ES2226105T3 - Diagnostico de cancer precoz. - Google Patents
Diagnostico de cancer precoz.Info
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Abstract
La presente invención se refiere al diagnóstico de cáncer de estómago y se refiere específicamente a un procedimiento de detección de carcinoma gástrico en una fase premaligna detectando la expresión de ciclooxigenasa-2 en una muestra de un paciente.
Description
Diagnóstico de cáncer gástrico precoz.
La presente invención se refiere al diagnóstico
del cáncer de estómago, específicamente a un método para detectar el
carcinoma gástrico en una fase premaligna, mediante la detección de
la expresión de la ciclooxigenasa-2 en una muestra
del paciente.
El cáncer gástrico es una de las enfermedades
malignas más frecuentes y letales en le mundo (Coleman et
al., 1993). Es el cuarto cáncer más frecuente entre los varones
finlandeses, y el quinto entre las mujeres, y constituye el 5% de
todos los cánceres en Finlandia (Cancer Incidente in Finland 1994.
Finish Cancer Registry, Helsinki, 1996). La detección precoz del
cáncer gástrico es difícil, y en la mayoría de los paises
occidentales la supervivencia a los cinco años es menor del 20%
(Wanebo et al., 1993). Más del 90% de los cánceres gástricos
son adenocarcinomas, que se dividen en tipo intestinal y difuso,
según la clasificación de Laurén (Lauren, 1965).
La patogenia del cáncer gástrico es compleja e
incompletamente conocida, pero en el caso del tipo intestinal, se
han asociado con la enfermedad alguno cambios precursores, como la
gastritis crónica atrófica, la metaplasia intestinal o la displasia
intestinal (Antoniolli, 1994). En contraste, el tipo difuso carece
de lesiones precursoras bien reconocidas. Como se han encontrado una
combinación diferente de alteraciones genéticas en estos dos tipos
de cáncer gástrico histológicamente distintos, pueden tener
diferente base genética (Stemmermann et al., 1994; Tahara
et al., 1996). Sin embargo, se cree que las alteraciones
genéticas relacionadas con el cáncer que comparten estos dos tipos
de adenocarcinoma gástrico, representan las que aparecen ya en la
etapa premaligna de la enfermedad (Tahara et al., 1996).
Los fármacos antiinflamatorios no esteroideos
(NSAID), tales como la aspirina, la indometacina, y el sulindac,
inhiben el carcinoma de colon inducido químicamente en modelos
animales (Steele et al., 1994; Giardiello et al.,
1995). Estudios epidemiológicos han demostrado que el uso prolongado
de aspirina disminuye la incidencia y la mortalidad de los cánceres
gastrointestinales, incluyendo el cáncer de estómago (Laakso et
al., 1986; Giardello, 1994; Thun, 1994; Thun et al.,
1993).
La diana mejor conocida de los NSAID es la
ciclooxigenasa (Cox), la enzima que limita la tasa de la conversión
de ácido araquidónico a prostanoides. Se han clonado dos genes Cox
(Cox-1 y Cox-2), que
comparten más del 60% de identidad en el nivel de aminoácidos, y
tienen actividades enzimáticas similares (Hershman, 1996; Smith
et al., 1996). La Cox-2 está
considerada como un gen constitutivo, y se piensa que los
prostanoides sintetizados por la vía de la
Cox-1 son responsables de la citoprotección
del estómago, de la vasodilatación del riñón, y de la producción de
un prostanoide proagregante por las plaquetas, el tromboxano. En
contraste, el Cox-2 es un gen inducible de
forma temprana-intermedia, y su papel
fisiopatológico ha sido conectado con la inflamación, la
reproducción y la carcinogénesis.
Estudios recientes sugieren que la
Cox-2 está relacionada con el cáncer de colon
y de esta forma podría ser la diana para el efecto quimiopreventivo
de los NSAID. i) la disrupción genética del gen
Cox-2 o el tratamiento con un fármaco
específico contra Cox-2 suprime la formación de
pólipos en un modelo de ratón de FAP (Oshima et al., 1996);
ii) la sobreexpresión de Cox-2 en el epitelio
intestinal de ratas altera su tasa de muerte celular programada y su
adhesión a la matriz extracelular (Tsuji et al., 1995), y
iii) dos inhibidores selectivos de Cox-2 diferentes
suprime los focos crípticos aberrantes inducidos químicamente en el
colon de rata (Takahashi et al., 1996; Reddy et al.,
1996). Además, se han encontrado niveles elevados de mRNA y proteína
Cox-2, pero no de Cox-1, en tejido
de carcinoma de colon inducido químicamente en ratas (DuBois et
al., 1996), y en carcinomas de colon humano, cuando se comparan
con la mucosa normal (Eberhart et al., 1994; Kargman et
al., 1995; Sano et al., 1995).
La idea de de que el efecto quimiopreventivo de
los NSAID pueda efectuarse a través de la diana
Cox-2, se apoya además en los hallazgos de que los
compuestos inhibidores selectivos de Cox-2 inhiben
la proliferación de las células epiteliales intestinales de rata, y
de las células epiteliales mamarias, en las que se indujo la
expresión de Cox-2 mediante oncogenes (Sheng
et al., 1997 y Subbaramaiah et al., 1996). También,
Tsuji et al., (1996) han descrito recientemente que un
inhibidor específico de Cox-2 suprimía la
proliferación de una línea celular de carcinoma gástrico y carcinoma
de colon, que expresaba niveles basales de mRNA de
Cox-2 elevados. Este no era el caso en líneas
celulares que expresan niveles bajos de mRNA de
Cox-2.
Además, Williams et al. En
Gastroenterology, Vol. 111, 1134-1140, 1996,
describe que la Cox-2 es inducible por una variedad
de factores, por ejemplo, promotores tumorales, y la expresión de
Cox-2 se aumenta en una etapa precoz, preinvasiva,
en adenomas de ratón. Aunque se ha sugerido la posible correlación
entre la expresión de Cox-2 y la formación de
tumores de colon, no se han hecho sugerencias de que esta
sobreexpresión temprana pudiera encontrarse en otros tejidos de
cáncer intestinal.
El tejido gastrointestinal normal contiene casi
exclusivamente la isoforma Cox-1, y no se ha
encontrado proteína Cox-2 en tejido de estómago sano
(Kargman et al., 1996). Puede detectarse también, sin
embargo, algo de mRNA de Cox-2, con métodos más
sensibles que el tradicional de hibridación mediante trasferencia
Northern de RNA total, por ejemplo, mediante RT-PCR
(véase O'Neill y Forth-Hutchinson 1993; y Figuras 2
y 4 del presente trabajo).
Como no se sabe si la Cox-2 está
presente en los tejidos de cáncer gástrico in vivo, o en
lesiones premalignas de carcinoma gástrico, estudiamos su expresión
en adenocarcinomas de estómago, así como en displasias gástricas
graves (que son altamente premalignas). Encontramos niveles elevados
de mRNA de Cox-2, pero no de Cox-1,
en tejidos de adenocarcinoma gástrico humano y de displasias graves
de estómago. Sin embargo, la expresión de
Cox-2 no estaba elevada en las displasias
leves que raramente se trasforman en cánceres. En el carcinoma
gástrico, la proteína Cox-2 se localizaba
primariamente en las células cancerosas.
La expresión elevada de
Cox-2 no estaba limitada al tipo intestinal,
ya que los tres carcinomas difusos analizados contenían niveles más
elevados de mRNA de Cox-2 que sus testigos
respectivos. Así, la sobreexpresión de Cox-2
es una de las propiedades compartidas por estas dos enfermedades
diferentes histológica y genéticamente, lo que podría sugerir que
estuviera implicada en la fase precoz de la carcinogénesis. Además,
encontramos que la Cox-2 se expresa en las
displasias graves del estómago, mientras que la expresión no está
elevada en las displasias leves.
Esto sugiere que la expresión de
Cox-2 puede estar asociada específicamente
con las lesiones premalignas del carcinoma gástrico.
En conclusión, hemos demostrado que la
Cox-2 se expresa en tejidos de carcinoma
gástrico humano, cuando se compara con especimenes de mucosa
gástrica pareados que no contienen células cancerosas. El mRNA de
Cox-2 se encontró tanto en adenocarcinomas
intestinales como difusos. La proteína Cox-2 se
localiza en las células de carcinoma gástrico, pero no en el estroma
que las rodea, como se detecta mediante inmunohitoquímica.
Es importante resaltar que los especimenes de
displasia gástrica grave, que representan lesiones premalignas son
intensamente positivas para Cox-2. Esto sugiere que
la Cox-2 puede utilizarse en el diagnóstico del
carcinoma gástrico precoz, y en la determinación de la gravedad de
las lesiones premalignas.
La expresión de Cox-2 en
los carcinomas humanos parece, al menos hasta ahora, estar
restringida al tracto gastrointestinal. Sin embargo, como el
carcinoma de colon y el carcinoma de estómago son enfermedades
diferentes tanto epidemiológica, como morfológica y genéticamente,
el hecho de que se hayan encontrado niveles elevados de mRNA y
proteína de Cox-2 en tejidos de carcinomas de colon
humanos y de ratón, no proporciona ninguna indicación sobre su papel
en los tejidos gástricos. El hecho de que se ha demostrado que una
línea celular de carcinoma gástrico expresaba niveles basales
elevados de mRNA de Cox-2, no significa que ésta
tenga un papel en el cáncer gástrico precoz in vivo.
El objetivo de esta invención es desarrollar un
método para el diagnóstico de carcinoma gástrico precoz, que
comprende la detección del mRNA de Cox-2 o de la
proteína Cox-2 en muestras relevantes de pacientes.
Esto se basa en nuestro hallazgo de que la
Cox-2 se expresa altamente en células de
carcinoma gástrico y en lesiones premalignas, pero que esta
expresión es muy baja o indetectable en tejidos de estómago
normal.
Las muestras de pacientes para detección son, por
ejemplo, biopsias o muestras de cepillado, que se obtienen durante
gastroscopia de rutina o lavado gástrico combinado con técnica de
cepillado. El lavado gástrico y las técnicas de cepillado son
métodos bien conocidos en la citología gástrica de rutina. Estas
técnicas proporcionan muestras celulares de mucosa gástrica para
examen microscópico, para incluir o excluir la posibilidad de
tumores malignos en el estómago. Los marcadores, como el
Cox-2, pueden aumentar la sensibilidad y la
especialidad del ensayo, cuando se comparan con el método actual de
visualizar la morfología de las células. Las muestras de biopsia de
gastroscopia se fijan en formalina (para inmunohistoquímica), o se
congelan en nitrógeno líquido y se guardan a -70ºC (para ensayos de
mRNA).
El mRNA de Cox-2 puede detectarse
convenientemente en dichas muestras de pacientes, utilizando métodos
conocidos en la técnica. Por ejemplo, el análisis con técnicas de
trasferencia Northern ha demostrado ser, en nuestras manos,
altamente específico, y cuando se combina con la técnica de
RT-PCR también muy sensible.
La detección de proteína Cox-2
puede llevarse a cabo convenientemente en dichas muestras de
pacientes utilizando, por ejemplo, la inmunohistoquímica, que además
de la detección de la expresión de Cox-2,
muestra la localización de la proteína.
El método diagnóstico de la invención puede
llevarse a cabo utilizando kits de ensayo adecuados. Así, un kit
para la detección de mRNA de Cox-2 comprende
reactivos de aislamiento de RNA o poli-A+mRNA,
cebadores específicos de Cox-2 para
RT-PCR y fragmentos de cDNA para fabricar sondas de
DNA o RNA (tanto en sentido directo como en sentido inverso, o
antisentido).
Un kit para la detección inmunológica de la
proteína Cox-2 comprende anticuerpos monoclonales o
policlonales específicos de Cox-2. También puede
utilizarse un ensayo basado en oligonucleótidos, en el que se
incluyen oligonucleótidos (moléculas de RNA modificado) con afinidad
de unión para la Cox-2 en un kit diagnóstico
correspondiente.
Figura 1A. Análisis de hibridación de
trasferencia Northern de RNA total extraído de especimenes de
carcinoma gástrico 1-11, y de las muestras de
testigos pareadas que no contenían células cancerosas (a, antro; c,
cuerpo). La hibridación se realizó con sondas de
Cox-1 y Cox-2 humanas
y con GAPDH como testigo de carga.
Figura 1B. Se muestra la relación entre mRNA de
Cox-2 y mRNA de GADPH. Los valores (medias\pmSEM)
en los gráficos representan la relación entre el mRNA de
Cox-2 y el mRNA de GADPH calculada a partir de
unidades densitométricas arbitrarias, que indican que los tejidos de
carcinoma gástrico expresaban niveles significativamente elevados de
mRNA de Cox-2 que las muestras de testigos
(p<0,05).
Figura 1C. Se muestra la relación entre mRNA de
Cox-1 y mRNA de GADPH. Los valores (medias\pmSEM)
en los gráficos, representan la relación entre mRNA de
Cox-1 y mRNA de GADPH, calculada a partir de
unidades densitométricas arbitrarias. Los niveles de
Cox-1 no estaban elevados en los tejidos de
carcinoma.
Figura 2. Se detectaron los niveles de mRNA de
Cox- y Cox-2 mediante RT-PCR en
especimenes de carcinoma gástrico (identificado como b), de los
casos 1, 5, 9 y 10 y de sus respectivos testigos, que no contenían
células cancerosas (a, antro; c, cuerpo). El RNA total fue primero
sometido a trascripción inversa. Después, las muestras de cDNA se
amplificaron con PCR, utilizando cebadores específicos de las
isoenzimas de Cox-1 y
Cox-2 humanas. Finalmente, los productos de
PCR se analizaron y se cuantificaron (véase Experimentación). El
gráfico muestra la relación entre mRNA de Cox-2 y
mRNA de Cox-1.
Figura 3A. La tinción inmunohistoquímica para
Cox-2 en tejidos de carcinoma gástrico mostraba
tinción citoplasmática (color rojo marrón) en las células cancerosas
(flechas negras), pero no en el estroma circundante (flecha
blanca).
Figura 3B. Cuando se utilizó IgG de conejo normal
como anticuerpo primario, las secciones titulares no exhibían
ninguna tinción.
Figura 3C y Figura 3D. Especimenes de displasia
gástrica grave de dos pacientes separados se tiñeron con anticuerpos
anti-Cox-2. Las glándulas
displásicas (flechas negras) eran positivas para
Cox-2, mientras que las glándulas normales (flechas
blancas) eran negativas.
Figura 4A. Se detectaron niveles de mRNA de
Cox-2 mediante RT-PCR en especimenes
gástricos con displasia leve y de sus respectivos testigos, que no
mostraban displasia. Procedimiento: véase la Figura 2. El gráfico
muestra la titulación del ciclo de PCR de Cox-2. El
ciclo número 40 se utilizó en la Figura 4C.
Figura 4B. El gráfico muestra la titulación del
ciclo de PCR de GADPH. El ciclo número 28 se utilizó en la Figura 4
C.
Figura 4C. El gráfico muestra la relación entre
mRNA de Cox-2 y mRNA de GADPH. No había diferencia
estadística entre las muestras con displasia leve (Displasia I)
(453\pm125, media\pmSEM) y sus testigos respectivos
(424\pm90).
| RT-PCR | Trascripción inversa-Reacción en cadena de la polimerasa |
| Cox-1 | Ciclooxigenasa 1 |
| Cox-2 | Ciclooxigenasa 2 |
| NSAID | Fármaco anti-inflamatorio no esteroideo |
| FAP | Poliposis adenomatosa familiar |
| mRNA | RNA mensajero (ácido ribonucleico) |
| GADPH | Deshidrogenasa de gliceraldehido-3-fosfato |
| SDS | Dodecil sulfato sódico |
Muestras de pacientes. Se obtuvieron
especimenes de histología mucinosa de doce adenocarcinomas gástricos
(Tabla 1) y doce carcinomas de ovario, de tejido removido
quirúrgicamente, que se congelaron en nitrógeno líquido, y se
guardaron a -70ºC hasta que se analizaron. Uno de los casos de
carcinoma gástrico se excluyó del análisis, porque mostraba intensa
autolisis en el examen histológico. En el caso de carcinoma
gástrico, se obtuvieron muestras pareadas de mucosa gástrica, que no
contenían tejido tumoral macroscópico ni células cancerosas
detectables histológicamente, del antro (n=10) y el cuerpo (n=10).
Todos los cánceres de estómago eran adenocarcinomas primarios, de
los cuales ocho eran de tipo intestinal y tres de tipo difuso
(Laurén 1965), según la evaluación del mismo patólogo.
Aislamiento de RNA y análisis de trasferencia
Northern. Se aisló RNA total por el método de Chomczynski y Sacchi
(1987), con reactivo RNAzol™ B (Tel-Test,
Friendswood, TX), y se cuantificó mediante absorbancia a 260 nm. Las
muestras de RNA (15 \mug) se desnatularizaron en glioxal 1 M,
dimetilsulfóxido al 50% y solución de tampón de fosfato 10 mM, a
50ºC durante 60 minutos, se sometieron a electroforesis a través de
un gel de agarosa al 1,2%, y se trasfirieron a membranas de nylon
Hybond-N® (Amersham Internacional, Aulesbury, UK),
que después se irradiaron con luz UV durante 6 minutos con un
iluminador de UV Reprostar™ II (Carnal, Muttenz, Suiza). Fragmentos
de cDNA purificado de Cox-1 ORF (1,8 kb),
Cox-2 ORF (1,8 kb), y deshidrogenasa de
gliceraldehido-3-fosfato (GADPH, 0,8
kb) humanos, se marcaron con
[^{32}P]-\alpha-dCTP (3000
Ci/mmol, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) y con el kit
Prime-a-Gene (Promega, Madison, WI).
Las sondas se purificaron con columnas nick (Pharmacia, Uppsala,
Suecia), y se utilizaron a 1 x 10^{6} cpm/ml, en solución de
hibridación que contenía formamida al 50%, 6 x SSC (1 x SSC = NaCl
0,15 M y citrato sódico 0,015 M, pH 7,0), Ficoll™ al 0,1%,
polivinilpirrolidona al 0,1%, albúmina sérica bovina al 0,1%, 100
\mug/ml de DNA de esperma de salmón, 100 \mug/ml de RNA de
levadura, y dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,5%, a 42ºC durante 16
horas. Los filtros se lavaron después tres veces con
0,1-1 x SSC y SDS al 0,1% a 50ºC. Los Northern blots
se cuantificaron con el Fujifilm IP-Reader
Bio-Imaging Analyzer BAS 1500 (Fuji Photo Co.,
Tokio, Japón) y con el programa MacBas suministrado por el
fabricante, y se visualizaron mediante autorradiografía.
Trascriptasa Inversa-Reacción
en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR). Se
convirtió RNA total (1 \mug) a cDNA con Superscript™ II (Life
Technologies, Gaithersburg, MD), con oligo-dT
(Pharmacia), y hexámeros randomizados (Life Technologies). Para
obtener resultados semi-cuantitativos, se
optimizaron tres parámetros: número de ciclos, concentración de
cebadores, y temperatura de reasociación. El cDNA (4 \mul) se
amplificó mediante PCR en 100 \mul de mezcla de reacción, que
contenía Tris-HCl, pH 8,8 10 mM, KCl 50 mM, dNTPs
0,2 mM, MgCl 1,5 mM, 0,2 \mug (Cox-1) o 2
\mug (Cox-2) de cebadores en sentido y en
antisentido (Ristimäki et al., 1994), y 2,5 U de
Dynazyme™ II DNA Polymerase (Finnzymes, Espoo, Finlandia). Para el
experimento de la Figura 2, las muestras se amplificaron durante 30
(Cox-1) ó 32 (Cox-2)
ciclos de desnaturalización a 96º C durante 1 minuto, reasociación a
60º C (Cox-1) ó 46ºC
(Cox-2) durante 1 minuto, y extensión a 72º C
durante 1 minuto. Los cDNA amplificados se analizaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 2% y tinción con bromuro de
etidio. Los productos amplificados se cuantificaron con una cámara
CCD de alta resolución (Cohu serie 4910, con integración de chip,
Cohu Inc., San Diego, CA) y con el programa Scion Image 1.57 (Scion
Corp., Frederick, MD) en un ordenador personal
Macintosh.
Macintosh.
El procedimiento de RT-PCR para
la Figura 4A y la Figura 4B se llevó a cabo como se describió
anteriormente. Sin embargo, los ciclos indicados fueron retitulados;
los resultados se muestran en la Figura 4C.
Inmunohistoquímica. Las muestras de tejido
se fijaron en formalina tamponada neutra al 10%, se embebieron en
parafina, se seccionaron (aproximadamente 5 \mum), se
desparafinaron y se pusieron en el microondas durante 15 minutos en
solución de tampón de citrato sódico 0,1 M (pH 6,0). Los
portaobjetos se sumergieron en peróxido de hidrógeno al 0,6% durante
30 minutos y después en suero de cabra normal (5%)/albúmina sérica
bovina (10%) durante 1 hora, para bloquear la actividad peroxidasa
endógena y los lugares inespecíficos de unión, respectivamente. La
inmunotinción se realizó con una inmunoglobulina G policlonal de
conejo dirigida contra un péptido Cox-2 de ratón
(Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI), en una dilución de
1:300-1:600 a 4º C durante la noche. A continuación
las secciones se trataron con anticuerpos secundarios biotinilados
en una dilución de 1:200 (Vector Laboratorios, Burlingame, CA), y
los lugares de unión al anticuerpo se visualizaron finalmente
mediante una solución compleja de peroxidasa de
avidita-biotina (ABComplex, Vectastain, Vector
Laboratorios) y
3-amino-9-etilcarbazol
(Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). La contratinción se realizó con
Mayer's hemalaum?? (Merck, Darmstadt, Alemania).
Análisis estadístico. La significación
estadística se calculó con el análisis de Wilkonson Signed Rank, y
se seleccionó una p < 0,05 como el valor de significación
estadística. Todos los resultados se muestran como
media\pmSEM.
Los tejidos de carcinoma gástrico expresaban
niveles significativamente más elevados de mRNA de
Cox-2 que las muestras de antro o cuerpo que no
contenían células cancerosas, según se detectó mediante hibridación
de trasferencia Northern (Figura 1A). Los trascriptos de
Cox-2 se expresaban tanto en los
adenocarcinomas intestinales como en los difusos. Los niveles de
mRNA de Cox-2 no se correlacionaba con la proporción
de tejido de carcinoma en los especimenes. La Figura 1B muestra que
los tejidos de carcinoma gástrico expresaban niveles
significativamente mayores de mRNA de Cox-2 que las
muestras de testigos (p < 0,05). Como se muestra en la Figura 1C,
los niveles de trascriptos de Cox-1 no
estaban elevados en los tejidos de carcinoma, cuando se comparaban a
los niveles de los respectivos testigos.
Tres muestras de carcinoma gástrico (números 5,
9, 10) expresaban niveles bajos de mRNA de Cox-2
según se detectó mediante el análisis de trasferencia Northern
(Figura 1A). Para evaluar mejor el nivel de expresión de
Cox-1 y Cox-2 en estas
muestras, realizamos una RT-PCR semicuantitativa,
con la muestra número 1 como testigo positivo. Como se muestra en la
Figura 2, la relación entre el mRNA de Cox-2 y mRNA
de Cox-1 era mayor en las muestras de carcinoma que
en las muestras pareadas de antro o cuerpo que no contenían células
cancerosas.
Como se muestra en la Figura 3A, la tinción
inmunohistológica con anticuerpos policlonales específicos de
Cox-2, mostró tinción citoplasmática en las células
cancerosas (flecha negra), pero no en el estroma circundante (flecha
blanca). Cuando se utilizó IgG de conejo normal como anticuerpo
primario, las secciones tisulares no exhibían ninguna tinción
(Figura 3B). Es importante resaltar que las Figuras 3C y 3D muestran
que los especimenes de displasia gástrica grave de dos pacientes
separados, se teñían con los anticuerpos
anti-Cox-2. Las glándulas
displásicas (flechas negras) eran positivas para
Cox-2, mientras que las glándulas normales (flechas
blancas), eran negativas. La IgG de conejo normal no mostró tinción
positiva (no mostrado).
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Claims (6)
1. Un método para la determinación del
significado de una lesión premaligna detectada histológicamente,
como riesgo para convertirse en cáncer gástrico o carcinoma in
situ,
que comprende detectar in vitro, sobre una
muestra de un paciente:
a) la expresión del mRNA de
ciclooxigenasa-2 (Cox-2), o
b) la proteína Cox-2, y
opcionalmente,
evaluar posteriormente la relación
entre la expresión de Cox-2 y la expresión de
Cox-1 en dicha muestra; donde la
sobreexpresión de Cox-2 es indicativa de un
riesgo aumentado de desarrollo de cáncer
gástrico.
2. Un método según la reivindicación 1,
caracterizado porque la muestra en la que se va a realizar la
detección es una biopsia o una muestra de cepillado.
3. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la detección de
la expresión de mRNA de Cox-2 se realiza utilizando
técnicas de trasferencia Northern, in situ, protección de
RNAsa, o RT-PCR, o una de sus combinaciones.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque la detección de
la proteína Cox-2 se realiza utilizando anticuerpos
policlonales o monoclonales con afinidad de unión a
Cox-2, o inmunohistoquímica.
5. Un método según la reivindicación 3, en el que
dicho método se realiza utilizando un kit que contiene reactivos de
aislamiento de RNA o poli-A+mRNA, cebadores
específicos de Cox-2 para
RT-PCR y fragmentos de cDNA, para preparar sondas de
DNA o de RNA.
6. Un método según la reivindicación 4, en el que
dicho método se realiza utilizando un kit que contiene anticuerpos
policlonales o monoclonales específicos de
Cox-2.
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