CN111321207A - 一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,包括以下步骤:a.利用二代测序对样本进行检测;b.将测序结果分为基因型明确和基因型不明确;c.对基因型不明确的样本进行RT‑PCR、单细胞单点突变验证和微量蛋白检测,明确基因分型。本发明为临床解决先天性骨髓衰竭性疾病的基因分型治疗提供快速准确及有效的检测手段,为IBMFS患儿的后期治疗及临床预后提供依据;本发明提高了此类疾病总体的诊断水平,并可为其他系统遗传性疾病的诊断提供可参考方法。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域,具体涉及一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法。
背景技术
先天性骨髓衰竭综合征(Inherited bone marrow failure syndromes, IBMFS)是一组以骨髓衰竭、先天畸形及易发生肿瘤为主要表现的疾病的总称。IBMFS包括范可尼贫血(Fanconi anemia, FA)、先天性角化不良(dyskeratosis congenita, DC)、先天性胰腺脂肪过多症(Shwachman-diamond syndrome, SDS)、无巨核细胞性血小板减少(Amegakaryocytic thrombocytopenia)、先天性纯红细胞再生障碍性贫血(diamond-blackfan anemia, DBA)、网状组织发育不良(reticular dysgenesis)、家族性再生障碍性贫血(Familial aplastic anemia)、伴桡骨缺失的血小板减少症(TAR)、严重的先天性中性粒细胞减少症等。诊断这些疾病的重要依据是较典型的临床表现、家族史、染色体断裂实验、互补试验、细胞周期实验、western blot蛋白检测方法、基因检测等,由于基因检测对疾病分型、预后及后期治疗尤为重要,故通过基因检测进行诊断及分型已成为国际目前普遍采用的疾病诊断及分型手段。
为了对IBMFS患儿进行准确的诊断,前期设计了包含儿童骨髓衰竭性疾病的基因突变检测试剂盒,目前在临床已应用5年,检测病例800余例,在对结果的分析中,发现一些问题,这也是目前国内外进行二代测序检测后遇到的共同问题,包括:1.同一位患者同时检测出两种甚至多种疾病相关的基因突变;2.同一患者检测出同一类疾病不同基因的杂合突变;3.突变基因的致病性不明确;这些问题的出现,严重影响了对疾病的精确分型,对患者的临床预后及治疗产生了困惑。另外,现在基因的检测技术仅是在基因层面对疾病进行分析,突变后基因编码蛋白的功能是否有缺陷不能得到很好的印证,虽然普通的westernblot技术可对蛋白的表达及功能作出初步判断,但其需要细胞量大、实验周期长,尤其对细胞量少的骨髓衰竭患儿更难开展,故此方法在临床很难普遍应用。
单细胞测序技术是指在单个细胞的水平上对基因组进行高通量测序分析的技术。2011年和2013年,单细胞测序技术分别被《自然一方法(Nature Methods)》和《科学(Science)》列为年度最值得期待和关注的技术之一,该技术已经用于海洋微生物的多样性研究、和肾透明细胞癌、及骨髓增殖性肿瘤等的研究,能更加精确地测量细胞内的基因突变情况。而传统的赖以进行高通量测序的DNA来源于大量细胞,其结果只是这个细胞群体的“平均值”。众所周知,细胞之间存在异质性,即使表型相同,细胞的遗传信息也可能具有显著差异,并且这种“整体表征”的做法,丢失了很多低丰度的信息。单细胞单点突变验证是基于单细胞DNA扩增后对已知突变位点进行分析的方法,这种方法不仅所需细胞量少,而且能反映出患儿不同细胞的克隆情况。能够很好的解释临床仅出现杂合或不同疾病基因杂合突变的情况尤为适用。
超微量蛋白分析仪是一种新的蛋白质分析系统,使用超微量蛋白分析仪的纳米技术的超微量蛋白免疫分析(nanofluidic proteomic immunoassay,NIA)方法可做到对少量样品(2000个细胞即可进行检测)、低丰度蛋白以及蛋白质翻译后修饰的定量研究。其工作原理主要是:蛋白质所处溶液的pH值不等于其等电点时蛋白质带有电荷,并会在电场中移动;当蛋白质处于稳定的pH值梯度中,即pH值等于等电点时蛋白质净电荷为0,在电场中不再移动,因此通过等电点分离,可以有效区分同一蛋白质的不同异构体及不同修饰。超微量蛋白分析仪则相当于更加灵敏和精准的微量western。
发明内容
本发明是为了解决上述技术问题,所提供一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法。
本发明是通过以下技术方案实现的:
一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,包括以下步骤:
a. 利用二代测序对样本进行检测;
b. 将测序结果分为基因型明确和基因型不明确;
c. 对基因型不明确的样本进行RT-PCR、单细胞单点突变验证和微量蛋白检测,明确基因分型。
进一步的,步骤c中,同时设定正常对照组和基因型明确对照组。
进一步的,步骤c中,单细胞DNA扩增及Sanger测序方法如下:
a.利用荧光激活细胞分选术将外周血淋巴细胞分到96孔板中;
b.利用单细胞DNA扩增试剂盒对细胞进行DNA扩增;
c.用已知突变位点引物进行扩增后,利用Sanger测序技术进行突变位点分析。
进一步的,步骤c中,毛细胞免疫电泳进行微量蛋白检测方法如下:
a.在6孔板的每个孔中分别培养外周血淋巴细胞,分为2组,每组3个孔,一组加入丝裂霉素C,另一组不加丝裂霉素C,培养18小时;
b.所有细胞加入细胞裂解液,加入裂解液后在冰上裂解30min;
c.以上蛋白裂解液与加入等电点标准条带1的预混G2按3:1比例混匀,实验中主要的一抗为1:50的浓度;
d.然后加入抗人IgG-HRP 二抗,利用抗体稀释buffer将二抗稀释为1:100的浓度, 然后与 luminol/peroxide 按1:1比例混合;
e.在加入二抗和luminol/peroxide后,将每个样品加入到NanoPro 1000仪器上,根据制造商的说明书进行操作;
f.利用compass软件2.5.11识别和量化化学发光峰,并可视化地优化跟踪。
进一步的,步骤a中,至少培养2000个外周血淋巴细胞。
进一步的,步骤b中,细胞裂解液的成分为Bicine/CHAPS 裂解液(ProteinSimple, Santa Clara, CA) 二甲基亚砜抑制剂混合物 (Protein Simple) 和水溶性抑制剂混合物(Protein Simple)
进一步的,步骤c中,一抗包括兔抗-FANCD, 兔抗-FANCD1, 兔抗-FANCM和兔抗-GAPDH,GAPDH作为内参。
本发明的有益效果是:
本发明为临床解决先天性骨髓衰竭性疾病的基因分型治疗提供快速准确及有效的检测手段,为IBMFS患儿的后期治疗及临床预后提供依据;本发明提高了此类疾病总体的诊断水平,并可为其他系统遗传性疾病的诊断提供可参考方法,具有广阔应用前景。
附图说明
图1是本发明技术路线图;
图2是本发明实施例的家系图;
图3是本发明实施例的超微量蛋白检测结果图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明技术方案,下面结合说明书附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。
本发明利用二代测序、单细胞单点突变验证、RT-PCR、超微量蛋白检测技术对正常对照(阴性对照)、可通过二代测序进行基因分型(阳性对照)及不能进行基因分型的患者进行检测,建立新的技术组合,最终通过整合,建立更加快速准确的分型方法。同时构建包括儿童IBMFS疾病及亦在临床混淆的骨髓增生异常综合征等疾病快速诊断RT-PCR与超微量蛋白检测试剂盒。
研究方案和技术路线(参见图1)
(1)利用二代测序、单细胞单点突变验证、Nanopro1000超微量蛋白检测技术对正常对照(阴性对照)、可通过二代测序进行基因分型(阳性对照)及不能进行基因分型的患者进行检测,进一步证实联合三种方法对疾病进行分型的确定性;
(2)利用RT-PCR对上述扩充样本突变相关基因进行转录层面检测,看患者转录组层面是否有变化,同时计算RT-PCR方法与单细胞单点突变之间的符合率;
(3)由于单细胞单点突变验证成本较高,如RT-PCR与其符合率>90%,则建立二代测序、RT-PCR及超微量蛋白检测技术对疾病进行分型的检测方法;如符合率<90%则建立联合二代测序、单细胞定点突变位点验证、RT-PCR及超微量蛋白检测技术对疾病进行分型的检测方法。
(4)进行技术整合,构建包括儿童IBMFS疾病及亦在临床混淆的骨髓增生异常综合征等疾病快速诊断RT-PCR与超微量蛋白检测试剂盒。更加快速准确的对标本进行检测。
单细胞DNA扩增及Sanger测序:
1 利用Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 直接将50个外周血淋巴细胞分到96孔板的50个孔中;
2 利用单细胞DNA扩增试剂盒Single cell DNA amplification kit (MALBAC TMSingle cell WGA Kit) 对50个细胞进行DNA扩增.
3用已知突变(FANCM chr14-45658156 c.4931G>A and FANCD1 chr13-32914817c.6325G>A) 位点引物进行扩增后,利用Sanger测序技术进行突变位点分析,看是纯合突变还是杂合突变。
毛细胞免疫电泳进行微量蛋白检测:
1 在6孔板的每个孔中分别培养至少2000个外周血淋巴细胞,分为2组,每组3个孔,一组加入300ng/ml丝裂霉素C(MMC),另一组不加入MMC,培养18小时后开始实验;
2 所有细胞使用细胞裂解液包括:Bicine/CHAPS Lysis Buffer (ProteinSimple,Santa Clara, CA) plus DMSO Inhibitor Mix (Protein Simple) and AqueousInhibitor Mix (Protein Simple),加入裂解液后在冰上裂解30min,
3以上蛋白裂解液与6 μL加入等电点标准条带1的 预混G2 (pH 3-10) (ProteinSimple) 按3:1比例混匀. 实验中主要的一抗为1:50的浓度, 这些抗体包括兔抗-FANCD2(ab108928, Abcam), 兔抗-FANCD1 (ab27976, Abcam), 兔抗-FANCM (ab95014, Abcam),和兔抗-GAPDH (#5174, Cell Signaling Technology). GAPDH作为内参。
4 然后加入抗人IgG-HRP 二抗 (Protein Simple) ,利用抗体稀释buffer将二抗稀释为1:100的浓度, 然后与 luminol/peroxide 按1:1比例混合.
5在加入二抗和luminol/peroxide后,将每个样品加入到NanoPro 1000仪器上,根据制造商的说明书进行操作。利用compass软件2.5.11(ProteinSimple)识别和量化化学发光峰,并可视化地优化跟踪。实验过程中用一名健康人的蛋白作为阴性常对照; FANCA复合杂合子突变患者(FANCA c.3638_3639del p.1213_1213del het和FANCA c.3348+1G>a het)的标本作为阳性对照。同时对病人及阴性对照与阳性对照标本进行检测,分析各自蛋白的量与等电点性质。
实施例
通过单细胞单点突变位点验证、超微量蛋白检测技术对一例同时伴有FANCM和FANCD1范可尼贫血基因杂合突变的患儿进行检测,建立了成熟的实验条件,结果如下:
由图2可知,患儿的祖母患有血小板减少,患儿父亲血小板减少,本患儿临床仅表现为全血细胞减少,无明显的畸形,临床表型不能明确诊断为范可尼贫血,但患儿彗星试验阳性,二代测序结果提示为FANCM和FAND1的杂合突变。如图示患儿同时携带FANCM chr14-45658156 c.4931G>A 和 FANCD1 chr13-32914817 c.6325G>A突变,其突变均来自父亲,而父亲的突变来自患儿的祖父母。
表1 单细胞基因组扩增后一代测序结果
由表1可知,患儿单细胞扩增细胞数量28个,其中可以看到8种突变的细胞基因型,提示患儿并非单纯的FANCM和FANCD1的杂合突变,而是多种细胞突变基因型的嵌合体。
图3中,检测标本包括:正常对照NC(NC-未加丝裂霉素C,NC+加入丝裂霉素C),患者阳性对照PC(PC-未加丝裂霉素C,PC+加入丝裂霉素C),及患者case标本(case-未加丝裂霉素C,case+加入丝裂霉素C)。由图3可知,图3A提示三者的标本量是一致的;图3B提示正常标本加入丝裂霉素C后出现了FANCD2泛素化条带,而阳性患者对照及本患儿均未出现FANCD2蛋白的泛素化,提示患儿为范可尼贫血途径中FANCD2泛素化异常,为范可尼贫血患儿;图3C为图3B的灰度表示法;图3D提示患儿FANCM蛋白在加入丝裂霉素C后表达量无明显变化,但正常人就会升高,再次提示患者FNACM蛋白表达异常;图3E说明患儿FANCD1在加入丝裂霉素C后表达未增加,提示患儿FANCD1表达异常,且从峰的数量来看,患儿的蛋白与正常对照亦存在差异。图3F为蛋白量的统计结果。以上结果提示此患者同时存在FANCM与FANCD1蛋白异常。
综上所述,本发明首先选择了一例经二代测序发现同时携带有FANCM和FANCD1杂合突变的范可尼贫血患者的外周血进行检测,单细胞单点突变验证结果表明,患儿其实并非单纯是两种基因的杂合突变,而是两种基因突变后不同组合的嵌合体,超微量蛋白检测结果证明这位范可尼贫血患儿同时出现了两种范可尼贫血相关蛋白异常,而且证实其FANCD2蛋白泛素化异常,这些结果不仅明确了患者的基因分型,同时也为临床诊断既有概念提出了挑战,即患儿并非是复合杂合突变,而是两种基因突变后不同组合的嵌合体。
申请人声明,以上所述仅为本发明的具体实施方式,但本发明的保护范围并不局限于此,所属技术领域的技术人员应该明了,任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到的变化或替换,均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (7)
1.一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:包括以下步骤:
a. 利用二代测序对样本进行检测;
b. 将测序结果分为基因型明确和基因型不明确;
c. 对基因型不明确的样本进行RT-PCR、单细胞单点突变验证和微量蛋白检测,明确基因分型。
2.根据权利要求1所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤c中,同时设定正常对照组和基因型明确对照组。
3.根据权利要求1所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤c中,单细胞DNA扩增及Sanger测序方法如下:
a.利用荧光激活细胞分选术将外周血淋巴细胞分到96孔板中;
b.利用单细胞DNA扩增试剂盒对细胞进行DNA扩增;
c.用已知突变位点引物进行扩增后,利用Sanger测序技术进行突变位点分析。
4.根据权利要求1所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤c中,毛细胞免疫电泳进行微量蛋白检测方法如下:
a.在6孔板的每个孔中分别培养外周血淋巴细胞,分为2组,每组3个孔,一组加入丝裂霉素C,另一组不加丝裂霉素C,培养18小时;
b.所有细胞加入细胞裂解液,加入裂解液后在冰上裂解30min;
c.以上蛋白裂解液与加入等电点标准条带1的预混G2按3:1比例混匀,实验中主要的一抗为1:50的浓度;
d.然后加入抗人IgG-HRP 二抗,利用抗体稀释buffer将二抗稀释为1:100的浓度, 然后与 luminol/peroxide 按1:1比例混合;
e.在加入二抗和luminol/peroxide后,将每个样品加入到NanoPro 1000仪器上,根据制造商的说明书进行操作;
f.利用compass软件2.5.11识别和量化化学发光峰,并可视化地优化跟踪。
5.根据权利要求4所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤a中,至少培养2000个外周血淋巴细胞。
6.根据权利要求4所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤b中,细胞裂解液的成分为Bicine/CHAPS 裂解液 二甲基亚砜抑制剂混合物和水溶性抑制剂混合物。
7.根据权利要求4所述的一种先天性骨髓衰竭性疾病基因分型的检测方法,其特征在于:步骤c中,一抗包括兔抗-FANCD, 兔抗-FANCD1, 兔抗-FANCM和兔抗-GAPDH,GAPDH作为内参。
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