DE69825431T2 - Diagnostik zur früherkennung von magenkrebs - Google Patents

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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Untersuchung steht im Zusammenhang mit der Diagnostik von Magenkrebs oder -karzinom und betrifft im speziellen eine Methode zur Erfassung von Magenkrebs durch Bestimmung der Cyclooxygenase-2-Expression in einer Patientenprobe während der prämalignen Phase.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Magenkrebs ist eine der häufigsten und tödlichsten Malignitäten der Welt (Coleman et al., 1993). Er ist die vierthäufigste Malignität bei finnischen Männern und die fünfthäufigste bei Frauen und stellt 5 % der gesamten Malignitäten in Finnland dar (Cancer Incidence in Finland 1994. Finnish Cancer Registry, Helsinki, 1996). Die Früherkennung von Magenkrebs ist schwierig, und in den meisten westlichen Ländern ist die Fünf-Jahres-Überlebensrate geringer als 20 % (Wanebo et al., 1993). Mehr als 90 % der Magenkrebse stellen Adenokarzinome dar, die entsprechend der Laurén-Klassifizierung in intestinale und diffuse Typen unterteilt werden (Lauren, 1965).
  • Die Pathogenese von Magenkrebs ist komplex und nicht vollständig geklärt; im Falle des intestinalen Typs wurden jedoch bestimmte vorangehende Veränderungen, wie chronisch-atrophische Gastritis, intestinale Metaplasie und epitheliale Dysplasie mit der Erkrankung in Zusammenhang gebracht (Antonioli, 1994). Im Gegensatz dazu sind beim diffusen Typ keine gut erkennbaren vorangehenden Lesionen bemerkbar. Da für die beiden histologisch verschiedenen Magenkrebstypen unterschiedliche Kombinationen von genetischen Veränderungen gefunden wurden, besteht die Möglichkeit, dass sie einen unterschiedlichen genetischen Hintergrund aufweisen (Stemmermann et al., 1994; Tahara et al., 1996). Es wird jedoch angenommen, dass Malignität-bezogene genetische Veränderungen, die bei beiden Typen von Magenkrebs auftreten, jene darstellen, die bereits in der prämalignen Phase der Erkrankung vorhanden sind (Tahara et al., 1996).
  • Im Tiermodell inhibieren nicht-steroidale Entzündungshemmer (NSAIDs) wie Aspirin, Indomethacin oder Sulindac chemisch induzierte Kolonkarzinome (Steele et al., 1994; Giardiello et al., 1995). Epidemiologische Untersuchungen haben gezeigt, dass die Einnahme von Aspirin über einen längeren Zeitraum das Auftreten und die Mortalität des gastrointestinalen Karzinoms einschließlich des Magenkrebses reduziert (Laasko et al., 1986; Giardiello, 1994; Thun, 1994; Thun et al., 1993).
  • Der am besten untersuchte Angriffspunkt für NSAIDs ist Cyclooxygenase (Cox), welche das limitierende Enzym für die Rate der Umwandlung von Arachidonsäure zu Prostanoiden darstellt. Bisher wurden zwei Cox-Gene (Cox-1 und Cox-2) cloniert, die über 60 % Identität im Aminosäuren-Bereich sowie ähnliche enzymatische Aktivität aufweisen (Hershman, 1996; Smith et al., 1996). Cox-1 gilt als Haushalts-Gen, und Prostanoide, die via Cox-1-Weg synthetisiert werden, werden für den Zellschutz des Magens, für die Vasodilatation in der Niere und für die Produktion von Thromboxan, eines proaggregatorischen Prostanoids, durch Blutplättchen verantwortlich gemacht. Im Gegensatz dazu ist Cox-2 ein induzierbares Gen vom Sofort- und Frühtyp, und seine pathophysiologische Funktion wurde mit Entzündungen, Reproduktion und Karzinogenese in Zusammenhang gebracht.
  • Jüngste Studien weisen darauf hin, dass Cox-2 mit der Kolon-Karzinogenese in Zusammenhang steht und daher einen Angriffspunkt für den chemopräventiven Effekt von NSAIDs darstellen könnte: i) Die genetische Zerstörung des Cox-2-Gens oder die Behandlung mit Cox-2-spezifischen Wirkstoffen unterdrückt die Bildung von Polypen im Mausmodell für FAP (Oshima et al., 1996), ii) Überexpression von Cox-2 in intestinalen Epithelzellen der Ratte ändern die Rate des programmierten Zelltods sowie deren Adhäsion an die extrazelluläre Matrix (Tsujii et al., 1995), und iii) zwei unterschiedliche Cox-2-selektive Inhibitoren unterdrücken chemisch induzierte aberrante Kryptenherde im Kolon der Ratte (Takahashi et al., 1996; Reddy et al., 1996). Weiterhin werden im Vergleich zu normaler Mukosa erhöhte mRNA- und Proteinwerte von Cox-2, nicht aber von Cox-1, in chemisch induzierten Kolonkarzinomgeweben der Ratte (DuBois et al., 1996) und in menschlichen Kolonkarzinomen gefunden (Eberhart et al., 1994; Kargman et al., 1995; Sano et al., 1995).
  • Die Idee, dass der chemopräventive Effekt von NSAIDs gegen Cox-2 gerichtet ist, wird durch weitere Untersuchungen bestärkt, die zeigen, dass Cox-2-selektive Verbindungen die Proliferation von intestinalen Epithelzellen sowie Epithelzellen des Brustgewebes der Ratte inhibieren, wobei Cox-2-Expression durch Oncogene induziert wird (Sheng et al., 1997 und Subbaramaiah et al., 1996). Zusätzlich wurde vor kurzem von Tsuji et al. (1996) berichtet, dass ein Cox-2-spezifischer Inhibitor die Proliferation von Magen- und Kolonkarzinom-Zelllinien unterdrückt, die ein dauerhaft hohes Expressionsniveau von Cox-2-mRNA aufwiesen. Dies war nicht der Fall bei Zelllinien, die ein niedriges Expressionsniveau von Cox-2-mRNA aufweisen.
  • Weiterhin zeigen Williams et al., in Gastroenterology, Bd. 111, 1134-1140, 1996, dass Cox-2 durch eine Reihe von Faktoren wie z.B. Tumor-Promotoren induziert werden kann, und dass die Cox-2-Expression in einem frühen präinvasiven Stadium von Mausadenomen hinaufreguliert ist. Während auf die mögliche Korrelation zwischen Cox-2-Expression und Kolontumorbildung hingewiesen wird, wurde kein Hinweis darauf gegeben, dass diese frühe Überexpression auch in anderen intestinalen Karzinomgeweben gefunden werden kann.
  • Normales gastrointestinales Gewebe weist fast ausschließlich die Cox-1-Isoform auf, weiterhin wurde in gesundem Magengewebe kein funktionelles Cox-2-Protein gefunden (Kargman et al., 1996). Es ist allerdings möglich, dass Cox-2-mRNA mit sensitiveren Methoden als dem traditionellen Northern Blot-Hybridisierungsverfahren für Gesamt-RNA, wie z.B. mit RT-PCR (siehe O'Neill und Ford-Hutchinson 1993, sowie 2 und 4 in der vorliegenden Arbeit) nachgewiesen werden kann.
  • Beschreibung der Erfindung
  • Da nicht bekannt ist, ob Cox-2 in Magenkrebsgeweben in vivo oder in prämalignen Lesionen des Magenkarzinoms vorhanden ist, haben wir die Expression von Cox-2 in Adenokarzinomen des Magens und in schweren Dysplasien des Magens (welche hochgradig prämalign sind) untersucht. Wir haben erhöhte Mengen von Cox-2-mRNA, nicht aber von Cox-1-mRNA, in menschlichen Adenokarzinomgeweben des Magens sowie in schweren Dysplasien des Magens gefunden. Die Cox-2-Expression bei milden Dysplasien des Magens, die sich nur selten zu Malignitäten entwickeln, war jedoch nicht erhöht. In Magenkarzinomen war das Cox-2-Protein vor allem in den Krebszellen lokalisiert.
  • Erhöhte Expression von Cox-2 war nicht ausschließlich beim intestinalen Typ zu finden, da jedes der drei analysierten Karzinome des diffusen Typs höhere Werte von Cox-2-mRNA aufwies als die entsprechenden Kontrollen. Daher ist die Überexpression von Cox-2 eine der Gemeinsamkeiten, die diese beiden histologisch und genetisch unterschiedlichen Erkrankungen aufweisen, was darauf hinweisen könnte, dass sie in der frühen Phase der Karzinogenese involviert ist. In der Tat haben wir festgestellt, dass Cox-2 in schweren Dysplasien des Magens exprimiert wird, während bei milden Formen keine erhöhte Expression vorhanden war. Das weist darauf hin, dass die Cox-2-Expression spezifisch mit prämalignen Lesionen des Magenkrebses assoziiert ist.
  • Zusammengefasst haben wir gezeigt, dass Cox-2 in menschlichen Magenkarzinomgeweben im Vergleich zu entsprechenden Proben der Magenmukosa, die keine Krebszellen aufwiesen, exprimiert wird. Cox-2-mRNA wurde sowohl bei Adenokarzinomen des intestinalen Typs als auch bei solchen des diffusen Typs nachgewiesen. Mittels Immunohistochemie wurde gezeigt, dass das Cox-2-Protein in Magenkarzinomzellen, nicht aber im umliegenden Stroma lokalisiert ist. Wichtig ist, dass Proben von schwerer Dysplasie des Magens, die prämaligne Lesionen aufwiesen, hochgradig positiv auf Cox-2 waren. Dies weist darauf hin, dass Cox-2 für die Diagnostik von frühen Magenkarzinomen und für die Bestimmung der Schwere von prämalignen Lesionen herangezogen werden kann.
  • Die Expression von Cox-2 bei menschlichen Karzinomen scheint, zumindest bis jetzt, auf den gastrointestinalen Trakt beschränkt zu sein. Da jedoch Kolon- und Magenkarzinome sowohl epidemiologisch als auch morphologisch und genetisch unterschiedliche Erkrankungen darstellen, kann aus erhöhten Werten von Cox-2-mRNA und -Protein, die tatsächlich in Kolonkarzinomgeweben von Nagern und Menschen gefunden wurden, nicht auf deren Bedeutung in Magengeweben geschlossen werden. Die Tatsache, dass eine Magenkarzinom Zell-Linie permanent erhöhte Werte von Cox-2-mRNA exprimiert, gibt ebenfalls keinen Hinweis auf deren Rolle bei frühem Magenkrebs in vivo.
  • Die Aufgabe dieser Erfindung ist die Entwicklung eines Verfahrens für die Diagnostik von frühen Magenkarzinomen, das den Nachweis von Cox-2-mRNA oder des Cox-2-Proteins in relevanten Patientenproben umfasst. Dies basiert auf unserer Erkenntnis, dass Cox-2 in Magenkarzinomzellen und in prämalignen Lesionen hochgradig exprimiert wird, und dass jedoch dessen Expression im normalen Magengewebe sehr niedrig bzw. nicht nachweisbar ist.
  • Die zu analysierenden Patientenproben sind z.B. Biopsien oder Bürstenabstrich-Proben, die routinemäßig während einer Gastroskopie oder einer Magenspülung, die mit der Bürstenabstrichtechnik kombiniert wird, genommen werden. Magenspülungen und Bürstenabstrichtechniken sind etablierte Methoden in der routinemäßigen Magencytologie. Mit diesen Techniken werden Zellproben der Magenschleimhaut bereitgestellt, die durch mikroskopische Untersuchung zur Diagnose oder zum Ausschluss der Möglichkeit einer Malignität des Magens beitragen. Marker wie Cox-2 könnten dazu beitragen, die Empfindlichkeit und Spezifität solcher Untersuchungen im Vergleich zur derzeitigen Methode der visuellen Analyse der Zellmorphologie zu erhöhen. Biopsieproben der Gastroskopie werden entweder Formalin-fixiert (für Immunhistochemie) oder in flüssigem Stickstoff gefroren und bei –70°C gelagert (für mRNA-Untersuchungen).
  • Cox-2-mRNA kann aus besagten Patientenproben mit bekannten Verfahren einfach nachgewiesen werden. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass das Northern Blot-Verfahren außerordentlich spezifisch, sowie in Kombination mit RT-PCR auch sehr empfindlich ist.
  • Der Nachweis von Cox-2-Protein aus besagten Patientenproben kann einfach z.B. mittels Immunhistochemie durchgeführt werden, die zusätzlich zum Nachweis der Cox-2-Expression auch die Lokalisation des Proteins zeigt.
  • Das diagnostische Verfahren der Erfindung kann mit geeigneten Test-Kits durchgeführt werden. Ein Kit für die Bestimmung der Cox-2-Expression enthält daher RNA- oder Poly-A+mRNA-Isolierungsreagentien, Cox-2-spezifische Primer für RT-PCR und cDNA-Fragmente für die Produktion von DNA- oder RNA (Sense und Antisense)-Sonden.
  • Ein Kit für den immunologischen Nachweis des Cox-2-Proteins umfasst Cox-2-spezifische polyclonale oder monoclonale Antikörper. Es können auch Tests angewendet werden, die auf Oligonucleotiden basieren, wobei Oligonucleotide (modifizierte RNA-Moleküle) mit Bindungsaffinität zu Cox-2 im entsprechenden diagnostischen Kit enthalten sind.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1A. Northern Blot-Hybridisierungsanalyse der Gesamt-RNA, extrahiert aus Magenkarzinomproben 1-11, und von deren gepaarten Kontrollproben, die keine Krebszellen enthalten (a, Antrum; c, Corpus). Die Hybridisierung wurde mit Sonden für menschliches Cox-1 und Cox-2 und mit GAPDH als Beladungskontrolle durchgeführt.
  • 1B. Das Verhältnis von Cox-2-mRNA zu GAPDH-mRNA wird gezeigt. Die Werte in der Graphik (Mittelwert±SEM) repräsentieren das Verhältnis von Cox-2-mRNA zu GAPDH-mRNA, das aus willkürlichen densitometrischen Einheiten berechnet wurde und einen Hinweis darauf gibt, dass Magenkarzinomgewebe signifikant höhere Mengen an Cox-2-mRNA exprimiert als Kontrollproben (P<0,05).
  • 1C. Das Verhältnis von Cox-1-mRNA zu GAPDH-mRNA wird gezeigt. Die Werte in der Graphik (Mittelwert±SEM) repräsentieren das Verhältnis von Cox-1-mRNA zu GAPDH-mRNA, das aus willkürlichen densitometrischen Einheiten berechnet wurde. Die Cox-1-mRNA-Werte waren in Karzinomgeweben nicht erhöht.
  • 2. Cox-1- und Cox-2-mRNA-Werte von Magenkarzinomproben (bezeichnet mit b) der Fälle 1, 5, 9 und 10 und von den gepaarten Kontrollen, die keine Krebszellen aufwiesen (a, Antrum; c, Corpus), wurden mittels RT-PCR nachgewiesen. Zuerst wurde eine reverse Transkription der Gesamt-RNA durchgeführt. Danach wurden die cDNA-Proben mittels PCR unter Verwendung von Isoenzym-spezifischen Primern für menschliches Cox-1 und Cox-2 amplifiziert. Schließlich wurden die PCR-Produkte analysiert und quantifiziert (siehe Versuchsaufbau). Die Graphik zeigt das Verhältnis von Cox-2- zu Cox-1-mRNA.
  • 3A. Die immunhistologische Färbung von Cox-2 in Magenkarzinomgeweben zeigt cytoplasmatische Färbung (rotbraune Farbe) der Karzinomzellen (schwarzer Pfeil), nicht aber des umgebenden Stromas (weisser Pfeil).
  • 3B. Bei Verwendung von normalem Kaninchen-IgG als primärem Antikörper zeigte das Gewebe keine Färbung.
  • 3C und 3D. Proben von schweren Dysplasien des Magens von zwei unterschiedlichen Patienten wurden mit Cox-2-Antikörpern gefärbt. Während dysplastische Drüsen (schwarze Pfeile) sich positiv für Cox-2 färbten, blieben normale Drüsen (weisse Pfeile) negativ.
  • 4A. Mittels RT-PCR wurden Cox-2-mRNA-Werte von Magenproben mit leichter Dysplasie, bzw. von den entsprechenden Kontrollen, die keine Dysplasie aufwiesen, nachgewiesen. Vorgehen: siehe 2. Die Graphik zeigt die PCR-Zyklus-Titration von Cox-2. In der 4C wurde der Zyklus Nummer 40 dargestellt.
  • 4B. Die Graphik zeigt die PCR-Zyklus-Titration für GAPDH. In der 4C wurde der Zyklus Nummer 28 dargestellt.
  • 4C. Die Graphik zeigt das Verhältnis von Cox-2-mRNA zu GAPDH-mRNA. Es konnte kein statistischer Unterschied zwischen Proben von milder Dysplasie (Dysplasie I, 453±125, Mittelwert±SEM) und den entsprechenden Kontrollen (424±90) festgestellt werden.
  • Versuchsaufbau Abkürzungen
    • RT-PCR
      Reverse Transkriptase-Polymerasenkettenreaktion
      Cox-1
      Cyclooxygenase 1
      Cox-2
      Cyclooxygenase 2
      NSAID
      Nicht-steroidale entzündungshemmende Wirkstoffe
      FAP
      Familiäre adenomatöse Polypose
      mRNA
      Boten-RNA (Ribonucleinsäure)
      GAPDH
      Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase
      SDS
      Natriumdodecylsulfat
  • Patientenproben. Zwölf Proben von Adenokarzinomen des Magens (Tabelle 1) und zwölf Proben von Ovarkarzinomen von muzinöser Histologie wurden aus chirurgisch entfernten Geweben gewonnen, die in flüssigem Stickstoff gefroren und bis zur Untersuchung bei –70°C gelagert wurden. Eine Probe eines Magenkarzinoms wurde von der Analyse ausgeschlossen, da sie in der histologischen Untersuchung starke Autolyse zeigte. Für die Untersuchungen der Magenkarzinome wurden gepaarte Kontrollproben der Magenschleimhaut entnommen, die kein makroskopisch erkennbares Tumorgewebe oder histologisch nachweisbare Krebszellen aufwiesen; die Proben stammten von Antrum (n=10) und Corpus (n=10) des Magens. In allen Fällen von Magenkrebs handelte es sich primär um Adenokarzinome, von denen vom gleichen Pathologen acht dem intestinalen und drei dem diffusen Typ (Launen, 1965) zugeordnet wurden.
  • Figure 00100001
  • RNA-Isolierung und Northern Blot-Analyse. Gesamt-RNA wurde nach der Methode von Chomczynski und Sacchi (1987) mit RNAzolTM B-Reagenz (Tel-Test, Friedenswood, TX) isoliert und durch Absorbtion bei 260 nm quantifiziert. RNA-Proben (15 μg) wurden in 1 M Glyoxal, 50 % Dimethylsulfoxid und 10 mM Phosphat-Puffer bei 50°C für 60 min denaturiert, die Elektrophorese wurde auf einem 1,2 %igen Agarose-Gel durchgeführt, anschließend erfolgte die Übertragung auf Hybond-N® Nylon-Membranen (Amersham International, Aulesbury, UK), welche dann für 6 min mittels ReprostarTM II UV Illuminator (Camag, Muttenz, Schweiz) mit UV-Licht bestrahlt wurden. Gereinigte cDNA-Fragmente von menschlichem Cox-1-ORF (1,8 kb), Cox-2-ORF (1,8 kb) und Glyceraldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH, 0,8 kb) wurden mit [32P]-α-dCTP (3000 Ci/mmol, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) und dem Prime-a-Gene Kit (Promega, Madison, WI) markiert. Sonden wurden mit Nick-Säulen (Pharmacia, Uppsala, Schweden) gereinigt und in einer Konzentration von 1 × 106 cpm/ml in der Hybridisierungslösung, enthaltend 50 Formamid, 6 × SSC (1 × SSC = 0,15 M NaCl und 0,015 M Na-Citrat, pH 7,0), 0,1 FicollTM, 0,1 % Polyvinylpyrrolidon, 0,1 % Rinderserumalbumin, 100 μg/ml Hering-Sperma-DNA, 100 μg/ml Hefe-RNA und 0,5 % Natriumdodecylsulfat (SDS) bei 42°C für 16 Stunden inkubiert. Die Filter wurden dreimal mit 0,1-1 × SSC und 0,1 % SDS bei 50°C gewaschen. Die Northern Blots wurden mit Hilfe des Fujifilm IP- Reader Bio-Imaging Analyzer BAS 1500 (Fuji Photo Co., Tokyo, Japan) und der vom Hersteller bereitgestellten MacBas-Software quantifiziert und mittels Autoradiographie visualisiert.
  • Reverse Transkriptase-Polymerasenkettenreaktion (RT-PCR). Die Gesamt-RNA wurde mit Hilfe von SuperskriptTM II (Life Technologies, Gaithersburg, MD) mit beiden Oligo-dT (Pharmacia) und zufälligen Hexameren (Life Technologies) in cDNA umgewandelt. Um semiquantitative Ergebnisse zu erzielen, wurden drei Parameter optimiert: Anzahl der Zyklen, Konzentration der Primer, und die Anlagerungstemperatur. Die PCR-Amplifizierung der cDNA (4 μl) erfolgte in 100 μl Reaktionsgemischen, enthaltend 10 mM Tris-HCl, pH 8,8, 50 mM KCl, 0,2 mM dNTPs, 1,5 mM MgCl, 0,2 μg (Cox-1) oder 2 μg (Cox-2) Sense- oder Antisense-Primer (Ristimäki et al., 1994) und 2,5 U DynazymeTM II DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finnland). Für den in 2 dargestellten Versuch wurden die Proben über 30 (Cox-1) bzw. 32 (Cox-2) Zyklen, bestehend aus Denaturierung bei 96°C für 1 min, Anlagerung bei 60°C (Cox-1) bzw. 46°C (Cox-2) für 1 min und Verlängerung bei 72°C für 1 min, amplifiziert. Die amplifizierte cDNA wurde auf einem 2 %igen Agarosegel elektrophoretisch aufgetrennt und mit Ethidiumbromid gefärbt. Die amplifizierten Produkte wurden mittels High-Performance CCD-Kamera (Cohu 4910 Serie mit ,on Chip' Integration, Cohu Inc., San Diego, CA) und der Scion Image 1.57-Software (Scion Corp., Frederick, MD) auf einem Macintosh-Computer quantifiziert.
  • Das Verfahren der RT-PCR für die in 4A und 4B dargestellten Versuche entspricht dem oben beschriebenen. Die Zyklen wurden jedoch neu titriert; die Ergebnisse sind in 4C dargestellt.
  • Immunhistochemie. Gewebeproben wurden in 10 %igem neutral-gepufferten Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet, in Sektionen (ca. 5 μm) geschnitten, das Paraffin entfernt und die Proben für 15 min in 0,1 M Na-Citratpufter (pH 6,0) in der Mikrowelle erhitzt. Die Präparate wurden dann in 0,6 %igem Wasserstoffperoxid für 30 min inkubiert und danach in einer Mischung von normalem Ziegenserum (5 %) und Rinderserumalbumin (10 %) für eine Stunde gewaschen, um endogene Peroxidase-Aktivität bzw. unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Die immunologische Färbung wurde mit polyclonalem Kaninchen-Immunglobulin G gegen ein Maus-Cox-2-Peptid (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, Ml) in einer Verdünnung von 1:300 bis 1:600 über Nacht bei 4°C durchgeführt. Danach wurden die Schnitte mit biotinylierten sekundären Antikörpern in einer Verdünnung von 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA) behandelt, und schließlich wurden die Antikörperbindungsstellen mit Avidin-Biotin-Peroxidase-Komplex-Lösung (ABComplex, Vectastain, Vector Laboratories) und 3-Amino-9-ethylcarbazol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) sichtbar gemacht. Die Gegenfärbung wurde mit Mayer's Hemalaum (Merck, Darmstadt, Deutschland) durchgeführt.
  • Statistik. Statistisch signifikante Unterschiede wurden mit dem Wilcoxon Signed Rank Test ermittelt, ein Wert von P<0,05 wurde als statistisch signifikanter Wert gewählt. Alle Ergebnisse wurden als Mittelwert±SEM dargestellt.
  • ERGEBNISSE
  • Durch Northern Blot-Hybridisierung wurde nachgewiesen, dass Magenkarzinomgewebe signifikant mehr Cox-2-mRNA exprimieren als Proben von Antrum oder Corpus, die keine Krebszellen enthalten (1A). Cox-2-Transkripte wurden sowohl von intestinalen als auch von diffusen Adenokarzinomen exprimiert. Die Höhe der Cox-2-mRNA-Expression korrelierte nicht mit dem Anteil des Karzinomgewebes in den Proben. In 1B wird gezeigt, dass Magenkarzinomgewebe eine signifikant höhere Cox-2-mRNA-Expression aufweisen als Kontrollproben (P<0,05). In 1C wird dargestellt, dass die Menge der Cox-1-Transkripte in Karzinomgeweben im Vergleich zu entsprechenden Kontrollen nicht erhöht war.
  • Die Proben von drei Magenkarzinomen (Nummer 5, 9, 10) exprimierten geringe Mengen an Cox-2-mRNA, was durch Northern Blot-Analyse nachgewiesen wurde (1A). Um die Höhe der Cox-1- und Cox-2-Expression in diesen Proben weiter zu evaluieren, wurde eine semiquantitative RT-PCR durchgeführt, wobei die Probe Nummer 1 als Positivkontrolle verwendet wurde. In 2 wird gezeigt, dass das Verhältnis von Cox-2-mRNA zu Cox-1-mRNA in Karzinomproben höher war als in den gepaarten Antrum- und Corpusproben, die keine Krebszellen enthielten.
  • Durch immunhistochemische Färbung mit Cox-2-spezifischen polyclonalen Antikörpern wurde eine cytoplasmatische Färbung in den Krebszellen (schwarzer Pfeil), nicht aber im umgebenden Stroma (weisser Pfeil) nachgewiesen, was in 3A dargestellt ist. Bei der Verwendung von normalem Kaninchen-IgG als primärem Antikörper zeigten die Gewebeproben keine Färbung (3B). Wichtig ist, dass Proben von schweren Dysplasien des Magens von zwei unterschiedlichen Patienten eine positive Färbung mit Cox-2-Antikörpern zeigten, wie in 3C und 3D gezeigt. Während dysplastische Drüsen (schwarze Pfeile) eine positive Färbung auf Cox-2 zeigten, blieben normale Drüsen (weisse Pfeile) negativ. Normales Kaninchen-IgG zeigte keine positive Färbung (nicht gezeigt).
  • Literaturverzeichnis
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Claims (6)

  1. Verfahren zur Bestimmung der Bedeutung einer histologisch nachgewiesenen prämalignen Lesion als ein Risiko für Magenkrebs oder -karzinom in situ, umfassend das Nachweisen in vitro in einer Patientenprobe von (a) Cyclooxygenase-2 (Cox-2)-mRNA-Expression, oder (b) Cox-2-Protein; und gegebenenfalls weiteres Bestimmen des Verhältnisses der Cox-2-Expression zur Cox-1-Expression in der Probe, wobei Überexpression von Cox-2 ein erhöhtes Risiko für Magenkrebs indiziert.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die nachzuweisende Probe eine Biopsie oder ein Bürstenabstrich ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis der Cox-2-mRNA-Expression durchgeführt wird unter Verwendung von Northern Blot-, in situ-, RNase-Schutz- oder RT-PCR-basierenden Techniken oder einer Kombination derselben.
  4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des Cox-2-Proteins ausgeführt wird unter Verwendung von poly- oder monoclonalen Antikörpern mit Bindungsaffinität für Cox-2 oder Immunhistochemie.
  5. Verfahren nach Anspruch 3, wobei das Verfahren ausgeführt wird unter Verwendung eines Kits, umfassend RNA- oder PolyA+mRNA-Isolierungsreagentien, Cox-2-spezifische Primer für RT-PCR und cDNA-Fragmente, um entweder DNA- oder RNA-Sonden zu machen.
  6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei das Verfahren ausgeführt wird unter Verwendung eines Kits, umfassend Cox-2-spezifische polyclonale oder monoclonale Antikörper.
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