KR100645979B1

KR100645979B1 - 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단킷트

Info

Publication number: KR100645979B1
Application number: KR1020040062475A
Authority: KR
Inventors: 김남순; 김정민; 김용성; 윤선영; 오정화; 이주연; 양진옥; 염영일; 유향숙; 김주헌; 송규상; 노승무
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2004-08-09
Filing date: 2004-08-09
Publication date: 2006-11-15
Also published as: KR20060013868A

Abstract

본 발명은 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단킷트에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 수집된 ESTs(expressed sequence tags)로부터 위암관련 신규 유전자를 밝히고 이 유전자가 배열된 cDNA 마이크로어레이를 이용하여 위 조직 내에 발생하는 위암에 대한 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현정도를 측정하여 위암 진단에 매우 유용하게 사용될 수 있도록 개발된 위암 진단방법 및 진단킷트에 관한 것이다.

위암, 유전자 마커, cDNA 마이크로어레이, 진단킷트

Description

위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단킷트{DETECTION KIT FOR GASTRIC CARCINOMA BY MEASURING THE EXPRESSION OF GASTRIC CARCINOMA-RELATED GENES}

도 1은 선별한 20종의 유전자의 발현정도를 경쟁적(competitive) RT-PCR 방법으로 정상 위 세포주(Hs 677.St)와 위암 세포주(SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)에서 수행한 것이고,

도 2는 선별한 20종 중에서 임의로 선별한 12종의 유전자의 발현정도를 정상 위 조직과 위암 조직에서 경쟁적 RT-PCR 방법을 수행한 것이다[X축은 위암 진행단계별로 정상 위 조직과 암조직을 나타내고, Y축은 유전자 발현값을 베타-엑틴 발현값으로 나눈 값임].

도 3은 위암 고발현 유전자 중 CDC20 과 SKB1의 발현을 정상 위 세포주(Hs 677.St)와 위암 세포주(SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)에서 웨스턴블랏팅(Western Blotting)으로 확인한 결과이다.

도 4는 위암 고발현 유전자 중 CDC20과 SKB1의 발현을 위암 환자로부터 절제한 임상 조직시료에서 면역조직화학 염색법으로 확인한 결과이다.

위암(gastric carcinoma)은 한국 및 일본 등의 아시아에서 발생하는 가장 흔한 암으로서 사망률 1위를 나타내는 암이다[Parkin 등, Int. J. Cancer 80: 827-841, 1999; Neugut 등, Semin. Oncol. 23: 281-291, 1996]. 위암과 관련한 유전자에 대해서 많이 보고되지 않고 있으나, 최근에는 분자적 생물학적 분석을 사용하여 p53[Yokozaki 등, Int. Rev. Cytol. 204: 49-95, 2001], β-카테닌[박 등, Cancer Res. 59: 4257-4260, 1999], E-카데린[Berx 등, Hum. Mutat. 12: 226-237, 1998], 삼엽형 인자 1(trefoil factor 1)[박 등, Gastroenterology 119: 691-698, 2000], c-met[이 등, Oncogene 19: 4947-4953, 2000], Rnux3[Li 등, Cell 109: 113-124]와 같은 유전자들이 위암에서 유전적으로 많이 변이되어 있다는 것이 확인, 보고되고 있다. 또한, CA11[Yoshikawa 등, Jpn. J. Cancer Res. 91: 459-463, 2000; Shiozaki 등, Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001]과 위장 점막에서 합성되는 삼엽형 인자(trefoil factor)인 TFF1과 TFF2[Shiozaki 등, Int. J. Oncol. 19: 701-707, 2001; Kirikoshi 등, Int. J. Oncol. 21: 655-659, 2002]과 같은 유전자들이 위암에서 저발현된다는 보고도 있다. 그러나, 위암 발암과정(carcinogenesis)에서의 일반적인 공통경로(common pathway)와 위암의 진행에 관해서는 많이 보고되지 않았다.

cDNA 마이크로어레이 방법은 1회의 실험으로 수많은 유전자의 발현양상을 동시에 연구하는데 사용되는 방법이다[DeRisi 등, Nat. Genet. 14: 457-460, 1996; Duggan 등, Nat. Genet. 21: 10-14, 1999]. 이러한 cDNA 마이크로어레이 방법을 사용하여 다양한 질병과 암에서의 유전자 발현양상에 대한 결과가 보고되고 있다[Ross 등, Nat. Genet. 24: 227-235, 2000; Wikman 등, Oncogene 21: 5804-5813, 2002; Han 등, Cancer Res. 62: 2890-2896, 2002; Jiang 등, Oncogene 21: 2270-2282]. 또한, 위암 관련 연구에서도 cDNA 마이크로어레이 방법이 사용되어 위암 세포주와 악성 조직(malignant tissues)에서의 S100A4, CDK4, MMP1 및 β-카테닌 유전자의 발현이 증가되고, GIF 유전자는 감소된다는 것이 보고되고 있다[El-Rifai 등, Int. J. Cancer 92: 832-838, 2001]. 이외에도, cDNA 마이크로어레이 방법을 이용한 위암 조직과 정상조직의 유전자 발현의 차이에 관한 보고도 있었고[이 등, Cancer Lett. 184: 197-206, 2002; Boussioutas 등, Cancer Res. 63: 2569-2577, 2003], 위암환자의 예후를 판단하는 보고도 있었다[Inoue 등, Clin. Cancer Res. 8: 3475-3479, 2002].

본 발명에서는 위암 시료로부터 수집된 ESTs 중에서 위암에서 발현되는 신규 유전자로 판단되는 1,995개의 유전자를 마이크로어레이 고형지지체에 배열시 키고, 이를 이용한 cDNA 마이크로어레이 분석을 통하여 위암 관련 유전자를 1차적으로 선별한 후, 최종적으로 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자를 위암 관련 신규 유전자로 발굴하였다. 이들은 위암과의 관련성이 전혀 보고되지 않은 것으로 현재 이들 유전자에 대해 알려진 내용은 다음과 같다. 위암에서 발현이 증가되는 유전자를 먼저 알아보면, CKS1B(CDC28 protein kinase regulatory subunit 1B)은 사이클린 의존 인산화효소(cyclin dependent kinase)의 촉매 부분(catalytic subunit)에 해당하는 단백질로 세포주기(cell cycle)에 관여하며, CKS1은 위암 조직에서 발현이 증가된다고 보고되고 있다[El-Rifai 등, Int. J. Cancer 92: 832-838, 2001; Hippo 등, Cancer Res. 62: 233-240, 2002]. D1S155E(NRAS-related gene)는 UNR(upstream of NRAS)로 알려져 있는 유전자로서, 종양형성 기니픽 세포(tumorigenic guinea pig cells)에서 처음 분리되었고, NRAS(neuroblastoma ras viral oncogene homolog)와 같이 조절(coordinately regulation)되는 것으로 추정되어 암과의 연관성이 보고되고 있다[Doniger 등, Nucleic Acids Res. 16: 969-980, 1998]. FKBP4(FK506-binding protein 4(59kD)는 이뮤노필린(immunophilin) 단백질의 일종으로, 면역조절과 단백질 접힘(folding)에서 중요한 기능을 하고, 또한 유방암에서 발현이 증가된다고 보고되고 있다[Ward 등, Breast Cancer Res. Treat. 58: 267-280, 1999]. SKB1(SKB1 homolog)은 세포 극성(cell polarity)의 조절[Wiley 등, J. Biol. Chem. 278: 25256-25263, 2003]과 유사분열(mitosis)[Gilbreth 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 14781-14786, 1998]의 조절에서 역할을 하는 것으로 알려져 있지만, 현재 까지 발암(Oncogenesis)과의 연관성은 보고되고 있지 않다. NT5C3(5' nucleotidase, cytosolic III)은 핵산 대사경로에 관여하는 효소로서 보통염색체 열성 용혈 빈혈(autosomal recessive hemolytic anemia)을 야기시키는 것으로 알려져 있다[Marinaki 등, Blood 97: 3327-3332, 2001]. p30(nuclear protein p30)은 쥐 간 핵(rat liver nuclei)으로부터 정제된 뉴클레오포린 프랙션(nucleoporin fraction)의 성분으로 분리되었지만[Cronshaw 등,J. Cell Biol. 158 : 915-927, 2002], 아직 기능은 알려져 있지 않다. GPI(glucose phosphate isomerase)는 췌장암에서 저산소증(hypoxia)하에서 유도되는 것이 보고되었고[Yoon 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 288: 882-886, 2001], PRO2000(PRP2000 protein)은 골육종(osteosarcoma)세포에서 항 종양 약제(anti-cancer drug) 처리시에 약제 관련(drug-related) 유전자로 보고되었다[Fellenberg 등, Int. J. Cancer 105: 636-643, 2003]. CDC20(CDC20 cell division cycle 20 homolog)은 세포주기(cell cycle) 구성성분이고, 이 유전자의 과발현이 췌장암에서 보고되었고[Li 등, Clin. Cancer Res. 9: 991-997, 2003], 또한 이 유전자의 발현변화가 폐암의 초기에 발견되었다[Singhal 등, Cancer Biol. Ther. 2: 291-298]. FEN1(flap structure-specific endonuclease 1)은 DNA 합성(synthesis)과 수복(repair)에 관여하는 효소로서, 이 유전자의 과발현이 생쥐(mouse)에서 위장관(gastrointestinal tract)암의 빠른 암진행을 유도하고[Kucherlapati 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99: 9924-9929, 2002], 또한 폐암 세포주에서 과발현되는 것으로 보고되고 있다[Sato 등, Oncogene 22: 7243-7246, 2003]. 또한, ZNF9(zinc finger protein 9)은 근육긴 장 퇴행위축(myotonic dystrophy)에 관련되어 있고[Liquori 등, Science 293: 864-867, 2001], RPS16(ribosomal protein 16)은 40S 서브유닛(subunit)의 성분으로 리보조말 단백질(ribosomal protein)을 코딩하고, 인간 전립선 암 세포에서 발현이 보고되고 있다[Karan 등, Carcinogenesis 23: 967-975, 2002]. 위암에서 발현이 감소되는 유전자를 알아보면, LGALS1(lectin, galactose-binding, soluble, 1)은 세포사멸(cell apoptosis)과 세포분화(cell differentiation)에 관여하는 것으로 알려져 있고, 이 유전자의 과발현이 대장암[Hittelet 등, Int. J. Cancer 103: 370-379, 2003]과 췌장암[Berberat 등, J. Histochem. Cytochem. 49: 539-549]에서 보고되고 있지만, 위암에서는 아직까지 보고되고 있지 않다. PEA15(phosphoprotein enriched in astrocytes 15)는 포도당 전달(glucose transport)에 관여하고, 제2형 당뇨병(type 2 diabetes mellitus)에서 과발현되는 것으로 보고되고 있다[Condorelli 등, EMBO J. 17: 3858-3866, 1998]. SEC61A1(protein transport protein SEC61A alpha subunit isoform 1)은 막성 단백질(membrane protein)과 분비성(secretory protein)의 조립(assembly)에 필요한 것으로 보고되고 있고, 암과는 관련성은 전혀 보고되고 있지 않다. MT2A(metallothionein 2A)는 중금속 결합 저분자량 단백질로 알려져 있고, 금속을 비독성화시키는 작용을 하며, 반응산소로부터 방어작용을 하는 메탈로티오네인(methallothionein)의 일종으로 알려져 있다. 또한, 이 유전자는 유방암[Jin 등, Carcinogenesis 23: 81-86, 2002]과 식도암[Cui 등, Biochem. Biophys. Res. Commun. 302: 904-915, 2003]에서 과발현되는 것으로 보고되고 있다. MAGED2(melanoma antigen, family D, 2)는 유방암 관련 유전자로, 유방암 조직에서 발현되는 것으로 보고되고 있다[Kurt 등, Breast Cancer Res. Treat 59: 41-48, 2000]. NPDC1(neural proliferation differentiation and control, 1)은 신경세포(neural cell) 증식과 분화에 중요한 역할을 하는 것으로 제시되고 있다[Qu 등, Gene 264: 37-44, 2001]. CXX1(CAAX box 1)은 CAAX motif를 가지고 있다는 사실만이 보고되고 있다. 나머지 FLJ34386은 아직 기능이 보고되고 있지 않다.

이에, 본 발명자들은 위암 시료로부터 수집된 ESTs 중에서 위암에서 발현되는 신규 유전자로 판단되는 1,995개의 유전자를 마이크로어레이 고형지지체에 배열시키고, cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하여 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자를 찾아내고, 경쟁적 RT-PCR 방법, 웨스턴블랏팅법, 면역조직화학 염색법을 이용하여 위암 세포주와 위암 임상 조직시료에서 위암 고발현 유전자와 저발현 유전자를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 위암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 위암 진단방법을 제공하는데 그 목적이 있다.

또한, 본 발명은 위암 조직에서 특이적으로 발현되는 유전자들의 발현정도 측정을 이용한 위암 진단킷트를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.

본 발명은 20종의 위암 특이적 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9, RPS16, LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1 중에서 선택된 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 위암을 진단하는 위암 진단방법 및 진단킷트를 그 특징으로 한다.

이와 같은 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 위암 특이적 고발현 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자와, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 발현 정도의 측정을 통하여 위암을 진단하는 위암 진단킷트에 관한 것이다.

본 발명의 위암 마커 유전자는 위암 조직에서 고발현되거나 저발현되는 유전자의 전장 및 그의 단편을 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 진단킷트는 위암 특이적 고발현 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머와, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 진단킷트는 위암 특이적 고발현 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브와, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 상보적인 프로브를 포함한다.

또한, 본 발명에 따른 진단킷트는 위암 특이적 고발현 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체와, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질을 인식하는 항체를 포함한다.

또한, 상기 항체, 기질, 적당한 완충용액, 발색 효소 또는 형광물질로 표지된 2차 항체, 발색 기질 등을 포함할 수 있다.

상기에서 기질은 니트로셀룰로오즈 막, 폴리비닐(Polyvinyl) 수지로 합성된 96 웰 플레이트(96 well plate), 폴리스티렌(Polystyrene) 수지로 합성된 96 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드글라스 등이 사용될 수 있고, 발색효소는 퍼옥시데이즈(peroxidase), 알칼라인 포스파테이즈(Alkaline Phosphatase)가 사용될 수 있고, 형광물질은 FITC, RITC 등이 사용될 수 있고, 발색기질액은 ABTS(2, 2'-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)) 또는 OPD(o-Phenylenediamine), TMB(Tetramethyl Benzidine)가 사용될 수 있다.

본 발명에서 확인된 위암 고발현 유전자 12종의 서열정보는 다음 표 1에 나타낸 바와 같고, 위암 저발현 유전자 8종의 서열정보는 다음 표 2에 나타낸 바와 같다.

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
CKS1B	717	10, 249	1q21.2	NM_001826
D1S155E	3582	421, 2733	1p22	NM_007158
FKBP4	2251	154, 1533	12p13.33	NM_002014
SKB1	2413	92, 2005	14q11.2-q21	NM_006109
NT5C3	1573	92, 952	7p14.3	NM_016489
p30	1191	64, 891	17p11.2	NM_181716
GPI	2075	104, 1780	19q13.1	NM_000175
PRO2000	4916	91, 4263	8q24.13	NM_014019
CDC20	1686	111, 1610	1p34.1	NM_001255
FEN1	2265	373, 1515	11q12	NM_004111
ZNF9	1500	103, 636	3q21	NM_003418
RPS16	621	104, 544	19q13.2	NM_001020

유전자	길이	CDS(단백질 영역)	위치	GenBank Accession No.
LGALS1	526	69, 476	22q13.1	NM_002305
PEA15	2486	194, 586	1q21.1	NM_003768
FLJ34386	2119	unknown	12q13.2	AK091705
SEC61A1	3571	251, 1522	3q21.3	BC002951
MT2A	372	58, 243	16q13	NM_005953
MAGED2	2080	100, 1920	Xp11.2	NM_014599
NPDC1	1554	215, 1192	9q34.3	NM_015392
CXX1	1209	335, 964	Xq26	NM_003928

본 발명에서는 위암 시료로부터 수집된 ESTs 중에서 위암 발현 신규 유전자로 판단되는 1,995개의 유전자를 마이크로어레이 고형지지체에 배열시키고, cDNA 마이크로어레이 분석을 수행하여 12종의 위암 고발현 유전자(CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9, RPS16)와 8종의 위암 저발현 유전자(LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1, CXX1)를 각각 선별하여 위암 마커 유전자를 찾아내었다.

cDNA 마이크로어레이 분석에 사용된 정상 위 세포주와 위암 세포주 시료에서 본 발명의 위암 고발현 유전자 12종과 위암 저발현 유전자 8종의 발현량을 정량적 RT-PCR 방법에 의해 비교한 결과, 12종의 위암 고발현 유전자는 위암 세포주 시료에서 고발현됨이 관찰되었고, 8종의 위암 저발현 유전자는 위암 세포주 시료에서 저발현됨이 관찰됨으로써 본 발명의 위암 마커 유전자들과 위암과의 관련성이 확인되었다.

또한, 25명의 환자에서 채취한 25쌍(정상 위 조직과 위암 조직)의 임상시료를 사용하여 위암 고발현 유전자 중에 12종과 위암 저발현 유전자 8종의 발현량을 비교한 결과, 12종의 위암 고발현 유전자 중 10종의 유전자는 정상 위 조직 임상시료에 비해 위암 조직 임상시료에서 고발현되는 경우가 많았고, 8종의 위암 저발현 유전자 중 2종의 유전자는 위암 조직 임상시료에서 저발현되는 경향을 나타내고 나머지 8종의 유전자는 자체 발현량이 적어서 발현여부를 확인할 수 없었다.

본 발명에서 제시한 위암 진단마커 유전자의 임상적인 유용성을 검증하는 한 방법으로 정상 위 세포주와 위암 세포주 시료에서는 웨스턴블랏팅을 이용하고, 위암 환자의 조직 시료에서 면역조직화학 염색법을 이용하여 진단마커 유전자 중 이미 항체가 확보되어 있는 CDC20과 SKB1 항체로 발현을 확인한 결과, 두 종류 모두 위암 세포주와 위암 조직 시료에서 발현이 현저히 증가됨이 확인되었다.

따라서, 20종의 위암 특이적 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9, RPS16, LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1 중에서 선택된 1종 이상의 유전자의 발현 정도를 측정함으로써 위암을 진단할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 위암 특이적 유전자들의 발현 정도를 측정하여 위암을 진단하는 방법을 상세하게 설명하면 다음과 같다: 즉,

(a) 시험 위암 조직에서 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;

(b) 비교 정상 위 조직에서 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위암 고발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;

(c) 시험 위암 조직에서 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계;

(d) 비교 정상 위 조직에서 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상의 위암 저발현 유전자의 발현량 또는 단백질의 양을 측정하는 단계; 및

(e) 상기 (a)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (b)에서 얻어진 측정값과 비교하고, 상기 (c)에 의해 얻어진 측정값을 상기 (d)에서 얻어진 측정값과 비교하여 위암 여부를 판정하는 단계를 포함한다.

본 발명은 총 20종의 마커 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9, RPS16, LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1의 발현양은 마커 유전자 또는 그 단편에 대하여 상보적인 염기 서열을 갖는 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 공지의 방법을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 경쟁적 RT-PCR 방법으로 측정할 수 있다. 이러한 프라이머는 20종 마커 유전자의 DNA 영역 중에서 단백질을 코딩하는 DNA 영역의 일부 또는 전부의 배열이 함유되고 적어도 15 bp 길이의 DNA이어야 한다. 예를 들어, 표 6에 기재된 프라이머들이 사용될 수 있다. 본 발명에서 상보적이란 적어도 15개의 연속 염기배열에서 완전히 상보적인 배열인 경우로 제한하지 않고 염기 서열상에서 70%, 바람직하게는 80% 이상의 상동성이 있으면 된다.

또한, 본 발명의 20종의 마커 유전자의 발현량은 마커 유전자 또는 그 단편을 프로브로 사용한 공지의 혼성화(하이브리다이제이션) 반응을 통하여 측정할 수 있다. 예를 들면, 노던 하이브리다이제이션("Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al., 1982, section 7.37-7.52), 인시츄 하이브리다이제이션[Jacquemier 등, Bull Cancer 90: 31-8, 2003] 또는 마이크로어레이[Macgregor, Expert Rev Mol Diagn 3: 185-200, 2003] 등의 방법으로 측정할 수 있다. 프로브는 20종 유전자의 염기 서열을 함유한 통상 200 ∼ 1000 bp이며, 바람직하게는 400 ∼ 800 bp의 길이를 가진다. 염기 서열은 20종 유전자의 염기 서열과 70% 이상의 유사성을 가지면 된다. 본 발명의 마커 유전자의 프로브는 상기에서 제조된 20종의 마커 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 이용한 유전자 증폭법(PCR) 등의 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다.

또한, 상기 20종의 위암 마커 유전자의 발현량은 각 유전자에 의하여 코드되는 단백질의 양을 측정함으로써 측정할 수 있다. 상기 방법에서 단백질은 위암마커 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 통상적인 ELISA 및 면역침강법 등에 의해 정량화될 수 있다.

본 발명의 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자에 대한 항체는 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 20종의 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩타이드도 포함되며, 본 발명의 부분 펩타이드로는, 최소한 7개 아미노산, 바람직하게는 9개 아미노산, 더욱 바람직하게는 12개 이상의 아미노산을 포함한다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.12-11.13], 모노클론날 항체[Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publish. Jhon Wiley & Sons Section 11.4-11.11] 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다. 나아가, 본 발명의 항체에는 인간화 항체(Methods in Enzymology 203, 99-121, 1991) 등의 특수항체도 포함된다.

본 발명의 20종의 위암 마커 유전자 또는 단백질은 단독으로 또는 조합하여 위암 진단에 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 위암 진단킷트는 상기 위암 특이적 마커 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머 또는 프로브 이외에 RNA 또는 폴리 (A)+ RNA 분리 시약을 더 포함할 수 있으며, 마이크로어레이를 통하여 발현양을 조사하는 경우에는 20종 유전자의 고형지지체를 포함한다.

또한, 20종의 위암 마커 유전자는 발암 관련 유전자 또는 발암 억제 유전자일 가능성이 높으므로, 이러한 표적 유전자가 코딩하는 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물은 표적 단백질을 저해 또는 촉진하는 화합물의 후보가 될 수 있으며 이는 항암제, 치료제 등의 의약품으로 사용할 수 있다.

이런 화합물을 스크리닝하는 방법으로는, 상기 20종의 위암 마커 유전자가 코딩하는 단백질을 어피니티칼럼에 고정시키고 이를 피검시료와 접촉시켜 정제하는 방법[Pandya 등, Virus Res 87: 135-143, 2002], 투하이브리드법을 이용하는 방법[Fields, S and Song, O., Nature 340: 245 -246, 1989], 웨스턴블랏팅법["Molecular Cloning - A Laboratory Manual" Cold Spring Habor Laboratory, NY, Maniatis, T. at al. (1982) section 18.30-18.74], 하이스루풋스크리닝법 [Aviezer 등, J Biomol Screen 6: 171-7, 2001] 등 다수의 공지의 방법을 사용할 수 있다. 스크리닝에 사용하는 피검시료로서는 세포 추출액, 유전자라이브러리의 발현산물, 합성저분자화합물, 합성 펩타이드, 천연 화합물 등이 있으나 이에 제한되지는 않는다.

이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: cDNA 마이크로어레이 분석에 의한 위암 관련 후보 유전자 검출

(1) 정상 위 세포주와 위암 세포주에서 총 RNA의 분리

정상 위 세포주인 Hs 677.St[ATCC CRL-7407]는 10% 소혈청(Fetal Bovine Serum)[Gibco BRL 사], 페니실린(10000 U/ml)과 스트렙토마이신(10 mg/㎖)을 첨가한 DMEM[Jeil Biotech사] 배양액을 15 cm 디쉬에 30 ㎖씩 분주한 후 디쉬당 세포가 5 ×10⁶이 되도록 접종하고 이를 37 ℃, 5% CO₂가 존재하는 배양기에서 배양하였다. 위암세포주인 SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU-638, SNU-668 및 SNU-719[한국세포주은행]는 DMEM[Jeil Biotech사] 배양액 대신에 RPMI1640[Jeil Biotech 사] 배양액을 사용한 것을 제외하고는 상기의 조건과 같은 조건에서 배양하였다.

세포의 총 RNA는 QIAGEN 킷트(RNeasy Maxi 킷트: cat#75162)를 사용하여 분리하였다. 우선, 부착 세포는 EDTA와 트립신을 이용해 회수한 후, 150 ㎕의 베타 머캅토에탄올(β-Mercaptoethanol)을 첨가한 15 ㎖의 분해 완충액(킷트 내 포함)에 용해시켰다. 여기에 15 ㎖의 70% EtOH을 첨가하여 잘 섞은 후, 3000 g에서 5분간 원심분리하여 총 RNA를 막에 부착시켰다. 두 차례의 세척 과정을 수행 후, 1.2 ㎖의 RNase가 제거된 물을 첨가하여 총 RNA를 용출, 분리하였다.

(2) Cy3 또는 Cy5를 표식한 cDNA의 합성

상기 (1)에서 추출한 총 RNA를 사용하여 3DNA Array 50 키트[Genisphere Inc, Hatfield, PA, USA]에 기재된 방법에 따라 역전사(reverse transcription) 반응을 수행하여 cDNA를 합성하였다. 즉, 위암 세포주인 실험군은 3 ㎕의 Cy5에 대한 RT 프라이머(3DNA Array 50 키트에 포함, Genisphere 사), 17 ㎕의 총 RNA(25 ㎍ 함유)을 함유한 RT 혼합물을 80 ℃에서 10분간 처리하고 바로 얼음에 방치한 후, RNase 저해제를 각각 1 ㎕ 첨가하였다. 여기에 2 ㎕의 10mM의 dNTP 혼합물(A, T, G, C 각 10 mM)와 4 ㎕의 0.1M의 DTT(dithiotreitol)[Invitrogen life technologies, USA], 250 mM 트리스-HCl(pH 8.3), 375 mM KCl 및 15 mM MgCl₂를 포함하는 8 ㎕의 5 X RT 완충액[Invitrogen life technologies, USA]을 넣고 잘 혼합하였다. 여기에 2 ㎕의 SuperScript II RNase H-역전사효소(200 unit/㎕)[Invitrogen life technologies, USA]를 넣고 42 ℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 7 ㎕의 0.5M NAOH/50 mM EDTA를 넣어 반응을 중단시키고 65 ℃에서 10분간 반응하여 반응물을 가수분해한 후 10 ㎕의 1M 트리스-HCl(pH 7.5)를 넣어 중화시켰다. 합성된 cDNA는 스핀 칼럼(Microcon YM-30)[Millipore Corporation, Bedford, MA]으로 처리하여 순수하게 분리하였다. 한편, 정상 위 세포주인 대조군은 3 ㎕의 Cy3에 대한 RT 프라이머를(3DNA Array 50 키트에 포함, Genisphere 사) 첨가하고, 상기와 동일한 방법으로 cDNA를 합성하고 분리하였다.

(3) 혼성화 반응

실험군 및 대조군으로부터 취득한 cDNA를 총 부피 40 ㎕로 혼합하고 이를 2K cDNA 칩[21C 인간유전체기능연구 사업단 제공, 한국]과 1차 혼성화 반응을 16시간 수행하였다. 그런 다음, 2% SDS를 포함하는 2XSSC, 2XSSC 및 0.2XSSC로 각각 5분간 세척하고, 95% 에탄올로 cDNA 프로브를 고정시킨 후, 다시 3DNA 포획 시약(Capture Reagent) #1과 3DNA 포획 시약 #2를 혼합하여 총 부피 40 ㎕로 2K cDNA 칩과 2차 혼성화 반응을 6시간 수행하였다. 반응 후 상기와 같은 방법으로 세척하고 최종적으로 1000 rpm에서 3분간 원심분리하여 건조시켰다. 실험군인 위암 세포주 8개에 대해서 상기와 같은 실험을 각각 두 번씩 반복 수행하여 총 16번의 마이크로어레이 실험을 수행하였다.

(4) 데이터 분석

칩상의 형광 이미지를 스캔어레이 5000 마이크로어레이 스캐너(Packard BioScience)로 532 nm에서 Cy3 및 635 nm에서 Cy5를 스캐닝하고 Gene PIX 프로그램(Axon Instruments, Inc.)을 사용하여 이미지 분석을 수행하고 R 패키지 프로그램을 이용하여 노말라이제이션(normalization)을 수행한 후 전체 16번의 실험 결과를 모아서 SAM(Significance Analysis of Microarrays) 프로그램을 이용하여 SAM 점수(scores)에 따라 위암 세포주에서 발현량이 증가 또는 감소하는 의미있는 유전자를 분석하였다. 그 결과, 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자 를 발굴하였다[표 3].

실시예 2: RT-PCR 반응에 의한 선별된 표적 유전자의 발현량 분석

cDNA 마이크로어레이에서 발굴한 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR 방법을 통해 정량적으로 분석하였다.

(1) 역전사 효소 반응

상기 실시예 1에서 분리한 총 20종의 총 RNA 중에서 각각 5 ㎍의 총 RNA을 사용하여 다음 표 4와 같은 역전사 반응액에서 42 ℃, 60분간 반응시켜 총 9종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭(heating block)에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

poly dT(12-18) 프라이머 (0.4 ㎍/㎕)	1㎕
5X first-strand buffer	4㎕
10mM dNTP 혼합물	1㎕
0.1M DTT	2㎕
RNaseOUT (40 U/㎕)	1㎕
역전사효소 (200 U/㎕)	1㎕
총 RNA (5 ㎍)	X㎕
증류수	(10-X)㎕
총 부피	20㎕

(2) 경쟁적(competitive) PCR을 이용한 cDNA의 증폭 및 발현량 확인

① 경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정

마커 유전자를 정량하기 위한 표준 유전자로 본 실험에서는 베타-엑틴 유전자를 사용하였다. 표준 유전자와 프라이머의 프라이밍 부분은 같으나, PCR 산물의 크기가 다른 경쟁 DNA(competitor)를 표준 유전자와 함께 PCR 반응을 수행하여, 시료간 표준 유전자의 발현양과 경쟁 DNA의 발현양이 같은 농도를 찾아, PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다.

베타-엑틴 경쟁 DNA는 시판의 DNA[Takara, 일본]를 사용하였으며, 이를 이용한 PCR 산물의 길이는 340 bp이며, 베타-엑틴 유전자로부터 PCR 산물의 길이는 275bp였다. 베타-엑틴 경쟁 DNA를 6 단계로 희석하고, 희석한 2 ㎕를 상기 (1) 의 역전사 효소 반응액의 희석액 5 ㎕에 각각 혼합한 후, 3 ㎕의 5XPCR 반응액[바이오니아, 한국], 각각 0.6 ㎕의 2종류의 베타-엑틴 프라이머[10 pmole/㎕: 정방향 프라이머(서열번호 1) : 5'-caagagatggccacggctgct-3', 역방향 프라이머(서열번호2) : 5'-tccttctgcatcctgtcggca-3'], 3.8 ㎕의 증류수를 함유한 총 15 ㎕의 6개 PCR 반응액을 사용하여 경쟁적 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 반응 조건은 94 ℃(30초), 68 ℃(1분), 72 ℃(1분)로 25회씩 수행하였다.

PCR 산물을 2% 아가로스 젤에 3 ㎕씩 로딩하여 100 V에서 30분 전기영동한 후, Frog^TM 기계(젤 이미지 어낼리시스 시스템)[Core Bio 사]를 이용하여 젤 사진을 촬영하였다. 최종적으로 얻은 젤 밴드 이미지 파일(.tif)을 ToltalLab v1.0 프로그램[NonLinear Dynamix 사]을 이용하여, 두 밴드(베타-엑틴 경쟁 DNA에서는 340 bp, 원래 베타-엑틴유전자에서는 275 bp)의 감도가 비슷한 농도를 선별, 정량화한 후, 각 시료의 농도를 보정하였다.

② PCR을 이용한 cDNA의 증폭

상기 ①에서 보정한 시료의 cDNA를 각 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 함유한 다음 표 5의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때, PCR 반응은 94 ℃ 1분, 55 ℃ 30초, 72 ℃ 1분으로 25회씩 수행하였다.

위암 특이적 고발현 유전자 12종인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16와, 위암 특이적 저발현 유전자 8 종인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1의 프라이머는 다음 표 6과 같이 단백질 코딩 영역 내부에서 디자인하였고, 각 프라이머의 길이는 19 ∼ 22 bp, GC 함량은 45 ∼ 60% 정도이다. 다음은 PCR 반응액의 조성을 나타낸다.

cDNA	5 ㎕
5X PCR 반응 mix[바이오니아 사]	3 ㎕
정방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
역방향 프라이머 (10pmole/㎕)	1 ㎕
증류수	5 ㎕
총 부피	15 ㎕

경쟁적 PCR에 사용한 각 위암 마커 유전자들의 프라이머

유전자	정방향 프라이머(5'-> 3')	역방향 프라이머(5'-> 3')
CKS1B	acgacgacgaggagtttgag (서열번호 3)	ccgcaagtcaccacacatac (서열번호 4)
D1S155E	gcaacaaagtcagtgcaga (서열번호 5)	cctcatctcctgcctgtagc (서열번호 6)
FKBP4	caccaaatgctgagctgaaa (서열번호 7)	ggctttgttgttggggtaga (서열번호 8)
SKB1	caagttggaggtgcagttca (서열번호 9)	gcccactcataccacacctt (서열번호 10)
NT5C3	tgatgccagaattccagaaa (서열번호 11)	caacattggccactccatct (서열번호 12)
p30	cttctcgcttcaagctcctg (서열번호 13)	tgttcttgatggtcttgtgctc (서열번호 14)
GPI	tcacggacgtcatcaacatt (서열번호 15)	aagaagttggccaggaggat (서열번호 16)
PRO2000	aatgagaccggaaacacagg (서열번호 17)	ttgcgatgccgataaataca(서열번호 18)
CDC20	gtacctgtggagtgcaagc (서열번호 19)	gtaatggggagaccagagg (서열번호 20)
FEN1	catggactgcctcaccttc (서열번호 21)	cggtcaccttgaagaaatc (서열번호 22)
ZNF9	ttcaagtgtggacgatctgg (서열번호 23)	ttgctgcagttgatggctac (서열번호 24)
RPS16	tgcagtctgtgcaggtcttc (서열번호 25)	atcggtaggatttctggtagc (서열번호 26)
LGALS1	gacgctaagagcttcgtgct (서열번호 27)	gtagttgatggcctccaggt (서열번호 28)
PEA15	ctgcaagacctgaccaacaa(서열번호 29)	acttcttggcactggggata (서열번호 30)
FLJ34386	tcactcttctccaaaaacctga(서열번호 31)	agtgaggcaggaggaattga (서열번호 32)
SEC61A1	ctcccaaatgctctcagctc (서열번호 33)	caacctcgctttgctcctta (서열번호 34)
MT2A	atggatcccaactgctcct (서열번호 35)	ctttgcagatgcagccttg (서열번호 36)
MAGED2	agcaccttagagcccactga (서열번호 37)	gggctttggctttagcttct (서열번호 38)
NPDC1	gcccagactggaagatgaga (서열번호 39)	tccttgggtggctctttatg (서열번호 40)
CXX1	ggaggaggacgaggacttct (서열번호 41)	tgggcagaatgatgtagtcg (서열번호 42)

③ 경쟁적 PCR을 이용한 발현량 확인

PCR 반응에 의해 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액을 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분간 전기영동하였다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 12종의 위암 고발현 유전자의 발현량은 정상 위 세포주 Hs 677.St보다 위암 세포주인 SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-601, SNU-638, SNU-668 및 SNU-719에서 발현량이 높았으며, 8종의 위암 저발현 유전자의 발현량은 정상 위 세포주보다 위암 세포주에서 낮은 발현량을 보였다. 즉, 12종의 위암 후보 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16은 위암 마커로서 유용함이 확인되었고 8종의 위암 저발현 유전자 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1는 위암 억제 마커로 사용 가능한 것이 확인되었다.

실시예 3: 임상 시료에서 위암 고발현 유전자와 저발현 유전자의 발현량 확인

본 실험에서는 충남대 의과대학교에서 제공한 25명의 위암 환자로부터 직접 채취한 정상 위 조직과 위암 조직의 쌍으로 총 50개의 임상 시료에서, 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자의 발현량을 경쟁적 RT-PCR법을 사용하여 수행하였다.

(1) 총 RNA 분리 및 역전사 효소 반응

상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 50개의 임상시료로 부터 총 RNA를 분리하고, 상기 실시예 2-1)에서와 같이 각 시료의 총 RNA 5 ㎍을 사용하여 42 ℃, 60 분간 역전사 반응을 수행함으로써 총 50종의 1^st cDNA를 합성하였다. 그 후, 70 ℃ 가열 블럭에서 15분간 반응함으로써 cDNA 합성을 종료시켰다.

(2) 경쟁적 PCR을 이용한 각 유전자의 발현량 확인

경쟁적 PCR을 위한 주형의 농도 보정은 상기 실시예 2-2)-①에서와 동일한 방법으로 PCR에 사용되는 각 주형의 농도가 동일하게 되도록 시료의 농도를 보정하였다. 보정한 시료의 역전사 반응액을 2 ㎕씩 주형으로 이용하여 각 유전자의 정방향 프라이머 및 역방향 프라이머를 함유한 총 15 ㎕의 PCR 반응액에서 증폭시켰다. 이때 PCR 반응은 94 ℃ 30초, 55 ℃ 1분, 72 ℃ 1분을 25회씩 수행하였다. 사용된 프라이머는 상기 표 6에서 표시된 것과 같다. 증폭된 PCR 산물을 확인하기 위하여, PCR 반응액 전부를 2%의 아가로스 젤에 100V로 30분으로 전기영동한 후, PCR 산물을 상기 ①에서와 같이 ToltalLab v1.0 프로그램(NonLinear Dynamix Ltd.)을 이용하여 정량화하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. X축은 위암 진행단계(IA, IB, II, IIIA/B, IV)별의 정상 위 조직(하얀색 막대 그래프)과 위암 조직(검은색 막대 그래프)을 나타내며, Y축은 각종 시료에서 발현되는 표적 유전자의 발현량을 베타-엑틴의 발현량으로 나눈 값을 표기하였다. 위암 고발현 유전자인 FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 동일 환자에서 채취한 정상 위 조직에서보다 위암 조직에서 높은 경우가 더 많았으며, 위암 저발현 유전자인 MT2A와 CXX1 유전자의 경쟁적 RT-PCR 산물량은 위암조직에서 보다 정상 위 조직에서 더 높게 나타나는 경향이 확인되었다. 하지만, 나머지 8종의 유전자는 자체 발현량이 적어서 발현여부를 확인할 수 없었다.

실시예 4: 정상 위 세포주와 위암 세포주에서의 웨스턴 블랏팅법에 의한 위암 고발현 유전자의 발현량 확인

본 실험에서는 RT-PCR방법에 의해 확인된 총 20종의 위암 진단마커 유전자 중, 현재 시판되고 있는 2종의 CDC20과 SKB1 단백질에 대한 항체를 이용하여 정상 위 세포주와 위암 세포주에서 CDC20과 SKB1의 단백질 발현량을 분석하였다.

실시예 1-(1)에서와 같이 세포주를 배양, 집균한 후, 세포주들의 세포파쇄액을 얻기 위하여 파쇄 완충액(lysis buffer; 50 mM TrisㆍHCl[pH 7.6], 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1 mM aprotinin, 1 mM PMSF)에 세포들을 현탁시켰다. 이를 4 ℃에서 1시간 동안 방치하고 12,000 rpm에서 30분간 원심분리하여 세포 내 단백질들을 상등액으로 회수하였다. 회수된 각각의 상등액을 브래드포드 시약[Bio-Rad, USA]으로 정량하여 동일한 양(50 ㎍)의 세포파쇄액을 10% SDS-PAGE에서 전기영동한 후, 나이론 막 필터[Millipore Corporation, USA]에 단백질들을 옮겼다. 이를 위암 고발현 유전자에 해당하는 CDC20의 모노클로날 1차 항체[Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA], SKB1의 폴리클로날 1차 항체[Cell Signaling Technology, Inc, USA] 및 표준 단백질인 ACTIN의 모노클로날 1차 항체[Sigma, USA]과 각각 1:1000, 1:1000 및 1:50000으로 반응시켰다. 반응이 끝난 후 TBST 용액(Tris-buffered saline, with 0.05% Tween20)으로 3회 세척한 후에, 2차 항체인 peroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG[Jackson ImmunoResearch, USA]와 horseradish peroxidase-conjuated goat anti-mouse antibody[Promega, USA]으로 반응을 하였다. 반응이 끝난 후, TBST 용액으로 3회 세척한 후에 ECL kit[Amersham Pharmacia, USA]로 immuno-reactive signal을 확인하였다. 그 결과 도 4에서 보는 바와 같이 위암 고발현 유전자로 발굴된 CDC20의 경우, CDC20 단백질의 발현량도 정상세포주인 Hs 677.St 보다 위암 세포주들에서 전반적으로 높음이 확인되었고, SKB1의 경우에도 위암 세포주에서 특히, SNU-1, SNU-16, SNU-216, 및 SNU-638에서 단백질 발현량이 높은 것이 확인되었다.

실시예 5: 면역조직화학 염색법을 이용한 위암 조직 시료에서의 위암 고발현 유전자의 단백질 발현량 확인

본 실험에서는 RT-PCR방법에 의해 확인된 총 20종의 위암 진단마커 유전자 중, 현재 시판되고 있는 2종의 CDC20와 SKB1 단백질에 대한 항체를 이용하여 을지의과대학교에서 제공된 위암 환자로부터 적출한 정상 위 조직과 위암 조직에서 CDC20과 SKB1의 단백질 발현량을 분석하였다.

종양 환자로부터 적출한 조직을 10% 중성 포르말린(formalin) 완충용액으로 고정한 후, 녹아 있는 상태의 파라핀에 포매하였다. 파라핀으로 포매시킨 조직을 마이크로톰(microtome)으로 얇게 박절한 후 상기 절편을 유리 슬라이드 위에 고정하여 자일렌(xylene)과 히스토클리어(histoclear) 용매로 파리핀을 제거하였다. 상기 절편을 1 M 트리스 완충용액으로 세척한 후, 1차 항체로 1 M 트리스 완충용액으로 200배 희석한 위암 고발현 유전자인 CDC20과 SKB1의 단백질에 대한 항체와 40 ℃에서 20분 동안 처리하였다. 반응하지 않은 항체를 1 M 트리스 완충용액으로 완전히 세척하여 제거한 후, 2차 항체로 바이오틴(biotin)이 결합된 아비딘-양고추냉이 퍼옥시다아제(avidin-horseradish peroxidase) 용액[Immunotech사]을 40 ℃에서 10분 동안 처리하였다. 반응하지 않은 2차 항체를 완전히 세척하여 제거한 후 상기 절편을 퍼옥시다아제 기질용액인 0.05% H₂O₂를 포함한 3-아민-9-에틸카바졸(3-amine-9-ethylcarbazole) 용액에 반응시켜 메이어 헤마톡실린(Meyer's hematoxylin)으로 상호 염색시키고 슬라이드를 봉합한 뒤 광학 현미경으로 확인하였다[도 4].

도 4에서는 a와 d는 정상 위 조직을 나타내고, b와 e는 중등도 분화된(moderately-differentiated) 위암 조직을 나타내고, c와 f는 하등도 분화된(poorly-differentiaed) 위암 조직을 나타낸다. 도 4의 a, b, c는 CDC20 단백질의 발현을 위암 조직 시료에서 확인한 것으로, 정상 위 조직 시료에 비해 위암 조직 시료에서 CDC20 단백질의 발현량이 높음이 확인되었으며, 분화가 덜된 위암 조직시료에서 CDC20 단백질의 발현량이 더 높음이 확인되었다. 또한, 위암의 분화 정도에 따라 CDC20 단백질의 존재 위치가 변하는 것(localization change)이 관찰된다. 즉, 정상 위조직에서는 CDC20 단백질이 세포질(cytosol)에 넓게 존재하는 반면에, 위암의 진행 정도가 높은 하등도 분화(poorly-differentiaed) 위암 조직에서는 핵주변(perinuclear region)에 많이 존재하였다. 도 4의 d, e, f는 SKB1 단백질의 발현을 위암 조직 시료에서 확인한 것으로 정상 조직 시료에서보다 위암조직 시료에서 많이 발현됨이 확인되었고, 또한 핵부분(nuclear region)으로의 SKB1 단백질의 위치이동이 관찰되었다. 이와 같이, 위암 고발현 유전자로 선별된 CDC20과 SKB1 유전자가 코딩하는 CDC20 단백질과 SKB1 단백질의 발현량도 위 정상 조직에 비해 위암 세포주와 위암 조직 임상시료에서 많이 발현됨이 확인되었고, 이와 더불어 이들 단백질의 존재 위치 변화도 관찰되었다.

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명은 위암 진단에 유용한 마커로 12종의 위암 고발현 유전자와 8종의 위암 저발현 유전자를 제공하며, 상기 종양 마커 유전자들은 환자 조직에서 신속하고 민감하게 정량하여 위암을 효과적으로 진단하는데 사용될 수 있다.

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위암 특이적 고발현 유전자인 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 3 내지 26으로 표시되는 프라이머 쌍과, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 대한 상보적인 염기서열을 갖는 서열번호 27 내지 42로 표시되는 프라이머 쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 진단킷트.
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위암 특이적 고발현 유전자 CKS1B, D1S155E, FKBP4, SKB1, NT5C3, p30, GPI, PRO2000, CDC20, FEN1, ZNF9 및 RPS16으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질과, 위암 특이적 저발현 유전자인 LGALS1, PEA15, FLJ34386, SEC61A1, MT2A, MAGED2, NPDC1 및 CXX1으로 구성되는 군 중에서 선택되는 하나 이상의 유전자에 의하여 코드되는 단백질에 시험 화합물을 결합시키고, 시험 화합물이 상기 단백질의 작용을 촉진 또는 억제하는지를 확인하는 것을 특징으로 하는 위암 억제제의 스크리닝 방법.