KR20030011982A - ｃＤＮＡ 마이크로어레이 분석법을 이용한 위암의 진단과항암제 개발에 사용되는 표적유전자 및 이것이 배열된마이크로어레이용 고형 지지체 - Google Patents

ｃＤＮＡ 마이크로어레이 분석법을 이용한 위암의 진단과항암제 개발에 사용되는 표적유전자 및 이것이 배열된마이크로어레이용 고형 지지체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 cDNA 마이크로어레이(microarray) 분석법에 의해, 위암조직 및 정상 위조직에서의 유전자 발현 양상(profile)을 얻어내고, 이로부터 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 표적유전자를 동정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 동정된 표적유전자를 이용하여, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩티드 및 분자량이 작은 화학물질 등의 위암에 대한 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해 얻어지는 위암조직에서의 유전자 발현 양상의 분석을 통해 위암의 전이성에 기초한 위암의 분류방법에 관한 것이다.

Description

ｃＤＮＡ 마이크로어레이 분석법을 이용한 위암의 진단과 항암제 개발에 사용되는 표적유전자 및 이것이 배열된 마이크로어레이용 고형 지지체{Target gene for diagnosis of gastric cancer and development of anticancer drugs identified by cDNA microarray analysis and solid support for microarray analysis arrayed the same}
본 발명은 cDNA 마이크로어레이(microarray) 분석법에 의해, 위암조직 및 정상 위조직에서의 유전자 발현 양상(profile)을 얻어내고, 이로부터 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 표적유전자를 동정하는 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 상기 동정된 표적유전자를 이용하여, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩티드 및 분자량이 작은 화학물질 등 위암에 대한 항암제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 cDNA 마이크로어레이 분석을 통해 얻어지는 위암조직에서의 유전자 발현 양상의 분석을 통하여 위암의 전이성에 기초한 위암의 분류방법에 관한 것이다.
위암은 전세계에서 가장 널리 분포되어 있는 암 중에 하나이다. 위암은 후발성(late-onset) 질환으로, 암중에서 위암의 발병율은 대한민국, 일본 등의 아시아 국가에서 1위 또는 2위로 가장 높다. 다른 암들에 비해 위암은 화학요법 (chemotherapy)에 대해 높은 저항성을 갖고, 후발성 질환이기 때문에, 암의 조기 진단이 위암의 가장 효과적인 예방 및 치료방법이다. 현재, 위암의 진단은 내시경 검사에 의존하고 있지만 가격이 매우 비싸고, 내시경에만 의존하여 여러 종류의 위암을 구별할 수 없다. 따라서, 내시경을 통해 위암을 발견했다고 하더라도, 위암의 분류에 따른 적절한 치료방법 및 치료제를 선택하는데 문제가 많다.
위암치료는 대부분 외과절제술 및 일부 약물들을 이용하는 화학요법으로 이루어진다. 또한, 위암의 완치를 위해서는, 위암의 초기 임상진찰시, 위암조직의체계적인 검출방법 및 발견된 위암조직을 정확하게 분류하는 것이 매우 중요하다. 즉, 종래에는 임상적, 형태학적 특징에 따라 위암을 분류하였기 때문에, 유전학적 수준에서 다르게 분류될 수 있는 환자들도 동일한 진단을 받을 수 있었다. 따라서, 종래의 분류에 따른 위암의 치료방법 및 치료제를 적용하였을 때, 위암이 치료되지 않는 경우가 많았다. 또한, 지금까지 개발된 항암제는 그 종류가 많지 않아, 다양하게 분류되는 위암 치료시, 그 분류에 따른 적절한 항암제를 선택하는 것도 한계가 있었다. 따라서, 한 집단에서 나타날 수 있는 모든 종류의 위암에 대해 각각의 분류에 따라 효과적으로 적용할 수 있는 약물들의 개발이 요구되고 있다. 이를 위해서는, 위암치료를 위한 표적유전자를 선정하는 것이 무엇보다도 중요하다. 즉, 위암의 단계에 따라 위암의 분화정도, 침입특성, 유전자들의 발현형태 및 발현량이 달라진다. 따라서, 위암의 분류에 따라 적절하게 투여할 수 있는 약물을 개발하기 위해서는, 각 단계마다 합당한 표적 유전자를 선택하고, 표적 유전자의 기능을 조절할 수 있는 물질을 찾는 것이 중요하다.
이에, 많은 제약회사 및 연구소에서는, 위암 분류에 따라 달리 사용할 수 있는 항암제 후보물질을 찾기 위해 많은 연구가 진행되었으나, 랜덤 접근방식(random approaches)에 의해 항암제 후보물질을 찾아왔기 때문에 엄청난 연구비용과 시간이 투자되어야 했고, 항암제 후보물질이 찾아졌다 하더라도 이들 물질이 임상실험에서 부작용이 있을 수 있어 부작용이 없는 항암제를 개발하기란 매우 어려웠다. 또한, 찾아진 항암제 후보물질의 위암치료에서의 작용 기작이 명확히 밝혀지지 않을 경우, 위암 분류에 따른 적용이 어려우므로, 이들의 작용 기작을 밝혀내는데에도 엄청난 연구비용과 시간을 투자하여야만 한다. 따라서, 당업계에서는, 이러한 랜덤 접근방식에 의한 종래의 항암제 개발방법을 대체할 수 있는 새로운 방법이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 새로운 항암제를 개발하기 위한 새로운 방식을 찾고자 많은 연구를 수행한 결과, 마이크로어레이(microarray) 분석방법에 의해서, 위암에서만 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 유전자들을 동정할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명의 목적은, 위암조직 및 정상 위조직에서의 유전자 발현 양상을 cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 분석하여 과발현되거나 저발현되는 표적유전자를 동정하고, 위암의 진단을 위해, 상기 동정된 위암진단용 표적 유전자를 배열한 마이크로어레이 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 다른 목적은, 전이성이 높은 위암조직과, 전이성이 낮은 위암조직에서의 유전자 발현양상을 cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 분석하여 전이성이 높은 위암조직에서 과발현되거나 저발현되는 표적유전자를 동정하고, 위암의 전이율을 분석하기 위해, 상기 동정된 위암 전이율 분석용 표적유전자를 배열한 마이크로어레이 고형 지지체를 제공한다.
또한, 본 발명의 또 다른 목적은, 상기 마이크로어레이 고형지지체를 이용하여 동정된 위암진단용 표적 유전자 및 위암 전이율 분석용 표적유전자를 이용하여, 위암에 적용하기 위한 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
도 1은 22쌍의 실험시료에 대해 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행한 결과이다.
<도면기호에 대한 설명>
가로축: 단일유전자
각각의 열: 동일 환자로부터 분리한 정상 위조직 또는 위암조직
녹색 사각형: 정상조직에서 과발현되는 유전자
검은색 사각형: 검출수준 이하에서의 유전자
붉은 사각형: 위암조직에서 과발현되는 유전자
회색 사각형: missing data
도 2는 림프절로 전이율이 높은 남성 위암 조직과 전이율이 낮은 남성 위암조직에서 총 2,400개 유전자들의 발현 양상을 각각 비교한 그림이다.
상기한 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 총 2,400개의 cDNA를 마이크로어레이의 고형 지지체에 고정시키고, 여기에 정상 위조직 및 위암조직으로부터 분리한 mRNA로부터 역전사 반응 및 형광물질 표지화에 의해 제작된 표지화된 cDNA로, 상기 고형 지지체를 하이브리드형성시킨 후, 마이크로어레이의 고형 지지체에서 검출되는 신호를 분석하여 정상 위조직에 비해 위암조직에서 발현이 증가되거나 감소되는 유전자들을 검출함으로써, 위암의 표적유전자를 동정함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은, 상기에서 동정된 표적 유전자들 중에서 선택된 적어도 1종이상의 유전자의 cDNA를 배열시킨 마이크로어레이용 고형 지지체를 제작하고, 이 고형 지지체에 위암조직일 것으로 판단되는 조직시료로부터 분리한 mRNA로부터 제작한 cDNA로 하이브리드형성을 시킨 다음, 상기 표적 유전자의 발현량을 분석함으로써, 위암을 진단함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은, 전이율이 높은 위암조직 및 전이율이 낮은 위암조직으로부터 유전자 발현양상을 cDNA 마이크로어레이 방법에 의해 분석함으로써, 위암의 전이성에 관여하는 표적유전자를 제공함을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은, 이들 전이성에 관여하는 1종 이상의 표적 유전자의 cDNA를 마이크로어레이 고형지지체에 배열시키고, mRNA로부터 역전사 반응 및 형광물질 표지화에 의해 제작된 표지화된 cDNA로 하이브리드형성을 수행함으로써, 상기 위암 시료조직의 전이성을 분석하고, 분석된 전이성과 과발현 또는 저발현된 유전자 발현 양상에 기초하여 위암을 분류하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명은 상기에서 동정된 위암 관련 표적유전자 및 위암의 전이성에 관련된 유전자들을 이용하여, 적절한 항암제를 스크리닝하는 것을 특징으로 한다.
이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.
본 발명의 cDNA 마이크로어레이 분석법은, 정상 위조직 또는 위암조직에서 발현이 되는 모든 유전자의 cDNA, 즉 어레이 요소를 배치시킨 마이크로어레이 위에, 정상 위조직 또는 위암조직으로부터 분리한 mRNA로부터 역전사 반응에 의해 제작한 cDNA로 하이브리드형성을 시켜, 정상 위조직 또는 위암조직에서의 mRNA 발현량 및 발현형태를 분석하는 방법이다. 여기에서, 마이크로어레이는 프로브에 부착되는 작은 2차원 표면으로, DNA 분자가 결합된 경질 또는 반경질 지지체로 정의되는 기질 위에 어레이 요소들이 정렬된 배열을 의미한다.
마이크로어레이 기술은 단 한번의 하이브리드형성을 수행함으로써, 한 조직에서 발현되는 수십, 수백, 수천 또는 수만 개 유전자의 발현량 및 발현형태를 파악할 수 있으므로, 질환 상태의 연구, 약물 표적의 동정, 및 시간의 경과에 따른 유전자 발현양상, 조직 특이적 유전자 발현양상 및 여러 세포상태변화에 따른 유전자의 발현양상을 분석하기 위한 방법으로 사용되어왔다. 이에 대한 논문들은 참고문헌 1-5 에 수록되어있다.
본 발명에서는, 마이크로어레이 분석법이 정상 위조직과 위암조직을 구분하는데 유효한 수단으로서도 이용될 수 있음을 주목하였다. 즉, 마이크로어레이 분석법을 이용하여, 위암에 특이적이거나 과발현되는 유전자를 동정하여 위암을 동정하고, 동정된 유전자를 표적 유전자로 하여 항암제 개발의 기초적인 자료를 제공할수 있다. 또한, 마이크로어레이 분석법에 의해서 과발현되는 것으로 확인된 유전자들은, 종양의 발생, 전파 또는 전이, 암의 표현형의 유지를 위한 기능에 관련되어 있는지의 여부와, 이들 유전자 발현양상을 분석함으로써, 위암의 전이율, 분화율 및 발생율 예측 등을 할 수 있다.
따라서, cDNA 마이크로어레이 분석법을 이용함으로써, 짧은 시간동안 위암 조직에서의 모든 유전자 발현양상을 동시에 모니터함으로써, 표적유전자의 선정을 쉽게 할 수 있고, 결과적으로, 이러한 cDNA 마이크로어레이 분석법을 이용하면, 상대적으로 짧은 시간 동안에 많은 약물의 개발이 가능하다.
또한, 본 발명은 병리학적 방법 이외에, 위암 조직에서의 유전자 발현양상에 기초하여, 위암조직의 분류를 가능하게 한다. 즉, 위암조직의 전이율 및 분화율을 높이는 유전자의 발현수준을 분석함으로써, 위암의 분류를 행할 수 있다.
이러한 위암의 분류를 통하여, 각 위암환자들에게 위암종류에 따른 적절한 치료방법 및 약물을 선택하여, 위암의 완치를 더욱 수월하게 행할 수 있다.
종래에, 위암은 그의 형태 및 분화 상태에 기초하여 분류되었다. 즉, 현미경 검사를 통한 위암의 형태를 관측하고, 생화학적 검사에 의해 결정된 수치를 통하여 위암을 분류하였다. 이 같은 분류는 매우 주관적이어서, 암의 원인 및 진행상태를 정확히 파악할 수 없고, 위암의 발병을 예측할 수 없으며, 적절한 치료법을 선택하기도 힘들기 때문에, 적절한 위암의 치료법을 찾기에 충분하지 않다.
그러나, 본 발명의 cDNA 마이크로어레이법을 사용하면, 위암의 발병원인을 유전자 수준에서 파악할 수 있다. 즉, 본 발명의 cDNA 마이크로어레이법을 사용하면, 위암조직에서 발현되는 모든 유전자 중에서 어떤 유전자의 변형에 의해 위의 종양형성(gastric tumorigensis)이 유도되는지를 파악할 수 있다. 본 발명에서는, 총 2,400개의 유전자에 대해 cDNA 마이크로어레이법을 수행하여, 정상 위조직이 종양조직으로 변형되면서 발현량이 변화되는 유전자들을 동정하였고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 하기 표 1에 기재된 유전자들은, 수술 또는 화학요법치료를 받고 있는 22명의 위암환자로부터 분리한 위암조직 및 정상조직에서 발현되는 유전자들에 대해 본 발명의 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행한 도 1의 결과 중에서, 이들 환자들 중 60%이상에서 확인된 것으로서 위암조직에서의 유전자 발현이 정상조직에서의 유전자 발현에 비해 과발현되거나 저발현된 유전자들의 목록을 작성한 것이다.
본 발명은, 하기 표 1에 기재된 유전자들 중, 1종 이상의 유전자의 cDNA를 배열시킨 마이크로어레이용 고형 지지체를 제작하고, 이 고형지지체에 위암조직일 것으로 판단되는 조직시료로부터 분리한 mRNA로부터 제작한 cDNA로 하이브리드형성을 시켜 상기 표적 유전자의 발현량을 분석함으로써, 위암을 진단할 수 있다.
과발현(≥2배) 프리프로(prepro)-α2(I) 콜라겐의 mRNA프로필린 Ⅱ(Profilin Ⅱ)프리프로-α1(I) 콜라겐의 mRNAC-시스/혈소판 유래 성장 인자 2(SIS/PDGF 2)보체성분 C3 mRNA, α 및 β 서브유닛들CPE 수용체의 hCPE- R mRNA염색체 분리 유전자 동족체(homolog) CAS프로-α-1 타입 3 콜라겐의 mRNA타입 Ⅵ 콜라겐 α3 사슬의 mRNA세린 프로테아제의 mRNA
과발현(≥2배) 프로스타사이클린-자극 인자루미칸(Lumican)미토틱 센트로메르-관련 키네신(Mitotic centromere-associated Kinesin)BST-2 유전자HMG-Y 유전자피브로블라스트 콜라겐나아제 억제 유전자ATP 분해 유전자
저발현(≤0.5배) 다이하이드로디올 디하이드로게나아제리보뉴클레아제 A(RNase A)의 mRNA추정(putative) 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 mRNA디하이드로디올 디하이드로게나아제성인 골격근 α-액틴 mRNA글루타민 합성효소의 mRNA(E.C. 6. 3.1.2)에즈린(ezrin)의 mRNA크리에이틴 키나아제 BMT-1l mRNA액포 H+ATPase 양성자 채널 서브유닛MHC 클래스 Ⅰ HLA-C-α-2 사슬 또는 클론 4 및 10TEGT 유전자글루타민 합성효소의 재배열된 mRNA글루타치온 퍼옥시다아제의 mRNAKIAA0391 유전자의 mRNANIPSNAP1 단백질의 mRNADoc2 β의 mRNAβ-액틴의 mRNAADP/ATP 운반체 단백질혈관 평활근 α-액틴의 mRNASREBP-1세포체 γ-액틴의 mRNA프로스타신(prostasin)골격근 LIM-단백질 FHL1단백질 포스파타아제-1 촉매성 서브유닛단백질 타이로신 포스파타아제의 CL 100 mRNAβ2-마이크로글로블린면역글로블린 κ사슬(VNJ)의 재배열(rearranged) mRNA1g 재배열된 κ-사슬 mRNA 가변부, 연결부, 불변부플라즈마 글루타치온 퍼옥시다아제의 GPx-3 mRNA면역글로블린 κ-라이트 사슬의 mRNA장 평활근 γ-액틴의 mRNA
위암조직에서 과발현되는 유전자들은, 예를 들면, 프로필린(profilin) Ⅱ, 프리프로(prepro)-α2(Ⅰ)형 콜라겐, 프로-알파-1 3형 콜라겐 등의 구조유전자; 아포톱시스 및 세포증식의 두가지 기능을 갖는 CAS 유전자; 화농성 감염에의 민감성에 관여하는 보체성분(complement component) C3; 혈청에서 다량 존재하는 미토겐(mitogen, 유사분열물질)인 Sis/PDGF; 기질유래 단백질로 콜라겐과 상호작용하는 루미칸(lumican); 및 결장암에서 발현량이 증가가 되는 프로스타사이클린-자극인자 (prostacyclin-stimulating factor) 등을 포함한다. 한편, 콜라겐이 위암조직에서 과발현된다는 사실은 위암조직이 기질기원이라는 것을 제시한다.
한편, 위암조직에서 저발현되는 유전자에는, 예를 들어, 세포가 산화되는 것을 막는 해독작용(detoxification) 및 암의 탈분화(dedifferentiation)에 관여하는 MT-11(Metallothionein), DHD(Dihydrodiol dehydrogenase) 및 글루타치온 퍼옥시다아제; 세포괴사에 대항하여 세포를 보호하는 CL100 단백질 타이로신 포스파타아제(protein tyrosine phosphatase); 세포의 이동, 침입 및 부착에 관여하는 에즈린(Ezrin); 및 세포괴사에 관여하는 리보뉴클레아제 A(ribonuclease A) 등을 포함한다.
본 발명은, 위암조직에서 과발현되는 유전자를 이용하여, 항암제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
예들 들면, 위암 조직에서 과발현되는 유전자의 전사 또는 번역을 억제하기 위해서, 과발현되는 유전자의 염기서열에 기초하여 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 설계할 수 있다. 암관련 유전자들의 발현수준을 감소시키는 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 항암제로 이용할 수 있다. 설계된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포내로 침투시키기 위해서 리포펙틴 또는 리포펙타민으로 포장(packaging)시키고, 포장된 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 세포내로 주입시켜, 표적 유전자의발현량을 감소시킬 수 있다. 설계된 올리고뉴클레오타이드의 효과는 안티센스 올리고뉴클레오타이드를 처리한 세포에서, 표적유전자의 발현량 감소효과로 판단할 수 있으며, 표적 유전자 발현량의 측정은 RT-PCR법 및 노던 블랏법으로 발현된 mRNA의 수준을 측정하는 것, 웨스턴 블랏법 또는 면역침전법에 의해 단백질 수준에서 측정하는 방법으로 행해질 수 있다.
또한, 상기 위암조직에서 과발현되는 표적유전자를 발현벡터에 클로닝하여, 상기 표적유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻어내고, 얻어진 단백질로부터 상기 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대한 항체를 통상적인 방법에 의해 제조할 수 있다. 제조된 항체는 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되는 단백질을 검출함으로써, 위암의 진단에 이용될 수 있다. 상기 항체를 이용한 단백질 발현수준의 검출은 ELISA법, 웨스턴 블롯법 또는 면역침전법에 의해 행해질 수 있다.
또한, 상기 위암조직에서 과발현되는 표적유전자가 코딩하는 단백질을 정제하고, 정제된 단백질에 결합하는 작은 분자의 화합물을 스크리닝하여, 이들 작은 분자를 항암제로서 이용할 수 있다. 상기 표적유전자가 코딩하는 단백질의 정제는, 1) 프로모터 서열 및 His 태그 또는 GST 태그와 같은 분자 태그들을 함유하는 발현벡터에 표적유전자를 도입하고; 2) 상기 발현벡터를 숙주세포에 형질감염 또는 형질전환시켜 표적유전자를 발현시킨 후; 3) 세포를 용해시킨 다음, 세포 용해물로부터 발현된 표적 단백질을 Ni2+수지 또는 GST-세파로스를 사용하여 정제함으로써 표적유전자가 코딩하는 단백질(이하, '표적 단백질'이라 함)을 얻어낸다. 얻어진표적단백질에 화합물 및 펩티드 라이브러리를 스크리닝하여, 표적단백질에 결합하는 화합물 및 펩티드를 얻어낼 수 있다. 이러한 화합물 및 펩티드는 임상실험을 거쳐 항암제로 이용될 수 있다.
또한, 위암조직에서 과발현된 표적유전자에 결합되어, 표적 유전자의 발현량을 조절하는 화합물 및 펩티드들을 동정하고, 이들 분자들을 항암제로서 사용할 수 있다. 이러한 표적유전자의 발현량을 조절하는 화합물 및 펩티드들의 스크리닝은 여러 방법에 의해서 수행될 수 있다. 예들 들어, 표적유전자의 프로모터 서열에 결합하여, 표적유전자의 발현량을 조절하는 화학물질 등의 작은 분자를 스크리닝할 수 있다. 이 경우, 표적유전자의 프로모터 서열에 루시퍼라아제와 같은 레포터 (reporter) 유전자를 연결시키고, 이를 벡터에 도입한 다음, 이 벡터를 리포펙틴 또는 리포펙타민으로 포장하여(packaging)하여 숙주세포로서 포유동물 세포에 형질감염 또는 형질전환시킨다. 그런 다음, 숙주세포를 여러 가지 화학물질로 처리한다. 여러 화합물질이 처리된 각 세포로부터 용해물을 얻어내어, 이로부터 루시퍼라제 활성을 측정함으로써, 표적유전자의 프로모터 서열에 결합하여 유전자의 발현량을 조절하는 특정화학물질을 선발할 수 있고, 선발된 화학물질은 임상실험을 거쳐 항암제로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명의 cDNA 마이크로어레이 분석법은, 위암의 진단 또는 발병예측에도 사용될 수 있다. 위암조직에서 과발현되거나 저발현되는 상기 표 1의 유전자들을 기질위에 배열하여 위암진단용 마이크로어레이를 제작할 수 있다. 상기 제작된 위암 진단용 마이크로어레이를, 사람의 혈청 또는 위조직으로부터 분리한 mRNA로부터 역전사 반응에 의해 제작된 cDNA로, 하이브리드형성을 수행함으로써, 상기한 사람들에게서의 유전자 발현양상을 얻어낼 수 있고, 유전자 발현양상을 분석함으로써, 위암의 진단 또는 발병예측을 할 수 있다.
또한, 상기 표 1에 기재되어 있는 유전자들의 cDNA를 마이크로어레이용 프로브로 함유하는 고형 지지체로는, 올리고뉴클레오타이드가 공유결합 또는 비공유결합될 수 있는 임의의 고형표면이 사용될 수 있고, 예를 들어, 필터 및 폴리염화비닐접시를 포함한다. 또한, 바람직한 고형 지지체의 예로는 고밀도 어레이 또는 DNA 칩을 포함한다.
또한, 본 발명은 cDNA 마이크로어레이 분석법을 이용하여, 위암조직에서의 유전자 발현양상을 얻어내어 이를 분석함으로써, 위암의 분류를 행할 수 있다. 즉, 위암은 위에서만 증식을 진행하는 초기단계와, 위에서 다른 조직으로 전이되는 말기단계로 크게 구분할 수 있고, 위암이 발달함에 따라 그들의 다른 조직으로의 침입특성, 즉 전이성이 달라지게 된다. 이러한 침입특성은 위암 조직에서 발현되는 특수한 유전자들에 의해 특정 지어진다. 다시 말하면, 위암은 그들의 전이성에 따라 각기 다른 세트의 유전자들이 발현되고, 이들 유전자들의 발현형태를 분석함으로써 위암을 분류할 수 있다. 위암의 전이성에 관여하는 유전자는 하기 표 2와 같다. 하기 표 2의 목록은, 전이율이 높은 남성 위암환자로부터 분리한 조직과 전이율이 낮은 남성 위암환자로부터의 위암조직에서의 유전자 발현형태를 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행한 결과에서, 전이성이 높은 조직에서 과발현되는 유전자의 목록을 나타낸 것이다.
과발현(≥2배) (PG 40) 중심 단백질트롬보스폰딘-4의 mRNA프로필린 Ⅱ보체성분 C1r의 mRNAα-2-마크로글로블린바이멘틴 N-말단 단편(vimentin N-terminal fragment)의 mRNA 5'-단편색소상피-분화인자(pigment epithelium-differentiation factor; PEDF)라이소 인지질분해 유전자보체성분 C1a 의 유전자
상기 표 2의 결과는, 전이성이 높은 남성 위암조직을 4개 선정하고, 전이성이 낮은 남성 위암조직을 4개 선정하여, 본 발명의 cDNA 마이크로어레이 분석을 수행한 것이다. cDNA 마이크로어레이 분석을 통해, 전이성이 높은 위암조직에서는 과발현(>2배)되는 유전자들이 동정되었다. 이들 유전자들은, 전이성이 낮은 위암조직에서는, 완전히 다른 패턴의 발현양상을 나타내었다(도 2 참조).
본 발명은, 상기 표 2에 기재된 유전자 중 1종 이상의 표적 유전자의 cDNA를 마이크로어레이 고형지지체에 배열시키고, 위암 시료조직으로부터 분리한 mRNA로부터 제작한 cDNA로 하이브리드 형성을 수행함으로써, 상기 위암 시료조직의 전이성을 분석하고, 분석된 전이성 및 과발현 또는 저발현된 유전자 발현 양상에 기초하여 위암을 분류할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명이 이에 의해서 한정되지 않고, 당업계에서 자명하게 인식되어지는 변형 등도 본 발명의 범위내에 포함된다.
[실시예 1] 위암 조직에서의 mRNA 발현양상 분석
(1) 정상 위조직 및 위암조직으로부터 cDNA 마이크로어레이분석을 위한 cDNA의 제작
위암진단을 받고 서울대학교 병원에서 수술을 받은 24명의 환자로부터 정상 위조직 및 위암조직을 얻었다. 각 조직 에 대한 병리학적 소견은 표 3에 기재 되어있다. 이들 각 조직 200㎎으로부터, Life Technologies, Inc(Gaithersburg, MD,USA)에서 제공한 메뉴얼에 따라 트리졸 시약(trizol reagent)을 사용하여 전체 RNA을 얻어내었다. 그런 다음, 분리한 RNA로부터, Qiagen Company(Santa Clarita, CA,USA)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 올리고텍스 비드(oligotex bead)를 사용하여 mRNA를 분리하였다.
분리된 mRNA는 역전사반응에 의해 cDNA로 전환되었다. 역전사 반응 동안, 정상 조직으로부터 분리된 cDNA는 녹색 플루오르포오(Green flurophore) Cy-3로 라벨화되고, 위암조직으로부터 유래된 cDNA는 레드 플루오로포오 Cy-5로 다음과 같이 라벨화되었다.
2㎕의 dNTP/프라이머 혼합농축물 또는 2㎕의 라벨화되지 않은 대조물, 상기에서 분리된 χ㎕의 mRNA, 13-χ㎕의 RNase가 없는 증류수를 혼합하여, 역전사 반응혼합물을 제조하였다. 혼합물은 65℃에서 10분; 25℃에서 5분 배양하고, 4㎕의 시아닌 3-dUTP 또는 2㎕의 시아닌 5-dUTP를 첨가한 후, 42℃에서 3분간 배양한 다음, 2.5㎕의 10 X RT 반응 완충액을 첨가한 후, 2㎕의 AMV 역전사효소 및 RNase 억제제 더 첨가하고, 42℃에서 약 60분간 역전사 반응을 수행한 후, 4℃에서 10분 방치하여, mRNA로부터 라벨화된 cDNA을 얻어내었다.
그런 다음, Millipore Company에서 제공하는 메뉴얼에 따라 스핀 컬럼을 사용하여 상기 라벨화된 cDNA를 정제하였다.
(2) 하이브리드형성
상기 (1)에서 제작된 cDNA를 고정화시킨 마이크로어레이(NEN사(Boston, MA,USA) 로부터 입수)를 이용하여, NEN Company(Boston, MA)에서 제공하는 매뉴얼에 따라 하이브리드형성을 수행하였다. 하이브리드 형성과정을 간단하게 설명하면, 0.5M의 EDTA 2.5㎕를 첨가한 후, 1N의 NaOH 2.5㎕를 첨가하여 이중쇄 cDNA를 단일쇄로 변성시키고; 그런 다음, 65℃에서 30분동안 배양한 후; 4℃에서 5분 배양하면서, 1M Tris HCl(pH 7.5) 6.2㎕를 첨가하여 반응용액을 중화시켜 하이브리드 형성을 종료하였다.
하이브리드가 형성된 마이크로어레이는 NEN Company 에서 제공하는 메뉴얼에 따라 세척을 수행하였다.
(3) 유전자 발현양상 분석
상기 하이브리드 형성 및 세척이 완료된 마이크로어레이의 형광강도는 유전자 PIX 4000 마이크로어레이 스캐닝(Axon Instruments)을 사용하여 측정하였고, 마이크로어레이 스캐닝데이터 분석은, the NEN web page(www.nen.com)에 개시된 "Microarray scanning and data analysis: for complete gene description and grid orientation on NEN MICROMAX cDNA microarrays"를 참조하여 수행하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 마이크로어레이에서 붉은 스팟은 위암조직에서 과발현되는 유전자를 의미하고, 녹색 스팟은 저발현되는 유전자를 의미한다.
암조직과 정상조직 사이의 유전자 발현비율은 Gene spring 소프트웨어(버젼 4.04, Silicon Genetics, Redwood city, CA,USA)를 사용하여 결정하였다. 2,400개 유전자의 발현양상과 위암조직에서의 발현양상사이의 관련성을 시험하기 위해서, 상대적 유전자 발현 분배량(Cy5/Cy3)를 사용하여, 계층적 분석(hierarchical analysis)을 수행하였다. 유전자 발현양상의 클러스터링(clustering)은 "Cluster software(버젼 2.10)"를 사용하여 행했고, "Tree view software(버젼 1.45)"를 사용하였다. cDNA 마이크로어레이 분석을 수행한 결과, 정상 위조직에 비해 위암조직에서 과발현되거나 저발현되는 표적 유전자들의 목록은 상기 표 1에 나타내었다.
cDNA microarray 분석결과 위암 조직은 크게 3 개의 그룹으로 분류될 수 있음을 알 수 있었다. 이는 위암조직을 종래의 형태학적 분류가 아닌 유전자 발현분석을 통해서도 분류 할 수 있음을 보여준다.
[실시예 2] 위암조직의 전이에 관여하는 유전자
상기에서 설명한 바와 같이, 위암은 그의 전이율에 의해서 분류를 행할 수 있고, 이러한 분류에 의해 전이에 관련하는 유전자를 규명함으로써 적절한 치료법을 선택할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 전이율에 관여하는 유전자를 찾기 위해서, 상기 실시예 1의 cDNA 마이크로어레이 분석결과를 전이율의 측면에서 분석하였다. 도 2의 결과에서, 전이율이 현저히 차이나는 위암조직들에서의 유전자 발현양상은, "Cluster software(버젼 2.10)" 및 "Tree view software(버젼 1.45)"를 사용하여 계층적 클러스터링 분석법(hierarchical clustering analysis)으로 분석하였다. 그 결과로, 전이율이 높은 위암조직에서 두 배 이상의 발현이 나타나는 유전자들에 대한 cDNA 마이크로 어레이 분석 결과는 상기 표 2에 나타내었다.
한편, 상기에서 위암조직의 전이성 정도의 판단은 전이림프절 수 및 절제된 림프절수(수술시 절제한 림프절 수를 의미함)를 측정하여, 사전에 결정한 것이다. 그 결과는, 하기 표 3에 나타내었다.
상기 표 3에서 보는 바와 같이, 위암의 전이성에 관련된 유전자를 동정하는데 사용된 남성의 위암 조직들은, T 98을 제외하고는 모두 Lauren 분류법에 의해 확산형(Diffuse)으로 분류된다. 그러나, 도 2에서 보는 바와 같이, 이 조직들은 위암조직들의 전이성에 관련하는 유전자들의 발현양상에 기초하여 분류할 때, 다르게 분류됨을 알 수 있었다. 이러한 결과는, Lauren 분류법과 같은 형태학적 분류방법보다, 유전자 발현양상의 분석을 통해서 위암환자를 분류하는 것이 위암치료의효과면에서 유리함을 입증하는 근거가 될 수 있다.
본 발명은 cDNA 마이크로어레이 분석방법(Microarray Hybridization Analysis)을 사용함으로써, 위암조직과 정상 위조직으로부터 유전자 발현양상 (profile)을 얻어 낼 수 있고, 이로부터 항암제를 스크리닝하기 위한 표적유전자를 동정할 수 있다. 상기 유전자 발현 양상을 통하여, 위암조직과 일반조직사이의 구분뿐만 아니라, 임파선(lymph node)으로의 전이(metastasis) 정도에 기초한 위암의 분류에도 사용될 수 있다.
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Claims (7)

  1. cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 위암조직 및 위의 정상 조직에서의 유전자 발현 양상을 분석하여 얻어진, 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 유전자들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 cDNA를 배열시킨 위암 진단용 마이크로어레이 고형 지지체.
  2. cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 위암조직 및 위의 정상 조직에서의 유전자 발현 양상을 분석하여 얻어진, 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되거나 감소되는 하기의 유전자들로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유전자의 cDNA를 배열시킨 위암 진단용 마이크로어레이 고형 지지체.
    과발현(≥2배) 프리프로(prepro)-α2(I) 콜라겐의 mRNA프로필린 Ⅱ(Profilin Ⅱ)프리프로-α1(I) 콜라겐의 mRNAC-시스/혈소판 유래 성장 인자 2(SIS/PDGF 2)보체성분 C3 mRNA, α 및 β 서브유닛들CPE 수용체의 hCPE- R mRA염색체 분리 유전자 동족체(homolog) CAS프로-α-1 타입 3 콜라겐의 mRNA타입 Ⅵ 콜라겐 α3 사슬의 mRNA세린 프로테아제의 mRNA프로스타사이클린-자극 인자Sm 단백질 F의 mRNA BST-2 유전자루미칸(Lumican)미토틱 센트로메르-관련 키네신(Mitotic centromere-associsted Kinesin) HMG-Y 유전자Fibroblast collagenase 억제유전자
    저발현(≤0.5배) 다이하이드로디올 디하이드로게나아제리보뉴클레아제 A(RNase A)의 mRNA추정(putative) 세린/트레오닌 단백질 키나아제의 mRNA디하이드로디올 디하이드로게나아제글루타민 합성효소의 mRNA(E.C. 6. 3.1.2)에즈린(ezrin)의 mRNA크리에이틴 키나아제 BMT-1l mRNA액포 H+ATPase 양성자 채널 서브유닛MHC 클래스 Ⅰ HLA-C-α-2 사슬 또는 클론 4 및 10TEGT 유전자글루타민 합성효소의 재배열된 mRNA글루타치온 퍼옥시다아제의 mRNAKIAA0391 유전자의 mRNANIPSNAP1 단백질의 mRNADoc2 β의 mRNAβ-액틴의 mRNAADP/ATP 운반체 단백질혈관 평활근 α-액틴의 mRNASREBP-1세포체 γ-액틴의 mRNA프로스타신(prostasin)골격근 LIM-단백질 FHL1KIAA0120 유전자의 mRNA단백질 포스파타아제-1 촉매성 서브유닛단백질 타이로신 포스파타아제의 CL 100 mRNAβ2-마이크로글로블린돌연변이 β-액틴(β'-액틴)의 ACTB mRNA면역글로블린 κ사슬(VNJ)의 재배열(rearranged) mRNAlg 재배열된 κ-사슬 mRNA 가변부, 연결부, 불변부플라즈마 글루타치온 퍼옥시다아제의 GPx-3 mRNA면역글로블린 κ-라이트 사슬의 mRNA장 평활근 γ-액틴의 mRNA
  3. cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 전이성이 높은 위암조직 및 전이성이 낮은 위암조직에서의 유전자 발현 양상의 분석에 의해 얻어진, 전이성이 높은 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되는 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 배열시킨 위암 전이성 분석용 마이크로어레이 고형 지지체.
  4. cDNA 마이크로어레이 분석법에 의해 전이성이 높은 위암조직 및 전이성이 낮은 위암조직에서의 유전자 발현 양상의 분석에 의해 얻어진, 전이성이 높은 위암조직에서 특이적으로 발현이 증가되는 하기 유전자들로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 유전자를 배열시킨 위암 전이성 분석용 마이크로어레이 고형 지지체.
    과발현(≥2배) (PG 40) 중심 단백질트롬보스폰딘-4의 mRNA프로필린 Ⅱ보체성분 C1r의 mRNAα-2-마크로글로블린바이멘틴 N-말단 단편(vimentin N-terminal fragment)의 mRNA 5'-단편색소상피-분화인자(pigment epithelium-differentitation factor; PEDF)라이소 인지질분해 유전자보체성분 C1a 의 유전자
  5. 제 1항, 제 2항, 제 3항 혹은 제 4항의 유전자를 이용하여 항암제를 스크리닝함을 특징으로 하는 항암제 스크리닝방법.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 항암제는 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 펩티드, 작은 분자의 화합물, 항체 및 상기 표적유전자의 프로모터에 결합하여 유전자 발현량을 조절하는 물질로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 상기 항암제는 제 2항의 유전자 또는 제 4항의 유전자에 의해 코딩되는 단백질에 대해 길항제(antagonist)로서 작용함을 특징으로 하는 항암제 스크리닝방법.
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