CN112020649A - 用于基于adamtsl5基因的过表达诊断和治疗癌症的方法和试剂盒 - Google Patents
用于基于adamtsl5基因的过表达诊断和治疗癌症的方法和试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种用于在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法。所述方法包括以下步骤：从所述哺乳动物收集生物样品；从所述生物样品中确定ADAMTSL5基因是否过表达；根据所述基因的过表达的确定来诊断癌症。其还涉及一种用于确定从哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5基因的过表达的试剂盒，涉及用于治疗癌症的包含靶向ADAMTSL5或ADAMTSL5途径的试剂以及药学上可接受的载体的药用组合物，以及涉及ADAMTSL5 mRNA或蛋白作为癌症生物标志物的用途。
Description
发明的技术领域
本发明涉及一种用于在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法。本发明的方法包括确定从所述哺乳动物获得的生物样品中特定生物标志物的表达水平的步骤。本发明还涉及用于确定这种表达水平的试剂盒以及用于抑制特定生物标志物途径的药用组合物。
发明背景
癌症为世界上第二大死亡原因。全球将近六分之一的死因是癌症。例如，2015年有880万人死于癌症。因此，重要的是开发新的方法用于改善在需要它的患者中的癌症诊断，并且尤其是用于预测其对治疗的敏感性以便增加其治疗反应，这将导致增加生存预期。
表观遗传学是对基因活性变化的研究，其不包括DNA序列的修饰，并且可在细胞分裂中传播。与影响DNA序列的突变不同，表观遗传修饰是可逆的。众所周知，表观遗传异常导致人类疾病，尤其是癌症的发展和进展。表观遗传过程介入许多事件比如细胞分裂、分化、存活和运动性的调控。这些机制的改变促进健康细胞向癌细胞的转化，并因此任何表观遗传异常均可能与致瘤性有关。在与细胞表观遗传异常有关的后果中，有肿瘤抑制基因沉默或癌基因(比如原癌基因)的过表达，其包括编码负责染色质修饰的酶的基因的异常DNA甲基化或突变。DNA甲基化是影响细胞中基因表达水平的必不可少的表观遗传机制。这些改变可导致急剧的生物学变化以及恶性特性的获得。癌症景况通常特征在于弥漫性DNA低甲基化和在称为CpG岛(CGI)的富含CpG的区域中的局灶性过度甲基化。通常，启动子处的CGI过度甲基化会抑制充当肿瘤抑制因子的基因的转录。尽管如此，在基因体CGI中也观察到大部分的DNA甲基化，在甲基化与基因表达上调之间呈正相关。这意味着基因体CGI中的DNA过度甲基化与基因的上调有关，所述基因会充当致瘤性的正调控因子，这与所报道的其中一些在癌细胞中的功能相一致。然而，几个其他过度甲基化和上调的基因在细胞致瘤性中的含义仍然未知。
这些发现破坏了靶向表观遗传调控因子的药物(称为表观遗传药物(epi-drug)或表观遗传药(epi-medicine))的开发。到目前为止，尤其开发了两个主要的化合物家族：(i)抑制DNA甲基化的化合物，和(ii) 靶向组蛋白修饰的化合物。然而，目前这些类型的化合物缺乏特异性作用。
基于以上所述，仍然需要鉴定可用作新的特异性生物标志物和/或靶标的基因，以用生物活性剂进行调节从而进行癌症治疗。特别地，仍然需要开发用于诊断、预后和治疗癌症的新方法。
发明概述
根据第一方面，本发明涉及一种用于在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法。所述方法包括以下步骤：
- 从所述哺乳动物收集生物样品；
- 从所述生物样品中确定ADAMTSL5基因是否过表达；
- 根据所述基因的过表达的确定来诊断癌症。
根据第二方面，本发明涉及用于确定从哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5基因的过表达的试剂盒。所述试剂盒包含至少一种抗ADAMTSL5类型的抗体、用于容纳生物样品的容器以及用于测量从哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5癌症标志物基因，优选肝细胞癌标志物基因的过表达的方案。
根据第三方面，本发明涉及药用组合物。所述药用组合物包含靶向ADAMTSL5基因本身和/或其中ADAMTSL5起作用的途径的试剂和药学上可接受的载体用于治疗癌症。
根据第四方面，本发明涉及ADAMTSL5蛋白作为癌症生物标志物的用途。
在第五方面，本发明涉及用于在需要它的哺乳动物中治疗癌症的方法。所述癌症与上述那些癌症相同。所述方法包括在需要它的哺乳动物中诊断癌症的第一步骤，以及通过给予ADAMTLS5的抑制剂治疗癌症的第二步骤。诊断癌症的步骤包括与以上在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法中描述的那些相同的步骤。
在第六方面，本发明涉及用于监测患有癌症的哺乳动物对抗癌治疗的反应的体外方法，其包括在所述抗癌治疗期间的两个或更多个时间点确定所述哺乳动物的生物样品中ADAMTSL5的表达水平，其中与在较早时间点的受试者的生物样品中获得的参考值相比较，在较晚时间点的受试者的生物样品中相等或更高的ADAMTSL5表达水平指示受试者对所述抗癌治疗具有抗性，而较低的ADAMTSL5水平则指示受试者对所述抗癌治疗有反应。
有利地，本发明的用于在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法的特征在于：- 癌症选自脑癌、CNS癌、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、肾癌、胃肠癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、宫颈癌、肝癌和肝细胞癌，优选地癌症为肝细胞癌；- 生物样品选自血液、活检组织、血清、血浆、尿、粪便、痰、脑脊液或来自细胞裂解物的上清液，优选地生物样品为组织活检、血液、血浆、血清或尿；- 通过测量所述生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平或mRNA水平来确定生物样品中ADAMTSL5基因的过表达；- 通过向所述生物样品中添加至少一种抗ADAMTSL5类型的抗体来测量生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平；- 抗ADAMTSL5类型的抗体选自与碱性磷酸酶辣根过氧化物酶或与荧光染料未偶联或偶联的；- 通过使用免疫染色、免疫荧光、蛋白质印迹或ELISA测量生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平。
有利地，本发明的用于确定ADAMTSL5基因过表达的试剂盒的特征在于：- 抗ADAMTSL5类型的抗体选自与碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或与荧光染料未偶联或偶联/缀合的。
有利地，本发明的药用组合物的特征在于：- 靶向ADAMTSL5或ADAMTSL5途径的试剂选自阻断抗体、肽、sh-RNA、si-RNA、微小RNA、反义RNA、化学药物、去甲基化剂和调节糖基化和/或肝素结合的试剂。
附图简述
本发明的其他特征和方面从以下描述和附图将显而易见，其中：
图1说明在临床相关的癌症小鼠模型(Alb-R26 Met 小鼠)中ADAMTSL5的基因体CGI中的过度甲基化和ADAMTSL5的过表达；
图2说明在临床相关的癌症小鼠模型(Alb-R26 Met 小鼠)中ADAMTSL5 mRNA和蛋白的过表达；
图3说明与具有降低的ADAMTSL5表达水平的细胞相比较，具有高表达水平的ADAMTSL5的从临床相关的癌症小鼠模型(Alb-R26 Met 小鼠)建立的肝细胞癌(HCC)细胞的体外致瘤特性；
图4说明ADAMTSL5下调后HCC细胞的体内致瘤特性丧失；
图5说明ADAMTSL5过表达后来自临床相关的小鼠模型(Alb-R26 Met 小鼠)的永生化肝细胞的致瘤特性的体内获得；
图6说明在肿瘤发生的早期和最后阶段，临床相关的癌症小鼠模型(Alb-R26 Met 小鼠)中的ADAMTSL5表达水平；
图7说明52% HCC患者中的ADAMTSL5 mRNA水平高，其中与饮酒相关的那些患者占多数；
图8说明与邻近的肝脏相比较，在9/10 HCC患者中ADAMTSL5蛋白水平的过表达；和
图9说明人类癌细胞系中的ADAMTSL5 mRNA水平。
发明详述
本发明涉及一种用于在需要它的哺乳动物中诊断和预后癌症的方法。首先，所述方法包括从所述哺乳动物收集生物样品的步骤，然后是从所述生物样品中确定ADAMTSL5基因/蛋白是否过表达的步骤，并然后根据第三步，根据所述基因或蛋白的过表达的确定来诊断/预后癌症。
根据本发明，哺乳动物特别地为人类。然而，所有哺乳动物均受到关注，甚至包括猫、狗、马或啮齿动物，比如小鼠和大鼠。
根据本发明的一个优选实施方案，癌症为脑癌、中枢神经系统(CNS)的癌症、结直肠癌、乳腺癌、肺癌、皮肤癌、胃肠癌、肾癌、骨髓瘤、淋巴瘤、白血病、宫颈癌、肝癌，比如肝细胞癌(HCC)。特别地根据本发明诊断的癌症为HCC。
根据本发明，生物样品选自血液、组织活检、血清、血浆、尿、粪便、痰、脑脊液和来自细胞裂解物的上清液。特别地被使用的生物样品为组织活检、血液、血浆、血清或尿。
根据本发明的一个优选实施方案，通过测量所述生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平或RNA水平来确定从需要它的哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5基因的过表达。术语“上调的”、“上调”、“过表达的”或“过表达”用于意指基因或基因的RNA转录物或蛋白产物的表达、活性或水平相对于一个或多个对照(比如一个或多个阳性和/或阴性对照)更高。特别地，当水平高于对照健康组织中的那些水平时，认为水平升高。
实际上，哺乳动物基因组含有19个ADAMTS (含血小板反应蛋白的解聚素和金属蛋白酶(A Disintegrin And Metalloproteinase with Thrombospondin))基因，编号为1至20。像其相关物基质金属蛋白酶(MMP)和ADAM一样，ADAMTS属于甲硫氨酸锌蛋白蛋白酶(metzincin protease)超家族，以靠近锌离子依赖性金属蛋白酶(zinc ion-dependentmetalloproteinase)活性位点的保守甲硫氨酸残基命名。ADAMTS家族的代表存在于所有后生动物中，尽管迄今为止，尚未在单细胞生物或植物中鉴定出它们。所有ADAMTS为分泌型的具有复合结构域组织(compound domain organization)的细胞外酶，其从氨基末端包含：信号肽，然后是可变长度的前区；金属蛋白酶结构域；解聚素样结构域；中央1型血小板反应蛋白序列重复(TSR)基序；和富含半胱氨酸的结构域，然后是间隔区。与ADAMTS分离开来的另一个家族是七个ADAMTS样基因(ADAMTSL)，其编码类似于ADAMTS辅助结构域，但缺少其催化结构域的蛋白。这些ADAMTSL蛋白(包括ADAMTSL 1至6和papilin)可能起到调节ADAMTS活性的作用。ADAMTSL5为一种蛋白，已在2000年代后期发现，并被描述为与原纤蛋白-1结合和促进原纤维形成。作为细胞外基质中生长因子调控的关键机制，ADAMTSL5在微原纤维形成中的作用备受关注。ADAMTSL5更具体地讲为一种分泌蛋白，具有独特的结构域组成，包含N-末端1型血小板反应蛋白重复、富含半胱氨酸的模块、间隔区模块和C-末端导蛋白样模块，其通过富含脯氨酸的区段连接至间隔区。ADAMTSL5被认为已与某些疾病(比如银屑病)有关，但迄今为止，ADAMTSL5尚未作为潜在的生物标志物或作为分子疗法的靶标与癌症相关联。
在本发明的上下文中和在一个优选的实施方案中，通过向所述生物样品中添加至少一种抗体来测量ADAMTSL5蛋白水平。特别用于测量ADAMTSL5蛋白水平的抗体属于抗ADAMTSL5类型。抗ADAMTSL5抗体特别地选自与碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)或与荧光染料未偶联或偶联或缀合的。
根据本发明，存在于需要它的哺乳动物的生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平特别地通过使用免疫染色、免疫荧光、蛋白质印迹或ELISA来测量。
在生物化学中，免疫染色称为使用基于抗体的方法来检测生物样品中的特定蛋白。免疫染色涵盖组织学、细胞生物学和分子生物学中使用的广泛范围的技术，这些技术使用基于抗体的染色方法。免疫荧光为一种用于利用荧光显微镜的光学显微镜术的技术，并且主要用于微生物样品。该技术利用抗体对其抗原的特异性，使荧光染料靶向细胞内的特定生物分子靶标，并因此允许经由样品可视化靶分子的分布。
根据第二方面，本发明提供一种用于确定从哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5基因的过表达的试剂盒。试剂盒包含至少一种抗ADAMTSL5类型的抗体和用于容纳生物样品的容器。试剂盒中使用的抗ADAMTSL5类型的抗体与上述那些抗体相同。
根据本发明，需要它的哺乳动物的生物样品中存在的ADAMTSL5水平还可通过使用例如微阵列、RNA-seq、原位杂交、RNA-scope以及常规的半定量或定量RT-PCR测量ADAMTSL5mRNA的水平来确定。
根据第三方面，本发明涉及药用组合物。药用组合物包含靶向ADAMTSL5本身或ADAMTSL5途径的试剂和药学上可接受的载体用于治疗癌症。术语“ADAMTSL5途径”及其语法变化是指其中涉及ADAMTSL5基因的途径。
所使用的靶向ADAMTSL5途径的试剂特别地为阻断抗体、肽、sh-RNA、si-RNA、微小RNA、反义RNA和化学药物。其还包括去甲基化剂(比如地西他滨)或调节糖基化和/或肝素结合的试剂。本发明的去甲基化剂为通过抑制DNA甲基转移酶而导致基因组DNA低甲基化的化合物。
在第四方面，本发明涉及ADAMTSL5蛋白作为癌症生物标志物的用途。所述癌症与上述那些癌症相同。
在第五方面，本发明涉及用于在需要它的哺乳动物中治疗癌症的方法。所述癌症与上述那些癌症相同。所述方法包括在需要它的哺乳动物中诊断癌症的第一步骤，以及通过给予ADAMTLS5的抑制剂治疗癌症的第二步骤。诊断癌症的步骤包括与以上在需要它的哺乳动物中诊断癌症的方法中描述的那些相同的步骤。
在第六方面，本发明涉及用于监测患有癌症的哺乳动物对抗癌治疗的反应的体外方法，其包括在所述抗癌治疗期间的两个或更多个时间点确定所述哺乳动物的生物样品中ADAMTSL5的表达水平，其中与在较早时间点的受试者的生物样品中获得的参考值相比较，在较晚时间点的受试者的生物样品中相等或更高的ADAMTSL5表达水平指示受试者对所述抗癌治疗具有抗性，而较低的ADAMTSL5水平则指示受试者对所述抗癌治疗有反应。
实施例：材料和方法：
在以下实施例中，使用遗传修饰的小鼠。在这些小鼠中，基于允许以组织/时间特异性方式调节基因表达的遗传方法，使在约50%的人类HCC中激活的受体酪氨酸激酶(RTK) Met的表达水平略提高至高于内源性水平- (R26stopMet小鼠; Fan等人 PLoS Genetics 2015;Fan等人 Hepatology 2017)。最近证明，肝脏中甲基化(Met) RTK表达水平的提高扰动组织稳态，导致肿瘤的起始和进化为HCC (Alb-R26Met)。基于对Alb-R26Met (n=32)和人类(n=249)肝脏肿瘤中Met表达水平的比较，表明在Alb-R26Met遗传环境中的Met水平(相对于对照肝脏为3.16±0.06)对应于约20% HCC患者(48/249)中发现的那些水平。通过分析一组肿瘤样品(n = 32)中的96个不同基因，表明由Alb-R26Met小鼠建模的肝脏肿瘤发生对应于HCC患者亚组，从而建立Alb-R26Met HCC小鼠模型的临床相关性。将Alb-R26Met小鼠模型用于研究DNA甲基化对与肿瘤发生有关的转录开关的影响。已鉴定出同时在CpG岛(CGI)中过度甲基化和过表达的基因的引人注目的富集。其中发现了ADAMTSL5。
实施例1：与对照肝脏相比较，Alb-R26Met肿瘤模型中ADAMTSL5基因体CGI中的过度甲基化和mRNA ADAMTSL5的过表达.
图1(A)显示来自UCSC基因组浏览器的小鼠ADAMTSL5转录物和CGI以及基于NCBI37/mm9小鼠参考的Refseq基因注释的图示。该图允许可视化AdamtsL5的外显子、内含子和CGI，以正方形突出显示肿瘤中发现过度甲基化的基因体CGI。
图1(B)为来自Badel等人 Matric Biology, 2012的人类ADAMTSL5蛋白的图示。报道了存在于ADAMTSL5蛋白中的不同结构域，其可能参与调节ADAMTSL5与其他蛋白的相互作用以及ADAMTSL5的生物学功能。
图1(C)和(D)说明对照肝脏(n=3)和Alb-R26Met肿瘤(n=10)中的启动子CGI (图1(C))和基因体CGI (图1(D))中ADAMTSL5的甲基化水平(β值)。注意到启动子CGI中ADAMTSL5的甲基化水平在对照和肿瘤样品中相似，而与对照肝脏相比较，在Alb-R26Met肿瘤中基因体CGI中的甲基化水平显著更高。结论是，肿瘤的特征在于基因体CGI中ADAMTSL5的过度甲基化。
图1(E)说明通过RNA-seq与对照肝脏相比较在Alb-R26Met肿瘤中的ADAMTSL5 mRNA表达水平。该图表显示读取计数(在右侧)和Log2FC (倍数变化) (在左侧)。显著性：*：P <0.05；FDR (已调整的p值) = 4.31E-15。结论是，肿瘤的特征在于ADAMTSL5 mRNA的过表达。
图1(F)说明相对于对照肝脏(n=5)在Alb-R26Met肿瘤(n=16)中的ADAMTSL5表达水平(通过RT-qPCR)。注意到与对照肝脏相比较在Alb-R26Met肿瘤中ADAMTSL5的高表达水平。结论是，肿瘤的特征在于ADAMTSL5 mRNA的一致过表达。
实施例2：Alb-R26Met肿瘤模型中ADAMTSL5 mRNA和蛋白的过表达.
图2 (A)显示肿瘤(从Alb-R26Met小鼠中解剖)和对照肝脏(从对照小鼠中解剖)中ADAMTSL5 mRNA表达水平(通过RNA-scope)的代表性图像。在Alb-R26Met肿瘤中观察到强染色，但在对照肝脏中则没有。结论是，类似于来自RNA-seq和RT-qPCR分析的数据，肿瘤的特征在于ADAMTSL5 mRNA的一致过表达。
图2(B)显示在肿瘤(从Alb-R26Met小鼠中解剖)和对照肝脏(从对照小鼠中解剖)中通过免疫荧光(左侧)和免疫染色(右侧)得到的ADAMTSL5蛋白水平的代表性图像。注意到与对照肝脏相比较ADAMTSL5在Alb-R26Met肿瘤中过表达。结论是，肿瘤的特征在于ADAMTSL5蛋白的一致过表达，与高mRNA水平相连贯。
实施例3：其中ADAMTSL5过表达的Alb-R26Met HCC细胞的体外致瘤特性。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。
图3(A)为用于分子和功能研究的Alb-R26Met HCC细胞系的建立的图示(Fan等人Hepatology, 2017)。该图概括如何产生HCC细胞系以进行其分子表征和用于其生物测定。按照方案，在Fan等人 Hepatology, 2017中建立并报道了HCC细胞系由从不同Alb-R26Met小鼠解剖的肝脏肿瘤产生。简而言之，将解剖的肿瘤切碎，在含有胶原酶和DNA酶的溶液中温育，并使用100 μm无菌过滤器去除组织碎片。然后将细胞在含有补充剂的William E培养基中直接在贴壁条件下或在非贴壁条件下1周进行培养，以富集具有致瘤特性的细胞。培养的细胞扩增之后，将其中一部分冷冻并保存为储备物，而另一部分进行分子(生物化学，RT-qPCR)和功能(其在裸鼠中形成肿瘤的能力)表征。
图3(B)为报告相对于对照肝脏的3种Alb-R26Met HCC细胞系(HCC3、HCC13和HCC14)中的ADAMTSL5表达水平(通过RT-qPCR)的图表。结论是，如在肿瘤中所示，HCC细胞的特征在于ADAMTSL5 mRNA的一致过表达。
图3(C)显示相对于对照，用携带shRNA靶向序列的质粒(还携带嘌呤霉素基因用于选择稳定克隆)稳定转染的Alb-R26Met HCC细胞中ADAMTSL5的mRNA表达水平。用目标质粒转染细胞，然后在48小时之后暴露于嘌呤霉素持续7天，以选择其中已稳定整合质粒的细胞。通过RT-qPCR鉴定其中ADAMTSL5的表达水平被shRNA靶向序列下调的克隆。结论是，针对ADAMTSL5的shRNA靶向序列导致HCC细胞中ADAMTSL5 mRNA水平的有效下调，这干扰ADAMTSL5蛋白表达水平。
图3(D)说明使用HCC对照细胞或携带靶向ADAMTSL5的shRNA序列的HCC细胞进行的锚着非依赖性生长测定(软琼脂测定)的结果。该测定例证在非贴壁条件下细胞形成集落的能力，因此揭示其体外致瘤特性。结果表明，与对照细胞相比较，由携带靶向ADAMTSL5的shRNA序列的Alb-R26Met HCC细胞形成的集落数减少。结论是，HCC细胞中高水平的ADAMTSL5为其体外致瘤特性所需要的。
图3(E)为锚着非依赖性生长测定(软琼脂测定)的描述，显示用来自对照细胞的条件培养基部分拯救了ADAMTSL5靶向的Alb-R26Met HCC细胞的体外致瘤特性。结果表明，细胞外ADAMTSL5赋予表达低水平ADAMTSL5的细胞致瘤性。结论是，ADAMTSL5为一种分泌蛋白，在细胞外环境中发挥其功能，并且也可以细胞非自主方式起作用。
图3(F)为源自对照和ADAMTSL5靶向的Alb-R26Met HCC细胞(右侧)的肿瘤球的代表性图像(左侧)和定量(右侧)。注意到，与Alb-R26Met HCC shAdamts15细胞(携带靶向ADAMTSL5的shRNA序列)相比较，从对照细胞产生的肿瘤球的数量和大小更高。结论是，HCC细胞中高水平的ADAMTSL5赋予自我更新能力。
实施例4：在Alb-R26Met HCC细胞中ADAMTSL5下调后，HCC细胞体内致瘤特性的丧失。*：P <0.05；**：P <0.01；***：P <0.001。
图4(A)含有从注射有Alb-R26Met HCC细胞(上)或Alb-R26Met-shADAMTSL5 HCC细胞(下)的裸鼠的异种移植物解剖的肿瘤的图像。
通过在裸鼠的侧腹皮下注射Alb-R26Met或Alb-R26Met-shAdamtsL5 HCC细胞(5x106个细胞)进行异种移植研究。图4(A)包含异种移植物建立8周之后解剖的肿瘤的图像。注意到在其中皮下注射Alb-R26Met HCC细胞的裸鼠中形成肿瘤，而来自其中皮下注射Alb-R26Met-shADAMTSL5 HCC细胞的小鼠的肿瘤却大大减少，说明体内细胞致瘤特性的受损。
图4(B)含有异种移植物生长曲线，其报告每周测量的每组平均肿瘤体积。结论是，HCC细胞中ADAMTSL5水平的下调(通过稳定转染shRNA靶向序列实现)会干扰HCC细胞的体内致瘤特性。总之，这些结果表明，ADAMTSL5表达水平的下调会干扰肿瘤的建立/进化。
在图4(C)中，显示细胞注射之后8周解剖的肿瘤体积的定量分析。每个点对应于每个肿瘤的体积。结论是，HCC细胞中AdamtsL5水平的下调(通过稳定转染shRNA靶向序列实现)会干扰体内致瘤特性。
实施例5：永生化-R26Met致敏肝细胞在ADAMTSL5过表达后获得体内致瘤特性.
图5(A)为永生化-A26Met致敏肝细胞(携带升高水平的Met RTK并被SV40大T抗原永生化的胚胎肝细胞)的建立的图示。简而言之，来自E15.5小鼠R26Met胚胎肝脏的培养的肝细胞用携带SV40大T抗原的逆转录病毒感染以永生化(加上新霉素基因用于选择稳定克隆)，然后随后用允许肝细胞耗尽其他细胞类型的培养基处理7天。永生化-R26Met肝细胞被致敏，因为野生型Met水平升高至3倍，尽管由于不能在异种移植物中形成肿瘤而不具有致瘤性。
图5(B)包含异种移植物建立11周之后的小鼠图像。注意到其中皮下注射永生化-R26Met hepaoverAdamts15 (过表达ADAMTSL5的细胞)的裸鼠在两个侧腹均出现肿瘤。
通过皮下注射永生化-R26Met对照(永生化-R26Met hepaWT)或过表达ADAMTSL5 (永生化-R26Met hepaoverAdamts15)肝细胞(5x106个细胞)在裸鼠的两个侧腹进行异种移植研究。
图5(C)含有异种移植物生长曲线，其报告每周测量的每组平均肿瘤体积。
在图5(D)中，显示细胞注射之后11周解剖的肿瘤体积的定量分析。每个点对应于每个肿瘤的体积。注意到与注射有永生化-R26Met hepaWT的小鼠形成对比，所有注射有永生化-R26Met hepaoverAdamts15的小鼠均形成肿瘤。结论是，由于不能在异种移植物中形成肿瘤而不具有致瘤性的永生化肝细胞中ADAMTSL5水平的过表达不足以赋予其体内细胞致瘤特性。
实施例6：Alb-R26Met肿瘤中在早期和最后阶段的ADAMTSL5表达水平.
图6(A)为用于ADAMTSL5水平的RT-qPCR分析的组织样品的图示。使用的样品为：对照野生型肝脏(WT)、Alb-R26Met健康肝脏、早期和晚期的Alb-R26Met肿瘤。
在图6(B)中，图表报告ADAMTSL5、AFP (甲胎蛋白)、GPC3 (磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3) (两种HCC标志物)和Ki67 (增殖标志物)的表达水平(通过RT-qPCR)。注意到在野生型和Alb-R26Met健康肝脏中ADAMTSL5以及其他分析的标志物具有相当低的表达水平。相比之下，在早期阶段，Alb-R26Met肿瘤的转录物水平已经升高。结论是，ADAMTSL5转录物水平可用于区分健康样品与已处于早期致瘤状态的肿瘤样品。
实施例7：在52%的HCC患者中存在高的ADAMTSL5 mRNA水平，其中与饮酒相关的那些患者占多数.
在图7(A)中，上图报告具有以下ADAMTSL5 mRNA水平的HCC患者队列(371名患者)：HCC患者中有21%的特征在于ADAMTSL5下调(白色，左侧)，27%的特征在于无变化(具有黑色线条的白色，中间)，和52%的ADAMTSL5 mRNA水平上调(黑色，右侧)。下图：根据低、不变和高ADAMTSL5表达水平报告HCC患者的3个亚组的图表(指示数字和百分比)。数据对应于371名HCC患者队列的RNA-seq研究(来自TCGA)。注意到，在371名HCC患者中的193名中过表达ADAMTSL5 (52%；Log2FC> 1；FDR <0.05)。结论是，在超过50%的HCC患者中可检测到高ADAMTSL5转录物水平。
在图7(B)中，该表报告所有371名分析的患者中主要的HCC危险因素的存在(黑色线条)或不存在。注意到，ADAMTSL5水平升高的HCC患者与饮酒显著相关，尽管不仅仅如此。结论是，ADAMTSL5的高mRNA水平存在于特征在于多种风险因素的大部分患者中，其中与饮酒相关的那些患者占多数。
实施例8：绝大多数HCC分析的患者的ADAMTSL5蛋白水平过表达.
该图报告与邻近的肝脏相比较，肿瘤样品中用抗ADAMTSL5抗体进行的免疫染色。注意到在所有分析的HCC患者(除#8患者之外)中具有强的ADAMTSL5蛋白水平(深色染色；通过固红进行)。结论是，ADAMTSL5蛋白水平高表征绝大多数HCC患者。
实施例9：一组人类癌细胞系中的ADAMTSL5过表达.
图表显示一组人类HCC细胞系、MKN (胃癌)细胞系、人类乳腺细胞系、HELA (人类宫颈)癌细胞系和HER (人类胚肾)细胞系中ADAMTSL5的mRNA表达水平。3个独立实验的平均值。结论是，在不同来源的癌细胞中存在ADAMTSL5的高mRNA水平。
Claims (12)
1.一种用于在需要它的哺乳动物中诊断肝细胞癌的方法，其包括以下步骤：
从所述哺乳动物收集生物样品；
从所述生物样品中确定ADAMTSL5基因是否过表达；
根据所述基因的过表达的确定来诊断肝细胞癌。
2.权利要求1的方法，其中所述生物样品选自血液、活检组织、血清、血浆、尿、粪便、痰、脑脊液或来自细胞裂解物的上清液，优选地所述生物样品为组织活检、血液、血浆、血清或尿。
3.前述权利要求中任何一项的方法，其中所述生物样品中的ADAMTSL5基因的过表达通过测量所述生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平或mRNA水平来确定。
4.权利要求3的方法，其中所述生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平通过向所述生物样品中添加至少一种抗ADAMTSL5类型的抗体来测量。
5.权利要求4的方法，其中所述抗ADAMTSL5类型的抗体选自与碱性磷酸酶辣根过氧化物酶或与荧光染料未偶联或偶联的。
6.权利要求3-5中任何一项的方法，其中所述生物样品中的ADAMTSL5蛋白水平通过使用免疫染色、免疫荧光、蛋白质印迹或ELISA测量。
7.一种用于在需要它的哺乳动物中诊断肝细胞癌的试剂盒，其包含至少一种抗ADAMTSL5类型的抗体、用于容纳所述生物样品的容器以及用于测量从所述哺乳动物获得的生物样品中ADAMTSL5肝细胞癌标志物基因的过表达的方案。
8.权利要求7的试剂盒，其中所述抗ADAMTSL5类型的抗体选自与碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶或与荧光染料未偶联或偶联/缀合的。
9.权利要求3的方法，其中所述生物样品中的ADAMTSL5 mRNA水平通过可用于对所述生物样品检测mRNA的方法学进行测量，所述方法学包括微阵列、RNA-seq、原位杂交、RNA-scope以及常规的半定量或定量RT-PCR。
10.一种用于治疗肝细胞癌的药用组合物，其包含靶向ADAMTSL5或ADAMTSL5途径的试剂和药学上可接受的载体，其中所述靶向ADAMTSL5或ADAMTSL5途径的试剂选自阻断抗体、肽、sh-RNA、si-RNA、微小RNA、反义RNA、化学药物、去甲基化剂和调节糖基化和/或肝素结合的试剂。
11.ADAMTSL5蛋白作为肝细胞癌的生物标志物的用途。
12.一种用于监测患有肝细胞癌的哺乳动物对抗癌治疗的反应的体外方法，其包括在所述抗癌治疗期间的两个或更多个时间点确定所述哺乳动物的生物样品中ADAMTSL5的表达水平，其中与在较早时间点的受试者的生物样品中获得的参考值相比较，在较晚时间点的所述受试者的生物样品中相等或更高的ADAMTSL5表达水平指示所述受试者对所述抗癌治疗具有抗性，而较低的ADAMTSL5水平则指示所述受试者对所述抗癌治疗有反应。
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