KR100588471B1

KR100588471B1 - 전이성 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 전이성 위암진단 킷트

Info

Publication number: KR100588471B1
Application number: KR1020030084001A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 김용성; 이주연; 오정화; 박홍석; 안희영; 윤선영; 한윤수; 김상수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-11-25
Filing date: 2003-11-25
Publication date: 2006-06-09
Also published as: KR20050050295A

Abstract

본 발명은 전이성 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 전이성 위암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 전이성 위암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 측정하여 암 전이를 통한 암의 악성 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 전이성 위암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

전이성 위암, 유전자 마커, 고발현, 저발현, 진단 킷트

Description

전이성 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 전이성 위암 진단 킷트{DETECTION KIT FOR METASTATIC GASTRIC CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF METASTASIS-RELATED GENES}

도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,

도 2는 각종 시료에서 전이성 위암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적(competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다.

위암은 전세계적으로 발생빈도가 높은 암 중 하나로 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다[Parkin 등, Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut 등, Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996; Parkin, Lancet Oncol. 2: 533-543, 2001]. 그러나, 실제 암 환자들 중 원발암(primary tumor)의 상태에서 사망하는 것보다 약 90% 정도의 환자가 전이암으로 악화된 후 사망에 이르고 있다. 또한, 위암 진단 마커에 대한 연구는 지속적인 위암치료와 진단 기술의 연구를 통하여 많은 향상이 있었으나, 위 혈장까지 침윤이 일어난 전이성 위암의 진단에 관한 연구는 아직 미비하다[Yamazaki 등, Cancer 63: 613-617, 1989; Shimada 등, Cancer 1: 1657-1668, 1999]. 기존의 연구에 따르면 암의 전이(metastasis)는 몇몇 특정 유전자들의 역할들로 인해 이루어지는 것이 아니라 암의 악성화가 진행되면서 발생하는 세포내 다양한 신호전달과 조절기작에 관여하는 많은 유전자들의 복합적인 상호작용에 의한 것임을 알 수 있다[Fang, Chin. Med. J., 81: 193-194, 2001]. 따라서 몇몇 특정한 유전자들에 중점을 두고 전이 기작을 연구하는 것 보다 원발암성 위암과 전이성 위암 세포주들 사이의 다량의 유전자 발현정도를 비교 분석하여 위암 전이에 관련된 새로운 유전자들을 발굴하는 연구는 매우 중요한 의미가 있는 것이다. 이와 같이 암의 전이는 다양한 유전자들과 이들 유전자들의 발현 및 조절기작이 복합적으로 연관되어 전이가 진행되므로 현재까지 위암 전이기작은 분명하게 밝혀져 있지 않다. 원발암성 위암이 전이가 이루어지는 악성종양으로 진행되는 과정에 관련된 유전자를 보면 최근에 들어 다량의 유전자를 사용한 cDNA 마이크로어레이나 유전자 칩으로 전이에 연관된 유전자들의 발현율을 비교하여 위암 전이의 새로운 진단이나 치료의 마커를 발굴하기 위한 연구가 이루어지고 있다[Sakakura 등, Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002; Wang 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002]. 기존의 보고에 따르면 암세포의 이동(migration), 침윤(invasion) 그리고 전이(metastasis)에 중요한 역할을 수행하는 부착수용체(adhesion receptor)인 E-카드헤린(cadherin) 수용체와 α-카테닌(catenin) 단백질의 감소가 위암의 탈분화와 림프절 전이에 관여한다는 보고가 있으며[Streit 등, J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996], CD44 수용체의 다양한 변이체들 중 CD44-6v 변이체의 과발현은 위암 세포가 림프절로의 전이를 일으키는데 중요한 역할을 한다고 보고되어 있다[Streit 등, Recent Results Cancer Res. 142: 19-50, 1996]. 세포의 성장인자로 잘 알려져 있는 EGF(epidermal growth factor)와 EGF-수용체(EGFR), 그리고 c-erbB-2의 과발현은 위암조직에서 병리학적으로 위암세포의 위벽 침윤과 림프절 전이에 상관한다고 보고되어 있다[Tokunaga 등, Cancer 75: 1418-1425, 1995]. 또한, Sakakura 등은 21,168개 유전자로 이루어진 고밀도의 cDNA 마이크로어레이를 이용해 원발암성 위암 세포와 전이가 이루어진 복수세포에서 유래한 세포주간의 발현형태를 비교, 분석한 후 보고하였으며 CD44, 케라틴 7, 케라틴 8, 케라틴 14, 알데하이드 디하이드로게나제(aldehyde dehydrogenase), CD9, IP3 수용체 타입 3, IL-2 수용체 γ, IL-4 Stat, p27 그리고 인테그린 β4 유전자들의 발현이 위암 전이에 관여한다는 사실을 보고한 바 있다[Sakakura 등, Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002]. 그러나, 기존의 대부분의 연구가 단일 유전자 혹은 몇몇 전이에 관련된 유전자들의 기능만을 연구한 것이 사실이며, 최근에 들어 암의 전이과정에 관련된 세포내 신호전달(signal transduction), 세포사멸(apoptosis), 세포부착(cell adhesion) 등에 관여하는 수많은 유전자들의 비교, 분석이 이루어지고 있다[Sakakura 등, Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002; Wang 등, J. Cancer Res. Clin. Oncol. 128: 547-553, 2002; Weiss 등, Oncogene 22: 1872-1879, 2003]. 따라서, 정확한 유전자를 이용한 진단에는 보다 많은 새로운 유전자들의 검색과 확인이 이루어져야 한다.

본 발명에서 사용한 위암 세포주들은 Park 등이 원발암성 위암(primary gastric cancer)으로부터 만든 SNU-1, SNU-484, SNU-719, SNU-520 세포들과 위암이 악성화된 후의 복수세포로부터 만든 전이성 위암 세포주인, SNU-5, SNU-16, SNU-601, SNU-620, SNU-638, SNU-668 세포들이다[Park 등, Cancer Res. 50: 2773-2780, 1990; Park 등, Int. J. Cancer 70: 443-449, 1997]. 현재까지 SNU 세포주를 이용한 연구가 광범위하게 이루어지고 있으며 SNU 세포주들간의 특이적인 발현을 보이는 유전자에 관한 연구 또한 많이 진행되었다. 특히, SNU-16 세포에서는 c-met 발암유전자의 발현이 증가되어있고 SNU-1, SNU-5 그리고 SNU-16 세포들에서는 TGF-β형 II 수용체, CEA, CA19-9 및 c-erbB 2 유전자가 과발현되고 있음이 보고되어 있다[Hara 등, Lab. Invest. 78: 1143-1153, 1998; Park 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 8772-8776, 1994; Bae 등, J Korean Med. Sci. 8: 153-159, 1993]. 그러나, 여러 세포주에서 동일하게 유전자 발현의 변화를 보이는 것은 아직까지 규명되지 않았다. 따라서, 몇 종류들의 원발암성 위암 세포주들과 악성화된 전이성 위암 세포주들에서 유전자의 발현이 최대한 유사한 변화를 보이는 유전자들을 선정하여 위암 전이 마커로서의 가능성을 확인하였다.

인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 "EST(expressed sequence tag) 수집"은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴[Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999], 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석[Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res. 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998]이 가능하다고 보고되고 있다. 따라서, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 위암 전이와 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 위암의 악성화 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이고 나아가 전이성 위암의 진단이 가능하게 될 것이다.

본 발명에서는 9종의 전이성 위암 고발현 유전자와 9종의 전이성 위암 저발현 유전자가 발굴되었으며, 이들 중 CD44의 과발현은 이미 위암 세포의 림프절 전이와 악성화에 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다[Streit 등, J. Mol. Med. 74: 253-268, 1996; Joo 등, Anticancer Res. 23: 1581-1588, 2003]. 반면에 세포부착물질로 알려져 있고 세포의 침윤과 관계가 있다고 알려져 있는 케라틴 8은 본 발명의 결과에서는 발현이 줄어드는 유전자로 규명되었으나 Sakakura 등은 발현이 증가하는 유전자로서 분류를 하였다[Sakakura 등, Br. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002]. 이는 본 발명에서 사용한 원발암성 위암 세포주의 종류가 다양하여 다른 결과를 나타내기는 하나 실제 Sakakura 등의 연구 결과에서처럼 본 발명의 실험에서도 SNU-16 세포주에서만은 케라틴 8 유전자의 발현이 원발암성 위암 세포주들보다 높게 나타나고 있음을 보여주고 있다. 이외의 다른 유전자들은 위암의 전이와 관련성이 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. 우선 전이성 위암 세포주에서 발현이 증가하는 유전자들 중 GADD45b(growth arrest and DNA-damage-inducible gene 45beta)는 세포사멸시 과발현되는 신호전달 물질로서 최근에 간암세포주에서 정상적인 간세포에 비해 GADD45b 유전자의 발현이 현저히 낮음이 보고되어 기존에 보고되어 있지 않은 암화기작에 있어 연관성을 시사하고 있다[Abdollahi 등, Oncogene 6: 165-167, 1991; Qiu 등, Am. J. Pathol. 162:1961-1974, 2003]. JUN (v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian))은 원종양유전자(proto-oncogene) 중 하나로 세포내 신호전달물질로서 AP-1이라는 전사활성인자를 조절하여 세포증식에 관련한다[Shaulian 등, Nat. Cell. Biol. 4: E131-136, 2002]. 따라서, 기존에 여러 암세포에서 이 유전자의 발현이 증가하고 있음을 보고한 바 있고 특히 유방암, 난소암, 혈액암, 골육종 등의 악성종양에 관련이 있다고 보고되어 있다[Selvamurugan 등, Mol. Cell. Biol. Res. Commun. 3: 218-223, 2000; Volm 등, Clin. Exp. Metastasis 14: 209-214, 1996; Rossi 등, Int. J. Cancer 57: 86-89, 1994; Honoki 등, Mol. Carcinog. 7: 111-115, 1993]. 그러나, 위암 전이 기작과 연관성이 있다는 보고는 아직 알려진 바 없다. HMGIY(high mobility group protein isoforms I and Y)는 DNA 결합 전사조절인자로서 이 유전자가 위치한 염색체 6p21.3 지역의 비정상(abnomality)이 양성 간엽 종양에서 확인되었다는 보고가 있다[Kazmierczak 등, Genes Chromosomes Cancer 23: 279-285, 1998]. 그러나, 아직까지 HMGIY 유전자의 발현이 다른 종양이나 종양의 악성화에 관련한다는 보고는 되어 있지 않다. GSTP1(Glutathione S-transferase P1)은 여러 종류의 발암원(carcinogen)들의 해독(detoxification)에 관여하는 GST(Glutathione S-transferase) 효소 중 하나로 폐암, 위암, 유방암 등 여러 암에서 발현량이 증가하는 효소로 알려져 있고, 특히 이 유전자의 메틸화(methylation)가 위암의 암화기전과 밀접한 관련이 있음이 최근에 보고되었다[Howie 등, Carcinogenesis 11: 451-458, 1990; Kang 등, Lab. Investigation 83: 635-641, 2003]. LMNA(Lamin A/C) 유전자는 핵막 단백질의 하나로 암화 기전에서의 기능은 밝혀진 바가 거의 없다[Wydner 등, Genomics 32: 474-478, 1996]. ESRRA(Estrogen-related receptor alpha) 유전자는 인간의 생식과 뼈 형성에 중요한 호르몬인 에스트로겐의 막 수용체로서 에스트로겐 신호전달 기전에 필수단백질이다[Giguere, Trends Endocrinol. Metab. 13: 220-225, 2002]. 그리고 최근에 악성화된 유방암 환자들의 치료 타겟 물질로서 ESRRA가 가능성이 있음을 보고한 연구도 있다[Ariazi 등, Cancer Res. 62: 6510-6518, 2002]. PLK(Polo-like kinase)는 세린-트레오닌 인산화효소로서 세포분열(mitosis)의 정확한 조절에 필요한 효소이며 인체의 폐암, 머리 및 목암 그리고 대장암에서 이 유전자 및 단백질의 발현이 증가하고 있음을 보고하였다[Wolf 등, Oncogene 14: 543-549, 1997; Knecht 등, Cancer Res. 59: 2794-2797, 1999; Takahashi 등, Cancer Sci. 94: 148-152, 2003]. IGFBP3(insulin-like growth factor binding protein 3)은 세포분열과 사멸을 조절하는 IGF(Insulin-like growth factor) 신호전달체계에서 중요한 단백질이며 여러 암환자의 혈청내에 IGFBP3 단백질의 증가는 실제 암의 진행을 진단하는데 중요한 단백질이다[Deal 등, J. Clin. Endoclinol. Metab. 86: 1274-1280, 2001; Furstenberger 등, Lancet Oncol. 3: 298-302, 2002].

위에서 언급한 유전자들은 위암 전이가 이루어진 복수세포로 만든 세포주에서 원발암성 위암에서 보다 발현이 증가한 유전자들이다. 이들 중 대부분의 유전자들이 암과 관련있는 유전자임을 증명하는 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 실제 이들 유전자들이 위암이나 또는 위암 전이과정에 있어 기능적인 관련연구는 거의 이루어지지 않은 실정이다.

이외에도 본 발명에서는 위암 전이가 진행되면서 발현이 감소하는 유전자들을 선별하여 위암 전이의 진단 마커로 사용하고자 하였다. 저발현 유전자로는 실제 위암 세포주들과 위암 조직에서 그 발현이 증가하는 유전자로서 이미 보고된 FKBP1A(FK506 binding protein 1A)와 TMSB4X(thymosin, beta 4, X chromosome)는 세포골격의 구성에 중요한 역할을 하며, PKM2(pyruvate kinase, muscle)와 GAPD(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)은 당분해 경로의 효소로 알려져 있는데 위암이 악성화 되면서 그 발현이 감소하는 현상을 보였다. KRT8(Keratin 8)은 기존의 보고에 따르면 세포 이동(cell migration)과 세포 침윤(cell invasiveness)에 관련이 있는 결합 단백질이다[Martens 등, Cancer 87: 87-92, 1999; Sakakura 등, Bri. J. Cancer 87: 1153-1161, 2002]. 그러나, 본 발명에서는 저발현 유전자로 확인되었다. PTMA(prothymosin-alpha)는 세포분열에 관련된 핵단백질로서 c-myc 전사조절인자에 의해 발현이 조절되는 유전자로서 위암이나 전이에 관련된 연구는 보고된 바가 없다[Szabo 등, Hum. Genet. 90: 629-634, 1993; Haggerty 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 5313-5318, 2003]. ATP5A1(ATP synthase alpha subunit)은 미토콘드리아에 위치하는 효소로서 에너지 대사에 관여하며 CALM2(calmodulin 2)는 칼슘 신호전달에 중요한 역할을 하는 단백질로서 특정암과의 관련 여부는 보고된 바가 없다. NET1(neuroepithelial cell transforming gene 1)은 1996년에 Chan 등이 규명한 새로운 원발암 유전자(proto-oncogene)로서 아직까지 많은 연구가 이루어지지 않은 상태이며 최근에 자궁경부암 세포의 분열에 NET1 유전자의 발현이 관련됨이 보고되었다[Chan 등, Oncogene 12: 1259-1266, 1996; Wollscheid 등, Int. J. Cancer 99: 771-775, 2002].

이에, 본 발명자들은 위암 세포주 및 위암 전이가 이루어진 복수 세포주의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 위암 전이와 관련있는 고발현 또는 저발현되는 유전자를 찾아내고 경쟁 적 RT-PCR 방법(competitive RT-PCR)에 의해 전이성 위암의 고발현 유전자와 전이성 위암의 저발현 유전자를 확인하여 악성화된 위암을 진단할 수 있는 새로운 전이성 위암 마커를 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 전이성 위암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 전이성 위암 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 전이성 위암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 전이성 위암 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 전이성 위암 특이적 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44, IGFBP3, PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 악성화된 위암 전이를 진단하는 전이성 위암 진단방법 및 진단킷트를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 악성화된 위암 전이를 진단하는 전이성 위암 진단킷트에 관한 것이다.

본 발명의 전이성 위암 마커 유전자는 전이성 위암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머와 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1 로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.

또한, 본 발명의 진단킷트는 전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.

또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있고, β1,6-N-아세틸글루코사민 당쇄가지 변화를 측정하기 위하여 L4-PHA를 포함한다.

상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색 기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

본 발명에서 확인된 전이성 위암 마커 유전자의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같다.

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
GADD45B	1121	101, 586	19p13.3	NM_015675
JUN	3254	975, 1970	1p32-p31	NM_002228
HMGIY	1978	308, 631	6p21	NM_145904
GSTP1	737	30, 662	11q13	NM_000852
LMNA	2032	213, 1931	1q21.2-q21.3	NM_005572
ESRRA	2221	178, 1449	11q13	NM_004451
PLK	2204	54, 1865	16p12.3	NM_005030
CD44	3091	179, 2407	11p13	NM_000610
IGFBP3	2506	88, 963	7p13-p12	NM_000598
PKM2	2287	110, 1705	15q22	NM_002654
FKBP1A	1578	104, 430	20p13	NM_000801
KRT8	1752	60, 1511	12q13	NM_002273
TMSB4X	556	78, 212	Xq21.3-q22	NM_021109
GAPD	1283	76, 1083	12p13	NM_002046
ATP5A1	1883	59, 1720	18q12-q21	NM_004046
PTMA	1233	182, 514	2q35-q36	NM_002823
CALM2	1128	69, 518	2p21	NM_001743
NET1	3236	147, 1775	10p15	NM_005863

본 발명에서는 4종의 원발암성 위암 세포주(SNU-1, SNU-484, SNU-719, SNU-520)와 6종의 악성화된 위암 세포주로부터 전이된 복수 세포주(SNU-5, SNU-668, SNU-16, SNU-620, SNU-638, SNU-601)를 사용하여 총 10종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 39,315개의 EST 염기 배열을 결정하고 원발암성 위암 세포주 시료와 악성화된 위암 세포로부터 전이된 복수 세포주 시료에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 전이성 위암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 높은 9종의 전이성 위암 고발현 유전자(GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44, IGFBP3)와 발굴 빈도가 낮은 9종의 전이성 위암 저발현 유전자(PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2, NET1)를 각각 선별하여 전이성 위암 마커 유전자를 찾아내었다.

유전자 발굴빈도 분석에 사용된 원발암성 위암 세포주 시료 및 전이성 위암 세포주 시료에서 본 발명의 9종의 전이성 위암 고발현 유전자와 9종의 전이성 위암 저발현 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 전이성 위암 고발현 유전자는 전이성 위암 세포주 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 전이성 위암 저발현 유전자는 전이성 위암 세포주 시료에서 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 전이성 위암 마커 유전자들과 위암 전이와의 관련성이 확인되었다.

따라서, 전이성 위암 특이적 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44, IGFBP3, PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2, NET1의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 위암 전이를 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 전이성 위암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하여 전이성 위암을 진단하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,

(a) 시험 전이성 위암 조직에서 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 전이성 위암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(b) 원발암성 위 조직에서 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 전이성 위암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(c) 시험 전이성 위암 조직에서 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 전이성 위암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(d) 원발암성 위 조직에서 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 전이성 위암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 위암 전이 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

본 발명의 18종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 18종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 서열번호 7 내지 42에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 18종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 18종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 18종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 18종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 18종의 종양 전이 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 위암 전이 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 9종의 전이성 위암 고발현 유전자와 9종의 전이성 위암 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 18종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991)등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 18종의 위암 전이 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 전이성 위암 진단에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 전이성 위암 진단킷트는 상기 위암 전이 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에 는 18종 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 18종의 전이성 위암 마커 유전자는 전이 유전자 또는 전이 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 18종의 전이성 위암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴 브로팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 원발암성 위암 세포주 및 전이성 위암 세포주으로부터 총 RNA 분리

10% 소혈청(Fetal Bovine Serum)[Gibco BRL 사], 페니실린(10000 U/ml)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 RPMI1640[Jeil Biotech 사] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 위암 세포주인 SNU-1, SNU-484, SNU-719, SNU-520, SNU-5, SNU-668, SNU-16, SNU-620, SNU-638, SNU-601[한국세포주은행]을 디쉬당 세포가 5 ㅧ10⁶이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 배양을 하였다. 세포의 총 RNA는 QIAGEN 키트(RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 15 ㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2 ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다.

실시예 2: EST 발굴 빈도에 의한 전이성 위암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별

악성화된 전이성 위암에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 원발암성 위암 세포주와 전이성 위암 세포주에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 전이성 위암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.

1) cDNA 라이브러리의 제조

상기 실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100 ㎍을 BAP 효소 반응액[100Mm Tris-Hcl(pH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin(promega사)]에서 3U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase)[TakaRa사] 효소로 처리하고, 이어 TAP[Waco사] 효소 반응액[50 mM sodium acetate(pH 5.5), 1mM EDTA, 2mM DTT, 80U Rnasin (promega사)]에서 100U의 TAP(Tabbaco acid pyrophosphatase) 효소를 반응시켰다. 그 후, 50 mM 트리스-HCl(pH 7.5), 5mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.5mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호 1의 올리고리보뉴클레오티드 40 pmole, 250U RNA 리가제[TakaRa사]의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.

이상의 반응을 처리한 총 RNA로부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 [QIAGEN사]를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호 2의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1^st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 [Perkin Elmer사]를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단(서열번호: 3)과 3'-말 단의

올리고머(서열번호: 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F'[Invitrogen사] 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다.

본 방법에 의해 4종의 원발암성 위암 세포주 cDNA 라이브러리와 6종의 전이성 위암 세포주 cDNA 라이브러리를 제조하였다[표 2].

2) cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린(100 ㎍/㎖)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96웰 플라스미드 프렙 시스템(plasmid prep system)으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다.

결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 유니진(UniGene) 데이터베이스(Hs.seq.all, build#151)에서 수행하였다.

SNU-1 세포주로부터 각기 다른 실험자들에 의해 제작된 3종류의 SNU-1 cDNA 라이브러리를 포함하여 총 12종의 cDNA 라이브러리에서 약 39,315개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 유니진 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 15,242종의 유전자가 발굴되었다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 상기 표 2에 나타낸 바와 같다.

3) 유전자 발굴 빈도 분석

6종의 원발암성 위암 세포주 cDNA 라이브러리를 대조군으로 하고 6종의 전이성 위암 세포주 cDNA 라이브러리는 위암 시료로 하여 크게 2가지로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한, 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다.

상기와 같은 분석에 의해 전이성 위암 세포주 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 9종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 9종이 각각 선별되었다[도 1].

실시예 3: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석

원발암성 위암 세포주 시료와 전이성 위암 세포주 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 9종의 전이성 위암 고발현 유전자와 9종의 전이성 위암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.

1) 역전사 효소 반응

상기 실시예 1에서 분리한 총 10종의 총 RNA에서 각각 5 ㎍을 사용하여 다음 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 10종의 1st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)	1㎕
5X first-strand buffer	4㎕
10mM dNTP 혼합물	1㎕
0.1M DTT	2㎕
RNaseOUT (40 U/㎕)	1㎕
역전사효소 (200 U/㎕)	1㎕
총 RNA (5 ㎍)	X㎕
증류수	(10-X)㎕
총부피	20㎕

2) 경쟁적(competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

① 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 B2M 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.

B2M 경쟁 DNA는 3 ㎕의 pCNS 벡터 DNA (2ng), 10 ㎕의 5 ㅧPCR premix[바이 오니아 사], 1 ㎕의 5' 프라이머(20pmole: 서열번호 5), 1 ㎕의 3'프라이머 (20pmole: 서열번호 6), 35 ㎕의 증류수를 함유한 50 ㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하여 제조하였다. 이때 PCR 반응의 조건은 94 ℃ 30초, 50 ℃ 30초, 72 ℃ 30초로 30회 수행하였으며, B2M 경쟁 DNA인 PCR 산물의 길이는 322 bp였다.

조제한 B2M 경쟁 DNA를 7/10⁸, 1/10⁷, 3/10⁷, 7/10⁷, 1/10⁶, 3/10⁶의 6 단계로 희석 한 후, 2 ㎕를 상기 1)의 역전사 효소 반응액(역전사 반응에 사용된 RNA의 10 ng에 해당되는 양)과 각각 혼합한 후, 4 ㎕의 5 ㅧTaq DNA 중합효소 혼합액, 2 ㎕의 B2M 프라이머(5 pmole/㎕)(서열번호 5 및 6), 8 ㎕의 증류수를 함유한 총 20 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때 PCR 반응 조건은 94℃ 40초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.

PCR 산물을 3% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분 전기영동한 후, Frog^TM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사]을 이용하여, 두 밴드(B2M 경쟁 DNA에서는 322 bp, 원래 B2M유전자에서는 390 bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화 한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.

② PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 ①에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 다음 표 4의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1 분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.

9종 전이성 위암 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44, IGFBP3와 9종의 전이성 위암 저발현 유전자 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2, NET1의 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 17 ∼ 22 bp, GC 함량은 50 ∼ 70% 정도이다. 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

cDNA	5 ㎕
5X PCR 반응 mix[바이오니아 사]	3 ㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
증류수	5 ㎕
총부피	15 ㎕

경쟁적 PCR에 사용한 각 전이성 위암 마커 유전자들의 프라이머

유전자	정방향 프라이머	역방향 프라이머
GADD45B	서열번호 7	서열번호 8
JUN	서열번호 9	서열번호 10
HMGIY	서열번호 11	서열번호 12
GSTP1	서열번호 13	서열번호 14
LMNA	서열번호 15	서열번호 16
ESRRA	서열번호 17	서열번호 18
PLK	서열번호 19	서열번호 20
CD44	서열번호 21	서열번호 22
IGFBP3	서열번호 23	서열번호 24
PKM2	서열번호 25	서열번호 26
FKBP1A	서열번호 27	서열번호 28
KRT8	서열번호 29	서열번호 30
TMSB4X	서열번호 31	서열번호 32
GAPD	서열번호 33	서열번호 34
ATP5A1	서열번호 35	서열번호 36
PTMA	서열번호 37	서열번호 38
CALM2	서열번호 39	서열번호 40
NET1	서열번호 41	서열번호 42

③ 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분간 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 ①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다.

그 결과를 도 2에 나타낸 바와 같고 [(a) ∼ (i)는 고발현 유전자, (j) ∼ (r) 저발현 유전자; X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, S10, S5, S7, S21은 원발암성 위암 세포주들이며 S1, S2, S3, S6, S8, S9는 전이성 위암 세포주들임. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 고발현 유전자의 발현량은 원발암성 위암 세포주에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 전이성 위암 세포주들에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것임. 각 유전자의 발현량은 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 값임.], 전이성 위암 세포주에서 발굴 빈도가 높은 고발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 전이성 위암 세포주 시료에서 높았으며, 전이성 위암 세포주에서 발굴 빈도가 낮은 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 전이성 위암 세포주 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 9종의 전이성 위암 후보 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44, IGFBP3는 위암 전이 마커로서 유용함이 확인되었으며 위암 전이 억제 유전자 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2, NET1은 전이성 위암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 악성화된 위암 전이의 진단에 유용한 마커로 원발암성 위암 세포주에서 9종의 전이성 위암 저발현 유전자와 전이성 위암 세포주에서 측정된 9종의 전이 관련 고발현 유전자가 제공되며, 상기 종양 전이 마커 유전자들은 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 위암을 비롯한 다양한 암환자들의 종양의 악성화에 따른 전이암을 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institutes of Bioscience and Biotechnology <120> Detection kit for metastatic gastric cancer by measuring the expression of metastasis-related genes <160> 42 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 31 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA oligomer <400> 1 agcaucgagu cggccuuguu ggcccuacug g 31 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> dT primer <400> 2 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5'-specific primer <400> 3 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3'-specific primer <400> 4 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying B2M <400> 5 ctcgctccgt ggccttag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying B2M <400> 6 caaatgcggc atcttcaa 18 <210> 7 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GADD45B <400> 7 gcggtggagg agctttt 17 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GADD45B <400> 8 gcgttcctga agagagatgt ag 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying JUN <400> 9 ggtatcctgc ccagtgttgt 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying JUN <400> 10 ctccagcctc ctgaaacatc 20 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying HMGIY <400> 11 gcatcccagc catcactc 18 <210> 12 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying HMGIY <400> 12 agcggagcaa agctgtc 17 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GSTP1 <400> 13 cgcacccttg ggctcta 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GSTP1 <400> 14 ctgtttcccg ttgccatt 18 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying LMNA <400> 15 aaaagcgcaa actggagtc 19 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying LMNA <400> 16 ctcatcctcg tcgtcctca 19 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ESRRA <400> 17 ggccttcgct gaggact 17 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ESRRA <400> 18 gtccatcatg gcctcgag 18 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying PLK <400> 19 acggcactga gtcctacctc 20 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying PLK <400> 20 ggaggccttg agacggtt 18 <210> 21 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying CD44 <400> 21 ggccagcaag tctcagga 18 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying CD44 <400> 22 aggcctccaa gtgggaac 18 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying IGFBP3 <400> 23 tctgcgtcaa cgctagtgc 19 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying IGFBP3 <400> 24 cgcttcctgc ctttgga 17 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying PKM2 <400> 25 atgtcgaagc cccatagtga 20 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying PKM2 <400> 26 tccacctctg cagtgcc 17 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying FKBP1A <400> 27 gctgctgtct tccgtggt 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying FKBP1A <400> 28 tgccttaggc ctcctctt 18 <210> 29 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying KRT8 <400> 29 ctgctggagg gcgagga 17 <210> 30 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying KRT8 <400> 30 cagcgcagga ggggtag 17 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying TMSB4X <400> 31 cctccgcaac catgtct 17 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying TMSB4X <400> 32 gcacgcctca ttacgatt 18 <210> 33 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying GAPD <400> 33 ccaaggctgt gggcaag 17 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying GAPD <400> 34 accaggaaat gagcttgaca 20 <210> 35 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying ATP5A1 <400> 35 atgctgtccg tgcgcgtt 18 <210> 36 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying ATP5A1 <400> 36 ccacaatggc tcctgtcc 18 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying PTMA <400> 37 atgtcagacg cagccgtag 19 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying PTMA <400> 38 gtcatcctcg tcggtcttct 20 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying CALM2 <400> 39 atggctgacc aactgactga a 21 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying CALM2 <400> 40 ctttgctgtc atcatttgta ca 22 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as forward primer of PCR for amplifying NET1 <400> 41 atggtggcac atgatgagac t 21 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleic acid used as reverse primer of PCR for amplifying NET1 <400> 42 cctgttcacc tcgggaca 18

Claims

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전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 7 내지 24로 표시되는 프라이머쌍과, 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 25 내지 42로 표시되는 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 전이성 위암 진단킷트.
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전이성 위암 특이적 고발현 유전자인 GADD45B, JUN, HMGIY, GSTP1, LMNA, ESRRA, PLK, CD44 및 IGFBP3으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질과 전이성 위암 특이적 저발현 유전자인 PKM2, FKBP1A, KRT8, TMSB4X, GAPD, ATP5A1, PTMA, CALM2 및 NET1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 전이성 위암 억제제의 스크리닝 방법.