RU2204835C2 - Диагностика рака желудка на ранней стадии - Google Patents

Диагностика рака желудка на ранней стадии Download PDF

Info

Publication number
RU2204835C2
RU2204835C2 RU99121656/14A RU99121656A RU2204835C2 RU 2204835 C2 RU2204835 C2 RU 2204835C2 RU 99121656/14 A RU99121656/14 A RU 99121656/14A RU 99121656 A RU99121656 A RU 99121656A RU 2204835 C2 RU2204835 C2 RU 2204835C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cox
mrna
gastric
coxy
expression
Prior art date
Application number
RU99121656/14A
Other languages
English (en)
Other versions
RU99121656A (ru
Inventor
Ари РИСТИМЯКИ (FI)
Ари РИСТИМЯКИ
Матти ХЯРКЕНЕН (FI)
Матти Хяркенен
Пентти СИППОНЕН (FI)
Пентти Сиппонен
Original Assignee
Биохит Ойй
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Биохит Ойй filed Critical Биохит Ойй
Publication of RU99121656A publication Critical patent/RU99121656A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2204835C2 publication Critical patent/RU2204835C2/ru

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6841—In situ hybridisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57407—Specifically defined cancers
    • G01N33/57446—Specifically defined cancers of stomach or intestine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57484—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving compounds serving as markers for tumor, cancer, neoplasia, e.g. cellular determinants, receptors, heat shock/stress proteins, A-protein, oligosaccharides, metabolites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Abstract

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ и диагностические наборы обеспечивают выявление рака желудка в предраковой фазе с высокой точностью. Выявляют гистологически повышенный риск развития рака желудка путем исследования образца, взятого у пациента и включающего клетки слизистой желудка и предраковых повреждений при карциноме желудка. Определяют в них экспрессию мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОКС-2) или белка ЦОКС-2 и на повышенный риск развития рака желудка указывают высокие уровни данной экспрессии по сравнению с контрольными образцами. Диагностические наборы содержат в одном случае реагенты для выделения РНК или поли-А+мРНК, специфические праймеры Цокс-2 для ОТ-ПЦР и фрагменты кДНК для изготовления пробных ДНК или РНК, а в другом специфичные в отношении Цокс-2 поликлональные или моноклональные антитела, специфические пептиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2, или олигонуклеотиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 11 ил.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к диагностике рака желудка и заключается в специфичном способе выявления рака желудка в предраковой фазе посредством определения экспрессии циклооксигеназы-2 в образце, взятом у пациента.
Предпосылки к созданию изобретения
Рак желудка является наиболее распространенным и чаще всего приводящим к летальному исходу злокачественным новообразованием в мире (Coleman et al., 1993). По частоте он находится на четвертом месте среди наиболее распространенных злокачественных новообразований у жителей Финляндии мужского пола и на пятом - женщин и составляет 5% от всех злокачественных новообразований в Финляндии (Cancer Incidence in Finland 1994. Finnish Cancer Registry, Helsinki, 1996). Раннее выявление рака желудка является сложной задачей, и в большинстве стран Запада пятилетняя выживаемость составляет менее 20% (Wanebo et al., 1993). Более 90% раковых опухолей желудка представляют из себя аденокарциномы, которые делят на интестинальный и диффузный типы по классификации Lauren (Lauren, 1965).
Патогенез рака желудка сложен и не до конца ясен, однако в случае интестинального типа с этим заболеванием связаны определенные предшествующие изменения, такие как хронический атрофический гастрит, интестинальная метаплазия и дисплазия эпителия (Antonioli, 1994). Напротив, в случае диффузного типа хорошо известные предшествующие повреждения отсутствуют. Поскольку в этих двух гистологически различимых типах рака желудка были обнаружены различные комбинации генетических изменений, они могут обладать и различными генетическими предпосылками (Stemmermann et al., 1994; Tahara et al., 1996). Однако связанные со злокачественными процессами генетические изменения, которые являются общими для этих двух типов аденокарциномы желудка, как представляется, могут быть выявлены уже на предраковой стадии болезни (Tahara et al., 1996).
Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП), такие как аспирин, индометацин и сулиндак, ингибируют химически индуцированный рак ободочной кишки у экспериментальных животных (Steel et al., 1994; Giardiello et al., 1995). Эпидемиологические исследования показали, что длительное применение аспирина снижает частоту и смертность при злокачественных опухолях желудочно-кишечного тракта, включая рак желудка (Laakso et al., 1986; Giardiello, 1994; Thun, 1994; Thun et al., 1993),
Наиболее известной мишенью действия НПВП является циклооксигеназа (Цокс), фермент, лимитирующий скорость превращения арахидоновой кислоты в простаноиды. Были клонированы два гена Цокс (Цокс-1 и Цокс-2), которые являются идентичными на 60% на уровне аминокислотного состава и обладают сходной ферментативной активностью (Hershman, 1996; Smith et al., 1996). Цокс-1 считается геном гомеостаза, а простаноиды, которые синтезируются по пути Цокс-1, как представляется, отвечают за защиту клеток желудка, вазодилатацию в почках и за выработку тромбоцитами простаноида проагрегации, тромбоксана. Напротив, Цокс-2 является индуцибельным геном неопосредованного раннего ответа, и его патофизиологическая роль связывается с воспалительными процессами, репродукцией и канцерогенезом.
Недавние исследования наводят на мысль о том, что Цокс-2 имеет отношение к канцерогенезу в толстом кишечнике и может являться, таким образом, мишенью химиопрофилактического эффекта НПВП: 1) генетическое разрушение гена Цокс-2 или лечение специфическим препаратом Цокс-2 подавляет образование полипов у подопытных мышей с FAP (семейный аденоматозный полиноз) (Oshima et al., 1996), 2) избыточная экспрессия Цокс-2 клетками кишечного эпителия у крыс изменяет скорость наступления запрограммированной гибели клеток и их адгезию к внеклеточному матриксу (Tsujii et а1., 1995), а также 3) два различных селективных ингибитора Цокс-2 подавляют химически индуцированные аберрантные очаги на криптах толстого кишечника у крыс (Takabashi et al., 1996; Ready et al. , 1996). Помимо этого, в тканях карциномы толстого кишечника, индуцированной химическим путем, обнаружены повышенные уровни мРНК и белка Цокс-2, но не Цокс-1 (DuBois et а1., 1996), а также в тканях карциномы толстого кишечника человека по сравнению с нормальной слизистой оболочкой (Eberhart et al., 1994; Kargman et al., 1995; Sano et al., 1995).
Идея о том, что химиопрофилактический эффект НПВП нацелен против Цокс-2, дополнительно подтверждается тем, что соединения, селективно ингибирующие Цокс-2, подавляют пролиферацию клеток кишечного эпителия у крыс, а также клетки эпителия молочной железы, в которых экспрессия Цокс-2 была индуцирована онкогенами (Sheng et al., 1997 и Subbaramaiah et al., 1996). Также Tsujii et al. (1996) недавно сообщили о том, что специфический ингибитор Цокс-2 подавляет пролиферацию клеточной линии карциномы желудка и толстого кишечника, которая экспрессирует стабильно высокие уровни мРНК Цокс-2. Это не имело место в клеточных линиях, которые экспрессируют низкие уровни мРНК Цокс-2.
Нормальные ткани желудочно-кишечного тракта содержат почти исключительно изоформу Цокс-1, и в здоровых тканях желудка не было выявлено функционального белка Цокс-2 (Kargman et al., 1996). Некоторое количество мРНК Цокс-2, однако, можно обнаружить более чувствительными методами, чем традиционный гибридизационный анализ общей РНК посредством нозерн-блоттинга, например, с помощью ОТ-ПЦР (см. O'Neill and Ford-Hutchinson 1993, а также фиг.1 и 4 настоящей работы).
Описание изобретения
Поскольку неизвестно, присутствует ли Цокс-2 в тканях карциномы желудка in vivo или в ее предраковых повреждениях, авторы изучали ее экспрессию в аденокарциномах желудка, а также в тяжелых дисплазиях желудка (которые с высокой степенью вероятности являются предраковыми). Авторы обнаружили повышенные уровни мРНК Цокс-2, но не Цокс-1, в тканях аденокарциномы желудка человека и при тяжелых дисплазиях желудка. Однако экспрессия Цокс-2 не была повышена при легких степенях дисплазии, которые редко переходят в злокачественное развитие. При карциноме желудка белок Цокс-2 локализовался прежде всего в раковых клетках.
Повышенная экспрессия Цокс-2 не ограничивалась интестинальным типом, поскольку каждая из изучавшихся трех диффузных карцином содержала более высокие уровни мРНК Цокс-2 по сравнению со своими контролями. Таким образом, чрезмерная экспрессия Цокс-2 представляет из себя одну из характеристик, общих для этих двух гистологически и генетически различных заболеваний, что может свидетельствовать в пользу ее участия в ранней фазе канцерогенеза. В самом деле, авторы обнаружили, что Цокс-2 экспрессируется в тяжелых дисплазиях желудка, в то время как в дисплазиях легкой степени эта экспрессия не увеличена. Это наводит на мысль о том, что в случае карциномы желудка экспрессия Цокс-2 может быть специфически связана с предраковыми повреждениями.
В заключение авторы показали, что Цокс-2 экспрессируется в тканях аденокарциномы желудка человека, при сравнении с парными образцами слизистой оболочки желудка, не содержащими раковых клеток. мРНК Цокс-2 была выявлена как в интестинальной, так и в диффузной карциноме. Белок Цокс-2 локализуется в клетках карциномы желудка, но не в окружающей строме, как показано методами иммуногистохимических исследований. Важно, что образцы тяжелых дисплазий желудка, представляющих из себя предраковые повреждения, содержат большие количества Цокс-2. Это свидетельствует о том, что Цокс-2 можно использовать в качестве диагностического маркера ранней карциномы желудка, а также для определения тяжести предраковых повреждений.
Экспрессия Цокс-2 в раковых опухолях человека, как представляется, по крайней мере, в настоящее время, ограничивается желудочно-кишечным трактом. Однако, поскольку рак толстого кишечника и рак желудка являются эпидемиологически, морфологически и генетически разными заболеваниями, тот факт, что повышенные уровни мРНК и белка Цокс-2 были обнаружены в тканях рака толстого кишечника грызунов и человека, никак не проясняет той роли, которую они играют в тканях желудка. Тот факт, что одна клеточная линия карциномы желудка, как было показано, экспрессирует стабильно высокие уровни мРНК Цокс-2, также не указывает на ее роль при ранних стадиях рака желудка in vivo.
Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики рака желудка на ранней стадии, который включает выявление мРНК Цокс-2 или белка Цокс-2 в соответствующих образцах, взятых у пациента. Этот метод основан на установленном авторами факте повышенной экспрессии Цокс-2 в клетках раковых опухолей желудка и в предраковых повреждениях, но в очень низкой или вообще не определяемой ее экспрессии в нормальных тканях желудка.
Взятые у пациентов образцы, которые подвергаются исследованию, например материалы биопсии или соскобы, являются материалами, которые получают во время обычной гастроскопии или промывания желудка в сочетании с соскобом. Промывание желудка и взятие соскобов являются хорошо известными способами обычного цитологического исследования желудка. Эти способы позволяют взять образцы клеток со слизистой оболочки желудка для микроскопического исследования с целью установить или исключить наличие злокачественного процесса в желудке. Маркеры, такие как Цокс-2, могут повысить чувствительность и специфичность этого исследования по сравнению с существующим в настоящее время способом прямой визуализации морфологии клеток. Биоптаты, взятые при гастроскопии, или фиксируют в формалине (для иммуногистохимического анализа), или замораживают в жидком азоте и хранят при -70oС (для анализа мРНК).
мРНК Цокс-2 удобно выявлять в указанных образцах, взятых у пациента, с помощью известных методик. Например, анализ Норзерн-блоттинг, как было показано авторами, является чрезвычайно специфичным и в сочетании с ОТ-ПЦР также весьма чувствительным.
Выявление белка Цокс-2 удобно выполнять в указанных образцах, взятых у пациента, с помощью, например, иммуногистохимического исследования, которое, кроме выявления экспрессии Цокс-2, указывает также локализацию этого белка.
Настоящее изобретение также относится к тест-наборам для осуществления способа диагностики по настоящему изобретению. Такой набор для определения экспрессии мРНК Цокс-2 включает реагенты для выделения РНК или поли-А+мРНК, специфические праймеры Цокс-2 для ОТ-ПЦР и фрагменты кДНК для изготовления проб ДНК или РНК (как чувствительных, так и античувствительных).
Набор для иммунологического выявления белка Цокс-2 включает специфичные в отношении Цокс-2 поликлональные или моноклональные антитела. Для анализа на основе пептидов белка Цокс-2 разработан диагностический набор, который включает специфические пептиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2. Указанные пептиды можно получить, например, из коллекций фагов. Также можно выполнять анализы с использованием олигонуклеотидов, в которые включены олигонуклеотиды (модифицированные молекулы РНК) в составе соответствующего диагностического набора.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1А. Нозерн-блот гибридизационный анализ общей РНК, экстрагированной из образцов карциномы желудка 1-11 и из их парных контрольных образцов, не содержавших раковых клеток ((а - полость (антрум); с - тело). Гибридизация выполнялась с пробами для Цокс-1 и Цокс-2 человека, а также с ГАФДГ в качестве нагрузочного контроля.
Фиг.1В. Показано соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК ГАФДГ. Величины (средние ± СКО среднего) на графиках представляют собой соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК ГАФДГ, рассчитанное с помощью стандартных денситометрических единиц, и показывают, что ткани карциномы желудка экспрессируют значительно более высокие уровни мРНК Цокс-2, чем контрольные образцы (Р <0,05).
Фиг.1С. Показано соотношение мРНК Цокс-1 и мРНК ГАФДГ. Величины (средние ± СКО среднего) на графиках представляют собой соотношение мРНК Цокс-1 и мРНК ГАФДГ, рассчитанное с помощью стандартных денситометрических единиц. Уровни мРНК Цокс-1 в тканях карциномы не повышены.
Фиг. 2. Уровни мРНК Цокс-1 и Цокс-2 определялись посредством ОТ-ПЦР в образцах карциномы желудка (обозначаются как b) в случаях 1, 5, 9 и 10 и в образцах из соответствующих им контролей, лишенных раковых клеток ((а - антрум; с - тело). Вся РНК сначала была обратно транскрибирована. Затем были амплифицированы образцы кДНК с помощью ПЦР с использованием изоферментных праймеров, специфичных для Цокс-1 и Цокс-2 человека.
В заключение продукты ПЦР были проанализированы и определено их количество (см. раздел "Экпериментальная часть"). График показывает соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК Цокс-1.
Фиг.3А. Иммуногистологическое окрашивание на Цокс-2 тканей карциномы желудка показало окрашивание цитоплазмы (красно-коричневый цвет) раковых клеток (черная стрелка), но не окружающей стромы (белая стрелка).
Фиг. 3В. Когда в качестве первичных антител использовали нормальные IgG кролика, срезы тканей не окрашивались.
Фиг.3С и 3D. Образцы от двух разных пациентов с тяжелой дисплазией желудка окрашивали антителами против Цокс-2. Дисплазированные железы (черные стрелки) давали положительную реакцию на Цокс-2, в то время как нормальные железы (белые стрелки) были отрицательными.
Фиг. 4А. Уровни мРНК Цокс-2 определялись с помощью ОТ-ПЦР в образцах желудка с легкой дисплазией и в соответствующих им контролях без дисплазии. Процедура: см. фиг.2. Этот график показывает цикл титрования Цокс-2 с помощью ПЦР. Цикл номер 40 использовался в фиг.4С.
Фиг. 4В. График показывает цикл титрования ГАФДГ с помощью ПЦР. Цикл номер 28 использовался в фиг.4С.
Фиг. 4С. График показывает соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК ГАФДГ. Статистически достоверной разницы между образцами с дисплазией легкой степени (Дисплазия 1) (453±125, среднее ± СКО среднего) и соответствующими им контролями (424±90) не наблюдалось.
Экспериментальная часть
Сокращения
ОТ-ПЦР - полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой
Цокс-1 - циклооксигеназа 1
Цокс-2 - циклооксигеназа 2
НПВП - нестероидные противовоспалительные препараты
САП - семейный аденоматозный полипоз
мРНК - матричная РНК (рибонуклеиновая кислота)
ГАФДГ - глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа
ДСН - додецилсульфат натрия
Образцы, взятые у пациентов. Двенадцать образцов аденокарциномы желудка (см. таблицу) и двенадцать образцов карциномы яичников со слизистых оболочек были получены из тканей, удаленных хирургическим путем, которые были заморожены в жидком азоте и до анализа хранились при -70oС. Один образец карциномы желудка из-за сильного аутолиза при гистологическом исследовании был исключен из анализа. В случае карциномы желудка парные образцы слизистой оболочки желудка, которые не содержали ни макроскопической опухолевой ткани, ни гистологически различимых раковых клеток, получали из антрума (n=10) и тела (n=10) желудка. Все формы рака желудка представляли собой, в основном, аденокарциномы, из которых восемь представляли собой интестинальный и три-диффузный тип (Lauren, 1965) по определению названного здесь патолога.
Выделение РНК и нозерн-блот анализ
Общую РНК выделяли с помощью методики Chomczynski и Sacchi (1987) с использованием реагента RNAzolTM В (Tel-Test, Friendswood, TX) и ее количество определяли поглощением при 260 нм. Образцы РНК (15 мкг) денатурировали в 1М глиоксале, 50% диметилсульфоксиде и 10 мМ фосфатном буфере при 50oС в течение 60 мин, подвергали электрофорезу на 1,2% геле агарозы и переносили на нейлоновые мембраны Hybond-N (Amersham International, Aulesbury, UK), которые затем облучали УФ в течение 6 мин с помощью УФ прибора Reprostar II (Camag, Muttenz, Switzerland). Фрагменты очищенной человеческой кДНК Цокс-1 ORF (1,8 тыс. осн.), Цокс-2 ORF (1,8 тыс. осн.) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ, 0,8 тыс. осн.) метили с помощью [32P]-α-dCTP (3000 Ки/ммоль, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) и набора Prime-a-Gene (Promega, Madison, WI). Пробы очищали на ник-колонках (Pharmacia, Uppsala, Sweden) и использовали при 1•106 имп. /мин/мл в гибридизационном растворе, содержавшем 50% формамида, 6•SSC (1•SSC=0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат Na, pH 7,0), 0,1% Ficoll, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота, 100 мкг/мл ДНК молок сельдевых рыб, 100 мкг/мл РНК дрожжей и 0,5% додецилсульфата натрия (ДСН) при 42oС в течение 16 ч. Фильтры трижды промывали 0,1-1•SSC и 0,1% ДСН при 50oС. Пробы нозерн блот количественно определяли на приборе FujiFilm IP-Reader Bio-Imaging Analyzer BAS 1500 (Fuji Photo Co., Tokyo, Japan) с помощью программы MacBas, поставляемой производителем, и визуализировали с помощью ауторадиографии.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР)
Общую РНК (1 мкг) превращали в кДНК на приборе Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD) с помощью олиго-dT (Pharzmacia) и случайных гексамеров (Life Technologies). Для получения полуколичественных результатов оптимизировались три параметра: количество циклов, концентрация праймеров и температура гибридизации. кДНК (4 мкл) амплифицировали с помощью ПЦР в 100 мкл реакционной смеси, которая содержала 10 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КС1, 0,2 мМ dNTPs, 1,5 мМ MgCl, 0,2 мкг (Цокс-1) или 2 мкг (Цокс-2) чувствительных и античувствительных праймеров (Ristimaki et al., 1994), и 2,5 ЕД ДНК-полимеразы Dynazyme II (Finnzymes, Espoo, Finland). Для эксперимента, указанного на фиг. 2, образцы амплифицировали в течение 30 (Цокс-1) или 32 (Цокс-2) циклов денатурации при 96oС в течение 1 мин, проводили гибридизацию при 60oС (Цокс-1) или при 46oС (Цокс-2) в течение 1 мин и распрямляли при 72oС в течение 1 мин. Амплифицированные кДНК анализировали с помощью электрофореза на 2% геле агарозы и окрашивания бромидом этидия. Амплифицированные продукты количественно определяли с помощью камеры CCD высокого разрешения (серии Cohu 4910 с чип-интеграцией, Cohu Inc., San Diego, CA) и программы Scion Image 1.57 (Scion Corp., Frederick, MD) на персональном компьютере Макинтош.
Процедуру ОТ-ПЦР для фиг.4А и фиг.4В выполняли, как описано выше. Однако указанные циклы титровали заново; результаты представлены на фиг.4С.
Иммуногистохимический анализ
Образцы ткани фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером, заливали в парафин, нарезали (приблизительно 5 мкм), депарафинизировали и подвергали высокочастотному воздействию в течение 15 мин в 0,1 М Na-цитратном буфере (рН 6,0). Срезы затем погружали в 0,6% пероксид водорода на 30 мин, а затем в нормальную козью сыворотку (5%)/сывороточный альбумин крупного рогатого скота (10%) на 1 ч для блокирования активности эндогенной пероксидазы и неспецифических сайтов связывания соответственно. Иммуноокрашивание осуществляли с помощью поликлонального иммуноглобулина G кролика против пептида Цокс-2 мыши (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) в разведении 1:300 - 1:600 при 4oС в течение ночи. Срезы затем обрабатывали биотинилированными вторичными антителами в разведении 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), а участки связывания антител в конечном итоге визуализировали с помощью раствора пероксидазного комплекса авидин-биотин (ABComplex, Vectastain, Vector Laboratories) и 3-амино-9-этилкарбазола (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). Контрастное окрашивание осуществляли с помощью гемалаума Mayer (Merck, Darmstadt, Germany).
Статистический анализ
Статистическую достоверность рассчитывали с помощью рангового знакового критерия Вилкоксона, и в качестве статистически значимой величины была выбрана Р<0,05, Все результаты представлены в виде средних ± СКО среднего.
Результаты
Ткани карциномы желудка экспрессировали достоверно более высокие уровни мРНК Цокс-2 по сравнению с образцами, взятыми из антрума или тела желудка, которые не содержали раковых клеток, как показала нозерн блот гибридизация (фиг. 1А). Транскрипты Цокс-2 экспрессировали как интестинальные, так и диффузные карциномы. Уровни мРНК Цокс-2 не коррелировали с долей ткани карциномы в образце. Фиг.1В показывает, что ткани карциномы желудка экспрессировали достоверно более высокие уровни мРНК Цокс-2 по сравнению с контрольными образцами (Р <0,05). Как показано на фиг.1С, уровни транскриптов Цокс-1 в тканях карциномы не были повышены по сравнению с уровнями в соответствующих им контролях.
Три образца карциномы желудка (номера 5, 9, 10) экспрессировали низкие уровни мРНК Цокс-2, как показал нозерн блот анализ (фиг.1А). Для дальнейшей оценки уровня экспрессии Цокс-1 и Цокс-2 в этих образцах авторы осуществили полуколичественную ОТ-ПЦР, с образцом номер 1 в качестве положительного контроля. Как показано на фиг.2, отношение мРНК Цокс-2 к мРНК Цокс-1 было выше в образцах карциномы по сравнению с парными образцами, взятыми из антрума или тела желудка, которые не содержали раковых клеток.
Как показано на фиг.3А, иммуногистологическое окрашивание специфичными в отношении Цокс-2 поликлональными антителами показало окрашивание цитоплазмы раковых клеток (черная стрелка), но не окружающей стромы (белая стрелка). При использовании нормальных IgG кролика в качестве первичных антител, срезы тканей не окрашивались (фиг.3В). Важно, что фиг.3С и 3D показывают окрашивание образцов тяжелой дисплазии желудка от двух разных пациентов антителами против Цокс-2. Дисплазированные железы (черные стрелки) давали положительную реакцию на Цокс-2, в то время как нормальные железы (белые стрелки) были отрицательными. Нормальные IgG кролика не давали положительного окрашивания (не показано).

Claims (6)

1. Способ определения риска развития рака желудка или карциномы in situ, включающий исследование образца, взятого у пациента, отличающийся тем, что исследуемые образцы, взятые у пациента, включают клетки слизистой желудка или предраковых повреждений при карциноме желудка, в которых определяют экспрессию мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОКС-2) или белка ЦОКС-2, причем высокие уровни экспрессии по сравнению с контрольными образцами указывают на повышенный риск развития рака желудка.
2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что образцом для определения, взятым у пациента, является биоптат или соскоб.
3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что определение экспрессии мРНК Цокс-2 выполняется с помощью анализа нозерн блот, in situ, методик на основе защиты РНК-азы или ОТ-ПЦР или их комбинаций.
4. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что определение белка Цокс-2 выполняется с помощью поли- или моноклональных антител, анализа на основе пептидов или анализов на основе олигонуклеотидов.
5. Диагностический набор для выполнения способа по пп. 1 и 3, включающий реагенты для выделения РНК или поли-А+мРНК, специфические праймеры Цокс-2 для ОТ-ПЦР и фрагменты кДНК для изготовления пробных ДНК или РНК.
6. Диагностический набор для выполнения способа по пп. 1, 4, включающий специфичные в отношении Цокс-2 поликлональные или моноклональные антитела, специфические пептиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2, или олигонуклеотиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2.
RU99121656/14A 1997-03-18 1998-03-18 Диагностика рака желудка на ранней стадии RU2204835C2 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI971124A FI971124A0 (fi) 1997-03-18 1997-03-18 Metod foer diagnostisering av magcancer
FI971124 1997-03-18

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU99121656A RU99121656A (ru) 2001-07-20
RU2204835C2 true RU2204835C2 (ru) 2003-05-20

Family

ID=8548414

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU99121656/14A RU2204835C2 (ru) 1997-03-18 1998-03-18 Диагностика рака желудка на ранней стадии

Country Status (20)

Country Link
US (1) US6416961B1 (ru)
EP (1) EP0968421B1 (ru)
JP (1) JP2001519900A (ru)
KR (1) KR20000076291A (ru)
CN (1) CN1250523A (ru)
AT (1) ATE272838T1 (ru)
AU (1) AU732228B2 (ru)
BR (1) BR9808378A (ru)
CA (1) CA2284048A1 (ru)
DE (1) DE69825431T2 (ru)
DK (1) DK0968421T3 (ru)
ES (1) ES2226105T3 (ru)
FI (1) FI971124A0 (ru)
IL (1) IL131594A (ru)
NO (1) NO994440L (ru)
NZ (1) NZ338068A (ru)
PT (1) PT968421E (ru)
RU (1) RU2204835C2 (ru)
TR (1) TR199902298T2 (ru)
WO (1) WO1998041864A1 (ru)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2613300C1 (ru) * 2015-11-10 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики низко дифференцированного нейроэндокринного рака желудка
RU2613139C1 (ru) * 2015-10-12 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов
RU2642989C1 (ru) * 2016-12-19 2018-01-29 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") Способ диагностики онкологических заболеваний
RU2743221C1 (ru) * 2020-10-12 2021-02-16 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения типа рака желудка по классификации lauren методом компьютерной томографии

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6335193B1 (en) * 1999-04-15 2002-01-01 Padmanabhan P Nair Isolated colonocytes
AU2543301A (en) * 2000-01-14 2001-07-24 Vera Genics Ltd. Method and kit for diagnosis of neoplastic transformation
EP1268854A4 (en) 2000-03-27 2003-05-02 Univ Jefferson HIGH SPECIFICITY MARKER DETECTION
WO2001075169A2 (en) * 2000-03-30 2001-10-11 Diadexus, Inc. Compositions and methods for diagnosing, monitoring, staging, imaging and treating stomach cancer
WO2003001183A2 (en) * 2001-06-25 2003-01-03 Oncomedx, Inc. Methods for detecting and monitoring cox-2 rna in plasma and serum
AU2002359817A1 (en) * 2001-12-21 2003-07-30 Diadexus, Inc. Compositions and methods relating to gastric specific genes and proteins
KR100475642B1 (ko) * 2001-12-29 2005-03-10 한국생명공학연구원 암 발생 및 전이에 관여하는 단백질의 당쇄 변화를측정하여 암을 진단하는 방법 및 이를 이용한 진단킷트
WO2004007770A2 (en) * 2002-07-10 2004-01-22 Oncotherapy Science, Inc. Method for diagnosis of intestinal-type gastric tumors
AU2003263607A1 (en) * 2002-10-25 2004-05-13 Japan As Represented By The President Of The University Of Tokyo Method for diagnosing diffuse-type gastric cancer
CN105316405A (zh) * 2003-07-17 2016-02-10 环太平洋生物技术有限公司 用于胃癌检测的标记物
US20050014165A1 (en) * 2003-07-18 2005-01-20 California Pacific Medical Center Biomarker panel for colorectal cancer
US20050075543A1 (en) * 2003-10-03 2005-04-07 Calabrese Charles A. Method of anonymous medical testing and providing the patient with the test results
KR100645979B1 (ko) * 2004-08-09 2006-11-15 한국생명공학연구원 위암 유전자 마커 및 이를 이용한 위암 진단킷트
US20080312093A1 (en) * 2005-11-04 2008-12-18 Johji Inazawa Method for detecting cancer and a method for suppressing cancer
CN109387635A (zh) * 2018-11-07 2019-02-26 国家纳米科学中心 基于热泳细胞外囊泡检测的胃癌检测系统及方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5459239A (en) 1994-01-24 1995-10-17 Merck Frosst Canada Inc. Peptide sequences and antipeptide antisera for detecting human cyclooxygenase-1 and cyclooxygenase-2 proteins

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
STEMMERMANN G. et al. The molecular biology of esophageal and gastric cancer and their precursors: oncogenes, tumor suppressor genes, and gromth factors. Hum. Pathol. 1994, 25, 968-981. DUBOIS R. N. et al. Jncreased cyclooxygenase-2 levels in carcinogen-induced rat colonic tumors. Gastroentercology. 1996, 110, 1259-1262. TSUJI S. et al Evidences for involvement of cyclooxygenase-2 in proliferation of two gastrointestinal cancer cell lines. Prostagland. Leuk. Essent. Fatty. 1996, 55, 179-183. *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2613139C1 (ru) * 2015-10-12 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ дифференциальной диагностики рака желудка различных гистологических типов
RU2613300C1 (ru) * 2015-11-10 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ диагностики низко дифференцированного нейроэндокринного рака желудка
RU2642989C1 (ru) * 2016-12-19 2018-01-29 федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого" (ФГАОУ ВО "СПбПУ") Способ диагностики онкологических заболеваний
RU2743221C1 (ru) * 2020-10-12 2021-02-16 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Петрова" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ определения типа рака желудка по классификации lauren методом компьютерной томографии

Also Published As

Publication number Publication date
CA2284048A1 (en) 1998-09-24
KR20000076291A (ko) 2000-12-26
WO1998041864A1 (en) 1998-09-24
TR199902298T2 (xx) 2000-01-21
DE69825431D1 (de) 2004-09-09
IL131594A (en) 2004-02-19
IL131594A0 (en) 2001-01-28
PT968421E (pt) 2004-10-29
AU732228B2 (en) 2001-04-12
ATE272838T1 (de) 2004-08-15
JP2001519900A (ja) 2001-10-23
NO994440D0 (no) 1999-09-13
DE69825431T2 (de) 2005-07-28
NZ338068A (en) 2001-03-30
NO994440L (no) 1999-11-18
US6416961B1 (en) 2002-07-09
AU6404198A (en) 1998-10-12
CN1250523A (zh) 2000-04-12
FI971124A0 (fi) 1997-03-18
EP0968421A1 (en) 2000-01-05
ES2226105T3 (es) 2005-03-16
EP0968421B1 (en) 2004-08-04
DK0968421T3 (da) 2004-12-06
BR9808378A (pt) 2000-05-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2204835C2 (ru) Диагностика рака желудка на ранней стадии
Al-Haddad et al. Psoriasin (S100A7) expression and invasive breast cancer
ES2355388T3 (es) Métodos para la detección precoz de cáncer.
US20170115296A1 (en) Traceability of cellular cycle anomalies targeting oncology and neurodegeneration
KR20070073802A (ko) Ｗｎｔ 단백질 및 암의 검출 및 치료
CA2691714C (en) Determination of 5-asa efficacy in crc prevention and/or treatment by gene expression analysis
ES2861440T3 (es) Uso de complejos del factor de transcripción de nucleosomas para la detección del cáncer
Cho et al. Overexpression and mutation of p53 exons 4–8 in canine intestinal adenocarcinoma
KR101058753B1 (ko) 대장암 마커로서의 ｅｓｍ－１ 유전자 및 이를 이용한대장암의 진단 및 치료에의 용도
EP2288721B1 (en) Treatment prediction involving hmgcr protein
FR2882754A1 (fr) Methodes diagnostics et pronostics du cancer du sein utilisant liv21
Liang et al. Activated leukocyte cell adhesion molecule expression is up-regulated in the development of endometrioid carcinoma
CN105785004B (zh) 细胞分裂周期相关蛋白2在胰腺癌诊断或预后中的用途
US20160108477A1 (en) Traceability of Cellular Cycle Anomalies Targeting Oncology and Neurodegeneration
US20160311928A1 (en) DCLK1 Short Form Specific Binding Agents
US8945832B2 (en) Treatment prediction involving HMGCR
JP7222117B2 (ja) Ｔｕｂａ１ｃタンパク質を過発現するエクソソーム基盤の癌の診断又は予後予測用マーカー組成物
US20230045066A1 (en) Biomarkers for diagnosing breast cancer and uses thereof
KR20090012382A (ko) 대장암 진단용 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트
US7759068B2 (en) Use of substances for treating tumors
Cocchi et al. The utility of FISH analysis in the diagnosis of BCOR-rearranged sarcomas
Schandl et al. EXPRESSION OF CDC25A, CDC25B AND C-MYC IN GASTRIC CANCER AND IN CHRONIC GASTRITIS BEFORE AND AFTER HELICOBACTER PYLORI ERADICATION THERAPY
JP2003527088A (ja) ＰＰＡＲδが仲介するＡＰＣと化学予防薬の結合
WO2007088639A1 (ja) Ｍ期キナーゼ基質タンパク質及びその使用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A The patent is invalid due to non-payment of fees

Effective date: 20150319