CN102282268A - eIF3m在癌症的诊断和治疗中的用途 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂；包含所述试剂的癌症诊断试剂盒；通过用所述试剂处理生物样本以检测与所述试剂特异性地结合的物质并定量比较个体和正常对照之间的所述物质来检测eIF3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌症的治疗和预防的方法，其包括用于下调eIF3m多核苷酸或蛋白的表达的试剂。

Description

eIF3m在癌症的诊断和治疗中的用途
技术领域
本发明涉及包含用于测量eIF3m表达水平的试剂的癌症诊断组合物和通过调节所述表达水平用于癌症的治疗和预防的组合物。更具体而言，本发明涉及：检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂；包含所述试剂的癌症诊断试剂盒；通过用所述试剂处理生物样本以检测与所述试剂特异性地结合的物质并定量比较个体和正常对照之间的所述物质来检测eIF3m多核苷酸或蛋白的方法；以及用于癌症的治疗和预防的方法，其包括用于下调eIF3m多核苷酸或蛋白表达的试剂。
背景领域
癌症是当今世界发病率和死亡率的最常见原因之一。随着平均预期寿命的增加，预计癌症发病率会增加，伴随发病年龄降低。ACS(美国癌症协会(American Cancer Society))的年度癌症统计文章报导称，在2007年，全世界诊断了1200万或更多的新癌症病例，癌症患者的死亡人数约为760万，死亡速率约每天2万。
肺癌、乳腺癌和结肠癌是最致命癌症的代表。特别是关于结肠癌，其结肠癌的发病率在韩国已显著升高。在韩国的男性中，其是胃癌、肺癌和肝癌之后第四位主要的癌症相关死亡的原因。相似的癌症死亡率的速率见于女性中。大部分病例发生在50多岁的患者之间，并且其次在60多岁的患者之间。在韩国结肠癌的最高发病率的年龄低于例如美国和欧洲的西方世界国家10年。在30多岁的人中，结肠癌的高发病频率占全部病例的5％-10％。年轻人中的病例是不常见的，除非存在早期结肠癌的家族病史。影响癌症发生的因素在多数情况下是环境的，例如饮食的西方化，特别是动物脂肪和蛋白的过量摄入，而不是遗传。仅5％的结肠癌病例是归因于遗传因素。根据这个事实和新近的报道，具有发展为结肠癌的高风险的人是：1)已经被结肠息肉侵袭的人，2)具有结肠癌家族史的人，3)长期患有溃疡性结肠炎的人，4)被顽固性肛瘘侵袭的人。
当早期被检测出时，通过内窥镜切除术或外科手术几乎可以完全治愈结肠癌。此外，即使转移到肝或肺(远处转移)，通过外科治疗仍然可以完全治愈结肠癌，除非发现太晚而不能手术。然而，在无症状患者中检出结肠癌是非常困难的，因为具有结肠癌的患者在早期没有主观症状。因此，即使不放便和疼痛，必须进行定期检测以在早期检测结肠癌，这允许实施外科手术用于治疗。隐血试验(occult blood test)被认为是相对方便的结肠癌筛选。然而，该试验中的阳性反应通常确定为假阳性。同样，并不是所有的阴性反应都能保证不存在结肠癌。也就是说，使用隐血试验作为准确诊断方法是不合理的。
对结肠癌的诊断治疗进行的广泛和透彻研究发现，某些基因及其表达产物可以用作在早期准确检测结肠癌的诊断标志物和用作治疗结肠癌的靶标，从而导致本发明。
发明公开
技术问题
因此，本发明的目的是提供用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
本发明的另一目的是提供癌症诊断试剂盒，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
本发明还一目的是提供检测eIF3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用所述用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂处理生物样本，检测所述试剂和与其互补的多核苷酸或蛋白的复合物，并定量比较个体和正常对照之间的所述复合物。
本发明还一目的是提供用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表达的寡核苷酸。
本发明的另一目的是提供用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含具有针对eIF3m多肽的抑制活性的抗体或其抗原结合片段。
本发明的另一目的是提供筛选用于癌症的治疗药物的方法，所述方法包括用候选化合物处理表达eIF3m多肽和/或多核苷酸的细胞，并测量所述细胞中eIF3m多肽或多核苷酸表达水平。
问题的解决方案
按照本发明的一方面，本发明涉及用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
如本文所用的术语“eIF3m”表示真核翻译因子3m亚基。eIF3是哺乳动物起始因子，分子量大至800kDa。ElF3由称为eIF3a、b、c…、m的13个非等同亚基(non-identical subunit)组成。已知某些亚基在某些癌症中显示异常表达，但是至今在之前的资料中没有报道关于本发明的亚基在某些癌症中的特异性表达的信息。eIF3m也称为PCID1(含有蛋白1的PCI结构域)，已知作为单纯疱疹病毒(HSV)进入的受体或共受体，但是还没有关于该亚基与肿瘤发生以及进一步癌症治疗的关联的报道。此外，在本发明中，首次公开了eIF3m在特异性癌细胞系和癌症中超表达。本发明人证实，在人肿瘤组织以及人癌细胞系中，eIF3m在转录和翻译水平的表达都显著升高。在本发明中，还发现eIF3m在肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌中以高水平表达，并且发现在人结肠组织的肿瘤部位中保持eIF3m水平升高的表达。
如本文所用的术语“标志物”或“诊断标志物”意图表示能够通过将癌细胞或患有癌症的个体区别于正常细胞或个体来诊断癌症的物质，并且包括有机生物分子，例如多肽、蛋白或核酸(例如mRNA等)、脂质、糖脂、糖蛋白和糖(单糖，二糖，寡糖等)，所述有机生物分子的量在癌症细胞中相对于在正常细胞中增加或减少。对于本发明的目的而言，所述癌症的诊断标志物是eIF3m多肽或编码该多肽的多核苷酸，所述多肽或多核苷酸在癌症细胞中相对于在正常细胞或组织中以高水平特异性地表达。
如本文所用的术语“mRNA表达水平的测量”或相应短语意指评价生物样品中癌症标志物基因的mRNA的存在和表达水平以诊断癌症的过程，其中测量mRNA的量。用于测量mRNA水平的分析方法包括但不限于，RT-PCR、竞争性RT-PCR、实时RT-PCR、RNA酶保护试验(RPA)、Northern印迹和DNA芯片检测。
如本文所用的术语“蛋白表达水平的测量”或相应短语意指评价生物样品中从结肠癌标志物基因表达的蛋白的存在和表达水平以诊断癌症的过程，其中使用与所述蛋白特异性地结合的抗体测量所述标志物基因的蛋白产物的量。用于测量蛋白水平的分析方法包括但不限于，Western印迹、酶联免疫吸附检测(ELISA)、放射免疫检测(RIA)、放射免疫扩散、Ouchterlony免疫扩散、火箭免疫电泳、免疫组织染色、免疫沉淀检测、补体结合检测、FACS(荧光激活的细胞分类仪)和蛋白芯片检测。
用于测量mRNA水平的试剂可以示例为引物对、探针或反义核苷酸，其与本发明的eIF3m多核苷酸或其片段有关。根据本发明的多核苷酸序列，本领域技术人员可以容易地设计所述引物、探针或反义核苷酸序列。
如本文所用的术语“引物”是指具有游离的3′羟基基团的短核酸链，其与互补模板形成碱基对，以便作为产生新模板链的起点。除引物外，DNA合成或复制需要合适的缓冲液、适当的温度、聚合酶(DNA聚合酶或逆转录酶)和4种三磷酸核苷酸。在本发明中，对eIF3m多核苷酸具有特异性的有义和反义引物可以用于PCR扩增，以便用PCR产物诊断癌症。根据本领域的已知信息，可以适当改变所述有义和反义引物的长度。
如本文所用的术语“探针”意指诸如RNA或DNA的核苷酸序列的片段，其长度范围从短至1个碱基至长至数百个碱基，其可以与目的mRNA特异性地结合并且用标签进行标记用于检测所述目的mRNA。本发明中有用的探针可以构建为寡核苷酸探针、单链DNA探针、双链DNA探针或RNA探针的形式。在本发明的实施方案中，通过测定与本发明的eIF3m多核苷酸互补的探针是否与目的核苷酸序列杂交，可以实现癌症发生的诊断。按照本领域已知的信息可以更改合适的探针和杂交条件的选择。
本发明中有用的引物或探针可以使用亚磷酰胺固相载体法或其他熟知技术化学合成。使用本领域已知的各种手段可以修饰它们的核苷酸序列。修饰的示例性、非限制性实例包括甲基化、加帽、用一个或多个同系物取代天然核苷酸和核苷酸之间的改变，例如不带电荷的连接物(例如甲基磷酸、磷酸三酯、氨基磷酸酯、氨基甲酸酯等)或带电荷的连接物(例如磷硫酰，二硫代磷酸酯等)。
优选地，所述引物或探针优选含有8个或更多核苷酸。通过将所述引物或探针暴露于本发明的eIF3m多核苷酸或使所述引物或探针与本发明的eIF3m多核苷酸接触，可以实现杂交。优选地，将这些序列在使非特异性配对最小化的严紧条件下彼此杂交。为了检测与本发明的eIF3m多核苷酸共享80％-90％同源性的序列，例如，杂交条件可以包括在42℃、含有0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％SDS和10％硫酸葡聚糖的缓冲液中杂交过夜并最终在50℃、用含有0.1×SSC和0.1％SDS的溶液洗涤。适于检测与本发明的eIF3m多核苷酸共享90％同源性的序列的严紧条件包括在65℃、在0.25M Na2HPO4、pH7.2、6.5％SDS、10％硫酸葡聚糖中杂交过夜，并最终在60℃、用含有0.1×SSC和0.1％SDS的溶液洗涤。
根据本发明的实施方案，测量eIF3m蛋白(下文与“eIF3m多肽”交换使用)的表达水平的试剂优选为抗体。
如本文所用的术语“抗体”是指指示抗原区的特异性蛋白分子。对于本发明的目的而言，所述抗体与本发明的标志物，即eIF3m多肽特异性地结合。该抗体可以使用常规方法自蛋白产生，通常克隆到表达载体的标志物基因编码所述蛋白。此外，可产生自由所述标志物基因编码的蛋白的部分肽，落入所述抗体的范围。为了作为抗体而发挥功能，所述部分肽需要含有至少7个氨基酸残基，优选地9个或更多氨基酸残基，以及更优选地12个或更多氨基酸残基。不给予本发明的抗体的形式特定的限制。其中有多克隆抗体、单克隆抗体及其含有互补位的片段以及所有免疫球蛋白抗体。此外，诸如人源化抗体的特殊抗体也在本发明的范围内。因此，只要可以使用本领域已知的方法产生，针对本发明的eIF3m蛋白的任何抗体都可以用于本发明中。
此外，用于检测癌症的诊断标志物的本发明的抗体包括抗体分子的功能性片段以及具有两个全长轻链和两个全长重链的完整形式。所述抗体分子的功能性片段是指，至少保留抗原结合功能的片段，并且包括Fab、F(ab′)、F(ab′)2、Fv等。
如本文所用的术语“癌症”是指与细胞死亡调节相关的一类疾病，其中细胞群表现出凋亡不足产生的不受控制的过度生长。所述过度生长的细胞侵袭邻近组织和器官以破坏正常结构和使正常结构变形，形成肿瘤块，以上情况定义为癌症。通常，肿瘤是细胞的异常过度生长所形成的赘生物或实体病变。肿瘤可以是良性的或恶性的。通常生长远快于良性肿瘤的恶性肿瘤侵袭邻近组织并有时转移，威胁生命。恶性肿瘤通常视为癌症。可以用检测癌症标志物的本发明的组合物检测到的癌症的实例包括髓样癌、头颈癌、肺癌、乳腺癌、胸腺瘤、间皮瘤、食道癌、胰腺癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胆管癌、肾癌、膀胱、前列腺癌、睾丸癌、精原细胞瘤、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、淋巴瘤、急性白血病、慢性白血病、多发性骨髓瘤、肉瘤和恶性黑素瘤，但不局限于此。在本发明优选的实施方案中，将所述用于检测癌症标志物的组合物应用于肺癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤和黑素瘤细胞系以检查其中癌症标志物的表达水平。当应用所述组合物时，观察到eIF3m蛋白在来自具有癌症的个体的组织中具有显著高于来自正常个体的组织中的表达水平。
按照本发明的另一方面，本发明提供了包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂的癌症诊断试剂盒。
本发明背景中的术语“诊断”是指，测定生物样本或组织样品中本发明的eIF3m多肽或多核苷酸的有无，从而鉴定与所述基因的表达相关的疾病的存在或特征的过程。
通过使用本发明的试剂盒测定所述eIF3m多肽或编码其的多核苷酸的表达水平可以实现癌症标志物的检测。本发明的试剂盒可以包含用于测量所述癌症诊断标志物的表达水平的引物或探针，选择性地识别所述癌症标志物的抗体或其保留抗原结合功能的片段和/或一种或多种适于分析所述多肽或多核苷酸的试剂或组合物。例如，用于定量分析本发明的多核苷酸或基因的诊断试剂盒可以包含至少一个与编码所述eIF3m多肽的多核苷酸特异性地结合的寡核苷酸。在优选的实施方案中，本发明的诊断试剂盒特征为，包括实施RT-PCR所需要的必需元件。RT-PCR试剂盒包括对eIF3m的核苷酸序列或其部分序列具有特异性的引物对、逆转录酶、Taq聚合酶、PCR引物和dNTP。只要其利用“mRNA表达水平的测量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而没有限制。
在另一优选的实施方案中，本发明的癌症诊断试剂盒可以包含与本发明的eIF3m蛋白特异性地结合的抗体。只要其利用“蛋白表达水平的测量”的上下文中已知的分析方法，可以使用任何试剂盒而没有限制。优选的是ELISA试剂盒或蛋白芯片试剂盒。
使用抗体测量蛋白表达水平是基于所述eIF3m蛋白和其抗体之间抗原-抗体复合物的形成。为了测定蛋白表达水平，可以使用各种方法测量抗原-抗体的量。
如本文所用的术语“抗原-抗体复合物”意指癌症标志物蛋白与对其具有特异性的抗体的结合产物。通过测量检测标记的信号大小，可以定量测定因此形成的所述抗原-抗体复合物。
例如，可以根据可疑个体和正常对照之间抗体-抗原复合物的量的比较，通过测定所述可疑个体中eIF3m蛋白表达水平的显著升高来诊断癌症。在这方面，用对本发明的eIF3m蛋白具有特异性的抗体处理来自具有可疑癌症的个体的样品，以形成可以使用试剂盒定量分析的抗原-抗体复合物，所述试剂盒是基于ELISA检测、RIA检测、夹心ELISA检测、Western印迹检测、放射免疫扩散检测、ouchterlony免疫扩散检测、火箭免疫电泳检测、免疫组织染色检测、免疫沉淀检测、补体结合试验、FACS、蛋白芯片检测或免疫斑点检测。所述分析数据与正常个体的分析数据的比较允许与eIF3m蛋白表达升高有关的癌症的诊断。
根据本发明的其他方面，本发明涉及检测eIF3m多核苷酸或蛋白的方法，所述方法包括用测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂处理生物样本，检测所述试剂与与其互补的多核苷酸或蛋白的复合物，并定量比较个体和正常对照之间的复合物。
详细而言，可以在mRNA水平或蛋白水平检测基因的表达。使用熟知的方法，可以实现从生物样本分离mRNA或蛋白。
如本文所用的术语“生物样本”意指从中可以测量eIF3m的基因或蛋白表达水平的样品。本发明中有用的生物样本的实例包括组织、细胞、全血、血清、血浆、唾液、痰、脑脊液和尿液，但不局限于此。
在本发明检测方法的实施方案中，可以将具有可疑癌症的个体中的表达水平与正常对照中的基因表达水平进行比较，以诊断所述个体中的癌症发病率。详细地说，测量来自具有可疑癌症的个体的生物样品的本发明的标志物的表达水平。将该水平与来自正常对照的生物样品中测量的水平进行比较。当所述个体中本发明的标志物的表达水平高于所述正常对照中时，可以确定所述个体受到癌症侵袭。
在编码本发明的eIF3m多肽的多核苷酸被用作标志物的情况下，所述方法包括：(a)提供生物样本；(b)用测量eIF3m的表达水平的试剂处理所述生物样本；(c)检测所述试剂与与其互补的多核苷酸的结合产物；并且(d)定量比较个体和正常对照之间的所述结合产物。在本发明的eIF3m多肽被用作标志物的情况下，所述方法包括：(a)提供生物样本；(b)用对所述eIF3m蛋白具有特异性的抗体处理所述生物样本；(c)检测抗原-抗体复合物；并(d)定量比较个体和正常对照之间的所述复合物。
按照本发明还一方面，本发明涉及用于癌症的治疗和预防的组合物，所述组合物包含作为活性成分的抑制eIF3m多核苷酸的表达的寡核苷酸或抑制eIF3m多肽的活性的抗体或其抗原-结合片段。
在该方面的优选的实施方案中，所述药物组合物可以包括抑制本发明的eIF3m多核苷酸的表达的物质。所述eIF3m表达抑制物质可以选自siRNA、shRNA、适体和反义寡核苷酸。
如本文所用的术语“siRNA(小干扰RNA)”意指介导RNA干扰或基因沉默的约20个核苷酸的小核酸分子。当将siRNA引入细胞时，其被dicer识别从而降解编码eIF3m的基因，导致eIF3m基因的特异性抑制(knockdown)。
术语“shRNA”是指短发夹RNA，其中siRNA靶序列的有义和反义序列被5-9个碱基的环状结构隔开。
如本文所用的术语“适体”是指长度为20-60nt的寡核糖核酸分子。取决于序列，其具有不同三维结构并且与特异性靶分子结合以有效地调节所述靶分子的功能。
最近，RNA干扰(RNAi)现象已被研究应用于在基因水平控制蛋白表达的方法。通常，siRNA已表现出通过与mRNA特异性地结合来抑制蛋白表达，所述mRNA具有与靶基因互补的序列。
为了干扰癌基因或转移基因(metastagenes)的表达，可以将包含按照本发明的siRNA或shRNA的组合物根据适用于基于这些RNA的基因治疗的典型方法给予个体。例如，可以按照Filleur et al.，Cancer Res.，63(14)：3919-22，2003所述的方法，通过siRNA的低量静脉内注射来调节基因表达。为了增加siRNA的细胞摄取和稳定性，按照Chien et al.，Cancer GeneTher.，12(3)321-8，2005，也可以联合注射siRNA与结合物。
可以通过直接化学合成(Sui G et al.，(2002)Proc Natl Acad Sci USA99：5515-5520)或体外转录(BrummelkampTR et al.，(2002)Science296：550-553)制备包含在本组合物中的所述短干扰RNA分子(siRNA)，但是本发明不限于这些方法。此外，可以从基于RNA聚合酶III的启动子表达经设计克服siRNA的缺点的shRNA，所述启动子包含在被引入细胞的腺病毒、慢病毒(rentiviral)或质粒表达载体系统中，所述siRNA的缺点包括昂贵的siRNA生物合成和低转染效率，这导致RNA干扰效果的短期持续性。使用siRNA加工酶(Dicer或RNaseIII)在细胞中将所述shRNA分子加工为功能性siRNA分子，并且随后诱导靶基因的沉默。
如本文所用的术语“反义”意指寡聚物具有核苷酸碱基的序列和亚基对亚基的骨架，所述骨架允许所述反义寡聚物与RNA中的靶序列通过Watson-Crick碱基配对杂交，从而在靶序列中形成RNA：寡聚物异源双链，通常与mRNA杂交。所述寡聚物可以与所述靶序列具有严格的序列互补性或与其接近的互补性。这些反义寡聚物可以阻断或抑制所述mRNA的翻译和/或修饰mRNA的加工以产生所述mRNA的剪接变体。因此，本发明的反义寡聚物是与编码eIF3m多肽的多核苷酸互补的反义寡聚物。对于基因治疗，可以通过通常方法给予本发明的反义寡核苷酸。给予所述组合物可以防止或抑制癌基因表达。例如，如J.S.Kim et al.，J controlledRelease 53，175-182(1998)所述，通过静电吸引将反义寡脱氧核苷酸装载到基于多聚左旋赖氨酸的微颗粒载体上，并且静脉内注射所述装载了寡核苷酸的微颗粒，但是本发明不限于此方法。
优选地，本发明的组合物可以包括已知治疗剂，所述治疗剂直接地或间接地与所述试剂结合或以未结合形式存在。能够与抗体结合的治疗剂包括但不限于，放射性核素、药物、淋巴因子、毒素和双特异性抗体。只要其当与抗体结合或与siRNA、shRNA或反义寡核苷酸联合给药时能发挥对于癌症的治疗效果，在本发明中可以使用任何已知治疗剂。
放射性核素的实例包括但不限于，3H、14C、32P、35S、36Cl、51Cr、57Co、58Co、59Fe、90Y、125I、131I、和186Re。
本发明中有用的药物和毒素包括依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、阿霉素、道诺霉素、去甲柔红霉素、氨喋呤、更生霉素、丝裂霉素、顺铂和顺铂类似物、博来霉素、埃斯培拉霉素(esperamicins)、5-氟尿嘧啶、美法仑(melphalan)和氮芥，但不限于此。
通过抑制eIF3m基因或蛋白表达，检查eIF3m特异性siRNA抑制癌发生的活性。与对照的比较表明细胞生长和细胞周期相关的表达模式受到调节。
在本发明的优选的实施方案中，本发明提供了包含抑制eIF3m蛋白活性的物质的组合物。优选地，所述抑制活性的物质是特异性地识别eIF3m蛋白的抗体。所述抗体包括所有单克隆抗体和嵌合抗体，所述单克隆抗体和嵌合抗体的人源化抗体和人抗体。只要抗体具有特异性地识别eIF3m的结合特性，则所述它们包括具有两条全长轻链和两条全长重链的完整形式，或可以是抗体分子的功能性片段的形式。如本文所用的术语“抗体分子的功能性片段”意指至少保留抗原结合功能的片段，所述片段以Fab、F(ab′)、F(ab)2和Fv作为示例。
优选地，本发明的组合物可以包括适于其给药模式的可接受的载体。
活性成分可以与药学上可接受的媒介、赋形剂或添加剂组合。本发明中有用的药学上可接受载体的实例包括生理盐水、无菌水、林格液、缓冲盐水、葡萄糖溶液、麦芽糊精溶液、甘油、乙醇和脂质体。它们可以单独使用或联合使用。必要的话，所述组合物还可以包含其他典型添加剂，例如抗氧化物、缓冲液等。根据给药模式，所述组合物可以与稀释剂、分散剂、表面活性剂，粘合剂和/或润滑剂配制为注射剂型，例如水溶液、悬液、乳液等，或口服剂型例如丸剂、胶囊剂、颗粒剂、片剂等。当与载体结合时，对靶器官或组织具有特异性的抗体或配体可以使活性成分定向于所述器官或组织。可以在本发明中使用本领域已知的典型的媒介、赋形剂和添加剂。本发明并不限于所述媒介、赋形剂和添加剂的实例。
所述组合物或制剂可以按照目的或需要通过适合的途径以治疗有效量给予个体。所述药物组合物可以口服给药、胃肠外给药、皮下给药、腹膜内给药或鼻内给药。对于局部免疫抑制治疗，如果需要的话，可以使用包括病灶内给药在内的适当方法给予所述组合物。胃肠外注射包括肌内途径、静脉内途径、动脉内途径、腹膜内途径和皮下途径。包含所述反义寡核苷酸、siRNA或shRNA的组合物的治疗有效量可以根据医学领域熟知的各种因素而改变，所述因素包括待实现的反应的种类和程度、患者的年龄、体重和健康状况等。
按照本发明的仍然另一方面，本发明涉及筛选癌症治疗剂的方法，所述方法包括用候选化合物处理表达eIF3m多肽和/或多核苷酸的细胞并测量所述细胞中eIF3m多肽或多核苷酸表达水平。
在本发明的筛选方法中，所述候选化合物，如果诱导eIF3m表达水平的增加，则被确定为致癌的。当eIF3m表达水平因而降低时，所述候选化合物被确定为可能的癌症治疗剂。按照所述筛选方法，可以由eIF3m表达水平很容易地确定所述候选者的活性。
本发明的有益效果
如目前所述，eIF3m可以用作癌症标志物，其允许以高敏感性和特异性诊断癌症。特别是，所述癌症标志物对于肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、直肠癌、黑素瘤和结肠癌的诊断是有用的。此外，当给予个体时，eIF3m表达调节剂可以通过抑制eIF3m基因的超表达来防止癌症的发作或进展。
附图简述
图1表示成对的患者组织中eIF3亚基的表达水平。使用表1所列的引物进行所有qRT-PCR反应并且通过AQ方法定量。
图2表示癌细胞系和人结肠组织中eIF3m(真核翻译因子3m亚基)的表达。
图3表示患者样品中的eIF3m的表达升高。通过qRT-PCR分析来自结肠腺癌患者的20对正常-肿瘤组织的eIF3m在转录水平的表达。
图4表示正常人组织和人癌细胞系中eIF3m的Northern印迹。
图5表示用来自结肠癌患者的正常/肿瘤组织对的qRT-PCR和Western印迹的数据。
图6表示人组织中eIF3m的免疫组织化学检测的结果。
图7表示通过siRNA沉默eIF3m的表达导致细胞增殖速率的降低。将eIF3m siRNA-1转染的HCT-116(wt)细胞孵育96小时。阴性对照包括无siRNA的单独缓冲液(BF)和非人阴性对照siRNA(NC)。
图8表示通过siRNA-3的eIF3m表达的沉默导致细胞增殖的降低。eIF3m siRNA-3转染的HCT-116(wt)细胞孵育96小时。阴性对照包括无siRNA的单独缓冲液(BF)和非人阴性对照siRNA(NC)。
图9表示在HCT-116细胞的免疫沉淀物中的eIF3m和RNA。(a)来自免疫沉淀的细胞裂解物的eIF3m的Western印迹。空白载体对照(pFLAG-CMV2)在输入对照(IC)或抗FLAG抗体结合的亲和性凝胶的免疫沉淀物(IP)中未显示出任何可检出的条带。然而，在pFLAG-CMV2-eIF3m转染的HCT-116细胞的IP中，出现具有指定大小的条带。(b)从免疫沉淀物提取后，在甲醛凝胶上分辨的RNA。空白载体对照未得到RNA，但是在pFLAG-CMV2-eIF3m转染的细胞中出现RNA。
图10表示相关分子的肿瘤学分析结果。
图11表示在eIF3m siRNA-1转染后0、24、48、72和96小时，在HCT-116细胞中通过Western印迹检测的巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)(a)和金属硫蛋白2A(MT2A)(b)的蛋白表达。还检测了人β肌动蛋白，用于上样对照(laoding control)。(c)在eIF3m siRNA-1转染后0、24、48、72和96小时，在HCT-116细胞中通过RT-PCR检测的MIF和MT2A的转录水平。
图12表示通过PCR产物测序确认的反应的特异性。在eIF3msiRNA-1转染后不同时间，在HCT-116细胞中通过qRT-PCR测量的(通过用β肌动蛋白mRNA表达标准化的相对定量)，MIF(a)和MT2A(b)的mRNA水平。
图13表示在eIF3m siRNA-1转染后0、24、48、72和96小时，HCT-116细胞中细胞分裂周期25同系物(CDC25A)蛋白的可调型表达。还检测了人β肌动蛋白，用于上样对照。
图14表示当沉默eIF3m表达时，HCT-116结肠癌细胞系的亚G0/G1群增加。处理后每24小时通过流式细胞仪测量siRNA转染的细胞的核含量，以检查细胞周期进程。BF和NC对照在有丝分裂细胞周期阶段未显示出任何显著的细胞周期差异。eIF3m siRNA-1处理在24小时增加亚G0/G1阶段，并且保持升高，直至96小时。
图15表示处理后每24小时通过流式细胞仪测量siRNA转染的细胞的核含量，以检查细胞周期进程。整个培养期中，BF和NC对照中的亚G0/G1期没有显著差异，但是eIF3m siRNA-3处理后的亚G0/G1阶段升高，直至96小时。
发明方式
通过以下实施例可以获得对本发明的更好的理解，提出这些实施例是为了举例说明，而不应当解释为限制本发明。
实施例1：结肠组织
遵照赫尔辛基协定(Helsinki Treaty)，获得人结肠组织。按照实验方案从患者切除组织并保存在-80℃，直至使用。
实施例2：细胞培养
本发明所用的所有的细胞系获自ATCC(American Type CultureCollection(美国典型培养物保藏中心)，Manassas，VA)和Korean Cell LineBank(韩国细胞系库)(首尔，韩国)。每种细胞系保持在补充了10％FBS(胎牛血清，Invitrogen)的维持液中。
实施例3：实时定量RT-PCR
使用Trizol试剂(Invitrogen)按照生产商使用说明，提取、洗涤总RNA。用DNA酶处理I分离物，以去除残留的基因组DNA，然后通过RNeasy柱(Qiagen)进行纯化。使用Nanodrop 1000(Thermo Scientific)定量RNA。用数微克的总RNA合成cDNA，使用1μl的在50mM Tris-Hcl(pH8.3)中的50μM oligo(dT)作为引物，然后通过Superscript III转录酶(Invitrogen)在20μl的含有75mM KCl、3mM MgCl2、5mM DTT、0.5mM dNTP和40U RNase Out(Invitrogen)的RT混合物中进行逆转录。通过与1μl的RNaseH(2单位)在37℃孵育20分钟去除模板RNA。自10倍连续稀释的克隆到pCR2.1 TOPO的扩增子，生成标准曲线，所述扩增子的范围从1.0×1010)拷贝/μl至1.0×102拷贝/μl。使用通过Superscript RT III(Invitrogen，USA)和5pmoles的正向和反向引物(表1)合成的1/10的cDNA，在QuantiFast SYBR Green PCR预制混合物(Master mix，Qiagen，Germany)中，按照以下热曲线(thermal profile)进行实时PCR分析：在LightCycler480(Roche Applied Science，Switzerland)上50℃保持2分钟，95℃保持10分钟，95℃30秒-58℃30秒-72℃30秒，重复40个循环。通过用GAPDH或ACTB标准化的相对定量(RQ)或绝对定量(AQ)法分析数据。
表1
  名称   序列(5′-＞3′)   SEQ ID No.
  EIF3A-F   GATCGAGAGGATCGCTTCAG   1
  EIF3A-R   CATCAGCACGTCTCCAAGAA   2
  EIF3B-F   GCCTCCTGCAGAAGAACAAC   3
  EIF3B-R   CTTCCGGAAATCTTCCATCA   4
  EIF3C-F   GTGCCTGGAAGAGTTTGAGC   5
  EIF3C-R   ATCTTCTGACGCAAGGTGCT   6
  EIF3D-F   CACGGAGCTGAAGAACAACA   7
  EIF3D-R   GTCAATGACGCAGCGTAAAA   8
  EIF3E-F   CAACCAGGGATGGTAGGATG   9
  EIF3E-R   TGCATCCCAATTCTGCATTA   10
  EIF3F-F   CCGCACAATGAGTCAGAAGA   11
  EIF3F-R   TGCTGACGTAGGCTTTGATG   12
  EIF3G-F   CTTTGCCTTCATCAGCTTCC   13
  EIF3G-R   GAGCTGCTTTATTGCCCTTG   14
  EIF3H-F   CCTCAGCACACAGAGGATGA   15
  EIF3H-R   TCCTTGGGCAGTTTTATGG   16
  EIF3I-F   CTCTCCCCCAACTATGACCA   17
  EIF3I-R   ATCAGGATGGAAGGCAACAC   18
  EIF3J-F   AAGCAAAGCAAAGCCAAAAA   19
  EIF3J-R   AGGGATTGTGGGCAACATAA   20
  EIF3J-F   TGGAATCTCTCGAGTGCAAA   21
  EIF3J-R   GTGCAGTTTGCTGAGCATGT   22
  EIF3K-F   GCCAAGGAAAATGCCTATGA   23
  EIF3K-R   ATTGGCCGTTCTTCTTGATG   24
  EIF3L-F   CTTCCTGGACCTCACAGAGC   25
  EIF3L-R   TTTGTGGATCTGACGGATGA   26
  EIF3M-F   TGCTGCTTCAAAAGTCATGG   27
  EIF3M-R   CATGAATAAGCTCGCCTTCC   28
  MIF-F   GCATCAGCCCGGACAGGGTC   29
  MIF-R   GGTGGAGCCAGCGCAGACAG   30
  MT2A-F   AACCCGCGTGCAACCTGTCC   31
  MT2A-R   GGCACACTTGGCACAGCCCA   32
实施例4：Norhern印迹
通过RediPrime试剂盒(GE Healthcare，USA)用[α-32P]dCTP(3000Ci/mmol，10mCi/ml；Perkin Elmer NEN)标记全长EIF3m基因的1126bp长的可读框，并通过G-50 Microcolumn(GE Healthcare，USA)进行过滤以去除未结合的核苷酸。使MTN印迹(BD clontech，USA)与变性的探针在ULTRAhyb溶液(Ambion，USA)中于42℃下杂交过夜，并按照标准流程在BioMax MS胶片(Kodak，USA)上进行检测，在-80℃强化筛选。
实施例5：Western印迹
通过将培养的细胞在含有Halt蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific，USA)的M-PER裂解缓冲液中匀质化制备细胞裂解物。通过将切片的组织在含有Halt蛋白酶抑制剂(Thermo Scientific，USA)的T-PER裂解缓冲液中匀质化制备组织裂解物。借助于TissueLyser(Qiagen)，通过在微管中以30Hz混合钨珠2分钟制备组织匀浆。使用BCA蛋白检测试剂盒(ThermoScientific)按照生产商的使用说明，测量蛋白浓度。在1×MOPS运行缓冲液中的4-12％NuPAGE凝胶(Invitrogen)上通过电泳分辨细胞或组织裂解物，然后转移到Immobilon-P膜(Millipore，USA)上，然后用1∶2000稀释的一抗eIF3m抗体(Proteintech Group)或1∶500稀释的抗MIF抗体(Abnova)，并最后HRP-结合的抗兔抗体(Sigma-Aldrich)进行检测。
实施例6：免疫组织化学
在10％中性缓冲甲醛溶液中固定结肠的肿瘤组织，并按照标准操作埋入石蜡块中。将4μm厚的组织切片固定在载玻片上并且用蛋白酶预处理。使用BechMark XT自动系统(Ventana Medical System)进行染色。用于Western印迹的一抗进行1∶100稀释，并且用内源生物素封闭以避免假阳性信号的检出。通过生物素化的二抗，然后通过结合其链霉抗生物素-HRP(辣根过氧化物酶)结合物来检测信号。用过氧化氢底物和3，3′-DAB(二氨基联苯胺四盐酸盐)色原体将复合物呈现为暗棕色沉淀物。用苏木精-伊红复染载玻片并在光学显微镜下观察。
实施例7：有标签的eIF3m的克隆
用具有以下核苷酸序列的引物扩增eIF3m ORF并插入pCR2.1-TOPO载体。
F：5′-CAC CAT GAG GGT CCC GGC-3′(SEQ ID NO.33)
R：5′-GGT ATC AGA AAG ACT CAA AAG GCT G-3′(SEQ ID NO.34)
测序后，将该插入物克隆到pFLAG-CMV2载体(Sigma-Aldrich)中。
实施例8：核糖核酸组学
通过Lipofectamine 2000(Invitrogen)，用4μg的pFLAG-CMV2-eIF3m表达载体转染两百万个HCT-116细胞，并在5％CO2孵育器中、在补充了10％FBS的DMEM中、37℃培养48小时。在Symplekin免疫沉淀缓冲液(150mM NaCl、25mM HEPES-KOH[pH 7.5]、10％[v/v]甘油、1mMMgCl2、2mM正钒酸钠、2mM β-磷酸甘油、1mM PMSF(苯甲基磺酰氟)、1mM DTT、2mM EDTA、0.5％ TritonX-100、50μg/ml RNA酶A[Sigma-Aldrich]和1×蛋白酶抑制剂混合物[Roche])中使细胞匀质化。将裂解物洗涤、离心并用40μl的FLAG-M2亲和凝胶沉淀。按照生产商提供的流程，使用Trizol试剂从免疫沉淀的胶团提取总RNA。用Nanodrop 1000定量总RNA。通过GeneRacer试剂盒(Invitrogen)，用1.575μg的总RNA生成cDNA文库。逆转录前，将总RNA脱磷酸、脱帽并连接到RNA接头。使用对所述接头具有特异性的GeneRacer 5′和3′引物，进行24个循环的以下热曲线的PCR。将PCR产物克隆到EcoRV消化的pBlueScriptII-KS(+)载体并通过电穿孔转化到DH10B感受态细胞。鉴定来自单个集落的细胞并将每个克隆测序。
实施例9：细胞增殖和细胞周期分析
用预先由Qiagen设计的siRNA处理野生型人结肠癌细胞系HCT-116后，检测eIF3m对细胞增殖和细胞周期的影响。用eIF3m-特异性siRNA或阴性对照siRNA(NC)或仅无RNA酶的缓冲液(BF)转染20,000个HCT-116细胞，并在6孔板培养96小时，每24小时通过MTT(3-[45-二甲基噻唑-2-基]-25-二苯基四氮唑溴盐)检测来监测细胞增殖。将具有非特异性对照siRNA、eIF3m-特异性siRNA和仅无RNA酶缓冲液(未处理的100％存活对照)的三种HCT-116细胞培养物横切(transected)并接种到6孔板。每小时将725μL的MTT(2mg/ml)添加到每个孔。孵育4小时后，吸去培养基并且用1.955ml的DMSO(二甲基亚砜)将细胞孵育10分钟。在扫描微板读数器(Molecular Devices)上读取540nm的吸光度。通过流式细胞仪分析细胞周期进程。将约5×104HCT-116细胞接种到6孔板并用阴性对照siRNA、eIF3m-特异性siRNA或仅无RNA酶的缓冲液处理。通过每小时用0.5％胰酶处理来收集、用冰冷PBS洗涤细胞并用70％乙醇在4℃固定细胞。然后，洗涤细胞并于37℃、在碘化丙啶(PI)染色缓冲液(PBS中10μg/ml无DNA酶的RNA酶A、50μg/ml PI)中重悬浮20分钟。使用BD Cellquest软件在FACSCaliburTM流式细胞仪(BD Biosciences，USA)上分析PT染色的细胞。如通过Western印迹所监测的，发现eIF3m表达降低(抑制)。
实施例10：统计学显著性评价
通过用于未配对组之间比较的斯氏双尾t检验(Student’s two-tail t-test)和用于正常/肿瘤组织对之间比较的斯氏配对双尾t检验(Student’s pairedtwo-tail t-test)，分析统计学显著性。为了显示误差范围，我们对于每组采用了标准偏差或标准误差平均值(SEM)。
结果
癌症中eIF3m亚基的表达升高
为了研究eIF3m亚基的上调和人结肠肿瘤的进程之间的关系，首先进行实时PCR来检测来自19名患者的正常结肠和肿瘤(腺癌)组织对中13种eIF3亚基的转录物。通过由GAPDH(图1)标准化的相对定量(RQ)测量表达差异。eIF3b是eIF3核心亚基之一，其在大多数患者(18/19)中表现出高表达水平，然而其他核心因子保持低表达水平。在8个非核心亚基中，eIF3d、e、h、k和m亚基在超过50％的患者的肿瘤中表现出表达升高。在表现出肿瘤中较高表达的5个非核心eIF3亚基中，选择eIF3m进一步研究其特征。为了确认肿瘤中eIF3m的表达升高，通过绝对定量(AQ)测量所有相同患者以及7种培养的癌细胞系的eIF3m mRNA水平。画出标准曲线(相关系数r2＞0.95)并用于计算分子数(图2A)。肺癌细胞系A549表现出4.25×104拷贝/ng总RNA。在4个结肠癌细胞系中，表达的范围为从1.92×104至3.44×104拷贝/ng总RNA。在2个乳腺癌细胞系中，特别是在赫赛汀(Herceptin)抵抗的JIMT-1中，表达水平(6.09×104拷贝/ng总RNA)大于2倍的赫赛汀敏感的SK-BR-3(2.57×104拷贝/ng总RNA)。与那7个人癌细胞系相反，正常的细胞系HDF表现出非常低的表达水平(1.17×103拷贝/ng总RNA)。在RQ数据在19名患者中的12名的肿瘤中表现出较高的表达的同时，与范围为从3.50×10至2.51×103的正常对应相比，在所有患者(配对t检验，p＝0.00013)的肿瘤中，AQ表现出eIF3m的表达显著升高，范围为从3.44×102至3.27×104拷贝/ng总RNA(图2B)。此外，在细胞系和组织对中确认了eIF3m的蛋白水平升高。癌细胞系比正常细胞系HDF表达更高的eIF3m的蛋白水平，这符合其mRNA水平的表达强度(图2C)。两个乳腺癌细胞系中蛋白水平的eIF3m表达与上述的mRNA水平相似。正常和肿瘤结肠组织之间eIF3m蛋白表达存在差异，然而，该差异不如mRNA水平中显著(图2D)。
为了确保其表达差异，我们检查了另外20个配对的患者组织中其mRNA和蛋白水平(图3A和3B)。然后，通过光密度法评价了正常和肿瘤组织之间的蛋白表达差异(图3C)。肿瘤组织中eIF3m自身的平均密度(86.6)高于正常对应(66.6)的1.3倍(配对t检验，p＝0.00098)。通过β肌动蛋白标准化的密度的倍数变化也为1.3(p＝0.00070)。
由分析获得的数据表明，eIF3m表达水平的升高与细胞系以及结肠组织中的肿瘤进程相关。
eIF3m mRNA表达的组织特异性
通过Northern杂交在转录水平检查eIF3m表达的肿瘤特异性。尽管正常组织、心脏、骨骼肌、肾、肝、胎盘和外周血白细胞表现出eIF3m表达升高，但是在脑、结肠、胸腺、小肠和肺中未见eIF3m的可检测的表达信号。作为管家基因的β肌动蛋白始终存在于所有这些组织中(图4A)。人癌细胞系也表现出eIF3m mRNA的高表达(图4B)。在几种白血病细胞系和淋巴瘤细胞系中观察到非常高的eIF3m表达水平。结肠直肠腺癌SW480在eIF3m表达中高于黑素瘤。此外，发现肺腺癌细胞系A549具有如通过qRT-PCR所测量的eIF3m表达水平。在该杂交中，未见eIF3m转录物的剪接变体。
通过qRT-PCR检测了来自结肠直肠腺癌患者的正常/肿瘤组织对的eIF3m在转录水平的表达(图5)。观察到来自大多数患者的肿瘤组织的eIF3m mRNA水平显著升高，表达水平比某些患者的正常组织中的高约10倍(图5A#33和#34)。在Western印迹分析中，与正常组织的条带相比，检测到显著厚重的条带。(图5B)
eIF3m在人结肠癌组织中优选表达的确认
如通过qRT-PCR和Western印迹测量的，还检测了eIF3m的表达。为了检查eIF3m是否仅在特定组织的细胞中表达，对组织切片进行了免疫组织化学(IHC)。将用于Western印迹的一抗施加于良好分化的淋巴结转移结肠直肠腺癌细胞和中等分化的结肠直肠腺癌细胞(图6D和6F)。结果，在肿瘤部位中的细胞中(图6C和6F)和在局部淋巴结中的转移癌细胞中(LN)都检测到eIF3m的显著高的表达水平(图6A)。相反，在瘤周组织的非瘤上皮细胞中检测到低信号，所述瘤周组织的非瘤上皮细胞位于结肠的内衬管腔(lining lumne)，在那儿经常发生细胞再生(图6B和6E)。以较高放大率确认了eIF3m表达的亚细胞定位。在蓝色复染的细胞核中未检测到eIF3m表达，但是在癌和非瘤上皮细胞中eIF3m表达被限于胞质溶胶。与隐窝部位的上皮细胞相比，于其间存在的基质细胞具有较低的表达水平。肌细胞中未观察到eIF3m(图6A和6D)。在肝组织上的转移癌中观察到eIF3m的高表达水平(图6G至6I)。如图6G和6F中所示，鉴于瘤周组织相对清楚，转移部位以与结肠直肠腺癌的肿瘤相似的模式表现出eIF3m的强表达。在肝细胞癌中也检测到高eIF3m表达水平(图6J和6L)。与正常组织的外周部位相比，特征为反应性增殖(responsiveproliferation)的肝硬化部位中的RN(regenerating nodules，再生结节)也表现出eIF3m的强表达。相似地，浆液性囊腺癌比卵巢组织的瘤周部位表现出更高的eIF3m表达水平(图6M和6O)。这些结果表明，在细胞增殖以较高水平活跃的肿瘤和瘤周组织中，eIF3m高度表达。
沉默eIF3m表达降低人结肠癌细胞的增殖
通过IHC所证实的瘤周部位中eIF3m的低表达表明，eIF3m还参与反应性增殖以及肿瘤进程。为了确定eIF3m表达对细胞增殖的影响，我们研究了使用siRNA在HCT-116结肠癌细胞中沉默eIF3m mRNA的效果。首先，用缓冲液(BF)、非人阴性对照siRNA(NC)和eIF3m特异性siRNA-1/-3转染HCT-116结肠癌细胞。然后，转染后96小时，我们通过Western印迹每24小时检查eIF3m的表达(图7A和8A)。从siRNA转染后24小时直至96小时eIF3m表达降低。相反，BF或NC未改变eIF3m蛋白的水平。BF和NC后的融合快速增加并在72小时达到稳定期(图7B)，但是eIF3m siRNA-1从24小时延缓增殖。eIF3m siRNA的96小时的融合低于用BF或NC的融合(图7B)。通过与用NC的6倍和用BF的5倍相比，表现出用eIF3m siRNA在72小时增加不高于3倍(图7C)，MTT检测确认了该情况。通过使用另一siRNA即siRNA-3再次证实该结果(图8B)。在96小时时，与NC相比，siRNA-1和-3的沉默效率分别为46.4％(斯氏t检验，p＝1.3×10-5)和65.3％(斯氏t检验，p＝2.8×10-9)。这些结果表明，通过沉默eIF3m表达阻碍癌症细胞的增殖。
eIF3m相关的转录物
eIF3m已知为“非核心”eIF3亚基之一。推定的eIF3m是40S核糖体亚基的组分之一，并且取决于细胞的生理状态，可以参与细胞增殖相关的转录物的亚类的表达。因此，本发明人采用核糖核酸组学策略来发现与eIF3m相关的高水平表达的转录物。将eIF3m克隆到FLAG标签表达质粒并受CMV2启动子的控制在HCT-116结肠癌细胞系中表达。转染48小时后，收获培养的细胞，并将裂解物与FLAG-M2亲和凝胶免疫沉淀。在Western印迹上，插入eIF3m的质粒产生指定大小的eIF3m条带，但是空白载体对照未产生(图9A)。从免疫沉淀凝胶团提取总RNA。在免疫沉淀物中，eIF3m表达克隆生成可检出的量的RNA，但是空白载体未产生(图9B)。用该RNA制备cDNA文库。在344个随机挑选的克隆中，成功读取181个克隆的序列，并且在下文的表2中给出了81个代表性种类的eIF3m相关基因。这些序列包括75个核糖体蛋白基因(41.4％)、eIF3m自身(25.4％)、54个代表性单一基因(29.8％)和8个未分类的条目(4.4％)。通过用于分子功能的基因本体(gene ontology)对这些基因的分类揭示出，大部分eIF3m相关的转录物编码用于蛋白翻译(蛋白结合、核糖体的结构组分、翻译起始因子活性和核糖核蛋白结合)和RNA结合(核酸结合、RNA结合和rRNA结合)的基因(表2)。另一类值得注意的基因与金属离子结合活性有关(镉离子和铜离子结合)。对于这些转录物的深入研究，选择巨噬细胞迁移抑制因子(MIF)基因。当通过Western印迹检查eIF3m siRNA处理的HCT-116细胞裂解物时，如eIF3m表达一样MIF的蛋白水平降低直至48小时，但是其从72小时恢复至正常水平(图11A)。UC1MT抗体检测MT1和MT2亚型，但是在核糖核酸组学中MT2A是主要形式，所以我们应用该抗体检测MT2A蛋白。MT2A的蛋白水平也降低，直至48小时，但是不同于MIF，其并不返回至正常水平(图11B)。然而，mRNA水平与蛋白水平并不相关，而是以不同方式显示出较小变化(图11A、11B和11C))。这表明eIF3m通过调节翻译效率或影响靶mRNA的稳定性来影响指定亚类的细胞增殖基因的表达。
此外，对于MIF和MT2A的蛋白水平是否受HCT-116细胞中eIF3m表达影响，检查了MIF和MT2A的蛋白水平。因为Lim et al.(2009)报道了通过乳腺癌细胞中的MT2A沉默的细胞分裂周期25同系物A(CDC25A)降解和G1抑制，所以检查了eIF3m沉默是否影响CDC25A水平并且立即发现其从24小时直至72小时降低CDC25A(图13)。这些结果确认eIF3m表达对于细胞周期调节的影响。
Figure BPA00001258901100221
Figure BPA00001258901100231
Figure BPA00001258901100251
eIF3m沉默对于细胞周期的影响
细胞增殖或细胞死亡与细胞分化密切相关，因为连续的细胞周期是决定增殖和凋亡的第一入口。因此，在细胞增殖阻滞的情况下，如图7中所示，通过eIF3m沉默，使用流式细胞仪分析了HCT-116细胞系中eIF3m抑制后的细胞周期进程。用eIF3m siRNA、BF或NC对照处理HCT-116细胞。siRNA转染24小时后，在用NC、BF和eIF3m siRNA处理的组之间，每个有丝分裂阶段的比例无显著差异(图14和15)。随着时间点从24小时移至48小时，eIF3m siRNA处理的细胞中亚G0/G1期的比例从1.65％增至7.87％，但是BF和NC的亚G0/G1分别保持在1.44％和2.37％。有趣的是，eIF3m siRNA-1处理的细胞的S期的比例从26.40％降至22.16％，而在BF和NC中S期的比例分别从24.67％增至30.12％和从26.00％增至31.06％。当培养细胞72小时时，eIF3m siRNA-1的亚G0/G1比例的增长(11.36％)与BF(1.97％)或NC(2.78％)相比变得更突出。对于eIF3m siRNA-1，在相同时间点的S期(23.73％)仍然低于用BF(29.15％)或NC(25.67％)的S期。此外，在之前的时间点未表现出显著差异的G2/M期在72小时与用BF的27.03％和NC的29.46％相比，降至22.91％。该趋势保持了96小时，eIF3m siRNA-1中亚G0/G1期达到12.36％，而BF(0.49％)和NC(0.91％)中仍然是低的。另一方面，与BF(32.22％)和NC(30.56％)的S期相比，eIF3m siRNA-1(19.49％)中的S期显著较低，并且相似地，与BF(25.63％)和NC(27.40％)相比，G2/M期降低(21.81％)。eIF3msiRNA-3从24小时也表现出增加的亚G0/G1，并且在96小时，与BF(2.52％)或NC(3.31％)相比，其表现出11.26％的亚G0/G1，以及与BF(31.16％)或NC(29.22％)相比，其表现出G2/M期(19.75％)的比例降低。综上所述，这些结果表明，eIF3m表达的沉默增加亚G0/G1比例并且导致细胞死亡。因此，eIF3m表达似乎是细胞继续细胞周期并最终对于细胞增殖所需要的。
尽管为了举例的目的，公开了本发明优选的实施方案，但本领域技术人员应当理解到，在不脱离附加权利要求中所公开的本发明的范围和实质的情况下，各种修饰、添加和取代是可能的。

Claims (13)

1.用于检测癌症标志物的组合物，其包含用于测量eIF3m的mRNA或蛋白表达水平的试剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述用于测量eIF3m的mRNA表达水平的试剂与eIF3m mRNA特异性地结合，并且选自引物对、探针和反义寡核苷酸。
3.如权利要求1所述的组合物，其中所述用于测量eIF3m的蛋白表达水平的试剂是抗体。
4.如权利要求1所述的组合物，其中所述癌症标志物在选自肺癌、乳腺癌、肝癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌的癌症中被靶定。
5.癌症诊断试剂盒，其包含权利要求1-4中之一所述的组合物。
6.如权利要求5所述的癌症诊断试剂盒，其基于RT-PCR试剂盒、竞争性RT-PCR试剂盒、实时RT-PCR试剂盒、DNA芯片试剂盒或蛋白芯片试剂盒。
7.检测eIF3m多核苷酸的方法，其包括：
(a)提供生物样本；
(b)用权利要求2所述的试剂处理所述生物样本；
(c)检测所述试剂与与其互补的多核苷酸的结合物；以及
(d)定量比较个体和正常对照之间的结合物。
8.检测eIF3m蛋白的方法，其包括：
(a)提供生物样本；
(b)用对所述eIF3m蛋白具有特异性的抗体处理所述生物样本；
(c)检测所形成的抗原-抗体复合物；以及
(d)定量比较个体和正常对照之间的复合物。
9.用于癌症治疗和预防的组合物，其包含抑制eIF3m多核苷酸表达的寡核苷酸。
10.如权利要求9所述的组合物，其中所述寡核苷酸是对eIF3m基因具有特异性的反义寡核苷酸、适体、siRNA或shRNA。
11.用于癌症的治疗和预防的组合物，其包含具有针对eIF3m多肽的抑制活性的抗体或其抗原-结合片段。
12.如权利要求9或11所述的组合物，其中所述癌症选自肺癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、结肠癌、黑素瘤和直肠癌。
13.筛选癌症的治疗药物的方法，其包括：
用候选化合物处理表达eIF3m多肽和/或多核苷酸的细胞；并且测量所述细胞中eIF3m多肽或多核苷酸表达水平。
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