KR100643046B1

KR100643046B1 - 위암 특이적 유전자들의 발현정도 측정을 통한 위암 진단키트

Info

Publication number: KR100643046B1
Application number: KR1020030038034A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 김용성; 이주연; 오정화; 안희영; 박홍석; 한윤수; 김상수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2003-06-12
Filing date: 2003-06-12
Publication date: 2006-11-10
Also published as: KR20040107145A

Abstract

본 발명은 위암 특이적 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1, IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA)의 발현 정도 측정을 통하여 위암을 진단하는 위암 진단키트에 관한 것으로, 위암의 진단에 매우 유용하게 사용 될 수 있다.

Description

위암 특이적 유전자들의 발현정도 측정을 통한 위암 진단 키트 {DETECTION KIT FOR STOMACH CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF STOMACH CANCER MARKER GENES}

도 1은 유전자 발굴 빈도를 분석한 것이고,

도 2는 각종 시료에서 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 실시간 RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다. (a)부터 (n)은 고발현 유전자를, (o)부터 (q)는 저발현 유전자를 나타낸다. X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, S14, S17, S18, S19는 정상 위 조직, S1, S2, S3, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S12, S13, S21은 위암 세포주이며, S20은 위암 조직이다. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 고발현 유전자의 발현량은 정상 위 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 위암 세포주 및 위암 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것이고,

도 3은 각종 시료에서 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 (competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다. (a)부터 (l)은 고발현 유전자를, (m)부터 (o)는 저발현 유전자를 나타낸다. X축은 각종 시료를 나타낸 것으로, S14, S18, S19는 정상 위 조직, S1, S2, S3, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S12, S13, S21은 위암 세포주이며, S20은 위암 조직이다. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 고발현 유전자의 발현량은 정상 위 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 위암 세포주 및 위암 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로서 나타낸 것이고,

도 4는 위암 임상시료에서 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현 정도를 경쟁적 (competitive) RT-PCR 방법을 수행하여 나타낸 것이다. (a)부터 (d)는 고발현 유전자를, (e)부터 (h)는 저발현 유전자를 나타낸다. X축은 4명의 위암 환자에서 채취한 임상시료를 나타낸 것으로, N1, N2, N3, N4는 정상 위 조직, T1, T2, T3, T4는 위암 조직이다. Y축은 각종 시료에서 표적 유전자의 발현량을 나타낸 것으로, 각 유전자의 발현량을 각종 시료에서 발현되는 B2M의 발현량으로 나눈 값이다.

본 발명은 위암 마커 유전자의 발현 정도 측정을 통하여 위암을 진단하는 진단키트에 관한 것이다.

위암은 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다 (Parkin 등, Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut 등, Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996). 위암과 관련한 유전자는 별로 보고 되고 있지 않으나, 최근 분자적 생물학적 분석으로 p53 (Yokozaki 등, Int. Rev. Cytol. 204: 49-95, 2001), β-카테닌 (박 등, Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999), E-카데린 (Berx 등, Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998), 삼엽형 인자 1(trefoil factor 1) (박 등, Gastroenterology 119: 691-698, 2000), c-met (이 등, Oncogene 19: 4947-4953, 2000)과 같은 유전자들이 위암에서 많은 유전적 변이가 있다고 보고 되고 있다. 그리고 CA11 (Yoshikawa 등, Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000; Shiozaki 등, Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001)과 위장 점막에서 합성되는 삼엽형 인자(trefoil factor)인 TFF1과 TFF2(Shiozaki 등, Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001; Kirikoshi와 KatohKirikoshi, Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002)과 같은 유전자들이 위암에서 저발현 된다는 보고도 있다. 또한, Hasegawa 등은 장 타입의 위암에서 발현되는 23,040개 유전자로 이뤄진 cDNA 마이크로어레이를 이용해 RPL10, HSPCB, LOC56287, IGHM, PGC, REGIA, RNASE1, TFF1, TFF2 유전자들의 발현이 위암 전이와 관련한다는 사실을 보고한 바 있다 (Hasegawa 등, Cancer Res. 62: 7012-7017, 2002). 그러나 이러한 유전자만으로 위암을 진단하기에는 아직 불충분하다.

인간 게놈 프로젝트의 한 연구 분야로 수행되어 온 "EST (expressed sequence tag) 수집"은 특정 조직이나 세포주에서 cDNA 라이브러리를 제조하고 여기에서 임의적으로 선별한 cDNA 클론들의 염기서열을 분석함으로써 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자를 수집하는 프로젝트이다. 이러한 EST 수집 방법을 통하여 새로운 유전자의 발굴 (Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991;Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Hillier 등, Genome Res. 6: 807-828, 1996; Marra 등, Nat. Genet. 21:191-194,1999), 특정 조직이나 세포주에서 발현되는 유전자들의 발현 패턴의 분석, 양적 분석 (Okubo 등, Nat. Genet. 2: 173-179, 1992; Adams 등, Science 252: 1651-1656, 1991; Adams 등, Nature 377:(Suppl.) 3-174, 1995; Liew 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 10645-10649, 1994; Mao 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 8175-8180, 1998; Ryo 등, Nucleic Acids Res . 26: 2586-2592, 1998; Sterky 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13330-13335, 1998)이 가능하다고 보고되고 있다. 따라서, 특정 세포내에서 특정 유전자의 발현 빈도를 분석함으로써 위암과 관련된 유전자의 발굴이 가능하며, 이를 통하여 위암 진행에 따른 분자적 메커니즘을 이해하게 될 것이며 나아가 위암의 진단이 가능하게 될 것이다.

본 발명에서는 26종의 위암 특이적 고발현 유전자와 6종의 위암 특이적 저발현 유전자가 발굴되었으며, 이들은 위암과의 관련성이 전혀 보고 되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. TUBA6 (tubulin-alpha 6 chain)은 마이크로튜불의 중요 요소이며, FKBP1A (FK506 binding protein 1A)는 골격근 근소포체의 칼슘 분비 경로의 구성 요소로서, 리아노딘(ryanodine) 수용체 동형-1(isoform-1)의 조절 기능을 지닌다. RPL4 (ribosomal protein L4)는 아직 정확한 기능이 밝혀지지 않았으며, ARF1 (ADP-ribosylation factor 1)은 GTP-binding 단백질로서 클로레라 톡신 카탈라이틱 서브유닛의 다른자리입체성 (allosteric) 활성효소로 작용한다. FTH1 (ferritin, heavy polypeptide 1)은 철분을 저장하는 세포내의 분자물질이며, SH3GLB2 (SH3-domain GRB2-like endophilin B2)는 링3 단백질과 유사하며, HSPCA (heat shock 90kDa protein 1, alpha)는 ATPase의 활성을 지닌다. TMSB4X (thymosin, beta 4, X chromosome)는 세포골격의 구성에 중요한 역할을 하며, PYCR1 (pyrroline-5-carboxylate reductase 1)은 촉매의 활성에 관여하는 것으로 전립선암과 관련 있다고 보고 되고 있다 (Ernst 등, Am. J. Pathol. 160: 2169-2180, 2002). ATF4 (activating transcription factor 4)는 tax 반응 증폭자 요소(enhancer element)이며, SURF4 (surfeit 4)는 막 단백질이다. ACTB (actin, beta), K-ALPHA-1, KRT8 (keratin 8)은 세포 구조 형성에 관여하며, LDHA (lactate dehydrogenase A), GAPD (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), PKM2 (pyruvate kinase, muscle), PGK1 (phosphoglycerate kinase 1)은 당분해 경로, HMGIY (high mobility group AT-hook 1), JUN (v-jun sarcoma virus 17 oncogene homolog (avian)), CD44 (CD44 antigen (homing function and Indian blood group system)는 신호 전달 경로, HSPA8 (heat shock 70kDa protein 8), HSPCB (heat shock 90kDa protein 1, beta), HSPB1 (heat shock 27kDa protein 1)은 열 충격 관련 단백질, EEF1A1 (eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 1)은 진핵 단백질 합성의 보조인자로 알려져 있다. SDC1 (syndecan 1)은 헤파란 설페이트를 함유하는 프로테오글리칸(heparan sulfate-bearing protoglycan)으로, 간암 (Msatumoto 등, Int. J. Cancer 74: 482-91, 1997), 머리 및 목 암종 (Inki 등, Br. J. Cancer 70: 319-323, 1994), 직장암 (Day 등, Virchows Arch. 434: 121-125, 1999) 등 인간의 악성종양과 관련있다고 보고되고 있다 (Mastumoto 등, Int. J. Cancer 74: 482-91, 1997). 한편, 정상 위조직에서 많이 발현되는 유전자인 CD74 (invariant polypeptide of major histocompatibility complex), LOC131177 (FAM3D), AGR2 (anterior gradient 2 homolog, Xenopus laevis), IMAGE:4296901 (pepsinA), SNC73 및 IGKC (immunoglobulin kappa constant)에 대해서는 별로 알려진 바가 없다.

본 발명자들은 위암 세포주, 위암 조직 및 정상 위조직의 cDNA 라이브러리의 유전자 염기서열을 분석하고, 이들 유전자의 발굴 빈도를 바탕으로 하여 위암 고발현 또는 저발현 되는 유전자를 찾아내고 실시간 (real-time) RT-PCR 및 경쟁적 RT-PCR 방법에 의해 위암 고발현 유전자와 위암 저발현 유전자를 확인함으로써 위암을 검출할 수 있는 새로운 위암 종양마커를 확립하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 위암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 위암 진단 키트를 제공하는 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 위암 특이적 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1, IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA)의 발현 정도의 측정을 통하여 위암을 진단하는 위암 진단키트를 제공한다.

본 발명의 위암 진단키트는 위암 특이적 고발현 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및/또는 안티센스 프라이머, 및 위암 특이적 저발현 유전자인 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자의 센스 및/ 또는 안티센스 프라이머를 포함한다.

또는, 본 발명의 위암 진단키트는 위암 특이적 고발현 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브, 및 위암 특이적 저발현 유전자인 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.

또 다르게는, 본 발명의 위암 진단키트는 위암 특이적 고발현 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44 , HSPB1 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되 는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체, 및 위암 특이적 저발현 유전자인 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명에서는 32종의 위암 마커 유전자, 구체적으로 26종의 위암 특이적 고발현 유전자 및 6종의 위암 특이적 저발현 유전자의 위암 진단용 용도를 제공한다.

본 발명의 위암 마커 유전자는 위암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.

본 발명에서 확인된 위암 마커 유전자의 서열정보는 하기 표 1에 나타낸 바와 같다.

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
EEFA1A	1833	59, 1447	6q13	NM_001402
TUBA6	1542	62, 1411	12q12-q14	BC021088
FKBP1A	1578	104, 430	20p13	NM_000801
PKM2	2287	110, 1705	15q22	NM_002654
LDHA	1661	98, 1096	11p15.4	NM_005566
RPL4	1449	57, 1340	15q22	NM_000968
ARF1	1814	76, 621	1q42	NM_001658
SURF4	2985	131, 940	3q34.2	NM_033161
KRT8	1752	60, 1511	12q13	NM_002273
GAPD	1283	76, 1083	12p13	NM_002046
HSPCB	2567	85, 2259	6p12	NM_007355
PGK1	2338	70, 1323	Xq13	NM_000291
HMGIY	1978	308, 631	6p21	NM_145904
K-ALPHA-1	1596	68, 1423	12q13.11	NM_006082
FTH1	801	92, 664	11q13	NM_002032
HSPA8	2276	79, 2019	11q24.1	NM_006597
SH3GLB2	2039	147, 1334	9q34	NM_020145
ACTB	1793	74, 1201	7p15-p12	NM_001101
HSPCA	2259	61, 2259	14q32.31	NM_005348
TMSB4X	556	78, 212	Xq21.3-q22	NM_021109
SDC1	3148	249, 1181	2p24.1	NM_002997
PYCR1	2059	279, 1238	17q25.3	NM_006907
ATF4	2015	882, 1937	22q13.1	NM_001675
JUN	3254	975, 1970	1p32-p31	NM_002228
CD44	3091	179, 2407	11p13	NM_000610
HSPB1	865	108, 725	7q11.23	NM_001540
IGKC	382	1, 382	2p12	BM993907
SNC73	1651	396, 1550	14	AF067420
CD74	1304	8, 706	5q33.1	NM_004355
LOC131177 (FAM3D)	1227	207, 881	3p14.2	NM_138805
AGR2	1701	58, 585	7p21.1	NM_006408
IMAGE:4296901 (pepsinA)	1387	31, 1197	11q12.2	BC029055

본 발명에서는 12종의 위암 세포주 (SNU5, SNU668, SNU16, SNU484, SNU520, SNU620, SNU719, SNU638, SNU601, SNU216, SNU520, KMS5), 1종의 위암 조직 표본 (T665307) 및 4종의 정상 위 조직 표본 (K402, N258215, N669761, N665307)을 사용하여 총 17종의 cDNA 라이브러리를 제조하고, 이로부터 약 57,320개의 EST 염기 배열을 결정하고 위암 시료 (위암 세포주 + 위암 조직)와 정상 위 시료 (정상 위 조직)에서 각 유전자의 발굴 빈도를 분석하여, 위암 시료에서 발굴 빈도가 높은 26종의 위암 특이적 고발현 유전자 즉, 발암 후보 유전자 (EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1)와 발굴 빈도가 낮은 6종의 위암 특이적 저발현 유전자 즉, 위암 억제 후보 유전자(IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA))를 각각 선별하여 위암 마커 유전자를 찾아내었다.

유전자 발굴빈도 분석에 사용된 위암 시료 및 위 정상 시료에서 본 발명의 26종의 위암 발암 후보 유전자와 6종의 위암 억제 후보 유전자의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 위암 발암 후보 유전자는 위암 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 위암 억제 후보 유전자는 위암 시료에서 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 위암 마커 유전자들과 위암과의 관련성이 확인되었다.

또한, 4명의 환자에서 채취한 4쌍(위암 조직 및 정상 조직)의 임상시료를 사용하여 26종의 위암 특이적 고발현 유전자와 6종의 위암 특이적 저발현 유전자 중에서 각각 4종(고발현 유전자 FKBP1A, LDHA, HSPCB, TUBA6; 및 저발현 유전자 SNC73, IGKC, LOC131177 (FAM3D), CD74)을 임의적으로 선별하여 유전자 발현량을 비교한 결과, 4종의 위암 발암 후보 유전자는 위 정상 임상 시료에 비해 대부분의 위암 임상 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 4종의 위암 억제 후보 유전자는 대부분의 위암 임상 시료에서 저발현됨이 관찰되어 임상학적으로 위암으로 진단된 조직에서 본 발명의 위암 마커 유전자들의 유용성이 확인되었다. 이밖에도 위암 시료 및 정상 시료에서 각각 특이적 유전자 발현 빈도가 상대적으로 높은 ACTB, K-ALPHA-1, HSPCA, GAPD 등의 위암 특이적 고발현 유전자 및 IMAGE:4296901 (pepsinA), AGR2 등의 저발현 유전자들이 본 발명의 위암 진단 키트에 있어서 특히 바람직하다.

따라서, 위암 특이적 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1, IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA)의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 위암을 진단할 수 있다.

따라서, 본 발명은 또한 하기와 같은 단계들을 포함하는 위암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하는 방법을 제공한다:

(a) 시험 위 조직에서 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위암 특이적 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(b) 정상 위 조직에서 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위암 특이적 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(c) 시험 위 조직에서 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위암 특이적 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계,

(d) 정상 위 조직에서 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 위암 특이적 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계.

상기 측정된 값들을 비교함으로써 위암을 진단할 수 있다. 구체적으로, (a)에 의해 얻어진 측정값을 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고 (c)에 의해 얻어진 측정값을 (d)에서 얻어진 측정값과 비교함으로써 위암 특이적 고발현 및 저발현 유전자의 상대적 발현양을 통하여 위암 여부를 판정할 수 있다.

본 발명의 32종의 마커 유전자의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 실시간 RT-PCR, 또는 경쟁적 RT-PCR 등의 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 32종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 표 5 및 표 7에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 32종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화 반응 (하이브리다이제이션 반응)을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션 (Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003) 또는 마이크로어레이 (Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003) 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 32종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200bp ~ 1000bp이며 바람직하게는 400bp ~ 800bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 32종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 32종의 마커 유전자의 센스 프라이머 및/또는 안티센스 프라이머를 이용한 유전자 증폭법 (PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 32종의 종양 마커 유전자의 발현 양은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 위암 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 26종의 위암 특이적 고발현 유전자와 6종의 위암 특이적 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 32종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리크론날 항체(Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13), 모노크론날 항체 (Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11) 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체 (Methods in Enzymology 203, 99-121 (1991)등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 32종의 위암 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 위암 진단에 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 위암 진단키트는 상기 위암 특이적 마커 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)⁺ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 32종 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 32종의 위암 마커 유전자는 위암 발암 유전자 또는 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 32종의 위암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법(Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002), 투하이브리드법을 이용하는 방법(Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989), 웨스턴 브로팅법("Molecular Cloning - A Laboratory Manual "Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74), 하이스루풋스크리닝법 (Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001) 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명의 예시일 뿐 본 발명이 이들만으로 제한되는 것은 아니다.

(실시예 1) 위암 세포주, 위암 조직 및 정상 위 조직으로부터 총 RNA 분리

위암 세포주인 SNU5, SNU668, SNU16, SNU1, SNU484, SNU620, SNU719, SNU638, SNU601, SNU216, SNU520 (한국세포주은행, http://cellbank.snu.ac.kr/), KMS5(한국생명공학연구원)는 10% FBS가 포함된 RPMI 배양액에서 배양하고, 1종의 위암 조직 표본인 T665307 및 4종의 정상 위 조직 표본인 K402, N258215, N669761, N665307(충남대학교 의과대학)은 외과적으로 제거된 조직으로부터 얻고, 분석할 때 까지 이를 액체 질소에 보관하였다.

세포 및 조직의 총 RNA는 QIAGEN 키트 (RNeasy Maxi 키트: cat#75162)를 사용하여 분리했다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150㎕의 베타 머캅토에탄올 (Mercaptoethanol)을 첨가한 15㎖의 키트 내 분해 완충액에 용해시켰다. 한편 조직은 약 1g을 취하여, 베타 머캅토에탄올을 첨가한 15㎖의 키트내의 RLT 완충액에 용해시키고, 호모지나이저로 분쇄하였다. 시료 용액을 3000g에서 10분 동안 원심분리하여 상층액을 분리하고, 여기에 15㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2ml의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다.

(실시예 2) EST 발굴 빈도에 의한 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 선별

본 발명자는 위암에서 발현되는 유전자를 분석하기 위하여, 위암 세포주, 위암 조직과 정상 위 조직에서 각종 cDNA 라이브러리를 구축하고, 이로부터 무작위로 클론을 선별, 분석함으로써 EST 발굴 빈도를 기초로 한 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자를 선별하고자 하였다.

2-1: cDNA 라이브러리의 제조

실시예 1에서 얻은 각 시료의 총 RNA 각 100㎍을 BAP 효소 반응액 (100Mm Tris-Hcl (PH 7.0), RNA 2mM DTT, 80U Rnasin (promega))에서 3U의 BAP (Bacterial alkaline Phosphatase, TakaRa) 효소로 처리하고, 이어 TAP (Waco) 효소 반응액 (50mM sodium acetate (PH 5.5), 1mM EDTA, 2mM DTT, 80U Rnasin (promega))에서 100U의 TAP (Tabbaco acid pyrophosphatase)효소를 반응시켰다. 그 후, 50mM Tris-HCl (PH 7.5), 5mM MgCl₂, 2mM DTT, 0.5mM ATP, 26% PEG, 100U Rnasin, 서열번호: 1의 올리고리보뉴클레오티드 40pmole, 250U RNA ligase (TakaRa)의 반응을 수행하여 합성한 올리고머를 인산기를 가지는 미분해 mRNA에만 첨가되도록 반응시켰다.

이상의 반응을 처리한 총 RNA로 부터 올리고텍스(oligotex) mRNA 정제키트 (QIAGEN)를 사용하여 mRNA를 분리하고, dT17을 함유한 서열번호: 2의 올리고머를 프라이머로 사용하여 1^st cDNA를 합성하였다. 합성된 cDNA는 XL PCR 키트 (PerkinElmer)를 사용하여 합성된 DNA 삽입체의 5'-말단(서열번호: 3)과 3'-말단의 올리고머(서열번호: 4)를 함유한 PCR 반응을 수행하여 소량 증폭시켰다. PCR 산물을 SfiI의 효소로 처리한 후 아가로스 젤 전기영동을 하여 1.3 kb 이상의 cDNA 단편을 분리하였다. 분리된 cDNA 단편은 TaKaRa 연결 키트를 이용하여 DraIII 효소로 처리한 pCNS-D2 벡터에 연결시킨 후, 전기침공법(electroporation)에 의해 대장균 Top10F' (Invitrogen) 균주에 형질전환시켜, cDNA 라이브러리를 제조하였다.

본 방법에 의해 14종의 위암 세포주 cDNA 라이브러리, 1종의 위암 조직 cDNA 라이브러리와 4종의 정상 위 조직 cDNA 라이브러리를 제조하였다 (표 2).

2-2: cDNA 염기서열의 결정 및 데이터 분석

제작한 cDNA 라이브러리를 앰피실린 (100ug/ml)이 함유된 LB 한천배지에 도말하여 다수의 cDNA 클론을 배양하였다. 얻어진 클론들의 염기서열을 분석하기 위하여 MWG 96well plasmid prep system으로 플라스미드 DNA를 분리하고, 자동화염기서열 결정기인 ABI 3700으로 염기서열분석을 수행하였다.

결정된 DNA 데이터의 유사성 검색은 BLASTN을 사용하여 UniGene 데이터베이스 (Hs.seq.all, build#151)에서 수행하였다.

19종의 cDNA 라이브러리에서 약 65,209개의 EST 염기 배열을 결정하고 이의 분석을 UniGene 데이터베이스에서 수행한 결과, 총 19,762종의 유전자가 발굴되었 다. 각 라이브러리별 결정된 EST 수와 발굴된 유전자의 종류는 표 2에 나타낸 바와 같다.

2-3: 유전자 발굴 빈도 분석

14종의 위암 세포주 cDNA 라이브러리와 1종의 위암 조직 cDNA 라이브러리는 위암 시료 (cancer pool)로, 3종의 정상 위 조직 cDNA 라이브러리는 정상 위 시료 (normal pool)로 크게 2개로 분류하였다. 각 유전자의 발굴 빈도는 각각의 시료에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자 수의 비로 나타내었다. 또한 각 라이브러리에서 각 유전자의 발굴 빈도는 각 라이브러리에서 발굴된 특정 유전자의 수를 발굴된 총 유전자의 수의 비로 계산하고 이를 색깔로서 나타내었다.

상기와 같은 분석에 의해 위암 시료에서 발굴 빈도가 증가하는 26종의 고발현 유전자와 발굴 빈도가 감소하는 저발현 유전자 6종이 각각 선별되었다 (도 1).

(실시예 3) RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석

위암 시료와 정상 위 조직 시료에서 유전자 발굴 빈도에 의해 선별된 26종의 위암 특이적 고발현 유전자와 6종의 위암 특이적 저발현 유전자의 발현량을 실시간 RT-PCR 및 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.

3-1: 역전사 효소 반응

실시예 1 에서 분리한 총 17종의 총 RNA에서 각각 5㎍을 사용하여 하기의 역 전사 반응액에서 42℃, 60분간 반응시켜 총 17종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

역전사 반응액

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4㎍/㎕)	1㎕
5X first-strand buffer	4㎕
10mM dNTP 혼합물	1㎕
0.1M DTT	2㎕
RNaseOUT (40U/㎕)	1㎕
역전사효소 (200U/㎕)	1㎕
총 RNA (5㎍)	X㎕
증류수	(10-X)㎕
총	20㎕

3-2: 실시간 PCR 반응에 의한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

3-2-1: 실시간 PCR 반응에 의한 cDNA의 증폭

실시간 PCR은 FastStart-DNA Master SYBR Green I 키트 (Roche사, 스위스)를 이용하여 실시하였고, 전체 반응량은 총 20㎕로 하였다. 즉, 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유하는 하기 표 4의 실시간 PCR 반응액에 실시예 3-1의 역전사 효소 반응에서 합성한 cDNA를 1/500 희석하여 2㎕씩 첨가하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같이, 사용한 14종의 위암 특이적 고발현 유전자와 3종의 위암 특이적 저발현 유전자의 PCR 프라이머는 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하고, 각 프라이머의 길이는 17∼20bp, GC 함량은 50∼70% 정도이다 (제노텍, 한국). PCR 반응 조건은 설명서를 참조하여 95℃ (15초), 55℃ (5초), 72℃ (30초)로 45회 수행하였다.

실시간 PCR 반응액

cDNA (0.5ng/㎕)	2㎕
25mM MgCl₂	0.8㎕
센스 프라이머 (5pmole/㎕)	2㎕
안티센스 프라이머 (5pmole/㎕)	2㎕
SYBR Green I 중합효소 혼합물	2㎕
증류수	11.2㎕
총	20㎕

실시간 PCR에 사용한 각 위암 마커 유전자들의 프라이머

유전자	5' 올리고머	3' 올리고머
EEFA1A	서열번호: 5	서열번호: 6
ACTB	서열번호: 7	서열번호: 8
K-ALPHA-1	서열번호: 9	서열번호: 10
FTH1	서열번호: 11	서열번호: 12
KRT8	서열번호: 13	서열번호: 14
FKBP1A	서열번호: 15	서열번호: 16
GAPD	서열번호: 17	서열번호: 18
LDHA	서열번호: 19	서열번호: 20
PKM2	서열번호: 21	서열번호: 22
PGK1	서열번호: 23	서열번호: 24
HSPCA	서열번호: 25	서열번호: 26
HSPA8	서열번호: 27	서열번호: 28
HSPCB	서열번호: 29	서열번호: 30
HSPB1	서열번호: 31	서열번호: 32
SNC73	서열번호: 33	서열번호: 34
pepsin A	서열번호: 35	서열번호: 36
IGKC	서열번호: 37	서열번호: 38

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 베타 2 마이크로글로뷸린 (B2M)를 사용하였다. 즉, 1.2 ug의 B2M DNA를 원액 및 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10000로 희석하고 이를 각각 2㎕씩 사용하여 상기와 같은 실시간 PCR을 수행하고 증폭된 PCR산물로부터 B2M양의 표준화 그래프를 작성하였다. 이를 사용하여 마커 유전자의 PCR 산물로부터 마커 유전자의 양을 정량화하였다. B2M의 PCR반응 시에 각각 서열번호: 39 및 40의 5'-올리고머 및 3'-올리고머 프라이머를 사용하였다. 이 프라이머들은 B2M 유전자 염기 서열 중에서 단백질 코딩 영역 내의 DNA 염기배열부에서 설계하였다.

3-2-2: 실시간 PCR 반응에 의한 발현량 확인

실시간 RT-PCR 방법에 의해 증폭된 후보 유전자의 PCR산물의 양은, 표준 유전자의 PCR 산물량 (3회 실행하여 얻어낸 B2M의 평균량)으로 나누었다. 그 후, 고발현 유전자의 발현량은 위암조직에서 발현되는 표적 유전자의 양을 정상 위 조직에서 발현되는 표적 유전자의 발현량의 평균량에 대한 비율로 나타냈으며, 저발현 유전자의 발현량은 정상 위 조직에서 발현되는 후보 유전자의 양을 위암 세포주 및 위암 조직에서 발현되는 발현량의 평균량에 대한 비율로 도 2에 나타내었다 (S14, S17, S18, S19는 정상 위 조직, S1, S2, S3, S5, S6, S7, S8, S9, S10, S12, S13, S21은 위암 세포주이며, S20은 위암 조직임).

그 결과, 위암에서 발굴 빈도가 높은 위암 특이적 고발현 유전자 (실시예 2-3의 데이터)의 실시간 RT-PCR 산물량은 위암 시료에서 높았으며, 위암에서 발굴 빈도가 낮은 위암 특이적 저발현 유전자의 RT-PCR 산물량은 위암 시료에서 낮게 나타났다. 즉, EEFA1A, FKBP1A, PKM2, LDHA, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, ACTB, HSPCA, HSPB1 유전자는 위암 발암 마커로서의 유용성이 명백해졌으며, 이와 함께 IGKC, SNC73, IMAGE:4296901 (pepsinA) 유전자는 위암 억제 마커로 사용 가능한 것이 밝혀졌다.

3-3: 경쟁적 (Competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

3-3-1: 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정

표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA (competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.

B2M 경쟁 DNA는 3ul의 pCNS 벡터 DNA (2ng), 10㎕의 5x PCR premix (바이오니아), 1㎕의 5' 프라이머 (20pmole: 서열번호:41), 1㎕의 3'프라이머 (20pmole: 서열번호:42), 35㎕의 증류수를 함유한 50㎕의 반응액에서 PCR 반응을 수행하여 제조하였다. 이때 PCR 반응의 조건은 94C 30(초), 50C 30(초), 72C 30(초)으로 30회 수행하였으며, B2M 경쟁 DNA인 PCR 산물의 길이는 322bp 였다.

조제한 B2M 경쟁 DNA를 7/10⁸, 1/10⁷, 3/10⁷, 7/10⁷, 1/10⁶, 3/10⁶의 6 단계로 희석 한 후, 2㎕를 실시예 3-1의 역전사 효소 반응액 (역전사 반응에 사용된 RNA의 10ng에 해당되는 양)과 각각 혼합한 후, 4㎕의 5X Taq DNA 중합효소 혼합액, 2㎕의 B2M 프라이머 (5pmole/㎕)(서열번호: 39 및 40), 8㎕의 증류수를 함유한 총 20㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때 PCR반응 조건은 94℃ (40초), 55℃ (1분), 72℃ (1분)으로 25회씩 수행하였다.

PCR 산물을 3% 아가로스 젤에 3㎕씩 로딩하여 100V에서 30분 전기영동한 후, Frog^TM 기계 (젤 이미지 어낼리시스 시스템, Core Bio)을 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일 (.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램 (NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여, 두 밴드 (B2M 경쟁 DNA에서는 322bp, 원래 B2M유전자에서는 390bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화 한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다. 즉, 가장 낮은 농도로 정량된 N665307의 3/10⁷의 농도를 기준으로 하여, 나머지 15개 시료의 농도를 3/10⁷ 농도가 되도록 희석하였다.

3-3-2: PCR을 이용한 cDNA의 증폭

실시예 3-3-1에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 하기 표 6의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94℃ (1분), 55℃ (30초), 72℃ (1분), 25회씩 수행하였다.

하기 표 7에 나타낸 바와 같이, 12종의 위암 특이적 고발현 유전자인 TUBA6, RPL4, ARF1, SURF4, HMGIY, SH3GLB2, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44와 3종의 위암 특이적 저발현 유전자 CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2의 프라이머는, 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 16∼20bp, GC 함량은 50∼70% 정도이다 (코아바이오시스템, 한국). 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

경쟁적 PCR 반응액

cDNA	5㎕
5X PCR 반응 mix (바이오니아, 한국)	3㎕
센스 프라이머 (10pmole/㎕)	1㎕
안티센스 프라이머 (10pmole/㎕)	1㎕
증류수	5㎕
Total	15㎕

경쟁적 PCR에 사용한 각 위암 마커 유전자들의 프라이머

유전자	5' 올리고머	3' 올리고머
TMSB4X	서열번호: 43	서열번호: 44
RPL4	서열번호: 45	서열번호: 46
TUBA6	서열번호: 47	서열번호: 48
HMGIY	서열번호: 49	서열번호: 50
ATF4	서열번호: 51	서열번호: 52
JUN	서열번호: 53	서열번호: 54
SDC1	서열번호: 55	서열번호: 56
ARF1	서열번호: 57	서열번호: 58
PYCR1	서열번호: 59	서열번호: 60
SURF4	서열번호: 61	서열번호: 62
SH3GLB2	서열번호: 63	서열번호: 64
CD44	서열번호: 65	서열번호:66
CD74	서열번호: 67	서열번호: 68
AGR2	서열번호: 69	서열번호: 70
FAM3D	서열번호: 71	서열번호: 72

3-3-3: 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분간 전기영동 한 후, PCR 산물을 3-3-1에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램 (NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화 하였다.

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이, 위암에서 발굴 빈도가 높은 위암 특이적 고발현 유전자 (실시예 2-3의 데이터)의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 위암 시료에서 높았으며, 위암에서 발굴 빈도가 낮은 위암 특이적 저발현 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 위암 시료에서 낮게 나타났다. 즉, 12종의 위암 발암 후보 유전자인 TMSB4X, RPL4, TUBA6, HMGIY, ATF4, JUN, SDC1, ARF1, PYCR1, SURF4, SH3GLB2, CD44는 위암 발암 마커로서 유용함이 명백해졌으며, 이와 함께 3가지 비종양 유전자 CD74, AGR2, LOC131177 (FAM3D)는 위암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.

(실시예 4) 임상시료에서 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인을 통한 위암 진단

본 실험에서는 충남대학교의 4명의 위암 의심 환자로부터 직접 채취한 시험 조직/정상 조직(각각 T1 내지 T4 및 N1 내지 N4)의 쌍으로 된 4종의 임상시료(376454, 663593, 668217, 670500)에서, 위암 특이적 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량을 확인하였다. 위암 특이적 고발현 유전자 중 FKBP1A, LDHA, HSPCB, TUBA6 유전자를, 위암 특이적 저발현 유전자 중 SNC73, IGKC, LOC131177 (FAM3D), CD74 유전자를 임의적으로 선별하여 경쟁적 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다.

4-1: 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응

실시예 1 에서와 같은 방법으로 총 RNA를 분리하고, 실시예 3-1에서와 같이 각 시료의 총 RNA 5㎍을 사용하여 42℃, 60분간 역전사 반응을 수행함으로써 총 8 종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70℃ heating block에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

4-2: 경쟁적 PCR을 이용한 각 유전자의 발현량 확인

3-3-1에서와 동일한 방법으로 PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다. 즉, 가장 낮은 농도로 정량된 T376454, N670500 및 T670500의 4/10⁷의 농도를 기준으로 하여, 나머지 5개 시료의 농도를 증류수로 희석하여 보정하였다. 보정한 시료의 역전사 반응액을 10㎕씩 주형으로 이용하여 각 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 함유한 총 15㎕의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94℃ (1분), 55℃ (30초), 72℃ (1분), 30회씩 수행하였다. 사용된 프라이머는 다음과 같다. 즉, FKBP1A는 서열번호 15과 서열번호 16, LDHA는 서열번호 19와 서열번호 20, HSPCB는 서열번호 29와 서열번호 30, TUBA6은 서열번호 47과 서열번호 48, SNC73은 서열번호 33과 서열번호 34, IGKC는 서열번호 37과 서열번호 38, CD74는 서열번호 67과 서열번호 68, LOC131177 (FAM3D)은 서열번호 71과 서열번호 72를 사용하였다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액 전부를 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분으로 전기영동 한 후, PCR 산물을 3-3-1에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램 (NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화 하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, 위암 특이적 고발현 유전자인 FKBP1A, LDHA, HSPCB, TUBA6 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 동일 환자에서 채취한 위 정상 조직에서보다 대부분의 시험 조직에서 더 높았으며, 위암 특이적 저발현 유전자인 SNC73, IGKC, LOC131177 (FAM3D), CD74 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 시험 조직에서보다 대부분의 위 정상 조직에서 더 낮게 나타났다. 즉, 4가지 시험 조직은 모두 위암으로 판정되었으며, 이는 종래의 임상학적 위암 검사 결과(T1, 위암 단계 IV; T2, 위암 단계 IIIA; T3과 T4, 위암 단계 II)와 일치하였다.

본 발명에 의해, 위암의 진단에 유용한 종양 마커로 정상 위조직에서 측정된 6종의 위암 특이적 저발현 유전자와 위암 세포주 및 위암 조직에서 측정된 26종의 위암 특이적 고발현 유전자가 확인되었다. 상기 종양 마커는 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량할 수 있어 위암의 진단에 매우 유용하게 사용 될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> DETECTION KIT FOR STOMACH CANCER BY MEASURING THE EXPRESSION OF STOMACH CANCER MARKER GENES <160> 72 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 1 <400> 1 agcaucgagu cggccuuguu ggccuacugg 30 <210> 2 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 2 <400> 2 gcggctgaag acggcctatg tggccttttt tttttttttt tt 42 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 3 <400> 3 agcatcgagt cggccttgtt g 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer 4 <400> 4 gcggctgaag acggcctatg t 21 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eefa1a 5'-primer <400> 5 tgacccacca atggaagc 18 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> eefa1a 3'-primer <400> 6 agccttctga gctttctgg 19 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actb 5'-primer <400> 7 ctggcaccca gcacaatg 18 <210> 8 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> actb 3'-primer <400> 8 cacctcccct gtgtggac 18 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> k-alpha-1 5'-primer <400> 9 ggcttcaagg ttggcatc 18 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> k-alpha-1 3'primer <400> 10 cctctccttc ttcctcacc 19 <210> 11 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fth1 5'primer <400> 11 catgacgacc gcgtcca 17 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fth1 3'primer <400> 12 tcacacaaat gggggtca 18 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> krt8 5'primer <400> 13 ctgctggagg gcgagga 17 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> krt8 3'primer <400> 14 cagcgcagga ggggtag 17 <210> 15 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fkbp1a 5'primer <400> 15 gctgctgtct tccgtggt 18 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fkbp1a 3'primer <400> 16 tgccttaggc ctcctctt 18 <210> 17 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapd 5'primer <400> 17 ccaaggctgt gggcaag 17 <210> 18 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> gapd 3'primer <400> 18 accaggaaat gagcttgac 19 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldha 5'primer <400> 19 atggcaactc taaaggatca gc 22 <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ldha 3'primer <400> 20 gcaacttgca gttcgggc 18 <210> 21 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pkm2 5'primer <400> 21 atgtcgaagc cccatagtga 20 <210> 22 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pkm2 3'primer <400> 22 tccacctctg cagtgcc 17 <210> 23 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgk1 5'primer <400> 23 atgtcgcttt ctaacaagct ga 22 <210> 24 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pgk1 3'primer <400> 24 gcggaggttc tccagca 17 <210> 25 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspca 5'primer <400> 25 atgcctgagg aaacccaga 19 <210> 26 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspca 3'primer <400> 26 tctgcaccag cctgcaa 17 <210> 27 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspa8 5'primer <400> 27 cgtatggtcc aggaagctg 19 <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspa8 3'primer <400> 28 atcaacctct tcaatggtgg g 21 <210> 29 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspcb 5'primer <400> 29 gtgaccagca cctacggc 18 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspcb 3'primer <400> 30 atcgacttct tccatgcgag 20 <210> 31 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspb1 5'primer <400> 31 tccccttctc gctcctg 17 <210> 32 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hspb1 3'primer <400> 32 atgtagccat gctcgtcct 19 <210> 33 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snc73 5'primer <400> 33 caggatgtga ctgtgccc 18 <210> 34 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> snc73 3'primer <400> 34 ggcagcagtg caagtgaa 18 <210> 35 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pepsin A 5'primer <400> 35 cccaccctgg tagatgaac 19 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pepsin A 3'primer <400> 36 ggtgtcagag atgcctcca 19 <210> 37 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> igkc 5'primer <400> 37 ccattcactt tcggccc 17 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> igkc 3'primer <400> 38 ggctggaact gaggagca 18 <210> 39 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m 5'primer <400> 39 ctcgctccgt ggccttag 18 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m 3'primer <400> 40 caaatgcggc atcttcaa 18 <210> 41 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m competitor 5'primer <400> 41 ctcgctccgt ggccttagac ggggtcatta gttcatag 38 <210> 42 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> b2m competitor 3'primer <400> 42 caaatgcggc atcttcaaag gtcatgtact gggcataa 38 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tmsb4x 5'primer <400> 43 cctccgcaac catgtct 17 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tmsb4x 3'primer <400> 44 gcacgcctca ttacgatt 18 <210> 45 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpl4 5'primer <400> 45 gagctggcaa aggcaaa 17 <210> 46 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> rpl4 3'primer <400> 46 tccggcgcat ggtcttt 17 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tuba6 5'primer <400> 47 cccgggcagt gtttgta 17 <210> 48 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> tuba6 3'primer <400> 48 ctccagggtg gtgtggg 17 <210> 49 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hmgiy 5'primer <400> 49 gcatcccagc catcactc 18 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hmgiy 3'primer <400> 50 agcggagcaa agctgtc 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> atf4 5'primer <400> 51 gctgggcagt gaagtgg 17 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> atf4 3'primer <400> 52 ttggccaggg aatccg 16 <210> 53 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> jun 5'primer <400> 53 ggtatcctgc ccagtgttgt 20 <210> 54 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> jun 3'primer <400> 54 ctccagcctc ctgaaacatc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sdc1 5'primer <400> 55 tgctgtaccg catgaagaag 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sdc1 3'primer <400> 56 gaggctgctt cagtttggag 20 <210> 57 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> arf1 5'primer <400> 57 ggaacatctt cgccaacc 18 <210> 58 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> arf1 3'primer <400> 58 tagtgagtgc agccccag 18 <210> 59 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pycr1 5'primer <400> 59 tcaggaagat gggggtga 18 <210> 60 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pycr1 3'primer <400> 60 gggctgtgaa tgcgtagg 18 <210> 61 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> surf4 5'primer <400> 61 tgctgggaca gctgactg 18 <210> 62 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> surf4 3'primer <400> 62 tggcaaagag ccacacaa 18 <210> 63 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh3glb2 5'primer <400> 63 agtttgaccg gcaagcag 18 <210> 64 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sh3glb2 3'primer <400> 64 atgccaggca ggctgtag 18 <210> 65 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cd44 5'primer <400> 65 ggccagcaag tctcagga 18 <210> 66 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cd44 3'primer <400> 66 aggcctccaa gtgggaac 18 <210> 67 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cd74 5'primer <400> 67 gcgcgacctt atctcca 17 <210> 68 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cd74 3'primer <400> 68 tcagtggcgg gtacacct 18 <210> 69 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agr2 5'primer <400> 69 actgccccag accctctc 18 <210> 70 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> agr2 3'primer <400> 70 tgagagcttt cttcatgttg tc 22 <210> 71 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fam3d 5'primer <400> 71 cctcgggtgg aagctga 17 <210> 72 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fam3d 3'primer <400> 72 tgccttctgt cccagca 17

Claims

위암 특이적 고발현 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머, 및 위암 특이적 저발현 유전자인 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자의 센스 및 안티센스 프라이머를 포함하는 위암 진단 키트.
제1항에 있어서, 상기 유전자 증폭을 위한 중합효소 반응액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 진단키트.
삭제
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 프라이머가 15 내지 20bp 범위의 DNA인 것을 특징으로 하는 진단키트.
위암 특이적 고발현 유전자인 EEFA1A, TUBA6, FKBP1A, PKM2, LDHA, RPL4, ARF1, SURF4, KRT8, GAPD, HSPCB, PGK1, HMGIY, K-ALPHA-1, FTH1, HSPA8, SH3GLB2, ACTB, HSPCA, TMSB4X, SDC1, PYCR1, ATF4, JUN, CD44, HSPB1 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 상보적인 프로브, 및 위암 특이적 저발현 유전자인 IGKC, SNC73, CD74, LOC131177 (FAM3D), AGR2, IMAGE:4296901 (pepsinA) 및 이들의 혼합물로 구성되는 군으로부터 선택되는 유전자에 상보적인 프로브를 포함하는 위암 진단 키트.
삭제
제5항에 있어서, 상기 프로브가 200 내지 1000bp임을 특징으로 하는 진단키트.
삭제
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