（aldehyde dehydrogenase）、ＣＤ９、ＩＰ３レセプタータイプ３、ＩＬ−２レセプター、ＩＬ−４ Ｓｔａｔ、ｐ２７、そしてインテグリン４遺伝子の発現が胃癌転移に関与すると報告している［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。しかし、既存の研究の大部分は単一遺伝子或いはいくつかの転移に係わる遺伝子の機能のみを研究したものであり、近来、癌の転移過程に係わる細胞内信号伝達（signal transduction）、アポトーシス（apoptosis）、細胞付着（cell adhesion）などに関与する数多くの遺伝子の比較、分析が行われている［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002；Wangら、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002；Weissら、Oncogene 22: 1872-1879, 2003］。したがって、正確な遺伝子を用いた診断にはさらに多くの新しい遺伝子の検索と確認が行われなければならない。
本発明で用いた胃癌細胞株は、Ｐａｒｋらが製造した１１種の細胞株（ＳＮＵ−１，ＳＮＵ−５，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−２１６，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−５２０，ＳＮＵ−６０１，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６６８，ＳＮＵ−７１９）と、韓国生命工学研究院で製造した１種（ＫＭＳ５）の細胞株である。これらのうち、原発癌性胃癌（primary gastric cancer）から作製した細胞株はＳＮＵ−１，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−７１９，ＳＮＵ−５２０細胞株であり、胃癌が悪性化された後の複数の細胞から作製した転移性胃癌細胞株はＳＮＵ−５，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−６０１，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６６８の細胞株である［Parkら、Cancer Res. 50: 2773-2780, 1990; Parkら、Int. J. Cancer 70: 443-449, 1997］。また、本発明で用いた胃癌臨床組織は、忠南大学（韓国）の医学部が提供した総３０個の胃組織（４個の正常の胃組織、１個の胃癌組織、４対の胃の正常／癌組織、１０個の原発性胃癌組織、７個の転移性胃癌組織）である。現在までＳＮＵ細胞株を用いてＳＮＵ細胞株間の特異的な発現を示す遺伝子に関しては多くの研究が行われている実情である。たとえば、ＳＮＵ−１６細胞ではｃ−ｍｅｔ発癌遺伝子の発現が増加され、ＳＮＵ−１，ＳＮＵ−５、そしてＳＮＵ−１６細胞ではＴＧＦ−型ＩＩレセプター、ＣＥＡ、ＣＡ１９−９およびｃ−ｅｒｂＢ ２遺伝子が過発現されると報告されている［Haraら、Lab. Invest. 78: 1143-1153, 1998; Parkら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8772-8776, 1994；Baeら、J Korean Med. Sci. 8: 153-159, 1993］。しかし、これらの細胞株において同一に遺伝子発現の変化を示す遺伝子についてはまだ糾明されていない。したがって、胃癌細胞株と正常の胃組織において類似する発現変化を示す胃癌関連遺伝子の発見、または種々の種類の原発癌性胃癌細胞株と悪性化された転移性胃癌細胞株において類似する発現変化を示す転移性胃癌関連遺伝子を選定して胃癌または転移性胃癌マーカーとしての可能性を確認した。
ヒトゲノムプロジェクトの研究分野の一つとして行われてきた「ＥＳＴ(expressed sequence tag) 収集」は、特定の組織や細胞株でｃＤＮＡライブラリーを製造し、これらから任意的に選別したｃＤＮＡクローンの塩基配列を分析することによって特定の組織や細胞株で発現される遺伝子を収集するプロジェクトである。このようなＥＳＴ収集方法を通じて新しい遺伝子の発見[Adamsら、Science 252: 1651-1656, 1991;Adamsら、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillierら、Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marraら、Nat. Genet. 21:191-194,1999］、特定の組織や細胞株で発現される遺伝子の発現パターンの分析、遺伝子の量的分析［Okuboら、Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adamsら、Science 252: 1651-1656, 1991; Adamsら、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liewら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Maoら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryoら、Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterkyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998］が可能であると報告されている。したがって、特定の細胞中で特定の遺伝子の発現頻度を分析することによって胃癌に係わる遺伝子の発見が可能であり、これを通じて胃癌進行による分子的メカニズムを理解でき、さらに胃癌の診断が可能となるであろう。
本発明では、24種の胃癌高発現遺伝子と６種の胃癌低発現遺伝子が発見され、これらは胃癌との関連性が全く報告されていないものであって、現在これらの遺伝子について知られている内容は次の通りである。
ＴＵＢＡ６（tubulin-alpha 6 chain）は微小管の重要要素であり、ＦＫＢＰ１Ａ（FK506 binding protein 1A）は骨格筋筋小胞体のカルシウム分泌経路の構成要素であって、リアノジン（ryanodine）レセプター同形−１（isoform-1）の調節機能を有する。ＲＰＬ４（ribosomal protein L4)はまだ正確な機能が明らかにされておらず、ＡＲＦ１（ADP-ribosylation factor 1)はＧＴＰ−結合タンパク質であって、クロレラトキシン触媒サブユニットのヘテロトロピックなアロステリック(allosteric)活性酵素として作用する。ＦＴＨ１（ferritin, heavy polypeptide 1）は鉄分を貯蔵する細胞内の分子物質であり、ＳＨ３ＧＬＢ２（SH3-domain GRB2-like endophilin B2）はリング３タンパク質と類似し、ＨＳＰＣＡ（heat shock 90kDa protein 1, alpha）はＡＴＰａｓｅの活性を有する。ＴＭＳＢ４Ｘ（thymosin, beta 4, X chromosome）は細胞骨格の構成に重要な役割を果たし、ＰＹＣＲ１（pyrroline-5-carboxylate reductase 1）は触媒の活性に関与するもので、前立腺癌と関わりがあると報告されている［Ernstら、Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002］。ＡＴＦ４（activating transcription factor 4）はｔａｘ反応増幅子要素（enhancer element）であり、ＳＵＲＦ４（surfeit 4）は膜タンパク質である。ＡＣＴＢ（actin, beta）、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、ＫＲＴ８（keratin 8）は細胞構造形成に関与し、ＬＤＨＡ（lactate dehydrogenase A）、ＧＡＰＤ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ＰＫＭ２（pyruvate kinase, muscle）、ＰＧＫ１（phosphoglycerate kinase 1）は糖分解経路、ＨＭＧＩＹ（high mobility group AT-hook 1）、ＪＵＮ（v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)）、ＣＤ４４（CD44 antigen (homing function and Indian blood group system）は信号伝達経路、ＨＳＰＡ８（heat shock 70kDa protein 8）、ＨＳＰＣＢ（heat shock 90kDa protein 1, beta）、ＨＳＰＢ１（heat shock 27kDa protein 1）は熱衝撃関連タンパク質、ＥＥＦ１Ａ１（eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1）は真核タンパク質合成の補助因子として知られている。 一方、正常の胃組織で多く発現される遺伝子であるＣＤ７４（invariant polypeptide of major histocompatibility complex）、ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＡＧＲ２（anterior gradient 2 homolog, Xenopus laevis）、ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）、 およびＩＧＫＣ（immunoglobulin kappa constant）についてはあまり知られていない。
ＴＵＢＡ６（tubulin-alpha 6 chain）は微小管の重要要素であり、ＦＫＢＰ１Ａ（FK506 binding protein 1A）は骨格筋筋小胞体のカルシウム分泌経路の構成要素であって、リアノジン（ryanodine）レセプター同形−１（isoform-1）の調節機能を有する。ＲＰＬ４（ribosomal protein L4)はまだ正確な機能が明らかにされておらず、ＡＲＦ１（ADP-ribosylation factor 1)はＧＴＰ−結合タンパク質であって、クロレラトキシン触媒サブユニットのヘテロトロピックなアロステリック(allosteric)活性酵素として作用する。ＦＴＨ１（ferritin, heavy polypeptide 1）は鉄分を貯蔵する細胞内の分子物質であり、ＳＨ３ＧＬＢ２（SH3-domain GRB2-like endophilin B2）はリング３タンパク質と類似し、ＨＳＰＣＡ（heat shock 90kDa protein 1, alpha）はＡＴＰａｓｅの活性を有する。ＴＭＳＢ４Ｘ（thymosin, beta 4, X chromosome）は細胞骨格の構成に重要な役割を果たし、ＰＹＣＲ１（pyrroline-5-carboxylate reductase 1）は触媒の活性に関与するもので、前立腺癌と関わりがあると報告されている［Ernstら、Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002］。ＡＴＦ４（activating transcription factor 4）はｔａｘ反応増幅子要素（enhancer element）であり、ＳＵＲＦ４（surfeit 4）は膜タンパク質である。ＡＣＴＢ（actin, beta）、Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１、ＫＲＴ８（keratin 8）は細胞構造形成に関与し、ＬＤＨＡ（lactate dehydrogenase A）、ＧＡＰＤ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）、ＰＫＭ２（pyruvate kinase, muscle）、ＰＧＫ１（phosphoglycerate kinase 1）は糖分解経路、ＨＭＧＩＹ（high mobility group AT-hook 1）、ＪＵＮ（v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)）、ＣＤ４４（CD44 antigen (homing function and Indian blood group system）は信号伝達経路、ＨＳＰＡ８（heat shock 70kDa protein 8）、ＨＳＰＣＢ（heat shock 90kDa protein 1, beta）、ＨＳＰＢ１（heat shock 27kDa protein 1）は熱衝撃関連タンパク質、ＥＥＦ１Ａ１（eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1）は真核タンパク質合成の補助因子として知られている。 一方、正常の胃組織で多く発現される遺伝子であるＣＤ７４（invariant polypeptide of major histocompatibility complex）、ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＡＧＲ２（anterior gradient 2 homolog, Xenopus laevis）、ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）、 およびＩＧＫＣ（immunoglobulin kappa constant）についてはあまり知られていない。
さらに、本発明では、９種の転移性胃癌高発現遺伝子と９種の転移性胃癌低発現遺伝子が発見され、これらのうちＣＤ４４の過発現は既に胃癌細胞のリンパ節転移と悪性化に重要な役割を果すと知られている［Streitら、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996; Jooら、Anticancer Res. 23: 1581-1588, 2003］。反面、細胞付着物質であって、細胞の浸潤と関わりがあると知られているケラチン８は、本発明の結果では発現が減少する遺伝子として糾明されたが、Sakakuraらは発現が増加する遺伝子として分類した［Sakakuraら、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。これは、本発明で用いた原発癌性胃癌細胞株の種類が多様であるため異なる結果を示すこともあるが、実際Sakakuraらの研究結果のように、本発明の実験においても原発癌性胃癌細胞株よりもＳＮＵ−１６細胞株でケラチン８遺伝子の発現が高く現れていることを示している。それ以外の遺伝子は胃癌の転移との関連性が報告されていないもので、現在これらの遺伝子について知られている内容は次の通りである。
まず、転移性胃癌細胞株で発現が増加する遺伝子のうち、ＧＡＤＤ４５ｂ（growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45beta）は細胞死滅の際に過発現される信号伝達物質であって、最近肝癌細胞株で正常な肝細胞に比べてＧＡＤＤ４５ｂ遺伝子の発現が著しく低いことが報告され、既存に報告されていない癌抑制との関連性を示唆している［Abdollahiら、Oncogene 6: 165-167, 1991; Qiuら、Am. J. Pathol. 162:1961-1974, 2003］。ＪＵＮ（v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)）は原癌遺伝子（proto-oncogene）中の一つで、細胞内信号伝達物質であり、ＡＰ−１という転写活性因子を調節して細胞増殖に関与する［Shaulianら、Nat. Cell. Biol. 4: E131-136, 2002］。この遺伝子の発現は種々の種類の癌細胞において増加されており、特に乳房癌、卵巣癌、血液癌、骨肉腫などの悪性腫瘍に関わりがあると報告されている［Selvamuruganら、Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 218-223, 2000; Volmら、Clin. Exp. Metastasis 14: 209-214, 1996; Rossiら、Int. J. Cancer 57: 86-89, 1994; Honokiら、Mol. Carcinog. 7: 111-115, 1993］。しかし、胃癌転移機構と関連性があるという報告はまだされていない。ＨＭＧＩＹ（high mobility group protein isoforms I and Y）はＤＮＡ結合転写調節因子であって、良性間葉系腫瘍においてこの遺伝子が位置する染色体６ｐ２１．３地域の非正常（abnomality）が報告されている［Kazmierczakら、Genes Chromosomes Cancer 23: 279-285, 1998］。
しかし、これまでＨＭＧＩＹ遺伝子の発現が他の腫瘍や腫瘍の悪性化に関連するという報告はされていない。ＧＳＴＰ１（Glutathione S-transferase P1）は種々の種類の発癌性（carcinogen）の解毒（detoxification）に関与するＧＳＴ（Glutathione S-transferase）酵素中の一つで、肺癌、胃癌、乳房癌などの種々の癌において発現量が増加する酵素として知られており、特にこの遺伝子のメチル化（methylation）が胃癌の癌化機構と密接な関わりがあるということが最近報告されている［Howieら、Carcinogenesis 11: 451-458, 1990; Kangら、Lab. Investigation 83: 635-641, 2003］。ＬＭＮＡ（Lamin A/C）遺伝子は核膜タンパク質の一つで、癌化機構における機能はほとんど明らかにされていない［Wydnerら、Genomics 32: 474-478, 1996］。ＥＳＲＲＡ（Estrogen-related receptor alpha）遺伝子はヒトの生殖と骨形成に重要なホルモンであるエストロゲンの膜レセプターであって、エストロゲン信号伝達機構に必ず必要なタンパク質でる［Giguere, Trends Endocrinol. Metab. 13: 220-225, 2002］。そして、最近は悪性化された乳房癌患者の治療ターゲット物質としてＥＳＲＲＡの可能性を報告した研究もある［Ariaziら、Cancer Res. 62: 6510-6518, 2002］。ＰＬＫ（Polo-like kinase）はセリン−トレオニンリン酸化酵素であって、有糸分裂（mitosis）の正確な調節に必要な酵素であり、ヒトの肺癌、頭および首癌、そして大腸癌においてこの遺伝子およびタンパク質の発現が増加すると報告されている［Wolfら、Oncogene 14: 543-549, 1997; Knechtら、Cancer Res. 59: 2794-2797, 1999; Takahashiら、Cancer Sci. 94: 148-152, 2003］。ＩＧＦＢＰ３（insulin-like growth factor binding protein 3）は有糸分裂と細胞の死滅を調節するＩＧＦ（Insulin-like growth factor）信号伝達システムにおいて重要なタンパク質であり、種々の癌患者の血清中にＩＧＦＢＰ３タンパク質の増加は実際癌の進行を診断するのに重要なタンパク質である［Dealら、J. Clin. Endoclinol. Metab. 86: 1274-1280, 2001; Furstenbergerら、Lancet Oncol. 3: 298-302, 2002］。
前述した遺伝子は、原発癌性胃癌細胞株よりも胃癌の転移がなされた複数の細胞に由来する細胞株で発現が増加した遺伝子である。これらのうち、大部分の遺伝子が癌と関わりのある遺伝子であることを証明する研究が行われてきたが、胃癌または胃癌の転移過程における機能的関連性に関する研究はほとんど行われていない実情である。
以外にも、本発明では、胃癌転移が進行するにつれて発現が減少する遺伝子を選別して胃癌転移の診断マーカーとして使用しようとした。低発現遺伝子としては、実際胃癌細胞株と胃癌組織でその発現が増加する遺伝子として既に報告されたＦＫＢＰ１Ａ（FK506 binding protein 1A）とＴＭＳＢ４Ｘ（thymosin, beta 4, X chromosome）は細胞骨格の構成に重要な役割を果たし、ＰＫＭ２（pyruvate kinase, muscle）とＧＡＰＤ（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）は糖分解経路の酵素として知られているが、胃癌が悪性化されるにつれてその発現が減少する現象を示した。ＫＲＴ８（Keratin 8）は、既存の報告によれば、細胞移動（cell migration）と細胞浸潤（cell invasiveness）に関わりのある結合タンパク質である［Martensら、Cancer 87: 87-92, 1999; Sakakuraら、Bri. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002］。しかし、本発明では低発現遺伝子として確認された。ＰＴＭＡ（prothymosin-alpha）は有糸分裂に関与する核タンパク質であって、ｃ−ｍｙｃ転写調節因子によって発現が調節される遺伝子として胃癌や胃癌の転移に係わる研究は報告されていない［Szaboら、Hum. Genet. 90: 629-634, 1993; Haggertyら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5313-5318, 2003］。ＡＴＰ５Ａ１（ATP synthase alpha subunit）はミトコンドリアに位置する酵素としてエネルギー代謝に関与し、ＣＡＬＭ２（calmodulin 2）はカルシウム信号伝達に重要な役割を果すタンパク質であって、特定癌との関連性があるかどうかは報告されていない。ＮＥＴ１（neuroepithelial cell transforming gene 1）は１９９６年にChanらが糾明した新しい原癌遺伝子（proto-oncogene）であって、これまで多くの研究が行われていない状態であり、最近子宮頚部癌細胞の分裂にＮＥＴ１遺伝子の発現が係わっていると報告されている［Chanら、Oncogene 12: 1259-1266, 1996; Wollscheidら、Int. J. Cancer 99: 771-775, 2002］。
そこで、本発明者らは、胃癌細胞株、胃癌組織および正常の胃組織と、胃癌の転移がなされた複数の細胞株から製造したｃＤＮＡライブラリーの遺伝子塩基配列を分析し、これらの遺伝子の発見頻度に基づいて胃癌および転移性胃癌高発現または低発現される遺伝子を見出し、実時間（real-time）ＲＴ−ＰＣＲおよび競争的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって胃癌および転移性胃癌の高発現遺伝子と低発現遺伝子を確認し、胃癌および転移性胃癌を検出できる新しい胃癌および転移性胃癌遺伝子マーカーを確立することによって本発明を完成した。
Parkinら著、Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999年発行
Neugutら著、Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996年発行
Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001年発行
Yokozakiら著、Int. Rev. Cytol. 204: 49-95, 2001年発行
Parkら著、Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999年発行
Berxら著、Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998年発行
Parkら著、Gastroenterology 119: 691-698, 2000年発行
李ら著、Oncogene 19: 4947-4953, 2000年発行
Yoshikawaら著、Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000年発行
Shiozakiら著、Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001年発行
KirikoshiとKatohKirikoshi、Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002年発行
Hasegawaら著、Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002年発行
Yamazakiら著、Cancer 63: 613-617, 1989年発行
Shimadaら著、Cancer 1: 1657-1668, 1999年発行
Sakakuraら著、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002年発行
Wangら著、J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002年発行
Streitら著、J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996年発行
Streitら著、Recent Results Cancer Res. 142: 19-50, 1996年発行
Tokunagaら著、Cancer 75: 1418-1425, 1995年発行
Sakakuraら著、Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002年発行
Weissら著、Oncogene 22: 1872-1879, 2003年発行
Parkら著、Cancer Res. 50: 2773-2780, 1990年発行
Parkら著、Int. J. Cancer 70: 443-449, 1997年発行
Haraら著、Lab. Invest. 78: 1143-1153, 1998年発行
Parkら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8772-8776, 1994年発行
Baeら著、J Korean Med. Sci. 8: 153-159, 1993年発行
Adamsら著、Science 252: 1651-1656, 1991年発行
Adamsら著、Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995年発行
Hillierら著、Genome Res. 6: 807-828, 1996年発行
Marraら著、Nat. Genet. 21:191-194,1999年発行
Okuboら著、Nat. Genet. 2: 173-179, 1992年発行
Liewら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994年発行
Maoら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998年発行
Ryoら著、Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998年発行
Sterkyら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335,1998年発行
Ernstら著、Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002年発行
Mastumotoら著、Int. J. Cancer 74: 482-91, 1997年発行
Inkiら著、Br. J. Cancer 70: 319-323, 1994年発行
Dayら著、Virchows Arch. 434: 121-125, 1999年発行
Jooら著、Anticancer Res. 23: 1581-1588, 2003年発行
Abdollahiら著、Oncogene 6: 165-167, 1991年発行
Qiuら著、Am. J. Pathol. 162:1961-1974, 2003年発行
Shaulianら著、Nat. Cell. Biol. 4: E131-136, 2002年発行
Selvamuruganら著、Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 218-223, 2000年発行
Volmら著、Clin. Exp. Metastasis 14: 209-214, 1996年発行
Rossiら著、Int. J. Cancer 57: 86-89, 1994年発行
Honokiら著、Mol. Carcinog. 7: 111-115, 1993年発行
Kazmierczakら著、Genes Chromosomes Cancer 23: 279-285, 1998年発行
Howieら著、Carcinogenesis 11: 451-458, 1990年発行
Kangら著、Lab. Investigation 83: 635-641, 2003年発行
Wydnerら著、Genomics 32: 474-478, 1996年発行
Giguere, Trends Endocrinol. Metab. 13: 220-225, 2002年発行
Ariaziら著、Cancer Res. 62: 6510-6518, 2002年発行
Wolfら著、Oncogene 14: 543-549, 1997年発行
Knechtら著、Cancer Res. 59: 2794-2797, 1999年発行
Takahashiら著、Cancer Sci. 94: 148-152, 2003年発行
Dealら著、J. Clin. Endoclinol. Metab. 86: 1274-1280, 2001年発行
Furstenbergerら著、Lancet Oncol. 3: 298-302, 2002年発行
Martensら著、Cancer 87: 87-92, 1999年発行
Szaboら著、Hum. Genet. 90: 629-634, 1993年発行
Haggertyら著、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5313-5318, 2003年発行
Chanら著、Oncogene 12: 1259-1266, 1996年発行
Wollscheidら著、Int. J. Cancer 99: 771-775, 2002年発行
したがって、本発明は、胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた胃癌診断方法および診断キットを提供することにその目的がある。
また、本発明は、転移性胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた転移性胃癌診断方法および診断キットを提供することに他の目的がある。
また、本発明は、転移性胃癌組織で特異的に発現される遺伝子の発現程度の測定を用いた転移性胃癌診断方法および診断キットを提供することに他の目的がある。
本発明は、胃癌特異的遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１，ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２およびＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に対する発現程度の測定を通じて胃癌を診断する胃癌診断方法および診断キットをその特徴とする。
また、本発明は、転移性胃癌特異的遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３，ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に対する発現程度の測定を通じて悪性化された胃癌転移を診断する転移性胃癌診断方法および診断キットを他の特徴とする。
さらに、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含む。
さらに、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含む。
また、本発明に係る胃癌診断キットは、胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む。
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる少なくとも一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含む。
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含む。
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含む。
さらに、本発明に係る転移性胃癌診断キットは、転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含む。
本発明では、胃癌の診断に有用な腫瘍マーカーとして正常の胃組織で測定された６種の胃癌低発現遺伝子と胃癌細胞株および胃癌組織で測定された24種の胃癌高発現遺伝子が提供され、前記腫瘍マーカーは患者組織で迅速かつ敏感に定量できるため、胃癌の診断に非常に有効に利用できる。
さらに、本発明は、悪性化された胃癌転移の診断に有用なマーカーとして原発癌性胃癌細胞株で測定された９種の転移性胃癌低発現遺伝子と、転移性胃癌細胞株で測定された９種の転移関連高発現遺伝子が提供され、これらの腫瘍転移マーカー遺伝子は患者組織で迅速かつ敏感に定量して胃癌をはじめとする様々な癌患者の腫瘍の悪性化による転移癌を効果的に診断するのに使用できる。
さらに、本発明は、悪性化された胃癌転移の診断に有用なマーカーとして原発癌性胃癌細胞株で測定された９種の転移性胃癌低発現遺伝子と、転移性胃癌細胞株で測定された９種の転移関連高発現遺伝子が提供され、これらの腫瘍転移マーカー遺伝子は患者組織で迅速かつ敏感に定量して胃癌をはじめとする様々な癌患者の腫瘍の悪性化による転移癌を効果的に診断するのに使用できる。
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、30種の胃癌マーカー遺伝子、具体的に24種の胃癌特異的高発現遺伝子および６種の胃癌特異的低発現遺伝子の胃癌診断用途を提供する。
また、本発明は、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子、具体的に９種の転移性胃癌高発現遺伝子および９種の転移性胃癌特異的低発現遺伝子の転移性胃癌診断用途を提供する。
本発明の胃癌マーカー遺伝子は胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子は転移性胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明で確認された胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表１に示し、転移性胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表２に示す。
本発明は、30種の胃癌マーカー遺伝子、具体的に24種の胃癌特異的高発現遺伝子および６種の胃癌特異的低発現遺伝子の胃癌診断用途を提供する。
また、本発明は、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子、具体的に９種の転移性胃癌高発現遺伝子および９種の転移性胃癌特異的低発現遺伝子の転移性胃癌診断用途を提供する。
本発明の胃癌マーカー遺伝子は胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子は転移性胃癌組織で高発現できるか、又は低発現できる遺伝子の全長およびその断片を含む。
本発明で確認された胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表１に示し、転移性胃癌マーカー遺伝子の配列情報を下記表２に示す。
本発明では、１４種の胃癌細胞株（ＳＮＵ５，ＳＮＵ６６８，ＳＮＵ１６，ＳＮＵ４８４，ＳＮＵ１［３種］、ＳＮＵ６２０，ＳＮＵ７１９，ＳＮＵ６３８，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ５２０，ＫＭＳ５）、１種の胃癌組織標本（Ｔ６６５３０７）および４種の正常の胃組織標本（Ｋ４０２，Ｎ２５８２１５，Ｎ６６９７６１，Ｎ６６５３０７）を用いて総１９種のｃＤＮＡライブラリーを製造し、これらから約６５，２０９個のＥＳＴ塩基配列を決定し、胃癌試料（胃癌細胞株＋胃癌組織）と正常の胃試料（正常の胃組織）で各遺伝子の発見頻度を分析し、胃癌試料で発見頻度が高い24種の胃癌高発現遺伝子、すなわち、発癌候補遺伝子（ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１）と発見頻度が低い６種の胃癌低発現遺伝子、すなわち、胃癌抑制候補遺伝子（ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A））をそれぞれ選別して胃癌マーカー遺伝子を発見した。
また、本発明では、前記で製造した総１９種のｃＤＮＡライブラリーのうち６種の原発癌性胃癌細胞株（ＳＮＵ−１［３種］，ＳＮＵ−４８４，ＳＮＵ−７１９，ＳＮＵ−５２０）と６種の悪性化された胃癌細胞株から転移された複数の細胞株（ＳＮＵ−５，ＳＮＵ−６６８，ＳＮＵ−１６，ＳＮＵ−６２０，ＳＮＵ−６３８，ＳＮＵ−６０１）から製造された総１２種のｃＤＮＡライブラリーを選別し、これらから約３９，３１５個のＥＳＴ塩基配列を決定し、原発癌性胃癌細胞株試料と悪性化された胃癌細胞から転移された複数の細胞株試料において各遺伝子の発見頻度を分析し、転移性胃癌細胞株試料で発見頻度の高い９種の転移性胃癌高発現遺伝子（ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３）と発見頻度の低い９種の転移性胃癌低発現遺伝子（ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１）をそれぞれ選別して転移性胃癌マーカー遺伝子を発見した。
遺伝子発見頻度分析に用いられた胃癌試料および正常の胃試料で本発明の24種の胃癌発癌候補遺伝子と６種の胃癌抑制候補遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって比較した結果、胃癌発癌候補遺伝子は胃癌試料で高発現されることが観察され、胃癌抑制候補遺伝子は胃癌試料で低発現されることが観察されることによって、本発明の胃癌マーカー遺伝子と胃癌との関連性が確認された。
また、遺伝子発見頻度分析に用いられた原発癌性胃癌細胞株試料および転移性胃癌細胞株試料で本発明の９種の転移性胃癌高発現遺伝子と９種の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって比較した結果、転移性胃癌高発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で高発現されることが観察され、転移性胃癌低発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で低発現されることが観察されることによって、本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子と胃癌転移との関連性が確認された。
また、遺伝子発見頻度分析に用いられた原発癌性胃癌細胞株試料および転移性胃癌細胞株試料で本発明の９種の転移性胃癌高発現遺伝子と９種の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量を定量的ＲＴ−ＰＣＲ方法によって比較した結果、転移性胃癌高発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で高発現されることが観察され、転移性胃癌低発現遺伝子は転移性胃癌細胞株試料で低発現されることが観察されることによって、本発明の転移性胃癌マーカー遺伝子と胃癌転移との関連性が確認された。
したがって、胃癌特異的遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１，ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）の遺伝子の発現程度を測定することによって胃癌を診断でき、転移性胃癌特異的遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３，ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１の遺伝子の発現程度を測定することによって胃癌転移を診断できる。
なお、本発明はまた下記の段階を含む胃癌特異的遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する方法を提供する：
なお、本発明はまた下記の段階を含む胃癌特異的遺伝子の発現程度を測定して胃癌を診断する方法を提供する：
（ａ）試験胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）正常の胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）正常の胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌であるかどうかを判定する段階。
（ｂ）正常の胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）正常の胃組織において、ＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌であるかどうかを判定する段階。
さらに、本発明に係る転移性胃癌特異的遺伝子の発現程度を測定して転移性胃癌を診断する方法を提供する：
（ａ）試験転移性胃癌組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）原発癌性胃組織においてＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験転移性胃癌組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）原発癌性胃組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌が転移されたかどうかを判定する段階。
（ａ）試験転移性胃癌組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）原発癌性胃組織においてＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）試験転移性胃癌組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）原発癌性胃組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌が転移されたかどうかを判定する段階。
本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量はマーカー遺伝子またはその断片に対して相補的な塩基配列を有するセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いた公知の方法を通じて測定できる。たとえば、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、または競争的ＲＴ−ＰＣＲなどの方法で測定できる。このようなプライマーは、前記マーカー遺伝子のＤＮＡ領域中でタンパク質をコーディングするＤＮＡ領域の一部または全部の配列が含有され、少なくとも１５ｂｐ長さのＤＮＡでなければならない。たとえば、下記実施例上の表５〜表７に記載されたプライマーを使用してもよい。本発明において「相補的」とは、少なくとも１５個の連続塩基配列において完全に相補的な配列の場合に制限されず、塩基配列上で７０％、好ましくは８０％以上の相同性があればよい。
さらに、本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量はマーカー遺伝子またはその断片をプローブとして用いた公知のハイブリダイゼーション反応を通じて測定できる。たとえば、ノーザンハイブリダイゼーション［“Molecular Cloning - A Laboratory Manual”Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52］、In situハイブリダイゼーション［Jacquemierら、Bull Cancer 90: 31-8, 2003］またはマイクロアレイー［Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003］などの方法によって測定できる。プローブは３２種の遺伝子の塩基配列を含有する通常２００〜１０００ｂｐであり、好ましくは４００〜８００ｂｐの長さを有する。塩基配列は胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の塩基配列と７０％以上の類似性を有していればよい。本発明の胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子のプローブは前記で製造された胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを用いた遺伝子増幅法（ＰＣＲ）などの通常の方法によって製造できる。
また、前記胃癌および転移性胃癌マーカー遺伝子の発現量は各遺伝子によってコードされるタンパク質の量を測定することによって測定できる。前記方法においてタンパク質は胃癌および転移性胃癌マーカータンパク質に特異的に結合する抗体を用いて通常のＥＬＩＳＡおよび免疫沈降法などによって定量化できる。
本発明の胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子または胃癌および転移性胃癌低発現遺伝子のそれぞれに対する抗体は、各遺伝子を通常の方法に従って発現ベクターにクローニングして前記マーカー遺伝子によってコーディングされるタンパク質を得た後、得られたタンパク質から通常の方法によって製造できる。これには前記タンパク質から誘導されたペプチド断片も含まれ、本発明のペプチド断片としては、少なくとも７個のアミノ酸、好ましくは少なくとも９個のアミノ酸、さらに好ましくは少なくとも１２個以上のアミノ酸を含む。本発明の抗体の形態は特に制限されず、ポリクロナール抗体［Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13］、モノクロナール抗体［Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11］または抗原結合性を有するものであればそれの一部も本発明の抗体に含まれ、すべての免疫グロブリン抗体が含まれる。さらに、本発明の抗体にはヒト化抗体［Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)］などの特殊抗体も含まれる。
本発明の30種の胃癌マーカー遺伝子またはタンパク質は単独または組合せて胃癌診断に使用してもよく、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子またはタンパク質は単独または組合せて転移性胃癌診断に使用してもよい。
また、本発明の胃癌および転移性胃癌診断キットは、前記胃癌および転移性胃癌特異的マーカー遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーまたはプローブ以外にＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ分離試薬をさらに含んでもよく、マイクロアレイーを通じて発現量を調査する場合は前記マーカー遺伝子の固形支持体を含む。
さらに、30種の胃癌マーカー遺伝子は胃癌発癌遺伝子または抑制遺伝子である可能性が高いので、このような標的遺伝子がコーディングするタンパク質に結合する小さい分子の化合物は標的タンパク質を阻害または促進する化合物の候補となり得、これは抗癌剤、治療剤などの医薬品として使用できる。
また、本発明の胃癌および転移性胃癌診断キットは、前記胃癌および転移性胃癌特異的マーカー遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーまたはプローブ以外にＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ＲＮＡ分離試薬をさらに含んでもよく、マイクロアレイーを通じて発現量を調査する場合は前記マーカー遺伝子の固形支持体を含む。
さらに、30種の胃癌マーカー遺伝子は胃癌発癌遺伝子または抑制遺伝子である可能性が高いので、このような標的遺伝子がコーディングするタンパク質に結合する小さい分子の化合物は標的タンパク質を阻害または促進する化合物の候補となり得、これは抗癌剤、治療剤などの医薬品として使用できる。
なお、１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子は転移遺伝子または転移抑制遺伝子である可能性が高いので、このような標的遺伝子がコーディングするタンパク質に結合する小さい分子の化合物は標的タンパク質を阻害または促進する化合物の候補となり得、これは抗癌剤、治療剤などの医薬品として使用できる。
このような化合物をスクリーニングする方法としては、３２種の胃癌マーカー遺伝子または１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子がコーディングするタンパク質をアフィニティー・カラムに固定し、これを被検試料と接触させて精製する方法［Pandyaら、Virus Res 87: 135-143, 2002］、ツーハイブリッド法を用いる方法［Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989］、ウェスタンブロッティング法［“Molecular Cloning - A Laboratory Manual”Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. et al. (1982) section 18.30-18.74］、ハイスループットスクリーニング（HTS）法［Aviezerら、J Biomol Screen 6: 171-7, 2001］など多数の公知の方法を使用してもよい。スクリーニングに用いる被検試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などがあるが、これに制限されない。
このような化合物をスクリーニングする方法としては、３２種の胃癌マーカー遺伝子または１８種の転移性胃癌マーカー遺伝子がコーディングするタンパク質をアフィニティー・カラムに固定し、これを被検試料と接触させて精製する方法［Pandyaら、Virus Res 87: 135-143, 2002］、ツーハイブリッド法を用いる方法［Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989］、ウェスタンブロッティング法［“Molecular Cloning - A Laboratory Manual”Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. et al. (1982) section 18.30-18.74］、ハイスループットスクリーニング（HTS）法［Aviezerら、J Biomol Screen 6: 171-7, 2001］など多数の公知の方法を使用してもよい。スクリーニングに用いる被検試料としては細胞抽出液、遺伝子ライブラリーの発現産物、合成低分子化合物、合成ペプチド、天然化合物などがあるが、これに制限されない。
（実施例）
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
以下、本発明を下記実施例によってさらに詳細に説明する。ただし、これらは本発明を例示するためのものであり、本発明の範囲を制限しない。
胃癌細胞株、胃癌組織および正常の胃組織からの総ＲＮＡ分離
胃癌細胞株であるＳＮＵ５，ＳＮＵ６６８，ＳＮＵ１６，ＳＮＵ１，ＳＮＵ４８４，ＳＮＵ６２０，ＳＮＵ７１９，ＳＮＵ６３８，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ５２０（韓国細胞株銀行、http://cellbank.snu.ac.kr/）、ＫＭＳ５（韓国生命工学研究院）は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培養液で培養し、１種の胃癌組織標本であるＴ６６５３０７および４種の正常の胃組織標本であるＫ４０２，Ｎ２５８２１５，Ｎ６６９７６１，Ｎ６６５３０７（忠南大学の医学部）は外科的に除去された組織から得、分析するまでこれを液体窒素に保管した。
細胞および組織の総ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮキット（RNeasy Maxiキット：ｃａｔ＃７５１６２）を用いて分離した。まず、付着細胞はＥＤＴＡとトリプシンを用いて回収した後、１５０μｌのβ−メルカプトエタノール（Mercaptoethanol）を添加した１５ｍｌのキット内分解緩衝液に溶解した。一方、組織を約１ｇ取ってβ−メルカプトエタノールを添加した１５ｍｌのキット中のＲＬＴ緩衝液に溶解し、ホモゲナイザーで粉砕した。試料溶液を３０００ｇで１０分間遠心分離して上澄液を分離し、これに１５ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加してよく混合した後、３０００ｇで５分間遠心分離して総ＲＮＡを膜に付着した。２回の洗浄過程を行った後、１．２ｍｌのＲＮａｓｅが除去された水を添加して総ＲＮＡを溶出、分離した。
胃癌細胞株であるＳＮＵ５，ＳＮＵ６６８，ＳＮＵ１６，ＳＮＵ１，ＳＮＵ４８４，ＳＮＵ６２０，ＳＮＵ７１９，ＳＮＵ６３８，ＳＮＵ６０１，ＳＮＵ２１６，ＳＮＵ５２０（韓国細胞株銀行、http://cellbank.snu.ac.kr/）、ＫＭＳ５（韓国生命工学研究院）は１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ培養液で培養し、１種の胃癌組織標本であるＴ６６５３０７および４種の正常の胃組織標本であるＫ４０２，Ｎ２５８２１５，Ｎ６６９７６１，Ｎ６６５３０７（忠南大学の医学部）は外科的に除去された組織から得、分析するまでこれを液体窒素に保管した。
細胞および組織の総ＲＮＡはＱＩＡＧＥＮキット（RNeasy Maxiキット：ｃａｔ＃７５１６２）を用いて分離した。まず、付着細胞はＥＤＴＡとトリプシンを用いて回収した後、１５０μｌのβ−メルカプトエタノール（Mercaptoethanol）を添加した１５ｍｌのキット内分解緩衝液に溶解した。一方、組織を約１ｇ取ってβ−メルカプトエタノールを添加した１５ｍｌのキット中のＲＬＴ緩衝液に溶解し、ホモゲナイザーで粉砕した。試料溶液を３０００ｇで１０分間遠心分離して上澄液を分離し、これに１５ｍｌの７０％ＥｔＯＨを添加してよく混合した後、３０００ｇで５分間遠心分離して総ＲＮＡを膜に付着した。２回の洗浄過程を行った後、１．２ｍｌのＲＮａｓｅが除去された水を添加して総ＲＮＡを溶出、分離した。
ＥＳＴ発見頻度による胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の選別
本発明者は、胃癌および悪性化された転移性胃癌で発現される遺伝子を分析するために、原発癌性胃癌細胞株と転移性胃癌細胞株を含む胃癌細胞株、胃癌組織と正常の胃組織で各種のｃＤＮＡライブラリーを構築し、これから無作為にクローンを選別、分析することによってＥＳＴ発見頻度に基づく胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子を選別しようとした。
本発明者は、胃癌および悪性化された転移性胃癌で発現される遺伝子を分析するために、原発癌性胃癌細胞株と転移性胃癌細胞株を含む胃癌細胞株、胃癌組織と正常の胃組織で各種のｃＤＮＡライブラリーを構築し、これから無作為にクローンを選別、分析することによってＥＳＴ発見頻度に基づく胃癌および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子を選別しようとした。
１）ｃＤＮＡライブラリーの製造
前記実施例１で得られた各試料の総ＲＮＡ各１００μｇをＢＡＰ酵素反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ＰＨ７．０）、ＲＮＡ ２ｍＭ ＤＴＴ、８０Ｕ Ｒｎａｓｉｎ（promega社））で３ＵのＢＡＰ（Bacterial alkaline Phosphatase, TakaRa）酵素で処理し、次いでＴＡＰ（Ｗａｃｏ）酵素反応液（50mM sodium acetate (PH5.5)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、８０Ｕ Ｒｎａｓｉｎ（promega））で１００ＵのＴＡＰ（Tabbaco acid pyrophosphatase）酵素を反応させた。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、２６％ ＰＥＧ、１００Ｕ Rnasin、配列番号１のオリゴリボヌクレオチド４０ｐｍｏｌｅ、２５０Ｕ ＲＮＡ ligase（TakaRa社）の反応を行い、リン酸基を有する未分解のｍＲＮＡにのみオリゴマーが添加できるように反応させた。
前記実施例１で得られた各試料の総ＲＮＡ各１００μｇをＢＡＰ酵素反応液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈｃｌ（ＰＨ７．０）、ＲＮＡ ２ｍＭ ＤＴＴ、８０Ｕ Ｒｎａｓｉｎ（promega社））で３ＵのＢＡＰ（Bacterial alkaline Phosphatase, TakaRa）酵素で処理し、次いでＴＡＰ（Ｗａｃｏ）酵素反応液（50mM sodium acetate (PH5.5)、１ｍＭ ＥＤＴＡ、２ｍＭ ＤＴＴ、８０Ｕ Ｒｎａｓｉｎ（promega））で１００ＵのＴＡＰ（Tabbaco acid pyrophosphatase）酵素を反応させた。その後、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ＰＨ７．５）、５ｍＭ ＭｇＣｌ2、２ｍＭ ＤＴＴ、０．５ｍＭ ＡＴＰ、２６％ ＰＥＧ、１００Ｕ Rnasin、配列番号１のオリゴリボヌクレオチド４０ｐｍｏｌｅ、２５０Ｕ ＲＮＡ ligase（TakaRa社）の反応を行い、リン酸基を有する未分解のｍＲＮＡにのみオリゴマーが添加できるように反応させた。
以上の反応で処理した総ＲＮＡからオリゴテックス（oligotex）ｍＲＮＡ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いてｍＲＮＡを分離し、ｄＴ17を含有する配列番号２のオリゴマーをプライマーとして用いて１ｓｔ ｃＤＮＡを合成した。 その後、 ＸＬ ＰＣＲキット（Perkin Elmer）およびＤＮＡ挿入体の５’−プライマー（配列番号３）と３’−プライマー（配列番号４）を含有するＰＣＲ反応槽で１ｓｔｃＤＮＡを 少量増幅させた。ＰＣＲ産物をSfiIの酵素で処理した後、アガロースゲル電気泳動を行って１．３ｋｂ以上のｃＤＮＡ断片を分離した。分離されたｃＤＮＡ断片はＴａＫａＲａ連結キットを用いてDraIII酵素で処理したｐＣＮＳ−Ｄ２ベクターに連結した後、電気穿孔法（electroporation）によって大腸菌Ｔｏｐ１０Ｆ’（Invitrogen）菌株に形質転換させてｃＤＮＡライブラリーを製造した。
前記方法によって１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリー、１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーと４種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーを製造した（表３）。
前記方法によって１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリー、１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーと４種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーを製造した（表３）。
各種のｃＤＮＡライブラリーの製造およびＥＳＴ分析
また、本発明の方法によって製造されたライブラリーのうち、６種の原発癌性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーと６種の転移性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーは表４の通りである。
各種のｃＤＮＡライブラリーの製造およびＥＳＴ分析
２）ｃＤＮＡ塩基配列の決定およびデータ分析
製作したｃＤＮＡライブラリーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天培地に塗抹して多数のｃＤＮＡクローンを培養した。培養されたクローンの塩基配列を分析するためにＭＷＧ 96 well plasmid prep systemでプラスミドＤＮＡを分離し、自動化塩基配列決定機であるＡＢＩ ３７００で塩基配列分析を行った。決定されたＤＮＡデータの類似性検索はＢＬＡＳＴＮを用いてUni Geneデータベース（Hs. seq. all, build #151）で行った。
前記表３の１９種の胃癌関連ｃＤＮＡライブラリーにおいて約６５，２０９個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１９，７６２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表３に示した通りである。
製造されたライブラリーのうち、原発癌性胃癌細胞株ライブラリーと転移性胃癌細胞株ライブラリーを含む前記表４の総１２種のｃＤＮＡライブラリーにおいて約３９，３１５個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１５，２４２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表４に示した通りである。
製作したｃＤＮＡライブラリーを、アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を含有するＬＢ寒天培地に塗抹して多数のｃＤＮＡクローンを培養した。培養されたクローンの塩基配列を分析するためにＭＷＧ 96 well plasmid prep systemでプラスミドＤＮＡを分離し、自動化塩基配列決定機であるＡＢＩ ３７００で塩基配列分析を行った。決定されたＤＮＡデータの類似性検索はＢＬＡＳＴＮを用いてUni Geneデータベース（Hs. seq. all, build #151）で行った。
前記表３の１９種の胃癌関連ｃＤＮＡライブラリーにおいて約６５，２０９個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１９，７６２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表３に示した通りである。
製造されたライブラリーのうち、原発癌性胃癌細胞株ライブラリーと転移性胃癌細胞株ライブラリーを含む前記表４の総１２種のｃＤＮＡライブラリーにおいて約３９，３１５個のＥＳＴ塩基配列を決定し、ＵｎｉＧｅｎｅデータベースで分析を行った結果、総１５，２４２種の遺伝子が発見された。各ライブラリー別の決定されたＥＳＴ数と発見された遺伝子の種類は前記表４に示した通りである。
３）遺伝子発見頻度分析
１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーと１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーは胃癌試料（cancer pool）に、３種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーは正常の胃試料（normal pool）に大きく２つに分類した。
また、６種の原発癌性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーを原発癌性胃癌試料に、６種の転移性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーは転移性胃癌試料に大きく２つに分類した。
各遺伝子の発見頻度は各々の試料で発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比として示した。また、各ライブラリーにおける各遺伝子の発見頻度は各ライブラリーで発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比で計算し、これを色として示した。
前記のような分析によって、胃癌試料で発見頻度が増加する24種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子６種が各々選別された（図１）。
また、前記のような分析によって、転移性胃癌細胞株試料における発見頻度が増加する９種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子９種が各々選別された（図２）。
１４種の胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーと１種の胃癌組織ｃＤＮＡライブラリーは胃癌試料（cancer pool）に、３種の正常の胃組織ｃＤＮＡライブラリーは正常の胃試料（normal pool）に大きく２つに分類した。
また、６種の原発癌性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーを原発癌性胃癌試料に、６種の転移性胃癌細胞株ｃＤＮＡライブラリーは転移性胃癌試料に大きく２つに分類した。
各遺伝子の発見頻度は各々の試料で発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比として示した。また、各ライブラリーにおける各遺伝子の発見頻度は各ライブラリーで発見された特定の遺伝子の数を発見された総遺伝子数の比で計算し、これを色として示した。
前記のような分析によって、胃癌試料で発見頻度が増加する24種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子６種が各々選別された（図１）。
また、前記のような分析によって、転移性胃癌細胞株試料における発見頻度が増加する９種の高発現遺伝子と発見頻度が減少する低発現遺伝子９種が各々選別された（図２）。
ＲＴ−ＰＣＲ反応による選別された標的遺伝子の発現量の分析
前記で選別された胃癌高発現遺伝子と胃癌低発現遺伝子の発現量および転移性胃癌高発現遺伝子と転移性胃癌低発現遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ方法を通じて定量的に分析した。
１）逆転写酵素反応
前記実施例１で分離した総１７種の総ＲＮＡ各々５μｇを用いて下記の逆転写反応緩衝液で４２℃、６０分間反応させて総１７種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃加熱ブロック（heating block）で１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
poly dT(12-18)プライマー(0.4μg/μl) １μｌ
5X first-strand buffer ４μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ） １μｌ
逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ） １μｌ
総ＲＮＡ（５μｇ） Ｘμｌ
蒸留水 （１０−Ｘ）μｌ
合計 ２０μｌ
前記で選別された胃癌高発現遺伝子と胃癌低発現遺伝子の発現量および転移性胃癌高発現遺伝子と転移性胃癌低発現遺伝子の発現量をＲＴ−ＰＣＲ方法を通じて定量的に分析した。
１）逆転写酵素反応
前記実施例１で分離した総１７種の総ＲＮＡ各々５μｇを用いて下記の逆転写反応緩衝液で４２℃、６０分間反応させて総１７種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃加熱ブロック（heating block）で１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
poly dT(12-18)プライマー(0.4μg/μl) １μｌ
5X first-strand buffer ４μｌ
１０ｍＭ ｄＮＴＰ混合物 １μｌ
０．１Ｍ ＤＴＴ ２μｌ
ＲＮａｓｅＯＵＴ（４０Ｕ／μｌ） １μｌ
逆転写酵素（２００Ｕ／μｌ） １μｌ
総ＲＮＡ（５μｇ） Ｘμｌ
蒸留水 （１０−Ｘ）μｌ
合計 ２０μｌ
２）実時間ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅および発現量の確認
ａ）実時間ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅
実時間ＰＣＲは、FastStart-DNA Master SYBR Green Iキット（Roche社、スイス）を用いて行い、全反応量を総２０μｌとした。すなわち、各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する次の実時間ＰＣＲ反応液に前記１）の逆転写酵素反応で合成したｃＤＮＡを１／５００に希釈して２μｌずつ添加した。下記表５に記載された１４種の胃癌高発現遺伝子と３種の胃癌低発現遺伝子のＰＣＲプライマーはタンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（ジェノテック、韓国）。ＰＣＲ反応は９５℃（１５秒）、５５℃（５秒）、７２℃（３０秒）の条件で４５回行った。
ｃＤＮＡ（０．５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．８μｌ
センスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ
アンチセンスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ
SYBR Green I重合酵素混合物 ２μｌ
蒸留水 １１．２μｌ
総 ２０μｌ
ａ）実時間ＰＣＲ反応によるｃＤＮＡの増幅
実時間ＰＣＲは、FastStart-DNA Master SYBR Green Iキット（Roche社、スイス）を用いて行い、全反応量を総２０μｌとした。すなわち、各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する次の実時間ＰＣＲ反応液に前記１）の逆転写酵素反応で合成したｃＤＮＡを１／５００に希釈して２μｌずつ添加した。下記表５に記載された１４種の胃癌高発現遺伝子と３種の胃癌低発現遺伝子のＰＣＲプライマーはタンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（ジェノテック、韓国）。ＰＣＲ反応は９５℃（１５秒）、５５℃（５秒）、７２℃（３０秒）の条件で４５回行った。
ｃＤＮＡ（０．５ｎｇ／μｌ） ２μｌ
２５ｍＭ ＭｇＣｌ2 ０．８μｌ
センスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ
アンチセンスプライマー（５ｐｍｏｌｅ／μｌ） ２μｌ
SYBR Green I重合酵素混合物 ２μｌ
蒸留水 １１．２μｌ
総 ２０μｌ
実時間ＰＣＲに用いた各胃癌マーカー遺伝子のプライマー
マーカー遺伝子を定量するための標準遺伝子としてβ２マイクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を用いた。すなわち、１．２μｇのＢ２Ｍ ＤＮＡを原液および１／１０，１／１００，１／１０００，１／１００００に希釈し、これを各々２μｌずつ用いて前記のような実時間ＰＣＲを行い、増幅されたＰＣＲ産物からＢ２Ｍ量の標準化グラフを作成した。これを用いてマーカー遺伝子のＰＣＲ産物からマーカー遺伝子の量を定量化した。Ｂ２ＭのＰＣＲ反応の際に各々５’−プライマー（配列番号３９）および３’−プライマー（配列番号４０）を用いた。このプライマーは、Ｂ２Ｍ遺伝子塩基配列のうちタンパク質コーディング領域内のＤＮＡ塩基配列部でデザインした。
ｂ）実時間ＰＣＲ反応による発現量の確認
実時間ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたマーカー遺伝子のＰＣＲ産物の量は、標準遺伝子のＰＣＲ産物の量（３回行って得られたＢ２Ｍの平均量）で割った。その後、高発現遺伝子の発現量は、胃癌組織で発現される標的遺伝子の量を正常の胃組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は、正常の胃組織で発現される標的遺伝子の量を胃癌細胞株および胃癌組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として図３に示す（Ｓ１４，Ｓ１７，Ｓ１８，Ｓ１９：正常の胃組織，Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ２１：胃癌細胞株、Ｓ２０：胃癌組織）。
その結果、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の実時間ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、ＥＥＦＡ１Ａ，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＨＳＰＢ１遺伝子は胃癌発癌マーカーとしての有用性が明らかになり、これとともにＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）遺伝子は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが明らかになった。
実時間ＲＴ−ＰＣＲによって増幅されたマーカー遺伝子のＰＣＲ産物の量は、標準遺伝子のＰＣＲ産物の量（３回行って得られたＢ２Ｍの平均量）で割った。その後、高発現遺伝子の発現量は、胃癌組織で発現される標的遺伝子の量を正常の胃組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として示し、低発現遺伝子の発現量は、正常の胃組織で発現される標的遺伝子の量を胃癌細胞株および胃癌組織で発現される標的遺伝子の発現量の平均量に対する比率として図３に示す（Ｓ１４，Ｓ１７，Ｓ１８，Ｓ１９：正常の胃組織，Ｓ１，Ｓ２，Ｓ３，Ｓ５，Ｓ６，Ｓ７，Ｓ８，Ｓ９，Ｓ１０，Ｓ１２，Ｓ１３，Ｓ２１：胃癌細胞株、Ｓ２０：胃癌組織）。
その結果、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の実時間ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子のＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、ＥＥＦＡ１Ａ，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＨＳＰＢ１遺伝子は胃癌発癌マーカーとしての有用性が明らかになり、これとともにＩＧＫＣ，ＳＮＣ７３，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）遺伝子は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが明らかになった。
３）競争的（Competitive）ＲＴ−ＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅および発現量確認
ａ）競争的ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型の濃度補正
本実験では、マーカー遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＢ２Ｍ遺伝子を用いた。
標準遺伝子とプライマーのプライミング部分は同じであるが、ＰＣＲ産物のサイズが異なる競争ＤＮＡ（competitor）を標準遺伝子とともにＰＣＲ反応を行って、試料間の標準遺伝子の発現量と競争ＤＮＡの発現量が同一な濃度を見出し、ＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。
Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡは３μｌのｐＣＮＳベクターＤＮＡ（２ｎｇ）、１０μｌの５ｘ PCR premix（バイオニア社）、１μｌの５’−プライマー（２０pmole：配列番号４１）、１μｌの３’−プライマー（２０pmole：配列番号４２）、３５μｌの蒸留水を含有する５０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行って製造した。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（３０秒）の条件で３０回行い、Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡであるＰＣＲ産物の長さは３２２ｂｐであった。
ａ）競争的ＲＴ−ＰＣＲのための鋳型の濃度補正
本実験では、マーカー遺伝子を定量するための標準遺伝子としてＢ２Ｍ遺伝子を用いた。
標準遺伝子とプライマーのプライミング部分は同じであるが、ＰＣＲ産物のサイズが異なる競争ＤＮＡ（competitor）を標準遺伝子とともにＰＣＲ反応を行って、試料間の標準遺伝子の発現量と競争ＤＮＡの発現量が同一な濃度を見出し、ＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。
Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡは３μｌのｐＣＮＳベクターＤＮＡ（２ｎｇ）、１０μｌの５ｘ PCR premix（バイオニア社）、１μｌの５’−プライマー（２０pmole：配列番号４１）、１μｌの３’−プライマー（２０pmole：配列番号４２）、３５μｌの蒸留水を含有する５０μｌの反応液でＰＣＲ反応を行って製造した。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５０℃（３０秒）、７２℃（３０秒）の条件で３０回行い、Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡであるＰＣＲ産物の長さは３２２ｂｐであった。
調製したＢ２Ｍ競争ＤＮＡを７／１０８，１／１０７，３／１０７，７／１０７，１／１０６，３／１０６の６段階に希釈した後、２μｌを前記実施例３の１）逆転写酵素反応液（逆転写反応に用いられたＲＮＡの１０ｎｇに該当する量）と各々混合した後、４μｌの５Ｘ Ｔａｑ ＤＮＡ重合酵素混合液、２μｌのＢ２Ｍプライマー（５pmole/μl）（配列番号３９および４０）、８μｌの蒸留水を含有する総２０μｌの６個のＰＣＲ反応液を用いて競争的ＰＣＲを行った。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（４０秒）、５５℃（１分）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。
ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルに３μｌずつローディングして１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、Ｆｒｏｇ（商標）機械（ゲルイメージ分析システム）[Core Bio社]を用いてゲル写真を撮影した。最終的に得られたゲルバンドイメージファイル(.tif)をToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて、二つのバンド（Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡでは３２２ｂｐ、本来Ｂ２Ｍ遺伝子では３９０ｂｐ）の同様な感度が同様な濃度を選別、定量化した後、各試料の濃度を補正した。
ＰＣＲ産物を３％アガロースゲルに３μｌずつローディングして１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、Ｆｒｏｇ（商標）機械（ゲルイメージ分析システム）[Core Bio社]を用いてゲル写真を撮影した。最終的に得られたゲルバンドイメージファイル(.tif)をToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて、二つのバンド（Ｂ２Ｍ競争ＤＮＡでは３２２ｂｐ、本来Ｂ２Ｍ遺伝子では３９０ｂｐ）の同様な感度が同様な濃度を選別、定量化した後、各試料の濃度を補正した。
ｂ）ＲＴ−ＰＣＲを用いたｃＤＮＡの増幅
前記ａ）で補正した試料のｃＤＮＡを胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表６のＰＣＲ反応液と転移性胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表７のＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。
下記表６の遺伝子と表７の遺伝子のプライマーは、タンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（コアバイオシステム、韓国）。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。
Ｃｄｎａ ５μｌ
５Ｘ ＰＣＲ反応ｍｉｘ（バイオニア、韓国） ３μｌ
センスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） １μｌ
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） １μｌ
蒸留水 ５μｌ
総 １５μｌ
前記ａ）で補正した試料のｃＤＮＡを胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表６のＰＣＲ反応液と転移性胃癌マーカー遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する表７のＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。
下記表６の遺伝子と表７の遺伝子のプライマーは、タンパク質コーディング領域内部でデザインし、各プライマーの長さは１７〜２０ｂｐ、ＧＣ含量は５０〜７０％程度である（コアバイオシステム、韓国）。以下にＰＣＲ反応液の組成を示す。
Ｃｄｎａ ５μｌ
５Ｘ ＰＣＲ反応ｍｉｘ（バイオニア、韓国） ３μｌ
センスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） １μｌ
アンチセンスプライマー（１０ｐｍｏｌｅ／μｌ） １μｌ
蒸留水 ５μｌ
総 １５μｌ
競争的ＰＣＲに用いた各胃癌マーカー遺伝子のプライマー
競争的ＰＣＲに用いた各転移性胃癌マーカー遺伝子のプライマー
ｃ）競争的ＰＣＲを用いた発現量の確認
ＰＣＲ反応によって増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液を２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図４に示すように、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、10種の胃癌発癌候補遺伝子であるＴＭＳＢ４Ｘ，ＲＰＬ４，ＴＵＢＡ６，ＨＭＧＩＹ，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＡＲＦ１，ＰＹＣＲ１，ＳＵＲＦ４，ＳＨ３ＧＬＢ２ は胃癌発癌マーカーとして有用であることが明らかになり、これとともに３個の非腫瘍遺伝子ＣＤ７４，ＡＧＲ２，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが確認された。
また、図５に示すように、転移性胃癌細胞株で発見頻度が高い高発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で高く、転移性胃癌細胞株で発見頻度が低い低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で低く現れた。すなわち、９種の転移性胃癌高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３および転移性胃癌低発現遺伝子ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１は転移性胃癌マーカーとして使用可能であることが確認された。
ＰＣＲ反応によって増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液を２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図４に示すように、胃癌で発見頻度が高い胃癌高発現遺伝子（実施例２の３）データ）の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で高く、胃癌で発見頻度が低い胃癌低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は胃癌試料で低く現れた。すなわち、10種の胃癌発癌候補遺伝子であるＴＭＳＢ４Ｘ，ＲＰＬ４，ＴＵＢＡ６，ＨＭＧＩＹ，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＡＲＦ１，ＰＹＣＲ１，ＳＵＲＦ４，ＳＨ３ＧＬＢ２ は胃癌発癌マーカーとして有用であることが明らかになり、これとともに３個の非腫瘍遺伝子ＣＤ７４，ＡＧＲ２，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）は胃癌抑制マーカーとして使用可能であることが確認された。
また、図５に示すように、転移性胃癌細胞株で発見頻度が高い高発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で高く、転移性胃癌細胞株で発見頻度が低い低発現遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は転移性胃癌細胞株試料で低く現れた。すなわち、９種の転移性胃癌高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４，ＩＧＦＢＰ３および転移性胃癌低発現遺伝子ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２，ＮＥＴ１は転移性胃癌マーカーとして使用可能であることが確認された。
臨床試料における胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量および転移性胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量の確認を通じての胃癌および転移性胃癌診断
本実験では、忠南大学の医学部で提供した４名の胃癌疑い患者から直接採取した試験組織／正常の組織（各々Ｔ１〜Ｔ４およびＮ１〜Ｎ４）の対となっている４種の臨床試料（３７６４５４，６６３５９３，６６８２１７，６７０５００）において、胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量を確認した。胃癌高発現遺伝子のうちＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子を、胃癌低発現遺伝子のうちＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＣＤ７４遺伝子を任意的に選別して競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行った。
また、忠南大学の医学部で提供した１０名の原発癌性胃癌患者（Ｅ１〜Ｅ１０）と７名の転移性胃癌患者（Ａ１〜Ａ７）から直接採取した臨床試料において、転移性胃癌高発現遺伝子のうちＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＣＤ４４遺伝子を、転移性胃癌低発現遺伝子のうちＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１遺伝子を任意的に選別して各遺伝子の発現量を競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認した。
本実験では、忠南大学の医学部で提供した４名の胃癌疑い患者から直接採取した試験組織／正常の組織（各々Ｔ１〜Ｔ４およびＮ１〜Ｎ４）の対となっている４種の臨床試料（３７６４５４，６６３５９３，６６８２１７，６７０５００）において、胃癌高発現遺伝子と低発現遺伝子の発現量を確認した。胃癌高発現遺伝子のうちＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子を、胃癌低発現遺伝子のうちＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＣＤ７４遺伝子を任意的に選別して競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて行った。
また、忠南大学の医学部で提供した１０名の原発癌性胃癌患者（Ｅ１〜Ｅ１０）と７名の転移性胃癌患者（Ａ１〜Ａ７）から直接採取した臨床試料において、転移性胃癌高発現遺伝子のうちＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＣＤ４４遺伝子を、転移性胃癌低発現遺伝子のうちＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１遺伝子を任意的に選別して各遺伝子の発現量を競争的ＲＴ−ＰＣＲ法を用いて確認した。
１）総ＲＮＡ分離および逆転写酵素反応
前記実施例１と同様な方法で総ＲＮＡを分離し、前記実施例３の１）と同様に各試料の総ＲＮＡ５μｇを用いて４２℃で６０分間逆転写反応を行うことによって、胃癌臨床試料からは総８種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成し、転移性胃癌臨床試料からは総１７種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃heating blockで１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
前記実施例１と同様な方法で総ＲＮＡを分離し、前記実施例３の１）と同様に各試料の総ＲＮＡ５μｇを用いて４２℃で６０分間逆転写反応を行うことによって、胃癌臨床試料からは総８種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成し、転移性胃癌臨床試料からは総１７種の１ｓｔ ｃＤＮＡを合成した。その後、７０℃heating blockで１５分間反応させることによってｃＤＮＡ合成を終了した。
２）競争的ＰＣＲを用いた各胃癌遺伝子の発現量の確認
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度で定量されたＴ１、Ｎ４およびＴ４の４／１０７の濃度を基準として、残りの５個の試料の濃度を蒸留水で希釈して補正した。補正した試料の逆転写反応液を１０μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で３０回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表５と表６の通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図６に示すように、胃癌高発現遺伝子であるＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は、同一患者から採取した正常の胃組織よりも大部分の試験癌組織でさらに高く、胃癌低発現遺伝子であるＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＣＤ７４遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は試験組織よりも大部分の正常の胃組織でさらに低く現れた。すなわち、４つの（Ｔ１〜Ｔ４）試験組織はいずれも胃癌として判定され、これは従来の臨床学的胃癌検査結果（Ｔ１：胃癌段階ＩＶ、Ｔ２：胃癌段階ＩＩＩＡ、Ｔ３とＴ４：胃癌段階ＩＩ）と一致した。
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度で定量されたＴ１、Ｎ４およびＴ４の４／１０７の濃度を基準として、残りの５個の試料の濃度を蒸留水で希釈して補正した。補正した試料の逆転写反応液を１０μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（１分）、５５℃（３０秒）、７２℃（１分）の条件で３０回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表５と表６の通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。
その結果、図６に示すように、胃癌高発現遺伝子であるＦＫＢＰ１Ａ，ＬＤＨＡ，ＨＳＰＣＢ，ＴＵＢＡ６遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は、同一患者から採取した正常の胃組織よりも大部分の試験癌組織でさらに高く、胃癌低発現遺伝子であるＳＮＣ７３，ＩＧＫＣ，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ）、ＣＤ７４遺伝子の競争的ＲＴ−ＰＣＲ産物の量は試験組織よりも大部分の正常の胃組織でさらに低く現れた。すなわち、４つの（Ｔ１〜Ｔ４）試験組織はいずれも胃癌として判定され、これは従来の臨床学的胃癌検査結果（Ｔ１：胃癌段階ＩＶ、Ｔ２：胃癌段階ＩＩＩＡ、Ｔ３とＴ４：胃癌段階ＩＩ）と一致した。
３）競争的ＰＣＲを用いた各転移性胃癌遺伝子の発現量の確認
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度の試料を基準として残りの１３個の試料の濃度を希釈した。遺伝子の種類によって鋳型として用いられた試料の濃度が異なるが、少なくとも１ｓｔ ｃＤＮＡの１／５０希釈した濃度の試料を用いた。補正した試料の逆転写反応液を２μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表７に示した通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。その結果は、図７に示すように、転移性胃癌高発現遺伝子であるＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ、そしてＣＤ４４の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的にさらに高く、転移性胃癌低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的に低く現れた。すなわち、１７個（Ｅ１〜Ｅ１０およびＡ１〜Ａ７）の試験組織はいずれも胃癌組織であり、１０個の原発癌性胃癌組織は胃癌段階ＩＡであり、７個の転移性胃癌組織は胃癌段階ＩＶに該当する。
前記実施例３−３）−ａ）と同様な方法でＰＣＲに用いられる各鋳型の濃度が同一になるように試料の濃度を補正した。すなわち、最も低い濃度の試料を基準として残りの１３個の試料の濃度を希釈した。遺伝子の種類によって鋳型として用いられた試料の濃度が異なるが、少なくとも１ｓｔ ｃＤＮＡの１／５０希釈した濃度の試料を用いた。補正した試料の逆転写反応液を２μｌずつ鋳型として用いて各遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含有する総１５μｌのＰＣＲ反応液で増幅させた。この際、ＰＣＲ反応は９４℃（３０秒）、５５℃（１分）、７２℃（１分）の条件で２５回ずつ行った。用いられたプライマーは前記表７に示した通りである。増幅されたＰＣＲ産物を確認するために、ＰＣＲ反応液の全てを２％のアガロースゲルに１００Ｖで３０分間電気泳動させた後、ＰＣＲ産物を前記実施例３−３）−ａ）と同様にToltalLab v1.0プログラム（NonLinear Dynamix Ltd.）を用いて定量化した。その結果は、図７に示すように、転移性胃癌高発現遺伝子であるＪＵＮ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ、そしてＣＤ４４の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的にさらに高く、転移性胃癌低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１の発現量は原発癌性胃癌組織よりも転移性胃癌組織で平均的に低く現れた。すなわち、１７個（Ｅ１〜Ｅ１０およびＡ１〜Ａ７）の試験組織はいずれも胃癌組織であり、１０個の原発癌性胃癌組織は胃癌段階ＩＡであり、７個の転移性胃癌組織は胃癌段階ＩＶに該当する。
Claims (21)
- （ａ）手術によって除去された試験胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）手術によって除去された正常の胃組織において、ＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ， ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）手術によって除去された試験胃組織において、ＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）手術によって除去された正常の胃組織において、ＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌であるかどうかを判定する段階を含むことを特徴とする胃癌診断方法。 - 前記遺伝子の発現量を実時間ＲＴ−ＰＣＲまたは競争的ＲＴ−ＰＣＲを通じて特定することを特徴とする請求項１記載の胃癌診断方法。
- （ａ）手術によって除去された試験転移性胃癌組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｂ）手術によって除去された原発癌性胃組織において、ＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌高発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｃ）手術によって除去された試験転移性胃癌組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、
（ｄ）手術によって除去された原発癌性胃組織において、ＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の転移性胃癌低発現遺伝子の発現量またはタンパク質の量を測定する段階、および
（ｅ）前記（ａ）によって得られた測定値を前記（ｂ）で得られた測定値と比較し、前記（ｃ）によって得られた測定値を前記（ｄ）で得られた測定値と比較して胃癌が転移されたかどうかを判定する段階を含むことを特徴とする転移性胃癌診断方法。 - 前記遺伝子の発現量を実時間ＲＴ−ＰＣＲまたは競争的ＲＴ−ＰＣＲを通じて測定することを特徴とする請求項３記載の転移性胃癌診断方法。
- 胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマー、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
- 前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項５記載の胃癌診断キット。
- 胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブ、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする胃癌診断キット。
- 前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項７記載の胃癌診断キット。
- 前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項７または８記載の胃癌診断キット。
- 胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする胃癌診断キット。
- 抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項１０記載の胃癌診断キット。
- 転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子のセンスおよびアンチセンスプライマーを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
- 前記プライマーが１５ｂｐ以上のＤＮＡであることを特徴とする請求項１２記載の転移性胃癌診断キット。
- 転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブと、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子に相補的なプローブを含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
- 前記プローブを用いたハイブリダイゼーション反応を通じて前記遺伝子の発現量を測定することを特徴とする請求項１４記載の転移性胃癌診断キット。
- 前記プローブが２００〜１０００ｂｐであることを特徴とする請求項１４または１５記載の転移性胃癌診断キット。
- 転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
- 抗原−抗体結合反応を通じて前記タンパク質の発現程度を測定することを特徴とする請求項１７記載の転移性胃癌診断キット。
- 転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質を認識する抗体を含むことを特徴とする転移性胃癌診断キット。
- 胃癌特異的高発現遺伝子であるＥＥＦＡ１Ａ，ＴＵＢＡ６，ＦＫＢＰ１Ａ，ＰＫＭ２，ＬＤＨＡ，ＲＰＬ４，ＡＲＦ１，ＳＵＲＦ４，ＫＲＴ８，ＧＡＰＤ，ＨＳＰＣＢ，ＰＧＫ１，ＨＭＧＩＹ，Ｋ−ＡＬＰＨＡ−１，ＦＴＨ１，ＨＳＰＡ８，ＳＨ３ＧＬＢ２，ＡＣＴＢ，ＨＳＰＣＡ，ＴＭＳＢ４Ｘ， ＰＹＣＲ１，ＡＴＦ４，ＪＵＮ，ＨＳＰＢ１およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質、および胃癌特異的低発現遺伝子であるＩＧＫＣ，ＣＤ７４，ＬＯＣ１３１１７７（ＦＡＭ３Ｄ），ＡＧＲ２，ＩＭＡＧＥ：４２９６９０１（pepsin A）およびこれらの混合物からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
- 転移性胃癌特異的高発現遺伝子であるＧＡＤＤ４５Ｂ，ＪＵＮ，ＨＭＧＩＹ，ＧＳＴＰ１，ＬＭＮＡ，ＥＳＲＲＡ，ＰＬＫ，ＣＤ４４およびＩＧＦＢＰ３からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質と、転移性胃癌特異的低発現遺伝子であるＰＫＭ２，ＦＫＢＰ１Ａ，ＫＲＴ８，ＴＭＳＢ４Ｘ，ＧＡＰＤ，ＡＴＰ５Ａ１，ＰＴＭＡ，ＣＡＬＭ２およびＮＥＴ１からなる群から選ばれる一つ以上の遺伝子によってコードされるタンパク質に試験化合物を結合させ、試験化合物が前記タンパク質の作用を促進または抑制するかを確認することを特徴とする転移性胃癌抑制剤のスクリーニング方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020030038034A KR100643046B1 (ko) | 2003-06-12 | 2003-06-12 | 위암 특이적 유전자들의 발현정도 측정을 통한 위암 진단키트 |
| KR1020030084001A KR100588471B1 (ko) | 2003-11-25 | 2003-11-25 | 전이성 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 전이성 위암진단 킷트 |
| PCT/KR2004/000677 WO2005001126A1 (en) | 2003-06-12 | 2004-03-25 | Detection kit for gastric cancer and metastatic gastric cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2006526998A true JP2006526998A (ja) | 2006-11-30 |
Family
ID=33554571
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2006516902A Pending JP2006526998A (ja) | 2003-06-12 | 2004-03-25 | 胃癌および転移性胃癌診断キット |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2006526998A (ja) |
| WO (1) | WO2005001126A1 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010507809A (ja) * | 2006-10-23 | 2010-03-11 | ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション | がん感受性についてのバイオマーカー及びその用途 |
| JP2011521239A (ja) * | 2008-05-21 | 2011-07-21 | 標揚 林 | 検体分類の正確性を向上する方法及び試薬キット |
| JP2016516421A (ja) * | 2013-04-05 | 2016-06-09 | ユニバーシティ−インダストリー・ファンデーション・ヨンセイ・ユニバーシティ | 局所進行性胃癌に対する予後予測システム |
Families Citing this family (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7795419B2 (en) * | 2004-05-26 | 2010-09-14 | Rosetta Genomics Ltd. | Viral and viral associated miRNAs and uses thereof |
| US8535914B2 (en) | 2005-01-21 | 2013-09-17 | Canon Kabushiki Kaisha | Probe, probe set and information acquisition method using the same |
| EP1910557A2 (en) * | 2005-04-07 | 2008-04-16 | Chiron Corporation | Cancer-related genes |
| US20070207467A1 (en) * | 2006-03-01 | 2007-09-06 | Ming Xu | Detection of lymph node metastasis from gastric carcinoma |
| JP5673641B2 (ja) * | 2006-09-26 | 2015-02-18 | 東レ株式会社 | 免疫誘導剤及びその用途 |
| JP5379350B2 (ja) | 2007-01-15 | 2013-12-25 | シスメックス株式会社 | 胃がんのリンパ節転移の判定を補助する方法。 |
| DE102007048636B4 (de) | 2007-10-02 | 2012-05-24 | Eberhard-Karls-Universität Tübingen Universitätsklinikum | Marker zur Diagnose von Krebs |
| KR100982186B1 (ko) * | 2010-01-21 | 2010-09-14 | 전남대학교산학협력단 | 신규한 종양 항원 단백질 ａｇｒ２ 및 이의 종양 항원성 펩티드 |
| CN102844435B (zh) * | 2010-02-22 | 2017-05-10 | 库尔纳公司 | 通过抑制吡咯啉‑5‑羧酸还原酶1(pycr1)的天然反义转录物而治疗pycr1相关疾病 |
| US20130011865A1 (en) | 2010-03-03 | 2013-01-10 | Michimoto Kobayashi | Marker for detecting gastric cancer and method for detecting gastric cancer |
| JP5670422B2 (ja) | 2010-03-03 | 2015-02-18 | 東レ株式会社 | 胃癌検出用マーカー及び胃癌検出方法 |
| US10648035B2 (en) | 2012-11-26 | 2020-05-12 | The Johns Hopkins University | Methods and compositions for diagnosing and treating gastric cancer |
| CN103290134B (zh) * | 2013-06-21 | 2015-04-22 | 中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所 | 牛actb基因转录水平荧光定量pcr检测试剂盒 |
| CN103884812A (zh) * | 2014-03-26 | 2014-06-25 | 昆山洛丹伦生物科技有限公司 | 一种电子元器件塑料部件中多氯化萘的检测方法 |
| WO2016181979A1 (ja) * | 2015-05-13 | 2016-11-17 | 国立大学法人名古屋大学 | Ｓｙｔ７・ｍｆｓｄ４・ｅｔｎｋ２発現量による胃癌肝転移の検査方法、検査キット、分子標的治療薬スクリーニング方法、医薬組成物 |
| CN106093429A (zh) * | 2016-06-02 | 2016-11-09 | 滨州医学院 | 一种检测胃癌组织的试剂盒 |
| CN108728539A (zh) * | 2018-06-05 | 2018-11-02 | 浙江大学 | 一种HoxD10基因在胃癌中的应用 |
| KR20210121505A (ko) * | 2020-03-30 | 2021-10-08 | 한국원자력의학원 | 미세플라스틱 노출에 의해 유도되는 암 악성화 예후 예측용 바이오마커 조성물 |
| CN112522412A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-03-19 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 检测生物标志物的试剂、产品及其在疾病中的应用 |
| CN113265462A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-08-17 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 与胃癌相关的基因及其应用 |
| CN113278694A (zh) * | 2020-12-30 | 2021-08-20 | 北京泱深生物信息技术有限公司 | 一种以生物标志物作为检测靶标的产品及其应用 |
| CN116516008B (zh) * | 2023-05-04 | 2024-05-07 | 中国中医科学院望京医院(中国中医科学院骨伤科研究所) | 胃粘膜肠上皮化生标志物jun及其应用 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007770A2 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-22 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for diagnosis of intestinal-type gastric tumors |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH10504188A (ja) * | 1994-07-21 | 1998-04-28 | アイシス・イノベーション・リミテッド | 診断方法およびプローブ |
| US6783933B1 (en) * | 1999-09-15 | 2004-08-31 | The Johns Hopkins University School Of Medicine | CACNA1G polynucleotide, polypeptide and methods of use therefor |
| WO2001077385A1 (fr) * | 2000-04-11 | 2001-10-18 | Takara Bio Inc. | Procede servant a detecter le cancer |
-
2004
- 2004-03-25 WO PCT/KR2004/000677 patent/WO2005001126A1/en active Application Filing
- 2004-03-25 JP JP2006516902A patent/JP2006526998A/ja active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004007770A2 (en) * | 2002-07-10 | 2004-01-22 | Oncotherapy Science, Inc. | Method for diagnosis of intestinal-type gastric tumors |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2010507809A (ja) * | 2006-10-23 | 2010-03-11 | ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション | がん感受性についてのバイオマーカー及びその用途 |
| JP2011521239A (ja) * | 2008-05-21 | 2011-07-21 | 標揚 林 | 検体分類の正確性を向上する方法及び試薬キット |
| JP2013029519A (ja) * | 2008-05-21 | 2013-02-07 | Biaoyang Lin | 検体分類の正確性を向上する方法及び試薬キット |
| JP2016516421A (ja) * | 2013-04-05 | 2016-06-09 | ユニバーシティ−インダストリー・ファンデーション・ヨンセイ・ユニバーシティ | 局所進行性胃癌に対する予後予測システム |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2005001126A1 (en) | 2005-01-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2006526998A (ja) | 胃癌および転移性胃癌診断キット | |
| Okugawa et al. | Enhanced AZIN1 RNA editing and overexpression of its regulatory enzyme ADAR1 are important prognostic biomarkers in gastric cancer | |
| Deacu et al. | Activin type II receptor restoration in ACVR2-deficient colon cancer cells induces transforming growth factor-β response pathway genes | |
| Ross et al. | HER-2/neu testing in breast cancer | |
| WO2010064702A1 (ja) | 癌の予後を予測するためのバイオマーカー | |
| US20110224313A1 (en) | Compositions and methods for classifying lung cancer and prognosing lung cancer survival | |
| EP1358349A2 (en) | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets | |
| WO2008058384A1 (en) | Materials and methods for prognosing lung cancer survival | |
| Wentzensen et al. | Identification of differentially expressed genes in colorectal adenoma compared to normal tissue by suppression subtractive hybridization | |
| Saleh et al. | Comparative analysis of triple-negative breast cancer transcriptomics of Kenyan, African American and Caucasian Women | |
| KR100643046B1 (ko) | 위암 특이적 유전자들의 발현정도 측정을 통한 위암 진단키트 | |
| EP1980627A1 (en) | Method of determining a chemotherapeutic regime and survival expectancy for non small cell lung cancer based on EGFR/CSF-1/CA IX expression | |
| JP7150018B2 (ja) | 新規なｃｉｐ２ａバリアント及びその使用 | |
| JP2007275054A (ja) | 胃癌腫のリンパ節転移の検出 | |
| US20050064454A1 (en) | Cancer gene determination and therapeutic screening using signature gene sets | |
| US20020115057A1 (en) | Process for identifying anti-cancer therapeutic agents using cancer gene sets | |
| KR100568724B1 (ko) | 담관암 유전자 마커 및 이를 이용한 담관암 진단킷트 | |
| KR100552494B1 (ko) | 간암 유전자 마커 및 이를 이용한 간암 진단킷트 | |
| KR100588471B1 (ko) | 전이성 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 전이성 위암진단 킷트 | |
| JP7232922B2 (ja) | 抗癌剤反応性予測用バイオマーカーおよびその用途 | |
| EP1682679B1 (en) | Molecular marker | |
| KR20170106084A (ko) | 사이클린(Cyclin) D1 b 를 이용한 갑상선암의 진단 방법 | |
| KR20200001583A (ko) | 신장암 환자의 예후 진단 및 치료 전략 결정용 성별 특이적 마커 | |
| KR100645979B1 (ko) | 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단킷트 | |
| US20020165180A1 (en) | Process for identifying anti-cancer therapeutic agents using cancer gene sets |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090113 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090413 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090420 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20090713 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20090810 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091210 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100127 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100203 |
|
| A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A911 Effective date: 20100208 |
|
| A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A912 Effective date: 20100305 |