JP2009039100A - 癌感受性および欠陥のあるｄｎａ修復機構の診断方法および組成物、ならびにそれらを治療するための方法および組成物 - Google Patents

癌感受性および欠陥のあるｄｎａ修復機構の診断方法および組成物、ならびにそれらを治療するための方法および組成物 Download PDF

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    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/52—Predicting or monitoring the response to treatment, e.g. for selection of therapy based on assay results in personalised medicine; Prognosis

Abstract

【課題】癌感受性、欠陥のあるＤＮＡ修復機構の診断方法および組成物、ならびにそれらを治療するための方法および組成物の提供。
【解決手段】ＦＡＮＣＤ２遺伝子、該遺伝子に基づく試験において患者をスクリーニングするためのプローブおよびプライマー、ならびにファンコニ貧血および癌について診断するためのプローブおよびプライマー。ＦＡＮＣＤ２遺伝子を、欠陥のあるＤＮＡ修復に関連する病態を治療するための新規治療薬のスクリーニングにおいて実験マウスモデルを調製するためにインビボで標的とする。２つのアイソフォームを識別するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を調製し、対象が無傷ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路を有するかどうかを決定するための診断学的検査において使用する。
【選択図】なし

Description

政府の支援
本明細書に記載した研究は、米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）助成金番号第ＲＯ１ＨＬ５２７２５−０４号、第ＲＯ１ＤＫ４３８８９−０９号、第１ＰＯ１ＨＬ４８５４６号、および第ＰＯ１ＨＬ５４７８５−０４号により支援を受けた。米国政府は、本発明に対して一定の権利を有する。
背景
本発明は、ＦＡＮＣＤ２遺伝子に欠陥を有する対象における癌感受性の診断、および癌を発症した当該対象のために適切な治療プロトコールの決定に関する。ＦＡＮＣＤ２遺伝子に欠陥のある動物モデルを使用すると、治療薬をスクリーニングすることができる。
ファンコニ貧血症（ＦＡ）は、先天性欠陥、骨髄不全および癌の素因を特徴とする常染色体劣性癌感受性症候群である。ＦＡ患者由来細胞は、マイトマイシンＣまたはジエポキシブタン等の鎖間ＤＮＡ架橋を産生する物質に対して特有の過敏性を示す。ＦＡ患者は、急性骨髄性白血病ならびに皮膚、胃腸および婦人科系の癌を含む、数種のタイプの癌を発症する。皮膚および胃腸の腫瘍は、通例は扁平上皮細胞癌である。ＦＡ患者の少なくとも２０％が癌を発症する。患者が癌を発症する平均年齢は、白血病については１５歳、肝腫瘍については１６歳、そして他の腫瘍については２３歳である。（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，Ｂｌｏｏｄ，（１９９７）ｖｏｌ．９０、ｐ１７２５、Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，（１９９９）ｖｏｌ．２、ｐ８３〜８８、およびＨｅｉｊｎａら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．ｖｏｌ．６６、ｐ１５４０〜１５５１を参照）。
ＦＡは、遺伝的に異質性である。体細胞融合研究では、少なくとも７つの別個の相補性群が同定されている（Ｊｏｅｎｊｅら，（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，ｖｏｌ．６１、ｐ９４０〜９４４、およびＪｏｅｎｊｅら，（２０００）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ，ｖｏｌ．６７、ｐ７５９〜７６２）。この観察から、ＦＡ遺伝子はＤＮＡ架橋に対する細胞応答に関係する多成分経路を定義するという仮説が生じた。５種のＦＡ遺伝子（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＮＣＧ）がクローニングされ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣおよびＦＡＮＣＧタンパク質は主として核局在化を伴って分子複合体を形成することが証明されている。ＦＡＮＣＣはまた、細胞質内にも局在する。種々のＦＡタンパク質は、無脊椎動物種において、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦ、およびＦＡＮＣＧタンパク質の強力な相同物を備えていない既知の配列モチーフをほとんどまたは全く有していない。ＦＡＮＣＦは、大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＲＮＡ結合タンパク質に対して有意性が不明の弱い相同性を有する。最も頻回に見られる２つの相補性群はＦＡ−ＡおよびＦＡ−Ｃであり、合計するとＦＡ患者の７５〜８０％を占める。多発性突然変異は、８０ｋｂに及び、少なくとも４３個のエクソンからなるＦＡＮＣＡ遺伝子において認識されている。ＦＡＮＣＣは、１４個のエクソンを有することが見いだされており、およそ８０ｋｂに及ぶ。ＦＡＮＣＣ遺伝子内の突然変異の数は同定されており、これは、重症度の相違するＦＡと相関する。ＦＡ−Ｄは、明確であるがまれな相補性群であると同定されている。ＦＡ−Ｄ患者は表現型により他のサブタイプの患者から区別することができるが、ＦＡタンパク質複合体は、通常はＦＡ−Ｄ細胞内に集合する（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，（１９９８）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．、ｖｏｌ．９５、ｐ１３０８５〜１３０９０）。
クローン化ＦＡタンパク質は、相互に配列類似性を備えていないか、またはＧｅｎＢａｎｋ内の他のタンパク質との配列類似性を備えていないオーファンタンパク質をコードし、前記タンパク質配列内では機能的ドメインは明白ではない。これらのタンパク質の細胞機能または生化学機能に関してはほとんど何も知られていない。
ＦＡの診断は、ＦＡ患者表現型における幅広い変動性によって複雑になる。さらに診断を混乱させることに、ＦＡ患者のおよそ３３％は明白な先天性異常を有していない。その上、現行の診断テストでは一般集団からＦＡキャリアを弁別できない。診断に関連する問題は、Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，（１９９７）に記載されている。ＦＡ細胞では多数の細胞表現型が報告されているが、最も一致しているのは、マイトマイシンＣまたはジエポキシブタン等の二官能性アルキル化剤に対する過敏性である。これらの薬剤は、鎖間ＤＮＡ架橋（ＤＮＡ損傷の重要な種類）を産生する。
癌感受性の診断は、癌の形成には極めて多数の調節遺伝子および生化学的経路が関係しているために複雑になる。それらがどのように発生するかに依存する種々の癌および関連する遺伝的病変は、対象がいずれかの特定の治療処置にどのように反応するかを決定しうる。欠陥のある修復機構に関連する遺伝的病変は、欠陥のある細胞分割およびアポトーシスを生じさせることがあり、これは次には、癌に対する患者の感受性を増加させる可能性がある。ＦＡは、多数の病理学的転帰が、癌感受性に加えて欠陥のある修復機構にも関連している、疾患状態である。
ファンコニ貧血経路の分子遺伝学および細胞生物学について理解できれば、非ＦＡ患者ならびにＦＡ患者において発症する特定の種類の癌およびＤＮＡ修復機構における欠陥に関連する病態に関して、予後、診断および治療への洞察が得られる。
発明の概要
本発明は、患者が癌を有するかどうか、もしくは患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法を特徴とし、本方法は癌関連性欠陥の存在についてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を検査することを含むが、ここで、１以上の癌関連性欠陥の存在は前記患者における癌または癌リスクの増加を示す。癌は、乳癌、卵巣癌、もしくは前立腺癌、または他の形態の癌であってよい。癌関連性欠陥は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内において１以上の癌関連性欠陥を有していない患者における比率に比較してＦＡＮＣＤ２−Ｓに対するＦＡＮＣＤ２−Ｌの比率の低下を生じさせる、癌関連性欠陥であってよい。
本発明はまた、患者が癌を有するかどうか、もしくは患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法を特徴とし、本方法は癌関連性欠陥の存在についてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路タンパク質を検査することを含むが、ここで、癌関連性欠陥の存在は患者における癌または癌リスクの増加を示す。癌は、乳癌、卵巣癌、もしくは前立腺癌、または他の形態の癌であってよい。
別の態様においては、本発明は、患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法を特徴とし、本方法は：（ａ）患者由来の組織サンプルを提供するステップと；（ｂ）組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；および（ｃ）細胞内のＦＡＮＣＤ２−ＳおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の存在についてアッセイするステップ；とを含むが、ここで、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ対ＦＡＮＣＤ２−Ｓの比率の低下は、前記患者の発癌リスクが増加していることを示す。癌は、乳癌、卵巣癌、もしくは前立腺癌、または他の形態の癌であってよい。患者は、ＢＲＣＡ−１またはＢＲＣＡ−２遺伝子内に以前より知られているいずれかの癌関連性欠陥を有することが、分かっていても分かっていなくてもよい。多数の当該組織サンプルは、アレイ上またはアレイ内に分配することができる。
別の態様においては、本発明は、患者が癌を有するかどうか、もしくは患者の発癌リスクが増加しているかどうかを決定する方法を特徴とするが、ここで、患者はＢＲＣＡ−１またはＢＲＣＡ−２遺伝子内に既知の癌を引き起こす欠陥を有しておらず、本方法は：（ａ）患者からのＤＮＡサンプルを提供するステップと；（ｂ）配列番号１１５〜１８６のＦＡＮＣＤ２遺伝子特異的ポリヌクレオチドプライマーを用いて、患者由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子を増幅させるステップと；（ｃ）増幅したＦＡＮＣＤ２遺伝子について配列決定するステップと；（ｄ）患者由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を、対照標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列と比較するステップとを含むが、ここで、２つの遺伝子配列間の不一致は癌関連性欠陥の存在を示し、１以上の癌関連性欠陥の存在は、前記患者が癌であること、または患者の発癌リスクが増加していることを示す。癌は、乳癌、卵巣癌、もしくは前立腺癌、または他の形態の癌であってよい。患者は、ＢＲＣＡ−１またはＦＡＮＣ−Ｄ１／ＢＲＣＡ−２遺伝子内に以前より知られているいずれかの癌関連性欠陥を有することが、分かっていても分かっていなくてもよい。多数の当該組織サンプルはアレイ上またはアレイ内に分配することができる。配列番号１１５〜１８６は、表７に示したように、一致したプライマーセットであり、奇数番号のプライマーはフォワードプライマーであり、偶数番号のプライマーはリバースプライマーである。プライマーはまた、新規のプライマー対を作成するために種々の対から使用することができ、例えば配列番号１１５を配列番号１１８と一緒に使用できる。「不一致（ｄｉｓｃｒｅｐａｎｃｙ）」とは、２つの配列間の相違を意味し、この相違は癌と関連することが知られている。
さらに別の態様においては、本発明は、化学増感剤をスクリーニングする方法を特徴とし、本方法は：（ａ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤を提供するステップと；（ｂ）１以上の抗腫瘍剤に耐性である腫瘍細胞系を提供するステップと；（ｃ）腫瘍細胞系、およびファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤、および１以上の抗腫瘍剤を接触させるステップと；（ｄ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤および抗腫瘍剤の存在下において腫瘍細胞系の増殖率を測定するステップ；とを含むが、ここで、抗腫瘍剤の存在下およびファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤の不存在下における腫瘍細胞系の細胞と比較した腫瘍細胞系の増殖率の低下は、潜在的阻害剤が化学増感剤であることを示している。ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤はマイクロアレイ上でスクリーニングすることができるが、ここで、マイクロアレイは、１以上の抗腫瘍剤に耐性である１以上の細胞を含有するアドレス（addresses）を含有する。ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のユビキチン化の阻害剤であってよい。抗腫瘍剤はシスプラチンであってよい。腫瘍細胞系は卵巣癌細胞系であってよい。
別の態様においては、本発明は、癌を有する患者を治療する方法を特徴とし、ここで、癌は抗腫瘍剤に耐性であり、本方法は治療的有効量のファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤を抗腫瘍剤と一緒に投与するステップを含む。抗腫瘍剤はシスプラチンであってよい。ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のユビキチン化の阻害剤であってよい。腫瘍細胞系は卵巣癌細胞系であってよい。
さらに別の態様においては、本発明は、癌治療薬をスクリーニングする方法を特徴とし、本方法は：（ａ）１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を含有する１以上の細胞を提供するステップと；（ｂ）潜在的癌治療薬の存在下で細胞を増殖させるステップと；（ｃ）前記潜在的癌治療薬の不存在下で増殖した相当する細胞の増殖率に比較して潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率を決定するステップ；とを含むが、ここで、潜在的癌治療薬の不存在下で増殖した相当する細胞の増殖率に比較した潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率の低下は、潜在的癌治療薬が癌治療薬であることを示している。細胞は、１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子、または数個のそのような遺伝子を含有していてよく、そしてアレイ内に分配されている。
本発明はまた、癌患者における治療薬の有効性を予測する方法を特徴とし、本方法は：（ａ）治療薬を用いて治療されている癌患者由来の組織サンプルを提供するステップと；（ｂ）組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；（ｃ）細胞内におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の存在を検出するステップ；とを含むが、ここで、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在は、癌患者における治療薬の有効性の低下を示す。治療薬は抗腫瘍剤であってよく、例えばシスプラチンであってよい。または、ステップ（ｃ）では、ＦＡＮＣ−Ｄ２−ＳおよびＦＡＮＣ−Ｄ２−Ｌの両方を検出することができ、非癌患者における比率と比較したＦＡＮＣＤ２−Ｓに対するＦＡＮＣＤ２−Ｌの比率の低下は、有効性の低下を示す。
本発明はまた、抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の耐性を決定する方法を特徴とし、：（ａ）抗腫瘍剤を用いて治療されている患者由来の組織サンプルを提供するステップと；（ｂ）組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；（ｃ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態を決定するステップ；とを含むが、ここで、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化は抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の耐性を示す。ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子はＦＡＮＣＦ遺伝子であってよい。抗腫瘍剤はシスプラチンであってよい。
本発明はまた、ＦＡＮＣＤ２遺伝子に対して特異的なポリヌクレオチドプライマー対、対照標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列およびそのためのパッケージング材料を含む、ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の欠陥を検出するためのキットを特徴とする。
本発明はまた、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ特異的抗体およびそのためのパッケージング材料を含む、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在を検出するためのキットを特徴とする。
本発明はまた、ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチドプライマー対およびプローブ、非メチル化対照標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列、ならびにそのためのパッケージング材料を含む、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態を決定するためのキットを特徴とする。
本発明はまた、１以上の抗腫瘍剤に耐性である腫瘍細胞系およびそのためのパッケージング材料を含む、化学増感剤についてスクリーニングするためのキットを特徴とする。腫瘍細胞系は卵巣癌細胞系、例えばシスプラチン耐性卵巣癌細胞系であってよい。抗腫瘍剤はシスプラチンであってよい。
本発明はまた、１以上のファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子からの１以上の核酸配列を含有する、マイクロアレイを特徴とする。この遺伝子は、ＡＴＭ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＮＣＧからなる群から選択できる。
本発明はまた、患者が癌を有するかどうか、または患者の発癌リスクが増加しているかどうかを決定する方法におけるこのようなマイクロアレイの使用を特徴とし、本方法は：（ａ）マイクロアレイを提供するステップと；（ｂ）患者由来の核酸サンプルを提供するステップと；（ｃ）マイクロアレイ上でファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路からの核酸配列へ核酸サンプルをハイブリダイズさせるステップと；（ｄ）患者由来の核酸サンプルにおいてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の突然変異の存在を検出するステップ；とを含むが、ここで、突然変異の存在の検出は、癌を有する患者、または発癌リスクが増加している患者を示す。
本発明のある実施形態では、（ａ）配列番号４に示したアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と；（ｂ）（ｂ）のポリヌクレオチドと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列と；（ｃ）（ｂ）のポリヌクレオチドと相補的であるヌクレオチド配列と；（ｄ）配列番号５〜８、１８７〜１８８に示したヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列と；（ｅ）（ｄ）のヌクレオチド配列と相補的であるヌクレオチド配列；とから選択されるポリヌクレオチドを含む、単離された核酸分子が提供される。ポリヌクレオチドはＲＮＡ分子、またはｃＤＮＡ等のＤＮＡ分子であってよい。
本発明の別の実施形態では、ＤＮＡ修復を促進するために細胞核内においてＦＡＮＣＤ２の短鎖型から長鎖型への転換の生物学的特性を維持するために、配列番号４のアミノ酸配列と十分に類似するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列から本質的に成る、単離された核酸分子が提供される。または、単離された核酸分子は本質的に、配列番号９〜１９１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド、もしくは配列番号９〜１９１に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列に相補的であるポリヌクレオチドからなる。
ある実施形態では、上述した単離核酸分子のいずれかをベクター内に挿入することを含む、組換えベクターを作成するための方法が提供される。この方法によって、組換えベクター産物を作成することができ、このベクターを宿主細胞へ導入して組換え宿主細胞を作成することができる。
本発明のある実施形態では、ＦＡ−Ｄ２細胞系を作成する方法であって、（ａ）ＦＡ−Ｄ２と関連する相補性群において二対立遺伝子突然変異を有する対象から細胞を入手するステップと；（ｂ）ＦＡ−Ｄ２細胞系を作成するために形質転換ウイルスで細胞を感染させるステップとを含む方法が提供され、ここで、この細胞が線維芽細胞およびリンパ球から選択され、そして形質転換ウイルスがエプスタイン・バーウイルス（Epstein Barr virus）およびレトロウイルスから選択される。ＦＡ−Ｄ２細胞系は、例えば（ｉ）ＦＡＮＣＤ２に対して特異的な抗体を使用するウェスタンブロット法または核免疫蛍光法、および（ｉｉ）ＤＮＡハイブリダイゼーションアッセイから選択される診断アッセイを実施することによって、細胞系における欠陥のあるＦＡＮＣＤ２の存在を決定することにより、特徴づけることができる。
本発明のある実施形態では、組換え宿主細胞を培養することを含む、ポリペプチドを産生するための組換え法が提供され、前記宿主細胞は上述した単離核酸分子のいずれかを含む。
本発明のある実施形態では、（ａ）配列番号４と；（ｂ）（ａ）と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列と；（ｃ）配列番号５〜８、１８７〜１８８の少なくとも１つと少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と；（ｄ）配列番号５〜８、１８７〜１８８の少なくとも１つに相補的な配列に少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列と；（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のポリペプチドフラグメントであって、長さが少なくとも５０アミノ酸であるフラグメント；とから選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチドが提供される。
この単離ポリペプチドは、ｎｔ ３７６Ａ〜Ｇ、ｎｔ ３７０７Ｇ〜Ａ、ｎｔ ９０４Ｃ〜Ｔおよびｎｔ ９５８Ｃ〜Ｔから選択される突然変異を有するＤＮＡによってコードされうる。または、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードするＤＮＡにおける多形性によって特徴づけることができ、この多形性は、ｎｔ １１２２Ａ〜Ｏ、ｎｔ １４４０Ｔ〜Ｃ、ｎｔ １５０９Ｃ〜Ｔ、ｎｔ ２１４１Ｃ〜Ｔ、ｎｔ ２２５９Ｔ〜Ｃ、ｎｔ ４０９８Ｔ〜Ｇ、ｎｔ ４４５３Ｇ〜Ａから選択される。または、ポリペプチドはアミノ酸２２２またはアミノ酸５６１での突然変異によって特徴づけることができる。
本発明のある実施形態では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質に対する結合特異性を有する抗体の調製が記載されるが、ここで、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であってよく、ＦＡＮＣＤ２はＦＡＮＣＤ２−ＳまたはＦＡＮＣＤ２−Ｌであってよい。
本発明のある実施形態では、生物学的サンプル内のＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定する診断方法が提供されるが、ここで、本方法は、（ａ）サンプルを、ＦＡＮＣＤ２−Ｌとの第１複合体を形成するために第１抗体へ、そして場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｓとの第２複合体を形成するために第２抗体へ曝露させるステップと；（ｂ）マーカーを用いてサンプル内の第１複合体および第２複合体の量を検出するステップとを含む。このサンプルは、無傷細胞または溶解物中の溶解細胞であってよい。生物学的サンプルは、癌への過敏性を有するか、または初期段階の癌を有するヒト対象由来であってよい。サンプルはヒト対象における癌由来であってよいが、ここで、癌は、黒色腫、白血病、星細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病、ならびに膵臓癌、乳癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、下垂体癌、腎臓癌、胃癌、食道癌および直腸癌から選択される。生物学的サンプルはヒト胎児またヒト成人由来であってよく、そして対象からの血液サンプル、生検組織サンプルおよび細胞系のいずれかに由来するものであってよい。生物学的サンプルは、心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸、末梢血、またはリンパ球由来であってよい。マーカーは蛍光マーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体と共役した蛍光マーカー、場合によってはＦＡＮＣＤ２−Ｌ抗体と共役した化学発光マーカーであってよく、そして第１および第２複合体を、基質へ共役した第３抗体へ結合させることができる。サンプルが溶解物である場合、サンプルはＦＡＮＣＤ２アイソフォームを分離するための分離方法にかけ、分離されたアイソフォームは、第１または第２ＦＡＮＣＤ２抗体への結合を決定することにより同定することができる。
本発明のある実施形態では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質に対する抗体を選択することと、野生型細胞集団内の量と比較してこの細胞集団内でＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの量が低下しているかどうかを決定することとを含む、対象からの細胞集団内のファンコニ貧血経路における欠陥を同定するための診断学的検査が提供されるが、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の量が低下している場合に、野生型細胞集団内と比較してこの細胞集団内において、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦまたはＦＡＮＣＧタンパク質のいずれかの量が変化しているかどうかを決定し、この細胞集団内のファンコニ貧血経路における欠陥を同定することができる。１つの例では、アイソフォームの量はＦＡＮＣＤ２−ＬおよびＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームの分離に左右され、ここで分離は、ゲル電気泳動法または移動結合バンド表示テストストリップ（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｂａｎｄｅｄ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ）によって達成できる。
本発明のある実施形態では、ＦＡＮＤ２−Ｌが低減量で生成される細胞集団を選択することと；この細胞集団を候補治療分子ライブラリーの個別メンバーへ曝露させることと；この細胞集団内でＦＡＮＣＤ２−Ｌの量の増加を誘発する個別メンバー分子を同定することとを含む、治療薬を同定するためのスクリーニングアッセイが提供される。１つの例では、この細胞集団はインビトロ細胞集団である。また別の例では、この細胞集団はインビボ細胞集団であり、インビボ細胞集団は実験動物内にあり、この実験動物は突然変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子を有する。さらに別の例では、実験動物は、マウスＦＡＮＤ２遺伝子がヒト突然変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子で置換されているノックアウトマウスである。別の例では、ＦＡＮＣＤ２が低減量で生成される細胞集団へ化学発癌物質が添加され、いずれかのメンバー分子がＦＡＮＣＤ２−Ｌの量の増加を誘発することによって化学発癌物質の有害作用から細胞を保護できるかどうかが決定される。
本発明のある実施形態では、動物ＦＡＮＣＤ２遺伝子が取り除かれており、場合によっては上述したいずれかの核酸分子で置換されている、実験動物モデルが提供される。
本発明のある実施形態では、対象由来の細胞サンプル内で、疑われる突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子内の突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定する方法であって、疑われる突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子のヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列と比較するステップを含む方法が提供されるが、ここで、疑われる突然変異配列と野生型配列との相違が前記細胞サンプル内の突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定する。ある例では、疑われる突然変異対立遺伝子は生殖細胞系対立遺伝子である。また別の例では、突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列の同定は、対象における癌の素因またはファンコニ貧血を有する子孫を持つ対象のリスクの増加についての診断に役立つ。別の例では、疑われる突然変異対立遺伝子は腫瘍タイプにおける体細胞対立遺伝子であり、そして突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列を同定するステップは、腫瘍タイプについての診断に役立つ。別の例では、野生型のヌクレオチド配列および疑われる突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列は、遺伝子、ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡから作成されたｃＤＮＡから選択される。別の例では、疑われる突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子のポリヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列と比較するステップは、突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列へ特異的にハイブリダイズするＦＡＮＣＤ２プローブを選択するステップと、プローブを用いたハイブリダイゼーションにより突然変異配列の存在を検出するステップと、をさらに含む。別の例では、疑われる突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子のポリヌクレオチド配列を野生型ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチド配列と比較するステップは、増幅したＦＡＮＣＤ２ ＤＮＡを産生するために野生型ＦＡＮＣＤ２ ＤＮＡに対して特異的なプライマーセットを使用してＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を増幅させるステップと、突然変異配列を同定できるようにＦＡＮＣＤ２ ＤＮＡについて配列決定するステップと、をさらに含む。別の例では、突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２対立遺伝子内における生殖細胞系の変化である場合は、この変化は表３に記載した変化から選択され、そして、突然変異ＦＡＮＣＤ２ヌクレオチド配列がヒト対象のＦＡＮＣＤ２対立遺伝子内における体細胞の変化である場合は、この変化は表３に記載した変化から選択される。
本発明のある実施形態では、対象における癌への感受性を診断する方法であって、対象由来の組織サンプル内におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列またはそのｍＲＮＡの配列を、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較するステップを含む方法が提供されるが、ここで、対象のＦＡＮＣＤ２遺伝子の生殖細胞系配列またはそのｍＲＮＡの配列における変化は、癌への感受性を示す。変化は、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の調節領域において検出できる。生殖細胞系配列内の変化は、（ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上の一本鎖ＤＮＡの電気泳動移動度における変化を観察するステップと；（ｂ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子プローブを組織サンプルから単離されたゲノムＤＮＡにハイブリダイズするステップと；（ｃ）組織サンプルのゲノムＤＮＡに対立遺伝子特異的プローブをハイブリダイズするステップと；（ｄ）増幅配列を作成するために組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を増幅させ、そして増幅配列について配列決定するステップと；（ｅ）特異的ＦＡＮＣＤ２突然変異対立遺伝子に対するプライマーを使用して、組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を増幅させるステップと；（ｆ）クローン化配列を作成するために組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を分子クローニングし、そしてクローン化配列について配列決定するステップと；（ｇ）（ｉ）組織サンプルから単離されたＦＡＮＣＤ２遺伝子またはＦＡＮＣＤ２ ｍＲＮＡと、（ｉｉ）ヒト野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列に相補的な核酸プローブとが相互にハイブリダイズして二本鎖を形成する場合に、分子（ｉ）と（ｉｉ）との間のミスマッチを同定するステップと；（ｈ）組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を増幅させるステップ、および野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含む核酸プローブヘ増幅配列をハイブリダイズするステップと；（ｉ）組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を増幅させるステップ、および突然変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含む核酸プローブヘ増幅配列をハイブリダイズするステップと；（ｊ）組織サンプル内の欠失突然変異についてスクリーニングするステップと；（ｋ）組織サンプル内の点突然変異についてスクリーニングするステップと；（ｌ）組織サンプル内の挿入突然変異についてスクリーニングするステップと；（ｍ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含む核酸プローブを用いて組織サンプルのＦＡＮＣＤ２遺伝子をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイズするステップ；とからなる群から選択されるアッセイによって決定できる。
本発明のある実施形態では、対象における癌に対する感受性を診断する方法であって：（ａ）欠陥のあるＤＮＡ修復を決定できるように、対象からの遺伝物質を入手するステップと；（ｂ）遺伝子セット内の突然変異の存在を決定するステップであって、このセットが、ＦＡＮＤ２、ならびにＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤＥ、ＦＡＮＤＦ、ＦＡＮＤＧ、ＢＲＡＣＡ１およびＡＴＭのうちの少なくとも１つを含むステップと；（ｃ）遺伝子セット内で、突然変異の存在から癌への感受性を診断するステップ；とを含む方法が提供される。
本発明のある実施形態では、ヒト対象におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子での腫瘍病変における突然変異を検出する方法であって、対象の病変由来組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列を、野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較するステップ（ここで、対象のＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列における変化が腫瘍病変のＦＡＮＣＤ２遺伝子での突然変異を示す）を含む方法が提供される。腫瘍病変のＦＡＮＣＤ２遺伝子での突然変異による腫瘍病変を治療するための、治療プロトコールを提供することができる。
本発明のある実施形態では、ヒト対象由来の腫瘍病変におけるＦＡＮＣＤ２突然変異の欠如を確認する方法であって、対象の病変由来組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列を、野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子の配列またはそのｍＲＮＡの配列と比較するステップ（ここで、組織サンプル内の野生型配列の存在がＦＡＮＣＤ２遺伝子での突然変異の欠如を示す）を含む方法が提供される。
本発明のある実施形態では、癌を有する対象のための治療プロトコールを決定する方法であって、（ａ）特異的抗体を使用してＦＡＮＣＤ２アイソフォームを測定することにより、ＦＡＮＣＤ２−Ｌにおける欠損が対象由来細胞サンプル内で発生するかどうかを決定するステップと；（ｂ）（ａ）において欠損が検出された場合に、この欠損が非癌細胞における遺伝的欠陥の結果であるかどうかを決定するステップと；（ｃ）（ｂ）が陽性である場合に、対象における正常組織を保護するためにＤＮＡ損傷の増大を誘発する治療プロトコールの使用を減少させ、そして（ｂ）が陰性であってこの欠損が癌細胞における遺伝的欠陥内にのみ含有される場合には、癌細胞に不都合な影響を及ぼすことができるようにＤＮＡ損傷の増加を誘発する治療プロトコールの使用を増加させるステップ；とを含む方法が提供される。
本発明のある実施形態では、細胞標的内のＦＡ経路欠陥を治療する方法であって、標的に有効量のＦＡＮＣＤ２タンパク質または外因性核酸を投与するステップを含む方法が提供される。ＦＡ経路欠陥は欠陥のあるＦＡＮＣＤ２遺伝子であってよく、そして外因性核酸ベクターは上述したものによるベクターを導入するステップをさらに含んでいてよい。ベクターは、突然変異ヘルペスウイルス、Ｅ１／Ｅ４欠失組換えアデノウイルス、突然変異レトロウイルスから選択することができ、ウイルスベクターは、感染性新規ウイルス粒子を産生するために必須のウイルス遺伝子に関して欠陥がある。ベクターは脂質ミセル中に含有されていてよい。
本発明のある実施形態では、欠陥のあるＦＡＮＣＤ２遺伝子を有する患者を治療する方法であって、欠陥のあるＦＡＮＣＤ２遺伝子から生じる病態から発生する欠陥を機能的に治すために、配列番号４に記載したポリペプチドを提供するステップを含む方法が提供される。
本発明のある実施形態では、ＦＡ経路欠陥を検出するための、細胞に基づくアッセイであって、対象から細胞サンプルを入手するステップと；細胞サンプルをＤＮＡ損傷剤へ曝露させるステップと；ＦＡＮＣＤ２−Ｌがアップレギュレートされるかどうかを検出するステップであって、アップレギュレーションの欠如がＦＡ経路欠陥を示すステップ；とを含むアッセイが提供される。細胞に基づくアッセイでは、ＦＡＮＣＤ２の量は、核内フォーカスを検出する免疫ブロット法と；ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量を検出するウェスタンブロット法と；ＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズすることによるｍＲＮＡの定量；とから選択される分析技術によって測定できる。
本発明のある実施形態では、生物学的サンプル内の癌細胞を検出する際に使用するキットであって、（ａ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の配列へ高ストリンジェンシー条件下で結合するプライマー対であって、このプライマー対が表７に記載された変化した核酸配列を特異的に増幅させるために選択されるプライマー対と；前記プライマーの各々のための容器；とを含むキットが提供される。
本明細書で使用する「ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路（Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ／ＢＲＣＡ ｐａｔｈｗａｙ）」もしくは「ファンコニ貧血経路（Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ Ｐａｔｈｗａｙ）」とは、７つの相補性群（ＦＡ−Ａ〜ＦＡ−Ｇ）内の遺伝子、ＢＲＣＡ−１遺伝子およびＡＴＭ遺伝子、ならびに、本明細書でファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路と称する経路において相互作用し、ＤＮＡ損傷への細胞応答を調節するそれらの各タンパク質を意味する（図２２を参照）。
ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の遺伝子は以下の通りである：
１）ＦＡＮＣ−Ａ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０００１３５）
２）ＦＡＮＣ−Ｂ（まだクローン化されていない）
３）ＦＡＮＣ−Ｃ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０００１３６）
４）ＦＡＮＣ−Ｄ１／ＢＲＣＡ−２（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ４３７４６）
５）ＦＡＮＣ−Ｄ２（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０３３０８４）
６）ＦＡＮＣ−Ｅ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０２１９２２）
７）ＦＡＮＣ−Ｆ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＮＭ ０２２７２５）
８）ＦＡＮＣ−Ｇ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＢＣ００００３２）
９）ＢＲＣＡ−１（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ１４６８０）
１０）ＡＴＭ（例、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：Ｕ３３８４１）
本明細書で使用する「ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路タンパク質を癌関連性欠陥の存在について試験すること（ｔｅｓｔｉｎｇ ａ Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ／ＢＲＣＡ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｆｅｃｔ）」とは、本明細書で定義されたようにファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子によってコードされたタンパク質が、本明細書で定義されたように、患者において癌を誘発または癌と関連する欠陥を持っているかどうかを決定する方法を意味する。
本明細書で使用する用語「欠陥（ｄｅｆｅｃｔ）」とは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路内における未変化の遺伝子またはタンパク質に関して、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路内の遺伝子またはタンパク質、および／またはタンパク質のいずれかの変化を意味する。
遺伝子の「変化（ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）」には、ａ）ＤＮＡ配列自体の変化、すなわちＤＮＡの突然変異、欠失、挿入、置換と；ｂ）調節領域突然変異等の遺伝子発現の調節に影響を及ぼすＤＮＡ修飾、関連する染色質における修飾、ｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすイントロン配列の修飾、遺伝子配列のメチル化／脱メチル化状態に影響を及ぼす修飾と；ｃ）タンパク質翻訳またはｍＲＮＡ輸送またはｍＲＮＡスプライシングに影響を及ぼすｍＲＮＡ修飾；とが含まれるが、それらに限定されない。
タンパク質の「変化」には、アミノ酸の欠失、挿入、置換；タンパク質のリン酸化またはグリコシル化に影響を及ぼす修飾；タンパク質の輸送または局在化に影響を及ぼす修飾；１以上の関連タンパク質とタンパク質複合体を形成する能力に影響を及ぼす修飾、またはアミノ酸をコードするＤＮＡ配列における変化により惹起されたアミノ酸配列の変化が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用する用語「増加したリスク（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｒｉｓｋ）」または「上昇したリスク（ｅｌｅｖａｔｅｄ ｒｉｓｋ）」とは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子またはタンパク質における変化を有していない患者と比較して、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子またはタンパク質が変化している患者における癌発生率がより高いことを意味する。「増加したリスク」はまた、既に癌であると診断され、異なる形態の癌の発生率が増加した可能性のある患者も意味する。本発明によると、癌の「増加したリスク」とは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の癌関連性欠陥を有していない患者と比較して、癌を獲得する確率において５０％、好ましくは９０％、より好ましくは９９％以上の増加をもたらす、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の癌関連性欠陥に関連する。
本明細書で使用する、本発明による「ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ／ＢＲＣＡ ｐａｔｈｗａｙ）」とは、直接的または間接的のいずれかでＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質機能を崩壊させるあらゆる化合物を意味する。ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質機能の崩壊は、経路内のＦＡＮＣＤ２タンパク質の上流にある他のＦＡＮＣタンパク質のいずれかの崩壊、ＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームへのＦＡＮＣＤ２−Ｓのユビキチン化の阻害、続いて起こるＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の核輸送の阻害、またはＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の核ＢＲＣＡ ＤＮＡ修復タンパク質複合体との結合の崩壊、のいずれかを通して達成できる。本発明による「阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌに特異的に結合してＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質機能を崩壊させる核酸（アンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチド）、タンパク質（ヒト化抗体）、ペプチドまたは低分子薬であってよい。最も好ましい実施形態では、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のモノユビキチン化の低分子阻害剤である。
本明細書で使用する「ＦＡＮＣＤ２−Ｌ対ＦＡＮＣＤ２−Ｓの比率の低下（ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ＦＡＮＣＤ２−Ｌ ｒｅｌａｔｉｖｅ ｔｏ ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）」とは、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォーム内のＦＡＮＣＤ２タンパク質総量のパーセンテージの減少を意味する。ある好ましい実施形態では、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォーム内にあるＦＡＮＣＤ２タンパク質の総量は、多くとも２５％、好ましくは１０％、より好ましくは１％および最も好ましくは０％である。このような低下は、本明細書で定義したように、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の１以上の遺伝子またはタンパク質における欠陥を示す。
本明細書で使用する「ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路タンパク質を癌関連性欠陥の存在について試験すること（ｔｅｓｔｉｎｇ ａ Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ／ＢＲＣＡ ｐａｔｈｗａｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ａ ｃａｎｃｅｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｄｅｆｅｃｔ）」とは、本明細書で定義されたように、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子経路を含む７つの相補性群（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦおよびＧ）内でコードされたタンパク質が、患者において癌を誘発または癌の一因となる欠陥またはその他の突然変異を持っているかどうかを決定する方法を意味する。
本明細書で使用する用語「ＤＮＡ損傷を誘発すること（ｉｎｄｕｃｉｎｇ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ）」とは、ＤＮＡを損傷させる化学的方法および物理的方法の両方を意味する。ＤＮＡを損傷させる化学薬品には、臭化エチジウム、アクリジンオレンジ、ならびにフリーラジカル等の酸／塩基および様々な突然変異原が含まれるが、それらに限定されない。物理的方法には、Ｘ線およびγ線等の電離放射線、および紫外（ＵＶ）放射線が含まれるが、それらに限定されない。「ＤＮＡ損傷を誘発する」どちらの方法も、典型的には一本鎖切断、二本鎖切断、塩基の変化、ＤＮＡ鎖の挿入、欠失または架橋が含まれるが、それらに限定されない、ＤＮＡ突然変異を生じうる。
本明細書で使用する用語「生検組織（ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｙ）」とは、患者から単離された生体材料を意味する。本明細書で使用する用語「組織（ｔｉｓｓｕｅ）」は、生体内で特定機能を実行する細胞凝集体であり、例えば血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液等の生体液、洗浄液、および白血球泳動法サンプルを含むがそれらに限定されない、細胞系およびその他の細胞物質源を含む。
本明細書で使用する用語「増幅させること（ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ）」は、核酸配列に適用したときには、好ましくはポリメラーゼ連鎖反応方法によって、それにより特定の核酸配列の１以上のコピーがテンプレート核酸から生成される工程を意味する（Ｍｕｌｌｉｓ ａｎｄ Ｆａｌｏｏｎａ，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：３３５）。「ポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）」すなわち「ＰＣＲ」とは、特異的核酸テンプレート配列を増幅させるためのインビトロ法を意味する。ＰＣＲ反応には、一連の繰り返し温度サイクルが含まれ、典型的には５０〜１００μＬの容量で実施される。反応混合物は、ｄＮＴＰ（４つのデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰの各々）、プライマー、バッファー、ＤＮＡポリメラーゼ、および核酸テンプレートを含む。ＰＣＲ反応は、１組のポリヌクレオチドプライマーを提供するステップ（第１プライマーは核酸テンプレート配列の１本の鎖における１領域に相補的な配列を含有し、相補的ＤＮＡ鎖の合成を準備し、そして第２プライマーは標的核酸配列の第２鎖における１領域に相補的な配列を含有し、相補的ＤＮＡ鎖の合成を準備する）と、および、（ｉ）テンプレート配列内に含有される標的核酸配列に増幅に必要なプライマーをアニーリングするステップと、（ｉｉ）前記プライマーを伸長させるステップ（核酸ポリメラーゼはプライマー伸長産物を合成する）とからなるＰＣＲサイクリングステップを許容する条件下においてテンプレート依存性重合化剤として核酸ポリメラーゼを使用して核酸テンプレート配列を増幅させるステップと、を含む。「１組のポリヌクレオチドプライマー（ａ ｓｅｔ ｏｆ ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒｓ）」または「１組のＰＣＲプライマー（ａ ｓｅｔ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ）」は、２、３、４またはそれ以上のプライマーを含むことができる。
その他の増幅方法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、ポリヌクレオチド特異的塩基増幅法（ＮＳＢＡ）、または当該技術分野において知られている他の方法が含まれるが、それらに限定されない。
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチドプライマー（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｒｉｍｅｒ）」とは、核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物の合成が標的核酸テンプレートに相補的なプライマー伸長産物を産生するために触媒される条件下で、核酸テンプレートにハイブリダイズして酵素による合成のための基質として機能できる、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を意味する。開始および伸長のための条件には、適切なバッファー（「バッファー（ｂｕｆｆｅｒ）」には、補因子である置換体、またはｐＨ、イオン強度等に影響を及ぼす置換体が含まれる）中における、４つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸、およびＤＮＡポリメラーゼもしくは逆転写酵素等の重合化誘導剤の存在、ならびに適切な温度が含まれる。プライマーは、好ましくは、増幅における最高効率のために一本鎖である。本発明において有用な「プライマー（ｐｒｉｍｅｒｓ）」は、一般に長さが約１０〜３５ヌクレオチド、好ましくは長さが約１５〜３０ヌクレオチド、および最も好ましくは長さが約１８〜２５ヌクレオチドである。
本明細書に定義された「腫瘍（ａ ｔｕｍｏｒ）」は、悪性または非悪性のどちらであってもよい腫瘍である。同一組織タイプの腫瘍は同一組織に由来し、それらの生物学的特徴に基づいて様々なサブタイプに分類できる。
本明細書で使用する用語「癌（ｃａｎｃｅｒ）」は、正常の増殖制御に対する感受性を消失した細胞の増殖により惹起された、またはそれを特徴とする悪性疾患を意味する。「悪性疾患（ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｄｉｓｅａｓｅ）」は、起源組織に侵入する、または起源組織から除去されて離れた部位へ移動する能力を獲得した細胞によって誘発される疾患を意味する。
本明細書で使用する用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」は、所定の抗原に特異的に結合する能力を有する免疫グロブリンを意味する。本明細書で使用する用語「抗体」は、いずれかのアイソタイプの全抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ等）、および同様に例えば哺乳動物のような脊椎動物のタンパク質に特異的に反応性であるそれらのフラグメントを含むことが意図されている。抗体は、従来技術を用いてフラグメント化することができ、そして前記フラグメントは全抗体と同一方法で有用性についてスクリーニングすることができる。そこで、この用語には、所定のタンパク質と選択的に反応することができる抗体分子のタンパク質分解により開裂した部分、または組換え作成された部分のセグメントが含まれる。このようなタンパク質分解性および／または組換えフラグメントの非限定的な例には、ペプチドリンカーにより結合されたＶ［Ｌ］および／またはＶ［Ｈ］ドメインを含有するＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、および一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖは、共有結合的または非共有結合的に連結して、２以上の結合部位を有する抗体を形成することができる。抗体は、当業者により、検出可能な部分を用いて標識できる。いくつかの実施形態では、測定することが望まれる実体へ結合する抗体（一次抗体）は標識されず、その代わりに標識された二次抗体が一次抗体へ特異的に結合することにより検出される。
患者は、本明細書に記載した癌の１つもしくは好ましくはそれ以上の症状が除去されるか、または重症度が低下するか、またはそれ以上進行もしくは発達することが防止される場合に、本発明によって「治療される（ｔｒｅａｔｅｄ）」。
本明細書で使用する用語「治療的有効量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｍｏｕｎｔ）」は、重要な患者に利益、すなわち関連する医学的状態の治療、治癒、予防もしくは改善、または当該病態の治療率、治癒率、予防率もしくは改善率の増加を示すに十分である、医薬組成物または方法における各活性成分の総量を意味する。
本明細書で使用する用語「癌治療薬（ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）」とは、癌の発病もしくは進行を予防するか、または癌転移を予防するか、または癌の症状を減少させるか、遅延させるか、もしくは除去する化合物を意味する。
本明細書で使用する用語「モノユビキチン化の阻害剤（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｎｏ−ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）」とは、ＦＡＮＣＤ２遺伝子のユビキチン化を防止または阻害する化合物を意味する。「ユビキチン化（ｕｂｉｑｕｉｔｉｎａｔｉｏｎ）」は、Ｅ３モノユビキチンリガーゼによる、ユビキチンのタンパク質への共有結合であると定義されている。１つの好ましい実施形態では、「モノユビキチン化の阻害剤」とは、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチンリガーゼ活性が阻害されるような、Ｅ３ＦＡＮＣＤ２モノユビキチンリガーゼ活性を備えるＦＡＮＣタンパク質複合体のあらゆる阻害剤を意味する。
本明細書で使用する用語「シスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）」とは、以下の化学構造を備える物質を意味する。
Figure 2009039100
シス−ジアミンジクロロ白金（ＩＩ）とも呼ばれるシスプラチンは、最も頻回に使用される抗癌剤の１つである。シスプラチンは、様々な充実性腫瘍を治療するために使用される幾つかの異なる薬物併用療法プロトコールの有効成分である。これらの薬物は、精巣癌（ブレオマイシンおよびビンブラスチンを使用）、膀胱癌、頭頸部癌（ブレオマイシンおよびフルオロウラシルを使用）、卵巣癌（シクロホスファミドまたはドキソルビシンを使用）および肺癌（エトポシド）の治療に使用される。シスプラチンは、これらの腫瘍の大多数に対して単剤で最も活性であることが見いだされている。シスプラチンは、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社から「Ｐｌａｔｉｎｏｌ」として市販で入手できる。シスプラチンは、抗腫瘍活性を備える多数の白金配位複合体の１つである。白金化合物は、アルキル化剤に類似するが同一ではないＤＮＡ架橋剤である。白金化合物は、塩化物イオンを様々な種類の求核基と置換する。シス異性体およびトランス異性体はどちらもこれを行うが、しかしトランス異性体は、その理由は完全には理解されていないが、生物学的不活性であることが知られている。抗腫瘍活性を持つためには、白金化合物は、２つの相対的に不安定なシス配向性脱離基を有していなければならない。主要な反応部位は、グアニンおよびアデニンのＮ７原子である。主要な相互作用は、薬物と隣接グアニンとの鎖間架橋の形成である。鎖間架橋は、シスプラチン療法への臨床反応と相関することが証明されている。ＤＮＡ／タンパク質架橋もまた発生するが、これは細胞毒性とは相関しない。２つの薬物グループ間の交差耐性は通例見られず、これは作用機序が同一ではないことを表している。ＤＮＡとの架橋のタイプは、白金化合物と典型的なアルキル化剤との間で相違しうる。
本明細書で使用する「１以上の抗腫瘍剤に対する耐性（ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ）」とは、抗癌剤への耐性を発生させる癌細胞の能力を意味する。薬物耐性の機序には、薬物流出の増加もしくは内部への輸送の低下によって惹起される細胞内薬物レベルの低下、薬物不活性化の増加、薬物の活性型への変換の減少、標的酵素もしくは受容体の量の変化（遺伝子増幅）、標的酵素もしくは受容体の薬物に対する親和性の低下、薬物誘発性欠陥の修復の増強、殺滅作用（トポイソメラーゼＩＩ）に必要な酵素活性の低下が含まれる。本発明の好ましい実施形態では、薬物耐性とは、１以上の抗腫瘍剤によって誘発されたＤＮＡ損傷の修復の強化を意味する。本発明の別の好ましい実施形態では、１以上の抗腫瘍剤によって誘発されたＤＮＡ損傷の修復の強化は、構成的に活性なファンコニ貧血／ＢＲＣＡ ＤＮＡ修復経路による。
本明細書で使用する用語「抗腫瘍剤（ａｎｔｉ−ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」とは、癌を治療するために使用される化合物を意味する。本発明によると、「抗腫瘍剤」には化学療法化合物ならびに当該技術分野において知られているその他の抗癌剤が含まれる。好ましい実施形態では、「抗腫瘍剤」はシスプラチンである。本発明による抗腫瘍剤にはまた、放射線療法および／または手術と共に化学療法化合物を使用する癌療法プロトコールが含まれる。放射線療法は、細胞ＤＮＡを崩壊させる電離放射線による癌細胞の局所的破壊に依存する。放射線療法は、高線量もしくは低線量で体外または体内から開始でき、そして腫瘍部位へコンピュータに支援された精度で送達できる。小線源療法、もしくは組織内放射線治療は、放射線源を、植え込まれた「シード（ｓｅｅｄｓ）」として直接腫瘍内に配置することができる。
本明細書で使用する用語「低下した増殖率（ａ ｒｅｄｕｃｅｄ ｇｒｏｗｔｈ ｒａｔｅ）」とは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤および１以上の化学療法化合物を用いて治療されていない腫瘍細胞系の細胞に比較して、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤および１以上の化学療法化合物を用いて治療されている腫瘍細胞系の細胞増殖率において、５０％、好ましくは９０％、より好ましくは９９％および最も好ましくは１００％の減少を意味する。
本明細書で使用する用語「化学感作剤（ｃｈｅｍｏｓｅｎｓｉｔｉｚｉｎｇ ａｇｅｎｔ）」とは、細胞または細胞集団を化学療法化合物に対して感受性にさせ、本明細書で定義した「低下した増殖率」を生じさせるあらゆる化合物を意味する。化学感作剤は、一般にそれ自体は細胞毒性ではないが、宿主細胞または腫瘍細胞を修飾して抗癌療法を強化する化合物である。本発明によると、化学療法化合物に対する細胞耐性は、化学感作剤が存在すると逆転する。ある好ましい実施形態では、化学感作剤はファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤である。最も好ましい実施形態では、化学感作剤はＦＡＮＣＤ２タンパク質のモノユビキチン化の阻害剤である。
本明細書で使用する「ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ ｓｔａｔｅ ｏｆ ａ Ｆａｎｃｏｎｉ Ａｎｅｍｉａ／ＢＲＣＡ ｐａｔｈｗａｙ ｇｅｎｅ）」とは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の１以上のメチル化シトシン（５ｍ−Ｃ）の存在に関連しており、メチル化されていない遺伝子に比較して遺伝子発現の９０％、９９％または好ましくは１００％の減少または阻害を生じる。好ましい実施形態では、メチル化シトシンはＣｐＧ島内に存在する。本発明によると、遺伝子は、１以上のＣｐＧ残基がメチル化されると、「メチル化（された）（ｍｅｔｈｙｌａｔｅｄ）」と称される。
本明細書で使用する「マイクロアレイ（ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」または「アレイ（ａｒｒａｙ）」は、固体支持体の１つの表面に付着した多数の固有の生体分子を意味する。好ましくは、本発明の生体分子は、本明細書に記載したファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤である。この実施形態では、本発明のマイクロアレイは、固体支持体上に、一般には高密度で固定化された、核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質または低分子を含む。生体分子各々は、前もって選択した領域内の固体支持体の表面に付着させられる。適切な固体支持体は市販で入手でき、当業者には明白であろう。これらの支持体は、ガラス、セラミック、シリカおよびシリコン等の材料から製造できる。支持体は通例、平坦な（平面的な）表面、または少なくとも、検査すべき分子が同一平面にあるアレイを含む。１つの実施形態では、アレイはマイクロビーズ上にある。１つの実施形態では、前記アレイは、固体支持体の１つの表面に付着した少なくとも１０、５００、１，０００、１０，０００の異なる生体分子を含む。
詳細な説明
「ＦＡＮＣＤ２−Ｌ治療薬（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ）」は、いずれかのタンパク質アイソフォームを意味し、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質のペプチド、ペプチド誘導体、類似体または異性体を含み、そしてＦＡＮＣＤ２−Ｌと機能的に等価であるあらゆる低分子誘導体、類似体、異性体またはアゴニストをさらに含む。この定義にまた含まれるのは、完全長もしくは部分長の遺伝子配列またはｃＤＮＡである可能性があり、または、遺伝子発現を調節するように作用できるアンチセンス分子のアプタマーを含む遺伝子活性化核酸もしくは核酸結合分子である可能性がある、ＦＡＮＣＤ２をコードする核酸である。
「ＦＡＮＣＤ−２をコードする核酸（ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ＦＡＮＣＤ−２）」には、上記に定義したように、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を発現させるためのＦＡＮＣＤ２またはその部分の完全ｃＤＮＡまたはゲノム配列が含まれる。核酸は、核酸担体もしくはベクター内にさらに含まれていてもよく、標的部位への効果的送達のために適切に修飾されている核酸を含む。
「ハイブリダイゼーションのストリンジェント条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」には、一般に、３０℃を超える、典型的には３７℃を超え、好ましくは４５℃を超える温度が含まれる。ストリンジェント塩条件は、通常は１，０００ｍＭ未満、典型的には５００ｍＭ未満、および好ましくは２００ｍＭ未満である。
核酸についての「実質的相同性または類似性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｏｒ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ）」とは、核酸もしくはそのフラグメントが別の核酸もしくはそのフラグメントと「実質的に相同（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）」（または「実質的に類似（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌｌｙ ｓｉｍｉｌａｒ）」）な場合であって、他の核酸（またはその相補鎖）と最適に（適切なヌクレオチド挿入もしくは欠失を含めて）アラインメントされた場合に、ヌクレオチド塩基の少なくとも約６０％、通常は少なくとも約７０％、より通常は少なくとも約８０％においてヌクレオチド配列同一性があることをいう。
「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）」には、一本鎖抗体およびＦａｂフラグメントを含む、ポリクローナルおよび／またはモノクローナル抗体およびそのフラグメント、ならびにタンパク質のアイソフォームを識別するために十分な結合特異性を有するそれらの免疫学的結合等価物が含まれる。これらの抗体は、アッセイならびに医薬品において有用であろう。
「単離（された）（ｉｓｏｌａｔｅｄ）」は、その自然状態でそれに付随する成分から分離されている、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸を記載するために使用される。「単離された」タンパク質または核酸は、サンプルの少なくとも約６０〜７５％が単一のアミノ酸またはヌクレオチド配列を示す場合には、実質的に純粋である。
「調節配列（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）」とは、通常は遺伝子座の１００ｋｂのコーディング領域内にある配列を意味するが、それらはまた、遺伝子の発現（遺伝子の転写、およびメッセンジャーＲＮＡの翻訳、スプライシング、安定性等を含む）に影響を及ぼすコーディング領域からもっと離れていてもよい。
「ポリヌクレオチド（ｐｏｌｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）」には、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方のＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成型、および混合ポリマーが含まれ、そして当業者には容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾することができ、または非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含有する可能性がある。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、１以上の天然型ヌクレオチドの類似体との置換、非荷電連鎖（例、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）・荷電連鎖（例、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）、ペンダント部分（例、ポリペプチド）、および修飾連鎖（例、αアノマー核酸等）等のヌクレオチド間修飾が含まれる。同様に、水素結合および他の化学的相互作用を介して指定の配列に結合する能力において核酸を模倣する合成分子も含まれる。
「突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）」は、野生型に比較した調節配列における遺伝子内または遺伝子外のヌクレオチド配列における変化である。変化は、発現および機能性が通常発生する範囲にある場合に、機能的細胞内で正常に発現した遺伝子の核酸もしくはタンパク質配列とその核酸もしくはタンパク質配列とに差異を生じさせる、欠失、置換、点突然変異、複数のヌクレオチドの突然変異、転位、逆位、フレームシフト突然変異、ナンセンス突然変異、またはその他の異常の形態であってよい。
「対象（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、ヒトを含む哺乳類を含む動物を意味する。
「野生型ＦＡＮＣＤ２（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ ＦＡＮＣＤ２）」とは、細胞内のＦＡＮＣＤ−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌを生成するためにモノユビキチン化され得るタンパク質または発現タンパク質をコードする遺伝子を意味する。
本発明者らは、一部のファンコニ貧血が毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、コケーン症候群（ＣＳ）、ブルーム症候群、骨髄異形成症候群、再生不良性貧血、癌感受性症候群およびＨＮＰＣＣ（遺伝性非ポリポーシス大腸癌）を含む１群の症候群との類似性を有することを見いだした（表２を参照）。これらの症候群は、ＤＮＡ修復における基礎的欠陥を有しており、染色体完全性の維持における欠陥と関連している。ＤＮＡ修復および染色体完全性の維持に関連する経路における欠陥は、ゲノム不安定性、および、鎖間架橋を誘発する二官能性アルキル化剤等のＤＮＡ損傷剤に対する細胞感受性を引き起こす。さらに、ＤＮＡ修復機構における欠陥は、遺伝子再配列によりある範囲の癌を開始する確率を実質的に増加させると思われる。この観察は、マイトマイシンＣ、シスプラチン、シクロホスファミド、ソラレンおよびＵＶＡ照射を含む、ＤＮＡ架橋薬の臨床使用に関して妥当である。
ファンコニ貧血はまれな疾患であるが、ＦＡの多形質発現作用は、ゲノム安定性、アポトーシス、細胞周期制御およびＤＮＡ架橋への耐性を含む、様々な細胞プロセスのための経路におけるＦＡタンパク質の野生型機能の重要性を表している。ＦＡにおける細胞異常には、架橋剤への感受性、細胞周期のＧ２期の延長；周囲Ｏ２での不良な増殖、Ｏ２ラジカルの過剰産生、不十分なＯ２ラジカル防衛、スーパーオキシドジスムターゼの欠損を含む酸素への感受性；電離放射線への感受性（Ｇ２期特異的）；腫瘍壊死因子の過剰産生、ＤＮＡ付加物の蓄積を含むＤＮＡ修復における直接的欠陥、およびＤＮＡ架橋の修復における欠陥、自発性染色体切断を含むゲノム不安定性、および欠失機序による超突然変異性、アポトーシス増加、欠陥のあるｐ５３誘導、インビトロでのコロニー増殖低下を含む内因性幹細胞欠陥；および性腺幹細胞生存の減少が含まれる。
これらの特徴は、造血幹細胞および性腺幹細胞の維持、ならびに骨格系および泌尿生殖器系を含む多数の様々な構造の正常胚発達にＦＡが関与することを反映している。患者由来細胞サンプルは、ＦＡ−Ｄ相補性群における欠陥を決定するために分析された。患者１例由来のリンパ芽球はＰＤ２０細胞系を産生したが、ＰＤ２０細胞系は、Ｄ相補性群における欠陥を有する別の患者由来のＨＳＣ６２からの相違する遺伝子においては突然変異していることが見いだされた。両方の患者からの突然変異はＤ相補性群ではあるが相違する遺伝子へマッピングされたので、２つのＦＡＮＣＤタンパク質の名称−ＦＡＮＣＤ１（ＨＳＣ６２）およびＦＡＮＣＤ２（ＰＤ２０）が生じた（Ｔｉｍｍｅｒｓら，（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｅｌｌ、ｖｏｌ．７、ｐ２４１〜２４８）。本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２がＦＡ経路の終点であり、ＦＡ核複合体の一部ではなく、さらにそのアセンブリーのためにも安定性のためにも必要でないこと、そしてＦＡＮＣＤ２はＦＡＮＣＤ２−ＳおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌの２種のアイソフォームで存在することを示した。本発明者らはまた、ＦＡ複合体に反応して短鎖型タンパク質（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）から長鎖型タンパク質（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）への形質転換が発生することも示した（図８）。ＦＡ経路に関連する特定のタンパク質における欠陥は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌであると同定されたＦＡＮＣＤ２の重要な翻訳後修飾型の作成の失敗を生じさせる。ＦＡＮＣＤ２の２種のアイソフォームは、短鎖型および長鎖型であると同定されている。
ＦＡＮＣＤ２−Ｌの作成の失敗は、上記に列挙した疾患に関連するＤＮＡ修復および細胞周期異常におけるエラーと相関している。
上述した症候群におけるＦＡＮＣＤ２の役割についてより詳細に理解するために、本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２遺伝子をクローニングしてタンパク質配列を決定した。ＦＡＮＣＤ２遺伝子は、予想分子量が１６６ｋＤである新規の１，４５１アミノ酸核タンパク質をコードする、４，３５３塩基対および４４個のエクソンからなるオープンリーディングフレームを有する。ウェスタンブロット分析により、１６２および１５５ｋＤの２つのタンパク質アイソフォームの存在が明らかになった。４４イントロン／エクソン接合部に対応する配列は表６に示した（配列番号９〜９４）。
以前にクローニングしたＦＡタンパク質とは相違して、数種の無脊椎動物真核細胞由来のＦＡＮＣＤ２タンパク質は、Ｄ．メラノガスター（キイロショウジョウバエ）、Ａ．タリアーナ（シロイヌナズナ）、およびＣ．エレガンス（線虫の一種）におけるタンパク質と高度に有意なアラインメントスコアを示した。ショウジョウバエ相同物は、ＦＡＮＣＤ２との２８％アミノ酸同一性および５０％類似性を有するが（図および配列番号１〜３）、それぞれの種において機能的研究は実施されていない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）またはＳ．セレビジエでは、ＦＡＮＣＤ２と類似するタンパク質は見いだされなかった。
本発明者らは、ＰＤ２０およびＶＵ００８における染色体３Ｐ遺伝子座を分析することによりＦＡＮＣＤ２ ＤＮＡ配列（配列番号５）を得たが、２つのＦＡ細胞系はＦＡＮＣＤ２遺伝子において二対立遺伝子突然変異を有する（図１０）。これらの細胞系は、患者由来のリンパ芽球がＤ群に対する基準細胞系であるＨＳＣ６２を相補化できなかったので、Ｄ相補性群とした。ＦＡＮＣＤ２突然変異はこのＤ群基準細胞系では検出されなかったが、これはＨＳＣ６２内で突然変異した遺伝子がＦＡＮＣＤ１をコードする遺伝子であり、ＰＤ２０およびＶＵ００８内ではＦＡＮＣＤ２であることを表している（図１１）。突然変異を同定するために、マイクロセル媒介染色体導入法を使用した（Ｗｈｉｔｎｅｙら，Ｂｌｏｏｄ，（１９９５）、ｖｏｌ．８８、ｐ４９〜５８）。遺伝子座を含む小さな重複欠失を含有する５つのマイクロセルハイブリッドの詳細な分析により、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の候補領域は２００ｋｂに狭まった。ＦＡＮＣＤ２遺伝子を以下の通りに単離した：３つの候補ＥＳＴは、このＦＡＮＣＤ２臨界領域内またはその近くに局在していた。完全長ｃＤＮＡを得るために５’および３’ＲＡＣＥを使用して遺伝子を配列決定し、各々の発現パターンをノーザンブロット法により分析した。ＥＳＴ ＳＣＣ３４６０３は、以前にクローニングしたＦＡ遺伝子に類似する５ｋｂおよび７ｋｂのｍＲＮＡの、偏在性かつ低レベルの発現を有した。ＴＩＧＲ−Ａ００４Ｘ２８、ＡＡ６０９５１２およびＳＧＣ３４６０３に対するオープンリーディングフレームが見いだされ、長さは各々２３４，５３１および４４１３ｂｐであった。３つすべてを、クローニングしたＲＴ−ＰＣＲ産物を配列決定することにより、ＰＤ２０細胞における突然変異について分析した。ＴＩＧＲ−Ａ００４Ｘ２８およびＡＡ６０９５１２において配列変化は検出されなかったが、ＳＧＣ３４６０３では５つの配列変化が見いだされた。次に、本発明者らは、臨界領域由来のＢＡＣ １７７Ｎ７上のｃＤＮＡシーケンシングプライマーを使用することにより、ＳＧＣ３４６０３遺伝子の構造を決定した。
ゲノム配列情報に基づいて、ＰＣＲプライマー対を設計し（表７）、推定される突然変異を含有するエクソンを増幅させ、ＰＤ２０ファミリーならびに５６８コントロール染色体をスクリーニングするために、対立遺伝子特異的アッセイを開発した。３つの対立遺伝子は共通の多型であった；しかしながら、対照では２つの変化は見いだされず、したがって潜在的突然変異を示していた（表３）。第１はｎｔ３７６での母系遺伝Ａ→Ｇ変化であった。アミノ酸（Ｓ１２６Ｇ）を変化させることに加えて、この変化はミス・スプライシングおよびイントロン５からｍＲＮＡへの１３ｂｐの挿入と関連していた。母性突然変異を含む４３／４３（１００％）の独立してクローン化されるＲＴ−ＰＣＲ産物はこの挿入を含有していたが、対照ｃＤＮＡクローン中の３％（１／３１）だけがミススプライスｍＲＮＡを示した。１３ｂｐの挿入はフレームシフトを生成し、長さがわずかに１８０アミノ酸の重度に短いタンパク質を予測させる。第２の変化は、位置１２３６（Ｒ１２３６Ｈ）での父性遺伝ミスセンス変化であった。ＰＤ２０コアファミリーにおける突然変異の分離は図１０に示した。ＰＤ２０のＳＧＣ３４６０３遺伝子は５６８コントロール染色体上に存在しない母性および父性両方の対立遺伝子を含有しており、そして母性突然変異は分析したｃＤＮＡの１００％においてミス・スプライシングと関連していたので、本発明者らは、ＳＧＣ３４６０３がＦＡＮＣＤ２遺伝子であると結論づけた。
ＦＡＮＣＤ２によってコードされたタンパク質はＰＤ２０には不在である：ＳＧＣ３４６０３がＦＡＮＣＤ２であるとの同一性をさらに確認するために、前記タンパク質に対して抗体を生じさせ、ウェスタンブロット分析を実施した（図１１）。抗体の特異性は、ＰＤ２０細胞におけるレトロウイルス形質導入およびＦＡＮＣＤ２の安定的発現によって証明された（図１１）。野生型細胞では、この抗体によって、本発明者らがＦＡＮＣＤ２−Ｓおよび−Ｌと呼ぶ２つのバンド（１５５および１６２ｋＤ）を検出した（図１１において最も明白である）。ＦＡＮＣＤ２タンパク質レベルは、患者ＰＤ２０由来のすべてのＭＭＣ感受性細胞系では顕著に低下していたが（図１１ａ、レーン２、４）、野生型細胞系および他の相補性群由来のＦＡ細胞では存在した。さらに、染色体３のマイクロセル媒介導入により補正したＰＤ２０細胞もまた、正常量のタンパク質を生成した（図１１ａ、レーン３）。
ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡを用いたＦＡ−Ｄ２細胞の機能的相補化：次に本発明者らは、クローン化ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡがＦＡ−Ｄ２細胞のＭＭＣ感受性を相補化する能力を評価した（図１２）。完全長ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡは、以前に記載されたように、レトロウイルス発現ベクターであるｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ内にサブクローニングした（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒら，（１９９８），Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，ｖｏｌ．４、ｐ４６８〜４７９）。形質導入されたＰＤ−２０細胞は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の両方のアイソフォームであるＦＡＮＣＤ２−ＳおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現した（図１２ｃ）。ｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２によるＰＡ−Ｄ２（ＰＤ２０）細胞の形質導入は細胞のＭＭＣ感受性を補正した。これらの結果はさらに、クローン化ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡが、翻訳後修飾してＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームにすることができる、ＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質をコードすることを証明している。この重要な修飾については、下記においてより詳細に検討する。
表現型復帰突然変異ＰＤ２０クローンの分析：次に本発明者らは、ＰＤ２０細胞中の配列変化が機能的に中立な多型ではないことを証明する、追加の証拠を生成した。このような目的で、本発明者らは、もはやＭＭＣに対して感受性ではない、患者ＰＤ２０由来の復帰突然変異リンパ芽球クローン（ＰＤ２０−ｃｌ．１）の分子分析を実施した。表現型復帰突然変異および体細胞モザイク現象はＦＡにおいてたびたび見られる所見であり、有糸分裂組換えまたは代償性フレームシフト等の遺伝子内事象と関連していた。実際に、母性由来ＳＧＣ３４６０３ ｃＤＮＡの〜６０％は、通常観察される１３ｂｐではなく３６ｂｐのイントロン５配列を挿入する新規スプライス変異体を有していた（図１３）。このインフレーム・スプライス変異体の発生は、位置ＩＶＳ５＋６におけるＧからＡへの新規塩基変化と相関しており、正確なリーディングフレームの回復はウェスタンブロット分析により確認された。患者ＰＤ２０由来のすべてのＭＭＣ感受性線維芽細胞およびリンパ芽球とは対照的に、ＰＤ２０−ｃｌ．１は、正常タンパク質よりわずかに大きな分子量を持つ、容易に検出可能な量のＦＡＮＣＤ２タンパク質を産生した。
他の「ＦＡＮＣＤ」患者由来の細胞系の分析：抗体はまた、ＦＡ−Ｄ群についての基準細胞系、ＨＳＣ、および欧州ファンコニ貧血登録（ＥＵＦＡＲ）によってＤ群と同定された他の２つの細胞系を含む、追加のＦＡ患者細胞系をスクリーニングするために使用した。ＶＵ００８はＦＡＮＣＤ２タンパク質を発現せず、どちらもエクソン１２にあるミスセンスおよびナンセンス突然変異を含む、化合物の異型接合体であることが見いだされたが、３７０コントロール染色体上では見いだされなかった（表３、図１１）。ミスセンス突然変異は、ＶＵ００８細胞からの溶解物中ではＦＡＮＣＤ２タンパク質が検出不能であるので、ＦＡＮＣＤ２タンパク質を不安定化させると思われる。第３の患者由来のＰＤ７３３もまた、ＦＡＮＣＤ２タンパク質を欠如しており（図１１ｂ、レーン３）、エクソン１７の欠如および前記タンパク質の内部欠失を導くスプライス突然変異が見いだされた。突然変異とこれらの患者由来の細胞溶解物中におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質の欠如との相関は、ＦＡＮＣＤ２のＦＡ遺伝子との同一性を実証している。これとは対照的に、ＨＳＣ６２中では、容易に検出可能な量のＦＡＮＣＤ２タンパク質の両方のアイソフォームが見いだされ（図１１ａ、レーン８）、そして、両方の細胞系からのＶＵ４２３ ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡが突然変異について広範囲に分析されたが、何も見いだされなかった。さらに、ＶＵ４２３とＰＤ２０線維芽細胞との間の全細胞融合は、染色体切断表現型の相補性を示した（表５）。これらのデータをまとめると、ＦＡ−Ｄ群は遺伝的に異質であり、ＨＳＣ６２およびＶＵ４２３において欠損している遺伝子はＦＡＮＣＤ２とは別個であることが証明されている。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子およびタンパク質の同定および配列決定は、表２に列挙したものを含むがそれらに限定されないＤＮＡ修復不全および細胞周期異常に関連する疾患のための、治療薬開発、診断学的検査およびスクリーニングアッセイにとっての新規標的を提供する。
以下の説明は、上記の症候群を診断および治療するための基盤となる、ＦＡ経路におけるＦＡＮＣＤ２の生物学的役割に関する新規かつ有用な洞察を提供する。
ＦＡ細胞が細胞周期調節における基礎的な分子的欠陥を有することの証拠には、次のものが含まれる：（ａ）ＦＡ細胞は、化学的架橋剤による処置によって強化される、４Ｎ ＤＮＡ含量を含む細胞周期遅延を示す；（ｂ）細胞周期停止およびＦＡ細胞の増殖低下は、タンパク質のサイクリンファミリーのメンバーであるタンパク質ＳＰＨＡＲの過剰発現によって、部分的に補正できる；および（ｃ）カフェインはＦＡ細胞のＧ２期停止を取り消す。これらの結果と一致して、カフェインは構成的にｃｄｃ２を活性化し、ＦＡ細胞内の正常Ｇ２期細胞周期チェックポイントを無効にする可能性がある。最後に、ＦＡＮＣＣタンパク質はサイクリン依存性キナーゼのｃｄｃ２へ結合する。本発明者らは、ＦＡ複合体がサイクリンＢ／ｃｄｃ２複合体の基質または調節因子である可能性があると提案する。
さらに、ＦＡ細胞がＤＮＡ修復において基礎的欠陥を有するという証拠は、（ａ）架橋ＤＮＡの修復または二本鎖切断における特異的欠陥を示唆する、ＤＮＡ架橋剤および電離放射線（ＩＲ）に対して感受性のＦＡ細胞；（ｂ）欠陥のある修復ではあるが無傷のチェックポイント活動が存在することを示唆する、非常に活発なｐ５３応答を生じさせるＦＡ細胞のＤＮＡ損傷；および（ｃ）非相同末端結合の適合度における欠陥および相同組換えの比率増加を伴うＦＡ細胞、によって示唆されている（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，（２００１）、ｖｏｌ．７、ｐ２４９〜２６２）、（Ｇｒｏｍｐｅら，Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，（２００１）、ｖｏｌ．１０、ｐ１〜７）。
細胞周期およびＤＮＡ修復におけるこれらの一般的異常にもかかわらず、ＦＡ経路がこれらの活動を調節する機序についてはこれまで理解しがたかった。本発明者らは、本明細書において、ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＦＡタンパク質複合体の下流で機能することを証明する。集合したＦＡタンパク質複合体の存在下では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、Ｓ期特異的ＤＮＡ修復反応を調節すると思われる高分子量のモノユビキチン化アイソフォームへと活性化される。活性化ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、ＤＮＡ損傷剤に反応して核内フォーカス内に集積し、既知のＤＮＡ修復タンパク質であるＢＲＣＡ１と共局在化および共免疫沈降する。これらの結果は、以前の矛盾するＦＡ経路モデル（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，１９９７）を解決し、ＦＡタンパク質がＤＮＡ修復への細胞応答において協働することを示している。
ＦＡ経路には、本発明者らが証明したＡ／Ｃ／Ｇに加えて複合体のサブユニットとしてＦＡＮＣＦをもまた含む、ＦＡマルチサブユニット核複合体の形成が含まれる（図８）。ＦＡ経路は、Ｓ期中に「活性」になり、Ｓ期特異的修復反応またはチェックポイント反応を生じさせる。ＦＡマルチサブユニット複合体に依存するＦＡ経路の正常な活性化は、リン酸化ステップを介して、ＦＡＮＣＤ−２Ｌと同定された高分子量活性化アイソフォームへのリンタンパク質−ＦＡＮＣＤ２の調節モノユビキチン化を生じさせる（図１）。モノユビキチン化は細胞トラフィッキングと関連している。ＦＡＮＣＤ２−ＬはＳ期特異的ＤＮＡ修復反応を調節すると思われる（図３）。ＦＡ細胞によるＦＡＮＣＤ２のＳ期特異的活性化の活性化の失敗は、細胞周期特異的異常と関連している。活性化ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、ＤＮＡ損傷剤、ＭＭＣおよびＩＲに反応して核内フォーカス内に集積し、既知のＤＮＡ修復タンパク質であるＢＲＣＡ１とともに共局在化および共免疫沈降する（図４〜６）。これらの結果は、以前のＦＡタンパク質機能の矛盾するモデル（Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，１９９７）を解決し、ＤＮＡ修復においてＦＡ経路が果たす役割を強力に支持する。
本発明者らは、初めて、ＦＡ経路に関わるＦＡＮＣＤ２アイソフォームと様々な癌について知られている診断分子であるタンパク質との関連を同定した。Ｓ期においてまたはＤＮＡ損傷に反応して高分子量の翻訳後修飾アイソフォームへと活性化されるＢＲＣＡ１タンパク質についてのＤＮＡ損傷に関する類似の経路は、活性化ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＢＲＣＡ１と相互作用することを示唆している。より詳しくは、ＦＡＮＣＤ２の調節モノユビキチン化は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の標的を、ＢＲＣＡ１を含有する核内フォーカスにすると思われる。ＦＡＮＣＤ２はＢＲＣＡ１と共免疫沈降し、そしてさらにＲＡＤ５０、Ｍｒｅ１１、ＮＢＳ、またはＲＡＤ５１等の他の「ドット（ｄｏｔ）」タンパク質と結合しうる。近年の研究は、ＢＲＣＡ１フォーカスが大きな（２メガダルトン）のマルチタンパク質複合体から構成されることを証明している（Ｗａｎｇら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，（２００１）ｖｏｌ．１４、ｐ９２７〜９３９）。この複合体には、ＡＴＭ、ＤＮＡ修復機能に関係するＡＴＭ基質（ＢＲＣＡ１）、およびチェックポイント機能に関係するＡＴＭ基質（ＮＢＳ）が含まれる。さらに、ＦＡ経路の損傷認識および活性化には、ＡＴＭ、ＡＴＲ、ＣＨＫ１、またはＣＨＫ２を含むＤＮＡ損傷に反応するキナーゼが関係することが示唆されている。
本発明者らは、ＤＮＡ損傷剤、ＩＲおよびＭＭＣがＦＡＮＣＤ２の独立した翻訳後修飾を活性化させ、その結果として別個の機能的結果を生じさせることを見いだした。ＩＲは、セリン２２２でＦＡＮＣＤ２のＡＴＭ依存性リン酸化を活性化してＳ期チェックポイント反応を生じさせる。ＭＭＣは、リジン５６１でＦＡＮＣＤ２のＢＲＡＣＡ−１依存性およびＦＡ経路依存性のモノユビキチン化を活性化し、ＦＡＮＣＤ２／ＢＲＣＡ１核内フォーカスのアセンブリーおよびＭＭＣ耐性を生じさせる。このためＦＡＮＣＤ２は、共通経路内で２つの追加の癌感受性遺伝子（ＡＴＭおよびＢＲＣＡ１）間の連結を提供する２つの別個の翻訳後修飾の結果として生じる染色体安定性の維持において、２つの独立した機能的役割を有している。いくつかの追加の証拠は、ＦＡＮＣＤ２とＢＲＣＡ１との相互作用を支持している。第１に、ＢＲＣＡ１（−／−）細胞系であるＨＣＣ１９３７（Ｓｃｕｌｌｙら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，（１９９９）、ｖｏｌ．４、ｐ１０９３〜１０９９）は、染色体不安定性ならびに三放射線および四放射線染色体形成の増加とともに、「ファンコニ貧血様」表現型を有する。第２に、ＦＡ細胞は、通常ＩＲに反応してＢＲＣＡ１フォーカス（およびＲＡＤ５１フォーカス）を形成するが、ＢＲＣＡ１（−／−）細胞は検出可能なＢＲＣＡ１フォーカスを有しておらず、正常細胞と比較してＦＡＮＣＤ２フォーカスの数が大きく減少している。ＢＲＣＡ１（−／−）細胞の機能的相補性は、ＢＲＣＡ１フォーカスおよびＦＡＮＣＤ２フォーカスを正常レベルへ回復させ、そして正常ＭＭＣ耐性を回復させた。
ＦＡＮＣＤ２−Ｌの量は、部分的にはｆａｎｃｄ２遺伝子から合成されたＦＡＮＤ２−Ｓの量によって、そして部分的にはＦＡＮＣＤ２−Ｌを形成するためのモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−ＳへのＦＡ複合体の利用可能性によって決定される。ＦＡＮＣＤ２−ＬとＢＲＣＡおよびＡＴＭを含む核内フォーカスとの関連、ならびにＤＮＡ修復におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌの役割を決定することは、このタンパク質を広範囲の癌について患者における潜在的癌発症を考察するための強力な標的にする。そのような癌には、染色体３ｐ上の損傷により発生する癌、ならびに、突然変異がＦＡＮＣＧ、ＦＡＮＣＣまたはＦＡＮＣＡ等のＦＡ経路の上流メンバーの産生の妨害を生じさせるような、他の染色体上の癌が含まれる。癌細胞系および腫瘍生検組織を含む癌患者由来の初代細胞は、ＦＡＮＣＤ−Ｌについてスクリーニングされ、このタンパク質の異常レベルは疾患の早期診断と相関すると予想されている。ＦＡＮＣＤ２タンパク質はＤＮＡ修復への経路における最終ステップであるので、ＦＡＮＣＤ２−ＳからＦＡＮＣＤ−Ｌへの転換を引き起こす１以上の経路におけるタンパク質の何らかの異常は、ＦＡＮＣＤ２のレベルを測定することによって容易に検出されると考えられる。さらに、ＦＡＮＣＤ２のレベルは、ＢＲＣＡおよびＡＴＭのような他のタンパク質がいかに核内で機能的に相互作用するかに影響を及ぼし、患者にとって重大な結果をもたらす。患者におけるＦＡＮＣＤ２のレベルの分析は、前記患者が示す癌のクラスの理解に関して医師が臨床決定を下すのに役立つと予想される。例えば、癌細胞がモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームを生成できない場合、その細胞は染色体不安定性の増加を有しており、おそらく放射線照射または化学療法薬への感受性の増加を有する可能性がある。この情報は、医師が患者の治療を改善する際に助けとなるであろう。
ファンコニ貧血は、広範囲のスペクトルの様々な癌だけではなく先天性異常とも関連している。胎児の発達は複雑ではあるが秩序立ったプロセスである。ある種のタンパク質は、この秩序立った発達の進行を崩壊させるため、特に広範囲のスペクトルの作用を及ぼす。ＦＡ経路は、ＦＡ経路の発達および崩壊に重大な役割を果たし、数多くの有害作用を引き起こす。ＦＡ経路におけるエラーは、胎児細胞由来のＦＡＮＤ２−Ｌタンパク質の分析を通して検出できる。ＦＡＮＣＤ２は、正常胎児発達の診断マーカーであり、治療的介入にとって可能性のある標的である。
上記と一致して、本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２が生育可能な精子の産生においてある役割を果たすことを証明した。ＦＡＮＣＤ２は、後期太糸期および複糸期マウス精母細胞におけるＸＹ二価染色体の不対軸上でフォーカスを形成する（図７）。興味深いことに、ＦＡＮＣＤ２フォーカスは複糸期における常染色体テロメアでも見られる。ＦＡ患者およびＦＡ−Ｃノックアウトマウスにおいて知られている生殖能力の欠陥と結び付けて考察すると、本発明者らの観察は、減数分裂第Ｉ期を通しての精母細胞の正常な発達のためには活性化ＦＡＮＣＤ２タンパク質が必要であることを示唆している。ＸＹ軸上で見られるＦＡＮＣＤ２フォーカスの大半はＢＲＣＡ１フォーカスと共局在することが見いだされており、これは、２つのタンパク質が減数分裂細胞中で一緒に機能することを示唆している。ＢＲＣＡ１と同様に、ＦＡＮＣＤ２は、発達中のシナプトネマ構造の軸（非接合（ｕｎｓｙｎａｐｓｅｄ））エレメント上で検出された。組換えはシナプス領域で発生するので、ＦＡＮＣＤ２は、おそらくシナプシスのために染色体を準備するのに役立つように、またはその後の組換え事象を調節するために、組換えが開始される前に機能できる。それによりＦＡＮＣＤ２が減数分裂染色体上で集合し、減数分裂細胞中でドット構造を形成する、比較的同調的な方法は、ＦＡＮＣＤ２が有糸分裂期および減数分裂期両方の細胞周期制御において役割を果たすことを示唆している。
本発明の実施形態は、ＦＡ経路の完全性を決定するための診断的標的としての翻訳後修飾アイソフォームであるＦＡＮＣＤ−２Ｌの使用を指向する。ＦＡＮＣＤ２のユビキチン化およびＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの形成は、ＦＡ経路における下流事象であり、いくつかのＦＡ遺伝子の機能を必要とする。本発明者らは、上流ＦＡ遺伝子（ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＮＣＧ）のいずれかの二対立遺伝子突然変異が、非ユビキチン化ＦＡＮＣＤ２（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）型からユビキチン化ＦＡＮＣＤ２（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）型へのＦＡＮＣＤ２の翻訳後修飾を阻止することを見いだした。これらの上流欠陥のいずれも、ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡを用いて細胞をトランスフェクトすることにより取り消すことができる（図１ａ）。
本発明者らは、初めて、ＦＡＮＣＤ２の存在およびＦＡ経路におけるそれの果たす役割を証明した。本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２がＢＲＣＡ１およびＡＴＭ等の他のＤＮＡ修復タンパク質と関連している場合、ＦＡＮＣＤ２はＤＮＡ損傷剤に反応して核内フォーカス内に集積することを証明した。本発明者らはまた、ＦＡＮＣＤ２が細胞中で２つのアイソフォームで存在しており、これら２つのアイソフォームの１つであるＦＡＮＣＤ２−Ｌの低下がファンコニ貧血および癌感受性の増加と相関することも証明した。本発明者らは、これらの所見を使用して、患者のケアに役立つように臨床使用するための多数の診断学的検査を提案してきた。
これらの検査には：（ａ）将来の子孫または現在の妊娠において遺伝性ファンコニ貧血について懸念がある親たちに対する遺伝学的および出生前カウンセリング；（ｂ）欠陥のあるＦＡ経路に相関する癌感受性の増加を決定するためのヒト成人のための遺伝学的カウンセリングおよび免疫学的診断検査；および（ｃ）副作用を最小限に抑えながら対象にとって最も有効である治療プロトコールを開発する機会を提供するために対象においてすでに存在する癌の診断をすること、が含まれる。
ここに記載する診断学的検査は、当技術分野において知られている標準プロトコールに基づいており、このため本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２タンパク質およびヌクレオチド配列について検査するための新規試薬を提供した。これらの試薬には、ＦＡＮＣＤ２アイソフォームに特異的な抗体、ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の遺伝的変化を検出するためにベクター、プローブおよびプライマーがそれに由来するヌクレオチド配列、ならびにＦＡ経路における欠陥を保存および検査するための細胞系および組換え細胞が含まれる。
本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２−ＬおよびＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質に対して特異的である、実施例１に記載したモノクローナルおよびポリクローナル抗体調製物を調製した。さらに、ＦＡＮＣＤ２アイソフォーム特異的抗体フラグメントおよび一本鎖抗体は、標準的な技術を使用して調製できる。本発明者らは、例えばウェスタンブロット法のような免疫沈降アッセイ等の湿式化学的アッセイにおいてこれらの抗体を使用して、生物学的サンプル内でＦＡＮＣＤ２アイソフォームを同定した（図１）。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫放射定量測定法（ＩＲＭＡ）および免疫酵素アッセイ（ＩＥＭＡ）を含み、さらにサンドイッチアッセイを含む、従来型イムノアッセイもまた使用できる。その他のイムノアッセイは、溶液中の抗体と反応させられ、場合によってはリザーバー内の液状で分析される、全細胞または溶解細胞のサンプルを利用できる。ＦＡＮＣＤ２のアイソフォームは、免疫蛍光細胞を検出するために、例えば蛍光活性化セルソーティング、およびレーザーまたは光線顕微鏡を使用する免疫学的技術によって、細胞系、生検組織および血液を含む無傷細胞中においてｉｎ ｓｉｔｕで同定することができる（図１〜７、９〜１４）。例えば、パラフィン中に包埋された、または凍結組織切片等の保存された状態でスライド上において調製された生検組織または細胞単層は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌを検出するために抗体に曝露させ、その後に蛍光顕微鏡によって検査することができる。
本発明の実施形態では、患者由来の細胞系または癌細胞系が、ＦＡＮＣＤ２アイソフォームの量の変化を検出するための新規の単純な診断学的検査を提供するために、免疫ブロッティング法および免疫蛍光法によって分析される。診断学的検査はまた、ＦＡ経路における上流にある欠損についてスクリーニングするための手段および現在使用されているＦＡについてのＤＥＢ／ＭＭＣ染色体切断検査の実際的代替法を提供するが、それはＦＡ経路における上流にある欠損を有する個人はＦＡＮＣＤ２をユビキチン化できないからである。表２に記載した症候群のいずれか、特にＦＡであると新規に診断された患者の迅速なサブタイプ分析を提供するために、形質転換した患者由来細胞系を形成するためのレトロウイルス遺伝子導入を、ＦＡＮＣＤ２免疫ブロッティングと一緒に組み合わせるアッセイ（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，（１９９８）ｖｏｌ．４、ｐ４６８〜７９）を含む、他のアッセイを使用できる。
上記のアッセイは、診断研究所によって実施すること、または診断キットを製造して医療提供者または自己診断のために個人へ販売することができる。これらの検査の結果およびその解釈から得られる情報は、医療提供者が患者の病態を診断および治療する際に有用である。
遺伝学的検査は、対象について、疫学的ベースラインに比較して特定状態についての迅速で確実なリスク分析を提供できる。本発明者らのデータは、ＦＡＮＣＤ２相補性群内のＦＡを有する患者において遺伝的異質性が発生することを示唆している。本発明者らは、遺伝的異質性と疾患との間、ならびに遺伝的異質性とＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在または不存在を生じさせる異常な翻訳後修飾との間に相関関係を見いだした。この相関は、異常なＤＮＡ修復を特徴とする症候群のいずれかについての予後の検査ならびに診断学的検査および治療の基盤を提供する。例えば、採血から入手した細胞サンプルまたは対象由来の他の細胞からの核酸をＦＡＮＣＤ２遺伝子内の突然変異について分析し、そして対象は癌への感受性の増加を有すると診断されうる。
本発明者らは、癌の高頻発と相関する領域における染色体３ｐ上の３ｐ２５．３においてＦＡＮＣＤ２遺伝子の局在を確認した。細胞遺伝学的研究およびヘテロ接合性消失（ＬＯＨ）研究は、染色体３ｐの欠失がすべての形態の肺癌において高頻度で発生することを証明している（Ｔｏｄｄら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５７、ｐ１３４４〜５２）。例えば、ホモ接合性欠失は、３ｐ２１の領域内の３つの扁平上皮細胞系で見いだされた。ホモ接合性欠失はまた、小細胞癌において３ｐ１２および３ｐ１４．２で見いだされた（Ｆｒａｎｋｌｉｎら，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．（１９９７）、ｖｏｌ．５７、ｐ１３４４〜５２）。本発明でのＦＡＮＣＤ２のマッピングは、この染色体領域が重要な腫瘍サプレッサー遺伝子を含有するという理論を支持している。これについてのまた別の支持は、家族性卵巣癌についての新規感受性遺伝子の染色体３ｐ２２−ｐ２５への局在化を報告している、Ｓｅｋｉｎｅらの最近の出版物、Ｈｕｍａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，（２００１）、ｖｏｌ．１０、ｐ１４２１〜１４２９によって提供されている。ＦＡＮＣＤ２−Ｌの減少または欠如は、本明細書においては、ＦＡＮＣＤ２部位（３ｐ２５．３）だけではなく、環境作用物質への曝露および正常な加齢プロセスから発生する細胞損傷後のＤＮＡ修復における欠陥からおそらく発生する染色体の他の部位においても、突然変異の結果として生じる腫瘍のリスクの増加について診断的であると提案されている。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の遺伝的欠陥についてより多数の個人および家系がスクリーニングされるにつれて、様々な突然変異に対する集団頻度が収集されたデータベースが開発され、遺伝的分析の予測値が引き続き改善されるように、これらの突然変異と個人にとっての健康プロフィールとの相関付けが行われるであろう。ＦＡＮＣＤ２についての対立遺伝子特異的家系分析の例は、図１０において２つの家系について提供されている。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の突然変異の診断は、最初は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の量の低下を検出するために迅速な免疫学的アッセイによって検出できる。陽性のサンプルは、その後、ＰＡ経路におけるいずれかの遺伝子内の欠陥について利用できるプローブおよびプライマーを用いてスクリーニングできる。ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の欠陥が関係している場合は、表７に示したようなプライマーまたはプローブを使用して突然変異を検出できる。それらのサンプル内では、そのようなプライマーまたはプローブによって突然変異が検出されない場合、前記遺伝子内の突然変異の存在および局在位置を決定するために全ＦＡＮＣＤ２遺伝子を配列決定することができる。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子座における遺伝的欠陥を同定するために使用する核酸スクリーニングアッセイには、突然変異を検出するためのＰＣＲ型および非ＰＣＲ型アッセイが含まれうる。特定の対立遺伝子内の突然変異の存在について細胞ゲノムを分析するためには、多数のアプローチ法がある。例えば、点突然変異、欠失または挿入のいずれであっても、野生型ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子の変化は、プローブを使用する標準的な方法を用いて検出できる（米国特許第６，０３３，８５７号）。標準的な方法には：（ａ）全無傷細胞上で使用できる蛍光ｉｎ ｓｉｔｕ・ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）；および（ｂ）単離された核酸上でハイブリダイゼーション技術を使用して突然変異を検出するのに使用できる、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が含まれる（Ｃｏｎｎｅｒら，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９８９）、ｖｏｌ．８５、ｐ５５〜７４）。その他の技術には、（ａ）非変性ポリアクリルアミドゲル上で一本鎖ＤＮＡの電気泳動度における変化を観察する方法、（ｂ）組織サンプルから単離したゲノムＤＮＡへＦＡＮＣＤ２遺伝子プローブをハイブリダイズさせる方法、（ｃ）組織サンプルのゲノムＤＮＡへ対立遺伝子特異的プローブをハイブリダイズさせる方法、（ｄ）増幅配列を作成するために組織サンプルからのＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を増幅させ、増幅配列を配列決定する方法、（ｅ）特異的ＦＡＮＣＤ２突然変異体対立遺伝子についてのプライマーを使用して、組織サンプル由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を増幅させる方法、（ｆ）クローン化配列を作成するために組織サンプル由来ＦＡＮＣＤ２遺伝子の全部または一部を分子クローニングし、クローン化配列を配列決定する方法、（ｇ）（ｉ）組織サンプルから単離したＦＡＮＣＤ２遺伝子またはＦＡＮＣＤ２ ｍＲＮＡと（ｉｉ）ヒト野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列と相補的である核酸プローブとの間のミスマッチを、分子（ｉ）および（ｉｉ）が二本鎖を形成するために相互にハイブリダイズされた場合に同定する方法、（ｈ）組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅、および野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含む核酸プローブヘの増幅配列のハイブリダイゼーション、（ｉ）組織サンプル内のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列の増幅、および突然変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を含む核酸プローブヘの増幅配列のハイブリダイゼーション、（ｊ）組織サンプル内の欠失突然変異についてのスクリーニング、（ｋ）組織サンプル内の点突然変異についてのスクリーニング、（ｌ）組織サンプル内の挿入突然変異についてのスクリーニング、ならびに（ｍ）ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含む核酸プローブを用いた組織サンプルのＦＡＮＣＤ２遺伝子のｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションが含まれる。
点突然変異については、遺伝子またはゲノムの比較的に短い領域を調べるのがしばしば望ましい：配列内のすべての潜在的部位を検査するために必要とされる多数のオリゴヌクレオチドは、効率的なコンビナトリアル法によって作成できる（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，Ｅ．Ｍら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，（１９９４）ｖｏｌ．２２、ｐ１３６８〜１３７３）。標的配列におけるすべての部位で突然変異について探索するために、リガーゼまたはポリメラーゼと組み合わせて、アレイを使用できる（米国特許第６，３０７，０３９号）。ハイブリダイゼーションによる突然変異の分析は、例えばゲル、アレイ、またはドット・ブロットによって実施できる。
全遺伝子は、配列決定して突然変異を同定することができる（米国特許第６，０３３，８５７号）。ＦＡＮＣＤ２遺伝子座の配列決定は、標的配列に付着させたときに固相支持体上の補体に付着する最小限クロスハイブリダイジングセットからのオリゴヌクレオチドタグを使用して達成できる（米国特許第６，２８０，９３５号）。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子内の突然変異を検出するための他の方法には、米国特許第６，２９７，０１０号、米国特許第６，２８７，７７２号および米国特許第６，３００，０７６号に記載された方法が含まれる。さらにまた、これらのアッセイにおいて核酸マイクロチップ・テクノロジーまたはラボ・オン・チップを使用した複数サンプルの分析を使用できることも考えられている。その後、これらの突然変異と、乳癌、卵巣癌または前立腺癌患者に関する遺伝学的研究の結果との相関を使用すると、ＦＡＮＣＤ２遺伝子内で同定された欠陥が本発明による癌関連性欠陥であるかどうかを決定することができる。
腫瘍を発症した対象は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子突然変異または欠損症を検出するために、核酸診断学的検査または抗体に基づく検査を使用してスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに基づき、サンプルは、黒色腫、白血病、星細胞腫、グリア芽腫、リンパ腫、神経膠腫、ホジキンリンパ腫、慢性リンパ球性白血病ならびに膵臓癌、乳癌、甲状腺癌、卵巣癌、子宮癌、精巣癌、下垂体癌、腎臓癌、胃癌、食道癌および直腸癌を含む広範囲の癌を有する患者から入手できる。臨床医は、前記患者のための治療有益性を最大化するために適切な治療プロトコールを選択する向上した能力を有する。特に、ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質における遺伝的損傷または欠損症の存在は、様々な現行の化学療法薬および放射線療法への反応性と相関付けることができる。
新規治療法は、細胞アッセイ（実施例１１〜１２）およびノックアウトマウスモデル（実施例１０）においてＦＡＮＣＤ２−Ｌを産生するＦＡＮＣＤ２−Ｓのモノユビキチン化を調節する分子をスクリーニングすることによって開発することができる。そのような分子には、ＦＡＮＣＤ２、または順にＦＡＮＣＤ２によって活性化されると思われるＢＲＡＣＡ−１と相互作用すると思われるＢＲＡＣＡ−２等の分子に直接結合する分子が含まれる。
ＦＡＮＣＤ２遺伝子またはタンパク質における欠陥に基づくスクリーニングアッセイに加えて、ＦＡＮＣＤ２−Ｓ自体を含むＦＡＮＣＤ２の翻訳後修飾に先行するいずれかの時点でのＦＡ経路における欠陥の結果として、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの形成のために必要なユビキチン化反応の失敗が観察されることがある。反応における最終ステップが明らかになると、破損した経路を修復させる分子が見いだされるまで、「破損したＦＡ経路」を含有する低分子が細胞内またはインビトロでスクリーニングされるスクリーニングアッセイを調製することが可能になる。その後この分子は、欠陥の性質を同定するためのプローブとして利用できる。この分子は、欠陥を修復するための治療薬としてさらに使用できる。例えば、本発明者らは、細胞周期停止およびＦＡ細胞の増殖低下が、一部にはタンパク質のサイクリンファミリーのメンバーであるタンパク質ＳＰＨＡＲの過剰発現によって補正できることを証明した。これは、治療的低分子を同定するためのスクリーンとして適切であるアッセイの基礎を形成できる。
翻訳後修飾されたＦＡＮＣＤ２が不十分である細胞は、ＤＮＡ損傷に対して特に感受性である。これらの細胞は、化合物（毒性分子を含む）がＤＮＡを損傷させる能力を有するかどうかを決定するための感受性スクリーンとして機能できる。逆に言えば、これらの細胞はまた、化合物がＤＮＡ損傷から細胞を保護できるかどうかを決定するための感受性スクリーンとしても機能できる。
ＦＡ患者およびＤＮＡ修復欠陥に関連する症候群に罹患している患者は、骨髄不全の合併症のために死亡する。遺伝子導入は、この欠陥を補正するための治療選択肢である。ＦＡ経路を通して多数の欠陥が発生することがある。本発明者らは、細胞および生体が適正に機能するために最終ステップが極めて重要であることを証明した。本発明の実施形態では、ＦＡ経路のいずれかでの欠陥の修正は、この形質転換が首尾よく達成されるようにＦＡＮＣＤ２−ＬへのＦＡＮＣＤ２−Ｓの形質転換を標的とする遺伝子療法または治療薬によって、十分に達成できる。
遺伝子療法は、例えばＦｒｉｅｄｍａｎが「遺伝疾患の治療（Ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｄｉｓｅａｓｅ）」、Ｔ．Ｆｒｉｅｄｍａｎ編集、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、ｐ１０５〜１２１で記載したような、一般に容認された方法によって実施できる。エクスビボ（ｅｘ ｖｉｖｏ）またはインビボ遺伝子療法の標的とする組織には、たとえば骨髄、貧血発症前の造血幹細胞、および発達異常に関係している胎児組織が含まれる。遺伝子療法は、突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子を有する細胞に野生型ＦＡＮＤ２−Ｌ機能を提供することができる。そのような機能の提供は、レシピエント細胞の腫瘍増殖を抑制する、またはファンコニ貧血の症状を改善するはずである。
野生型ＦＡＮＣＤ−２遺伝子または前記遺伝子の一部は、前記遺伝子が染色体外にとどまるようにベクターで細胞に導入することができる。そのような状況では、遺伝子は染色体外の位置からの細胞によって発現させることができる。遺伝子の一部分が突然変異ＦＡＮＣＤ−２対立遺伝子を有する細胞に導入されてその中で発現する場合、前記遺伝子の一部分は、細胞の非腫瘍増殖のために必要なＦＡＮＣＤ−２タンパク質の一部をコードすることができる。あるいは、野生型ＦＡＮＣＤ−２遺伝子または前記遺伝子の一部は、それが細胞内に存在する内因性突然変異ＦＡＮＣＤ−２遺伝子と再結合するような方法で、前記突然変異細胞内に導入することができる。
ウイルスベクターは、遺伝子療法を達成するための１クラスのベクターである。ウイルス媒介性遺伝子導入は、リポソーム送達を使用する直接的インビボ遺伝子導入と組み合わせることができ、周囲の細胞分裂しない細胞内にではなく腫瘍細胞にウイルスベクターを差し向けることが可能になる。あるいは、ウイルスベクタープロデューサー細胞を腫瘍内へ注入することができる（Ｃｕｌｖｅｒら，１９９２）。プロデューサー細胞の注入は、その後、ベクター粒子の持続的な供給源を提供するであろう。この技術は、手術不能の脳腫瘍を有するヒトにおける使用のために承認されている。
ベクターは、腫瘍部位へ局所的に、または（他の部位へ転移した可能性があるあらゆる腫瘍細胞に到達するために）全身性のいずれかで、患者に注入することができる。トランスフェクトされた遺伝子が標的腫瘍細胞各々のゲノム内に永久的に取り込まれなければ、治療は定期的に繰り返されなければならない。
組換えまたは染色体外での維持の両方のための遺伝子導入用ベクターは、当技術分野において知られており（たとえば、米国特許第５，２５２，４７９号、国際特許出願第９３／０７２８２号および米国特許第６，３０３，３７９号）、レトロウイルス、ヘルペスウイルス（米国特許第６，２８７，５５７号）もしくはアデノウイルス（米国特許第６，２８１，０１０号）等のウイルスベクターまたはＦＡＮＣＤ２−Ｌを含有するプラスミドベクターが含まれる。
治療遺伝子配列、または遺伝子もしくは遺伝子の部分をコードするＤＮＡを有するベクターは、腫瘍の部位で局所的に、または転移した腫瘍細胞に到達できるように全身性のいずれかで、患者に注入することができる。ターゲティングは、ベクターをそれ以上操作することなく達成でき、あるいは、ベクターは、腫瘍に対して結合特異性を有する分子に結合させることができ、ここで、そのような分子は受容体アゴニストもしくはアンタゴニストである可能性があり、そして、ペプチド、脂質（リポソームを含む）またはオリゴ多糖もしくは多糖を含む糖、ならびに合成ターゲティング分子をさらに含むことができる。ＤＮＡはポリリジンを介して結合リガンドに結合させることができる。トランスフェクトされた遺伝子が標的腫瘍細胞各々のゲノム内に永久的に取り込まれなければ、治療は定期的に繰り返されなければならない。
患者への導入前に細胞内にＤＮＡを導入する方法は、当技術分野において記載されているように（米国特許第６，０３３，８５７号）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム共沈法およびウイルス形質導入法等の技術を使用して遂行でき、そしてその方法の選択は当業者の能力の範囲内にある。
野生型ＦＡＮＣＤ２遺伝子または突然変異ＦＡＮＣＤ２遺伝子を用いて形質転換された細胞は、欠陥のあるＤＮＡ修復の結果として生じる疾患の寛解およびそのような寛解を促進する薬物療法について研究するためのモデル系として使用できる。
上記で一般的に検討したように、ＦＡＮＣＤ２遺伝子、またはフラグメント（適用できれば）は、異常な細胞内のそのような遺伝子の発現産物の量を増加させるために、遺伝子療法において使用できる。そのような遺伝子療法は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌポリペプチドのレベルが正常細胞と比較して欠如または減少している場合、そしてＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルの増強が欠陥のあるＤＮＡ修復から発生する欠陥の蓄積を遅延化させ、したがって癌状態の開始を延期できる場合には、前癌細胞において使用するために特に適切である。このような遺伝子療法はまた、突然変異遺伝子が「正常」レベルで発現しているが、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームのレベルが低下している細胞においてさえ、ＦＡＮＣＤ２遺伝子の発現レベルを増加させるために有用なことがある。正常ＤＮＡ修復におけるＦＡＮＣＤ２−Ｌの極めて重要な役割は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルにおける減少を誘発する欠陥を補正する治療薬を開発するための機会を提供することにある。新規治療薬を開発するための１つのアプローチは、合理的な薬物デザインを通してのアプローチである。合理的な薬物デザインは、生物学的に活性な対象となるポリペプチドまたはそれと相互作用する低分子（例、アゴニスト、アンタゴニスト、阻害剤または増強剤）の構造的類似体を、前記ポリペプチドのより活性または安定性の形態を作成するために、またはインビボでのポリペプチドの機能を増強または妨害する低分子を設計するために、提供することができる。合理的な薬物デザインは、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性もしくは安定性を改善した、またはＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性の増強剤、阻害剤、アゴニスト、またはアンタゴニストとして機能する、低分子または修飾ポリペプチドを提供することができる。クローン化ＦＡＮＣＤ２配列の入手可能性によって、Ｘ線結晶学等の分析試験を実施するために十分な量のＦＡＮＣＤ２−Ｌポリペプチドを利用できるようにすることができる。さらに、ここに提供したＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質配列に関する知識により、Ｘ線結晶学の代わりに、またはそれに加えて、コンピュータ支援モデリング法を使用する方法が導かれる。
ＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性を有するペプチドまたはその他の分子は、治療調製物においてタンパク質が不足している細胞に供給することができる。ＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の配列は、数種の生物（ヒト、ハエおよび植物）について開示されている（配列番号１〜３）。ＦＡＮＣＤ２は、例えば追加の翻訳後修飾を用いて既知の発現ベクターを使用して、細菌においてｃＤＮＡ配列を発現させることにより産生できる。あるいは、ＦＡＮＣＤ２−ＬポリペプチドはＦＡＮＣＤ２−Ｌ産生哺乳類細胞から抽出できる。さらに、合成化学の技術を使用してＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を合成することができる。ＦＡＮＣＤ２−Ｌ活性を備える他の分子（例えば、ペプチド、薬物または有機化合物）を治療薬として使用することもできる。ペプチド療法には、実質的に類似する機能を有する修飾ポリペプチドもまた使用される。
同様に、変異体ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子を有する、または不十分なレベルのＦＡＮＣＤ２−Ｌを産生する、細胞および動物は、治療薬としての可能性を有する物質について研究および試験するためのモデル系として使用できる。体細胞系または生殖細胞系のいずれであってもよい細胞は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルが低下している個人から単離できる。あるいは、上記に記載したように、ＦＡＮＣＤ２−Ｌのレベルが減少している細胞系を遺伝子工学的に作成することができる。試験物質が細胞に適用された後、ＤＮＡ修復が損なわれている、細胞の形質転換表現型が決定される。
新規の候補治療分子の有効性は、有効性および毒性の欠如について実験動物において試験できる。標準的な技術を使用すると、全動物の突然変異誘発後に、または生殖細胞系細胞もしくは接合体の遺伝子操作後に、トランスジェニック動物を形成するために動物を選択できる。そのような処理には、通常は第２動物種からの突然変異ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子の挿入、ならびに破壊した相同遺伝子の挿入が含まれる。あるいは、動物の内因性ＦＡＮＣＤ２遺伝子は、従来型技術を使用して、挿入もしくは欠失突然変異またはその他の遺伝的変化によって破壊することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９８９）、ｖｏｌ．２４４、ｐ１２８８〜１２９２）（Ｖａｌａｎｃｉｕｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９９１）。試験物質を動物に投与した後、腫瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が、欠陥のあるＤＮＡ修復から発生した病理を防止または抑制した場合は、前記試験物質はここで同定した疾患を治療するための候補治療薬である。
本発明は、患者が癌を有するかどうか、または患者において癌のリスクが増加しているかどうかを決定するための、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡに基づく診断アッセイを提供する。本発明はまた、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤である新規癌治療薬を発見するためのスクリーニング方法を特徴とする。最後に、本発明は、１以上の化学療法化合物に対して耐性となっている腫瘍細胞の化学的感作方法、ならびに化学療法薬の有効性を決定するためのアッセイを提供する。
本発明の実施には、他に特に指示しない限り、分子生物学、細胞生物学、微生物学の従来型技術および当技術分野の範囲内にある組換えＤＮＡ技術が使用されるであろう。そのような技術は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ＆ Ｍａｎｉａｔｉｓ，１９８９，「分子クローニング：実験マニュアル、第２版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ）」；「オリゴヌクレオチドの合成（Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集，１９８４）；「核酸ハイブリダイゼーション（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）」（Ｂ．Ｄ．Ｈａｒｎｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編集，１９８４）；「分子クローニングの実践ガイド（Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，１９８４）；（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．）「抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）（１９９９），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；および「酵素学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）シリーズ；「分子生物学におけるショートプロトコール（Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ）（Ａｕｓｕｂｅｌら編集，１９９５）を参照されたい。上記および下記のどちらにおいても、本明細書で言及したすべての特許、特許出願、および出版物は、参照されることによりそれらの全体が組み込まれる。
生検組織
本発明は、脳、心臓、肺、リンパ節、眼、関節、皮膚およびこれらの器官と関連する腫瘍を含むがそれらに限定されない、患者の生検組織由来の細胞抽出物の調製を提供する。「生検組織（ｔｉｓｓｕｅ ｂｉｏｐｓｙ）」にはまた、血液、血漿、痰、尿、脳脊髄液、洗浄液および白血球泳動サンプルを含むがそれらに限定されない、生物学的液体の収集物も含まれる。好ましい実施形態では、本発明による「生検組織」は、乳癌、卵巣癌、または前立腺癌から採取される。「生検組織」は、針吸引および皮膚のパンチ生検を含む当技術分野においてよく知られている技術を使用して入手される。
シスプラチン
シスプラチンは、転移性の精巣癌もしくは卵巣癌、進行性の膀胱癌、頭頸部癌、子宮頸癌、肺癌またはその他の腫瘍等の癌を治療するために広く使用されてきた。シスプラチンは、臨床用途において使用される有効量である１５〜２０ｍｇ／ｍ２で、単独でまたは他の薬剤と併用して、３週間毎に５日間ずつ合計３コースにわたり使用できる。典型的な用量は、０．５０ｍｇ／ｍ２、１．０ｍｇ／ｍ２、１．５０ｍｇ／ｍ２、１．７５ｍｇ／ｍ２、２．０ｍｇ／ｍ２、３．０ｍｇ／ｍ２、４．０ｍｇ／ｍ２、５．０ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２であってよい。当然ながら、これらの用量はすべて例であり、これらのポイント間のあらゆる用量は本発明で使用できると予想されている。シスプラチンは、経口吸収されないため、静脈内、皮下、腫瘍内、または腹腔内への注射を介して送達しなければならない。抗癌剤の適切な取扱いおよび処分の手順を考慮に入れなければならない。この問題に関するいくつかのガイドラインは公表されており、当技術分野においてよく知られている。
例えば、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ，（シスプラチン注射）ＮＤＣ ００１５−３２２０−２２（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）は、保存料を含まない無菌の多用量バイアルとして供給されている。それぞれの多用量バイアルは５０ｍｇのシスプラチンＮＤＣ ００１５−３２２１−２２を含有しており、１５〜２５℃で遮光して保管しなければならない。初回使用後にアンバーバイアル内に残留しているシスプラチンは、遮光下では２８日間、室内蛍光灯下では７日間安定性である。
ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ，（シスプラチン注射）ＮＤＣ ００１５−３２２０−２２に関する処方情報は、Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社から入手できる。血漿中シスプラチン濃度は、５０または１００ｍｇ／ｍ２の用量でのボーラス投与後には、約２０〜３０分間の半減期で単一指数関数的に減少する。１００ｍｇ／ｍ２の２時間または７時間注射の後にも、単一指数関数的減少および約０．５時間の血漿中半減期が見られる。後者の後、シスプラチンの全身クリアランスおよび定常状態での分布量は、約１５〜１６Ｌ／ｈ／ｍ２および１１〜１２Ｌ／ｍ２である。
シスプラチンの用量および適用
癌治療のためのシスプラチンの用量および適用は、当技術分野においてよく知られている。ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（Ｂｒｉｓｔｏｌ Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ社）の処方情報は、用量および適用について次のガイドラインを推奨している：「調製または投与には、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱと接触する可能性があるアルミニウムパーツを含有する注射針または静注セットを使用しないこと。アルミニウムはＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱと反応して、沈殿物生成および有効性の消失を引き起こす」。
転移性精巣癌：他の承認された化学療法薬と併用して精巣癌を治療するためのＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱの常用量は、１サイクルにつき５日間にわたり１日２０ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）である。
転移性卵巣癌：ＣＹＴＯＸＡＮ（シクロホスファミド）と併用して転移性卵巣癌を治療するためのＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱの常用量は、４週間毎に１回（第１日）、１サイクルにつき７５〜１００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）である。ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱと併用する場合のＣＹＴＯＸＡＮの用量は、４週間毎に１回（第１日）、６００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）である。ＣＹＴＯＸＡＮの投与方法については、ＣＹＴＯＸＡＮの添付文書を参照されたい。併用療法では、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱおよびＣＹＴＯＸＡＮは連続投与すること。単剤療法では、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱは４週間毎に１回、１サイクルにつき１００ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）の用量で投与しなければならない。
進行性膀胱癌：ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ（シスプラチン注射）は、照射療法への事前の曝露および／または事前の化学療法の程度に依存して、３〜４週間毎に１回、１サイクルにつき５０〜７０ｍｇ／ｍ２（Ｉ．Ｖ．）の用量で単剤として投与すべきである。多量に前治療を受けていた患者については、４週間毎に１サイクルにつき５０ｍｇ／ｍ２の初期用量を繰り返すことが推奨されている。ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱ投与の８〜１２時間前に１〜２リットルの液体を輸注することによる前処置である水分負荷（ｈｙｄｒａｔｉｏｎ）が推奨される。その後、３７．５ｇのマンニトールを含有する１／２もしくは１／３生理食塩水中の２リットルの５％デキストロース中に薬剤を希釈し、６〜８時間をかけて注入する。希釈液を６時間以内に使用しない場合は、溶液を遮光すること。５％ちょうどのデキストロース注射液中にＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱを希釈しないこと。その後２４時間中は、適正な水分負荷および尿量を維持しなければならない。血清クレアチニンが１．５ｍｇ／１００ｍＬ未満になるまで、および／またはＢＵＮが２５ｍｇ／１００ｍＬ未満になるまでは、ＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱの反復コースを実施してはならない。反復コースは、循環血液要素が容認できるレベルになるまでは実施してはならない（血小板＞１００，０００／ｍｍ２、ＷＢＣ＞４，０００／ｍｍ２）。聴力分析結果が聴力が正常限界内にあることを表示するまでは、引き続いてのＰＬＡＴＩＮＯＬ−ＡＱの投与を実施してはならない。他の潜在的毒性化合物を用いる場合と同様に、水溶液の取扱いにおいては注意を払わなければならない。シスプラチンへの偶発的曝露に関連する皮膚反応が発生することがある。手袋の使用が推奨される。この水溶液は静脈内投与でのみ使用すべきで、６〜８時間をかけたＩＶ注射で投与しなければならない。
化学感作剤の用量および用法
癌化学感作の方法は、米国特許第５，７７６，９２５号で報告されており、その全体が本明細書に組み込まれる。本発明による癌治療は、それ自体は必ずしも細胞毒性ではないが抗癌療法を強化できるように宿主または腫瘍を修飾する化合物と併用する、１以上の抗腫瘍剤の使用を構想している。そのような薬剤は化学感作剤と呼ばれている。
化学感作剤を用いた治療は、本発明によると、抗腫瘍剤および対応する化学感作剤の存在下において、抗腫瘍剤存在下ではあるが対応する化学感作剤が存在しない場合における治療の後の腫瘍サイズに比較して、腫瘍サイズが１０％、好ましくは２５％、好ましくは５０％、より好ましくは７５％、最も好ましくは１００％低下した場合には、癌患者において治療的に有効である。
本発明は、本明細書に開示したように、治療有効量の化学感作剤を医薬上許容される担体または賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物を提供する。本発明による化学感作剤は、局所的に、または静脈内、皮下、筋肉内、非経口的、腹腔内もしくは経口的のいずれかの全身性の方法で患者へ投与することができる。好ましくは、投与は、１以上の抗腫瘍剤の投与と共にまたはその投与前に全身性で行われる。好ましい実施形態では、抗腫瘍剤は、当技術分野においてよく知られており、そして本明細書に記載したようなプロトコールによって投与されるシスプラチンである。
経口投与のためには、本発明において有用な化学感作剤は一般に、錠剤もしくはカプセル剤の形態で、粉剤もしくは顆粒として、または水溶液もしくは懸濁液として、提供できる。経口投与のための錠剤には、不活性の希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤沢剤、甘味剤、矯味剤、着色剤および保存剤等の医薬上許容される賦形剤と混合された活性成分を含むことができる。適切な不活性希釈剤には、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カルシウム、および乳糖が含まれ、適切な崩壊剤はコーンスターチおよびアルギン酸である。結合剤にはでんぷんおよびゼラチンが含まれ、潤沢剤は、存在する場合には、一般にステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクである。錠剤は、所望であれば、消化管内での吸収を遅延させるために、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリン等の物質でコーティングされてよい。
経口投与するためのカプセル剤には、活性成分が固形希釈剤と混合されている硬質ゼラチンカプセル、および活性成分が水またはピーナッツ油、液状パラフィンもしくはオリーブ油等の油脂と混合されている軟質ゼラチンカプセルが含まれる。
皮下および静脈内使用のためには、本発明の化学感作剤は、適切なｐＨおよび等張性に緩衝剤で処理された無菌水溶液もしくは懸濁液に溶解させて提供できる。適切な水性賦形剤には、リンゲル液および等張性塩化ナトリウムが含まれる。本発明による水性懸濁液には、セルロース誘導体、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドンおよびトラガカントゴム等の懸濁化剤、ならびにレシチン等の湿潤剤が含まれうる。水性懸濁液のための適切な保存剤には、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチルおよびｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピルが含まれる。
本発明による有用な化学感作剤はまた、リポソーム製剤として提示することもできる。
一般に、適切な用量は、１日当たりレシピエントの体重１ｋｇ当たり０．０１〜１００ｍｇの範囲内、好ましくは１日当たり体重１ｋｇ当たり０．２〜１０ｍｇの範囲内である。所望の用量は、好ましくは１日１回提供されるが、１日を通して適切な間隔をあけて２、３、４、５、６回以上の分割用量として投与することもできる。これらの分割用量は、例えば単位用量の剤形につき１０〜１，５００ｍｇ、好ましくは２０〜１，０００ｍｇ、および最も好ましくは５０〜７００ｍｇの活性成分を含有する、単位用量剤形で投与できる。本発明による有用な化学感作剤の用量は、治療または予防される状態および使用される化学感作剤の性質に依存して変動するであろう。本発明に含まれる個別の化合物についての有効用量およびインビボ半減期の推定値は、本明細書に記載したマウスモデル等の動物モデルを使用したインビボ試験またはより大型の哺乳類への当該方法の適合に基づいて見積もられうる。
それらの個々の投与に加えて、本発明による有用な化合物は、本明細書に記載したように、他の知られている化学感作剤および抗腫瘍剤と併用して投与することができる。いずれにせよ、薬剤を投与する医師は、当技術分野において知られている癌活性の標準尺度を使用して観察された結果に基づいて、薬物投与の用量および時期を調整できる。
抗腫瘍剤
抗腫瘍剤の非限定的例には、例えば抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路を妨害できる薬剤、アポトーシスを促進する薬剤、放射線療法、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（裸の抗体、免疫毒素および放射性コンジュゲート（ｒａｄｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）を含む）が含まれる。特定のクラスの抗癌剤の例を以下の通り詳細に提供する：例えばパクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテレ等の抗チューブリン剤／抗微小管剤；例えばトポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトキサントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アムサクリン、エピルビシン、メルバロン、塩酸ピロキサントロン等のトポイソメラーゼＩ阻害剤；例えば５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキセート、ゲムシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパラギン酸（すなわちＰＡＬＡ）、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、ａｒａ−Ａ、クラドリビン、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸等の代謝拮抗剤；例えばシスプラチン、カルボプラチン、マイトマイシンＣ、ＢＣＮＵ（すなわちカルムスチン）、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロラムブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、ナイトロジェン・マスタード、ウラシル・マスタード、ピポブロマン、４−イポメノール等のアルキル化剤；例えばジヒドロレンペロン、スピロムスチンおよびデシペプチド等の他の作用機序を介して作用する薬剤；例えばインターフェロン等の抗腫瘍反応を強化する生物学的反応修飾剤；アクチノマイシンＤ等のアポトーシス剤；および、例えばタモキシフェン等の抗エストロゲン剤、または４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリド等の抗アンドロゲン剤のような抗ホルモン剤。
抗腫瘍剤は、本発明によると、抗腫瘍剤による治療開始前の腫瘍サイズに比較して、腫瘍サイズが１０％、好ましくは２５％、好ましくは５０％、より好ましくは７５％、最も好ましくは１００％低下した場合には、癌患者において治療に役立つ。
また別の実施形態では、抗腫瘍剤は、本発明によると、癌患者が癌から解放されたままであれば、すなわち癌治療の開始後、好ましくは６ヵ月間、好ましくは１年間、より好ましくは２年間、および最も好ましくは５年間以上検出可能な腫瘍がなければ、治療的に有効である。
本発明によるファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の阻害剤
ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的な阻害剤には、本明細書において定義したように、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子またはタンパク質の発現または機能を崩壊させる生体分子が含まれるがそれらに限定されない。ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的な阻害剤には、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子アンチセンス核酸（アンチセンス・ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ）、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子の優性ネガティブ突然変異体、ならびにファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子の転写、ｍＲＮＡプロセシング、ｍＲＮＡ輸送、タンパク質翻訳、タンパク質修飾、タンパク質輸送、核輸送およびファンコニ貧血／ＢＲＣＡタンパク質複合体形成の阻害剤が含まれるが、それらに限定されない。
最も好ましい実施形態では、本発明はＦＡＮＣ−Ｄ２ユビキチンＥ３リガーゼの低分子阻害剤を提供する。
本発明によるマイクロアレイ
癌治療薬または化学感作剤を同定するために、本発明はマイクロアレイの使用を提供する。
ある実施形態では、本発明のマイクロアレイは、化学感作剤を同定するために使用される。
別の実施形態では、本発明のマイクロアレイは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の癌関連性欠陥の存在について生検組織サンプルを試験するために使用される。
別の実施形態では、本発明のマイクロアレイは、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子経路の阻害剤についてスクリーニングするために使用される。
別の実施形態では、本発明のマイクロアレイは、ＦＡＮＣ−Ｄ２ユビキチンＥ３リガーゼの阻害剤についてスクリーニングするために使用される。
別の実施形態では、本発明は、本明細書において定義したように、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子経路内の癌関連性欠陥の存在についてスクリーニングする、癌を有するかまたは癌のリスクがある可能性がある患者に由来する生検組織サンプルを含む、組織マイクロアレイを提供する。好ましい実施形態では、本発明の組織マイクロアレイは、モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在についてスクリーニングするために使用される。
また別の実施形態では、本発明は、ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２／ＦＡＮＣＤ−１癌関連性欠陥を有する患者由来の生検組織サンプルを含む、組織マイクロアレイを提供する。
また別の実施形態では、本発明は、ＢＲＣＡ−１およびＢＲＣＡ−２／ＦＡＮＣＤ−１癌関連性欠陥を有していない患者由来の生検組織サンプルを含む、組織マイクロアレイを提供する。
「配列決定アレイ（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｒｒａｙ）」は、臨床サンプル内の突然変異を探索するために、当該遺伝子の全オープンリーディングフレームの領域を含有する。「転写プロファイリングアレイ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ａｒｒａｙ）」は、臨床サンプル内のｍＲＮＡの発現を測定するために、当該遺伝子の３’末端からの配列を有することができる。
転写プロファイリングアレイを使用して、経路における遺伝子各々に対応するｍＲＮＡレベルを調べることができる。例えば、例えばＦＡＮＣＦに対応する転写産物の１つが低下する乳癌または卵巣癌は、ＦＡＮＣＦ発現の低下に起因するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路における欠陥があることを示す。
マイクロアレイの構築
マイクロアレイの基質
本発明のある実施形態では、マイクロアレイまたはアレイは、様々な分子的手法を通してマイクロアレイの取扱いを容易にする基質を含んでいる。本明細書で使用するように、「分子的手法（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」とは、マイクロアレイを抗体、核酸プローブ、酵素、色原体、標識等の検査試薬または分子プローブと接触させることを意味する。ある実施形態では、分子的手法は、複数のハイブリダイゼーション、インキュベーション、固定ステップ、温度の変化（４℃から１００℃まで）、溶媒への曝露、および／または洗浄ステップを含む。
本発明のまた別の実施形態では、マイクロアレイは、生検組織サンプルをファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の様々な潜在的阻害剤、癌治療薬または化学感作剤に曝露させることを容易にするための基質を含む。
本発明のある実施形態では、マイクロアレイの基質は溶媒耐性である。本発明の別の実施形態では、基質は透明である。基質は、粒子、ストランド、沈降物、ゲル、シート、チューブ、球、ビーズ、容器、キャピラリー、パッド、スライス、フィルム、プレート、スライド、チップ等として存在する、生物学的、非生物学的、有機、無機、またはこれらのいずれかの組み合わせであってよい。基質は、好ましくは平坦または平面状であるが、別の様々な表面構造を取ってもよい。基質は、重合化ラングミュア・ブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）膜、機能化ガラス、Ｓｉ、Ｇｅ、ＧａＡｓ、ＧａＰ、Ｓｉ０２、ＳＩＮ４、変性シリコン、またはその他の非多孔性基質；ポリオレフィン、ポリアミド、ポリアクリルアミド、ポリエステル、ポリアクリルエステル、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン、ポリ酢酸ビニル等のプラスチック；ならびに、充填剤（ガラス充填剤等）、増量剤、安定剤、および／または酸化防止剤を含有するプラスチック組成物；セルロイド、セロファンもしくはウレアホルムアルデヒド樹脂、または酢酸セルロース、エチルセルロース等の他の合成樹脂、または他の透明ポリマーであってよい。他の基質材料は、本開示を検討すれば当業者には容易に明白になるであろう。
ある実施形態では、マイクロアレイ基質は剛性である；しかしながら、別の実施形態では、プロファイルアレイ基質は半剛性または柔軟性である（例えば、ポリカーボネート、酢酸セルロース、ポリ塩化ビニル等）。また別の実施形態では、アレイ基質は光学的に不透明であり、実質的には非蛍光性である。ナイロン（商標）またはニトロセルロース膜もまたアレイ基質として使用でき、ポリカーボネート、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリスルホン、セルロースとニトロセルロースの混合エステル等が含まれる。
基質のサイズおよび形状は、一般に様々であってよい。基質は、円板形、四角形、球形、円形等の便宜的な形状を有していてよい。しかしながら、好ましくは、基質は顕微鏡のステージ上に完全に適合する。１つの実施形態では、プロファイルアレイ基質は平面状である。本発明のある実施形態では、マイクロアレイ基質は１インチ×３インチ、７７×５０ｍｍ、または２２×５０ｍｍである。本発明の別の実施形態では、マイクロアレイ基質は少なくとも１０〜２００ｍｍ×１０〜２００ｍｍである。
基質の追加的な特徴
本発明のある実施形態では、基質は、識別因子（例、色鉛筆またはクレヨンのマーク、エッチングされたマーク、標識、バーコード、無線信号または電気信号を送信するためのマイクロチップ等）を配置するための場所を含む。１つの実施形態では、その場所はすりガラスを含む。ある実施形態では、マイクロチップは、同一性およびアレイ上のサブ位置のアドレスに関連する保存された情報、および／または、例えば予後、診断、病歴、家族の病歴、薬物療法、死亡年齢および死因等の組織が採取された個人に関する情報を含む保存された情報を含んでいるか、またはそれらにアクセスすることができるプロセッサーと連絡している。
サブ位置
マイクロアレイは複数のサブ位置を含んでいる。各サブ位置は、それらと安定性に結び付いている（例えば、少なくとも１つの分子的手法に曝露させた後に別のサブ位置に比較してその位置を保持することができる）組織を含んでいる。ある実施形態では、組織は、細胞レベル下の特徴（例えば、核、無傷細胞膜、オルガネラ、および／または他の細胞学的特徴）を識別するために少なくとも顕微鏡下で視認できる、すなわち組織が溶解していない、実質的に無傷の形態学的特徴を有する組織である。
本発明のある実施形態では、マイクロアレイは２〜１，０００個のサブ位置を含む。また別の実施形態では、マイクロアレイは２、５、１０、２０、２５、３０、４５、５０、５５、６０、６５、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０または１，０００個以上のサブ位置を含む。本発明のある実施形態では、各サブ位置は２〜１０ｍｍ離れている。本発明のまた別の実施形態では、各サブ位置は、２０〜６００ｍｍである少なくとも１つの寸法を含んでいる。サブ位置は、あらゆるパターンで構成されてよく、そして各サブ位置は一般にあらゆる形状（四角形、円形、楕円形、長円形、円板形、長方形、三角形等）であってよい。
好ましい実施形態では、サブ位置は、組織タイプに関する各サブ位置の同定がアレイ探知装置の使用によって確実にできるように、規則的な繰り返しパターン（例、行および列）で配置されている。ある実施形態では、アレイ探知装置は、各形状がアレイ内の各サブ位置の形状に対応する複数の形状を有しており、アレイ上の各サブ位置と同一の関係を維持しているテンプレートである。アレイ探知装置は、使用者が固有の座標によってアレイ上のサブ位置を容易に同定できる座標によってマークされる。本発明のある実施形態では、アレイ探知装置は透明なシート（例、プラスチック、アセテート等）である。本発明の別の実施形態では、アレイ探知装置は、それぞれの穴が形状およびアレイ上の各サブ位置への位置に対応する、複数の穴を含むシートである。
ある態様では、本発明はアレイを提供するが、ここで、このアレイを含む化合物は、例えばロボット型ＧＭＳ４１７アレイヤー（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社、カリフォルニア州）を使用してスポッティングされるように、固体支持体上にスポッティングされる。あるいは、スポッティングは、コンタクトプリンティング技術または当技術分野において知られている他の方法を使用して実施できる。
本発明によるマイクロアレイのタイプ
低分子アレイ
本発明の低分子マイクロアレイまたはアレイでは、低分子は固体支持体の表面と安定的に結び付いており、このとき支持体は柔軟性または剛性の固体支持体であってよい。「安定的に結び付いている（ｓｔａｂｌｙ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」とは、各低分子が結合および洗浄条件下で固体支持体に比して固有の位置を維持することを意味する。そこで、サンプルは支持体表面と非共有的または共有的に安定的に結び付いている。非共有的結合の例には、非特異的吸着、静電的相互作用（例、イオン対相互作用）に基づく結合、疎水性相互作用、水素結合相互作用、支持体表面に共有的に付着した特異的結合対メンバーを介しての特異的結合などが含まれる。共有結合の例には、低分子と剛性支持体の表面上に存在する官能基（例、−−ＯＨ）との間で形成された共有結合が含まれ、このとき前記官能基は天然型であってよい。基質の表面には、好ましくはリンカー分子の層を備えることができるが、リンカー分子は本発明の要求される要素でないことが理解されるであろう。リンカー分子は、好ましくは、本発明のおよび基質上の低分子が低分子に結合および前記基質に曝露された分子と自由に相互作用するために十分な長さである。
各組成物中に存在する低分子の量は、前記アレイが使用されるアッセイ中に標的低分子の適正な結合および検出を提供するのに十分であろう。一般に、アレイの固体支持体と安定的に結び付いている各低分子の量は、少なくとも約０．１ｐｇ、好ましくは少なくとも約０．５ｐｇ、およびより好ましくは少なくとも約１ｐｇであるが、このときこの量は１，０００ｐｇ以上と多くてもよいが、通常は約１００ｐｇを超えない。好ましい実施形態では、マイクロアレイは１、２、５、７、１０、１５または２０低分子／ｃｍ２以上を超える密度を有する。
組織マイクロアレイ
本発明の好ましい実施形態では、マイクロアレイもしくはアレイは、ヒト組織サンプルを含む。本発明によるマイクロアレイは、各サブ位置が少なくとも１つの既知の生物学的特徴（例、組織タイプ等）を有する組織サンプルを含む、複数のサブ位置を含む。本発明の好ましい実施形態では、複数のサブ位置は様々な腫瘍病期にある癌性組織を含む。
本発明のある実施形態では、個々のサブ位置にある癌性細胞は基礎をなす癌または癌を有する素因を有する個人由来である。
本発明のある実施形態では、個々のサブ位置にある癌性細胞は、ＢＲＣＡ−１および／またはＦＡＮＣＤ１／ＢＲＣＡ−２遺伝子内の癌関連性欠陥を有する個人由来である。
ある実施形態では、マイクロアレイは、単一患者由来の癌性細胞を含む少なくとも１つのサブ位置を含み、そして同一患者由来の他の組織および器官からの細胞を含む複数のサブ位置を含む。別の実施形態では、全員が同一の病理が原因で死亡した複数の個人由来、または同一薬剤を用いて治療されている個人（疾患から回復した、および／または回復していない個人を含む）由来の細胞を含むマイクロアレイが提供される。
本発明の別の実施形態では、マイクロアレイは癌に加えて、形質を共有する個人由来の細胞を含む複数のサブ位置を含む。本発明のある実施形態では、共有する形質は性別、年齢、病理、病理への素因、感染性疾患（例、ＨＩＶ）への曝露、血縁関係、同一疾患に起因する死亡、同一薬剤による治療、化学療法または照射療法への曝露、ホルモン療法への曝露、手術への曝露、同一環境条件への曝露、同一の遺伝的変化または変化群、同一遺伝子または同一遺伝子群の発現である。
本発明のまた別の実施形態では、マイクロアレイの各サブ位置は癌の家族歴を共有する家系の様々なメンバー（例えば兄弟姉妹、双生児、従兄弟（従姉妹）、母親、父親、祖母、祖父、伯父（叔父）、伯母（叔母）等からなる群から選択される）由来の細胞を含む。本発明のまた別の実施形態では、「家系マイクロアレイ（ｐｅｄｉｇｒｅｅ ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ）」は環境が適合した対照（例、夫、妻、養子、継父・継母等）を含む。本発明のさらにまた別の実施形態では、マイクロアレイは、例えば過体重の喫煙者、末梢血管疾患のある糖尿病患者、疾患（例、鎌状赤血球貧血、テイ・サックス病、重症複合型免疫不全症）への特定素因を有する個人等の、対象となる特定患者の人口統計上の集団を表す複数の形質の反映であるが、このとき各群に含まれる個人は癌を有する。
本発明の好ましい実施形態では、マイクロアレイはヒト生検組織を含む。
本明細書に開示したＦＡＮＣＤ２−／−。１つの実施形態では、マイクロアレイはそのようなマウス由来の複数の組織を含んでいる。本発明の別の実施形態では、マイクロアレイは、本明細書に開示したＦＡＮＣＤ２−／−であり、そして癌治療（例、薬物、抗体、タンパク質療法、遺伝子療法、アンチセンス療法等）で治療されている、マウス由来の組織を含む。
化学感作剤および新規癌治療薬のスクリーニング
本発明のマイクロアレイは、化学感作剤および癌治療薬をスクリーニングするために使用される。使用されるスクリーニング方法は、実施例１５および１６に開示した。
化学感作剤への耐性の測定
シスプラチンにより治療される腫瘍細胞内のＦＡＮＣＦ遺伝子のメチル化は、ＦＡＮＣＦ遺伝子発現の抑制を生じさせ、そしてこれにより腫瘍細胞のＤＮＡ損傷修復機構の崩壊を引き起こし、シスプラチンへの耐性を生じさせる。このため本発明は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のいずれかのメチル化状態の決定方法を提供する（実施例１９を参照）。好ましい実施形態では、本発明は、１以上の化学療法用化合物への腫瘍の耐性の程度の測定値としてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子のメチル化状態を決定するために、１以上の化学療法用化合物を用いて治療されている患者由来の生検組織サンプルのマイクロアレイを提供する。遺伝子のＤＮＡメチル化を測定する方法は、当技術分野においてよく知られている（米国特許第６，２００，７５６号；第６，３３１，３９３号；第６，２５１，５９４を参照）。
本発明によるキット
本発明は、化学感作剤および癌治療薬についてスクリーニングするために有用なキット、ならびにファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子経路における癌関連性欠陥に関係する、癌または癌に対する素因について診断するために有用なキットを提供する。本発明による有用なキットには、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の単離ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチドプライマー対、プローブおよび阻害剤ならびにＦＡＮＣＤ２−特異的抗体が含まれる。さらに、このキットは対照の非メチル化ＦＡＮＣＤ２遺伝子を含有することができる。また別の実施形態では、本発明によるキットは卵巣癌の腫瘍細胞系を含有することができる。本発明によるすべてのキットは、上記の品目または品目の組み合わせおよびそのためのパッケージング材料を含む。キットにはまた、取扱説明書が含まれる。
本発明は以下の実施例を参照しながら説明するが、これらの実施例は例示するために提供するものであり、決して本発明を限定することを意図していない。当技術分野において知られている標準的な技術または以下に詳細に記載する技術を利用した。
実施例
実施例１：実施例２〜８で使用した実験プロトコール
細胞系および培養条件。エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）形質転換リンパ芽球は１５％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を添加したＲＰＭＩ培地中で維持し、５％ＣＯ２を含有する３７℃の加湿大気中で増殖させた。対照リンパ芽球系（ＰＤ７）およびＦＡリンパ芽球系（ＦＡ−Ａ（ＨＳＣ７２）、ＦＡ−Ｃ（ＰＤ−４）、ＦＡ−Ｄ（ＰＤ−２０）、ＦＡ−Ｆ（ＥＵＦＡ１２１）、およびＦＡ−Ｇ（ＥＵＦＡ３１６））については以前に記載されている（ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９８）、ｖｏｌ．２０、ｐ２８１〜２８３）（Ｗｈｉｔｎｅｙら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９５）ｖｏｌ．１１、３４１〜３４３）（Ｙａｍａｓｈｉｔａら，Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．，（１９９４）ｖｏｌ．９１、６７１２〜６７１６）（ｄｅ Ｗｉｎｔｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，（２００１）、ｖｏｌ．５７、１３０６〜１３０８）。ＰＤ８１は、ＦＡ−Ａ患者由来のリンパ芽球細胞系である。ＳＶ４０形質転換ＦＡ線維芽細胞のＧＭ６９１４、ＰＤ４２６、ＦＡＧ３２６ＳＶおよびＰＤ２０ＦならびにＨｅＬａ細胞は、１５％ＦＣＳを添加したＤＭＥＭ中で増殖させた。ＦＡ細胞（リンパ芽球および線維芽細胞の両方）は、対応するＦＡＮＣ ｃＤＮＡを含有するｐＭＭＰレトロウイルスベクターを用いて機能的に相補化し、そして機能的相補性はＭＭＣアッセイによって確認した（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９）ｖｏｌ．１９、ｐ４８６６〜４８７３）（Ｋｕａｎｇら，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），ｖｏｌ．９６、ｐ１６２５〜１６３２）。
細胞周期の同調化。ＨｅＬａ細胞、ＧＭ６９１４細胞、およびｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＡレトロウイルスを用いて補正したＧＭ６９１４細胞は、小さな変更を加えて、以前に記載された二重チミジンブロック法によって同調化した（Ｋｕｐｆｅｒら，Ｂｌｏｏｄ，（１９９７）、ｖｏｌ．９０、ｐ１０４７〜１０５４）。簡単に言えば、細胞は、Ｇ１／Ｓ境界期で細胞周期を停止させるために、２ｍＭチミジンを用いて１８時間、チミジン無含有培地を用いて１０時間、および追加の２ｍＭチミジンを用いて１８時間処理した。細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄し、次にＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中に遊離させ、種々の時間間隔で分析した。
あるいは、ＨｅＬａ細胞は、後期Ｇ１期において同調化させるために０．５ｍＭミモシン（Ｓｉｇｍａ）を用いて２４時間処理し（Ｋｒｕｄｅ，１９９９）、ＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中に遊離させた。Ｍ期における同調化のためには、ノコダゾールブロック法を使用した（Ｒｕｆｆｎｅｒら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９）、ｖｏｌ．１９、ｐ４８４３〜４８５４）。細胞は０．１μｇ／ｍＬノコダゾール（Ｓｉｇｍａ）を用いて１５時間処理し、そして非付着性細胞はＰＢＳを用いて２回洗浄し、ＤＭＥＭ＋１５％ＦＣＳ中で再プレーティングした。
細胞周期の分析。トリプシン処理細胞を０．５ｍＬのＰＢＳ中に再懸濁させ、５ｍＬの氷温エタノールを加えることにより固定した。次に細胞は１％ウシ血清アルブミン分画Ｖ（１％ＢＳＡ／ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ）を含むＰＢＳを用いて２回洗浄し、０．２４ｍＬの１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中に再懸濁させた。３８ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）および３０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅフリーＲＮａｓｅＡ（Ｓｉｇｍａ）中に溶解させた３０μＬの５００μ／ｍＬヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ）を加えた後、サンプルを３７℃で３０分間インキュベートした。ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によりＤＮＡ含量を測定し、データをＣｅｌｌＱｕｅｓｔおよびＭｏｄｆｉｔ ＬＴプログラム（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。
抗ＦＡＮＣＤ２抗血清の生成。ＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清は、抗原源としてＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を使用して生成した。５’フラグメントは、プライマー（配列番号９５）ＤＦ４ＥｃｏＲＩ（５’ＡＧＣＣＴＣｇａａｔｔｃＧＴＴＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡ−３’）および（配列番号９６）ＤＲ８１６Ｘｈ（５’−ＧＧＴＡＴＣｃｔｃｇａｇＴＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡ−３’）を用いて、完全長ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。結果として生じた、ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのアミノ末端２７２アミノ酸をコードする８４１ｂｐのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを用いて消化し、プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位内にサブクローニングした。予想サイズが（５４ｋＤ）のＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＤＨ５γ中で発現させ、グルタチオン−Ｓ−セファロースで精製し、ニュージーランドホワイト・ウサギを免役するために使用した。ＦＡＮＣＤ２特異的免疫抗血清は、ＧＳＴタンパク質を装填したＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を通過させ、そしてＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を装填したＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカラムを通過させることによりアフィニティー精製した。
抗ＦＡＮＣＤ２ ＭｏＡｂｓの生成。２つの抗ＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体を以下の通りに生成した。Ｂａｌｂ／ｃマウスはＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を用いて免役したが、これはＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清（Ｅ３５）を生成するために使用したものと同一の融合タンパク質であった。動物は融合前４日間にわたり免疫原を用いて追加免役し、脾細胞を採取し、骨髄腫細胞を用いたハイブリダイゼーションを実施した。ハイブリドーマ上清を収集し、初期スクリーンとして標準ＥＬＩＳＡアッセイを使用し、二次スクリーンとしてＦＡＮＣＤ２の免疫ブロット分析法を使用してアッセイした。その後の研究のために、２つの抗ヒトＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体（ＭｏＡｂｓ）（ＦＩ１７およびＦＩ１４）を選択した。２つの陽性細胞系由来のハイブリドーマ上清は、遠心により清澄化した。上清はウェスタンブロット法のためのＭｏＡｂｓとして使用した。ＭｏＡｂｓはＩｇＧに対するアフィニティーカラムを使用して精製した。ＭｏＡｂｓは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中の０．５ｍｇ／ｍＬストックとして保管した。抗ＨＡ抗体（ＨＡ．１１）はＢａｂｃｏ製であった。
免疫ブロッティング。細胞は１×サンプルバッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ６．８）、８６ｍＭの２−メルカプトエタノール、２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））を用いて溶解させ、５分間沸騰させ、そして７．５％ポリアクリルアミドＳＤＳゲル電気泳動にかけた。電気泳動後、タンパク質は、２５ｍＭのＴｒｉｓベース、２００ｍＭグリシン、２０％メタノールを充填したサブマージドトランスファー装置（ＢｉｏＲａｄ）を使用してニトロセルロースへ移した。ＴＢＳ−Ｔ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のＴｗｅｅｎ ２０）中の５％脱脂粉乳を用いてブロックした後、ＴＢＳ−Ｔ（アフィニティー精製抗ＦＡＮＣＤ２ポリクローナル抗体（Ｅ３５）もしくは抗ＨＡ（ＨＡ．１１）に対して１：１０００の希釈率、抗ＦＡＮＣＤ２マウスモノクローナル抗体ＦＩ１７に対して１：２００の希釈率）中に希釈した一次抗体と一緒に膜をインキュベートし、しっかりと洗浄し、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ）と一緒にインキュベートした。検出には化学ルミネセンスを使用した。
ＤＮＡ損傷の生成。Ｇａｍｍａ ｃｅｌｌ ４０装置を使用してγ線照射を行った。ＵＶ曝露は、培養培地を静かに吸引した後にＳｔｒａｔａｌｉｎｋｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用して達成した。マイトマイシンＣ処理のために、細胞は、表示した時間にわたり持続的にこの薬剤に曝露させた。ヒドロキシウレア（Ｓｉｇｍａ）を最終濃度が１ｍＭとなるまで２４時間にわたり添加した。
モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２の検出。ＨｅＬａ細胞（またはＦＡ−Ｇ線維芽細胞、ＦＡＧ３２６ＳＶ）は、ＦｕＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、製造業者のプロトコールにしたがってトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞を１５ｃｍ組織培養皿上でプレーティングし、培養皿１枚につき１５μｇのＨＡ−タグ標識ユビキチン発現ベクター（ｐＭＴ １２３）（Ｔｒｅｉｅｒら，Ｃｅｌｌ，（１９９４）、ｖｏｌ．７８、ｐ７８７〜７９８）を用いてトランスフェクトした。トランスフェクションの１２時間後、細胞は表示した濃度のＭＭＣ（０、１０、４０、１６０ｎｇ／ｍＬ）または表示した線量のＩＲ（０、５、１０、１０、２０Ｇｙ）を用いて処理した。ＭＭＣを用いた２４時間のインキュベーション後、またはＩＲ処理２時間後、全細胞抽出物は、プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）およびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で調製した。ＦＡＮＣＤ２（Ｅ３５）に対するポリクローナル抗体を使用して、免疫沈降（ＩＰ）は、各ＩＰが４ｍｇのタンパク質を含有するように標準化したことを除き、本質的には以前に記載された（Ｋｕｐｆｅｒら，１９９７）通りに実施した。ＩＰ反応における陰性対照として、同一ウサギからの免疫前血清を使用した。免疫ブロッティングは、抗ＨＡ（ＨＡ．１１）または抗ＦＡＮＣＤ２（ＦＩ１７）モノクローナル抗体を使用して実施した。
ユビキチンアルデヒド処理。ＨｅＬａ細胞は１ｍＭのヒドロキシウレアを用いて２４時間処理し、全細胞抽出物はプロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤を添加した溶解バッファー中で調製した。ＤＭＳＯ中６．７μＬの２５μＭユビキチンアルデヒド（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）または６．７μＬのＤＭＳＯを含む６７μＬの反応液中の２００μｇの細胞溶解物を、表示した期間にわたり３０℃または３７℃でインキュベートした。各サンプルに６７μＬの２×サンプルバッファーを添加し、これらのサンプルを５分間沸騰させ、７．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ＦＩ１７モノクローナル抗ヒトＦＡＮＣＤ２抗体を使用してＦＡＮＣＤ２に対して免疫ブロッティングした。
免疫蛍光顕微鏡検査。細胞は、ＰＢＳ中の２％パラホルムアルデヒドを用いて２０分間かけて固定し、続いてＰＢＳ中の０．３％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を用いて透過化処理した（１０分間）。ＰＢＳに溶解した１０％のヤギ血清、０．１％のＮＰ−４０（ブロッキングバッファー）中でブロックした後、ブロッキングバッファー中の適切な希釈率で特異的抗体を添加し、室温で２〜４時間インキュベートした。ＦＡＮＣＤ２は、アフィニティー精製Ｅ３５ポリクローナル抗体（１／１００）を使用して検出した。ＢＲＣＡ１を検出するためには、市販のモノクローナル抗体（Ｄ−９、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を２μｇ／ｍＬで使用した。引き続いて細胞をＰＢＳ＋０．１％ ＮＰ−４０中で３回洗浄し（各洗浄につき１０〜１５分間）、種特異的フルオレセインまたはテキサスレッド複合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ）をブロッキングバッファー中に希釈し（抗マウス１／２００、抗ウサギ１／１０００）、添加した。室温に１時間おいた後、さらに１０〜１５分間の洗浄を３回実施し、Ｖｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ（Ｖｅｃｔｏｒ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にスライドを載せた。Ｎｉｋｏｎ製顕微鏡で画像を記録し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐソフトウェアを使用して画像処理した。
減数分裂染色体の染色。１６〜２８日齢のオスのマウス由来の太糸期および複糸期精母細胞の表面塗抹標本は、（Ｐｅｔｅｒｓら，１９９７）が記載した通りに調製した。マウスＳＣＰ３タンパク質に対するポリクローナルヤギ抗体を使用して、減数分裂調製物中の軸状構造およびシナプトネマ構造を視覚化した。マウスＢＲＣＡ１に対するＭ１１８マウスモノクローナル抗体は、マウスをマウスＢＲＣＡ１タンパク質により免役することによる標準的な技術によって生成した。ＦＡＮＣＤを検出するために、アフィニティー精製Ｅ３５ウサギポリクローナル抗体を１：２００の希釈率で使用した。抗体インキュベーションおよび検出方法は、（Ｋｅｅｇａｎら，Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．，（１９９６）、ｖｏｌ．１０、ｐ２４２３〜２４３７）によって記載された通りに、（Ｍｏｅｎｓら，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９８７）、ｖｏｌ．１０５、ｐ９３〜１０３）のプロトコールの変法であった。検出のためには、ロバ−抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ−複合、ロバ−抗ウサギＩｇＧ−ＴＲＩＴＣ−複合、およびロバ−抗ヤギＩｇＧ Ｃｙ５−複合二次抗体の組み合わせを使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。すべての調製物は、４’，６’ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ、Ｓｉｇｍａ）を用いて対比染色し、ＤＡＢＣＯ（Ｓｉｇｍａ）アンチフェード液中に置いた。調製物は、Ｎｉｋｏｎ Ｅ１０００顕微鏡（６０Ｘ ＣＦＩプランアポクロマートおよび１００Ｘ ＣＲプランフルオール油浸対物レンズ）で検査した。各蛍光色素（ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ｃｙ５およびＤＡＰＩ）画像は、冷却ＣＣＤカメラ（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ ＭｉｃｒｏＭａｘ）を制御するＩＰＬａｂソフトウェア（Ｓｃａｎａｌｙｔｉｃｓ）を介して８００×１０００ピクセル１２−ビットのソース画像として個別に記録し、個別の１２ビットのグレースケール画像をリサンプルし、２４−ビット疑似カラー画像化し、Ａｄｏｂｅ Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐを使用して結合した。
実施例２：ＦＡ遺伝子は共通細胞経路において相互作用する
正常リンパ芽球は、短鎖型（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ、１５５ｋＤ）および長鎖型（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ、１６２ｋＤ）の、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームを発現する。図１には、全細胞抽出物をリンパ芽球系から調製し、抗ＦＡＮＣＤ２抗血清を用いて細胞タンパク質を免疫沈降させたときに何が起こるのかを示した図である。正常野生型細胞は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームである低分子量アイソフォームＦＡＮＣＤ２−Ｓ（１５５ｋＤアイソフォーム）および高分子量アイソフォームＦＡＮＣＤ２−Ｌ（１６２ｋＤアイソフォーム）を発現する。ＦＡＮＣＤ２−Ｓは、クローン化ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡの一次翻訳産物である。本発明者らは、次にＦＡＮＣＤ２アイソフォームの発現について一連の大規模なＦＡリンパ芽球および線維芽細胞を評価した（表５）。対応するＦＡ ｃＤＮＡを用いたこれらのＦＡ細胞系の補正は、高分子量アイソフォームＦＡＮＣＤ２−Ｌの機能的相補化および修復を生じさせた。
以前に記載されたように、ＦＡ細胞はＤＮＡ架橋剤であるＭＭＣに、そして一部の場合には電離放射線（ＩＲ）に感受性である。興味深いことに、複数の相補性群（Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＦ）由来のＦＡ細胞は、ＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームしか発現しなかった（図１Ａ、レーン３、７、９、１１）。ＢおよびＥ相補性群由来のＦＡ細胞もまたＦＡＮＣＤ２−Ｓしか発現しない。対応するＦＡＮＣ ｃＤＮＡを用いたこれらのＦＡ細胞のＭＭＣおよびＩＲ感受性の機能的補正は、ＦＡタンパク質複合体を回復させ（Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら，１９９９）、そして高分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）を回復させた（図１Ａ、レーン４、８、１０、１２）。これらを総合すると、これらの結果は、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＦ、およびＦＡＮＣＧを含有するＦＡタンパク質複合体がＦＡＮＣＤ２の２つのアイソフォームの発現を直接的または間接的に調節することを証明している。このため、６つのクローン化ＦＡ遺伝子が共通経路で相互作用すると思われる。
実施例３：ＦＡタンパク質複合体はＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のために必要である
ＦＡＮＣＤ２の高分子量アイソフォームは、ＦＡＮＣＤ２ ｍＲＮＡの選択的スプライシングまたはＦＡＮＣＤ２タンパク質の翻訳後修飾を含む、１以上の機序から生じさせることができた。ホスファターゼを用いた処理はＦＡＮＣＤ２−ＬをＦＡＮＣＤ２−Ｓへと転換させず、これはリン酸化だけではそれらの分子量において観察された差の原因とはならないことを証明している。
ＦＡＮＣＤ２の他の可能性のある翻訳後修飾を同定するために、本発明者らは最初に、ＦＡＮＣＤ２−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌへの転換を調節する細胞条件を探った（図１Ｂ、Ｃ）。ＦＡ細胞はＭＭＣおよびＩＲに対して感受性であるので、これらの物質が正常細胞中でのＦＡＮＣＤ２−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌへの転換を調節する可能性があると推論した。興味深いことに、ＭＭＣ（図１Ｂ、レーン１〜６）またはＩＲ（図１Ｃ、レーン１〜６）を用いて処理したＨｅＬａ細胞は、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの発現において用量依存性増加を示した。
ＦＡＮＣＤ２−ＬがＦＡＮＣＤ２−Ｓのユビキチン化アイソフォームであるかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした（Ｔｒｅｉｅｒら，１９９４）。ＭＭＣ（図１Ｂ、レーン７〜１０）またはＩＲ（図１Ｃ、レーン７〜１０）への細胞の曝露は、ＦＡＮＣＤ２のＨＡ−ユビキチン結合における用量依存性増加を生じさせた。ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームだけが抗ＨＡ抗体と免疫反応性であり、ＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームは免疫反応性ではなかった。ＦＡＮＣＤ２はＦＡ細胞中でユビキチン化されなかったが、これらの細胞が機能的に相補化されるとＦＡＮＣＤ２ユビキチン化が回復した。ＦＡＮＣＤ２はＦＡ細胞中でユビキチン化されなかったが、これらの細胞が機能的に相補化されるとＦＡＮＣＤ２ユビキチン化が回復した。ＦＡＮＣＤ２−ＳアイソフォームおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームは７ｋＤ相違するので、ＦＡＮＣＤ２−ＬはおそらくＦＡＮＣＤ２の内部のリジン残基へのアミド結合によって共有的に結合した単一のユビキチン部分（７６アミノ酸）を含有している。
モノユビキチン化を確認するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞からＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質を単離し、質量分析によってそのトリプシンフラグメントを分析した（Ｗｕら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０００）、ｖｏｌ．２８９、ｐ１１ａ）。ユビキチン・トリプシンフラグメントは明確に同定でき、さらにモノユビキチン化部位（ＦＡＮＣＤ２のＫ５６１）も同定できた。興味深いことに、このリジン残基はヒト、ショウジョウバエ、およびＣ．エレガンス（線虫の一種）由来のＦＡＮＣＤ２配列間で保存されており、これはこの部位のユビキチン化が複数の生物におけるＦＡ経路に重要であることを示唆している。このリジン残基、ＦＡＮＣＤ２（Ｋ５６１Ｒ）の突然変異は、ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の消失を生じさせた。
実施例４：ＦＡＮＣＤ２を含有する核内フォーカスの形成は無傷ＦＡ経路を必要とする
本発明者らは、補正されていないＭＭＣ感受性ＦＡ線維芽細胞および機能的相補化線維芽細胞中でのＦＡＮＣＤ２タンパク質の免疫蛍光パターンを試験した（図２）。
補正されたＦＡ細胞はＦＡＮＣＤ２−ＳアイソフォームおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームのどちらも発現した（図２Ａ、レーン２、４、６、８）。内因性ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、ヒト細胞の核内でもっぱら観察され、細胞質染色は明白ではなかった（図２Ｂ、ａ〜ｈ）。ＰＤ−２０（ＦＡ−Ｄ）細胞は、免疫ブロッティングによるこれらの細胞中のＦＡＮＣＤ２タンパク質の発現低下（図２Ａ、レーン７）に一致して、核の免疫蛍光を低下させた（図２Ｂ、ｄ）。染色体導入法によりＦＡＮＣＤ２遺伝子を用いて機能的に補正したＰＤ２０細胞では、ＦＡＮＣＤ２タンパク質は２つの核パターンで染色した。補正された大多数の細胞は、染色の拡散性核パターンを有しており、細胞の小さな分画は核内フォーカスについて染色した（ドットを参照、パネルｈ）。両方の核パターンは、３つの独立して得られた抗ＦＡＮＣＤ２抗血清を用いて観察された（１つはポリクローナル、２つはモノクローナル抗血清）。サブタイプＡ、Ｇ、およびＣからのＦＡ線維芽細胞は、ＦＡＮＣＤ２核免疫蛍光の拡散性パターンだけを示した。ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＧ、またはＦＡＮＣＣ ｃＤＮＡを用いたこれらの細胞の機能的相補化は、それぞれ、これらの細胞のＭＭＣ耐性を回復させ（表６）、そして一部の細胞における核内フォーカスを回復させた。このため、高分子量ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの存在はＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの存在と相関しており、これはモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームだけがこれらのフォーカスに選択的に局在することを示唆している。
実施例５：ＦＡＮＣＤ２タンパク質は細胞周期のＳ期中に核内フォーカスへ局在化する
ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスを含有していたのは非同調化機能的相補化細胞の１分画だけであるので、本発明者らは、これらのフォーカスが細胞周期中の不連続の時点に集合する可能性があると推測した。この仮説を試験するため、本発明者らは、同調化細胞内のＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームおよびＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの生成について試験した（図３）。ＨｅＬａ細胞はＧ１／Ｓ境界期で同調化させ、Ｓ期へ遊離させ、そしてＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの生成について分析した（図３Ａ）。ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームは、後期Ｇ１期中およびＳ期を通して特異的に発現した。同調化した、相補化されていないＦＡ細胞（ＦＡ−Ａ線維芽細胞、ＧＭ６９１４）は正常レベルから増加レベルのＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質を発現したが、細胞周期中のいずれの時点においてもＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現することはできなかった。ＦＡＮＣＡ ｃＤＮＡを用いた安定性トランスフェクションによるこれらのＦＡ−Ａ細胞の機能的相補化はＦＡＮＣＤ２−ＬのＳ期特異的発現を回復させた。ＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームのＳ期特異的発現は、ＨｅＬａ細胞がノコダゾール停止（図３Ｂ）またはミモシン曝露（図３Ｂ）等の他の方法によって同調化されたときに確認された。有糸分裂期に停止した細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現しなかったが、これはＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームが細胞分割前に取り除かれているか、または分解されていることを示唆している（図３Ｂ、有糸分裂）。これをまとめると、これらの結果は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のモノユビキチン化が細胞周期中に高度に調節されること、そしてこの修飾には無傷ＦＡ経路が必要とされることを証明している。
ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの細胞周期依存性発現はまた、ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの生成と相関していた（図３Ｃ）。ノコダゾール停止（有糸分裂期）細胞はＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームを発現せず、ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスを示さない（図３Ｃ、０時間）。これらの同調化細胞にＳ期を超えさせると（１５〜１８時間）、ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの増加が観察された。
実施例６：ＦＡＮＣＤ２タンパク質はＤＮＡ損傷に反応して核内フォーカスに局在化する
本発明者らは、ＤＮＡ損傷に反応したＦＡＮＣＤ２−ＬアイソフォームおよびＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの蓄積について試験した（図４）。以前の研究は、ＦＡ細胞はＤＮＡ鎖間架橋（ＭＭＣ）または二本鎖切断（ＩＲ）を惹起する物質に感受性であるが、紫外線（ＵＶ）および単官能性アルキル化剤に対しては比較的耐性であることを証明している。ＭＭＣは、非同調化ＨｅＬａ細胞中でのＦＡＮＣＤ２−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌへの転換を活性化させた（図４Ａ）。ＦＡＮＣＤ２−Ｌへの最高の転換はＭＭＣ曝露の１２〜２４時間後に発生し、これは最高ＦＡＮＣＤ２核内フォーカス生成の時間と相関していた。ＦＡＮＣＤ２−Ｌの増加に対応するＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの増加が生じた。電離放射線はまた、ＦＡＮＣＤ２フォーカスにおける対応する増加とともに、ＨｅＬａ細胞中のＦＡＮＣＤ２−Ｌにおける時間依存性および用量依存性増加を活性化した（図４Ｂ）。意外にも、紫外（ＵＶ）光線は、ＦＡＮＣＤ２フォーカスにおける対応する増加とともに、ＦＡＮＣＤ２−ＳからＦＡＮＣＤ２−Ｌへの時間依存性および用量依存性増加を活性化した（図４Ｃ）。
本発明者らは、ＤＮＡ損傷がＦＡ細胞に及ぼす効果を試験した（図４Ｄ）。複数の相補性群（Ａ、Ｃ、およびＧ）由来のＦＡ細胞は、ＭＭＣまたはＩＲ曝露に反応してＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームを活性化できず、さらにＦＡＮＣＤ２核内フォーカスを活性化できなかった。これらのデータは、ＦＡ細胞の細胞感受性は、少なくとも一部には、それらがＦＡＮＣＤ２−ＬおよびＦＡＮＣＤ２核内フォーカスを活性化するのに失敗することから生じることを示唆している。
実施例７：活性化ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１タンパク質の共局在化
ＦＡＮＣＤ２と同様に、乳癌感受性タンパク質であるＢＲＣＡ１は増殖性細胞中でアップレギュレートされ、Ｓ期中の翻訳後修飾によって、またはＤＮＡ損傷に反応して活性化される。ＢＲＣＡは、高度に酸性のＨＭＧ様ドメインを含有するカルボキシ末端２０アミノ酸を有しており、これはクロマチン修復について可能性のある機序を示唆している。ＢＲＣＡ１タンパク質は、ＲＡＤ５１またはＮＢＳ／Ｍｒｅ１１／ＲＡＤ５０複合体等のＤＮＡ修復に関係する他のタンパク質と共に、ＩＲ誘導性フォーカス（ＩＲＩＦ）に共局在化する。ＢＲＣＡ１における二対立遺伝子突然変異をもつ細胞は、ＤＮＡ修復における欠陥を有しており、ＩＲおよびＭＭＣ等のＤＮＡ損傷剤に感受性である（表５）。これらをまとめると、これらのデータは、ＦＡＮＣＤ２タンパク質とＢＲＣＡ１タンパク質との間の可能性のある機能的相互作用を示唆している。ＢＲＣＡフォーカスは、ＤＮＡ修復（ＢＲＣＡ１）およびチェックポイント機能（ＮＢＳ）に関係するＡＴＭおよびＡＴＭ基質を含む、大きな（２ｍＤａ）複数タンパク質複合体である。
活性化ＦＡＮＣＤ２タンパク質がＢＲＣＡ１タンパク質と共局在化するかどうかを決定するために、本発明者らは、ＨｅＬａ細胞の二重免疫標識法を実施した（図５）。電離放射線の不存在下では、約３０〜５０％の細胞がＢＲＣＡ１核内フォーカスを含有していた（図５Ａ）。これとは対照的に、ＦＡＮＣＤ２ドットを含有していたのは、Ｓ期を超えるまれな細胞だけであった（ｂ、ｅ）。これらの核内フォーカスはまた、ＢＲＣＡ１およびＦＡＮＣＤ２の両方に対する抗血清と免疫反応性でもあった（ｃ、ｆ）。ＩＲ曝露後には、核内フォーカスを含有する細胞数および１細胞当たりのフォーカスの数の増加が生じた。これらの核内フォーカスは、ＩＲの不存在下で観察されたフォーカスより大きく、より蛍光性であった。さらに、これらの核内フォーカスはＢＲＣＡ１およびＦＡＮＣＤ２タンパク質の両方を含有していた（ｉ、ｌ）。ＦＡＮＣＤ２−ＬとＢＲＣＡ１との相互作用は、ＩＲに曝露された指数関数的に増殖するＨｅＬａ細胞からのタンパク質の共免疫沈降反応（図５Ｂ）によってもさらに確認された。
本発明者らは、ＢＲＣＡ１発現がＦＡＮＣＤ２−Ｌおよび核内フォーカスの生成に及ぼす効果について試験した（図６）。ＢＲＣＡ１（−／−）細胞系であるＨＣＣ１９３７は、カルボキシ末端切断を含むＢＲＣＡ１タンパク質の突然変異型を発現する。これらの細胞は低レベルのＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現したが（図６Ａ）、ＩＲはＦＡＮＣＤ２−Ｌレベルの増加を活性化できなかった。さらに、これらの細胞はＩＲ誘導性ＦＡＮＣＤ２フォーカスの数を低下させた（図６Ｂ、パネルｃ、ｄ）。ＢＲＣＡ１ ｃＤＮＡを用いた安定性トランスフェクションによるこれらのＢＲＣＡ１（−／−）細胞の補正は、ＩＲ誘導性ＦＡＮＣＤ２ユビキチン化および核内フォーカスを回復させた（図６Ｂ、パネルｋ、ｌ）。これらのデータは、野生型ＢＲＣＡ１タンパク質がＩＲ誘導性ＦＡＮＣＤ２ドット生成の「形成体（ｏｒｇａｎｉｚｅｒ）」として必要であることを示唆しており、さらに、これらのタンパク質間の機能的相互作用を示唆している。
実施例８：ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１の減数分裂染色体上における共局在化
減数分裂細胞中のＦＡＮＣＤ２とＢＲＣＡ１との結び付きは、これらのタンパク質がまた、減数分裂前期中に共局在化する可能性があることを示唆した。以前の研究は、ＢＲＣＡ１タンパク質が接合期および太糸期精母細胞中のヒト・シナプトネマ構造の非シナプス／軸状構造上に集中していることを証明した。減数分裂細胞中のＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１の可能性のある共局在化について試験するために、本発明者らは、ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１タンパク質の存在について後期太糸期および早期複糸期のマウス精母細胞の表面塗抹標本を試験した（図７）。本発明者らは、ウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体Ｅ３５が後期太糸期（図７ａ）および複糸期（図７ｄ、７ｅおよび７ｇ）におけるＸおよびＹ染色体の不対軸を特異的に染色することを見いだした。同一実験条件下で、免疫前血清はシナプトネマ構造を染色しなかった（図７ｂおよび７ｃ）。Ｍ１１８抗ＢＲＣＡ１抗体はマウス太糸期および複糸期精母細胞中の不対性染色体を染色した（図７ｆおよび７ｈ）。性染色体の非シナプス軸のＦＡＮＣＤ２ Ａｂ染色は中断され、数珠玉構造の外観を示した（図７ｇ）。２０の太糸期核の連続試験は、これらの抗ＦＡＮＣＤ２フォーカスの大半（〜６５％）が強度の抗ＢＲＣＡ１染色の領域と共局在することを示し、さらにこれらのタンパク質間の相互作用を支持している（図７ｇ、７ｈ、および７ｉ）。これらの結果は、クロマチンに結合するＦＡＮＣタンパク質（活性化ＦＡＮＣＤ２）の最初の例を提供する。
実施例９：ＦＡＮＣＤ２についてＤＮＡおよびタンパク質配列を入手および分析するための実験プロトコール
ノーザンハイブリダイゼーション。ヒト成人および胎児複数組織ｍＲＮＡブロットは、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から購入した。ブロットは、ＥＳＴクローンＳＧＣ３４６０３由来の３２Ｐ標識ＤＮＡを用いて調査した。標準的なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を使用した。アクチンｃＤＮＡプローブを用いてブロットを再ハイブリダイズすることにより同等の負荷を確認した。
突然変異分析。全細胞ＲＮＡは市販キット（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ）を使用して逆転写させた。ＦＡＮＣＤ２の５’末端部分は、ネステッドＰＣＲプロトコールを用いて、結果として生じた患者および対照ｃＤＮＡから増幅させた。第１ラウンドは、プライマー（配列番号９７）ＭＧ４７１ ５’−ＡＡＴＣＧＡＡＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＧ−３’および（配列番号９８）ＭＧ４５７ ５’−ＧＡＧＡＡＣＡＣＡＴＧＡＡＴＧＡＡＣＧＣ−３’を用いて実施した。このラウンドからのＰＣＲ産物は、プライマー（配列番号９９）ＭＧ４９２ ５’−ＧＧＣＧＡＣＧＧＣＴＴＣＴＣＧＧＡＡＧＴＡＡＴＴＴＡＡＧ−３’および（配列番号１００）ＭＧ４７２ ５’−ＡＧＣＧＧＣＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＴＧ−３’を用いた次のラウンドのために１：５０で希釈した。ＰＣＲ条件は次の通りであった：９４℃で３分間、その後９４℃で４５秒間、５０℃で４５秒間、７２℃で３分間を２５サイクルおよび最後に７２℃で５分間。この遺伝子の３’部分は、プライマー（配列番号１０１）ＭＧ４７４ ５’−ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧ−３’および（配列番号１０２）ＭＧ４７５ ５’−ＴＧＧＣＧＧＣＡＧＡＣＡＧＡＡＧＴＧ−３’を用いた以外は上記の通りに増幅させた。第２ラウンドは、（配列番号１０３）ＭＧ４９１ ５’−ＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＧ−３’および（配列番号１０４）ＭＧ４７６ ５’−ＧＴＧＣＣＡＧＡＣＴＣＴＧＧＴＧＧＧ−３’を用いて実施した。ＰＣＲ産物をゲル精製し、ｐＴ−Ａｄｖベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）内にクローニングし、内部プライマーを用いて配列決定した。
対立遺伝子特異的アッセイ。対立遺伝子特異的アッセイは、ＰＤ２０ファミリーおよび２９０の対照サンプル（＝５８０染色体）中で実施した。ＰＤ２０ファミリーは混合北欧家系のファミリーであり、ＶＵ００８はオランダのファミリーである。対照ＤＮＡサンプルはＣＥＰＨファミリーの非血縁個人（ｎ＝９５）由来サンプル、外胚葉性異形成（ｎ＝９５）またはファンコニ貧血（ｎ＝９４）のどちらかの非血縁の北米ファミリー由来のサンプルであった。このＰＤ２０ファミリーにおける母性ｎｔ３７６ａ→ｇ突然変異は、新規ＭｓｐＩ制限部位を作り出した。ゲノムＤＮＡについては、このアッセイは、エクソン４に局在するプライマー（配列番号１０５）ＭＧ７９２ ５’−ＡＧＧＡＧＡＣＡＣＣＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣ−３’およびイントロン５にあるプライマー（配列番号１０６）Ｍ０８０３ ５’−ＧＡＡＧＴＴＧＧＣＡＡＡＡＣＡＧＡＣＴＧ−３’を使用してゲノムＤＮＡを増幅させるステップを含んでいた。ＰＣＲ産物のサイズは３４０ｂｐであり、突然変異が存在する場合はＭｓｐＩ消化後に２つのフラグメントである２８３ｂｐおよび５７ｂｐを産生した。復帰突然変異ｃＤＮＡクローンを分析するために、ＰＣＲはプライマー（配列番号１０７）ＭＧ９２４ ５’−ＴＧＴＣＴＴＧＴＧＡＧＣＧＴＣＴＧＣＡＧＧ−３’および（配列番号１０８）ＭＧ７５３ ５’−ＡＧＧＴＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧＧＣＡＧＧＣ−３’を用いて実施した。ＰＤ２０における父性エクソン３７突然変異（Ｒ１２３６Ｈ）およびＶＵ００８におけるエクソン１２ミスセンス突然変異（Ｒ３０２Ｗ）を、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ハイブリダイゼーションによって試験した（Ｗｕら，ＤＮＡ，（１９８９）、ｖｏｌ．８、ｐ１３５〜１４２）。エクソン１２アッセイのために、ゲノムＤＮＡはプライマー（配列番号１０９）ＭＧ９７９ ５’−ＡＣＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＣＣＡＣＴＡＴＧ−３’および（配列番号１１０）ＭＧ９８４ ５’−ＣＣＴＧＴＧＴＧＡＧＧＡＴＧＡＧＣＴＣＴ−３’を用いて増幅させた。エクソン３７のためには、プライマー（配列番号１７１）ＭＧ８１８ ５’−ＡＧＡＧＧＴＡＧＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＴＡＣ−３’および（配列番号１７２）ＭＧ８１３ ５’−ＣＣＡＡＡＧＴＣＣＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧ−３’を使用した。野生型（配列番号１１１）（Ｒ３０２Ｗのためには５’−ＴＴＣＴＣＣＣＧＡＡＧＣＴＣＡＧ−３’およびＲ１２３６Ｈのためには（配列番号１１２）５’−ＴＴＴＣＴＴＣＣＧＴＧＴＧＡＴＧＡ−３’）、ならびに突然変異型（配列番号１１１）（Ｒ３０２Ｗのためには５’−ＴＴＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＡＧ−３’およびＲ１２３６Ｈのためには（配列番号１１２）５’−ＴＹＴＣＴＴＣＣＡＴＧＴＧＡＴＧＡ−３’）オリゴヌクレオチドは、γ３２Ｐ−［ＡＴＰ］を用いて末端標識し、以前に記載した新規のＤｄｅＩ部位としてドット・ブロットされた標的ＰＣＲ産物にハイブリダイズした。野生型ＰＣＲ産物は１１７および７１ｂｐ産物へと消化するが、他方、突然変異型対立遺伝子は長さ５６、６１および７１ｂｐの３つのフラグメントを産生する。上記のアッセイすべてにおけるＰＣＲは、９４℃で２５秒間、５０℃で２５秒間および７２℃で３５秒間からなる３７サイクルについて５０ｎｇのゲノムＤＮＡを用いて実施した。
抗ＦＡＮＣＤ２抗血清の生成。ＦＡＮＣＤ２に対するウサギポリクローナル抗血清は、抗原源としてＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ末端）融合タンパク質を使用して生成した。５’フラグメントは、プライマー（配列番号１１３）ＤＦ４ＥｃｏＲＪ（５’−ＡＧＣＣＴＣｇａａｔｔｃＧＵＴＣＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＴＣＡ−３’）および（配列番号１１４）ＤＲ８１６Ｘｈ（５’−ＧＧＴＡＴＣｃｔｃｇａｇＴＣＡＡＧＡＣＧＡＣＡＡＣＴＴＡＴＣＣＡＴＣＡ−３’）を用いて、完全長ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡからポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅させた。結果として生じた、ＦＡＮＣＤ２ポリペプチドのアミノ末端２７２アミノ酸をコードする８４１ｂｐのＰＣＲ産物は、ＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩを用いて消化し、プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のＥｃｏＲＩ／ＸｈｏＩ部位内にサブクローニングした。予想サイズが（５４ｋＤ）のＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を大腸菌株ＤＨ５中で発現させ、グルタチオン−Ｓ−セファロースで精製し、ニュージーランドホワイト・ウサギを免役するために使用した。ＦＡＮＣＤ２特異的免疫抗血清は、ＧＳＴタンパク質を装填したＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を通過させ、ＧＳＴ−ＦＡＮＣＤ２（Ｎ−末端）融合タンパク質を装填したＡｍｉｎｏＬｉｎｋ Ｐｌｕｓカラムを通過させることによりアフィニティー精製した。
免疫ブロッティングは、実施例１に記載の通りである。
細胞系およびトランスフェクション。ＰＤ２０ｉは不死化されたＦＡ線維芽細胞系、ＰＤ７３３は一次ＦＡ線維芽細胞系であって、Ｏｒｅｇｏｎ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓファンコニ貧血細胞貯蔵所によって生成されたものである（Ｊａｋｏｂｓら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９６）、ｖｏｌ．２２、ｐ１５１〜１５７）。ＰＤ２０リンパ芽球は骨髄サンプル由来であった。ＶＵ００８はリンパ芽球であり、ＶＵ４２３は線維芽細胞系であって、欧州ファンコニ貧血登録（ＥＵＦＡＲ）によって生成されたものである。ＶＵ４２３ｉは、ＳＶ４０ Ｔ−抗原（Ｊａｋｏｂｓら，１９９６）およびテロメラーゼ（Ｂｏｄｎａｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（１９９８）、ｖｏｌ．２７９、ｐ３４９〜３５２）を用いたトランスフェクションにより誘導された、不死化細胞系であった。他のＦＡ細胞系については以前に記載されている。ヒト線維芽細胞は、ＭＥＭおよび２０％ウシ胎仔血清中で培養した。形質転換リンパ芽球は、１５％熱不活化ウシ胎仔血清を添加したＲＰＭＩ１６４０中で培養した。
ＦＡＮＣＤ２発現構築物を生成するために、完全長ｃＤＮＡはｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ内のクローン化ＲＴ−ＰＣＲ産物から構築し、ＰＣＲ誘導性突然変異の欠如は配列決定により確認した。発現ベクターｐＩＲＥＳ−Ｎｅｏ、ｐＥＧＦＰ−Ｎｌ、ｐＲｅｖＴＲＥおよびｐＲｅｖＴｅｔ−ｏｆｆは、ＣｌｏｎＴｅｃｈ（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、カリフォルニア州）から入手した。ＦＡＮＣＤ２は、これらのベクターの適切なマルチクローニング部位内へ挿入した。発現構築物は、標準的な条件を使用して細胞系ＰＤ２０および正常対照線維芽細胞系ＧＭ６３９内にエレクトロポレートした（ｖａｎ ｄｅｎ Ｈｏｆｆら，１９９２）。ネオマイシン選択は、４００μｇ／ｍＬの活性Ｇ４１８（Ｇｉｂｃｏ）を用いて実施した。
全細胞融合。全細胞融合試験のために、ヒグロマイシンＢに対して耐性で、ＨＰＲＴ遺伝子座が欠失しているＰＤ２０細胞系（ＰＤ２０ｉ）を使用した（Ｊａｋｏｂｓら，Ｓｏｍａｔ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９７）、ｖｏｌ．２３、ｐ１〜７）。対照はＰＤ２４（ＰＤ２０の感染した姉妹細胞由来の一次線維芽細胞）およびＰＤ３１９ｉ（Ｊａｋｏｂｓら，１９９７）（非Ａ、Ｃ、ＤまたはＧ型ＦＡ患者由来の不死化線維芽細胞）を含んでいた。各細胞系由来の２．５×１０５個の細胞をＴ２５フラスコ内で混合し、２４時間にわたり回復させた。細胞は無血清培地を用いて洗浄し、次に５０％ＰＥＧを用いて１分間融合させた。ＰＥＧの除去後、細胞は無血清培地を用いて３回洗浄し、選択せずに完全培地中で一晩回復させた。翌日、細胞は、４００μｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）および１×ＨＡＴを含有する選択培地内に１：１０で分割した。選択が完了した後、ハイブリッドを１回培養し、その後以下に記載した通りに分析した。
ＦＡ−Ｄ２細胞のレトロウイルス形質導入および相補性分析。完全長ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡをベクターｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒら，１９９８）内にサブクローニングした。レトロウイルス上清を使用してＰＤ２０Ｆに形質導入し、ピューロマイシン耐性細胞を選択した。細胞をクリスタルバイオレットアッセイ（Ｎａｆら，１９９８）によってＭＭＣ感受性について分析した。
染色体切断の分析。染色体切断の分析は、Ｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｅ Ｌａｂ ａｔ ＯＨＳＵ（Ｐｏｒｔｌａｎｄ、オレゴン州）によって実施された。分析（Ｃｏｈｅｎら，１９８２）のために、細胞をＴ２５フラスコ内にプレーティングし、回復させ、その後２日間にわたり３００ｎｇ／ｍＬのＤＥＢを用いて処理した。処理後、細胞はコルセミドに３時間曝露させ、０．０７５ＭのＫＣｌおよび３：１のメタノール：酢酸を用いて採取した。スライドはライト染色液を用いて染色し、５０〜１００の（有糸分裂の）中期をラジアルについてスコア付けした。
実施例１０：潜在的治療薬をスクリーニングする際に使用するＦＡのためのマウスモデル
ＦＡＮＣＤ２のマウスモデルは、Ｄ’Ａｎｄｒｅａら，（１９９７）９０：１７２５〜１７３６およびＹａｎｇら，Ｂｌｏｏｄ，（２００１）、ｖｏｌ．９８、ｐ１〜６に記載された、胚性幹細胞における相同組換えまたは標的破壊を使用して作成できる。マウスにおけるＦＡＮＣＤ２遺伝子座のノックアウトは致死性突然変異ではない。これらのノックアウト動物は癌に対する感受性が増大しており、さらにＦＡに特徴的な他の症状を示す。ノックアウトマウスに一定の治療薬を投与するとそれらの癌への感受性が減少すると予想される。さらに、特定の遺伝的欠陥の結果として癌を発症したノックアウトマウスを治療するためにより有効である一定の確立した化学療法薬が同定されることが予想され、これは、癌に対する感受性を有する、またはＦＡＮＣＤ２遺伝子座における突然変異の結果として癌を発症した、ヒト対象を治療する際にも有用であろう。
本発明者らは、例えばＦＡＮＣＣについて、遺伝子のエクソンにおける破壊を作り出したＣｈｅｎら，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，（１９９６）、ｖｏｌ．１２、ｐ４４８〜４５１、および相同組換えを使用して遺伝子のエクソンの破壊を作り出したＷｈｉｔｎｅｙら，（１９９６）、ｖｏｌ．８８、ｐ４９〜５８によって記載されたアプローチを使用すると、ＦＡＮＣＤ２の標的破壊を用いて実験用マウスモデルを作成することができる。どちらの動物モデルでも、二官能性アルキル化剤に反応して、脾リンパ球における自発性染色体切断、および染色体切断の増加が観察される。どちらのモデルでも、ＦＡＮＣＤ２−／−マウスは生殖細胞の欠陥および生殖能力の低下を有する。ＦＡＮＣＤ２マウスノックアウトモデルは、（１）ＤＮＡ損傷への造血性細胞の生理的反応におけるＦＡＮＣＤ２遺伝子の役割、（２）ＦＡ骨髄細胞に阻害性サイトカインが及ぼすインビボの効果、および（３）遺伝子療法の有効性を試験する際に、および（４）候補治療分子をスクリーニングするために有用である。
他のＦＡ遺伝子破壊の利用可能性は、複数のＦＡ遺伝子ノックアウトを用いたマウスの生成および特徴づけを可能にするであろう。例えば、２つのＦＡ遺伝子が同一細胞経路においてもっぱら機能する場合、二重ノックアウトは単一ＦＡ遺伝子ノックアウトと同一の表現型を有しているはずである。
マウスＦＡＮＣＤ２遺伝子は、１２９／ＳｖＪａｅ胚性幹細胞における相同組換えを介して、エクソンをＦＲＴが側面に位置するネオマイシンカセットと置換することにより破壊させることができる。１２９／ＳｖおよびＣ５７ＢＬの混合された遺伝的バックグラウンド内のＦＡＮＣＤ２突然変異のためのマウスホモ接合体は、標準プロトコールにしたがって生成できる。マウス尾ゲノムＤＮＡは、以前に記載された通りに調製でき、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による遺伝子型特定のためのテンプレートとして使用できる。
脾細胞は、既知のＦＡＮＣＤ２遺伝子型の６週齢マウスから調製できる。脾臓を切開し、ＲＰＭＩ培地中で粉砕して単細胞懸濁液とし、７０μｍフィルターを通して濾過した。赤血球は低張性塩化アンモニウム中に溶解させた。残りの脾リンパ球はリン酸緩衝生理食塩水中で洗浄し、ＲＰＭＩ／１０％ウシ胎仔血清＋フィトヘマグルチニン中に再懸濁させた。細胞をトリパンブルー色素排除試験により生存能力について試験した。細胞は培地中で２４時間培養し、さらに４８時間ＭＭＣまたはＤＥＢに曝露させた。あるいは、細胞は５０時間培養し、ＩＲに曝露させ（表示されたように、２または４Ｇｙ）、染色体切断またはトリパンブルー色素排除試験（生存性）分析の前１２時間にわたり回復させた。
単核細胞は、以前に記載されたように、４〜６週齢のＦＡＮＣＤ２＋／−またはＦＡＮＣＤ２−／−マウスの大腿骨および脛骨から単離できる。計２×１０４個の細胞は、ＭＭＣ処理を施した、または施していない１ｍＬのＭｅｔｈｏＣｕｌｔ Ｍ３４３培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バンクーバー、ブリティッシュコロンビア州）中で培養した。大多数のコロニーが顆粒球―マクロファージコロニー形成単位または赤芽球バースト形成単位系統に属する、第７日にコロニーをスコア付けした。各数値は、２枚のプレートから平均し、データは２回の独立した実験から引き出した。
胸腺、脾臓、および末梢リンパ節から単離したリンパ球は、フルオレセイン・イソチオシアネート結合抗ＣＤ３、ＣＤ４、およびＣＤ１９ならびにＰＥ結合抗ＣＤ８、ＣＤ４４、ＣＤ４５Ｂ、免疫グロブリンＭ、およびＢ２２０（ＢＤ ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ、カリフォルニア州）を用いて、Ｔリンパ球またはＢリンパ球表面分子について染色した。染色した細胞は、Ｃｏｕｎｔｅｒ Ｅｐｉｃｓ ＸＬフローサイトメトリーシステムで分析した。
マウス卵巣および精巣は、単離して４％パラホルムアルデヒド中で固定し、さらにマサチューセッツ総合病院病理部の中央施設にて処理した。
実施例１１：ヒト対象における癌感受性の増加を検出するための抗体試薬を用いたスクリーニングアッセイ
ＦＡＮＣＤ２−Ｌに比較したＦＡＮＣＤ２−Ｓの相対量ならびにＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在または不存在について試験するために、血液サンプルまたは組織サンプルを対象から採取することができる。ＦＡＮＣＤ２−Ｓタンパク質およびＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質に特異的な抗体試薬（実施例１）を使用すると、陽性サンプルを図１４に示したようにウェスタンブロット法で同定することができる。例えば第５，６５４，１６２号および第５，０７３，４８４号に記載されたワンステップ移動結合バンドアッセイ等の他の抗体アッセイを利用できる。酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイおよびその他の当技術分野において知られている免疫診断アッセイを使用して、ＦＡＮＣＤ２−ＳおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌの相対結合濃度を決定することができる。
このアプローチの実現可能性を以下の記載によって説明する：
ヒト癌細胞系をスクリーニングするためのＦＡＮＣＤ２診断的ウェスタンブロット法
ヒト癌細胞系は電離放射線を用いて、または用いずに処理し（図１４に示した通り）、総細胞タンパク質を電気泳動にかけ、ニトロセルロースへ移し、実施例１の抗ＦＡＮＣＤ２モノクローナル抗体を用いて免疫ブロッティングした。卵巣癌細胞系（ＴＯＶ２１Ｇ）はＦＡＮＣＤ２−Ｓを発現したが、ＦＡＮＣＤ２−Ｌを発現しなかった（レーン９、１０を参照）。この細胞系はＦＡＮＣＤ２遺伝子にオーバーラップしているヒト染色体３ｐの欠失を有し、ＦＡＮＣＤ２に対してヘミ接合性であり、そして、第２ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子において突然変異を有しており、このために第２ＦＡＮＣＤ２対立遺伝子についてＰＡ複合体によってモノユビキチン化できず、それ故ＦＡＮＣＤ２−Ｌを有しない（レーン９、１０）と予想されている。この実施例は、癌感受性の増加を引き起こすＦＡＮＣＤ２遺伝子における損傷を測定するために、抗体に基づく試験が適することを証明している。
実施例１２：ヒト対象における癌感受性の増加を検出するための核酸試薬を用いたスクリーニングアッセイ
対象のゲノム内に存在する場合、遺伝子病変のサイズおよび位置を決定するために、血液サンプルまたは組織サンプルを対象から採取し、配列決定技術または核酸プローブを使用してスクリーニングできる。このスクリーニング法は、全遺伝子を配列決定するステップ、または病変を同定するためにプローブセットまたは単一プローブを使用するステップを含んでいてよい。単一病変は集団において優勢でありうるが、他の病変は、嚢胞性線維症およびＰ５３癌抑制遺伝子等の他の遺伝的状態の場合と同様に、低頻度で前記遺伝子の至る所に発生しうると予想されている。
このアプローチの実現可能性を以下の記載によって説明する：
末梢血リンパ球はフィコール・ハイパック （Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）勾配法を使用して患者から単離し、ゲノムＤＮＡはこれらのリンパ球から単離する。本発明者らは、ゲノムＰＣＲを使用して、ヒトＦＡＮＣＤ２遺伝子の４４のエクソンを増幅させ（プライマーの表７を参照）、突然変異を同定するために２つのＦＡＮＣＤ２対立遺伝子を配列決定する。そのような突然変異が見いだされた場合、本発明者らは、ＦＡ−Ｄ２指標細胞系の機能的相補化を取り除くそれらの能力によって、これらを良性多型から識別した。
実施例１３：生検組織中のモノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌの測定
生検組織は、針吸引または皮膚穿刺生検によって入手した。マイクロタイタープレート内の適切な培養培地に再懸濁させた細胞は、その後、表示した濃度のＭＭＣ（０、１０、４０、１６０ｎｇ／ｍＬ）または表示した線量のＩＲ（０、５、１０、１０、２０ Ｇｙ）を用いて処理した。ＭＭＣを用いた２４時間のインキュベーション後、またはＩＲ処理の２時間後、全細胞抽出物は、プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）およびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭのフッ化ナトリウム）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で調製した。その後、本明細書で開示したように、抗ＦＡＮＣＤ２−Ｌ特異的モノクローナル抗体、そして細胞サンプル内のタンパク質レベルを定量するために一般に使用される酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の従来型イムノアッセイを使用して、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの存在についてサンプルを試験した（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．、「抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。
実施例１４：ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子またはタンパク質中の癌関連性欠陥の診断
ヒトＦＡＮＣＤ２遺伝子−ｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡテンプレートのＰＣＲ増幅および配列決定
ゲノムＤＮＡ配列決定
ＦＡＮＣＤ２遺伝子を配列決定している間に、ヒトゲノム内にはＦＡＮＣＤ２に対する少なくとも８個の偽遺伝子配列があって、それらはすべてヒト染色体３ｐに局在することが明らかになった（添付した表８を参照）。したがって、ＦＡＮＣＤ２配列を特異的に増幅させ、そして偽遺伝子を排除するように設計された、特異的ゲノムＰＣＲアッセイを設計することが重要であった。それらのエクソンの１以上の非機能的コピーをもまた増幅しない機能的ＦＡＮＣＤ２遺伝子のエクソン１、２、３、７〜１４、１９〜２２、２３〜２９、３０〜３２、３３〜３６および４３〜４４に近接するＰＣＲプライマーを設計することは、不可能であった。機能的遺伝子のこれらの領域に固有の大きなＰＣＲ産物を最初に生成し、その後に、機能的遺伝子に固有ではないプライマーを用いてエクソンのＰＣＲ産物を産生するための引き続く増幅反応におけるテンプレートとしてそれらの固有産物を使用することによって、それらのコピーからのＰＣＲ産物を超える機能的遺伝子からの極めて過剰なＰＣＲ産物を生成した。この方法により、機能的遺伝子内の突然変異が検出可能になった。
スーパーアンプリコンＰＣＲ
上記で指摘したように、これらのＰＣＲ反応の目的は、機能的ＦＡＮＣＤ２遺伝子の一定領域に固有である大きなアンプリコン（スーパーアンプリコン）を生成することである。ＰＣＲの構成要素は次の通りであった：６０ｍＭのＴｒｉｓ−Ｓ０４（ｐＨ８．９）、１８ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２．０ｍＭのＭｇＳ０４、各々０．２ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、０．１μＭの各プライマー、５ｎｇ／μＬのＤＮＡ、０．０５ｕｎｉｔｓ／μＬのＰｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）。
熱サイクル条件は次の通りであった：９４℃で４分間；その後に各々のサイクルが９４℃で２０秒間の変性ステップおよび７２℃で３００秒間の伸長ステップ、および初回サイクルは６４℃で開始して第１１サイクルでは５４℃へ低下するように１℃／サイクルで温度を低下させる２０秒間のアニーリングステップを含む１１サイクル；その後、第１１サイクルを２５回繰り返した；７２℃で６分間インキュベートし、その後４℃での浸漬でプログラムを完了した。
プライマーの同一性は次の通りであった（プライマー配列は表９に示した）：
Figure 2009039100
エクソンＰＣＲ
これらのＰＣＲには２つのタイプがある：（１）スーパーアンプリコンＰＣＲはＤＮＡテンプレートとして使用する：１〜３、７〜１４、１９〜２２、２３〜２９、３０〜３２、３３〜３６および４３〜４４はこのグループに含まれる、および（２）非増幅ゲノムＤＮＡはＤＮＡテンプレートとして使用する；エクソン４〜６、１５〜１８および３７〜４２はこのグループに含まれる。
それぞれの対における１つのプライマー（「−Ｆ」と表示）は、その５’末端で１８塩基のＭ１３〜２１フォワード配列（ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）を用いて合成し、もう１つのプライマー（「−Ｒ」と表示）は、その５’末端で１８塩基のＭ１３〜２８リバース配列（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ）を用いて合成した。エクソン１５については、２つの重複アンプリコンを設計した。
１０μＬのＰＣＲ反応液の構成要素は次の通りである：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ１２、各々０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、０．１μＭの各プライマー、１μＬの１：１００希釈率のスーパーアンプリコンＰＣＲまたは５ｎｇ／μＬの非増幅ゲノムＤＮＡのどちらか、０．０５ｕｎｉｔｓ／μＬのＴａｑ ポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）。熱サイクル条件は次の通りである：９４℃で４分間；その後に各々のサイクルが９４℃で３０秒間の変性ステップおよび７２℃で２０秒間の伸長ステップ、および初回サイクルは６０℃で開始して第１１サイクルでは５０℃へ低下するように１℃／サイクルで温度を低下させる２０秒間のアニーリングステップを含む１１サイクル；その後、第１１サイクルを２５回繰り返した；７２℃で６分間インキュベートし、その後４℃での浸漬でプログラムを完了した。
ｃＤＮＡ配列決定
２μｇの総ＲＮＡは、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）を使用して、製造業者の取扱説明書にしたがって、ｃＤＮＡに転換した。ＲＴ−ＰＣＲ反応液の２０分の１を１８のＰＣＲ反応各々でＤＮＡテンプレートとして使用した；これらのＰＣＲ反応液は、重複フラグメントにおいてｃＤＮＡのコード領域を増幅させる。プライマーは以下の表に示した。
それぞれの対における１つのプライマー（「−Ｆ」と表示）は、その５’末端で１８塩基のＭ１３〜２１フォワード配列（ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）を用いて合成し、もう１つのプライマー（「−Ｒ」と表示）は、その５’末端で１８塩基のＭ１３〜２８リバース配列（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣＣ）を用いて合成した。
１０μＬのＰＣＲ反応液の構成要素は次の通りである：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣ１２、各々０．１ｍＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ＴＴＰ、０．１μＭの各プライマー、１μＬの１：１００希釈率のスーパーアンプリコンＰＣＲまたは５ｎｇ／μＬの非増幅ゲノムＤＮＡのどちらか、０．０５ｕｎｉｔｓ／μＬのＴａｑ ポリメラーゼ（Ｔａｑ Ｐｌａｔｉｎｕｍ、ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）。
熱サイクル条件は次の通りである：９４℃で４分間、その後に各々のサイクルが９４℃で３０秒間の変性ステップおよび７２℃で２０秒間の伸長ステップ、および初回サイクルは６０℃で開始して第１１サイクルでは５０℃へ低下するように１℃／サイクルで温度を低下させる２０秒間のアニーリングステップを含む１１サイクル；その後、第１１サイクルを２５回繰り返した；７２℃で６分間インキュベートし、その後４℃での浸漬でプログラムを完了した。
Figure 2009039100
Figure 2009039100
ＤＮＡ配列決定
各ＰＣＲ反応液の分液は水を用いて１：１０に希釈した。希釈したＰＣＲ産物は、Ｍ１３フォワードおよびＭ１３リバースＢｉｇ Ｄｙｅプライマーキット（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を使用して、製造業者の推奨にしたがって、両方の鎖について配列決定した。配列決定産物は、蛍光シーケンサー（３７７型、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）で分離した。ベースコールは機器ソフトウェアにより行い、目視検査により精査した。各配列は、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ ３．０ソフトウェア（ＬｉｆｅＣｏｄｅｓ）を使用して、対応する正常配列と比較した。
実施例１５：化学感作剤のスクリーニング方法
ＦＡ／ＢＲＣＡ経路のモデルで示したように、ＦＡＮＣＤ２の酵素モノユビキチン化は重要な調節事象である。この事象は無傷ＦＡタンパク質複合体（Ａ／Ｃ／Ｅ／Ｆ／Ｇ複合体）を必要とし、ＢＲＣＡ１およびＢＲＣＡ２を必要とする。ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化のために必要な実際の触媒サブユニットは依然として不明であるが、モノユビキチン化のアンタゴニストをスクリーニングすることはまだ可能である。本明細書の他のところで記載したように、大体において、ＦＡ経路の阻害剤は、卵巣癌または他の癌の治療においてシスプラチンの化学感作剤として機能することができる。ＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化の阻害剤のスクリーニングは、単純な哺乳類細胞に基づくスクリーンとして実施できる。例えばＨｅＬａ細胞のような哺乳類組織培養細胞系は、最初に無作為の候補低分子を用いてプレインキュベートされる。次に細胞クローンは、抗ＦＡＮＣＤ２ウェスタンブロット法を使用してスクリーニングする。ＦＡ経路の阻害剤（アンタゴニスト）はＦＡＮＣＤ２モノユビキチン化をブロックする。
Ｇａｒｃｉａ−Ｈｉｇｕｅｒａら，２００１に記載されたように、ＢＲＣＡ１は実際上ＦＡＮＣＤ２をモノユビキチン化する酵素である可能性がある。したがって、ＢＲＣＡ１はユビキチンリガーゼ（Ｒｉｎｇ Ｆｉｎｇｅｒ）触媒ドメインを有する。このため、ＦＡＮＣＤ２のＢＲＣＡ１媒介性モノユビキチン化についてスクリーニングするために、インビトロアッセイが考案される。阻害剤は、このインビトロ反応を阻害する能力について直接にスクリーニングされる。阻害剤が同定されると、そのような薬剤は動物試験または第１相ヒト試験において、シスプラチン感作剤としてのそれらの機能を決定するために使用することができる。
実施例１６：潜在的癌治療薬のスクリーニング方法
１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を有する細胞および動物は、治療薬としての可能性を有する物質について研究および試験するためのモデル系として使用できる。細胞は、典型的には培養上皮細胞である。これらは、１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子をもつ個人から単離することができ、体細胞性または生殖細胞性のいずれかである。あるいは、１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子に突然変異をもつ細胞系を、遺伝子工学的に作成できる。
試験物質が細胞に適用された後、腫瘍により形質転換された細胞の表現型が決定される。足場非依存性増殖、ヌードマウスにおける腫瘍原性、細胞の侵襲性、および増殖因子依存性を含む、腫瘍により形質転換された細胞のあらゆる形質を評価できる。これらの形質各々についてのアッセイは当技術分野において知られている。
治療薬を試験するための動物は、全動物の突然変異誘発後に、または生殖細胞系細胞もしくは接合体の処理後に選択できる。そのような処理には、通常は第２動物種からの１以上の癌関連性欠陥を有する突然変異ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子の挿入、ならびに、崩壊した相同遺伝子の挿入が含まれる。あるいは、動物の内因性ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子は、実施例１０に略述したように、従来型技術を使用して挿入もしくは欠失突然変異または他の遺伝的変化によって破壊することができる（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，１９８９；Ｖａｌａｎｃｉｕｓ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９９１；Ｈａｓｔｙら，１９９１；Ｓｈｉｎｋａｉら，１９９２；Ｍｏｍｂａｅｒｔｓら，１９９２；Ｐｈｉｌｐｏｔｔら，１９９２；Ｓｎｏｕｗａｅｒｔら，１９９２；Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒら，１９９２）。試験物質を動物に投与した後は、腫瘍の増殖を評価しなければならない。試験物質が腫瘍の増殖を防止または抑制した場合は、前記試験物質は本明細書にて同定した癌を治療するための候補治療薬である。
実施例１７：抗腫瘍剤に耐性である癌の治療方法
本実施例では、シスプラチン等の抗腫瘍剤に耐性である癌を有する患者の治療について説明する。このプロトコールは、化学感作剤としてのＦＡＮＣＤ２タンパク質のユビキチン化阻害剤を用量増加させて併用する、本明細書に記載したようなシスプラチンの投与を提供する。シスプラチンおよび化学感作剤は、静脈内、皮下、腫瘍内または腹腔内に投与することができる。薬剤を投与する医師は、当技術分野において知られている癌活性の標準尺度を使用して観察された結果に基づいて、薬物の投与量および投与時期を調整できる。腫瘍の増殖および転移の抑制は、癌の有効な治療を表示するものである。
実施例１８：治療薬の将来の有効性を測定する方法
治療薬を用いて治療されている癌患者由来の腫瘍の生検組織は、針吸引または皮膚穿刺生検によって入手した。マイクロタイタープレート内の適切な培養培地に再懸濁させた細胞は、その後、表示した濃度のＭＭＣ（０、１０、４０、１６０ｎｇ／ｍＬ）または表示した線量のＩＲ（０、５、１０、１０、２０Ｇｙ）を用いて処理した。ＭＭＣを用いた２４時間のインキュベーション後、またはＩＲ処理の２時間後、全細胞抽出物は、プロテアーゼ阻害剤（１μｇ／ｍＬのロイペプチンおよびペプスタチン、２μｇ／ｍＬのアプロチニン、１ｍＭのフェニルメチルスルホニルフルオリド）およびホスファターゼ阻害剤（１ｍＭのオルトバナジウム酸ナトリウム、１０ｍＭフッ化ナトリウム）を添加した溶解バッファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）中で調製した。その後、本明細書で開示したように、抗ＦＡＮＣＤ２−Ｌ特異的モノクローナル抗体、そして細胞サンプル内のタンパク質レベルを定量するために一般に使用される酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）等の従来型イムノアッセイを使用して、ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの存在についてサンプルを試験した（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ｄ．、「抗体の使用：実験マニュアル（Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）」（１９９９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。モノユビキチン化ＦＡＮＣＤ２−Ｌアイソフォームの検出は、癌患者を治療するために使用されている治療薬の有効性の低下を表示すると考えられる。
実施例１９：化学療法剤への耐性を決定する方法
ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態を決定するために使用されるプロトコールを記載したフローチャートは図２１に示した。
ＦＡＮＣＦメチル化の分析
ＦＡＮＣＦ遺伝子におけるＤＮＡメチル化パターンは、メチル化特異的ＰＣＲまたはＰＣＲに基づくＨｐａＩＩ制限酵素アッセイによって決定した。ゲノムＤＮＡは、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ血液ミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して、表示した細胞系から単離した。
ＰＣＲに基づくＨｐａＩＩ制限酵素アッセイ
２５０ｎｇのゲノムＤＮＡは、３０単位のＨｐａＩＩまたはＭｓｐＩを用いて３７℃で１２時間消化した。各消化物からの１２．５ｎｇのＤＮＡは、１×ＰＣＲバッファー、各２００μＭの４つのデオキシヌクレオチド三リン酸、０．５単位のＡｍｐｌｉＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ）、および各０．２μＭのプライマーを含有する１０μＬの反応液中でＰＣＲによって分析した。ＰＣＲは３３サイクル実施し、各サイクルは変性（９４℃で４５秒間、第１サイクルは４分４５秒間）、アニーリング（６１℃で１分間）、および伸長（７２℃で２分間、最終サイクルは９分間）から構成した。ＰＣＲ反応液は臭化エチジウムを含有する１．２％アガロースゲル上で電気泳動にかけた。使用したプライマーは、ＦＰＦ６（５’−ＧＣＡＣＣＴＣＡＴＧＧＡＡＴＣＣＣＴＴＣ−３’）（フォワード）およびＦＲ３４３（５’−ＧＴＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＧＴＧＧＴＡＡ−３’）（リバース）であった。これらのプライマーは、フォワードプライマーのためにはｎｔ−６−１４およびリバースプライマーのためにはｎｔ ４０３〜４３２を使用して設計した。
メチル化特異的ＰＣＲ
ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩修飾は、以前に記載されたように実施した（Ｈｅｒｍａｎ ＪＧら，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ９３（１８），９８２１−６（１９９６））。重亜硫酸塩処理ＤＮＡは、メチル化特異的または非メチル化特異的プライマーセットのどちらかを用いて増幅させた。ＰＣＲは４０サイクル実施し、各サイクルは変性（９４℃で４５秒間、第１サイクルは４分４５秒間）、アニーリング（６５℃で１分間）、および伸長（７２℃で２分間、最終サイクルは９分間）から構成した。ＰＣＲ反応液は臭化エチジウムを含有する３％セパライド（Ｓｅｐａｒｉｄｅ）（Ｇｉｂｃｏ）ゲル上で電気泳動にかけた。メチル化特異的プライマーは、ＦＦ２８０Ｍ（５’−ＴＴＴＴＴＧＣＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＴＣＧＧＧＴＴＴＴＣ−３’）（フォワード）およびＦＲ４３２Ｍ（５’−ＡＴＡＣＡＣＣＧＣＡＡＡＣＣＧＣＣＧＡＣＧＡＡＣＡＡＡＡＣＧ−３’）（リバース）であった。非メチル化特異的プライマーは、ＦＦ２８０Ｕ（５’−ＴＴＴＴＴＧＴＧＴＴＴＧＴＴＧＧＡＧＡＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＴ−３’）（フォワード）およびＦＲ４３２Ｕ（５’−ＡＴＡＣＡＣＣＡＣＡＡＡＣＣＡＣＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＣＡ−３’）（リバース）であった。これらのプライマーは、フォワードプライマーのためにはｎｔ ２８０−３０９およびリバースプライマーのためにはｎｔ ４０３〜４３２を使用して設計した。
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本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および出版物はこれによりそれらの全体が参照により組み込まれる。本発明はそれの好ましい実施形態を参照しながら特別に示して記載してきたが、当業者には、添付の特許請求の範囲によって含まれる本発明の範囲から逸脱することなく形態および詳細を様々に変化させることができることは理解されるであろう。
本発明の上記の特徴は、添付の図面を参照しながら詳細に記した説明を参照することでより容易に理解できるであろう。
図１Ａは、ファンコニ貧血タンパク質複合体がＦＡＮＣＤ２のモノユビキチン化のために必要であることを示している、ウェスタンブロットの図である。正常（ＷＴ）細胞（レーン１）は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームである低分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｓ）（１５５ｋＤ）および高分子量アイソフォーム（ＦＡＮＣＤ２−Ｌ）（１６２ｋＤ）を発現する。レーン３、７、９、１１は、タイプＡ、Ｃ、Ｇ、およびＦの患者由来のＦＡ細胞系がＦＡＮＣＤ２−Ｓアイソフォームだけを発現ことを示している。レーン４、８、１０、１２は、対応するＦＡｃＤＮＡを用いた細胞系のトランスフェクション後の高分子量アイソフォームＦＡＮＣＤ２−Ｌの回復を示している。 図１Ｂは、ＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした後に入手したウェスタンブロットを示した図である。トランスフェクション後、細胞は表示した量のマイトマイシンＣ（ＭＭＣ）を用いて処理した。細胞タンパク質は、表示したように、ＦＡＮＣＤ２に対するポリクローナル抗体（Ｅ３５）を用いて免疫沈降させた。ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降させ、免疫複合体は抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてブロッティングした。 図１Ｃは、ＨＡ−ユビキチンをコードするｃＤＮＡを用いてＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした後に入手したウェスタンブロットを示した図である。トランスフェクション後、細胞は表示した線量の電離放射線（ＩＲ）を用いて処理した。ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降させ、免疫複合体は抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡモノクローナル抗体を用いてブロッティングした。 図１Ｄは、ＨＡ−Ｕｂ ｃＤＮＡを用いてＰＡ−Ｇ線維芽細胞系（ＦＡＧ３２６ＳＶ）または補正した細胞（ＦＡＧ３２６ＳＶ＋ＦＡＮＣＧ ｃＤＮＡ）をトランスフェクトした後、ＦＡＮＣＤ２を免疫沈降させ、そして抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＨＡ抗血清を用いてブロットした。 図１Ｅは、１ｍＭのヒドロキシウレアを用いたＨｅＬａ細胞の２４時間の処理後に入手したウェスタンブロットを示した図である。ＨｅＬａ細胞溶解物を抽出し、２．５μＭユビキチンアルデヒドを用いて、または用いずに、表示した時間にわたり表示した温度でインキュベートした。ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、モノクローナル抗ＦＡＮＣＤ２（Ｆ１１７）を用いた免疫ブロット法により検出した。 図２は、ファンコニ貧血経路がＦＡＮＣＤ２核内フォーカスを形成するために必要であることを示した図である。上方のパネルは、全細胞抽出物として調製したＳＶ４０形質転換線維芽細胞の抗ＦＡＮＣＤ２免疫ブロットを示している。パネルａ〜ｈは、アフィニティー精製抗ＦＡＮＣＤ２抗血清を用いた免疫蛍光法を示している。補正されていない（突然変異体、Ｍ）ＦＡ線維芽細胞はＦＡ−Ａ（ＧＭ６９１４）、ＦＡ−Ｇ（ＦＡＧ３２６ＳＶ）、ＦＡ−Ｃ（ＰＤ４２６）、およびＦＡ−Ｄ（ＰＤ２０Ｆ）であった。ＦＡ−Ａ、ＦＡ−Ｇ、およびＦＡ−Ｃ線維芽細胞は、対応するＦＡ ｃＤＮＡを用いて機能的に相補化された。ＦＡ−Ｄ細胞は、ネオマイシン標識ヒト染色体３ｐを用いて相補化した（Ｗｈｉｔｎｅｙら，１９９５）。 図３は、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の２つのアイソフォームの細胞周期依存性発現を示した図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞、ＦＡ−Ａ患者由来のＳＶ４０形質転換線維芽細胞（ＧＭ６９１４）、およびＦＡＮＣＡ ｃＤＮＡを用いて補正したＧＭ６９１４細胞は、二重チミジンブロック法によって同調化した。細胞周期の表示した期に対応する細胞を溶解させ、ＦＡＮＣＤ２免疫ブロット法のために処理した。（ｂ）ノコダゾールブロックによる同調化。（ｃ）ミモシンブロックによる同調化。（ｄ）ＨｅＬａ細胞はノコダゾールまたは（ｅ）ミモシンを使用して細胞周期において同調化し、細胞周期の表示した期に対応する細胞は抗ＦＡＮＣＤ２抗体を用いて免疫染色し、免疫蛍光により分析した。 図４は、ＭＭＣ、電離放射線、または紫外線への細胞曝露後の活性化ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスの形成を示した図である。指数関数的に増殖するＨｅＬａ細胞は、未処理とするか、または表示したＤＮＡ損傷剤である（ａ）マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）、（ｂ）γ線照射（ＩＲ）、または（ｃ）紫外線（ＵＶ）へ曝露させ、ＦＡＮＣＤ２免疫ブロット法またはＦＡＮＣＤ２免疫染色法のために処理した。（ａ）細胞は表示した通りに０〜７２時間、４０ｎｇ／ｍＬのＭＭＣに連続的に曝露させるか、または２４時間処理し、免疫蛍光法のために固定した。（ｂ）および（ｃ）細胞はγ線（１０Ｇｙ、Ｂ）またはＵＶ線（６０Ｊ／ｍ２、Ｃ）に曝露させ、表示した時間後に収集するか（上方パネル）、または表示した線量で照射して１時間後に採取した（下方パネル）。免疫蛍光分析のためには、細胞は処理（Ｂ、１０Ｇｙ、Ｃ、６０Ｊ／ｍ２）の８時間後に固定した。（ｄ）正常個人（ＰＤ７）または様々なファンコニ貧血患者由来の表示したＥＢＶ形質転換リンパ芽球系を、４０ｎｇ／ｍＬのマイトマイシンＣを用いて連続的に処理するか（レーン１〜２１）、または１５Ｇｙのγ線（レーン２２〜３３）に曝露させ、ＦＡＮＣＤ２免疫ブロット法のために処理した。ＭＭＣまたはＩＲ処理後のＦＡＮＣＤ−Ｌのアップレギュレーションは、ＰＤ７（レーン２〜５）および補正されたＦＡ−Ａ細胞（レーン２８〜３３）で見られたが、突然変異ファンコニ貧血細胞系のいずれでも観察されなかった。同様に、ＩＲ誘導ＦＡＮＣＤ２核内フォーカスは、ＰＡ線維芽細胞では検出されなかったが（ＦＡ−Ｇ＋ＩＲ）、機能的相補化後には回復した（ＰＡ−Ｇ＋ＦＡＮＣＧ）。 図５は、ＤＮＡ損傷後の離散性核内フォーカスにおける活性化ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１の共局在化を示した図である。ＨｅＬａ細胞は、未処理とするか、または表示したように電離放射線（１０Ｇｙ）に曝露させ、８時間後に固定した。（ａ）細胞はＤ−９モノクローナル抗ＢＲＣＡ１抗体（緑色、パネルａ、ｄ、ｇ、ｈ）およびウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体（赤色、パネルｂ、ｅ、ｈ、ｋ）を用いて二重染色し、染色した細胞を免疫蛍光法により分析した。緑色および赤色シグナルが重複する（マージ（Ｍｅｒｇｅ）、パネルｃ、ｆ、ｉ、ｌ）場合には黄色パターンが見られ、これはＢＲＣＡ１とＦＡＮＣＤ２の共局在化を表す。（ｂ）ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１の共免疫沈降。ＨｅＬａ細胞は、未処理（−ＩＲ）とするか、１５Ｇｙのγ線照射（＋ＩＲ）に曝露させ、１２時間後に回収した。細胞溶解物を調製し、そして、モノクローナルＦＡＮＣＤ２抗体（ＦＩ−１７、レーン９〜１０）、またはヒトＢＲＣＡ１に対する３つの独立して得られたモノクローナル抗体のいずれか１つ（レーン３〜８）のどちらかを用いて免疫沈降させた：Ｄ−９（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）、Ａｂ−１およびＡｂ−３（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。対照サンプル（レーン１〜２）では同一量の精製マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）を使用した。免疫複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離させ、抗ＦＡＮＣＤ２または抗ＢＲＣＡ１抗血清を用いて免疫ブロットした。ＦＡＮＣＤ−Ｌアイソフォームは、ＢＲＣＡ１と優先的に共免疫沈降した。 図６は、Ｓ期中の離散性核内フォーカスにおける活性化ＦＡＮＣＤ２およびＢＲＣＡ１の共局在化を示した図である。（ａ）ＨｅＬａ細胞は後期Ｇ１期においてミモシンを用いて同調化し、Ｓ期に遊離させた。Ｓ期細胞は、モノクローナル抗ＢＲＣＡ１抗体（緑色、パネルａ、ｄ）およびウサギポリクローナル抗ＦＡＮＣＤ２抗体（赤色、パネルｂ、ｅ）を用いて二重染色し、染色した細胞を免疫蛍光法により分析した。緑色および赤色シグナルが重複する（マージ、パネルｃ、ｆ）場合には黄色パターンが見られ、これはＢＲＣＡ１とＦＡＮＣＤ２の共局在化を表す。（ｂ）Ｓ期において同調化したＨｅＬａ細胞は、未処理とするか（ａ、ｂ、ｋ、ｌ）、または表示した通りにＩＲ（５０Ｇｙ、パネルｃ、ｄ、ｍ、ｎ）、ＭＭＣ（２０μｇ／ｍＬ、パネルｃ、ｆ、ｏ、ｐ）、もしくはＵＶ（１００Ｊ／ｍ２、パネルｇ、ｈ、ｑ、ｒ））に曝露させ、１時間後に固定した。引き続き、ＦＡＮＣＤ２またはＢＲＣＡ１に対して特異的な抗体を用いて細胞を免疫染色した。 図７は、ＦＡＮＣＤ２がマウス精母細胞中の減数分裂Ｉ期中にＢＲＣＡ１と共局在化できるシナプトネマ構造上でフォーカスを形成するのを示した図である。（ａ）後期太糸期マウス核中でのシナプトネマ構造の抗ＳＣＰ３（白色）および抗ＦＡＮＣＤ２（赤色）染色。（ｂ）後期太糸期染色体のＳＣＰ３染色。（ｃ）抗ＦＡＮＣＤ２ Ｅ３５抗体に対する免疫前血清を用いたこの塗抹標本の染色。（ｄ）マウス複糸期核中でのシナプトネマ構造の抗ＳＣＰ３染色。（ｅ）Ｅ３５ 抗ＦＡＮＣＤ２抗体を用いたこの塗抹標本の共染色。抗ＦＡＮＣＤ２を用いた不対の性染色体および常染色体のテロメアの両方の染色に注目。（ｆ）抗ＢＲＣＡ１抗体を用いたこの塗抹標本の共染色。性染色体が優先的に染色される。（ｇ）後期太糸期の性染色体シナプトネマ構造の抗ＦＡＮＣＤ２染色。（ｈ）同一複合体の抗ＢＲＣＡ１染色。（ｉ）抗ＦＡＮＣＤ２（赤色）および抗ＢＲＣＡ１（緑色）共染色（黄色領域によって反映される共局在化）。 図８は、細胞経路内でのＦＡタンパク質の相互作用を略図で示した図である。ＦＡタンパク質（Ａ、Ｃ、およびＧ）は機能的核複合体中で結合する。Ｓ期進行またはＤＮＡ損傷のいずれかによってこの複合体が活性化されると、この複合体はＤタンパク質を酵素的に修飾（モノユビキチン化）する。このモデルによると、活性化Ｄタンパク質は、引き続いて、それがＤＮＡ修復に関係するＢＲＣＡ１タンパク質および他のタンパク質と相互作用する場所である、核内フォーカスの標的とされる。 図９は、完全長ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡを用いて調べ、そして２４時間曝露させた、ヒト成人由来の心臓、脳、胎盤、肝臓、骨格筋、腎臓、膵臓、脾臓、胸腺、前立腺、精巣、子宮、小腸、結腸および末梢血リンパ球ならびにヒト胎児由来の脳、肺、肝臓および腎臓からの細胞のノーザンブロットを示した図である。 図１０は、２つのＦＡＮＣＤ２ファミリーの突然変異分析のための対立遺伝子特異的アッセイを示した図であり、対応する突然変異分析が問題となっている個人の下方にあるように、ファミリー系図（ａ、ｄ）ならびにパネルｂ、ｃ、ｅおよびｆを垂直に配列した。パネルａ〜ｃはＰＤ２０を描出し、パネルｄ〜ｆはＶＵ００８ファミリーを描出している。パネルｂおよびｅは、新規ＭｓｐＩ部位（ＰＤ２０）またはＤｄｅＩ部位（ＶＵ００８）の作成によって検出された母性突然変異の分離を示している。両ファミリーにおける父性遺伝性突然変異は、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド・ハイブリダイゼーションを用いて検出された（パネルｃおよびｆ）。 図１１は、ヒトファンコニ貧血細胞系におけるＦＡＮＣＤ２タンパク質のウェスタンブロット分析を示した図である。全細胞溶解物は、表示した線維芽細胞系およびリンパ芽球系から生成した。タンパク質溶解物（７０ｇ）は、抗ＦＡＮＣＤ２抗血清を用いた免疫ブロッティングによって直接調べた。ＦＡＮＣＤ２タンパク質（１５５ｋＤおよび１６２ｋＤ）は矢印で表示した。免疫ブロットにおける他のバンドは非特異的である。（ａ）試験した細胞系には、野生型細胞（レーン１、７）、ＰＤ２０線維芽細胞（レーン２）、ＰＤ２０リンパ芽球（レーン４）、復帰突然変異体ＭＭＣ耐性ＰＤ２０リンパ芽球（レーン５、６）、および染色体３Ｐ補体結合ＰＤ２０線維芽細胞（レーン３）が含まれた。ＨＳＣ６２（レーン８）およびＶＵ００８（レーン９）を含む数種の他のＦＡ−Ｄ群細胞系を分析した。ＦＡ−Ａ細胞はＨＳＣ７２（レーン１０）、ＦＡ−Ｃ細胞はＰＤ４（レーン１１）、そしてＦＡ−Ｇ細胞はＥＵＦＡ３１６（レーン１２）であった。（ｂ）第３のＦＡＮＣＤ２患者の同定。ＦＡＮＣＤ２タンパク質は、野生型およびＦＡ−Ｇ群細胞中では容易に検出できたが、ＰＤ７３３細胞中では検出できなかった。（ｃ）抗体の特異性。レトロウイルスＦＡＮＣＤ２発現ベクターを用いて形質導入したＰＤ２０ｉ細胞は、空ベクター対照（レーン３）およびトランスフェクトされていないＰＤ２０ｉ細胞（レーン２）とは対照的に、ＦＡＮＣＤ２タンパク質の両方のアイソフォームを表示した（レーン４）。野生型細胞では、内因性ＦＡＮＣＤ２タンパク質（２つのアイソフォーム）もまた、抗体と免疫反応性であった（レーン１）。 図１２は、クローン化ＦＡＮＣＤ２ ｃＤＮＡを用いたＦＡ−Ｄ２細胞の機能的相補化を示した図である。ＳＶ４０形質転換ＦＡ−Ｄ２線維芽細胞系であるＰＤ２０ｉは、ｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ（ＰＤ２０＋ベクター）またはｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２（ＰＤ２０＋ＦＡＮＣＤ２ｗｔ）を用いて形質導入した。ピューロマイシン選択細胞についてＭＭＣ感受性分析を実施した。分析した細胞は、親ＰＤ２０Ｆ細胞（△）、ヒト染色体３Ｐを用いて補正したＰＤ２０（○）、およびｐＭＭＰ−ｐｕｒｏ（□）またはｐＭＭＰ−ＦＡＮＣＤ２（ｗｔ）−ｐｕｒｏ（◆）のいずれかを用いて形質導入したＰＤ２０細胞であった。 図１３は、ＰＤ２０リンパ芽球の復帰突然変異についての分子的基盤を示した図である。（ａ）ｃＤＮＡを増幅させるためにエクソン５および６へのＰＣＲプライマーを使用した。対照サンプル（右のレーン）は１１４ｂｐの単一バンドを産生したが、他方、ＰＤ２０ ｃＤＮＡ（左のレーン）は２つのバンドを示し、大きい方のバンドは母性対立遺伝子内への１３ｂｐのイントロン配列の挿入を反映している。ＰＤ２０から復帰突然変異したＭＭＣ耐性リンパ芽球（中央のレーン）は、１１４＋３６ｂｐの第３のインフレーム・スプライス変異体を示した。（ｂ）ＦＡＮＣＤ２ エクソン５／イントロン５境界でのスプライシングの略図。野生型ｃＤＮＡでは、スプライス事象の１００％が適当なエクソン／イントロン境界で発生するが、他方、母性Ａ→Ｇ突然変異（矢印によって表示した）は、同様に１００％で異常なスプライシングをもたらす。復帰突然変異細胞では、母性突然変異を有するすべてのｃＤＮＡはまた、第２配列変化（太い矢印）を有し、１３ｂｐ（〜４０％のｍＲＮＡ）または３６ｂｐ（〜６０％のｍＲＮＡ）のどちらかの挿入を伴う混合スプライシングパターンを示した。 図１４は、卵巣癌患者由来の癌細胞系のＦＡＮＣＤ２ウェスタンブロットを示した図である。 図１５は、ヒトＦＡＮＣＤ２のアミノ酸配列についての配列表およびＢＥＡＵＴＹアルゴリズム（Ｗｏｒｌｅｙら，（１９９５），Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．、ｖｏｌ．５、ｐ１７３〜１８４）を使用した、ハエおよび植物相同物とのアラインメント。（配列番号１〜３）黒い囲みはアミノ酸同一性を、灰色の囲みは類似性を表示する。最高のアラインメントスコアは、Ｄ．メラノガスター（キイロショウジョウバエ）（ｐ＝８．４×１０−５８、受託番号ＡＡＦ５５８０６）およびＡ．タリアーナ（シロイヌナズナ）（ｐ＝９．４×１０−４５、受託番号Ｂ７１４１３）中の仮想タンパク質を用いて観察した。 図１６は、ＦＡＮＣＤ ｃＤＮＡ配列の６３〜５１２７ヌクレオチド（配列番号５）、およびアミノ酸１〜１４７２のこの配列によってコードされたポリペプチド（配列番号４）の図である。 図１７は、ＦＡＮＣＤ ｃＤＮＡ（配列番号１８８）と比較したＦＡＮＣＤ−Ｓ．ＯＲＦ（配列番号１８７）についてのヌクレオチド配列の図である。 図１８は、ヒトＦＡＮＣＤ２−Ｌについてのヌクレオチド配列（配列番号６）の図である。 図１９は、ヒトＦＡＮＣＤ２−Ｓについてのヌクレオチド配列（配列番号７）の図である。 図２０は、マウスＦＡＮＣＤ２についてのヌクレオチド配列（配列番号８）の図である。 図２１は、ＦＡＮＣＦ遺伝子のメチル化状態を分析するために使用したプロトコールを示した図である。 図２２は、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路を示した図である。

Claims (41)

  1. 患者が癌を有するかどうか、もしくは患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法であって、前記方法が癌関連性欠陥の存在についてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を検査するステップを含み、このとき１以上の前記癌関連性欠陥の存在が前記患者における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
  2. 前記癌が乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記癌関連性欠陥が、ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の１以上の癌関連性欠陥を有していない患者における比率に比較してＦＡＮＣＤ２−Ｓに対するＦＡＮＣＤ２−Ｌの比率の低下を生じさせる、請求項１に記載の方法。
  4. 患者が癌を有するかどうか、もしくは患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法であって、前記方法が癌関連性欠陥の存在についてファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路タンパク質を検査するステップを含み、ここで、前記癌関連性欠陥の存在が前記患者における癌または癌のリスクの増加を示す方法。
  5. 前記癌が乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項４に記載の方法。
  6. 患者の発癌リスクが増加しているかどうかを診断または決定する方法であって：
    （ａ）前記患者由来の組織サンプルを提供するステップと；
    （ｂ）前記組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；
    （ｃ）前記細胞内のＦＡＮＣＤ２−ＳおよびＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の存在についてアッセイするステップと；
    を含み、ここで、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ対ＦＡＮＣＤ２−Ｓの比率の低下が前記患者の発癌リスクの増加を示す方法。
  7. 前記癌が乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項６に記載の方法。
  8. 前記患者が、ＢＲＣＡ−１またはＢＲＣＡ−２遺伝子内に既知の癌関連性欠陥を有していない、請求項６に記載の方法。
  9. 前記患者が、ＢＲＣＡ−１またはＢＲＣＡ−２遺伝子内に１以上の癌関連性欠陥を有している、請求項６に記載の方法。
  10. 複数の前記組織サンプルがアレイに分配されている、請求項６に記載の方法。
  11. 患者が癌を有するかどうか、または患者の発癌リスクが増加しているかどうかを決定する方法であって、ここで、前記患者がＢＲＣＡ−１またはＢＲＣＡ−２遺伝子内に既知の癌を誘発する欠陥を有しておらず、前記方法が：
    （ａ）前記患者からＤＮＡサンプルを提供するステップと；
    （ｂ）前記患者由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子を、配列番号１１５〜１８６のＦＡＮＣＤ２遺伝子特異的ポリヌクレオチドプライマーを用いて増幅させるステップと；
    （ｃ）増幅したＦＡＮＣＤ２遺伝子を配列決定するステップと；
    （ｄ）前記患者由来のＦＡＮＣＤ２遺伝子配列を対照標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列と比較し、ここで、２つの遺伝子配列間の不一致が癌関連性欠陥の存在を示すステップと、
    を含み、ここで１以上の癌関連性欠陥の存在が、前記患者が癌であること、または患者の発癌リスクが増加していることを示す方法。
  12. 前記癌が乳癌、卵巣癌、または前立腺癌である、請求項１１に記載の方法。
  13. 前記患者が、ＢＲＣＡ−１またはＦＡＮＣ−Ｄ１／ＢＲＣＡ−２遺伝子内に既知の癌関連性欠陥を有していない、請求項１１に記載の方法。
  14. 前記患者が、ＢＲＣＡ−１またはＦＡＮＣ−Ｄ１／ＢＲＣＡ−２遺伝子内に１以上の癌関連性欠陥を有している、請求項１１に記載の方法。
  15. 複数の前記ＤＮＡサンプルがマイクロアレイに分配されている、請求項１１に記載の方法。
  16. 化学感作剤をスクリーニングする方法であって、前記方法が：
    （ａ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の潜在的阻害剤を提供するステップと；
    （ｂ）１以上の抗腫瘍剤に耐性である腫瘍細胞系を提供するステップと；
    （ｃ）前記腫瘍細胞系およびファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記潜在的阻害剤および前記１以上の抗腫瘍剤を接触させるステップと；および
    （ｄ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記阻害剤および前記抗腫瘍剤の存在下で前記腫瘍細胞系の増殖率を測定するステップと；
    を含み、このとき前記抗腫瘍剤の存在下およびファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記阻害剤の不存在下における腫瘍細胞系の細胞に比較した前記腫瘍細胞系の増殖率の低下が、前記潜在的阻害剤が化学増感剤であることを示す方法。
  17. ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記潜在的阻害剤がマイクロアレイでスクリーニングすることができ、このとき前記マイクロアレイが、１以上の抗腫瘍剤に耐性である１以上の細胞を含有するアドレスを含有する、請求項１６に記載の方法。
  18. ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記潜在的阻害剤が、ＦＡＮＣＤ２タンパク質のユビキチン化の阻害剤である、請求項１６に記載の方法。
  19. 前記抗腫瘍剤がシスプラチンである、請求項１６に記載の方法。
  20. 前記腫瘍細胞系が卵巣癌細胞系である、請求項１６に記載の方法。
  21. 癌を有する患者を治療する方法であって、前記癌が抗腫瘍剤に耐性であり、前記方法が治療的有効量のファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路阻害剤を前記抗腫瘍剤と一緒に投与するステップを含む方法。
  22. 前記抗腫瘍剤がシスプラチンである、請求項２１に記載の方法。
  23. ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路の前記潜在的阻害剤がＦＡＮＣＤ２タンパク質のユビキチン化の阻害剤である、請求項２１に記載の方法。
  24. 前記腫瘍細胞系が卵巣癌細胞系である、請求項２１に記載の方法。
  25. 癌治療薬をスクリーニングする方法であって、前記方法が：
    （ａ）１以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を含有する１以上の細胞を提供するステップと；
    （ｂ）潜在的癌治療薬の存在下で前記細胞を増殖させるステップと；
    （ｃ）前記潜在的癌治療薬の不存在下で増殖した同等の細胞の増殖率に比較した、前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率を決定するステップと；
    を含み、このとき前記潜在的癌治療薬の不存在下で増殖した同等の細胞の増殖率に比較した前記潜在的癌治療薬の存在下における前記細胞の増殖率の低下が、前記潜在的癌治療薬が癌治療薬であることを示す方法。
  26. １以上の癌関連性欠陥を有するファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子を含有している前記細胞がアレイにおいて分配されている、請求項２６に記載の方法。
  27. 癌患者における治療薬の有効性を予測する方法であって、前記方法が：
    （ａ）前記治療薬を用いて治療されている前記癌患者由来の組織サンプルを提供するステップと；
    （ｂ）前記組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；
    （ｃ）前記細胞内のＦＡＮＣＤ２−Ｌタンパク質の存在を検出するステップと；
    を含み、ここで、ＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在が前記癌患者における前記治療薬の有効性の低下を表す方法。
  28. 前記治療薬がシスプラチンである、請求項２７に記載の方法。
  29. 抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の耐性を決定する方法であって：
    （ａ）抗腫瘍剤を用いて治療されている患者由来の組織サンプルを提供するステップと；
    （ｂ）前記組織サンプルの細胞内でＤＮＡ損傷を誘発するステップと；
    （ｃ）ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態を測定するステップと；
    を含み、このときファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化が抗腫瘍剤に対する腫瘍細胞の耐性を示す方法。
  30. 前記ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ遺伝子がＦＡＮＣＦ遺伝子である、請求項２９に記載の方法。
  31. 前記抗腫瘍剤がシスプラチンである、請求項２９に記載の方法。
  32. ＦＡＮＣＤ２遺伝子における欠陥を検出するためのキットであって、ＦＡＮＣＤ２遺伝子に対して特異的なポリヌクレオチドプライマー対、対照標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
  33. ＦＡＮＣＤ２−Ｌの存在を検出するためのキットであって、ＦＡＮＣＤ２−Ｌ特異的抗体およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
  34. ファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子のメチル化状態を測定するためのキットであって、ＦＡＮＣＤ２ポリヌクレオチドプライマー対およびプローブ、対照非メチル化標準ＦＡＮＣＤ２遺伝子配列およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
  35. 化学感作剤についてスクリーニングするためのキットであって、１以上の抗腫瘍剤に耐性である腫瘍細胞系およびそのためのパッケージング材料を含むキット。
  36. 前記腫瘍細胞系が卵巣癌細胞系である、請求項３５に記載のキット。
  37. 前記卵巣癌細胞系がシスプラチン耐性卵巣癌細胞系である、請求項３６に記載のキット。
  38. 前記抗腫瘍剤がシスプラチンである、請求項３６に記載のキット。
  39. １以上のファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子からの１以上の核酸配列を含有するマイクロアレイ。
  40. 前記遺伝子が、ＡＴＭ、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＢ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＤ１、ＦＡＮＣＤ２、ＦＡＮＣＥ、ＦＡＮＣＦおよびＦＡＮＣＧからなる群より選択される、請求項３９に記載のマイクロアレイ。
  41. 患者が癌を有するかどうか、または患者の発癌リスクが増加しているかどうかを決定する方法であって、前記方法が：
    （ａ）請求項３９のマイクロアレイを提供するステップと；
    （ｂ）前記患者から核酸サンプルを提供するステップと；
    （ｃ）前記核酸サンプルを前記マイクロアレイにおけるファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路からの前記核酸配列にハイブリダイズさせるステップと；
    （ｄ）前記患者由来の核酸サンプルにおけるファンコニ貧血／ＢＲＣＡ経路遺伝子内の突然変異の存在を検出するステップと；
    を含み、ここで、突然変異の存在についての前記検出が、癌を有する患者であるか、または発癌リスクが増加している患者を示す方法。
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