ES2938033T3 - Diagnóstico y tratamiento de un cáncer con base en la sobreexpresión del gen ADAMTSL5 - Google Patents

Diagnóstico y tratamiento de un cáncer con base en la sobreexpresión del gen ADAMTSL5 Download PDF

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Abstract

La invención se refiere a un método para diagnosticar un cáncer en un mamífero que lo necesite. El método comprende los siguientes pasos: recolectar una muestra biológica de dicho mamífero; determinar, a partir de dicha muestra biológica, si el gen ADAMTSL5 está sobreexpresado; diagnosticar un cáncer a partir de la determinación de la sobreexpresión de dicho gen. También se refiere a un kit para determinar una sobreexpresión del gen ADAMTSL5 en una muestra biológica obtenida de un mamífero, a una composición farmacéutica que comprende un agente dirigido a ADAMTSL5 o la vía ADAMTSL5, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar en el tratamiento de una cáncer, y al uso de un ARNm o proteína de ADAMTSL5 como biomarcador de cáncer. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Diagnóstico y tratamiento de un cáncer con base en la sobreexpresión del gen ADAMTSL5
Campo técnico de la invención
La invención se relaciona con un método de diagnóstico, una composición farmacéutica, un uso de un biomarcador y un método de monitorización del tratamiento como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Antecedentes de la invención
El cáncer es la segunda causa de muerte en el mundo. Casi una de cada seis muertes en todo el mundo se debe al cáncer. Por ejemplo, en el 2015, 8.8 millones de personas murieron de cáncer. Por tanto, es importante desarrollar nuevos métodos para mejorar el diagnóstico del cáncer en pacientes que lo necesiten y, en particular, para predecir su susceptibilidad a los tratamientos para aumentar sus respuestas terapéuticas, lo que resultará en un aumento de las expectativas de supervivencia. Algunos biomarcadores para el carcinoma hepatocelular son revisados por Lou et al. en Biomarker in Cancer, págs. 1-9, DOI: 10.1177/1179299X16684640.
La epigenética es el estudio de los cambios en la actividad de los genes, que no involucra las modificaciones de la secuencia del ADN y que pueden transmitirse en divisiones celulares. A diferencia de las mutaciones que afectan la secuencia de ADN, las modificaciones epigenéticas son reversibles. Es bien conocido que las anomalías epigenéticas conducen al desarrollo y progresión de enfermedades humanas, especialmente cánceres. Los procesos epigenéticos intervienen en la regulación de muchos eventos como la división celular, diferenciación, supervivencia y movilidad. La alteración de estos mecanismos promueve la transformación de células sanas en cancerosas, por lo que cualquier aberración epigenética puede estar implicada en la tumorigenicidad. Entre las consecuencias vinculadas a las anomalías epigenéticas en las células, se encuentra el silenciamiento de los genes supresores de tumores o la sobreexpresión de oncogenes como protooncogenes, que implican una metilación aberrante del ADN o mutaciones de genes que codifican enzimas responsables de las modificaciones de cromatina. La metilación del ADN es un mecanismo epigenético esencial que influye en los niveles de expresión génica en las células. Estas alteraciones pueden conducir a cambios biológicos dramáticos, así como a la adquisición de propiedades malignas. El panorama del cáncer se caracteriza generalmente por una hipometilación difusa del ADN y por una hipermetilación focal en regiones ricas en CpG conocidas como islas CpG (CGI). Generalmente, la hipermetilación de CGI en los promotores reprime la transcripción de genes que actúan como supresores de tumores. Sin embargo, también se observa una gran fracción de metilación del ADN en los CGI del cuerpo génico, con una correlación positiva entre la metilación y la sobrerregulación de la expresión génica. Esto implica que la hipermetilación del ADN en los CGI del cuerpo génico está relacionada con la sobrerregulación de genes que actuarían como reguladores positivos de tumorigenicidad, lo que es coherente con la función reportada de algunos de ellos en las células cancerosas. Sin embargo, aún se desconoce la implicación de varios otros genes hipermetilados y sobrerregulados en la tumorigenicidad celular.
Estos hallazgos han frustrado el desarrollo de fármacos direccionados a los reguladores epigenéticos, que se denominan epifármacos o epimedicinas. Dos familias principales de compuestos se han desarrollado notablemente hasta ahora: (i) compuestos que inhiben la metilación del ADN y (ii) compuestos que tienen como diana las modificaciones de las histonas. Sin embargo, en la actualidad este tipo de compuestos carecen de acción específica.
En base a lo anterior, sigue existiendo la necesidad de identificar genes que puedan usarse como nuevos biomarcadores y/o dianas específicos para modular con agentes bioactivos para el tratamiento contra el cáncer. En particular, sigue existiendo la necesidad de desarrollar nuevos métodos para el diagnóstico, pronóstico y tratamiento del cáncer.
Sumario de la invención
De acuerdo con un primer aspecto, la invención se relaciona con un método para diagnosticar un carcinoma hepatocelular en un mamífero que lo necesite. El método comprende las siguientes etapas:
- proporcionar una muestra biológica recolectada de dicho mamífero;
- determinar, a partir de dicha muestra biológica, si el gen ADAMTSL5 está sobreexpresado;
- diagnosticar un carcinoma hepatocelular a partir de la determinación de la sobreexpresión de dicho gen.
De acuerdo con un segundo aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende un agente direccionado al propio gen ADAMTSL5 y/o la ruta en la que actúa ADAMTSL5, y un portador farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de un cáncer.
De acuerdo con un tercer aspecto, la invención se refiere al uso in vitro de una proteína ADAMTSL5 como biomarcador de un carcinoma hepatocelular.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para monitorizar la respuesta a un tratamiento anticancerígeno de un mamífero que padece carcinoma hepatocelular que comprende determinar el nivel de expresión de ADAMTSL5 en una muestra biológica de dicho mamífero en dos o más momentos durante dicho tratamiento anticancerígeno, en donde un nivel de expresión de ADAMTSL5 igual o mayor en una muestra biológica del sujeto en un momento posterior, en comparación con un valor de referencia obtenido en una muestra biológica del sujeto en un momento anterior, es indicativo de una resistencia del sujeto a dicho tratamiento anticancerígeno, mientras que un nivel más bajo de ADAMTSL5 es indicativo de una respuesta del sujeto a dicho tratamiento anticanceroso.
Ventajosamente, el método para el diagnóstico de un carcinoma hepatocelular en un mamífero que lo necesite, de acuerdo con la invención, se caracteriza porque: - la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, tejido de biopsia, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo o sobrenadante de lisado celular, preferiblemente la muestra biológica es biopsia de tejido, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina; -la sobreexpresión del gen ADAMTSL5 en la muestra biológica se determina midiendo los niveles de proteína ADAMTSL5 o los niveles de ARNm en dicha muestra biológica; - los niveles de proteína ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden añadiendo al menos un anticuerpo de tipo anti-ADAMTSL5 a dicha muestra biológica; - el tipo de anticuerpo anti-ADAMTSL5 se selecciona del grupo que consiste, desacoplado o acoplado con peroxidasa de rábano picante fosfatasa alcalina, o con colorantes fluorescentes; - los niveles de proteína ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden mediante inmunotinción, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación western o ELISA; y - los niveles de ARNm de ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden mediante metodologías disponibles para detectar ARNm en dicha muestra biológica, incluidos micro matriz, secuanciación de ARN, hibridación in situ, ARNscopía, así como RT-PCR regular, semicuantitativo o cuantitativo.
La composición farmacéutica de acuerdo con la invención se caracteriza porque: - los agentes que direccionados a ADAMTSL5 se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos de bloqueo, sh-ARN, si-ARN y ARN antisentido contra ADAMTSL5.
Breve descripción de los dibujos
Otras características y aspectos de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción y los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 ilustra la hipermetilación en el cuerpo del gen CGI de ADAMTSL5 y la sobreexpresión de ADAMTSL5 en un modelo de cáncer en ratón clínicamente relevante (ratones Alb-R26Met);
La figura 2 ilustra la sobreexpresión del ARNm y la proteína de ADAMTSL5 en un modelo de cáncer en ratón clínicamente relevante (ratones Alb-R26Met);
La figura 3 ilustra las propiedades tumorigénicas de células de carcinoma hepatocelular (CHC) in vitro establecidas a partir de un modelo de cáncer en ratón clínicamente relevante (ratones Alb-R26Met) con altos niveles de expresión de ADAMTSL5 en comparación con células con niveles reducidos de expresión de ADAMTSL5;
La figura 4 ilustra la pérdida in vivo de propiedades tumorigénicas de células de HCC después de la subregulación de ADAMTSL5;
La figura 5 ilustra la adquisición in vivo de propiedades tumorigénicas de hepatocitos inmortalizados de un modelo de ratón clínicamente relevante (ratones R26Met) después de la sobreexpresión de ADAMTSL5;
La figura 6 ilustra los niveles de expresión de ADAMTSL5 en un modelo de cáncer en ratón clínicamente relevante (ratones Alb-R26Met) en etapas tempranas y tardías de tumorigénesis;
La figura 7 ilustra niveles elevados de ARNm de ADAMTSL5 en el 52 % de pacientes con HCC, con predominio en los asociados a la ingesta de alcohol;
La figura 8 ilustra la sobreexpresión de los niveles de proteína ADAMTSL5 en 9/10 de pacientes con HCC en comparación con el hígado adyacente; y
La figura 9 ilustra los niveles de ARNm de ADAMTSL5 en líneas celulares de cáncer humano.
Descripción detallada de la invención
La invención se relaciona con un método para diagnosticar y pronosticar un carcinoma hepatocelular en un mamífero que lo necesite. En primer lugar, el método comprende una etapa de proporcionar una muestra biológica obtenida de dicho mamífero, seguido de una etapa de determinar, a partir de dicha muestra biológica, si el gen/proteína ADAMTSL5 está sobreexpresado, y luego, de acuerdo con una tercera etapa, diagnosticar/pronosticar un cáncer a partir de la determinación de la sobreexpresión de dicho gen o proteína.
De acuerdo con la invención, el mamífero es en particular un humano. Sin embargo, todos los mamíferos están involucrados, incluso gatos, perros, caballos o roedores como ratones y ratas. De acuerdo con la invención, la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, biopsia de tejido, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo y sobrenadante de lisado celular. La muestra biológica que se utiliza en particular es biopsia de tejido, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina. De acuerdo con una realización preferida de la invención, la sobreexpresión del gen ADAMTSL5 en la muestra biológica obtenida de los mamíferos que lo necesitan se determina midiendo los niveles de proteína ADAMTSL5 o los niveles de ARN en dicha muestra biológica. El término "sobrerregulado", "sobrerregulación", "sobreexpresado" o "sobreexpresión" se utiliza para indicar que la expresión, actividad o nivel de un gen, o transcripciones de ARN o productos proteicos del gen, es mayor en relación con uno o más controles, como, por ejemplo, uno o más controles positivos y/o negativos. En particular, se consideran niveles aumentados cuando los niveles son más altos que los de los tejidos sanos de control.
En la práctica, los genomas de los mamíferos contienen 19 genes ADAMTS (una desintegrina y metaloproteinasa con tromboespondina) numerados del 1 al 20. Al igual que sus parientes, las metaloproteinasas de matriz (MMP) y las ADAM, las ADAMTS pertenecen a la superfamilia de proteasas de metzincina, denominada así por el residuo de metionina conservado cerca del sitio activo de la metaloproteinasa dependiente de iones de zinc. Los representantes de la familia ADAMTS se encuentran en todos los metazoos, aunque, hasta la fecha, no se han identificado en organismos unicelulares ni en plantas. Todas las ADAMTS son enzimas extracelulares secretadas que tienen una organización de dominio compuesta que comprende, desde el terminal amino: un péptido señal seguido de una pro región de longitud variable; un dominio de metaloproteinasa; un dominio tipo desintegrina; un motivo central de repetición de secuencia (TSR) de trombospondina tipo 1; y un dominio rico en cisteína seguido de una región espaciadora. Aparte de los ADAMTS, otra familia de siete genes tipo ADAMTS (ADAMTSL) codifican proteínas que se asemejan a los dominios auxiliares de ADAMTS, aunque carecen de sus dominios catalíticos. Estas proteínas ADAMTSL, que incluyen ADAMTSL 1 a 6 y papilina, pueden funcionar para modular las actividades de ADAMTS. ADAMTSL5 es una proteína que se descubrió a fines de la década de 2000 y se describe que se enlaza a la fibrilina-1 y promueve la formación de fibrillas. El papel de ADAMTSL5 en la formación de microfibrillas es de considerable interés como mecanismo crucial para la regulación del factor de crecimiento en la matriz extracelular. ADAMTSL5 es más particularmente una proteína secretada con una composición de dominio única, que comprende una repetición de trombospondina tipo 1 terminal N, un módulo rico en cisteína, un módulo espaciador y un módulo tipo netrina terminal C, que está conectado al espaciador por un segmento rico en prolina. Se sabe que ADAMTSL5 ya está implicado en algunas enfermedades como la psoriasis pero, hasta la fecha, ADAMTSL5 no se ha relacionado con el cáncer, como biomarcador potencial o como diana para terapias moleculares.
En el contexto de la presente invención y en una realización preferida, el nivel de proteína ADAMTSL5 se mide añadiendo al menos un anticuerpo a dicha muestra biológica. El anticuerpo, que se utiliza en particular para medir los niveles de proteína ADAMTSL5, es de tipo anti-ADAMTSL5. El anticuerpo anti-ADAMTSL5 se selecciona en particular del grupo que consiste en desacoplado o acoplado o conjugado con fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante (HRP) o con colorantes fluorescentes.
De acuerdo con la invención, los niveles de proteína ADAMTSL5 presentes en la muestra biológica de los mamíferos que lo necesitan se miden en particular mediante inmunotinción, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación western o ELISA.
En bioquímica, la inmunotinción se conoce como el uso de un método con base en anticuerpos para detectar una proteína específica en una muestra biológica. La inmunotinción abarca una amplia gama de técnicas utilizadas en histología, biología celular y biología molecular, que utilizan métodos de tinción con base en anticuerpos. La inmunofluorescencia es una técnica utilizada para la microscopía óptica con un microscopio de fluorescencia y se utiliza principalmente en muestras microbiológicas. Esta técnica utiliza la especificidad de los anticuerpos contra su antígeno para tener como diana tintes fluorescentes a biomoléculas diana específicas dentro de una célula y, por lo tanto, permite la visualización de la distribución de la molécula diana a través de la muestra.
También se describe un kit para determinar una sobreexpresión del gen ADAMTSL5 en una muestra biológica obtenida de un mamífero. El kit comprende al menos un anticuerpo de tipo anti-ADAMTSL5 y un recipiente para contener la muestra biológica. Los anticuerpos tipo anti-ADAMTSL5 utilizados en el kit son los mismos que los descritos anteriormente.
De acuerdo con la invención, los niveles de ADAMTSL5 presentes en la muestra biológica de los mamíferos que lo necesitan también pueden determinarse midiendo los niveles de ARNm de ADAMTSL5 utilizando, por ejemplo, micro matriz, secuenciación de ARN, hibridación in situ, ARNscopía, así como RT-PCR regulares, semicuantitativos o cuantitativos.
De acuerdo con un segundo aspecto, la invención se relaciona con una composición farmacéutica. La composición farmacéutica comprende un agente como se define en la reivindicación 8 independiente. En un aspecto no reivindicado, también se describe un agente desmetilante, como por ejemplo Decitabina, o agentes que modulan la glicosilación y/o el enlace de heparina. Un agente desmetilante, de acuerdo con esta descripción, es un compuesto que conduce a la hipometilación del ADN genómico mediante la inhibición de la ADN metiltransferasa.
En un tercer aspecto, la invención se refiere a un uso in vitro de una proteína ADAMTSL5 como biomarcador de un carcinoma hepatocelular.
En un cuarto aspecto, la invención se relaciona con un método in vitro para monitorizar la respuesta a un tratamiento anticancerígeno de un mamífero que padece cáncer que comprende determinar el nivel de expresión de ADAMTSL5 en una muestra biológica de dicho mamífero en dos o más momentos durante dicho tratamiento anticancerígeno, en donde un nivel de expresión de ADAMTSL5 igual o mayor en una muestra biológica del sujeto en un momento posterior, en comparación con un valor de referencia obtenido en una muestra biológica del sujeto en un momento anterior, es indicativo de una resistencia del sujeto a dicho tratamiento anticanceroso, mientras que un nivel más bajo de ADAMTSL5 es indicativo de una respuesta del sujeto a dicho tratamiento anticanceroso.
Ejemplos: materiales y métodos:
En los siguientes ejemplos, se usaron ratones genéticamente modificados. En estos ratones, los niveles de expresión de Met, un receptor de tirosina quinasa (RTK) activado en aproximadamente el 50 % de los HCC humanos, aumentan ligeramente por encima del nivel endógeno, según una metodología genética que permite la modulación de la expresión génica de manera especifica tejido/temporal ("ratones R26sstopMet; Fan et al. PLoS Genetics 2015; Fan et al. Hepatology 2017). Recientemente se demostró que los niveles mejorados de expresión de RTK de metilación (Met) en el hígado perturban la homeostasis del tejido, lo que lleva a la iniciación del tumor y la evolución a HCC (Alb-R26Met). Con base en comparaciones de los niveles de expresión de Met en Alb-R26Met (n=32) y tumores hepáticos humanos (n=249), se demostró que los niveles de Met en el entorno genético Alb-R26Met (3.16 ± 0.06 frente a hígados de control) corresponde los encontrados en aproximadamente el 20 % de los pacientes con HCC (48/249). Al analizar 96 genes diferentes en un panel de muestras de tumores (n=32), se demostró que la tumorigénesis hepática modelada por los ratones Alb-R26Met corresponde a un subconjunto de pacientes con HCC, lo que establece la relevancia clínica del modelo de ratones HCC Alb-R26Met. Se usó el modelo de ratones Alb-R26Met para explorar el impacto de la metilación del ADN en los interruptores transcripcionales asociados con la tumorigénesis. Se identificó un enriquecimiento llamativo en genes simultáneamente hipermetilados en islas CpG (CGIs) y sobreexpresados. Entre ellos, se encuentra ADAMTSL5.
Ejemplo 1: Hipermetilación en el cuerpo del gen CGI de ADAMTSL5 y sobreexpresión de ARNm ADAMTSL5 en el modelo tumoral Alb-R26Met en comparación con hígados de control.
La figura 1 (A) muestra una representación esquemática de las transcripciones de ADAMTSL5 de ratón y CGI del navegador de genoma UCSC y las anotaciones del gen Refseq con base en la referencia de ratón NCBI37/mm9. El esquema permite la visualización de exones, intrones y CGI de AdamtsL5, resaltando con un cuadrado el cuerpo del gen que CGI encontró hipermetilado en tumores.
La figura 1 (B) es una representación esquemática de la proteína ADAMTSL5 humana de Badel et al. Matric Biology, 2012. Se reportan los diferentes dominios presentes en la proteína ADAMTSL5, que podrían estar involucrados en la modulación de las interacciones de ADAMTSL5 con otras proteínas y en las funciones biológicas de ADAMTSL5.
Las figuras 1 (C) y (D) ilustran los niveles de metilación (valor p) de ADAMTSL5 en el promotor CGI (figura 1 (C)) y en el cuerpo del gen CGI (figura 1 (D)) en hígados de control (n = 3) y tumores Alb-R26Met (n=10). Se observa que los niveles de metilación de ADAMTSL5 en el promotor CGI es similar en las muestras de control y de tumor, mientras que los niveles de metilación en el cuerpo del gen CGI son significativamente más altos en tumores Alb-R26Met en comparación con los hígados de control. Se concluye que los tumores se caracterizan por una hipermetilación de ADAMTSL5 en el cuerpo del gen CGI.
La figura 1(E) ilustra los niveles de expresión de ARNm de ADAMTSL5 en Alb-R26Met tumores en comparación con los hígados de control por secuenciación ARN. Los gráficos muestran los recuentos de lectura (a la derecha) y Log2FC (veces de cambio) (a la izquierda). Significancia: *: P<0.05; FDR (valor p ajustado) = 4.31E-15. Se concluye que los tumores se caracterizan por una sobreexpresión de ARNm de ADAMTSL5.
La figura 1 (F) ilustra los niveles de expresión ADAMTSL5 (por RT-qPCR) en tumores Alb-R26Met(n=16) en relación con los hígados de control (n=5). Se observan altos niveles de expresión de ADAMTSL5 en tumores Alb-R26Met en comparación con los hígados de control. Se concluye que los tumores se caracterizan por una sobreexpresión constante de ARNm de ADAMTSL5.
Ejemplo 2: Sobreexpresión de ARNm y proteína de ADAMTSL5 en un modelo tumoral Alb-R26Met
La figura 2 (A) muestra imágenes representativas de los niveles de expresión de ARNm de ADAMTSL5(por ARNscopía) en tumores (diseccionados de ratones Alb-R26Met) y en hígado control (diseccionado de ratones control). Se observa una fuerte tinción en tumores Alb-R26Met, pero no en hígados control. Se concluye que, de manera similar a los datos de los análisis de secuenciación de ARN y RT-qPCR, los tumores se caracterizan por una sobreexpresión constante de ARNm de ADAMTSL5.
La figura 2(B) muestra imágenes representativas de los niveles de proteína ADAMTSL5 por inmunofluorescencia (izquierda) e inmunotinción (derecha) en tumores (diseccionados de ratones Alb-R26Met) y en hígado control (diseccionado de ratones control). Se observa que ADAMTSL5 se sobreexpresa en tumores de ratones Alb-R26Met en comparación con los hígados control. Se concluye que los tumores se caracterizan por una sobreexpresión constante de la proteína ADAMTSL5, coherente con niveles elevados de ARNm.
Ejemplo 3: propiedades tumorigénicas in vitro de células HCC Alb-R26Met, en las que se sobreexpresa ADAMTSL5. *: P< 0.05; **: P< 0.01; ***: P< 0.001.
La figura 3(A) es una representación esquemática del establecimiento de líneas celulares HCC Alb-R26Met (Fan et al. Hepatology, 2017) utilizado para estudios moleculares y funcionales. El esquema recapitula cómo se han generado líneas celulares de HCC para su caracterización molecular y para uso en ensayos biológicos. Siguiendo el protocolo, se establece y se informa en Fan et al. Hepatology, 2017, que las líneas celulares de HCC se generaron a partir de tumores hepáticos disecados de diferentes ratones Alb-R26Met. Brevemente, los tumores disecados se trituraron, se incubaron en una solución que contenía colagenasa y ADNasa, y los restos de tejido se eliminaron utilizando un filtro estéril de 100 pm. A continuación, las células se cultivaron en medio William E con suplementos directamente en condiciones adherentes o durante una semana en condiciones no adherentes para enriquecer las células con propiedades tumorigénicas. Después de la expansión de las células cultivadas, una parte de ellas se congeló y se mantuvo como solución madre, mientras que otra parte se caracterizó molecularmente (bioquímica, RT-qPCR) y funcionalmente (por su capacidad para formar tumores en ratones lampiños).
La figura 3(B) es un gráfico que informa los niveles de expresión ADAMTSL5 (por RT-qPCR) en tres líneas celulares HCC Alb-R26Met ( H c C 3 , HCC13 y HCC14) en relación con los hígados de control. Se concluye que las células de HCC se caracterizan por una sobreexpresión constante de ARNm de células de HCC ADAMTSL5, como se muestra en los tumores.
La figura 3(C) muestra los niveles de expresión de ARNm ADAMTSL5 en células Alb-R26Met transfectadas de forma estable con un plásmido que porta una secuencia direccionada a shARN (que también porta el gen de puromicina para la selección de clones estables) frente a los controles. Las células se transfectan con el plásmido de interés, luego se exponen después de 48 horas a puromicina durante 7 días para seleccionar células en las que el plásmido se ha integrado de forma estable. Los clones en los que los niveles de expresión de ADAMTSL5 están subregulados por la secuencia de direccionamiento de shARN se identifican mediante RT-qPCR. Se concluye que la secuencia de direccionamiento de shARN contra ADAMTSL5 conduce a una subregulación eficiente de niveles de ARNm ADAMTSL5 en células de HCC, que interfieren con los niveles de expresión de la proteína ADAMTSL5.
La figura 3(D) ilustra los resultados del ensayo de crecimiento independiente del anclaje (ensayo de agar blando) realizado utilizando células de control de HCC o células de HCC que portan la secuencia de shARN direccionada a ADAMTSL5. Este ensayo ejemplifica la capacidad de las células para formar colonias en condiciones no adherentes, revelando así sus propiedades tumorigénicas in vitro.
Los resultados muestran que el número de colonias formadas por las células HCC Alb-R26Met que portan una secuencia de shARN direccionada a ADAMTSL5 se reduce en comparación con las células de control. Se concluye que se requieren altos niveles de ADAMTSL5 en células HCC para sus propiedades tumorigénicas in vitro.
La figura 3(E) es descriptiva del ensayo de crecimiento independiente de anclaje (ensayo de agar blando) que muestra parcialmente el rescate de propiedades tumorigénicas in vitro de células de HCC Alb-R26Met direccionadas a ADAMTSL5 con medios de acondicionamiento de células de control. Los resultados indican que ADAMTSL5 extracelular confiere tumorigenicidad a las células que expresan niveles bajos de ADAMTSL5. Se concluye que ADAMTSL5, que es una proteína secretada, provoca su función en el medio extracelular y puede actuar también en una célula de manera no autónoma.
La figura 3(F) son imágenes representativas (izquierda) y cuantificación (derecha) de esferas tumorales derivadas del control y células de HCC Alb-R26Met direccionadas a ADAMTSL5 (derecha). Se observa un mayor número y tamaño de la esfera tumoral generada a partir de células de control en comparación con células de HCC Alb-R26Met ADAMTSL5 (que portan la secuencia de shARN direccionada a ADAMTSL5). Se concluye que altos niveles de ADAMTSL5 en células HCC confieren capacidades de autorrenovación.
Ejemplo 4: Pérdida de propiedades tumorigénicas in vivo de las células de HCC después de la subregulación de ADAMTSL5 en células de HCC Alb-R26Met. *: P< 0.05; **: P< 0.01; ***: P< 0.001.
La figura 4(A) contiene imágenes de tumores disecados de xenoinjertos en ratones inmunodeprimidos inyectados con células de HCC Alb-R26Met (arriba) o con células HCC Alb-R26Met-shADAMTSL5 (abajo).
Los estudios de xenoinjerto se realizaron mediante inyección subcutánea de células de HCC Alb-R26Met o Alb-R26Met -shADAMTSL5 (5 * 106 células) en el flanco de ratones inmunodeprimidos. La figura 4 (A) comprende imágenes de tumores disecados después de 8 semanas del establecimiento de xenoinjertos. Se observa que los tumores se forman en ratones inmunodeprimidos en donde las células de HCC Alb-R26Met se inyectaron por vía subcutánea, mientras que los tumores de ratones en donde las células de HCC Alb-R26Met-shADAMTSL5 se inyectaron por vía subcutánea se reducen drásticamente, lo que ilustra las propiedades tumorigénicas de las células deterioradas in vivo.
La figura 4(B) contiene curvas de crecimiento de xenoinjertos que informan el volumen tumoral medio por grupo medido cada semana. Se concluye que la subregulación de los niveles de ADAMTSL5 en células de HCC (logrado mediante la transfección estable de una secuencia direccionada a shARN) interfiere con propiedades tumorigénicas in vivo de las células de HCC. En conjunto, estos resultados muestran que la subregulación de los niveles de expresión de ADAMTSL5 interfiere con el establecimiento/evolución tumoral.
En la figura 4(C), se muestra un análisis cuantitativo del volumen de tumores disecados 8 semanas después de la inyección de células. Cada punto corresponde al volumen de cada tumor. Se concluye que la subregulación de los niveles de ADAMTSL5 en células de HCC (logrado mediante la transfección estable de una secuencia direccionada a shARN) interfiere con propiedades tumorigénicas in vivo.
Ejemplo 5: Adquisición de propiedades tumorigénicas in vivo después de la sobreexpresión de ADAMTSL5 por hepatocitos sensibilizados-R26Met.
La figura 5(A) es una representación esquemática del establecimiento de hepatocitos sensibilizados inmortales-R26Met (hepatocitos embrionarios que portan niveles elevados de Met RTK e inmortalizados con el antígeno T grande SV40). Brevemente, hepatocitos cultivados de hígados R26Met embrionarios de ratón E15.5 se infectaron con un retrovirus que portaba el antígeno T grande SV40 para la inmortalización (más el gen de neomicina para la selección de clones estables) y luego se trataron durante 7 días con un medio que permitía que los hepatocitos agotaran otros tipos de células. Los hepatocitos inmortales-R26Met están sensibilizados debido al aumento de 3 veces de los niveles de Met de tipo salvaje, aunque no son tumorigénicos ya que son incompetentes para formar tumores en xenoinjertos.
La figura 5(B) comprende imágenes de ratones después de 11 semanas del establecimiento de xenoinjertos. Se observa que los ratones inmunodeprimidos en donde la inyección subcutánea de inmortales-R26Met hepasobreAdamtsl5 (células que sobreexpresan ADAMTSL5) desarrollan tumores en ambos flancos.
Los estudios de xenoinjerto se realizaron mediante inyección subcutánea de control inmortales-R26Met (inmortales-R26Met hepasobreAdamtsl5) o sobreexpresando ADAMTSL5 (inmortales-R26Met hepasobreAdamtsl5) hepatocitos (5*10® células) en ambos flancos de ratones desnudos.
La figura 5(C) contiene curvas de crecimiento de xenoinjertos que informan el volumen tumoral medio por grupo medido cada semana.
En la figura 5(D), se muestra un análisis cuantitativo del volumen de tumores disecados 11 semanas después de la inyección de células. Cada punto corresponde al volumen de cada tumor. Se observa que todos los ratones inyectados con inmortales-R26Met hepasobreAdamtsl5 formaron tumores en contraste con los ratones inyectados con inmortales-R26Met hepaWT Se concluye que la sobreexpresión de los niveles de ADAMTSL5 en hepatocitos inmortales, que no son tumorigénicos como incompetentes para formar tumores en xenoinjertos, es suficiente para conferirles propiedades tumorigénicas de las células in vivo.
Ejemplo 6: Nivel de expresión de ADAMTSL5 en Tumores Alb-R26Met en estadíos tempranos y tardíos.
La figura 6(A) es una representación esquemática de las muestras de tejido utilizadas para el análisis RT-qPCR de los niveles de ADAMTSL5. Las muestras utilizadas son: hígados control de tipo salvaje (WT), hígados Alb-R26Met sanos, tumores Alb-R26Met en estadios tempranos y avanzados.
En la figura 6(B), los gráficos informan los niveles de expresión (por RT-qPCR) de ADAMTSL5, AFP (alfa-fetoproteína), GPC3 (Glypican-3) (dos marcadores HCC), y Ki67 (un marcador proliferativo). Se observan niveles de expresión bajos comparables de ADAMTSL5 así como para los demás marcadores analizados en hígados sanos de tipo salvaje y Alb-R26Met. Por el contrario, los niveles de transcripción ya están aumentados en tumores Alb-R26Met en etapas tempranas. Se concluye que los niveles de transcripción de ADAMTSL5 se pueden usar para discriminar muestras sanas de neoplásicas que ya se encuentran en un estado tumorigénico temprano.
Ejemplo 7: Altos niveles de ARNm ADAMTSL5 están presentes en el 52 % de los pacientes con HCC, con predominio en los asociados a la ingesta de alcohol.
En la figura 7(A), la cohorte de pacientes con HCC (371 pacientes) con niveles de ARNm ADAMTSL5 se informan en la parte superior: 21 % se caracterizan por subregulación de ADAMTSL5 (blanco, izquierda), 27 % sin cambios (blanco con líneas negras, centro) y 52 % de pacientes con HCC con sobrerregulación de niveles de ARNm ADAMTSL5 (negro, derecha). Abajo: gráfico que informa los tres subgrupos de pacientes con HCC de acuerdo con niveles de expresión de ADAMTSL5 bajos, sin cambios y altos (se indican números y porcentajes). Los datos corresponden a estudios de secuenciación de ARN de una cohorte de 371 pacientes con h Cc (de TCGA). Tener en cuenta que ADAMTSL5 se sobreexpresa en 193 de 371 pacientes con h Cc (52 %; Log2CF>1; FDR<0.05). Se concluye que altos niveles de transcripción ADAMTSL5 se pueden detectar en más del 50 % de los pacientes con HCC.
En la figura 7(B), la tabla informa la presencia (línea negra) o la ausencia de principales factores de riesgo de HCC en los 371 pacientes analizados. Tener en cuenta que los pacientes con HCC con niveles ADAMTSL5 aumentados se asocian significativamente, aunque no exclusivamente, a alcohol ingerido. Se concluye que niveles elevados de ARNm de ADAMTSL5 está presente en una gran proporción de pacientes caracterizada por varios factores de riesgo, con predominio de los asociados a la ingesta de alcohol.
Ejemplo 8: Los niveles de proteína ADAMTSL5 están sobreexpresados en la gran mayoría de los pacientes con HCC analizados.
La figura informa la inmunotinción con anticuerpos anti-ADAMTSL5 en muestras tumorales en comparación con el hígado adyacente. Tener en cuenta los niveles fuertes de proteína ADAMTSL5 (tinción oscura; por Fast Red) en todos los pacientes con HCC analizados (excepto el paciente # 8). Se concluye que los altos niveles de proteína ADAMTSL5 caracterizan a la gran mayoría de los pacientes con HCC.
Ejemplo 9: Sobreexpresión de ADAMTSL5 en un panel de líneas celulares de cáncer humano.
El gráfico muestra los niveles de expresión de ARNm de ADAMTSL5 en un panel de líneas celulares HCC humano, en línea celular MKN (cáncer gástrico), en líneas celulares de mama humana, en línea celular de cáncer HELA (cuello uterino humano) y en línea celular HEK (riñón embrionario humano). Valor medio de tres experimentos independientes. Se concluye que niveles elevados de ARNm de ADAMTSL5 están presentes en las células cancerosas con diferente origen.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para diagnosticar un carcinoma hepatocelular en un mamífero que lo necesite, que comprende las siguientes etapas:
proporcionar una muestra biológica recolectada de dicho mamífero;
determinar, a partir de dicha muestra biológica, si el gen ADAMTSL5 está sobreexpresado;
diagnosticar un carcinoma hepatocelular a partir de la determinación de la sobreexpresión de dicho gen.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste en sangre, tejido de biopsia, suero sanguíneo, plasma sanguíneo, orina, heces, esputo, líquido cefalorraquídeo o sobrenadante de lisado celular, preferiblemente la muestra biológica es tejido de biopsia, sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina.
3. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la sobreexpresión del gen ADAMTSL5 en la muestra biológica se determina midiendo los niveles de proteína ADAMTSL5 o los niveles de ARNm en dicha muestra biológica.
4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los niveles de proteína ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden añadiendo al menos un anticuerpo de tipo anti-ADAMTSL5 a dicha muestra biológica.
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el anticuerpo tipo anti-ADAMTSL5 se selecciona del grupo que consiste en acoplado o no acoplado con fosfatasa alcalina con peroxidasa de rábano picante, o con colorantes fluorescentes.
6. El método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en donde los niveles de proteína ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden usando inmunotinción, inmunofluorescencia, inmunoprecipitación western o ELISA.
7. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde los niveles de ARNm ADAMTSL5 en la muestra biológica se miden mediante metodologías disponibles para detectar ARNm en dicha muestra biológica, incluidos micro matrices, secuenciación de ARN, hibridación in situ, ARNscopía, así como RT-PCR regulares, semicuantitativas o cuantitativas.
8. Una composición farmacéutica que comprende un agente direccionado a ADAMTSL5 y un portador farmacéuticamente aceptable para uso en el tratamiento de un carcinoma hepatocelular, en donde los agentes direccionados a ADAMTSL5 se seleccionan del grupo que consiste en anticuerpos bloqueadores, sh-ARN, si-ARN y ARN antisentido contra ADAMTSL5.
9. Un uso in vitro de una proteína ADAMTSL5 como biomarcador de un carcinoma hepatocelular.
10. Un método in vitro para monitorizar la respuesta a un tratamiento anticancerígeno de un mamífero que padece carcinoma hepatocelular que comprende determinar el nivel de expresión de ADAMTSL5 en una muestra biológica de dicho mamífero en dos o más momentos durante dicho tratamiento anticanceroso, en donde un nivel de expresión de ADAMTSL5 igual o mayor en una muestra biológica del sujeto en un momento posterior, en comparación con un valor de referencia obtenido en una muestra biológica del sujeto en un momento anterior, es indicativo de una resistencia del sujeto a dicho tratamiento anticanceroso, mientras que un nivel más bajo de ADAMTSL5 es indicativo de una respuesta del sujeto a dicho tratamiento anticanceroso.
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