KR20000076291A - 초기 위암의 진단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 위암의 진단에 관한 것으로서 특히, 환자 샘플 중 시클로옥시게나제-2의 발현을 검색함으로써 전암상에서 위 암종을 검색하는 방법에 관한 것이다.

Description

초기 위암의 진단방법{DIAGNOSIS OF EARLY GASTRIC CANCER}
위암은 세계적으로 가장 흔하고 치명적인 질병의 하나이다 (Coleman 외, 1993). 핀란드 남성의 경우에는 4번째로 흔한 질병이고 핀란드 여성에 있어서는 5번째로 흔한 질병으로서 핀란드의 모든 질병의 5%에 해당한다 (Cancer Incidence in Finland 1994. Finnish Cancer Registry, Helsinki, 1996). 위암은 조기 검색이 어렵고 대부분의 서구 국가에서는 5년간 생존률이 20% 미만이다 (Wanabe 외, 1993). 위암의 90% 이상은 Lauren 분류 (Lauren, 1965)에 의할 때 장 (intestinal)타잎과 확산(diffuse) 타잎으로 나뉘어지는 선암종 (adenocarcinomas)이다.
위암의 병인은 복잡하고 아직 완전하게 이해되고 있지는 않지만 장 타잎의 경우 특정 전구체가 변화하는데, 예컨대 만성 위축성 위염, 장 화생, 및 상피 이형성 등이 이 질병과 연관이 있다 (Antonioli, 1994). 이와 대조적으로, 확산 타잎에는 잘 인식된 전구체 병변이 없다. 조적학적으로 구별되는 이들 두가지 유형의 위암에서 상이한 유전적 변화의 조합이 발견되었기 때문에, 이들은 서로 다른 유전적 배경을 지니는 것일 수 있다 (Stemmermann외, 1994; Tahara 외, 1996). 그러나, 이들 두가지 선암종 유형이 공유하는 유전적 변화와 관련된 질환은 이 질환의 전암상에서 이미 발현된 것들을 나타내는 것이라고 여겨진다 (Tahara 외, 1996).
아스피린, 인도메타신, 및 설린닥 등과 같은 비스테로이드계 항염 약물 (NSAIDs; nonsteroidal anti-inflammatory drugs)은 동물 모델에서 유도된 결장의 암종을 화학적으로 억제한다 (Steele 외, 1994; Giardiello 외, 1995). 역학적 연구 결과 아스피린을 장기간 사용하면 위암을 비롯한 위장암(gastrointestinal cancer)의 발병률과 그로 인한 사망률이 감소되는 것으로 밝혀졌다 (Laakso 외, 1986; Giardiello, 1994; Thun, 1994; Thun 외, 1993).
NSAIDs의 가장 잘 알려진 표적은 아라키돈산을 프로스타노이드로 전환시키는데 있어서 속도-제한 효소인 시클로옥시게나제 (Cox)이다. 아미노산 수준에서 60% 이상의 상동성을 갖고 유사한 효소 활성을 갖는 두가지 Cox 유전자 (Cox-1 및 Cox-2)가 클로닝되었다 (Hershman, 1996; Smith 외, 1996). Cox-1은 간접 유전자로 여겨지고, Cox-1 경로를 통해 합성된 프로스타노이드가 위의 세포보호, 신장의 혈관확장, 및 혈소판에 의한 전응집성 (proaggregatory) 프로스타노이드, 즉, 트롬복산의 생산에 책임이 있는 것으로 여겨지고 있다. 이와 대조적으로, Cox-2는 유도가능한 즉시-조기 (immediate-early) 유전자로서, 이것의 병원생리학적 역할은 염증, 재생 및 암종 형성과 연관되어 있다.
최근의 연구결과는 Cox-2가 결장의 암종 형성과 관련되어 있고, 따라서 NSAIDs의 화학예방적 효과의 표적이 될 수 있음을 시사하고 있다: i) Cox-2 유전자의 유전적 파괴 또는 Cox-2 특이 약물을 이용한 치료는 FAP에 대한 생쥐 모델에서 폴립 형성을 억제한다 (Oshima 외, 1996), ii) 래트의 장 상피 세포에서 Cox-2의 과도한 발현은 프로그램된 이들의 세포 사멸률과 세포외 매트릭스에 대한 이들의 부착성을 변경시킨다 (Tsujii 외, 1995), iii) 2가지 상이한 Cox-2 선택적 저해제는 쥐의 결장에서 화학적으로 유도된 미주성 음와 병소를 억제한다 (Takahashi 외, 1996; Reddy 외, 1996). 또한, 정상적인 점막과 비교할 경우, 화학적으로 유도된 쥐의 결장 암종 조직 (DuBois 외, 1996) 및 인간의 결장 암종에서 Cox-2 mRNA 및 단백질은 상승된 수준으로 발견되지만 Cox-1의 경우는 그렇지 않다 (Eberhart 외, 1994; Kargman 외, 1995; Sano 외, 1995).
NSAIDs의 화학예방적 효과가 Cox-2에 대해 표적화될 것이라는 추론은 Cox-2 발현이 종양원성 세포들에 의해 유도된 쥐의 장 상피 세포 및 유방 상피 세포의 증식을 Cox-2 선택적 화합물이 억제한다는 발견에 의해서도 더욱 뒷받침된다 (Sheng 외, 1997 및 Subbaramaiah 외, 1996). 또한, Tsuji 등 (1996)은 최근 Cox-2 특이 저해제가 Cox-2 mRNA를 고 정상상태 수준으로 발현하는 위 및 결장의 암종 세포주의 증식을 억제한다고 보고한 바 있다.
정상적인 위장 조직은 Cox-1 이소형만을 거의 독점적으로 함유하고, 건강한 위 조직에서는 기능적인 Cox-2 단백질은 발견되지 않는다 (Kargman 외, 1996). 그러나 전통적인 총 RNA의 Northern 블롯 하이브리다이제이션 분석법보다 더 민감한 방법, 예컨대 RT-PCR을 이용할 경우, 어떤 Cox-2 mRNA가 검색될 수 있다 (O'Neill 및 Ford-Hutchinson 1993, 및 본 발명 도 2 및 도 4 참조).
본 발명은 위암의 진단방법에 관한 것으로서 특히 환자 샘플 중 시클로옥시게나제-2의 발현을 검색함으로써 전암상 (premalignant phase)에서 위의 암종을 검색하는 방법에 관한 것이다.
도 1A. 위 암종 표본 1-11 및 암 세포를 전혀 함유하지 않는, 이들의 대응하는 대조군 샘플 쌍으로부터의 위 암종 표본으로부터 추출된 총 RNA의 Nothern 블롯 하이브리다이제이션 분석을 도시하였다 (a, antrun; c, corpus). 인간의 Cox-1 및 Cox-2용 프로브 및 로딩 대조군으로서 GAPDH를 이용하여 하이브리다이제이션을 수행하였다.
도 1B. Cox-2 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비율을 나타내었다. 그래프 중의 값 (평균±SEM)은 임의 농도계 단위로부터 산출한 Cox-2 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비율을 나타내며, 위 암종 조직이 대조군 샘플보다 유의적으로 더 높은 수준의 Cox-2 mRNA를 발현시켰음을 보여준다 (P〈0.05).
도 1C. Cox-1 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비율을 나타내었다. 그래프의 값 (평균 ±SEM)은 임의 농도계 단위로부터 산출된 Cox-1 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비율을 나타낸다. Cox-1 mRNA 수준은 암종 조직에서 상승하지 않았다.
도 2. 케이스 1, 5, 9, 및 10의 위 암종 표본 (b로 표시됨) 및 암 세포가 없는 상응하는 이들의 대조군으로부터 RT-PCR을 이용하여 Cox-1 및 Cox-2 mRNA 수준을 검색하였다 (a, antrum; c, corpus). 총 RNA를 먼저 역전사하였다. 이어서 Cox-1 및 Cox-2에 대해 이소엔자임 특이 프라이머를 이용하여 PCR로 cDNA 샘플을 증폭시켰다. 마지막으로, PCR 산물을 분석하고 정량하였다 (실험예 참고). 그래프는 Cox-2 mRNA 대 Cox-1 mRNA의 비율을 나타낸다.
도 3A. 위 암종 조직에 있어서 Cox-2에 대한 면역조직학적 염색은 암 세포 (검은색 화살표) 에 있어서 세포질 염색 (적갈색)을 보여주지만, 주변의 기질 (흰색 화살표)에서는 세포직 염색되지 않았다.
도 3B. 일차 항체로서 정상적인 토끼의 IgG를 사용하자, 조직 섹션은 염색되지 않았다.
도 3C 및 도 3D. Cox-2 항체를 이용하여 2명의 서로다른 환자로부터의 위중한 위 이형성 표본을 염색하였다. 이형성선 (dysplatic glands: 검은색 화살표)은 Cox-2에 대해 양성인 반면 정상적인 선 (흰색 화살표)은 음성이었다.
도 4A. 약한 이형성을 갖는 위 표본 및 이형성이 없는 이들의 대응하는 대조군에서 RT-PCR에 의해 Cox-2 mRNA 수준을 검색하였다. 과정: 도 2 참조. 이 그래프는 Cox-2의 PCR 사이클 적정을 보여준다. 도 4C에서는 40회의 사이클수를 이용하였다.
도 4B. 이 그래프는 GAPDH의 PCR 사이클 적정을 나타낸다. 도 4C에서는 28회의 사이클수를 이용하였다.
도 4C. 이 그래프는 Cox-2 mRNA 대 GAPDH mRNA의 비율을 보여준다. 약한 이형성 (이형성 I) 샘플 (453±125, 평균 ±SEM) 및 이들의 대응 대조군 (424±90) 사이에는 통계적인 차이가 없었다.
Cox-2가 위암 조직 중에 생체내 존재하는지, 또는 위암의 전암성 병소에 존재하는지 알려지지 않았기 때문에, 본 발명자들은 위의 선암종에서 뿐만 아니라 중증의 위 이형성 (고도로 전암성임)에 있어서의 그것의 발현에 대해 연구하였다. 본 발명자들은 인간의 위 선암종 조직과 위의 중증 이형성에서 Cox-2 mRNA의 수준은 증가된 반면 Cox-1의 경우는 그렇지 않음을 발견하였다. 그러나, 거의 암으로 전환되지 않는 약한 이형성에 있어서는 Cox-2의 발현이 증가되지 않았다. 위 암종에 있어서, Cox-2 단백질은 암 세포에 우선적으로 국소화하였다.
Cox-2의 상승된 발현은 장 타잎에 한정되지 않았는데, 이는 분석된 3종의 확산 암종이 각각 그들의 상응하는 대조군에 비해 Cox-2 mRNA를 보다 높은 수준으로 함유하였기 때문이다. 따라서, Cox-2의 과잉발현은 조직학적 및 유전학적으로 구별되는 이들 2가지 질병이 공유하는 특성 중 하나이고, 이것은 암 형성의 초기상태와 관련된 것임을 암시하는 것일 수 있다. 실제로, 본 발명자들은 Cox-2가 위의 중증 이형성에서는 발현된 반면, 약한 이형성에서는 발현이 증가되지 않았음을 발견하였다. 이것은 Cox-2 발현이 위 암종의 전암성 병변과 특이적으로 연관이 있는 것일 수 있음을 암시하는 것이다.
결론적으로, 본 발명자들은 암 세포의 쌍을 이룬 위점막 표본과 비교할 때, Cox-2가 인간의 위 암종 조직에서 발현됨을 밝혀냈다. Cox-2 mRNA는 장 선암종 및 확산 선암종의 두가지 모두에서 발견되었다. 면역조직화학법으로 검색하자 Cox-2 단백질은 위 암종 세포에 국소된 반면, 주변 기질로는 국소화되지 않았다. 중요한 것은, 전암성 병변을 대표하는 중증의 위 이형성 표면이 강력하게 Cox-2 양성을 나타낸다는 것이다. 이는, Cox-2가 초기 위 암종의 진단용 마커로서, 그리고 전암성 병변의 위중도를 결정하는데 있어서의 진단용 마커로서 이용가능함을 시사하는 것이다.
인간의 암종에 있어서 Cox-2의 발현은 적어도 이제까지는 위장관에 국한된 것으로 보인다. 그러나, 결장 암종과 위 암종은 두가지 모두 역학적으로, 형태학적으로 그리고 유전학적으로 구별되는 질환이므로, 설치류 및 인간 결장 암종 조직에서 Cox-2 mRNA 및 단백질 수준이 상승된 것으로 발견되었다는 사실이 위장 조직에서의 어떠한 이들의 역할의 지표를 제시하는 것은 아니다. 한가지 위장 암종 세포주가 Cox-2 mRNA의 고 정상-상태 수준을 발현하는 것으로 나타났다는 사실이 생체내에서 초기 위암에 어떤 역할을 한다는 것을 나타내는 것은 아니다.
본 발명의 목적은 대상 환자의 샘플에서 Cox-2 mRNA 또는 Cox-2 단백질을 검색하는 것을 포함함을 특징으로 하는, 초기 위 암종의 진단방법을 개발하는 것이다. 이것은 위 암종 세포 및 전암성 병변에서는 Cox-2가 높게 발현되지만, 정상적인 위 조직에서는 이것의 발현이 매우 저조하거나 검색조차 되지 않는다는 본 발명자들의 발견에 기초한 것이다.
검색하고자 하는 환자의 샘플은 생검 또는 브러쉬 샘플로서, 이들은 통상적인 위경검사법 또는 브러쉬 기법과 병용되는 위세척시 얻어진다. 위세척 및 브러쉬 기법은 통상적인 위세포학에서 널리 알려진 방법이다. 이 기술들에 의해 위에 질환이 존재 또는 부재할 가능성을 현미경으로 검사하기 위한 위점막으로부터의 세포 샘플을 얻는다. Cox-2와 같은 마커는 세포 형태학만을 가시화시키는 현재의 방법에 비해 이 분석의 감도와 특이성을 증가시킬 수 있다. 위경검사를 위한 생검 샘플은 포르말린으로 고정시키거나 (면역조직화학법의 경우) 또는 액체 질소에서 냉동시켜 -70℃에서 보관한다 (mRNA 분석의 경우).
기술분야에 잘 알려진 방법을 이용함으로써 상기 환자 샘플로부터 Cox-2 mRNA를 간편하게 검색할 수 있다. 예컨대, 본 발명자들은 Northern 블롯 분석이 극히 특이적이었으며, RT-PCR과 병용하는 경우에도 매우 감도가 높음을 발견하였다.
Cox-2 발현의 검색에 더해, 단백질 국소화를 나타내주는 예컨대 면역조직화학법을 이용하여 상기 환자 샘플로부터 Cox-2 단백질을 쉽게 검색할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 진단 방법을 수행하기 위한 테스트 키트도 제공한다. Cox-2 mRNA 발현을 검색하기 위한 이러한 키트는 RNA 또는 폴리 A+ㅡmRNA 분리 시약, RT-PCR을 위한 Cox-2 특이적인 프라이머 및 DNA 또는 RNA (센스 및 안티센스 두가지 모두) 프로브를 제조하기 위하 cDNA 단편을 포함한다.
Cox-2 단백질의 면역학적 검색을 위한 키트는 Cox-2 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 포함한다. Cox-2 단백질의 펩타이드 기초 분석을 위해, Cox-2에 대한 결합 친화성을 갖는 특이적인 펩타이드를 함유하는 진단용 키트가 고안된다. 이러한 펩타이드는 예컨대 파지 디스플레이 라이브러리로부터 구할 수 있다. 한편, 올리고뉴클레오타이드에 기초한 분석법도 이용가능한데, 이 방법에서는 올리고뉴클레오타이드 (변형 RNA 분자)들이 대응하는 진단용 키트 내에 포함되게 된다.
실험예
약어
RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chian Reaction) 역전사-폴리머라제 연쇄반응
Cox-1 (Cyclooxygenase 1) 시클로옥시게나제 1
Cox-2 (Cyclooxygenase 2) 시클로옥시게나제 2
NSAID (Nonsteroidal antiinflammatory drug) 비스테로이드성 항염 약물
FAP (Familial adenomatous polyposis) 가족성 선종성 융종
mRNA (messenger RNA) (리보뉴클레익 산)
GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나제
SDS (sodium dodecyl sulfate) 소듐 도데실 설페이트
환자 샘플
뮤신 조직학의 12개 난소 암종 표본 및 12개의 위 선암종 (표 1) 표본을 외과적으로 제거된 조직으로부터 얻고, 이를 -70℃에서 분석시까지 보관하였다. 위 암종 중 한 케이스는 조직학 시험기 강한 자기 분해를 나타냈기 때문에 분석대상에서 제외하였다. 위 암종의 경우, 거시적인 종양 조직이나 조직학적으로 검색가능한 암 세포를 함유하지 않는 위 점막의 쌍을 이룬 샘플들은 antrum (n=10)과 corpus (n=10)로부터 구하였다. 모든 위암들은 주로 선암종이었으며, Lauren에 따라 평가할 때 (Lauren, 1965) 이들 중 8개는 장 타잎이고 3개는 확산 타잎이었다.
11가지 위 암종 케이스의 특성
케이스 연령 성별 암 부위 암 유형 암 %a Antrum 샘플b Corpus 샘플b
1 88 남 angulus 장 50 약함 약함
2 82 남 corpus 장 100 샘플 없음 보통c
3 69 남 antrum 장 20 심각 약함
4 67 남 whole stomach 확산 30 약함 (샘플 없음)
5 66 남 antrum, pylorus 장 50 약함 부재
6 70 여 angulus 장 40 보통 부재
7 85 남 pylorus 장 80 약함 약함
8 75 남 antrum 확산 90 부재 약함
9 62 남 corpus 장 60 부재 심각
10 82 남 angulus 장 60 약함 약함
11 73 남 antrum, prepylorus 확산 30 부재 부재
a위 암종 샘플 중의 종양 세포의 백분율
b암 세포를 함유하지 않는 표본 중 위축성 위염 및 장 화생의 위중도.
cRNA의 수율이 Northern 블롯 분석을 하기에 부족함.
RNA 분리 및 Northern 블롯 분석.
RNAzolTMB 시약 (Tel-Test, Friendswood, TX)을 이용하여 Chomczynski 및 Sacchi (1987)의 방법에 의해 총 RNA를 분리하여 260nm에서 흡수도를 측정함으로써 정량하였다. RNA 샘플 (15μg)을 1M 글리옥살, 50% 디메틸설폭사이드, 및 10mM 인산염 완충액 중에서 50℃, 60분간 변성시키고, 1.2% 아가로스 겔을 통해 전기영동시킨 다음, Hybond-N 나일론막 (Amersham International, Aulesbury, UK)을 통해 통과시키고, 이어서 Reprostar II UV 조사기 (Camag, Muttenz, Switzerland)를 이용하여 6분간 UV 조사시켰다. 인간 Cox-1 ORF (1.8kb), Cox-2 ORF (1.8 kb), 및 글리세랄데히드-3-포스페이트 데히드로게나제 (GAPDH, 0.8kb)의 정제시킨 cDNA 단편들을 [32P]-α-dCTP (3000 Ci/mmol, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) 및 Prime-a-Gene kit (Promega, Madison, WI)로 표지시켰다. 프로브들을 닉 컬럼 (Pharmacia, Uppsala, Sweden)으로 정제하고 50% 포름아미드, 6 x SSC (1 x SSC = 0.15 M NaCl 및 0.015 M Na 시트레이트, pH 7.0), 0.1% Ficoll, 0.1% 폴리비닐피롤리돈, 0.1% 소 혈청 알부민, 100μg/ml 청어 정자 DNA, 100μg/ml 효모 RNA, 및 0.5% 소듐 도데실 설페이트 (SDS)를 함유하는 하이브리다이제이션 용액 중에서 42℃, 16시간 동안 1 x 106cpm/ml의 농도로 사용하였다. 50℃에서 0.1 ~ 1 SSC 및 0.1% SDS를 이용하여 필터를 3회 세정하였다. Fujifilm IP-Reader Bio-Imaging Analyzer BAS 1500 (Fuji Photo Co., Tokyo, Japan) 및 제조업자 공급 BacBas 소프트웨어를 이용하여 Northern 블롯을 정량하고 방사선 자동사진법에 의해 가시화시켰다.
역전사-폴리머라제 연쇄반응 (RT-PCR)
올리고-dT (Pharmacia) 및 무작위적 헥사머 (Life Technologies)로 총 RNA (1μg)를 Superscript II (Life Technologies, Gaitherburg, MD)를 이용하여 cDNA로 전환시켰다. 반-정량적인 결과를 얻기 위해, 세가지 변수, 즉: 사이클 횟수, 프라이머 농도 및 어닐링 온도를 최적화하였다. 10mM Tris-HCl, pH 8.8, 50 mM KCl, 0.2mM dNTPs, 1.5mM MgCl, 센스 또는 안티센스 프라이머 (Ristimaki 외, 1994)의 0.2μg (Cox-1) 또는 2μg (Cox-2), 및 2.5U Denzyme II DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finland)를 함유하는 100μl 반응 혼합물에서 cDNA (4μl)를 PCR 증폭시켰다. 도 2의 실험을 위해, 샘플들을 96℃에서 1분간 30회 (Cox-1) 또는
32회 (Cox-2) 사이클동안 증폭시켜 60℃ (Cox-1) 또는 46℃ (Cox-2)에서 1분간 어닐링시킨 다음 72℃에서 1분간 연장시켰다. 증폭된 cDNA를 2% 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하고 에티디움 브로마이드 염색하였다. 증폭된 산물을 고성능 CCD 카메라 (온 칩 집적 Cohu 4910 시리즈, Cohu Inc., San Diego, CA) 및 Macintosh 개인용 컴퓨터 상에서 Scion Image 1.57 소프트웨어 (Scion Corp., Frederick, MD)를 이용하여 정량하였다.
면역조직화학.
조직 샘플을 10% 중성-완충된 포르말린에 고정시켜서 파라핀에 임베딩하고, 섹셔닝한 후 (약 5μm), 파라핀을 제거하고 0.1 M Na-시트레이트 완충액 (pH 6.0) 중에서 15분간 마이크로웨이브 처리하였다. 이어서 상기 슬라이드를 0.6% 과산화수소에 30분간 침지시킨 다음 정상적인 염소 혈청 (5%)/소의 혈청 알부민 (10%) 중에서 1시간 침지시켜 내인성 퍼옥시다제 활성과 비특이적인 결합 부위를 각각 차단하였다. 4℃에서 1:300 ~ 1:600의 희석배수에서 마우스 Cox-2 펩티드 (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI)에 대해 토끼의 폴리클로날 면역글로불린 G를 이용하여 면역염색을 밤새 수행하였다. 그 후 섹션들을 1:200의 희석배수로 바이오티닐화된 2차 항체 (Vector Laboratories, Burlingame, CA)로 처리하고 항체 결합부위를 마지막으로 아비딘-바이오틴 퍼옥시다제 복합 용액 (ABComplex, Vectastatin, Vector Laboratories) 및 3-아미노-9-에틸카르바졸 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO)로 가시화시켰다. Mayer's 헤말라움 (Merck, Darmstadt, Germany)으로 역염색을 수행하였다.
통계학적 분석.
Wilcoxon Signed Rank 테스트를 이용하여 통계학적 유의성을 산출하고, 통계학적 유의치로서 P〈0.05가 선택되었다. 모든 결과는 평균±SEM으로 표시하였다.
결과
Nothern 블롯 하이브리다이제이션에 의한 검색 결과, 위 암종 조직은, 암 세포가 없는 antrum 또는 corpus 샘플에 비해 Cox-2 mRNA를 유의적으로 더 높은 수준으로 발현하였다 (도 1A). Cox-2 전사체는 장 선암종 및 확산 선암종의 두가지 모두에 의해 발현되었다. Cox-2 mRNA의 수준은 표본 중의 암종 조직의 비율과 상관적이지는 않았다. 도 1B는 대조군 샘플에서보다 위 암종 조직이 Cox-2 mRNA를 훨씬 높은 수준으로 발현시켰음을 보여준다 (P〈0.05). 도 1C에 도시된 바와 같이, Cox-1 전사체의 수준은 상응하는 대조군과 비교할 때 암종 조직에서 증가하지 않았다.
세가지 위암종 샘플 (5번, 9번, 10번)을 Nothern 블롯 분석결과 Cox-2 mRNA를 낮은 수준으로 발현하였다 (도 1A). 이 샘플들에서의 Cox-1 및 Cox-2 발현 정도를 더 잘 평가하기 위해, 본 발명자들은 양성 대조군으로서 샘플 1번을 이용하여 반-정량적 RT-PCR을 수행하였다. 도 2에 나타난 바와 같이, Cox-2 mRNA 대 Cox-1 mRNA의 비율은 암세포를 함유하지 않은 쌍을 이룬 antrum 또는 corpus 샘플보다 암종 샘플에서 더 높았다.
도 3A에 도시된 바와 같이, Cox-2 특이적인 폴리클로날 항체에 의한 면역조직학적 염색은 암 세포 (검은색 화살표)에서 세포질 염색을 나타냈으나, 주변 기질 (흰색 화살표)에 대해서는 그렇지 않았다. 일차 항체로서 토끼의 IgG를 사용한 경우, 조직 섹션들은 염색되지 않았다 (도 3B). 도 3C와 도 3D는 2명의 환자에게서 얻어진 심각한 위 이형성 표본이 Cox-2 항체에 의해 염색됨을 가리키는 것으로 중요한 사항이다. 이형성선 (검은색 화살표)는 Cox-2에 대해 양성적인 반면, 정상선 (흰색 화살표)에 대해서는 음성적이었다. 정상적인 토끼의 IgG는 양성 염색을 나타내지 않았다 (도시하지 않음).
참조문헌

Claims (6)

  1. 환자 샘플로부터
    a) 시클로옥시게나제-2 (Cox-2) mRNA의 발현 또는
    b) Cox-2 단백질 또는 그의 활성을 검색하여;
    Cox-2이 과잉발현된 경우 위암 위험성이 높은 것으로 하여 in situ 위암 또는 위 암종의 위험도로서, 조직학적으로 검색된 전암성 병변의 유의성을 결정하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 검색하고자 하는 환자 샘플이 생검 또는 브러쉬 샘플인 것이 특징인 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Cox-2 mRNA 발현의 검색을 in situ Northern 블롯, RNase 보호, 또는 RT-PCR 기술, 또는 이들의 조합에 의해 수행하는 것이 특징인 방법.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, Cox-2 단백질의 검색을 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, 펩타이드 기초 분석, 또는 올리고뉴클레오타이드 기초 분석에 의해 수행하는 것이 특징인 방법.
  5. RNA 또는 폴리A+mRNA 분리 시약, RT-PCR에 대한 Cox-2 특이 프라이머 및 DNA 또는 RNA 프로브 제조를 위한 cDNA 단편을 함유하는 것을 특징으로 하는, 제 3항에 따른 방법을 수행하기 위한 진단용 키트.
  6. 제 4항에 있어서, Cox-2 특이적인 폴리클로날 또는 모노클로날 항체, Cox-2에 대한 결합 친화도를 갖는 특이적인 펩타이드 또는 Cox-2에 대한 결합 친화도를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 것이 특징인 진단용 키트.
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