JP4790127B2 - Ｃｙｐ２４の複製およびその使用 - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願に対するクロス・リファレンス
（該当せず）
【０００２】
連邦援助研究開発のもとになされた発明に対する権利に関する声明
本発明は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）付与グラント番号ＣＡ５８２０７の政府支援により行われた。米国政府は、本発明にある権利を有することができる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、癌遺伝学および細胞遺伝学の分野に関する。特に、本発明は、ＣＹＰ２４遺伝子の増幅と癌との間の関連の同定に関する。
【０００４】
発明の背景
染色体異常は、遺伝的障害類、変性疾患類および癌にしばしば関連している。全染色体類のコピー類の欠失または増殖および染色体セグメント類または特定領域の欠失または増幅は、癌ではよく起こる（Ｓｍｉｔｈ（１９９１）Ｂｒｅｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．１８：Ｓｕｐｐｌ．１：５−１４；ｖａｎ ｄｅ Ｖｉｊｅｒ（１９９１）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．１０７２：３３−５０）。実際、ＤＮＡ配列類の増幅および欠失は、癌の原因であることができる。たとえば、プロトオンコジーン類および癌抑制遺伝子類はそれぞれ、腫瘍化の特徴であることが多い（Ｄｕｔｒｉｌｌａｕｘ（１９９０）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅｔ．Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔ．４９：２０３−２１７）。癌に関連する特定ゲノム領域類の同定とクローニングは、腫瘍化の研究および診断および予後のよりよい手段の開発の両者において極めて重要である。
【０００５】
比較ゲノムハイブリット形成（ＣＧＨ）を用いる研究では、ヒト乳癌のおよそ２０個の増幅ゲノム領域を明らかにした（Ｍｕｌｅｒｉｓ（１９９４）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １０：１６０−１７０；Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１；２１５６−２１６０；Ｉｓｏｌａ（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１４７；９０５−９１１）。これらの領域は、腫瘍の進行および治療に対する応答においてある役割を果たすかもしれない非常に作用性の高い遺伝子類をコードすると予測されている。これらの増幅領域類のうち３個は、確立されたオンコジーン類；１７ｑ１２のＥＲＢＢ２、８ｑ２４のＭＹＣおよび１１ｑ１３のＣＣＮＤ１およびＥＭＳ１と関連していた。乳癌においては、ＥＲＢＢ２およびＣＣＮＤ１／ＥＭＳ１増幅および過剰発現が、平均余命短縮と関連していた（Ｇａｕｄｒａｙ（１９９２）Ｍｕｔａｔ．Ｒｅｓ．２７６：３１７−３２８；Ｂｏｒｇ（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６：１３７−１４３）。ＭＹＣ増幅は、リンパ節関与、進行期癌および再燃率増加と関連していた（Ｂｏｒｇ（１９９２）Ｉｎｔｅｒｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ５１：６８７−６９１；Ｂｅｒｍｓ（１９９５）Ｇｅｎｅ１５９：１１−１８）。 乳癌または他の腫瘍細胞と関連している追加的な増幅ゲノム領域類の同定は、腫瘍化の研究および癌診断学の開発において極めて重大であることは明白である。
【０００６】
前記のＣＧＨ研究で見出された増幅領域類のひとつは、染色体２０、特に２０ｑ１３上にあった。その後、２０ｑ１３の増幅が種々の腫瘍タイプに出現することおよび攻撃的腫瘍挙動に関連していることが見出された。２０ｑ１３コピー数増加は、乳癌細胞株の４０％および原発性乳癌類の１８％において見出された（Ｋａｌｌｉｉｏｎｉｅｍｉ（１９９４）同上）。２０ｑ１３におけるコピー数増加は、また、卵巣（Ｉｗａｂｕｃｈｉ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６１７２−６１８０）、結腸（Ｓｃｈｌｅｇｅｌ（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：６００２−６００５）、頭頚部（Ｂｏｃｋｍｕｈｌ（１９９６）Ｌａｒｙｎｇｏｒ。７５：４０８−４１４）、脳（Ｍｏｈａｐａｔｒａ（１９９５）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ １３：８６−９３）、および膵臓（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９６）Ｇｅｎｅｓ Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ Ｃａｎｃｅｒ ２０：３９９−４０７）の癌類の２５％を超えるもので報告されてきた。
【０００７】
この２０ｑ１３領域は、蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を用いて、乳癌類および細胞株類において高分解能で分析された。２０ｑ１３内部の１．５メガベース（Ｍｂ）幅の増幅領域が同定された（Ｓｔｏｋｋｅ（１９９５）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ２６：１３４−１３７）；Ｔａｎｎｅｒ（１９９４）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ。５４：４２５７−４２６０）。乳癌のそれぞれ２９％および７％において、低レベル（＞１．５Ｘ）および高レベル（＞３Ｘ）２０ｑ１３配列増幅がインタフェースＦＩＳＨによって明らかになった（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１：１４５５−１４６１）。高レベル増幅は、攻撃的腫瘍表現型に関連していた（Ｔａｎｎｅｒ（１９９５）同上；Ｃｏｕｒｊａｌ（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ７４：１９８４）。ＦＩＳＨを用いて未培養乳癌腫類１４６個の染色体２０ｑの座１４個を分析したもうひとつの研究では、２０ｑ１３．２のＲＭＣ２０Ｃ００１領域（症例の９．６％において高度増幅）、ＰＴＰＮ１領域３Ｍｂ近位（６．２％）および２０ｑ１１のＡＩＢ３領域（６．２％）を含む３個の独立して増幅される領域類を識別した（Ｔａｎｎｅｒ（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５６：３４４１−３４４５）。２０ｑ１３内部の増幅領域類を明確に特性解析することは、これらの癌類の診断および予後において重要な段階であろうということは明らかである。
【０００８】
培養細胞中において染色体２０ｑのコピー数増加は、また、不死化およびゲノム不安定性を含む進行腫瘍類に特徴的な表現型に関連していた。たとえば、２０ｑ１１−ｑｔｅｒにおけるコピー数増加は、それぞれ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６Ｅ７またはＨＰＶ１６による形質転換後のヒト尿路上皮細胞（ウロエピセリアルセル）（ＨＵＣ（Ｒｅｚｎｉｋｏｆｆ（１９９４）ＧｅｎｅｓＤｅｖ．８：２２２７−２２４０）およびケラチン細胞類（Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９４：３８５４−３８５９）中でしばしば観察されている。さらに、２０ｑ１３．２におけるコピー数増加は、一部のＨＰＶ１６Ｅ７形質転換ＨＵＣ株類中におけるｐ５３非依存性ゲノム不安定性に関連していた（Ｓａｖｅｌｉｅｖａ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：５５１−５６０）。これらの研究は、２０ｑ上および特に２０ｑ１３．２における１個以上の遺伝子類の発現増加が乳癌および他の固形腫瘍類の出現に寄与していることを示唆している。いくつかの候補オンコジーン類は、ＡＩＢ１（Ａｎｚｉｃｋ（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７：９６５−９６８）、ＢＴＡＫ（Ｓｅｎ（１９９７）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ １４：２１９５−２００）、ＣＡＳ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．６：１８７−１９４）およびＴＦＡＰ２Ｃ（Ｗｉｌｌｌｉａｍｓｏｎ（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５：２６２−２６４）を含めて、２０ｑ上において増幅されるとして同定されている。腫瘍表現型に関連している２０ｑ１３中の核酸配列類を明確に同定することは、これらの癌類の診断と予後に重要な段階であろう。本発明はこれらおよび他の必要性を満たすものである。
【０００９】
発明の概要
本発明は、ＣＹＰ２４遺伝子の増幅またはＣＹＰ２４活性の増加が、癌（例乳癌）の存在、その進行またはそれにかかりやすい素質のマーカーであるという発見に関する。本発明は、この情報を用いて、動物における癌にかかりやすい素質、その進行またはその予後を検出／評価する方法類を提供する。したがって、ひとつの態様では、本発明は、動物における癌にかかりやすい素質を検出する方法類を提供する。この方法類では、前記動物由来の生物試料を提供すること、この生物試料内部におけるＣＹＰ２４のレベルを検出すること；および正常な無担癌組織から採取した対照試料中におけるＣＹＰ２４レベルとこのＣＹＰ２４レベルを比較することを含み、対照試料中のＣＹＰ２４レベルと比較した前記生物試料中のＣＰＹ２４増加レベルが前記動物中における癌の存在を示唆する。同様に、前記試料中のＣＹＰ２４レベル増加は、癌を有することが判明している動物／患者の予後不良、および／または生存余命短縮、および／または癌が現実に存在することを示唆する。
【００１０】
ひとつの態様では、ＣＹＰ２４レベルは、前記生物試料の細胞中におけるＣＹＰ２４遺伝子類のコピー数を定量することによって、検出する。特に好適な態様では、前記コピー数は、コンパラティブゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を用いて測定する。別の好適な態様では、前記コピー数は、核酸プローブ列に対するハイブリダイゼーションによって測定し、さらに特に好適な態様では、コンパラティブゲノムハイブリダイゼーションを列に対して行う。
【００１１】
もうひとつの態様では、ＣＹＰ２４レベルは、前記生物試料中におけるＣＹＰ２４ ｍＲＮＡレベルを（例 列になっている１個以上のプローブに対するハイブリット形成によって）測定することによって検出し、この場合、前記対照試料中におけるＣＹＰ２４ ＲＮＡと比較した前記試料中におけるＣＹＰ２４ ＲＮＡレベル増加は、癌にかかりやすい素質を示唆する。好適な態様では、ＣＹＰ２４レベルは、前記生物試料中および同一ビタミンＤレセプター活性にある対照試料中において測定するか、または前記ＣＹＰ２４レベル類を前記試料中および対照においてビタミンＤレセプター活性レベルに対して基準化する。
【００１２】
さらに別の態様では、ＣＹＰ２４レベルは、前記生物試料中におけるＣＹＰ２４タンパク質レベルを測定することによって検出し、この場合、前記対照試料中におけるＣＹＰ２４タンパク質と比較した試料中におけるＣＹＰ２４タンパク質レベル増加は、癌にかかりやすい素質を示唆する。好適な態様では、ＣＹＰ２４タンパク質のレベルは、生物試料中および同一ビタミンＤ活性にある対照試料中で測定するか、または、前記タンパク質レベル類を前記試料中および対照においてビタミンＤレセプター活性レベルに対して基準化する。
またさらに別の態様において、ＣＹＰ２４レベルは、生物試料中における２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４ヒドロキシラーゼ酵素活性レベルを測定することによって検出し、その場合、対照試料中における２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４ヒドロキシラーゼ酵素活性に比較した生物試料中における２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４ヒドロキシラーゼ酵素活性レベル増加は、癌にかかりやすい素質を示唆する。好適な方法類において、生物試料中および対照試料中において２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４ヒドロキシラーゼ活性レベルは、生物試料中および同一ビタミンＤ活性にある対照試料中で測定するか、または、前記活性レベル類を前記試料中および対照においてビタミンＤレセプター活性レベルに対して基準化する。
【００１３】
本文に記載の方法類において、前記動物（類）とは、哺乳類、さらに好適にはヒト、非ヒト霊長類、イヌ類、ネコ類、マウス類、ウシ類、ウマ類、ブタ類およびウサギ類からなる群から選択された哺乳類である。
好適な生物試料類は、摘出（例 組織生検）組織類、全血、血清、血漿、口内さっ過物、唾液、脳脊髄液、および尿からなる群から選択される。
好適な態様において、生物試料中におけるＣＹＰ２４の増加レベルと対照試料中におけるＣＹＰ２４のレベルの差は、統計的に有意差となっている（例 生物試料中におけるＣＹＰ２４の増加レベルは、対照試料中におけるＣＹＰ２４レベルに対して少なくとも約２倍大きく、さらに好適には少なくとも４倍大きい）。
【００１４】
本発明は、また、動物における癌を治療する方法類を提供する。前記方法類は、本文に記載のようなアッセイ類を実施すること（例 前記動物由来の生物試料を提供すること；この生物試料内部におけるＣＹＰ２４のレベルを検出すること；および正常な無担癌組織から採取した対照試料中におけるＣＹＰ２４レベルとこのＣＹＰ２４レベルを比較すること）および前記対照試料中のＣＹＰ２４レベルと比較してＣＰＹ２４レベル増加を有する動物において癌治療を選択して実施することを含む。好適な態様において、前記癌療法は、化学療法、放射線療法、外科手術、抗ホルモン療法、および免疫療法からなる群から選択される。一部の好適な態様において、前記癌療法は、アジュバント癌治療である。
【００１５】
本発明は、また、ＣＹＰ２４−発現細胞の増殖を阻害する能力を試験する物質をスクリーニングする方法類を提供する。本方法類では、前記試験物質にＣＹＰ２４−発現細胞を接触させること、およびＣＹＰ２４活性レベルを検出することを含むが、前記物質に接触させなかった細胞中におけるＣＹＰ２４活性レベルと比較してのＣＹＰ２４活性レベル低下は、前記物質が前記細胞の増殖を阻害することを示唆している。好適な態様において、前記細胞はビタミンＤに接触させる。ＣＹＰ２４レベルの検出は、本文で記載のようにして実施できる。一部の態様において、前記ＣＹＰ２４−発現細胞は、癌細胞である。一部の態様において、前記ＣＹＰ２４−発現細胞は、過増殖性細胞である。特に好適な態様において、前記ＣＹＰ２４活性低下レベルと前記物質に接触させなかった細胞中におけるＣＹＰ２４アッセイレベルの差は、統計的に有意差となっている（例 前記試験物質に接触させた細胞中において、少なくとも約２倍低く、さらに好適には少なくとも４倍低い）。
【００１６】
本発明は、さらに、ＣＹＰ２４レベル増加細胞の増殖を低下させる方法類を提供する。前記方法類は、ＣＹＰ２４阻害剤を用いて前記細胞中におけるＣＹＰ２４活性レベルを低下させることを含む。前記方法類は、さらに、前記細胞をビタミンＤに接触させることを含むことができる。前記細胞は癌細胞（例 乳癌細胞、前立腺癌細胞、結腸直腸癌細胞、白血病細胞、リンパ腫、肺癌細胞、脳癌細胞、膵臓癌細胞、結腸癌細胞、および卵巣癌細胞）であることができる。前記細胞は、過増殖性細胞であることができる。前記細胞は、また、転移細胞であることができる。好適な阻害剤類として、アンチセンスオリゴヌクレオチド類、リボザイム類、ＣＹＰ２４遺伝子発現レプレッサー類、２５−ハイドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ活性の競合的阻害剤類、および２５−ハイドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ活性の非競合的阻害剤類が挙げられる。
【００１７】
定義
本発明をよりよく理解できるように、いくつかの用語を下記で定義した。
“ＣＹＰ２４遺伝子”とは、２５−ハイドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ６０６６９ Ｓ７８７７５およびＸ５９５０６を参照）をコードするＤＮＡ配列である。用語遺伝子は、遺伝子の変異コピーまたは遺伝子断片を意味することができる。
【００１８】
用語“ＶＤＲ”は、ビタミンＤレセプターを意味する。
【００１９】
用語“対して特にハイブリッドを形成する”および“特異的ハイブリダイゼーション”および“対して選択的にハイブリダイズする”とは、本文では、緊縮条件下で特定のヌクレオチド配列に対して優先的にある核酸分子が結合、二重鎖形成、またはハイブリダイゼーションすることを意味する。用語“緊縮条件”とは、あるプローブが優先的にその標的配列に対してハイブリダイズすること、それよりは低度に他の配列類に対してハイブリダイズするかまたは全くハイブリダイズしないであろう条件を意味する。核酸ハイブリダイゼーション（例 列状になっている場合、サザンまたはノーザンハイブリダイゼーション）の範疇における“緊縮ハイブリダイゼーション”および“緊縮ハイブリダイゼーション洗浄条件”は、配列依存性であり、異なる環境パラメータ下では異なってくる。核酸類のハイブリダイゼーションに関する詳しい参考については、たとえば、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３） Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅ Ａｓｓａｙｓ、第１部、第２章、“ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ（ハイブリダイゼーションの原則と核酸プローブアッセイ手法の概説）”、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、Ｎ．Ｙ．（“Ｔｉｊｓｓｅｎ”）でわかる。一般的に、高緊縮ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定配列の熱融解点（Ｔｍ）より低い約５℃であるように選択される。このＴｍは、標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブにハイブリダイズする温度（規定のイオン強度およびｐＨにおいて）である。非常に緊縮な条件は、特定プローブについてのＴｍと等しくなるように選択される。列上またはサザンまたはノーザンブロットにおけるフィルター上で１００個を超える相補性残基を有する相補性核酸類のハイブリダイゼーションのための極めて緊縮なハイブリダイゼーション条件の例としては、標準的ハイブリダイゼーション溶液を用いてハイブリダイゼーションを一晩実施する時、４２℃である（例 Ｓａｍｂｒｏｏｋ（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ （第２版）、第１−３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、 ＮＹ、および下記の詳細な記載を参照）。高緊縮洗浄条件の１例としては、６５度で１５分について０．２×ＳＳＣ洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の説明については、例 同上のＳａｍｂｒｏｏｋ参照）。列ハイブリダイゼーションの典型的な緊縮洗浄は、５０％ホルムアミド、２×ＳＳＣで５０℃または５０℃までである。しばしば、高緊縮洗浄の前に、低緊縮洗浄を行ってバックグランドプローブシグナルを除去する。たとえば１００個を超えるヌクレオチド類の二重鎖についての中等度緊縮洗浄の例は、４５℃で１５分で１×ＳＳＣである。たとえば１００個を超えるヌクレオチド類の二重鎖についての低緊縮洗浄の例は、４０℃で１５分で４×乃至６×ＳＳＣでである。
【００２０】
用語“検出可能な組成物による標識”とは、本文では、検出可能な組成物、すなわちラベルに結合した核酸を意味するものとして使用する。前記検出は、たとえば、分光学的、光化学的、生物化学的、免疫化学的、物理または化学的手段によって実施できる。たとえば、有用なラベル類としては、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^３Ｈ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^１３１Ｉ、蛍光色素類（例 ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド燐光類、レキサスレッド）、電子稠密試薬類（例 金）、たとえばＥＬＩＳＡなどで一般的に使用されているような酵素類（例 西洋わさびパーオキシダーゼ、ベータガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、発色性ラベル類（例 金コロイド）、磁気ラベル類（例 Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）、ビオチン、ジオキシゲニン、または抗血清またはモノクローナル抗体類が利用可能なハプテン類およびタンパク質類などが含まれる。前記ラベルは、検出すべき核酸、ペプチドまたは他の標的化合物に直接取り込ませることができ、または、それは、前記標的にハイブリダイズするかまたは結合するプローブまたは抗体に結合させることができる。ペプチドは、二次的レポーター（例 ロイシンジッパーペア配列類、二次抗体類のための結合部位類、転写活性化剤ポリペプチド、金属結合ドメイン類、エピトープタグ類）によって認識される既定のポリペプチドエピトープを取り込むことによって検出可能とすることができる。ラベルは、種々の長さのスペーサーアームによって結合させ、潜在的立体妨害を低下させるかまたは他の有用なあるいは所望の性質に対する影響を低下させることができる（たとえば、Ｍａｎｓｆｉｅｌｄ（１９９５）Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ ９：１４５−１５６参照）。ラベルの組み合わせも同様に使用できることがわかるであろう。したがって、ある態様では、たとえば、異なる核酸類を識別可能な（たとえば、違うように着色される）ラベルによって標識することもできる。
用語“核酸”とは、本文では、一重鎖または二重鎖形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを意味するものとして使用する。この用語は、核酸類、すなわち、天然ヌクレオチド類の公知のアナログ類で所望の目的のために参考核酸と同等のまたは改良された結合特性を有するアナログ類を含むオリゴヌクレオチド類を含む。前記用語は、また、天然のヌクレオチド類に類似または所望の目的のためにそれを凌ぐように改善された速度で代謝される核酸類を含む。前記用語は、また、合成骨格を有する核酸様構造類を含む。本発明によって提供されるＤＮＡ骨格アナログ類は、ホスホジエステル、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、メチルホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルホスホトリエステル、スルファメート、３’−チオアセタール、メチレン（メチルイミノ）、３‘−Ｎ−カルバメート、モルホリノカルバメート、およびペプチド核酸類（ＰＮＡｓ）が含まれる；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｕｅｓ、ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｆ。Ｅｃｈｓｔｅｉｎ編著、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ、Ａｎｎａｌｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第６００巻、ＢａｓｅｒｇａおよびＤｅｎｈａｒｄｔ編著（ＮＹＡＳ１９９２）；Ｍｉｌｌｉｇａｎ（１９９３）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１９２３−１９３７；Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（１９９３、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ）を参照。ＰＮＡｓは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位のような非イオン性の骨格類を含んでいる。ホスホロチオアート結合については、ＷＯ ９７／０３２１１；ＷＯ ９７／３９１５４；Ｍａｔａ（１９９７）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４４：１８９−１９７に記載されている。本用語によって包含される他の合成骨格には、メチルホスホネート結合類またはメチルホスホネートとホスホジエステルが交互に結合しているもの（Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３６：８６９２−８６９８）、およびベンチルホスホネート結合類（Ｓａｍｓｔａｇ（１９９６）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ ６：１５３−１５６）が挙げられる。用語核酸は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オイゴヌクレオチドプライマー、プローブまたは増幅産物と相互に交換可能なものとして使用している。
【００２１】
用語“核酸アレー（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｒｒａｙ）”とは、本文で、各標的要素が１個以上の固体表面に固定化された１個以上の核酸分子類（プローブ類）を含む複数の標的要素類であるとして使用されており、試料核酸類は、これに対してハイブリット形成できる。標的要素の核酸類は、例えばＣＹＰ２４由来である特定遺伝子類またはクローン類由来の配列（類）を含有できる。他の標的要素類は、たとえば、参考配列類を含有するであろう。種々の大きさの標的要素類を、本発明のアレーで使用することができる。一般的に、小さい標的要素類が好まれる。典型的には、標的要素は、直径が約２ｃｍ未満であろう。通常、要素の大きさは、１マイクロメータから約３ｍｍであり、好適には、約５マイクロメータと約１ｍｍの間である。前記アレーの標的要素類は、異なる密度で前記固体表面に配置できる。前記標的要素密度は、ラベルの性質、固体支持体等のようないくつかの要因に依存するであろう。当業者は、各標的要素は、異なる長さの配列を有する核酸類混合物を含むことができることを理解するであろう。したがって、標的要素は、クローン化されたＤＮＡ片の１個を超えるコピーを含有でき、各コピーは、異なる長さの断片類に分けることができる。標的要素に固定された核酸の長さおよび複雑さは、本発明にとって重要ではない。当業者は、これらの要因を調節して、あるハイブリダイゼーション操作のために最適なハイブリダイゼーションおよびシグナル産生を得ることができ、さらに、異なる遺伝子類またはゲノム位置間において必要な分解を得ることできる。さまざまな態様において、標的要素配列は、約１ｋｂから約１Ｍｂの間、約１０ｋｂから約５００ｋｂの間、約２００から約５００ｋｂの間、および約５０ｋｂから約１５０ｋｂの間の複雑性を有するであろう。
【００２２】
用語“プローブ”または“核酸プローブ”とは、本文で、試料へのそのハイブリダイゼーションが検出可能である１個以上の核酸断片類の集まりを意味するものとして使用している。前記プローブは標識しないこともできるし、または、標的または試料へのその結合が検出できるように下記で説明するように標識することもできる。特に列の場合には、プローブまたは標的核酸類のいずれかを列に対して固定することができる。前記列が“プローブ”または“標的”核酸類を含むかどうかは、その内容から明白であろう。同様に、この内容に応じて、前記プローブ、標的またはその両者のいずれかを標識できる。前記プローブは、たとえば、１個以上のクローン類、単離された全染色体または染色体断片、またはポリメラーゼチェーンリアクション（ＰＣＲ）増幅産物類の集合体のようなゲノムの１個以上の特定（事前に選択された）部分類由来の核酸源から産生される。本発明のプローブ類は、本文に記載の領域中で見出された核酸類から産生される。前記プローブまたはゲノム核酸試料は、たとえば、反復性核酸類のブロックまたは除去または独特の核酸類を多くすることによって、ある方法で処理することができる。前記用語“試料”とは、本文では、検出された核酸類ばかりでなく、ブロック核酸類等との標識に適用される形状となっている検出可能な核酸類を意味するものとして使用できる。ブロック核酸は、また、別個の言い方もできる。“プローブ”が特に意味するところは、用語を使用した内容から明らかである。前記プローブは、また、固体表面（例 ニトロセルロース、ガラス、石英、溶融シリカスライド）上に列状に固定化された核酸類である。いくつかの態様では、前記プローブは、たとえば、ＷＯ９６／１７９５８中で述べられているように核酸類の列の一員であることもできる。高密度列を作製可能な技術は、また、この目的のためにも使用することができる（たとえば、Ｆｏｄｏｒ（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ ７６７−７７３；Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｕｍｍｅｒ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２３：１０８７−１０９２；Ｋｅｍ（１９９７）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ２３：１２０−１２４；米国特許第５、１４３、８５４参照）。当業者は、本文に記載した特定プローブ類の正確な配列をある程度改変して、開示されたプローブ類と“実質的に同一で”あるがそれでもなおそれらが由来したプローブと同一標的類または試料類に対して特異的に結合（すなわち、対して特異的にハイブリダイズ）できる能力を保持しているプローブ類を産生できることがわかるであろう（上記の検討を参照）。このような改変は、本文に記載のこのプローブについての引用によって具体的に記載網羅されている。
【００２３】
本文では、用語“ヒト核酸試料”は、ハイブリダイゼーションまたは増幅による検出に適した形状のヒトＤＮＡまたはＲＮＡを含む試料を意味するものとして使用する。この核酸は、単離、クローニング、または増幅できる；それは、たとえば、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、または特定染色体由来のｃＤＮＡ、または本文に開示した特定のアンプリコン類または欠失物類内部の選択された配列類（例特定プロモータ類、遺伝子類、増幅または制限断片類、ｃＤＮＡ等）であることができる。前記核酸試料は、特定の細胞類または組織類から抽出することができる。核酸試料を調製した細胞または組織試料は、通常、アンプリコン増幅または欠失または転座に関連して検出された癌を有している疑いがある患者から採取される。細胞および組織試料類の方法類は当業者に周知であり、吸引、組織切片類、針生検等が挙げられるがこれらに限定されない。前記試料は、しばしば、患者由来の試料である“臨床試料”であり、組織学的目的のために採取した凍結切片類またはパラフィン切片類のような組織切片類を含む。前記試料は、また、細胞培養物由来の（細胞の）上清または細胞それ自体、および染色体異常を検出するかまたはアンプリコンコピー数を求めることが望ましい組織培養および他の媒体由来の細胞であることができる。ある場合では、前記核酸類を、ハイブリダイゼーション前にＰＣＲのような標準的手法を用いて増幅させることもできる。前記試料は、固体に固定化された単離核酸類であることもできる。１態様では、前記試料は、それぞれの核酸類が実質的に未改変のまま保持されかつ典型的には標準的手法に従って調製されたインタフェース核を含むように、調製することができる。
【００２４】
用語“癌検出”とは、動物中における癌の存在または不在を確認することを意味している。“癌検出”とは、また、動物中における癌性細胞の存在の可能性に関してまたは癌発症の可能性またはそれに対してのかかりやすさに関して間接的証拠を得ることを意味することもできる。癌検出は、本発明の方法類を単独でまたは他の方法類と組み合わせて、または動物健康状態に関する他の情報と照らし合わせて、達成することができる。
【００２５】
動物における“癌”とは、コントロール不可の増殖、不死化、転移能、急激成長および増殖速度およびある形態学的特長のような癌の原因となる細胞類に特異的な特徴性質を有する細胞類の存在を意味している。癌細胞は、腫瘍の形状であることも頻繁であろうが、上記細胞は、動物内部において単独で存在することもでき、または白血病細胞のように非腫瘍化癌細胞であることもできる。癌には、乳癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸部癌、メラノーマ、子宮または子宮内膜癌、口腔腔または咽頭癌、肝癌、腎臓癌、精巣癌、胆管癌、小腸または盲腸癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨髄腫および軟骨肉腫などが挙げられる。
【００２６】
「動物」とは、多細胞、神経系の所有、自発的運動、内部消化、などで特徴づけられる動物界のものを表わす。「動物」はヒトまたはその他の哺乳動物であることができる。好ましい動物は、ヒト、非ヒト霊長類、およびその他の哺乳動物である。すなわち、本発明の方法は、ヒトに対する医療的応用と同じく獣医学的応用をも意図していることが認識されるであろう。
【００２７】
「生物学的サンプルの提供」とは、本発明に記載された方法における使用のための生物学的サンプルを得ることを意味する。これは最も多くは動物から細胞のサンプルを除去することで行なわれるであろうが、また既に単離した細胞（たとえば他の人によって単離された）ものを用いたり或いは本発明の方法をインビボで行なうことによっても達成することができる。
【００２８】
「生物学的サンプル」とは、細胞もしくは細胞集団、または動物からの大量の組織もしくは体液を意味する。最もしばしば、サンプルは動物から取出されてきたが、しかし「生物学的サンプル」という用語はインビボ、すなわち動物から取出さずに分析された細胞や組織をも意味する。「生物学的サンプル」とはしばしば動物からの細胞を含むであろうが、しかしこの用語はまた、ＣＹＰ２４レベルを測定するために使用できる血液、唾液または尿の非細胞画分のような非細胞的な生物学的材料をも意味する。好ましい生物学的サンプルは、組織バイオプシー、切屑（たとえば頬面切屑または頬側擦過物）、全血、プラズマ、血清、尿、唾液、細胞培養物、または脳脊髄体液を含む。
【００２９】
「ＣＹＰ２４のレベルの検出」とは、ＣＹＰ２４遺伝子の数、または２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする遺伝子の発現レベルの測定を意味する。遺伝子のコピー数は、当業者に公知の種々の方法、たとえばこれらに限定されるものではないが、比較ゲノムハイブリッド化（ＣＧＨ）や定量的ＤＮＡ増幅（たとえば定量的ＰＣＲ）によって測定することができる。遺伝子発現は、それらの何れもが標準的技術を用いて測定可能であるところのｍＲＮＡレベル、タンパクレベルまたはタンパク活性の検出を含めた種々の方法でモニターすることができる。検出はＣＹＰ２４（たとえばゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパクもしくは酵素活性）のレベルの定量を含むことができ、または特に対照レベルと比較してのＣＹＰ２４のレベルの定性的評価であってもよい。検出されるレベルのタイプは明細書から明瞭であろう。ＣＹＰ２４はＶＤＲ活性としっかりリンクしているので、遺伝子発現の測定は好ましくは、ＶＤＲ活性の測定と組み合わせて行なわれる。
【００３０】
ＣＹＰ２４のレベルの「比較」とは、２つのサンプルにおけるＣＹＰ２４レベルを検出し、そしてそのレベルが同等であるかまたは一方が他方よりも大きいかどうかを決定することを意味する。この比較は、２つの値の間の統計的比較を可能とするような定量的レベル間において、またはたとえばヒトによる目視での評価のような定性的検出方法のように定量性の欠如のもとに行なうことができる。
【００３１】
「対照サンプル」とは、健康でありガンに罹患していない動物及び／又は細胞や組織で代表される生物学的材料のサンプルを意味する。対照サンプルにおけるＣＹＰ２４のレベルは、特定の組織における、または特定の時点（たとえ治療方式の前、途中、もしくは後）における正常で無ガンの動物の一般的集団もしくは特定の個体において望ましくは典型的なものである。このサンプルは、特に本発明に記載の方法で用いられる動物から取出すことができるし、また体内のどこかにガンのある動物から取り出した無ガンの生物学的材料を含むところの正常で無ガンの動物で代表される如何なる生物学的材料であってもよい、対照サンプルもまた、正常で無ガンの動物からの測定に基いてこれまでに確定されたところの無ガン集団で代表される確定されたＣＹＰ２４レベルをも意味することができる。
【００３２】
「増大したレベルのＣＹＰ２４」とは、ＣＹＰ２４の対照レベルと比較して明らかに高いレベルのＣＹＰ２４を意味する。比較のための方法は、ＣＹＰ２４の定量値を用いて統計的に行なうことができ、またはたとえばヒトによる目視評価のような非統計的手段を使って比較することもできる。
【００３３】
「ＣＹＰ２４遺伝子のコピー数」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素をコードする細胞中のＤＮＡ配列の数を意味する。遺伝子に関して、一般に動物は各々の遺伝子の２つのコピーをもっている。しかしながらコピーの数は、遺伝子増幅や複製によって増大させたりまたは欠失によって減少させたりすることができる。
【００３４】
ｍＲＮＡ、タンパク、酵素活性またはコピー数のレベルが「測定」されたとき、それは定性的または定量的方法を用いて評価される。そのレベルは好ましくは、生物学的サンプルから得た値と対照の値の統計的な比較が可能な定量的手段を用いて決定される。このレベルはまた、たとえば可視分析や蛍光顕微鏡その他の光学的検出器（たとえば画像分析計など）を用いて検出した蛍光的にラベルしたサンプルのような複数の可視ラベル化サンプルのヒトによる比較、といったような定性的方法を用いて決定することもできる。ＣＹＰ２４ｍＲＮＡ、タンパクまたは酵素活性のレベルが測定するとき、好ましくはその測定は、ＶＤＲ活性の測定及び／又は正常な組織または細胞（たとえば同一動物からか、もしくは異なった「対照」動物からの）におけるＣＹＰ２４活性の測定を含む。
【００３５】
「２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３、１α−２５−ヒドロキシビタミンＤ３またはその他の類縁の基質の２４−ヒドロキシル化の触媒を意味する（たとえば次を参照。Ｓｔｒｙｅｒ（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．；Ｊｅｈａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１３９５：２５９−２６５；Ｓｅｏ ａｎｄ Ｎｏｒｍａｎ（１９９７）Ｊ．Ｂｏｎｃ Ｍｉｎｅｒ．Ｒｅｓ．１２：５９８−６０６）。
【００３６】
「組織バイオプシー」とは、診断的分析のための生物学的サンプルの除去を意味する。ガンに罹患している患者においては、腫瘍の中の細胞を分析するために腫瘍から組織を除去してもよい。
【００３７】
ＣＹＰ２４の定量されたレベルがＣＹＰ２４の正常レベルの信頼区間の外側にあるときは、その２つのレベル間の差は「統計的に有意である」といわれる。もし検査値がＣＹＰ２４の正常レベルの信頼区間の外側にあるときは、その検査値は正に異常であり平均値からの正常な偏移を表わすものではない、という確率を予測することができる。本発明の方法において、テストサンプルが異常である確率が０．１５、０．１、０．０５および０．０１を含めた多くの値の何れかでアレー（ａｒｒａｙ）ば、テストサンプルと対照の間の差は「統計的に有意である」と定義することができる。たとえばＦｒｅｕｄｅ，Ｊ．Ｅ．：（１９８８）Ｍｏｄｅｒｎ Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌのような多くの資料が、統計的有為差の評価方法を教示している。
【００３８】
動物の「延命予測（余命）」とは、疾患または病状の結果の予後予想を意味する。「延命予測」は、疾患、病状、またはそれらの症状の重篤度、持続または進行に関する予測を意味することができる。「延命予測」はまた、動物の延命が期待される時間の長さ、または一定時間までの動物の延命の確率をも意味することができる。
【００３９】
「ガンの治療方法」とは、動物におけるガン細胞数を減少または消滅するように考えられた手段や処置方法を意味するか、またはガンの症状を治癒させることを意味する。「ガンの治療方法」は、ガン細胞が現実に消滅したり、細胞数が現実に減少したり、またはガンの症状が現実に治癒したりすることを必須的に意味するものではない。ガンの治療方法は、成功の可能性が低くてもしばしば行なわれるが、もし動物の病歴や予想延命予測（余命）がわかっておれば、それは全体として有益な処置方法とみなされる。
【００４０】
「ＣＹＰ２４活性のレベルの減少」とは、細胞における２５−ヒドロキシビタミンＤ３２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性の阻害、またはＣＹＰ２４遺伝子のコピー数の減少、または細胞でのＣＹＰ２４ｍＲＮＡもしくはタンパクの減少（たとえば与えられたＶＤＲ活性レベルにおける）を意味する。好ましくは、ＣＹＰ２４活性のレベルは正常で無ガンの細胞に典型的なレベルにまで減少されるが、そのレベルは、正常細胞に典型的なものより以下のレベルを含め細胞の増殖を減少させるに充分な如何なるレベルにまでも減少させることができるであろう。
【００４１】
細胞をビタミンＤと「接触」させることは、細胞がビタミンＤの存在下にあることを確かにするものである。通常はビタミンＤと接触しない細胞の場合には、ビタミンＤはインビボまたはインビトロで細胞に添加される。「ビタミンＤ」とは、ビタミンＤ_１、ビタミンＤ_２およびビタミンＤ_３を含み但しそれらには限定されないビタミンＤ分子の一群の如何なるものをも意味する。それはまた、たとえばビタミンＤの代謝産物と同じくＣＹＰ２４酵素の基質である分子の構造的および機能的同族体をも意味する。
【００４２】
「腫瘍細胞」とは、腫瘍から単離された腫瘍の一部分であるか、または腫瘍形成可能なガン細胞である。腫瘍細胞はインビボまたはインビトロで存在することができる。
【００４３】
「過増殖細胞」とは、異常に高い増殖速度をもつ細胞、または異常に大きな程度すなわち時間につれて数が増大する細胞集団となるまで増殖する細胞である。「過増殖細胞」はインビボまたはインビトロで存在することができる。
【００４４】
「ＣＹＰ２４活性の阻害剤」とは、上で定義したようなＣＹＰ２４活性を減少させるように作用する分子である。そのような阻害剤は、アンチセンス分子もしくはリボザイム、ＣＹＰ２４遺伝子転写のリプレッサー、または２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素の競合的もしくは非競合的分子阻害剤を包含することができる。
【００４５】
「ＣＹＰ２４転写のリプレッサー」というフレーズは、ＣＹＰ２４遺伝子からのＣＹＰ２４ｍＲＮＡの生産を阻害することができる分子を意味する。好ましくはこの部分は、ＣＹＰ２４遺伝子の調節要素と直接または間接に結合し、それによりＣＹＰ２４遺伝子の転写を防ぐものである。
【００４６】
「２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼの競合的阻害剤」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素とまたはその基質と直接または間接に結合することができ、それによって該酵素の基質への結合を防ぎそしてインビトロまたはインビボで基質の２４−ヒドロキシル化を防ぐような分子を意味する。
【００４７】
「２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼの非競合的阻害剤」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素基質の２４−ヒドロキシル化は阻害するが、酵素と基質との結合は阻害しない分子を意味する。
【００４８】
細胞増殖のまたはＣＹＰ２４活性の阻害剤の「スクリーニング」とは、細胞増殖またはＣＹＰ２４活性を阻害するための分子集団の活性を系統的に試験することを意味する。スクリーニングは、インビトロまたはインビボで行なうことができる。スクリーニングされる分子の阻害活牲は、たとえば標準的な試験方法を用いてのＣＹＰ２４酵素活性を調べるように直接的に評価するか、またはたとえば細胞増殖のようなＣＹＰ２４酵素活性の細胞的結果をモニターすることによって間接的に評価することができる。
【００４９】
「ＣＹＰ２４−発現細胞」とは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼタンパクをいくらかでも生産する細胞である。一般的に、その細胞で生産される酵素の量は、標準的な技術を用いて検出可能であろう。
【００５０】
「供試物質」とはスクリーニングでテストされる如何なる分子または非分子体をも意味する。該分子はスクリーニングに含まれるように無作為に選択されるか、または該分子がスクリーニングで陽性の結果を与えるであろうとの経験的な予測によって含まれることができる。この分子は、スクリーニングの目的のために生化学的アッセイまたは細胞の中へ直接導入してもよく、あるいはスクリーニングで望ましくテストされるＲＮＡまたはポリペプチドをコードする核酸から成っていてもよい。アッセイ系の中へ直接導入された分子は、ペプチド、核酸、含水炭素、脂質、またはそれ以外如何なる有機もしくは無機の分子をも含む如何なる公知の化学的または生化学的分子を包含することができる。「供試物質」はまた、たとえば電磁気的放射や加熱のような非分子体をも意味する。
【００５１】
細胞の「増殖」とは、細胞もしくは細胞集団が生長し分裂する速度、または細胞もしくは細胞集団が生長し、分裂しまたは数が増加する程度を意味する。細胞の「増殖」はまた、細胞の生長および分裂速度ならびに細胞死の速度を含めた複数の因子を反映することができる。
【００５２】
「細胞の増殖の減少」というフレーズは、細胞または細胞集団の生長または分裂の速度または程度の減少を意味する。そのような方法は細胞分裂もしくは細胞生長の防止を含むことができ、細胞死をも含んでもよく、そしてインビボまたはインビトロで実施することができる。
【００５３】
「ＣＹＰ−２４阻害活性」とは、細胞における２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性の産生及び／又は蓄積を減少または阻害する分子の能力である。該分子は、たとえば転写の阻害、ｍＲＮＡレベルの減少、翻訳の阻害、または酵素自体の阻害のようなＣＹＰ２４遺伝子から酵素活性までの経路の如何なる工程における蓄積をも防ぐことができる。この減少や阻害は好ましくは、ＶＤＲ活性の同一のレベルでの制御への参照によって確認される。
【００５４】
ＣＹＰ２４酵素またはＣＹＰ２４ポリペプチドは、２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ活性をもつタンパクであり、最も好ましくはＣＹＰ２４遺伝子によってコードされる。
【００５５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク」という用語はここでは、アミノ酸残基の重合体を表わすものとして相互交換可能的に用いられている。これらの用語は、天然に存在するアミノ酸重合体と同様に、１つまたはそれより多いアミノ酸残基が対応する天然存在アミノ酸の人工的な化学的類似体であるようなアミノ酸重合体に適用される。
【００５６】
ここでたとえば「アルギニン」とか「アルギニン残基」というような名称で特定されるアミノ酸は、天然の、人工的の、または改変されたアミノ酸を意味する。すなわち、たとえばアルギニンとは、ポリペプチド中に取り込まれる能力により天然のアルギニンと同一もしくは類似の機能を有し、そのポリペプチド中に取り込まれる能力により天然のアルギニンと同一もしくは類似の機能を有し、そのポリペプチドのフォールディングを行ない、そしてそのポリペプチドとその他のポリペプチドとの相互作用を行なうようなアルギニン類似体をも包含するものである。
詳細な説明
本発明は、ビタミンＤ２４ヒドロキシラーゼ（ＣＹＰ２４）遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６０６６９ Ｓ７８７７５およびＸ５９５０６）の増幅が各種の癌（たとえば乳癌）で発生するという発見に関する。ビタミンＤ ２４ヒドロキシラーゼは、ビタミンＤ３の活性形の分解を開始することによって、細胞内のビタミンＤ系の活性を制御する。特定の理論に縛られずに、腫瘍発生時のＣＹＰ２４の増幅によって、ビタミンＤが仲介する増殖制御を中断させる手段を提供することが考えられている。
【００５７】
ヒト乳癌の染色体バンド２０ｑ１３．２の増幅は、予後不良と腫瘍の攻撃的挙動に関連しており（Ｔａｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １：１４５５−１４６１；Ｃｏｕｒｊａｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７４：１９８４−１９８９）、この領域への遺伝子マッピングの過剰発現は、乳癌の発達が原因であることが示唆される。比較ゲノムハイブリダイゼーションの新しい高分解能形である、配列ＣＧＨ（Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０：２０７−２１１）を用いて、我々はＤＮＡ複製数プロファイルを、２０ｑ１３．２における再帰性増幅の領域にマップした。
【００５８】
この分析は、遺伝子ＣＹＰ２４に注目している。なぜならＣＹＰは、最も情報を与える腫瘍において、最も高度に増幅される狭いゲノム間隔にマップされ、ＣＹＰ２４の機能について知識があるためである。ＣＹＰ２４は、ビタミンＤ３の活性形、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３の分解を触媒する酵素である、ビタミンＤ ２４ ヒドロキシラーゼをコード化する（総説については、Ｗａｌｔｅｒｓ（１９９２）Ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ １３：７１９−７６４；Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｍｅｒ．Ｐｈｙｓｉｃａｌ．Ｓｏｃ．７８：１１９３−１２３１）。ビタミンＤは、カルシウムと骨の代謝の調節に主要な役割を果たすセコステロイドホルモンである。しかし、ビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）も、乳房を含む（Ｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：６７９３−６７９９；Ｂｕｒａｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９４）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ３１：１９１−２０２）、無機質代謝に関与しない他の多くのいわゆる「古典的でない」組織で発見されており、これらの組織におけるビタミンＤの役割も示されている。
【００５９】
１，２５−ジヒドロキシＤ３およびリガンド結合受容体のレベルは、フィードバック機構によって細胞内で非常に厳しく制御されているように思われる。ホルモンをＶＤＲに結合させると、ＣＹＰ２４転写の活性化が生じて、１，２５−ジヒドロキシＤ３の分解と、１，２５−ジヒドロキシＤ３の合成に必要な酵素であるＣＹＰ１の阻害が開始される。実際に、ＣＹＰ２４の転写はＶＤＲレベルおよび活性に非常に密接に関連しているため、ＣＹＰ２４プロモーターリポータ作成物からの転写の活性化は、ＶＤＲ活性のアッセイとして使用される（Ａｒｂｏｕｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：１４８−１５４）。したがって、この理論に束縛されずに、我々は、細胞内のＣＹＰ２４の役割がビタミンＤ系の生物活性を制限することであると考えている。
【００６０】
乳房などの「古典的でない」組織において、ビタミンＤは、細胞を分化と増殖休止の方向へ向かわせることによって、増殖阻害を促進する。乳癌細胞は、生体内と生体外の両方で、ビタミンＤの抗増殖効果に応答する（Ｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：２１−２５）。乳癌細胞系は一般に、ビタミンＤに応答して、細胞サイクルのＧ０／Ｇ１ステージで捉えられ、ＭＣＦ−７乳癌細胞系は、アポトーシスを行うよう誘導させることができる（Ｅｌｓｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９５）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５：２８２２−２８３０；Ｌｏｖｅ−Ｓｃｈｉｍｅｎｔｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ５６：２７８９−２７９４；Ｓｉｒｎｂｏｌｉ−Ｃａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ，４２：３１−４１）。げっ歯類へのビタミンＤの投与は、腫瘍キセノグラフの進行を低下させる（Ｅｉｓｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９） Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７：２１−２５；Ｃｏｌｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｃａｎｃｅｒ，１８８−１９１）。
【００６１】
ビタミンＤのこのような成長調節特性は、ビタミンＤ系の崩壊が異常増殖の原因になりやすいという、現行の意見を支持する。この示唆は、受容体陰性腫瘍の患者が予後不良であるという観察と、日光を浴びることと乳癌と結腸癌の危険が、反比例して相互に関連していること確立した疫学的研究によって、さらに支持されている（Ｇｏｒｔｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｃａｎ．Ｊ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ ８０：９６−１００；Ｇｏｒｈａｍ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｉｎｔ． Ｊ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ １９：８２０−８２４；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １９：６１４−６２２）。
【００６２】
それゆえ、ＣＹＰ２４のこの仮説的な発癌遺伝子の役割は、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ３のレベルを低下させ、リガンド結合ＶＤＲの生物効果を調節するその機能に由来している。この仮説は、生体外でのビタミンＤの抗増殖活性が、ヒドロキシラーゼ阻害剤の存在下で向上するという観察によって支持されている（Ｒｅｉｎｈａｒｄｔ ａｎｄ Ｈｏｒｓｔ（１９８９）Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７２：４５９−４６５；Ｚｈａｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７；１９７−２０２）。したがって、理論に束縛されずに、本発明は、リガンド結合ＶＤＲが結合し、増加した数のＣＹＰ２４遺伝子複製による転写を開始するため、ＣＹＰ２４の増幅が細胞内のビタミンＤ分解のアップレギュレーションによって、ビタミンＤ仲介成長制御を取り消すという認識に、一部基づいている。
【００６３】
これらの発見を考慮すると、ＣＹＰ２４は癌および／または癌発生の可能性（予測）のための良好なマーカーとなる。したがって、ある実施例において、本発明は、動物における癌の存在、または偏好の検出方法を提供する。方法には（ｉ）動物（たとえばヒト患者）による生物サンプルを与えること；（ｉｉ）生物サンプル内のＣＹＰ２４レベルを検出すること；（ｉｉｉ）ＣＹＰ２４レベルを、通常の癌のない動物から採取した対照サンプルのＣＹＰ２４レベルと比較することが含まれる。ここで対照サンプルのＣＹＰ２４レベルに比較した生物サンプル内のＣＹＰ２４の上昇したレベルによって、前記動物における前記癌の存在が示される。ＣＹＰ２４転写物、翻訳ポリペプチドまたは酵素活性をアッセイする場合、方法はＶＤＲ活性の測定を含むことが好ましく、サンプルと対照の比較は、同じＶＤＲレベルで行うか、ＶＤＲレベルの違いを反映させて補正を行う。
【００６４】
同様にＣＹＰ２４レベルの検出は、癌に罹患した動物の生存予測値を予測するのにも使用できる。ＣＹＰ２４レベルは生存予測値（たとえば疾病の進行または再発の可能性）のアッセイに使用可能なため、ＣＹＰ２４レベルのアッセイによって、癌治療の有用な構成要素が与えられる。したがって、癌治療の１つの好ましい方法において、ＣＹＰ２４レベルがアッセイされ、適切な対照または個体群標準と比較して高い場合には、１個以上のアジュバント療法（たとえば放射線療法、再手術、化学療法など）が癌治療措置として選択される。
【００６５】
上昇したＣＹＰ２４レベルが癌または癌の素因の表示として確認されると、ＣＹＰ２４レベルは、潜在的な予防法および／または治療法を評価する有用な標的／マーカーとなる。したがってたとえば、（ＶＤＲ活性の所与のレベルにおける）ＣＹＰ２４活性のレベルは、１つ以上の推定上の潜在的治療／予防法がある場合でもない場合でも、治療／予防化合物の潜在的活性の尺度となる、すなわち化合物の存在時にＣＹＰ２４活性が低いと、化合物の潜在的活性がより高いことが示される。
【００６６】
別の実施例において、本発明は細胞の増殖を低下させる方法を提供する（たとえば癌細胞）。本方法は、ＣＹＰ２４の阻害剤を用いて、前記細胞におけるＣＹＰ２４活性のレベルを低下させることを含む。
１．ＣＹＰ２４レベルのアッセイ
上で示したように、（たとえば特定のビタミンＤ受容体活性において）ＣＹＰ２４の複製数または活性レベルのアッセイは、癌の存在または可能性（素因）の尺度となる。ＣＹＰ２４の配列は既知であるため、複製数は、以下で述べるように多数の各種方法によって直接測定できる。
【００６７】
ＣＹＰ２４「活性」レベルに基づくアッセイに関して（たとえば、転写産物のレベル、翻訳タンパク質のレベル、タンパク質のレベル、酵素活性）、ＣＹＰ２４の転写をビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）のレベルおよび活性に密接に結びつけることは、ＣＹＰ２４レベルの評価を複雑にする。手短に言えば、ＣＹＰ２４発現レベルは、ＶＤＲ活性はもちろんのこと、複写数から生じる転写の規模の上昇にも依存する。したがって、ＣＹＰ２４「活性」のアッセイに基づく実施例では特に、ＣＹＰ２４レベルの評価が、正常細胞に対する腫瘍細胞中のＣＹＰ２４レベルの測定だけでなく、腫瘍および正常細胞におけるＶＤＲレベルと活性の測定も含むことが好ましい。そのようはアッセイを以下で説明する。
Ａ） 複製数の検出
１つの実施例において、癌の存在または偏好は単にＣＹＰ２４複製数の決定によって評価される。特定の遺伝子の複製数の評価方法は、当業熟練者には周知である。
１） ハイブリダイゼーションに基づくアッセイ
サンプル中のＣＹＰ２４コード化核酸の複製数を評価する方法の１つには、サザントランスファーがある。サザンブロットにおいて、ゲノムＤＮＡ（通常、フラグメント化され、電気泳動ゲルで分離された）は、標的領域に特異性のプローブに対してハイブリダイゼーションされる。標的領域のプローブからのハイブリダイゼーション信号の強度を、正常ゲノムＤＮＡ（たとえば、同一または関連細胞、組織、器官などの非増幅部分）の分析による対照プローブ信号と比較すると、標的核酸の相対複製数の概算値が得られる。
【００６８】
ＣＹＰ２４の複製数を決定する別の方法は、ｉｎ ｓｉｔｕ（原位置）ハイブリダイゼーションである。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは既知である（たとえばＡｎｇｅｒｅｒ（１９８７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ １５２：６４９）。一般にｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは、以下の主要なステップより成る：（１） 分析される組織または生物構造の固定；（２） 標的ＤＮＡのアクセシビリティを高め、非特異性結合を減少させるため、生物構造の事前ハイブリダイゼーション処理；
（３） 核酸混合物の、生物構造または組織内の核酸へのハイブリダイゼーション；（４） ハイブリダイゼーションで結合されなかった核酸フラグメントを除去するため、ハイブリダイゼーション後の洗浄；（５） ハイブリダイゼーションした核酸フラグメントの検出。これらの各ステップで用いた試薬と使用した条件は、特定の用途によって変わる。
【００６９】
好ましいハイブリダイゼーションに基づくアッセイは、これに限定されるわけではないが、サザンブロットまたはｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（たとえばＦＩＳＨ）などの従来の「直接プローブ」法と、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）などの「比較プローブ」法がある。方法は、これに限定されるわけではないが、基質（たとえば膜またはガラス）結合法、または以下で述べる配列ベース手法を含む、広範な形式で用いることができる。
【００７０】
代表的なｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて、細胞は、一般にガラススライドである固体担体に固定される。もし核酸がプローブされれば、細胞は、一般に熱やアルカリにより変性する。細胞を次に、適切な温度のハイブリダイゼーション溶液に接触させて、タンパク質をコード化する核酸配列に特異性である標識プローブをアニーリングさせる。標的（たとえば細胞）を次に、通常は規定の厳密性で、あるいは厳密性を増して、雑音温度比に対して適切な信号が得られるまで洗浄する。
【００７１】
プローブは通常、たとえば放射線同位体または蛍光レポータによって標識する。好ましいプローブは、厳密な条件下で標的核酸と特異的にハイブリダイゼーションできるように、十分な長さである。好ましいサイズ範囲は約２００〜約１０００ｂｐである。
【００７２】
一部の用途において、反復配列のハイブリダイゼーション能力を阻害する必要がある。したがって一部の実施例では、ｔＲＮＡ、ヒトゲノムＤＮＡ、またはＣｏｔ−Ｉ ＤＮＡを用いて、非特異性ハイブリダイゼーションを阻害する。
【００７３】
比較ゲノムハイブリダイゼーション法において、（たとえば考えられる腫瘍からの）核酸の第１の収集（サンプル）には第１の標識を付け、（たとえば健康な細胞／組織からの）核酸の第２の収集（対照）には第２の標識を付ける。核酸のハイブリダイゼーション比は、配列において各繊維に結合した２つ（第１および第２）の標識の比によって決定される。染色体欠損または増殖がある場合、２つの標識からの信号の比の差が検出され、比はＣＹＰ２４複製数の尺度となる。
【００７４】
本発明の方法によって使用するのに適したハイブリダイゼーション手順は、たとえばＡｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ．３：１２２７−１２３４；Ｐｉｎｋｅｌ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：９１３８−９１４２，ＥＰＯ Ｐｕｂ．Ｎｏ．４３０，４０２，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３３： Ｉｎ Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃｈｏｏ編，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９８４）などで述べられている。
【００７５】
特に好適実施例では、Ｐｉｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：２０７１−２１１またはＫａｌｌｉｏｎｉｅｒｎｉ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：５３２１−５３２５（１９９２）の方法を使用する。
２） 増幅に基づくアッセイ
また別の実施例において、増幅に基づくアッセイを用いて複製数を測定する。このような増幅に基づくアッセイでは、ＣＹＰ２４核酸配列は、増幅反応（たとえばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）においてテンプレートとして作用する。定量的増幅において、増幅生成物の量は、元のサンプル中のテンプレートの量に比例する。適切な（たとえば健康な組織）対照との比較は、ＣＹＰ２４の複製数の尺度となる。
【００７６】
「定量的」増幅の方法は、当業熟練者には周知である。たとえば、定量的ＰＣＲには、同じプライマーを用いて、既知量の対照配列を同時に共増幅することが含まれる。これは、ＰＣＲ反応を校正する場合に用いられる内部標準となる。定量的ＰＣＲの詳細な手順は、Ｉｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ）で与えられている。ＣＹＰ２４の既知の核酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ受入番号Ｕ６０６６９ Ｓ７８７７５ Ｘ５９５０６を参照）によって、当業熟練者は遺伝子の任意の部分を増幅するためのプライマーをルーチン的に十分選択することができる。
【００７７】
他の適切な増幅方法は、これに限定されるわけではないが、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ（１９８９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４：５６０，Ｌａｎｄｅｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：１０７７、Ｂａｒｒｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｇｅｎｅ ８９：１１７を参照）、転写増幅（Ｋｗｏｈ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：１１７３）、自己維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：１８７４）、ドットＰＣＲ、リンカアダプタＰＣＲなどが挙げられる。
Ｂ）遺伝子発現の検出
上で示したように、ＣＹＰ２４レベルも、癌への偏好のマーカーとしてアッセイできる。しかし、ＣＹＰ２４の転写を、ＣＹＰ２４「活性」のビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）レベル測定に密接に結びつけることは、本発明のアッセイで使用されるＶＤＲ活性の測定と好ましく結びつけられる。したがって、同じレベルのＶＤＲ活性における対照と比較して、ＣＹＰ２４活性が上昇していることは、癌の存在および／または偏好の表示となる。
【００７８】
好適実施例において、ＣＹＰ２４活性はＣＹＰ２４遺伝子転写産物（たとえばｍＲＮＡ）の測定によって、翻訳タンパク質の量の測定によって、またはＣＹＰ２４酵素活性（２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性）の測定によって特徴付けられる。
１） 遺伝子転写の検出
ａ） 直接ハイブリダイゼーションに基づく定量
核酸ハイブリダイゼーション技法を用いたＣＹＰ２４遺伝子の写し（由来のＣＹＰ２４ ｍＲＮＡないしはｃＤＮＡ）の検出および、または定量化の方法は、専門分野の熟練者にはよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ参照）。例えば、ＣＹＰ２４ ｃＤＮＡの存在、欠如または量を測定する方法の１つは、上記記載のサザントランスファーに含まれる。簡潔に言えば、ＣＹＰ２４ ｍＲＮＡを分離して（例、酸グアニジニウム−フェノール−クロロフォルム抽出法、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａ）、逆転写し、ｃＤＮＡを生成する。その後、ｃＤＮＡを随意、蒸解してバッファ中のゲル上を移動させ、膜に移す。その後、標的ＣＹＰ２４ ｃＤＮＡに特化した核酸プローブを用いてハイブリダイゼーションを実行する。
【００７９】
プローブには、ＣＹＰ２４蛋白質を符号化した核酸配列の全長、または、それより短いものが利用できる。短いプローブは、実験により特異性を試験される。核酸プローブは、２０塩基以上の長さを持つことが好ましい。（核酸ハイブリダイゼーションに使用する核酸プローブ配列の選択法については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．ｓｕｐｒａを参照。）ハイブリダイゼーション蛋白質の測定によって、ＣＹＰ２４ ｃＤＮＡの存在または欠如の定性的測定が可能になる。
【００８０】
同様に、ノーザントランスファーは、ＣＹＰ２４ ｍＲＮＡの直接検出に使用できる。簡潔に言えば、例えば、酸グアニジニウム−フェノール−クロロフォルム抽出法を用いて、任意の細胞試料からｍＲＮＡを分離する。その後、ｍＲＮＡを電気泳動にかけて、ｍＲＮＡ種に分離し、ゲル中からニトロセルロース膜に移動させる。サザンブロットを用いた場合のように、標識を持つプローブが、ＣＹＰ２４ ｍＲＮＡの同定および、または定量化に利用される。
ｂ） 増幅ベースの定量
別の好ましい実施例では、ＣＹＰ２４ ＤＮＡのコピー数を直接推定するために、ＣＹＰ２４の写し（例、ＣＹＰ２４ ｍＲＮＡ）が、上記記載の増幅（例、ＰＣＲ）ベース法で測定できる。好ましい実施例において、ＣＹＰ２４の写しのレベルは、ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）の逆転写によって推定される。上に述べたように、ＣＹＰ２４活性は、遺伝子の写しのレベルが測定されているビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）活性と直接連結しているので、ＶＤＲ活性（例、写しのレベル）も測定されることが好ましい。その時、ＶＤＲ活性の任意のレベルに応じたＣＹＰ２４活性の増加は、悪性腫瘍、または、悪性腫瘍素質の増加を示す。このように、好ましい増幅ベース定量（例、ＲＴ−ＰＣＲ）では、ＶＤＲの写しのレベルも定量される。
【００８１】
上に示すように、ＰＣＲ定量法は、専門分野の熟練者にはよく知られている。同様に、ＲＴ−ＰＣＲ法もよく知られている。さらに、当該ＲＴ−ＰＣＲ定量のためのプローブは、以下の表１で規定され、定量法は例１に図解される（例、図３参照）。
２） 発現蛋白質の検出
ＣＹＰ２４の「活性」も、発現したＣＹＰ２４ポリペプチドを検出または定量化することによって、検出および、または定量化できる。同ポリペプチドは、専門分野の熟練者にはよく知られてた幾種かの方法を用いて検出および定量化できる。これらの方法には、電気泳動、毛細電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄膜クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなどの分析的な生化学的方法、ないしは、流動またがゲル沈降素反応、免疫拡散（一回または二回）、免疫電気泳動、放射免疫測定（ＲＩＡ）、酵素連結免疫吸着検定（ＥＬＩＳＡｓ）、免疫蛍光測定、ウエスタンブロットなどの様々な免疫学的方法が含まれる。
【００８２】
好ましい実施例の１つにおいて、ＣＹＰ２４ポリペプチドは、電気泳動蛋白質分離（例、１ないし２次元電気泳動）を通して検出・定量化される。電気泳動技法を用いた蛋白質の検出法は、専門分野の熟練者にはよく知られている（Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ（１９８２）『蛋白質精製』Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ， Ｎ．Ｙ．；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，（１９９０）「酵素学の方法」１８２巻『蛋白質精製の手引き』Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ．Ｉｎｃ．， Ｎ．Ｙ．を広く参照のこと）。
【００８３】
もう１つの好ましい実施例において、試料中のＣＹＰ２４ポリペプチドの存在の検出および定量化に、ウエスタンブロット（免疫ブロット）分析が用いられる。この技法は、一般に、分子量を基礎としたゲル電気泳動によって試料蛋白質を分離し、分離蛋白質を適切な固形支持物（ニトロセルロースフィルター、ナイロンフィルターないしは誘導ナイロンフィルターなど）に移動させ、ＣＹＰ２４ポリペプチドに特定的に結合する抗体を加えて試料をインキュベートすることから成る。抗ＣＹＰ２４ポリペプチド抗体は、固形支持物上でＣＹＰ２４と特定的に結合する。これらの抗体は、直接標識できるか、または、もう１つのやり方として、抗ＣＹＰ２４と特定的に結合する標識を持つ抗体（例、標識ヒツジ抗マウス抗体）を用いて後から検出することができる。
【００８４】
より好ましい実施例では、ＣＹＰ２４ポリペプチドは免疫測定を用いて検出される。本件で用いられているように、免疫測定は、検体（ＣＹＰ２４ポリペプチド）と特定的に結合する抗体を利用する定量法である。このように、免疫測定は、抗ＣＹＰ２４抗体に対するＣＹＰ２４ポリペプチドの特定的な結合の検出を特徴とし、検体を単離、標的化および定量化する他の物理的ないしは化学的な特性とは対照をなす。
【００８５】
ＣＹＰ２４ポリペプチドは、幾種かの広く認められた免疫学的な結合測定（例、米国特許４，３６６，２４１、４，３７６，１１０、４，５１７，２８８および４，８３７，１６８参照）を用いて検出および、または定量化される。一般的な免疫測定の再検討のためには、Ａｓａｉ（１９９３）「細胞生物学の方法」３７巻『細胞生物学における抗体』Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｓｔｉｔｅｓ ＆ Ｔｅｒｒ（１９９１）「基礎臨床免疫測定」第７版も参照のこと。
【００８６】
免疫学的な結合測定（すなわち、免疫測定）は、多くの場合、検体（この場合には、ＣＹＰ２４ポリペプチドないしは部分列）と特定的に結合し、しばしば固定する手段として「捕捉剤」を利用する。同捕捉剤は、検体に特異的に結合する一部分である。好ましい実施例では、捕捉剤は、ＣＹＰ２４ポリペプチドに特定的に結合する抗体である。抗体（抗ＣＹＰ２４）は、専門分野の熟練者にはよく知られた幾種かの方法によって生成できる。
【００８７】
免疫測定も、捕捉剤と検体によって形成された結合錯体に特定的に結合して標識を付ける手段として、しばしば標識付け剤を利用する。標識付け剤自体には、抗体・検体錯体から成る一部分が利用できる。このように、標識付け剤には、標識を持つＣＹＰ２４ポリペプチド、または、標識を持つ抗ＣＹＰ２４抗体が利用できる。もう１つのやり方として、標識付け剤には、抗体・ＣＹＰ２４ポリペプチド錯体を特定的に結合する第３部分、例えば、他の抗体などが利用できる。
【００８８】
好ましい実施例の１つでは、標識付け剤には、標識を持つ、人由来の第２ＣＹＰ２４抗体が利用される。もう１つのやり方として、第２ＣＹＰ２４抗体には標識を付けず、標識を持つ第３抗体によって、次々に、第２抗体の誘導源である種の抗体に特定的に結合することもできる。第２抗体は、標識を持つ第３の分子、例えば、酵素標識を持つステレプタビジンなどが特定的に結合することのできる、検出可能部分のある形態、例えばビオチンに修正可能である。
【００８９】
プロテインＡまたはプロテインＧといった免疫グロブリン定常部に特異的にあ結合することが可能な他のタンパク質も、標識物として使用されてよい。これらのタンパク質は、連鎖球菌の仲間の細菌の細胞壁の正常な成分である。それらは様々な種からの免疫グロブリン定常部との非免疫原性の反応性を示す（全般的には、Ｋｒｏｎｖａｌら、（１９７３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１１：１４０１−１４０６、およびＡｋｅｒｓｔｒｏｍ（１９８５） Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３５：２５８９−２５４２参照のこと）。
【００９０】
前文に示したように、ＣＹＰ２４ポリペプチドの検出および／または定量のためのイアムノアッセイは、当業者に周知の非常に多様なフォーマットをとることが可能である。
【００９１】
ＣＹＰ２４ポリペプチドを検出するための好ましいイムノアッセイは、競合または非競合性でよい。非競合イムノアッセイは、捕捉された分析物の量が直接的に測定されるアッセイである。一つの好ましい「サンドイッチ」アッセイにおいては、たとえば、捕捉剤（抗ＣＹ２４抗体）は、固形の素地に直接結合されることが可能であって、それらはそこに固定される。固定された抗体は次いで、検査試料中のＣＹＰ２４ポリペプチドを捕捉する。このようにして固定されたＣＹＰ２４は、標識をつけている第２のヒトＣＹＰ２４抗体などの標識物によって結合される。
【００９２】
競合アッセイにおいては、試料中に存在する分析物の量は、捕捉された物質（抗ＣＹＰ２４抗体）から、試料中に存在する分析物によってとって代わられた（または押退けられた）添加された（外来性の）分析物（ＣＹＰ２４ポリペプチド９の量を測定することにより、間接的に測定される。一つの非競合アッセイにおいては、既知の量の、この場合にはＣＹＰ２４ポリペプチドが、試料に添加され、次に当該試料は捕捉物質と接触される。抗体に結合したＣＹＰ２４ポリペプチドの量は、試料中に存在するＣＹＰ２４ポリペプチドの濃度に反比例する。
【００９３】
一つの特に好ましい態様においては、抗体は固体支持体上に固定される。抗体に結合したＣＹＰ２４ポリペプチドの量は、ＣＹＰ２４ポリペプチド／抗体複合体中に存在するＣＹＰ２４ポリペプチドの量を測定することによるか、または別法として、残っている未結合のＣＹＰ２４ポリペプチドの量を測定することにより決定される。ＣＹＰ２４ポリペプチドの量用は、標識されたＣＹＰ２４ポリペプチドを供給することにより測定されてもよい。
【００９４】
本発明のアッセイは、当業者に周知の標準的な方法により得点づけされる（正か負、またはＣＹＰ２４ポリペプチドの量として）。得点づけの詳細な方法は、アッセイのフォーマットおよび標識の選択に依存するであろう。たとえば、ウェスタンブロットアッセイは酵素標識により産生される色のついた産物を可視化することによって得点づけされることが可能である。正しい分子量にある明らかに見える色のついたバンドまたはスポットは正の結果として得点づけされ、一方明らかに見えるスポットまたはバンドがないことは負として得点づけされる。バンドまたはスポットの強度は、ＣＹＰ２４の定量的な測定を提供することが可能である。
【００９５】
本文に述べられた種々のイムノアッセイにおける使用のための抗体は、以下に述べられるように製造されることが可能である。
【００９６】
３） 酵素活性の測定
もう一つの態様においては、ＣＹＰ２４レベル（活性）はＣＹＰ２４ポリペプチドの酵素活性（２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４ヒドロキラーゼ）を測定することによってアッセイされる。この酵素の活性のアッセイ法は、当業者には周知である。したがって、たとえば細胞懸濁物中のＣＹＰ２４活性は、^３Ｈ−標識された２５ＯＨＤ_３（アマシャム）の代謝を測定することによりアッセイされるであろう。酸化産物はＨＰＬＣにより分離され、活性はＣ−２４酸化産物の合計として計算される（Ｔｏｍｏｎら、１９９０Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，１２６：２８６８−２８７５）。別法としてＣＹＰ２４活性は、２５−ＯＨ−［２６，２７−^３Ｈ］Ｄ_３（ＮＥＮ＃ＮＥＴ３４９）とのインキュベーションと、過ヨウ素酸分解の後に［^３Ｈ］アセトンとして放出された放射能の測定の後に測定されることができる（ＢｅｃｋｍａｎおよびＤｅＬｕｃａ（１９９７）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２８２：２００−２１３）。
Ｃ） ＶＤＲ活性を制御している間のＣＹＰ２４レベルの比較
前文に説明したように、ＣＹＰ２４の活性レベルはビタミンＤ受容体（ＶＤＲ）の活性レベルにしっかりと関連している。したがって、ＣＹＰ２４活性（たとえば転写、翻訳、翻訳されたタンパク質の活性、その他）をアッセイする場合には、活性レベルは好ましくはＶＤＲ活性のレベルについて測定される。試料組織（たとえば組織生検）が対照試料（たとえば健康な組織）（好ましくは同レベルのＶＤＲ活性にある）よりも高いレベルのＣＹＰ２４活性を示す場合には、それゆえ高められたＣＹＰ２４活性は、癌の存在、予後、または発症の素質を示す。
【００９７】
ＶＤＲ転写物（たとえばｍＲＮＡ）レベルか、または翻訳されたタンパク質のレベルは、ＣＹＰ２４活性について前文に述べられたアッセイを用いて測定されることが可能である；唯一の差は、当該アッセイがＣＹＰ２４よりもむしろＶＤＲ核酸またはポリペプチドに対して特異的に調整されていることである。
【００９８】
ＶＤＲに特異的な抗体は市販されている（アフィニティ・バイオリージェンツ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｂｉｏｒｅａｇｅｎｔｓ）＃ＰＡ１−７１１、ＭＡ１−７１０、サンタクルーズγ・バイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）＃ｓｃ−１００８、ｓｃ−１００９）。ｍＲＮＡ ＦＩＳＨ用のリボプローブを生成するために使用されることが可能なＣＹＰ２４およびＶＤＲ ｍＲＮＡのための遺伝子特異プローブは、実施例１において提供される。さらに、ＣＹＰ２４およびＶＤＲの転写レベルのためのアッセイは、実施例１において説明されている。
Ｄ） ハイブリダイゼーション・フォーマットおよびハイブリダイゼーション条件の最適化
１） アレーに基づくハイブリダイゼーション
本発明の方法は、アレーに基づくハイブリダイゼーションフォーマットに特に好都合である。一つの好ましいアレーに基づくハイブリダイゼーション系についての記述として、Ｐｉｎｋｅｒら（１９９８）、Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２０：２０７−２１１を参照のこと。
【００９９】
アレーは、一つまたはそれより多い表面（たとえば固体、膜、またはゲル）に付着された多数の異なる「プローブ」または「ターゲット」核酸（または他の化合物）である。好ましい態様においては、多数の核酸（または他の成分）は、一つの連続した表面か、または互いに並置された複数の表面に付着される。
【０１００】
一つのアレーフォーマットにおいては、多数の異なるハイブリダイゼーション反応が、基本的には「平行して」進行されることが可能である。これは、迅速な、基本的に同時の、数多くのハイブリダイゼーションの査定を、１回の「実験」において提供する。アレーに基づくフォーマットにおいてハイブリダイゼーション反応を行なう方法は、当業者に周知である（たとえば、Ｐａｓｔｉｎｅｎ（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：６０６−６１４；Ｊａｃｋｓｏｎ（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １４：１６８５；Ｃｈｅｅ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７４：６１０；ＷＯ９６／１７９５８、Ｐｉｎｋｅｌら（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ２０：２０７−２１１参照のこと）。
【０１０１】
アレー、特に核酸アレーは、当業者に周知の広く多様な方法により製造されることが可能である。たとえば、一つの単純な態様においては、固形支持体（たとえばガラス表面、膜、その他）の上の異なる位置に異なる核酸をスポッティング（ピペットを用いて手で）することにより、「低密度」アレーが簡単に製造されることが可能である。
【０１０２】
この単純なスポッティングアプローチは自動化され、高密度にスポットされたアレーが製造されている（米国特許第５，８０７，５２２号参照のこと）。この特許は、マイクロキャピラリーを表面に対してたたいて少量の生体試料を置くべく自動化されたシステムの使用について述べている。このプロセスは高密度のアレーを生じるべく繰返される。
【０１０３】
アレーはまたオリゴヌクレオチド合成技術を用いても産生される。このように、たとえば、米国特許第５，１４３，８５４号およびＰＣＴ特許公報ＷＯ９０／１５０７０および９２／１００９２は、高密度のオリゴヌクレオチドアレーの光に指示される組合せによる合成の使用を教示している。
【０１０４】
手短にいえば、ガラス表面上の光に指示される結合によるオリゴヌクレオチドアレーの合成は、自動化されたホスホロアミダイト化学とチップマスキング法とを用いて進行する。一つの特別な実施においては、ガラス表面はたとえば、感光性の保護基によってブロックされたヒドロキシルまたはアミン基などの官能基を含んでいるシラン試薬を用いて被覆される。フォトリトガフィック（ｐｈｏｔｏｌｉｔｈｏｇａｐｈｉｃ）マスクを通した光分解が、選択的に官能基を暴露するべく用いられ、次いでそれらは次に入って来る５′を光防護されたホスホロアミダイトと反応するべく用意される。ホスホロアミダイトは、照明された（したがって感光性の防護基の除去により暴露された）部位とのみ反応する。したがって、ホスホロアミダイトは先行する工程から選択的に暴露された領域に選択的に付加される。これらの工程は、固体表面の上に所望の配列のアレーが合成されるまで反復される。アレー上の異なる位置における異なるオリゴヌクレオチド類似体の組合せによる合成は、合成を通じた照明パターンと、カップリング剤の添加の順序とによって決定される。
【０１０５】
好ましい態様においては、本発明に使用されるアレーはプローブまたはターゲット核酸であることが可能である。これらのプローブまたはターゲット核酸は、それらの「標的」核酸と各々ハイブリダイズされる。ＣＹＰ２４遺伝子配列は既知であるため、オリゴヌクレオチドアレーは、ＣＹＰ２４に特異的な一つまたは多数のプローブを含んで合成されることが可能である。
【０１０６】
もう一つの態様においては、アレー、特にスポットされたアレーは、ゲノムＤＮＡ、たとえばＣＹＰ２４を含んでいるアンプリコンか、またはＣＹＰ２４それ自身についての高分解能スキャンを提供する重複クローンを含むことが可能である。アンプリコン核酸は、たとえばＨＡＣ、ＭＡＣ、ＹＡＣ、ＢＡＣ、ＰＡＣ、Ｐｌ、コスミド、プラスミド、ゲノムクローンのインター・アル（ｉｎｔｅｒ−Ａｌｕ）ＰＣＲ産物、ゲノムクローンの制限消化物、ｃＤＮＡクローン、増幅（たとえばＰＣＲ）産物、その他から取得可能である。
【０１０７】
種々の態様において、アレー核酸は本発明のアンプリコン配列にかかっていいる、または含んでいる先にマップされたクローンのライブラリ、ならびに以下に述べたような、他のゲノム領域からのクローンから由来する。アレーは試料核酸の内の一つの集団とハイブリダイズされることができるか、または二つの別個に標識されたコレクションとともに（検査試料と参考試料を用いてというように）使用されることもできる。
【０１０８】
当該技術においては、種々の固体表面の上に核酸を固定するための多くの方法が知られている。広く多様な有機および無機ポリマー、ならびに天然および合成による他の物質が、固体表面用の物質として使用されることができる。代表的な固体表面は、たとえばニトロセルロース、ナイロン、ガラス、石英、ジアゾ化膜（紙またはナイロン）、シリコーン、ポリホルムアルデヒド、セルロース、および酢酸セルロースを含む。さらに、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリスチレン、その他といったプラスチックが使用されることができる。紙、セラミックス、金属、メタロイド、半導体物質、セラミド、などを含む他の物質も使用されてよい。さらに、ゲルを形成する物質が使用される。かかる物質は、たとえばタンパク質（たとえばゼラチン）、リポ多糖、ケイ酸塩、アガロース、およびポリアクリルアミドを含む。当該固体表面が多孔性である場合には、系の性質に依存して種々の孔サイズが用いられてよい。
【０１０９】
表面の調製においては、複数の異なる物質、特にラミネートが、種々の特性を取得するべく用いられてよい。たとえば、タンパク質（たとえばウシ血清アルブミン）か、または高分子混合物（たとえばデンハーツ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）の溶液）が、非特異的な結合を避けるべく、共有結合をわかりやすくするべく、シグナル検出を高めるべく用いられることが可能である。もし化合物と表面との間に共有結合が望ましい場合には、表面は通常多官能性であるか、または多官能性化されることが可能である。表面上に存在し、かつ結合に使用されてもよい官能基は、カルボン酸、アルデヒド、アミノ基、シアン基、エチレン性基、ヒドロキシル基、メルカプト基、その他を含むことが可能ある。広く多様な化合物を種々の表面に結合するための方法は周知であり、文献に平易に説明されている。
【０１１０】
たとえば、種々の官能基を分子に導入することによる核酸の固定法は周知である（たとえば、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１６４：３３６−３４４； Ｋｒｅｍｓｋｙ（１９８７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５：２８９１−２９１０参照のこと）。修飾されたヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチドを含んでいるＰＣＲプライマーを用いて、あるいは修飾されたヌクレオチドを用いた酵素による末端標識により、標的の上に置かれることができる。本発明の核酸アレー用のためのガラスまたは膜の支持体（たとえばニトロセルロース、ナイロン、ポリプロピレン）の使用は、比較的高いエレメント濃度において標的にアレーするための手動およびロボットによる方法を用いている充分に開発された技術であるため、好都合である。かかる膜は市販されており、プロトコールおよび膜へのハイブリダイゼーションのための装置は周知である。
【０１１１】
直径１ｍｍから１μｍまでの、種々のサイズの標的エレメントが使用されることが可能である。各々の標的エレメントに結合するために得られる試料の総量が限られているため、少量の濃縮され、固定されたプローブＤＮＡを含んでいる小さい標的エレメントが、高度にコンプレキシティの比較ハイブリダイゼーション（ｈｉｇｈ ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）用に用いられた。したがって、少量の濃縮されたプローブＤＮＡを含んでいる小さいアレー標的エレメントをもち、得られるシグナルが高度に局在化されかつ鮮明になるようにすることは利点がある。かかる小さいアレー標的エレメントは、典型的には１０^４／ｃｍ^２よりも大きい密度のアレーにおいて使用される。１ｃｍ^２の面積の定量的な蛍光イメージングの可能な比較的単純な装置が、一つの画像における多数の標的エレメントからのデータの獲得を可能にすることが記述されている（Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９４）Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ１６：２０１−２１３、Ｐｉｎｋｅｌら、（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ２０：２０７−２１１参照）。
【０１１２】
ガラス、石英、小さいビーズなどの、膜よりはるかに低い蛍光を持つ固体表面基板上のアレイは、はるかに良好な感度を達成できる。ガラスまたは溶融石英などの基板は、それらが極低蛍光性の基板となり、著しく効率のよいハイブリダイゼーション環境を提供する点で有利である。ガラスまたは合成溶融石英への標的核酸の共有結合は多くの既知技術（上述）に従って達成できる。核酸は市販の試薬を用いてガラスに便利にカップリングすることができる。例えば、多くの官能基を持つシラン処理ガラスを製造するための材料は市販されているか、標準的技術を使って製造できる（例えばＧａｉｔ（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ： Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、ワシントンＤ．Ｃ．）を参照されたい）。ガラスと比べて１０分の１以下の自己蛍光を持つ石英製カバースリップもシラン処理できる。
【０１１３】
もう一つの選択肢として、市販の被覆ビーズまたは他の表面にプローブを固定化することもできる。例えば、ビオチン末端標識核酸を市販のアビジン被覆ビーズに結合させることができる。ストレプトアビジンまたは抗ジゴキシゲニン抗体を、標準的プロトコールに従い、例えばプロテインＡを用いて、タンパク質を介したカップリングによって、シラン処理ガラススライドに取り付けることもできる（例えばＳｍｉｔｈ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８：１１２２−１１２６を参照されたい）。ビオチンまたはジゴキシゲニン末端標識核酸は標準的技術に従って製造できる。ビーズに取り付けた核酸へのハイブリダイゼーションは、それらをハイブリダイゼーション混合物に懸濁し、次にそれらをガラス基板に沈着させ、洗浄後に分析を行なうことによって達成される。もう一つの選択肢として、酸化第二鉄粒子などの常磁性粒子を使用することもできる。
【０１１４】
特に好ましい一態様として、ある表面（例えばガラスまたは石英表面）にプローブ核酸をスポットする。水、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）およびニトロセルロースの混合物に核酸を溶解し、アミノシラン被覆ガラススライドにスポットする。プローブ混合物を「スポットする」作業には小さい毛細管を使用できる。
【０１１５】
２）他のハイブリダイゼーションフォーマット
当業者には様々な核酸ハイブリダイゼーションフォーマットが知られている。例えば一般的なフォーマットとしてサンドイッチアッセイと、競合または置換アッセイが挙げられる。ハイブリダイゼーション技術は、ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ（１９８５）「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）、ＧａｌｌおよびＰａｒｄｕｅ（１９６９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ６３：３７８−３８４、ならびにＪｏｈｎら（１９６９）Ｎａｔｕｒｅ ２２３：５８２−５８７に概説されている。
【０１１６】
サンドイッチアッセイは核酸配列を検出または単離するための商業上有益なハイブリダイゼーションアッセイである。このようなアッセイでは、共有結合によって固形支持体に固定化された「捕捉」核酸と、溶解状態の標識された「シグナル」核酸とを利用する。サンプルで標的核酸を供給する。「捕捉」核酸と「シグナル」核酸プローブは標的核酸とハイブリダイズして「サンドイッチ」ハイブリダイゼーション複合体を形成する。最も有効であるためにはシグナル核酸が捕捉核酸とハイブリダイズしてはならない。
【０１１７】
通例、ハイブリダイゼーションの検出には標識されたシグナル核酸が使用される。相補的核酸またはシグナル核酸は、ハイブリダイズしたポリヌクレオチドの存在を検出すために典型的に使用されるいくつかの方法のいずれを使って標識してもよい。最も一般的な検出方法は^３Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃまたは^３２Ｐ−標識プローブなどを用いるオートラジオグラフィーの使用である。他の標識には、標識された抗体に結合するリガンド、蛍光体、化学発光剤、酵素、標識されたリガンドにとって特異的な結合対要素として働くことのできる抗体などがある。
【０１１８】
ハイブリダイゼーション複合体の検出には、標的ポリヌクレオチドまたは標的核酸およびプローブポリヌクレオチドまたはプローブ核酸の二重鎖へのシグナル生成複合体の結合が必要な場合がある。通例、そのような結合は、リガンドに結合したプローブと、シグナルに結合した抗リガンドとの間に起こるような、リガンドと抗リガンドの相互作用によって起こる。
【０１１９】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出すべき標的核酸を増幅する核酸増幅系の使用によって向上させることができる。そのような系の例にはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）系、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）系などがある。当技術分野で最近になって記述された他の方法にはＮＡＳＢＡＯ（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｂａｓｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ；Ｃａｎｇｅｎｅ社（オンタリオ州ミシソーガ））システムとＱ Ｂｅｔａ Ｒｅｐｌｉｃａｓｅシステムがある。
【０１２０】
３）ハイブリダイゼーション条件の最適化
核酸ハイブリダイゼーションには単に、プローブとその相補的標的が相補的塩基対により安定したハイブリッド二本鎖分子を形成することができる条件下で、変性プローブと標的核酸を提供するステップが含まれるだけである。ハイブリッド二本鎖分子を形成しないこの核酸はその後、典型的には、検出可能な付着標識の検出により検出される、ハイブリダイズされた核酸を残して洗い流される。一般的には、核酸は温度を上昇させる、あるいはその核酸を含有する緩衝液の塩濃度を減少させることにより、あるいは化学的薬剤を添加するときに、あるいはｐＨの値を上げるときに、変性されると考えられている。低緊縮条件下（例えば、低い温度および／または高い塩濃度および／または高い標的濃度）で、ハイブリッド二本鎖分子（例えば、ＤＮＡ：ＤＮＡ、ＲＮＡ：ＲＮＡあるいはＲＮＡ：ＤＮＡ）は、アニーリングされる配列が完全には相補的ではない場合であっても形成される。したがって、ハイブリダイゼーションの特異性は低い緊縮性では減少される。反対に、高い緊縮性（例えば、高い温度あるいは低い塩濃度）では、ハイブリダイゼーションを成功裡に行うにはミス対合がより少ないことが求められる。
【０１２１】
当業者であれば、いかなる程度の緊縮性であっても提供されるよう、ハイブリダイゼーション条件を選択することが可能であることは理解されるであろう。１つの好適な実施態様では、ハイブリダイゼーションを確実なものとする低い緊縮性で実施され、またその後は引き続いて洗浄がミス対合ハイブリッド二本鎖分子を取り除くために高い緊縮性で実施される。成功裡に行われる洗浄は、ハイブリダイゼーションの所望されるレベルが得られるまで、次第に高くなる緊縮性で実施される（例えば、３７℃〜７０℃にて０．２５ ｘ ＳＳＰＥに低く下げる）。緊縮性はまた、ホルムアミドなどの薬剤の添加により上昇させることができる。ハイブリダイゼーション特異性は、提供することができるさまざまな対照に対するハイブリダイゼーションと、そのテストプローブに対するハイブリダイゼーションとを比較することにより評価することが可能である。
【０１２２】
一般的には、ハイブリダイゼーション特異性（緊縮性）とシグナル強度との間で折り合いをつける。１つの好適な実施態様では、洗浄が、一致した結果を生みまた、バックグラウンド強度のおよそ１０％よりも大きなシグナル強度を提供するもっとも高度な緊縮性で実施される。このように、１つの好適な実施態様では、ハイブリダイズされたアレイは、さらに高い緊縮性を備えた溶液で連続的に洗浄され、また各洗浄間で読み出されるのが良い。このように産み出されたデータの分析により、ハイブリダイゼーションパターンが測定できるように改変されることがない、より上の洗浄緊縮性、および関心の対象となっている特定プローブに対して十分なシグナルを供給する洗浄緊縮性が明らかにされる。
【０１２３】
１つの好適な実施態様では、バックグラウンドシグナルは、非特異的結合を減少させるためにハイブリダイゼーション時に洗浄剤（例えば、Ｃ−ＴＡＢ）、あるいは遮断剤（例えば、ｔＲＮＡ、精子ＤＮＡ、ｃｏｔ−１ ＤＮＡ、その他）を使用することにより減少される。特に好適な１つの実施態様では、ハイブリダイゼーションは約１０μｇ／１μＬ ｔＲＮＡの存在下で実施される。ハイブリダイゼーション時の遮断剤の使用は、当業者には周知のものである（例えば、Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ、同上掲載書中の第８章を参照のこと）。
【０１２４】
ハイブリダイゼーション条件を最適化する諸方法は、当業者には周知のものである（例えば、Ｔｉｊｓｓｅｎ『生化学と分子生物学における実験室技術（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）』、第２４巻「核酸プローブによるハイブリダイゼーション（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ）」、 １９９３年、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ社刊、ニューヨークを参照のこと）。
【０１２５】
最適条件はまた、基板タイプ、蛍光色素、励起および放出バンド、スポットサイズなどの異なる組み合わせの標識（例えば、蛍光）を検出する際の感受性の１つの関数でもある。低い蛍光バックグラウンドシグナル表面を使用することができる（例えば、Ｃｈｕ（１９９２）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １３：１０５−１１４を参照のこと）。候補表面上のさまざまな直径のスポット（「標的要素」）の検出に関する感受性は、例えば、蛍光的に末端標識化されたＤＮＡ断片の一連の希釈液をスポットすることにより、容易に測定することができる。これらのスポットは、通常の蛍光顕微鏡を使用してその後に画像化される。感受性、直線性、および蛍光色素と固体表面（例えば、ガラス、融解石英、その他）のさまざまな組み合わせから到達可能な動的範囲をこのように測定することができる。また公知の相対的な命題における一対の蛍光色素率の連続希釈も分析することができる。これにより、検出器とプローブが固定された基板の蛍光により、蛍光率測定がその許容動的範囲にわたっている実際の蛍光色素率を反映するその正確度が測定される。
【０１２６】
４）核酸の標識化と検出
１つの好適な実施態様では、ハイブリダイズされた核酸は、サンプル核酸に付着させた１つあるいはそれ以上の標識を検出することにより検出される。標識は、当業者には周知のものである数々の手段のいずれかにより、組み込むことが可能である。核酸に標識を付着させる手段には、例えば、ニック翻訳、あるいは核酸のキナーゼ化による末端標識化およびその後のサンプル核酸を標識（例えば、蛍光体）に結合させるリンカーの付着（結合）が含まれる。核酸に標識を付着させるための広い範囲のさまざまなリンカーもまた公知のものである。さらに、インターカレート染色剤と蛍光ヌクレオチドもまた使用することができる。
【０１２７】
本発明で使用するのに適当な検出可能な標識には、分光、光化学、生物化学、免疫化学、電気、光学あるいは化学的手段により検出可能な、いずれかの組成が含まれる。本発明で有用な標識には、標識化されたストレプトアビジン共役による染色用のビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ^ＴＭ）、蛍光染色剤（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、グリーン蛍光タンパク質など、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ社、米国オレゴン州ユージーン市を参照）、放射能標識（例えば、^２Ｈ、^１２５Ｉ、^３５Ｓ、^１４Ｃあるいは^３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびその他のＥＬＩＳＡで通常使用されているもの）、および金コロイドなどの比色標識（例えば、高い効率を有する、４０〜８０ ｎｍ直径寸法範囲にある、散乱グリーン光の金粒子）あるいは色ガラスあるいはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス、その他）ビーズが含まれる。こうした標識の使用を教示している特許には、米国特許第３，８１７，８３７号、第３，８５０，７５２号、第３，９３９，３５０号、第３，９９６，３４５号、第４，２７７，４３７号、第４，２７５，１４９号および第４，３６６，２４１号が含まれる。
【０１２８】
蛍光標識は、バックグラウンドシグナルが低くてしかも非常に強いシグナルを供給するためには、好ましいものである。また、これは迅速スキャニング法により高度な解像度と感受性で光学的に検出可能である。核酸サンプルは単一標識、例えば、単一蛍光標識によりすべて標識化することができる。代替的には、もう１つの実施態様では、異なる核酸サンプルは、各核酸サンプルが異なる標識を有する場合に同時にハイブリダイズすることができる。例えば、１つの標識がグリーン蛍光標識を有することができ、また第２標的がレッド蛍光標識を有することができた場合である。スキャニングステップは、グリーン蛍光標識の結合部位と、レッド標識の結合部位とを識別することになる。各核酸サンプル（標的核酸）は、もう１つのものとは別に分析することができる。
【０１２９】
用いることができる適当な色原体には、色を観察することができるように波長の区別できる範囲にある光を吸収するそうした分子および化合物、例えば、蛍光剤、あるいは代替的には、特定の波長あるいは波長範囲の照射により照射されるときに光を放射するそうした分子および化合物、例えば、蛍光剤が含まれる。
【０１３０】
望ましくは、蛍光剤は、吸収される光の波長よりも約１０ ｎｍ高い値のものよりもさらに大きな波長で通常放射される、約３００ ｎｍより上の光を吸収するべきであり、好適には約３５０ ｎｍ、そしてさらに好適には約４００ ｎｍの光を吸収するべきである。結合染色剤の吸光および放出特性は、非結合染色剤とは区別すべきである。したがって、さまざまな波長範囲と染色剤の特性と照らし合わるとき、用いられる染色剤を示し、また、共役されておらずまた任意の溶媒で特徴付けられる染色剤は示さないように意図される。
【０１３１】
蛍光剤を照射することにより、複数の放射を得ることができるので、蛍光剤は一般的には好適である。したがって、単一標識を、複数の測定可能な出来事に対して供給することができる。
【０１３２】
検出可能な信号も、化学発光および生物発光源から供給できる。化学発光源は、化学反応によって電子的に励起される、次に光を発光可能な化合物を含む。この光は検出可能な信号として作用するか、蛍光受容体にエネルギーを供給する。あるいは、ルシフェリンをルシフェラーゼまたはルシジェニンとともに用いて、生物発光を与えることもできる。
【０１３３】
スピン標識は、電子スピン共鳴（ＥＳＲ）分光法によって検出可能な不対電子スピンを持つレポータ分子によって供給される。スピン標識の例としては、誘起フリーラジカル、遷移金属錯体、特にバナジウム、銅、鉄、マンガンなどが挙げられる。スピン標識の例としては窒素酸化物フリーラジカルが挙げられる。
【０１３４】
標識は、ハイブリダイゼーションの前か後に、標的（サンプル）核酸に添加できる。いわゆる「直接標識」は、ハイブリダイゼーション前に標的（サンプル）核酸に直接添加または包含される、検出可能な標識である。これにたいしていわゆる「間接標識」は、ハイブリダイゼーション後にハイブリッド二重鎖に結合される。間接標識は、ハイブリダイゼーション前に標的核酸に結合された結合部分に添加されることが多い。したがってたとえば、標的核酸は、ハイブリダイゼーション前にビオチン化してもよい。ハイブリダイゼーション後に、アビジン結合蛍光団は、検出されやすい標識を与えるビオチン保持ハイブリッド二重鎖を結合する。核酸の標識とハイブリダイゼーションされた標識核酸の検出の方法に関する詳細な総説は、Ｌｏｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌ ２４：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ， Ｐ． Ｔｉｊｓｓｅｎ編、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ， ＮＹ，（１９９３）を参照。
【０１３５】
蛍光標識は、生体外転写反応中に簡単に添加される。したがってたとえば、フルオレセイン標識ＵＴＰおよびＣＴＰは、生体外転写で生成されたＲＮＡに包含させることができる。
【０１３６】
標識は直接、またはリンカ部分によって添加できる。一般に標識またはリンカ標識添加部位は、特定の位置に限定されていない。たとえば、標識は、ヌクレオシド、ヌクレオチド、またはその類似体の、所望の検出またはハイブリダイゼーションが阻害されない任意の位置に添加できる。たとえば、あるＣｌｏｎｔｅｃｈ（パロアルト、カリフォルニア州）による標識ＯＮ試薬は、オリゴヌクレオチドのリン酸主鎖全体に点在した標識と、３’および５’末端における末端標識を与える。本明細書の実施例で示すように、標識はリボース環の位置に添加可能であり、リボースは希望通りに変更、そして削除することさえ可能である。有用な標識試薬の塩基部分は、加えられた目的を阻害しない方法で、天然型または改良型の塩基部分を含むことができる。改良された塩基は、これに限定されるわけではないが、７−ｄｅａｚａ ＡおよびＧ、７−ｄｅａｚａ−８−ａｚａ ＡおよびＧ、その他のヘテロ環部分を含む。
【０１３７】
蛍光標識は単一種の有機分子に限定されないが、無機分子、有機および／または無機分子の多分子混合物、水晶、ヘテロポリマーなどを含むことが認識される。したがってたとえば、シリカシェル内に包囲されたＣｄＳｅ−ＣｄＳコアシェルナノクリスタルは、生体分子に結合させるために容易に誘導体化できる（Ｂｒｕｃｈｅｚら，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：２０１３−２０１６）。同様に、蛍光度の高い量子ドット（硫化亜鉛キャップセレン化カドミウム）は、超高感度生物検出で使用するために、生物分子に共有結合されている（Ｗａｒｒｅｎ ａｎｄ Ｎｉｅ（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２８１：２０１６−２０１８）。
【０１３８】
Ｅ）ＣＹＰ２４に対する抗体
ポリクローナルまたはモノクローナル抗体のどちらも、本明細書で述べる発明の免疫学的検定および治療方法に使用できる。ポリクローナル抗体は、実質的に純粋なＣＹＰ２４ポリペプチドまたは抗原ＣＹＰ２４ポリペプチドを、適切なヒト以外の哺乳動物に複数回注射（たとえば皮下または筋肉注射）することによって上昇させることが好ましい。ＣＹＰ２４ペプチドの抗原性は、ペプチドを用いて免疫化された動物の抗体反応の大きさを決定する従来の方法によって決定できる。一般に、ＣＹＰ２４抗体の上昇に使用されるＣＹＰ２４ペプチドは、ＣＹＰ２４に比較的高い親和性を持つ抗体の高い力価を生成させる、ＣＹＰ２４ペプチドであることが望ましい。
【０１３９】
所望ならば、免疫化ペプチドを、当業界で周知の方法を用いて、接合によって担体タンパク質に結合させてもよい。このような、一般に使用される担体は、キーホールリンペットヘマシアニン（ＫＬＨ）、サイログロブリン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、破傷風トキソイドなどが含まれ、ペプチドに化学的に結合される。結合ペプチドは次に、動物（たとえばマウスまたはウサギ）の免疫化に用いる。ＣＹＰ２４は哺乳類種で保存されるため、ＣＹＰ２４タンパク質の免疫原性を高めるために担体タンパク質を使用することが好ましい。次に哺乳動物から採取した血液サンプルより、抗体を得る。ポリクローナル抗体の作成に使用する技法は、当業界で既知である（たとえば、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ， Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｎｔｉｓｅｒａ Ｗｉｔｈ Ｓ ｍａｌｌ Ｄｏｓｅ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ：Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ， Ｌａｎｇｏｎｅら編（Ａｃａｄ． Ｐｒｅｓｓ， １９８１）を参照）。動物より生成されるポリクローナル抗体は、たとえば抗体が上昇されたペプチドが結合するマトリックスへの結合と溶離によって、さらに精製できる。
【０１４０】
当業熟練者にとっては、モノクローナル抗体と同様に、ポリクローナル抗体の精製および／または濃縮の免疫学的技術において一般的な各種技術は既知であろう。たとえば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ら，（１９９１）， Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅを参照。
【０１４１】
しかし、生成されるＣＹＰ２４抗体は、モノクローナル抗体（「ｍＡｂ」）であることが好ましい。モノクローナル抗体を調製する場合、８匹のマウスまたはラットを免疫化することが好ましい。「抗体」という語は、本明細書で使用されるように、エピトープ決定基を結合可能な、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２などの無傷の細胞はもちろんのこと、そのフラグメントを含む。またこの文脈において、「本発明のｍａｂ」という語は、ＣＹＰ２４に特異性を持つモノクローナル抗体を指す。
【０１４２】
ハイブリドーマスクリーニングｍＡｂの生成に用いる一般的な方法は周知である（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ， ２５６：４９５）。簡単には、ＫｏｈｌｅｒとＭｉｌｓｔｅｉｎが述べているように、方法は、メラノーマ、奇形癌、または子宮癌、神経膠腫、肺癌に罹患した５名の個別の癌患者の、流入領域リンパ節からリンパ球を単離することと（サンプルは外科試料より得た）、細胞をプールすることと、ＳＨＦＰ−１によって細胞を融合させることより成る。ハイブリドーマは、癌細胞系に結合する抗体の生成についてスクリーニングした。
【０１４３】
ｍＡｂ間のＣＹＰ２４特異性の確認は、興味のあるｍＡｂの初期反応パターンを判定するために、比較的ルーチン的なスクリーニング技法（酵素結合免疫吸着剤アッセイ、すなわち「ＥＬＩＳＡ」）を用いて行える。
【０１４４】
試験するｍＡｂによって本発明のｍＡｂの、上で述べたように単離されたＣＹＰ２４への結合が阻害されるかどうか判定することによる不要な実験を行わずに、ｍＡｂが本発明のｍＡｂと同じ特異性を持っているかどうか判定するためにｍＡｂを評価することも可能である。本発明のｍＡｂによる結合の低下で示されるように、試験されるｍＡｂが本発明のｍＡｂに競合する場合、２つのモノクローナル抗体は、同じまたは密接に関連するエピトープに結合しやすい。ｍＡｂが本発明のｍＡｂの特異性を持つかどうか判定する、また別の方法は、本発明のｍＡｂを、通常反応性である抗原を用いて事前にインキュベートし、試験されるｍＡｂが抗原に結合する能力を阻害されるかどうかを判定することである。そして、試験されるｍＡｂが阻害されれば、そのｍＡｂはおそらく、本発明のｍＡｂと同じ、または密接に関連するエピトープ特異性を持っている。
【０１４５】
抗体フラグメント、たとえば単鎖抗体（ｓｃＦｖまたはその他）も、ファージ表示技術を用いて生成／選択できる。細菌に感染するウィルス（バクテリオファージまたはファージ）の表面に抗体フラグメントを発現する能力によって、１０ １０を超える非結合クローンのライブラリから単結合抗体フラグメントを単離することができる。ファージ表面に抗体フラグメントを発現するために（ファージ表示）、抗体フラグメント遺伝子を、ファージ表面タンパク質（ｐＩＩＩ）をコード化する遺伝子に挿入すると、抗体フラグメント−ｐＩＩＩ融合タンパク質がファージ表面に表示される（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １９：４１３３−４１３７）。
【０１４６】
ファージ表面の抗体フラグメントは機能性であるため、抗体フラグメントを結合するファージ保持抗原は、抗原親和性クロマトグラフィーによって非結合ファージから分離できる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ， ３４８）。抗原フラグメントの親和背によって、１回の親和性選択について、２０〜１００００００倍の濃縮因子が得られる。しかし、溶出ファージによって細菌に感染させると、さらにファージが成長し、もう１回選択を行うことができる。このようにして、１回で１０００倍の濃縮が、２回の選択で１００００００倍になり得る（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ， ３４８：５５２−５５４）。したがって濃縮が低い場合でも（Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７）、複数回の親和性選択によって、まれなファージを単離することができる。抗原に対するファージ抗体ライブラリの選択によって濃縮されるため、クローンの大半は、３，４回という少ない選択の後に抗原に結合する。したがって、抗原への結合を分析するのに必要なのは、比較的少数のクローン（数百）である。
【０１４７】
ヒト抗体は、ファージに対する非常に巨大で多様なＶ遺伝子レパートリを表示することによって、事前に免疫化を行わずに生成できる（Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７）。ある実施態様において、ヒト末梢血リンパ球に存在する天然ＶＨおよびＶＬレパートリは、免疫化されていないドナーからＰＣＲによって単離された。Ｖ遺伝子レパートリはＰＣＲを用いて無作為にスプライスされ、ｓｃＦｖ遺伝子レパートリが作成され、これをファージベクター内でクローニングして、３０００万のファージ抗体のライブラリ（Ｉｄ．）が作成された。この１つの「ナイーブ」なファージ抗体ライブラリから、結合抗体フラグメントがハプテン、多糖類、タンパク質を含む１７を超える異なる抗原に対して単離された（Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７；Ｍａｒｋｓら，（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：７７９−７８３；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，（１９９３）ＥＭＢＯＪ １２：７２５−７３４；Ｃｌａｃｋｓｏｎら，（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４−６２８）。抗体は、ヒトサイログロブリン、免疫グロブリン、腫瘍壊死因子およびＣＥＡを含む自己タンパク質に対して生成されていた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，（１９９３）ＥＭＢＯＪ １２：７２５−７３４）。無傷の細胞で直接選択することによって、細胞表面抗原に対する抗体を単離することも可能である。抗体フラグメントは、選択に用いる抗原に対して高度に特異性であり、１〜１００μＭの範囲の親和性を持つ（Ｍａｒｋｓら，（１９９１）Ｊ． Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ． ２２２：５８１−５９７；Ｇｒｉｆｆｉｔｈら，（１９９３）ＥＭＢＯＪ １２：７２５−７３４）。ファージ抗体ライブラリが大きくなると、さらに多くの抗原に高い結合親和性を持つ、さらに多くの抗体を単離することができるようになる。
【０１４８】
ＣＹＰ２４抗体は、多数の市販サービスを用いても調製できることも認識されるであろう（たとえばＢｅｒｋｌｅｙ抗体研究所、Ｂｅｔｈｙｌ研究所、Ａｎａｗａ、Ｅｕｒｏｇｅｎｅｔｉｃなど）。
【０１４９】
ＩＩ． 重要であると予想されるレベルを最適化−測定する分析
この発明の分析は、癌の可能性検出／予知することに、癌から生存を予測することに、ＣＹＰ２４活性を調整する薬品のスクリーニングに、そして細胞の増殖を抑制する薬品のスクリーニングにすぐに役立つ。特に、例えば、ＣＹＰ２４（ゲノムＤＮＡ）の増幅の識別は癌の存在および／または癌の進行に対する素因を示している。
【０１５０】
予言的な／診断検定を最適化するの方法は、当業者には十分に知られている。一般的には、この測定には、正常組織のレベルおよび病理学（例えば、癌組織）のＣＹＰ１４活性レベルにおける「基準レベル」（例えば、ＣＹＰ２４の）を測定することが含まれる。特に好ましい実施の形態では、そのようなレベルを、共存するＶＤＲ活性、サンプルの種類、年齢、性、進行状態、全体的な生理学的な状態（例えば、妊娠している女性に比べて妊娠していない女性）、全足し的な健康、腫瘍のタイプ等について、適切なコントロールを使って測定する。好ましい実施の形態では、「基準線」（例えば、コントロール）レベルは、（同じ個人からのまたは同じ住民の人達からの正常な（健康な）組織から測定される。代わりに、「基準線」と「異常である」レベルは、「上述で確認され多さまざまな共同因子（年令、健康、性など，）の影響を統計的に評価できる充分なサンプルの大きさと多様性を提供する「住民」研究から決定される。「基準線」 ＣＹＰ２４レベルを、例えば、実施例３−５で記述したように、モデル系を参考にして評価することもできる。
【０１５１】
好ましい実施の形態では、その測定したＣＹＰ２４レベルが、コントロールサンプルの測定したまたは既知のレベルよりも大きいとき（例えば、同じ種の正常で健康な哺乳動物についての既知のまたは測定されたレベル、或いは同じ個人についての異なる組織および／または異なる時間で測定された「基準線／参照レベルのいずれか」、ＣＹＰ２４レベルの定量的検定は陽性の結果、例えば、上昇したＣＹＰ２４レベルを示すように思われる。特に好ましい実施の形態では、サンプルと「コントロール」の間の差が統計的に重要である（例えば、８５％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、そして最も好ましくは９８％以上の信頼できるレベル）である場合、検定は陽性の結果を示すように思われる（例えば、予知できる重要なレベル）。
【０１５２】
ＩＩＩ．癌を処理する方法−ＣＹＰ２４レベルに基づいた補助治療の選択
癌の存在、または進展の素因を評価する能力のために、本発明の検定は癌治療養生法の有用な構成要素になる。従って、一つの実施の形態では、ＣＹＰ２４の活性を病気の進行の手段として使うことができるけれど、一方別の実施の形態では、ＣＹＰ２４活性は補助治療の必要性を評価するのに使用されている。「補助の癌治療」は、癌処理のもう一つの方法と組み合わせて、またはその後に続いて施される化学療法、放射線治療、外科学、再手術、反ホルモン治療、および、免疫療法のように癌を処理することの方法を当てはまる。「補助の癌治療」は、対照レベルと比較すると高められている、ＣＹＰ２４の生存が下がっているという期待あるいは検出されたレベルを考慮して選ばれる癌処理の積極的な形態を表すことが多い。補助治療法は当業者にはよく知られていて、そして、化学療法、放射線治療、一次手術または再手術、反ホルモン治療、免疫療法などを含むけれど、それに限定されない。この状況で用いられる「化学療法」は、動物の中の癌細胞の数を殺すことまたは減らすことを目的にした、癌を持つ動物への化学物質の投与に当てはまる。一般に、化学療法剤は、癌細胞のような分裂しているすなわち増殖している細胞の成長を抑えたり、またはそういう細胞を殺す。癌に対して使用される化学療法剤は、当業者にはよく知られており、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ゲニステインなどが含まれるが、それらに限定されない。
【０１５３】
この状況での「放射線治療」は、癌を持つ動物へ放射線の投与に当てはまる。放射線は、癌細胞のような、分裂する細胞の増殖を殺すか、抑制する。外の発生源（例えば、ｇａｍｎ発生源、プロトン発生源、分子線発生源など）によって、または移植可能放射性物質によって投与することができる。放射線治療には、腫瘍容積を減少させるかまたは除去することを目的とする「伝統的な」放射線処理、またはより積極的な放射線外科技術がある。
【０１５４】
外科手術の方法は、動物から、細胞、例えば、癌細胞の直接的な除去、または切断に当てはまる。その癌細胞は、ほとんど、腫瘍の形（例えば、乳房の腫瘍）であり、動物から取り除かれる。外科手術方法には、異常の組織だけでなく健康な組織の除去も伴う可能性がある。「再手術」は、同じ病理学の処理のための手術を以前に受けた動物に行なわれる手術に当たる。
【０１５５】
「抗ホルモン治療」は、細胞に対してミトゲン効果を有するエストロゲンまたはアンドロゲンのようなホルモンに対向するまたは抑制する化合物の投与に当たる。しばしば、これらのホルモンは、生体内で癌細胞の癌性特性を増大させるように作用する。
【０１５６】
免疫療法は、動物の中で癌細胞を破壊するために動物の免疫系の能力を高める方法に当たる。この方法には、免疫系エフェクターの細胞障害抗体を腫瘍目標に向けるのに役立つ腫瘍に特有のマーカ（例えば、ＩＬ−１３レセプターおよびルイスＹ（Ｌｅｖ）マーカなど）を結合するポリクローン抗体、またはモノクローナル抗体による処理を含むことができる。免疫療法の方法は、当業者にはよく知られている（例えば、Ｐａｓｔａｎ ら（１９９２） Ａｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．， ６１：３３１−３５４、 ＢｒｉｎｋｍａｎおよびＰａｓｔａｎ （１９９４） Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ Ｂｉｐｈｙｓｆｃａ Ａｃｔａ， １１９８： ２７−４５などを参照）。
【０１５７】
ＩＶ．治療法のスクリーニング
ＣＹＰ２４活性（ビタミンＤレセプター活性の所定のレベルで）の低く規制することが癌の進行を防ぐために予防として作用する、および／または癌を減らすまたは除去するように治療として作用すると期待されるということも、本発明の発見であった。従って、１つの実施の形態では、本発明は、ＣＹＰ２４の活性を調整し、そして好ましくは低く規制する薬品をスクリーニングする方法を提供する。この状況で用いられる低く規制するということは、ＣＹＰ２４転写の減少、および／またはＣＹＰ２４翻訳の減少および／またはＣＹＰ２４ポリペプチド活性の減少である。
【０１５８】
この発明の好ましい「スクリーニング」の方法は、試験薬品エージェントを持つＣＹＰ２４を表している細胞（例えば、ＣＹＰ２４を表すことが可能な細胞）を試験薬品と接触指せること、そして（ｉｉ）ＣＹＰ２４活性のレベルを検出すること（例えば、上述のように）を含んでおり、その場合、その薬品と接触していない細胞中のＣＹＰ２４活性のレベルと比較して、低いレベルのＣＹＰ２４活性は、その薬品がＣＹＰ２４活性を抑制しているまたは低く規制しているということ、および／またはその細胞の増殖を抑制しているということを示している。実質的に、そのような検定で、どんな薬品もを検査をすることができる。
そのような薬品には、自然のまたは合成された核酸、自然のまたは合成されたポリペプチド、自然のまたは合成物されたリピド、自然のまたは合成された小さい有機分子などが含まれるが、それに限定されない。一つの好ましい形には、試験薬品は組み合わせライブラリーとして提供される。
【０１５９】
Ａ）組み合わせライブラリー（例えば、小さい有機分子）。
慣例的には、有益な性状を持つ新しい化学物体は、望ましい性質または活性を持つ化学物質（「鉛化合物」と呼ばれる）確認し、鉛化合物の変異体を作り出し、そしてこれらの異なる化合物の性状と活性を評価することによって、生成される。しかしながら、現在は、薬剤発見の全ての態様について時間を短くする傾向にある。多くの試験を速くしかも効率的に試験する能力のために、高処理能力のスクリーニング（ＨＴＳ）方法が伝統的な鉛化合物識別方法に取って代わっている。
【０１６０】
一つの好ましい実施の形態で、高処理能力スクリーニング方法には、多数の潜在的治療化合物（候補化合物）を含むライブラリーを提供することが含まれる。次ぎに、そのような「組み合わせの化学ライブラリー」を、望ましい特性の活性を示すこれらの構成物（特に、化学種又は副分類）を確認するために下記に記述するような、一つまたはそれ以上の分析でスクリーニングする。こうして確認された化合物は、伝統的な「鉛化合物」として役立つことができ、またはそれだけで潜在的なまたは実際の治療法として使うことができる。
組み合わせ化学ライブラリーは、試薬のような多数の化学的「構成ブロック」を組み合わせることによる化学的合成または生物学的合成のいずれかによって生成された多様な化学物質の集積である。例えば、ポリペプチド（例えば、突然変異蛋白質）ライブラリーのような線状の組み合わせ化学ライブラリーは、アミノ酸と呼ばれる１組の化学構成ブロックを、所定の化合物の長さ（すなわち、ポリペプチド化合物のアミノ酸の数）にあらゆる可能な方法で組み合わせることによって生成される。そのような化学構成ブロックの組み合わせ混合物を通して、無数の化学化合物を合成することができる。例えば、１人の注釈者は、１００の交換可能な化学構成ブロックの系統的な組み合わせ混合物で、理論的に１億の四量体化合物、または１Ｏ０億の五量体化合物を合成するという結果になるということを観察した（Ｇａｌｌｏｐら， （１９９４） ３７（９）： １２３３−１２５Ｏ）。
組み合わせの化学ライブラリーの調製とスクリーニングは当業者にはよく知られている。
【０１６１】
そのような組み合わせの化学ライブラリーには、ペプチドライブラリーが含まれるが、それに限定されない（米国特許第 ５，０１０，１７５、 Ｆｕｒｋａ （１９９１） Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔ． Ｒｅｓ．， ３７： ４８７−４９３、 Ｈｏｕｇｈｔｏｎら （１９９１） Ｎａｔｕｒｅ， ３５４： ８４−８８を参照）。ペプチド合成は、決して、本発明で使用するために考えられ、意図される唯一の手法ではない。化学的多様性ライブラリーを生成するための他の化学的性質を使うこともできる。そのような化学的性質には、ペプトイド（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ ＷＯ ９１／１９７３５， ２６ Ｄｅｃ． １９９１）、コード化したペプチド（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９３／２０２４２， １４ Ｏｃｔ． １９９３）、任意のバイオオリゴマー（ＰＣＴ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ＷＯ ９２／０００９１， ９ Ｊａｎ． １９９２）、ベンゾジアゼビン（米国特許第５，２８８，５１４号）、ヒダントイン、ベンゾジアゼビンおよびジペプチドのようなダイバーソマー（Ｈｏｂｂｓら、（１９９３年）（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０： ６９０９−６９１３）、ｖｉｎｙｌｏｇｏｕｓポリペプチド（Ｈａｇｉｈａｒａら（１９９２）Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：６５６８）、ベータ−Ｄ−グルコースを持つｎｏｎｐｅｐｔｉｄａｌ ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃｓ（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎら， （１９９２） Ｊ． Ａｍｅｒ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１４： ９２１７−９２１８）、小さい合成ライブラリーの相似の有機合成（Ｃｈｅｎら、（１９９４）Ｊ． Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ．１１６：２６６１）、オリゴカルバメイト（Ｃｈｏら、（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１ ： １３０３）、および／またはリン酸ペプチディル（Ｃａｍｐｂｅｌｌら、（１９９４）Ｊ． Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５９：６５８．）。一般に、Ｇｏｒｄｏｎら， （１９９４） Ｊ． Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７： １３８５を参照、核酸ライブラリー（例えば、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ、Ｃｏｒｐ．を参照）、ペプチド核酸ライブラリー（例えば、米国特許第５，５３９，０８３号参照）、抗体ライブラリー（例えば、Ｖａｕｇｈｎら、（１９９６） Ｎｅｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ， １４（３）： ３０９−３１４、およびＰＣＴ／ＵＳ９６／１０２８７を参照）、炭水化物ライブラリー（例えば、 Ｌｉａｎｇら、（１９９６） Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２７４： １５２０−１５２２、および米国特許第５，５９３，８５３を参照）および小さい有機分子ライブラリー（例えば、ベンゾジアゼピンはＢａｕｍ （１９９３） Ｃ＆ＥＮ， Ｊａｎ １８， ３３頁、イソプレノイドは米国特許第５，５６９，５８８号、チアゾリジノンおよびメタチアゾノンは米国特許第５，５４９，９７４号、ピロリジンは米国特許第５，５２５，７３５号および５，５１９，１３４号、モノホリノ化合物は米国特許第５，５０６，３３７号、ベンゾジアゼピンは第５，２８８，５１４号など）。
【０１６２】
組み合わせライブラリーの調製装置は、市販されている（例えば、３５７ＭＰＳ、３９０ＭＰＳ、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍ Ｔｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ ＫＹ，Ｓｙｍｐｈｏｎｙ， Ｒａｉｎｉｎ， Ｗｏｂｕｍ． ＭＡ， ４３３Ａ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ， Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ， ＣＡ， ９０５Ｏ Ｐｌｕｓ， Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｂｅｄｆｏｒｄ， ＭＡを参照）。
【０１６３】
多数のよく知られたロボット体系も、溶液相の化学的性質のために開発された。これらの装置には、ロボットアームを利用する武田薬品工業（日本の大阪）により開発された自動合成装置のような自動ワークステーション、および化学者によって行なわれた手動の合成操作を真似るロボットアームを利用する多くのロボット装置（Ｚｙｍａｔｅ ＩＩ， Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， Ｍａｓｓ．； Ｏｒｃａ， Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ， Ｃａｌｉｆ．）がある。
【０１６４】
前述の装置のどれでも、本発明で使用するのに適している。本明細書で論じたように操作することができるようにこれらの装置の修正について特性と実行は、関連業者には明らかである。その上に、多数の組み合わせライブラリーそのものが市販されている（例えば、ＣｏｍＧｅｎｅｘ， Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ， Ｎ．Ｊ．， Ａｓｉｎｅｘ， Ｍｏｓｃｏｗ， ＲＵ， ｔｒｉｐｏｓ， ＩＮｃ．， Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ， ＭＯ， ＣｈｅｍＳｔａｒ， Ｌｔｄ， Ｍｏｓｃｏｗ， Ｒｕ， ３Ｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｅｘｔｏｎ， ＰＡ， Ｍａｒｔｅｋ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｃｏｌｕｍｂｉａ， ＭＤなどを参照）。
【０１６５】
Ｂ）高速選別分析
本願明細書において記載されているＣＹＰ２４の水準を調整している化合物に対するどんな分析法でも高速選別分析が可能である。したがって、好ましい分析法であれば、ＣＹＰ２４遺伝子転写 の増進または阻害、ＣＹＰ２４ポリペチド形質発現の増進または阻害、およびＣＹＰ２４ポリペチド活動の阻害または増進を検出する。（与えられたＶＤＲ活動水準において）。
特定の核酸またはタンパク産物の存在、非共存または定量化のための高速選別法は、当業者にとって周知である。同様に、結合分析およびリポータ・ジーン・アッセイも周知である。たとえば、米国特許第５，５５９，４１Ｏ号には、タンパク質用高速選別法が開示されている。また、米国特許第５，５８５，６３９号には結合（すなわち配列において）核酸に対する高速選別法が開示されている。一方、米国特許第５，５７６，２２０号および第５，５４１，０６１号にはリガンド／抗体結合用高速選別法が開示されている。
【０１６６】
加えて、高速選別セットは市販されている（例えば Ｚｙｍａｒｋ Ｃｏｒｐ．， Ｈｏｐｋｉｎｔｏｎ， ＭＡ や Ａｉｒ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｍｅｎｔｏｒ，ＯＨ や Ｂｅｃｋｍａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ， Ｉｎｃ． Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ， ＣＡ や Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．， Ｎａｔｉｃｋ， ＭＡ，などを参照のこと）。
【０１６７】
これらの装置は、概して全てのサンプルおよび試薬のピペット操作、液体調剤、時限式インキュベーションおよび分析に適した検知器中マイクロプレートの最終的な読み込みを含む全ての手順を自動化している。
これらの設定可能装置は、高度な柔軟性および使用者用の設定および高速分析と急速立ち上げが可能である。かかる装置の製造業者は、各種の高速分析装置用に詳しいプロトコルを提供している。たとえば、Ｚｙｍａｒｋ社は、遺伝子転写、リガンド結合、などの転形を検出するための選別装置を記載している技術文書を提供している。
【０１６８】
Ｖ．細胞中活動水準の低減
もう一つの実施例においては、本発明は細胞のＣＹＰ２４活動水準を低減する方法を提供している。この文脈では、ＣＹＰ２４活動の低減とは、「未処置」条件の同じ細胞と比較したＣＹＰ２４活動の低減である。より好ましくは、ＶＤＲ活動の同じ水準での同じ細胞と比較して、あるいはＶＤＲ活動のために標準化してである。
【０１６９】
特定の遺伝子または遺伝子産物の活動水準を低減する方法は、当業者にとって周知である。かかる方法は、例えばアンチセンス分子またはリボザイムの使用、ターゲッティング転写因子（例えば抗体またはＤＮＡ結合タンパクで）、およびポリペチド産物（例えば不活性な結合剤（例えば突然変異蛋白質）との競合によって）を目標とすること、直接型ブロッキング（例えばそばに抗体または他リガンドを有するバインディング、その他）によるターゲッティング転写または翻訳を含むが、これに限定されるものではない。
【０１７０】
Ａ）アンチセンス分子
ＣＹＰ２４活動は、刺激に対する反応を抑制されることができるかまたは、アンチセンス分子の使用によって、完全に抑制されることができる。「アンチセンス配列またはアンチセンス核酸」は核酸である。そして、符号化ＣＹＰ２４メッセンジャーＲＮＡに対する補足性は核酸一次構造またはその結果である。ＣＹＰ２４メッセンジャーＲＮＡにアンチセンス分子を結合すると、ＣＹＰ２４ポリペチドの正常翻訳を妨げる。
【０１７１】
かように、本発明の好適な実施例に従えば、好ましいアンチセンス分子は、ＣＹＰ２４メッセンジャーＲＮＡとハイブリッド可能な核酸（例えばオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド類似体）を含む。この関係は一般に「アンチセンス」と命名される。アンチセンスの核酸類似体は、ＲＮＡの機能、すなわちタンパク質への翻訳、細胞質へのトランスロケーション、またはその全体的な生物学的機能に必要な他のいかなる活動をも禁ずることができる。メッセンジャーＲＮＡがその機能の全部または一部を遂行するのに失敗するとＣＹＰ２４ポリペプチドの発現が減少するかまたは完全に抑制される。
【０１７２】
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、自然に生成する塩基および／またはホスホジエステル結合でつながれるシクロフラノシル群から形成されるポリヌクレオチドを指す。この用語は、自然に発生しているサブユニットまたはそれらに近い相同物から形成される自然発生種または合成種に効果的に関連する。用語「オリゴヌクレオチド」は、また、オリゴヌクレオチドに類似して機能するが自然には発生しない部分を有する部分を指すこともある。したがって、オリゴヌクレオチドは糖の一部分または糖内の結合をかえるかもしれない。これらの中で典型的なのはホスホロチオネート及びそのたの当業者には公知である硫黄を含有している種である。若干の好適な実施例に従えば、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル結合の少なくとも１つは、活性が調整されることになっているＲＮＡが位置する細胞領域に入り込む組成物の能力を高めるように機能する構造で置換されている。この種の置換がホスホロチオネート結合、メチルホスホネート結合または短いチェーン・アルキルまたはシクロアルキル組織を含むことは好ましい。他の好適な実施例に従えば、ホスホジエステル結合は実質的に非イオン性でキラルでない構造またはキラルで光学異性体的に特殊な構造によって置換されている。当業者が、本発明を実施するに当たり他の結合を選択することは可能である。
【０１７３】
オリゴヌクレオチド類は、又少なくともある種の修飾された塩基型を含む種類を含んでもよい。このようにして、自然界に通常見出される以外のプリンとピリミジンとを用いることが可能である。 同様に、ヌクレオチドのサブユニットのフラノシル部分で、この発明の本質的な主義が守られる限り、修飾があっても良い。そのような修飾の例は、２‘−アルキルー及び２’−ハロゲンー 置換ヌクレオチドである。本発明において、有用な糖部分の２‘位置での修飾のいくつかの特定の例としては、ＯＨ，ＳＨ，ＳＣＨ_３， Ｆ，ＯＣＨ_３，ＯＣＮ，Ｏ（ＣＨ_２）〔ｎ〕ＮＨ_２、又は、Ｏ（ＣＨ_２）〔ｎ〕ＮＨ_３であり、そこでｎは、１−約１０であり、そして、他の置換基は同様な性質を持つ。
【０１７４】
そのようなオリゴヌクレオチドは、天然のオリゴヌクレオチド或いは、天然のラインに沿ってはいるが、天然の構造とは、１つ或いは、それ以上の相違のある合成のオリゴヌクレオチドと、機能的に相互変換が可能なものとして、描くのが最善である。全てのそのような類縁体は、ＣＹＰ２４のメッセンジャーＲＮＡと効果的にハイブリダイズして、そのＲＮＡの機能を阻害するために機能する限り、この発明によって包含される。
【０１７５】
この発明と一致したオリゴヌクレオチドは、好ましくは、約３−約１００のサブユニットからなる。より好ましくは、その様なオリゴヌクレオチドと類縁体は、約８−約２５のサブユニットからなり、更に好ましくは、約１２−約２０のサブユニットを持つ。 認められるように（評価されるように）、１つのサブユニットは、１つのホスホジエステル或いは、他の結合を介して、隣接したサブユニットに適切に結合した、塩基と糖の組み合わせである。この発明に合致して用いられるオリゴヌクレオチド類は、既知の個相合成の技術によって、簡便に通例的に作られる。その様な合成用の装置は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含めたいくつかの業者で販売されている。そのような合成のいかなる他の手段も又用いられることが可能である。しかしながら、オリゴヌクレオチド類の実際の合成は、日常的に実施している人の能力の十分、範囲内である。ホスホロチオエート及び、アルキル化された誘導体のようなほかのオリゴヌクレオチド類の調製もまた当業者に良く知られている。
【０１７６】
Ｂ） リボザイム
アンチセンス分子に加えて、リボザイムは、ＣＹＰ２４の転写をターゲットとし、阻害するために用いることが可能である。リボザイムは、他のＲＮＡ分子を触媒的に切断するＲＮＡ分子である。異なった種類のリボザイムはが記述されてきている。これらは、グループ１リボザイム、槌型リボザイム、ヘアピンリボザイム、ＲＮＡｓｅＰ、及び、斧型リボザイムを含む。（種々のリボザイムの性質に関する概説は、Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ その他（１９９４） Ａｄｖ． ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ２５： ２８９−３１７を参照のこと）。
【０１７７】
ヘアピンリボザイムの一般的な特徴については、例えば、Ｈａｍｐｅｌその他 （１９９０） Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． １８：２９９−３０４； Ｈａｍｐｅｌ その他 （１９９０）ヨーロッパ特許公報Ｎｏ．０ ３６０ ２５７； アメリカ合衆国特許Ｎｏ，５，２５４，６７８に記載されている。調製の方法は、当業者に良く知られている。（例えば、Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ その他，ＷＯ９４／２６８７７；Ｏｊｗａｎｇ その他 （１９９３） Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９０：６３４０−６３４４； Ｙａｍａｄａ その他 （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ １：３９−４５； Ｌｅａｖｉｔｔｅ その他 （１９９５）Ｐｒｏｃ， Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９２；６９９−７０３； Ｌｅａｖｉｔｔ その他 （１９９４） Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５： １１５１−１２０； 及び、Ｙａｍａｄａ その他（１９９４） Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ２０５：１２１−１２６を参照のこと）
【０１７８】
Ｃ）ＣＹＰ２４ポリペプチド活性の拮抗的阻害
例えば、与えられたＶＤＲ活性レベルでのＣＹＰ２４活性は、ＣＹＰ２４ポリペプチドの拮抗的阻害剤を与えることにより、減少されうる。これは、もっとも簡単に２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−水酸化酵素活性に欠けるＣＹＰ２４ポリペプチドを与えることにより達成される。
【０１７９】
不活性なポリペプチド変更体（突然変異たんぱく質）を作る方法は、当業者にはよく知られている。（例えば、アメリカ合衆国特許５，４８６，４６３ ５，４２２，２６０， ５，１１６，９４３， ４，７５２，５８５， ４，５１８，５０４を参照のこと）。そのようなポリペプチドのスクリーニング（例えば、上記のアッセイにおける）は、単に通常の実験操作で達成することが可能である。ここに、上述したように、ハイスループット方法を用いて、事実上数千の作用物質を僅か１日か２日でスクリーニングすることが可能である。
【０１８０】
Ｄ）内在性ＣＹＰ２４発現を調節するプロモーターの修飾
更に他の実施例では、ＣＹＰ２４の発現は、内在性プロモーターを改変することによって変化させることが可能である。内在性遺伝子の発現を変化させる方法は、当業者に良く知られている。一般的にその様な方法は調節される特定の遺伝子の発現を制御する調節配列の全体あるいは、一部を改変或いは、置換することを含む。好的実施例では、ＣＹＰ２４の上流にある調節配列（例えば、本来のプロモーター）を改変する。
【０１８１】
これは、相同組換えを利用して、本来の調節配列に異種の核酸を導入することにより、一般に達成される。ＣＹＰ２４遺伝子産物の発現をダウンレギュレートするためには、読み取り枠を改変するかプロモーターを破壊するかのいずれかである単純な突然変異が適切である。
【０１８２】
特に好適実施例では、問題とする構造遺伝子あるいは、上流配列を形成する核酸配列が非相同組換え構造体をターゲットとするために用いられる。内在性遺伝子の発現を改変するための相同組換えの利用は、アメリカ合衆国特許５，２７２，０７１，ＷＯ ９１／０９９５５， ＷＯ ９３／０９２２２， ＷＯ ９６／２９４１１， ＷＯ ９５／３１５６０ 及びＷＯ ９１／１２６５０に詳しく記載されている。
【０１８３】
Ｅ）他の分子の利用
ＣＹＰ２４活性をダウンレギュレートするために、他の数多くの手段をとることが可能である。上述したように、特にハイスループットスクリーニング方法を用いて、事実上数千の化合物をＣＹＰ２４活性の改変（例えば、ダウンレギュレート）能力について、試験することが可能である。上述で同定された化合物又は、そのようなスクリーニング系で同定された化合物の１つ或いはそれ以上のものは、どれでもＣＹＰ２４活性を調節するのに用いることが可能である。
【０１８４】
Ｆ）ＣＹＰ２４調節物質の投与
ＣＹＰ２４活性を調節（例えば、ダウンレギュレート）する化合物は種々の方法で投与されうる。 これらは予防的及び ／ 或いは治療的処置のために非経口、局所、経口、或いはエアロゾルや経皮のような局部投与を含むが、これらに限定されるものではない。 医薬組成物は投与方法に応じて種々の単位剤型で投与されうる。 例えば経口投与に適した単位剤型は粉末剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、トローチ剤を含む。 ＣＹＰ２４調節剤（例えば、 抗体、 アンチセンス構成体、 リボザイム、 有機低分子等）は経口投与される際、 消化から防御されなくてはならない。 このことは典型的にはその分子（類）を酸性加水分解や酵素的加水分解に抵抗性を付与する組成物わで複合体化するか、 或いはその分子（類）をリポソームのような適切な抵抗性担体に包含させることによって成就されうる。 消化保護剤の手段は当業者に良く知られている。
【０１８５】
投与組成物は通常、 薬学的に許容されうる担体、 好ましくは水溶性担体に溶解したＣＹＰ２４調節剤からなる。 種々の水溶性担体、 例えば緩衝化された食塩水等を使うことができる。 これらの溶液は無菌で、 一般に不要物を含まない。 これらの組成物は通常の、良く知られた無菌操作によって無菌化される。 その組成物にはｐＨ調製剤や緩衝剤、毒性調整剤等のような生理条件に近似させるのに必要な薬学的に許容される補助剤、たとえば酢酸ナトリウム、 食塩、 塩化カリウム、 塩化カルシウム、 乳酸ナトリウム等、 を含んでいても良い。これらの製剤における活性物質の濃度は広範囲にわたり、 選ばれる特定の投与形態と患者の必要に応じて、 主として溶液容積、 粘度、 体重等に基づいて選択される。
【０１８６】
このようにして、 静脈投与用の典型的な薬剤組成は１患者１日あたり約０．１から１０ ｍｇとなる。 特に薬物が体腔や臓器の内腔のような隔離された場所で、 血流ではないところに投与される場合には、 １患者１日当たり０．１から約１００ ｍｇ の投与量を使いても良い。 局所投与では本質的に、より高用量が可能である。非経口的に投与可能な組成物を調製する実際的な方法は当業者にとって良く知られ、 かつ明白であり、詳しくはＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ， １５ｔｈ ｅｄ．， Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ， Ｅａｓｔｏｎ， Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ（１９８０）のような刊行物に記載されている。
【０１８７】
ＣＹＰ２４の調節剤を含有する組成物は治療的、 或いは予防的処置の目的で投与されうる。 治療的応用においては、 組成物は病気及びその合併症を治癒するか、 或いは少なくとも部分的に進行を阻止するに充分な量で病気（例えば上皮癌）に苦しんでいる患者に投与される。 このことを達成するのに適した量は“ 治療有効投与量 ”と定義される。 この使用に有効な量は病気の重篤度と患者の健康の一般状態に依存している。 その組成物の単回、 あるいは多回投与は患者により必要されかつ耐えられる投与量と頻度に依存して投与される。 いずれにせよ、 その組成物は患者を効果的に治療するために本発明の薬剤の充分量を提供すべきである。
【０１８８】
ＶＩ． 診断及び ／ 或いは予後への応用に使用するキット
診断、 研究、 及び上記に示した治療的応用に使うために、 この発明によりキットが提供される。 診断と研究応用ではこのようなキットは次のような物をいくつか、 或いはすべてを含んでいても良い： アッセイ試薬、 緩衝剤、ＣＹＰ２４特異的及び ／ 或いはＶＤＲ特異的核酸類、 或いは抗体（例えば フルサイズのモノクローナル或いはポリクローナル抗体、 単鎖抗体（例えばｓｃＦｖ）、 或いは他のＣＹＰ２４やＶＤＲ結合分子類）、 及び他のハイブリダイゼーション プローブ類及び ／ 或いはプライマー類、 及び ／ 或いは２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ。治療製品は無菌食塩或いは別に薬学的に許容される乳化及び懸濁用塩基を含んでいても良い。
【０１８９】
加えて、 そのキットは本発明の方法を実施するための指針（例えばプロトコル）を含む使用説明物を包含していても良い。 使用説明物は典型的には記載物や印刷物から成るがそのようなものに限定されない。 そのような使用説明を保存することが可能でエンドユーザーに伝達することが可能なすべての媒体が本発明により意図されている。 そのような媒体には電子貯蔵媒体（例えば磁気ディスク、 テープ、 カートリッジ、 チップ）、 光学媒体（ＣＤＲＯＭ）等を含むがこれらに限定されるものではない。 そのような媒体にはそのような使用説明物を提供するインターネットサイトのアドレスを含んでも良い。
【０１９０】
実施例
以下の実施例は、特許請求された発明を制限するためではなく、例証するために提供される。
【０１９１】
実施例１
２０ｑ１３．２．での増幅のためのドライバー発ガン遺伝子としてのＣＹＰ２４の識別。
この実験は、ＣＹＰ２４の選択的な増幅を示す胸部腫瘍の遺伝子分析を記述する。腫瘍発展の間のこの遺伝子のより高いコピー数のための選択は、胸部における腫瘍の発現におけるビタミンＤ経路の重要性の更なる所見を提供する。
我々は、染色体帯域２０ｑ１３．２での再発する増幅の領域を渡ったＤＮＡコピー番号の高解像度定量的地図を得るために、比較ゲノム雑種形成の新しい高解像度種類、配列ＣＧＨを使用した。我々の研究所で開発した配列ＣＧＨは、その分析がゲノム領域（図１）にわたって目標クローンを区切ることによって決定されるように、雑種形成目標としてＤＮＡクローンの微小配列を使用する。このように、隣接するクローンが配列を構成するとき、非常に高い解像度コピー数プロフィールが得られうる。
【０１９２】
配列ＣＧＨの前例のない高いダイナミックレンジと量的精度ＣＧＨが、最初増幅された領域にわたって、コピー数プロフィールを非常に正確に描く能力を提供する。若干の腫瘍においては、コピー数プロフィールは、増幅の狭いピーク（図３において〜３００ｋｂ）を示す。この知見は、遺伝子マッピングの注意をその領域に集中させ、それらが候補ドライバー発ガン遺伝子としての評価に対して最も高い優先権を与えられなければならないことを示す。
【０１９３】
乳癌の染色体帯域２０ｑ１３．２における領域Ａにわたる高解像度配列ＣＧＨの適用は、はっきりした増幅挙動を持つ、２個のサブ領域、Ａ１およびＡ２の存在を明らかにした。最近、サブ領域Ａ１に位置付けられ、Ａ１の増幅のためのドライバー遺伝子でありそうな、候補発ガン遺伝子、ＺＮＦ２１７（コリンズら（１９９８））が同定された。それがこれらの腫瘍において最も高く増幅された狭いゲノム間隔に位置づけられるので、我々の注意は、今や領域Ａ２のためのドライバー発ガン遺伝子としての遺伝子ＣＹＰ２４に集中する。
以前は、それが乳癌細胞系ＢＴ４７４において転写されることが分からなかったので、ＣＹＰ２４は候補発ガン遺伝子として無視された（コリンズら（１９９８）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５巻：８７０３頁〜８７０８頁）。しかし、コピー数プロフィールのピークの位置の故に、およびその機能についての既存の知識の故に、細胞系と腫瘍におけるＣＹＰ２４の表現の再評価が正当化された。
【０１９４】
したがって、我々はＣＹＰ２４とビタミンＤレセプター（ＶＤＲ）の表現レベルを調べた。それは、表Ｉにリストしたプライマーを使用して、ＲＴ−ＰＣＲによるＣＹＰ２４発現を制御している。
【０１９５】
この再評価は、これらの遺伝子が乳癌細胞系と腫瘍において発現されることを示す（図３）。ＣＹＰ２４とＶＤＲの発現は、ＭＣＦ７細胞に認められ、細胞が１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａ．ｍｉｎ−Ｄ３（図３Ａ）で処理されたとき、ＣＹＰ２４の発現のより高いレベルが誘起された。さらに、ＣＹＰ２４とＶＤＲの発現は、２種の胸部腫瘍Ｓ２１とＳ５９で確認された（図３Ｂ）。
しかしＢＴ４７４では、ＣＹＰ２４発現は、培養培地への１，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ−Ｄ３の追加なしでは確認されなかった（図３Ｃ）。ＶＤＲの低レベル発現だけがこの細胞系において見つかった。これは、おそらく、たぶんｌ，２５−ｄｉｈｙｄｒｏｘｙｖｉｔａｍｉｎ Ｄ３の追加なしで、ＢＴ４７４におけるＣＹＦ２４の発現を見つけることができないことを示している。ＢＴ４７４についてのこれらの所見は、ＣＹＰ２４機能の分析の複雑さを例証し、腫瘍形成におけるＣＹＰ２４の役割を評価するとき、ＶＤＲ活性を測定することの重要性を強調している。
【表１】

＊ 増幅された製品がｍＲＮＡＦＩＳＨのためのリボプローブを生成するために試験管内転写のためのテンプレートとして使うことができるように、括弧で示されたＴ３プロモータは、５’末端に含まれる。
＊＊ 増幅された製品がｍＲＮＡＦＩＳＨのためのリボプローブを生成するために試験管内転写のためのテンプレートとして使うことができるように、括弧で示されたＴ７プロモータは、５’末端に含まれる。逆進プライマーは第二のｅｘｏｎ−ｅｘｏｎジャンクションに架かり、ゲノムＤＮＡの増幅を防止する。Ａ１１１ ｂｐ断片は、増幅される。
＋ 第３のｅｘｏｎ−ｅｘｏｎジャンクションに架かる。
＋＋ Ａ１３４ｂｐ ＰＣＲ断片は、増幅される。
^ａ Ａ２６５ｂｐ ＰＣＲ断片は、増幅される。
【０１９６】
実施例２
組織切片でのマルチ・カラー蛍光性ｉｎ ｓｉｔｕハイブリッド形成（ｍＲＮＡＦＩＳＨ）を使用する発現分析。
通常の組織と比較して腫瘍において過剰発現される遺伝子を識別するために、我々は、ホルマリン固定パラフィン埋込み臨床標本を使用するために、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓに転写パターンを視覚化するために、我々のＦＩＳＨプロトコルを適応した（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら（１９９５）Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ、第４８巻 ３３９〜３６４ページ、Ｈ． Ｆ． ＥｐｓｔｅｉｎなおよびＤ． Ｃ． Ｓｈａｋｅｓ編集Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．；Ｂｉｒｃｈａｌｌら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｒ． １１巻３１４〜３２０ページ）。我々のアプローチには、試験管内の転写によって合成される蛍光体をラベルしたリボプローブの使用が含まれる。転写反応のためのＤＮＡテンプレートは、Ｔ３またはＴ７バクテリオファージプロモータが、５’末端に導入された特殊なプライマーを遺伝子を使用する増幅によって生成する。このように、プローブを作成するために遺伝子断片のサブクローニングは、避けることができる。
【０１９７】
ハイブリッド形成信号は、狭い波長の励起光と焦点蛍光の排除のために組織の自己蛍光発光からの妨害を減らす共焦点顕微鏡で映し出された。放射性プローブよりむしろ、蛍光性プローブの使用は、高解像度、時間節約、同時の免疫組織化学との両立性（Ｃｈｕａｎｇら（１９９６の）Ｃｅｌｌ、７９巻１〜２０頁）、および、単一の組織切片で同時に数多くの遺伝子の発現の相対的レベルを測定する可能性（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら（１９９５））を含めて、数多くの利点を持っている。
【０１９８】
実施例３
正常乳房細胞におけるＣＹＰ２４およびＶＤＲの発現
ヒトにおいては、ビタミンＤレセプターは、免疫組織化学によって正常乳房の内腔および胞状上皮細胞に、そして、胸部腫瘍細胞中に突き止められた（Ｂｅｒｇｅｒ ら（１９８７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．４７巻：６７９３〜６７９９頁； ＣｏｌｓｔｏｎＲら（１９８９年）Ｌａｎｃｅｔ、１８８〜１９１頁）。この実験では、ネズミの乳腺の発達および退縮の間のＣＹＰ２４およびＶＤＲ遺伝子の発現プロフィールは、細胞タイプとこれらの遺伝子生成物が機能する発達段階を識別するために決定される。これらの研究は、これらの遺伝子の正常な発現の説明を提供し、それは、つぎに下記のように開発される、ネズミ胸部腫瘍モデルおよびＣＹＰ２４トランスジェニックのマウスにおける発現と比較される。発現分析は、転写体と蛋白質レベルの両方で実行される。
上述のように、ＣＹＦ２４とＶＤＲ ｍＲＮＡのための遺伝子特異的プローブは、ｍＲＮＡＦＩＳＨのためのリボプローブを生成するのに用いることができる。ＶＤＲに固有な抗体は、市販されている（Ａｆｆｉｎｉｔｙ ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔｓ ＃ＰＡＩ−７１１、ＭＡＩ−７１０；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ＃ｓｃ−１ＯＯ８、ｓｃ−１００９）。
免疫組織化学および／またはｍＲＮＡ ＦＩＳＨの免疫組織化学との組合せは、胸部におけるさまざまな細胞タイプに固有な特定の遺伝子とマーカータンパク質の発現のサイトを突き止めるのに用いられる。可能ならば、ＣＹＰ２４ および／または ＶＤＲならびに細胞タイプに特異的なマーカーの位置決めは、遺伝子とマーカータンパク質のために、プローブの上に多数の区別できる蛍光色素を使用して、同一組織切片で、同時に実行される。
齧歯目の胸部の発達が記述された（例えば、Ｍｅｄｉｎａ（１９９６年）Ｊ． Ｍａｍｍ．Ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌ． Ｎｅｏｐｌ．１巻５〜１９頁参照）、そして、週齢の４−８週に乳房の脂肪パッド全体の管状組織の樹脂状化から始まる。侵入する管の先端に位置する末端の芽状突起には増殖している細胞が含まれる。妊娠時に、管状組織の更なる樹枝状化が、既存の管状ツリーの側からの第三の末端芽状突起の精密化によって起こる。乳タンパク質、ラクトグロブリンと乳漿酸性の蛋白が合成されるとき、腺の末端分化が乳汁分泌の間に起こる。乳を出す乳腺の退縮には、大規模なアポトーシスが含まれ、離乳後の４〜６週間に起こる。
【０１９９】
実験設計
ＣＹＰ２４とＶＤＲの発現は、ｍＲＮＡＦＩＳＨまたは遺伝子特異的抗体を使用して組織切片のｉｎ ｓｉｔｕ 染色によって決定される。マウスの生体内潅流および固定続いて、組織ブロックが調製される。乳腺は、次の時点でマウスから採取する：（ａ）胸部管状組織の樹枝状化の始めと終り（それぞれ、３−４週齢と８週齢に）（ｂ）妊娠の初期、中期および後期（性交後４、８、１３および１８日に）（ｃ）乳汁分泌の間、ならびに（ｄ）胸部の退縮の初期と終期の間。屠殺の前に、全てのマウスに、単クローナルＢｒｄＵ抗体を使用してのＳフェース細胞の免疫組織化学的検出のために５−ｂｒｏｍｏ−ｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ（ＢｒｄＵ）を注射する（Ａｒｂｅｉｔら、 １９９４年）．ケラチン中間フィラメント・タンパク質の免疫組織化学的染色は、乳管の基底（ｋｅｒａｔｉｎ−１４）および内腔細胞（ｋｅｒａｒｉｎ−６）を区別するのに用いられる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ， ＢａｂＣｏ ＃ ｐｒｂ−１５５ｐ）−１６９ｐ）。退縮の初期および後期は、アポトーシスのためのＴＵＮＥＬアッセイを用いて識別される（Ｎａｉｋら（１９９６年）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１０巻：２１０６〜２１６６頁）．
【０２００】
方法
標本調製。
マウスは、屠殺の２時間前に、ＢｒＵ１００ｍｇ／ｋｇを腹腔内注射する。マウスは、秤量し、０．２５％アベルチン溶液３７．５ｍｇ／ｋｇで麻酔し、新に用意したパラホルムアルデヒドの３．７５％溶液で潅流する。組織を除去し、ポスト４の＜Ｃでの３．７５％のパラホルムアルデヒドで、一晩、後固定して、それからパラフィンに埋め込む。切片（〜６μｍの厚み）はキシレン中で脱蝋し、エタノールの段階的なシリーズ中を通し、それから、用途に従い、１５分間３７℃で、プロテイナーゼＫ５〜１５μｇ／ｍｌ添加してインキュベーションする。プロテアーゼ処理の後で、室温で２０分間１％パラホルムアルデヒド中でポスト固定し、すすぎ、つぎに脱水する。
【０２０１】
ｍＲＮＡ ＦＩＳＨ。
標本は、３７℃で２時間、ハイブリド化緩衝液（５０−７０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、０．１％のトゥイーン２０、１００ｕｇ／ｍｌ ｔＲＮＡ、１０％デキストラン硫酸塩）中でプリハイブリド化する。プリハイブリド化溶液を除去し、蛍光体をラベルしたリボプローブ（Ａｌｂｅｒｔｓｏｎら（１９９５年）、Ｃ． ｅｌｅｇａｎｓ：Ｍｏｄｅｒｎ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａｎ Ｏｒｇａｎｉｓｍ， ４２巻， Ｈ． Ｆ． Ｅｐｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｄ． Ｃ． Ｓｈａｋｅｓ， ｅｄｓ． Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ． の３３９〜３６４頁）をハイブリッド化緩衝液中の標本に適用する。ハイブリド化は、プローブの長さとＧＣ内容にしたがって、３７−５０℃で一晩行う。
【０２０２】
免疫組織化学
切片の処理は、抗体に従いわずかに異なるが、間接的検出のための標準の方法を使用する（例えば、Ａｌｂｅｒｔｓｏｎ（１９８４）Ｄｅｖｅｌｏｐ． Ｂｉｏｌ．１０１：６１〜７２）。
【０２０３】
Ｓフェース分析。
ＢｒｄＵ陽性細胞のための免疫組織化学的染色の後に、ＢｒｄＵラベル指数を、連続した２０倍率の場で１０００個の核を計数することによって決定する。
【０２０４】
アポトーシス
ＴＵＮＥＬアッセイは、製造業者の指示書（Ｏｒｉｃｏｒ ＃ Ｓ７１ １０、Ｇａｉｔｅｒｂｕｒｇ、ＭＤ）にしたがって、末端トランスフェラーゼ活性の蛍光検出を使用して、行う。
【０２０５】
データ収集および分析。
乳房組織中のＣＹＰ２４とＶＤＲの発現プロフィールには、特殊な細胞タイプ、発達段階に特有の発現パターンおよび発現の相対的レベルの列挙が含まれる。細胞に特異的なマーカータンパク質の発現は、特定の細胞および発達段階におけるＣＹＰ２４とＶＤＲ発現の指定を確かめるのに用いられる。乳管の基底および内腔細胞は、特定のケラチンの発現によって識別され、退縮する細胞は、ＴＵＮＥＬ陽性細胞として同定される。
異なる成長段階におけるＣＹＰ２４およびＶＤＲｍＲＮＡの発現の相対的レベルは、同一組織切片にハイブリド化したリボソームプローブに関して測定される。
【０２０６】
実施例４
確立されたネズミ乳がんモデル、ＭＭＴＶ−ＥＲＢＢ２トランスジェニックマウスにおけるＣＹＰ２４の発現
【０２０７】
われわれは、ヒト胸部腫瘍標本（図３）におけるＣＹＰ２４およびＶＤＲｍＲＮＡを文書に記録し、ヒト胸部腫瘍標本からの正常および腫瘍組織におけるこれらの遺伝子の発現を研究しつづける。ここで、われわれは、ＥＲＢＢ２がん遺伝子がマウスの乳がんウイルスプロモーター（ＪＡＸ Ｍｉｃｅ、ＭＭＴＶｎｅｕ Ｅｒｂｂ２、＃００２３７６）の制御の下で、乳房組織で発現される、確立された胸部腫瘍のトランスジェニックマウスモデルにおける胸部がん発生の間のＣＹＰ２４およびＶＤＲの発現を調べる。これらのマウスは、最初、約４月齢で過形成性で形成異常の乳腺に巣状の腫瘍を発生させる（Ｇｕｙら、１９９２年）。胸部腫瘍発生のトランスジェニックマウスモデルの研究は、患者の材料の分析では研究することのできない腫瘍発生の特定の相におけるこれらの遺伝子の潜在的役割を研究する機会を提供する。特に、マウスモデルは、ヒトの標本からは得ることのできない妊娠前段階へのアクセスを提供する。さらに、マウスの腫瘍モデルは、腫瘍発生における特別の遺伝子の役割が、はっきりした遺伝的背景において誘起される腫瘍（たとえば、ＥＲＢＢ２の過剰発現、ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１またはｐ５３の欠如によって誘起される腫瘍）で評価することを可能にする。
【０２０８】
実験計画
初期および後期腫瘍発達の時点を網羅するために、２、４、６および１０〜１２月齢のトランスジェニックマウスを研究する。屠殺の２時間前に、ＢｒｄＵを腹腔内に注射し、Ｓフェースキネティックを測定する。組織を採取し、ｍＲＮＡ ＦＩＳＨ用に処理し、ケラチン−１４および−６、ならびにＨＥＲ２−ｎｅｕ導入遺伝子の発現を、実施例３におけるように抗体を用いて測定する。
【０２０９】
ここに記載した実施例および具体例は、例証の目的のためだけであって、それらの光の中での種々の修正および変更は、当該業者には示唆されるであろうし、付された請求範囲の応用と範囲の精神および権限の中に含まれることは理解される。ここに挙げられたすべての出版物、特許、および特許の応用は、これによって全ての目的のために、全体として参照されて入れられている。
【図面の簡単な説明】
【図１】 比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を示す。左のパネルでは、ゲノムＤＮＡ全体が、「供試および「参照」細胞個体群から単離され、各種の蛍光色素によって標識され、正常な分裂中期染色体へハイブリダイズされる。Ｃｏｔ−１ ＤＮＡを用いて、反復配列のハイブリダイゼーションを抑制する。染色体のある位置において生じた２種類の蛍光色素の蛍光強度の比は、供試および参照ゲノムにおける対応するＤＮＡの複製数の比にほぼ比例している。右のパネルは、マップされたクローンの配列に対する、同様のハイブリダイゼーションを示す。これにより、クローンのサイズおよび／またはその間のマップ空間によって決定された分解能を用いて、複製数の測定が可能になる。
【図２】 乳癌腫瘍Ｓ２１の高分解能配列ＣＧＨ測定を示す。２０ｑ１３．２における領域Ａによる近接標的クローンの試験：参照比を、棒として示した各標的クローンの比とともにプロットし、ＳＴＳ含有量マッピングによって決定されるクローンの重複を示す。クローン名は最後の４桁に短縮してある。この分析は、重複クローンのＲＭＣ２０Ｂ４１２１、ＲＭＣ２０Ｂ４０８７、ＲＭＣ２０Ｂ４１９５が複製数プロファイルのピークの遺伝子座であることと、重複クローンＲＭＣ２０Ｂ４０８７、ＲＭＣ２０Ｂ４１９５に遠位の領域内の複製数が急勾配で減少することを示している。
【図３】 ＲＴ−ＰＣＲによって評価した、１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３で誘発を行った場合と行わない場合のヒト乳癌細胞系および腫瘍におけるＣＹＰ２４、ＶＤＲおよびＺＮＦ２１７遺伝子の発現を示す。（ａ） １０^−８Ｍの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３およびビヒクル対照（エタノール、ＥｔＯＨ）を用いてインキュベートしたＭＣＦ７乳癌細胞における、ＣＹＰ２４遺伝子発現の誘発の時間経過。（ｂ） ２種類の乳癌腫瘍Ｓ２１およびＳ５９における遺伝子発現。（ｃ） ＢＴ４７４細胞系における遺伝子発現。細胞は（ａ）で述べたように、１０^−８Ｍの１，２５−ジヒドロキシビタミンＤ_３を用いてインキュベートした。

Claims (14)

1. 動物における乳癌細胞の存在の可能性又は乳癌の素質を検出する方法であって、前記方法は、（ｉ）動物から得たサンプル内のＣＹＰ２４レベルを検出し；（ｉｉ）前記のＣＰＹ２４レベルを、正常で癌を含まない組織の対照サンプルのＣＹＰ２４レベルと比較することを包含し、ここで、前記対照サンプルのＣＹＰ２４レベルと比較して、増加した前記生物学的サンプルのＣＹＰ２４レベルは、前記動物の乳癌細胞の存在の可能性又は乳癌の素質を示す、方法。
2. 前記のＣＹＰ２４レベルは、前記生物学的サンプルの細胞中のＣＹＰ２４遺伝子のコピー数を測定することにより検出される、請求項１に記載の方法。
3. 前記コピー数は、比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用して測定する、請求項２に記載の方法。
4. 前記コピー数は、核酸プローブのアレーへのハイブリダイゼーションにより決定する、請求項２に記載の方法。
5. 前記比較ゲノムハイブリダイゼーションはアレー上で実施する、請求項３に記載の方法。
6. 前記のＣＹＰ２４レベルは、前記生物学的サンプルのＣＹＰ２４ｍＲＮＡレベルを測定することにより検出され、ここで、前記対照サンプルのＣＹＰ２４ｍＲＮＡと比較して、増加した前記サンプルのＣＹＰ２４ｍＲＮＡレベルは、乳癌細胞の存在の可能性又は乳癌の素質を示す、請求項１に記載の方法。
7. 前記のＣＹＰ２４ｍＲＮＡレベルは、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルにおいて測定し、ここで前記生物学的サンプル中のビタミンＤ受容体活性は、前記対照サンプル中におけるビタミンＤ受容体活性と同じであり、または、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルの、それぞれにおけるＣＹＰ２４ｍＲＮＡレベルを、ビタミンＤ受容体活性レベルに基準化する、請求項６に記載の方法。
8. 前記のＣＹＰ２４ｍＲＮＡレベルは、アレー上の１つ以上のプローブへのハイブリダイゼーションにより測定する、請求項６に記載の方法。
9. 前記のＣＹＰ２４レベルは、前記生物学的サンプルのＣＹＰ２４タンパク質レベルを測定することにより検出され、ここで、前記対照サンプルのＣＹＰ２４タンパク質と比較して、増加した前記サンプルのＣＹＰ２４タンパク質レベルは、乳癌細胞の存在の可能性又は乳癌の素質を示す、請求項１に記載の方法。
10. ＣＹＰ２４タンパク質レベルは、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルにおいて測定し、ここで前記生物学的サンプル中のビタミンＤ受容体活性は、前記対照サンプル中におけるビタミンＤ受容体活性と同じであり、または、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルの、それぞれにおけるＣＹＰ２４タンパク質レベルを、ビタミンＤ受容体活性レベルに基準化する、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＣＹＰ２４レベルは、前記生物学的サンプルの２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性レベルを測定することにより検出され、ここで、前記対照サンプルの２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性と比較して、増加した前記サンプルの２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ酵素活性レベルは、乳癌細胞の存在の可能性又は乳癌の素質を示す、請求項１に記載の方法。
12. 前記の２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ活性レベルは、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルにおいて測定し、ここで前記生物学的サンプル中のビタミンＤ受容体活性は、前記対照サンプル中におけるビタミンＤ受容体活性と同じであり、または、前記生物学的サンプルおよび前記対照サンプルの、それぞれにおける２５−ヒドロキシビタミンＤ３ ２４−ヒドロキシラーゼ活性レベルを、ビタミンＤ受容体活性レベルに基準化する、請求項１１に記載の方法。
13. 前記動物が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
14. 前記生物学的サンプルが、切除組織である、請求項１に記載の方法。

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