KR20090012382A

KR20090012382A - 대장암 진단용 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트

Info

Publication number: KR20090012382A
Application number: KR1020070076137A
Authority: KR
Inventors: 이철주; 김혜정; 유명희; 김호근; 강현주; 이한나
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2007-07-30
Filing date: 2007-07-30
Publication date: 2009-02-04
Also published as: KR100883530B1

Abstract

본 발명은 대장암을 진단할 수 있는 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제(Adenosylhomocysteinase) 및 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트에 관한 것으로, 구체적으로 정상인에 비하여 대장암 환자의 혈장 내에서 그 양이 특이적으로 증가하여 대장암을 진단할 수 있는 단백질 마커로 선발된 아데노실호모시스테이나제 및 이를 선택적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암 진단키트, 및 항원-항체 결합반응을 이용하여 혈장 내에서 아데노실호모시스테이나제를 검출하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라 대장암 진단용 마커로 선발된 아데노실호모시스테이나제에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트는 진단의 민감도 및 정확도가 높을 뿐만 아니라 환자의 혈장을 이용하여 매우 간편하게 대장암을 진단할 수 있어 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

대장암, 진단용 마커, 아데노실호모시스테이나제

Description

대장암 진단용 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및 이에 대한 항체를 포함하는 대장암 진단키트{PROTEIN MARKER ADENOSYLHOMOCYSTEINASE FOR COLON CANCER DIAGNOSIS AND DIAGNOSIS KIT FOR COLON CANCER USING ANTIBODIES AGAINST THE SAME}

본 발명은 혈액에서 대장암의 발병유무를 선택적으로 진단할 수 있는 단백질 마커 아데노실호모시스테이나제 및 이를 특이적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암 진단키트에 관한 것이다.

대장암은 병리학적으로는 대부분이 선암(adenocarcinoma)이며, 부위별로는 크게 결장암과 직장암으로 구분된다. 부위별 발생 빈도는 하부 대장, 즉 직장에서 발생하는 경우가 약 50%로 가장 높다. 최근의 연구 결과에 의하면, 식이습관의 변화로 한국에서도 대장암의 발생률과 그에 따른 사망률이 현저하게 증가하고 있으며, 대장암의 발생률은 1995년 이후 2002년까지 420% 증가하여 암 중 발생률 1위를 나타내고 있다(2003 건강보험통계연보, 국민건강보험공단 발간).

대장암의 발병 원인은 아직 불분명하지만 유전적 요인, 고지방 및 저섬유 음식의 섭취와 관련된 식이습관, 염증성 장질환 등이 고려되고 있다. 대장암은 모든 연령층에서 발생할 수 있으나, 연령이 증가함에 따라 발생빈도가 높아지며 50~60대에서 자주 발생한다. 남녀의 발생비는 결장암은 여자에게서, 직장암은 남자에게서 다소 높게 나타난다.

대장암의 치료는 외과적 절제술을 근간으로 항암화학요법 및 방사선요법이 병행하여 수행된다. 수술적 요법, 항암화학요법 및 방사선요법 등의 진보에도 불구하고 특정한 증상이 없이 진행되는 대장암의 특성으로 인해 다른 장기로 전이된 후 진단되어 수술 시점을 놓친 경우에는 사망률이 매우 높다. 5년 평균생존율은 1기의 경우 90% 이상, 2기의 경우 70% 이상, 3기의 경우 50% 이상이고 4기의 경우에는 5% 이하이지만, 대장암을 조기에 발견하고 치료할수록 생존율은 현저히 증가하는 것으로 나타났다(2004 암정보, 국립암센터 발간). 따라서, 대장암을 효과적으로 조기에 진단하는 방법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

대장암의 진단은 주로 대장과 관련된 증세를 보이는 환자에게 직장 수지검사(rectal digital examination), 분변 잠혈검사(fecal occult blood test) 및 대장 조영술을 수행하여 이루어지고 있으며, 필요에 따라 결장경검사를 통한 조직검사가 행해진다. 현재 가장 조기에 대장암을 진단할 수 있는 방법으로 분변혈에 대한 검사 또는 내시경 검사가 이용되고 있지만, 분변혈이 검출된다는 것은 전형적으로 상당한 크기의 종양이 이미 형성된 후를 의미하고, 잠혈 기준(guaiac-based) 분변 검사의 감수성은 26%로 낮아 이 검사로는 악성 병변이 있는 74%의 환자가 검출 되지 않을 수도 있다는 문제점이 있다(Ahlquist 등, Gastroenterol . Clin . North Am. 26: 41-55, 1997; 대한민국 특허공개 제2006-0027893호; 대한민국 특허공개 제2005-0114099호). 또한, 전암성 및 암성 병변의 시각화는 조기 검출에 대한 최선의 접근법이지만, 결장내시경은 상당한 비용 뿐만 아니라 환자에게 고통과 위험을 초래할 수 있다(Silvis 등, JAMA 235: 928-930, 1976; Geenen 등, Am. J. Dig . Dis. 20: 231-235, 1975; Anderson 등, J. Natl . Cancer Institute 94: 1126-1133, 2002).

상기와 같은 종래의 방법들은 진단의 정확도가 낮을 뿐만 아니라 대장암이 발병하기 이전의 환자들에 대한 조기 진단이 불가능하며, 피검체들에게 불편을 초래하는 문제점이 있다. 이러한 기존 진단방법의 단점을 보완하기 위하여 환자의 혈장에서 종양 표지자(marker)의 농도를 측정하여 대장암을 진단하려는 시도가 있었다(Clinton 등, Biomed . Sci . Instrum. 39: 408-414, 2003; Rui 등, Proteomics 3: 433-439, 2003; Soletormos 등, Dan . Med . Bull. 48: 229-255, 2001).

현재, 태아성암항원(carcinoembryonic antigen, CEA), 종양-연관 당단백질을 근거로 한 진단적 혈장 시험만이 대장암 분야에서의 진단 보조에 이용가능하다. CEA는 대장암, 위암, 췌장암 및 대다수의 유방 암종, 폐 암종 및 두경부 암종을 가진 환자로부터 수득된 조직의 95%에서 증가한다(Goldenberg 등, J. Natl . Cancer Inst .(Bethesda) 57: 11-22, 1976). 그러나, 상승된 CEA 수준은 비-악성 질환을 가진 환자에서도 보고되었으며, 대장암이 있는 대다수 환자의 혈청에서, 특히 질환의 조기 단계 동안에는 정상적인 CEA 수준을 나타내었다(Carriquiry 등, Dis . Colon Rectum 42: 921-929, 1999; Herrera 등, Ann . Surg. 183: 5-9, 1976; Wanebo 등, N. Engl . J. Med. 299: 48-451, 1978). 검출 재발에서의 혈청 또는 혈장으로부터 측정된 CEA의 이용은 이처럼 논란의 여지가 있으며, 아직 널리 적용되지 못하고 있다(Martell 등, Int . J. Biol . Markers 13: 145-149, 1998; Moertel 등, JAMA 270: 943-947, 1993; 국제 특허공개 제WO 2004/057335호)

한편, 아데노실호모시스테이나제(Adenosylhomocysteinase)는 아데노실호모시스테인(Adenosylhomocysteine)을 가역적으로 아데노신(Adenosine)과 호모시스테인(Homocysteine)으로 가수분해하는 촉매효소이다(Turner 등, Cell Biochem . Biophys . 33: 101-125, 2000). 상기 아데노실호모시스테이나제는 아데노실호모메티오닌(Adenosylhomomethionine)에 메틸기가 전이되어 형성된다. 아데노실호모시스테인의 축적은 메틸트란스퍼라제(Methyltransferase)의 기능을 억제하여 메틸화 작용에 필수적이다. 아데노실호모시스테이나제 유전자가 결실된 생취는 초기 배아기에 높은 치사율을 보였고(Miller 등, EMBO J. 13: 1806-1816, 1994), 인간에게서 아데노실호모시스테이나제의 결핍은 심한 성장제한과 기형발달을 유발하였다(Baric 등, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 101: 4234-4239, 2004). 아데노실호모시스테이나제는 세포질에 존재한다고 알려져 있었으나, 최근 세포 배양기간 동안과 손톱개구리(X. laevis)의 초기 배발생 동안에 아데노실호모시스테이나제가 세포질에서 핵으로 전이되는 것이 보고되었다(Radomski 등, Mol . Biol . Cell 10: 4283-4298, 1999). 또한, 상기 효소는 mRNA 메틸트란스퍼라제(mRNA methyltransferase) 및 RNA 폴리머라제 Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ)와 복합체를 형성하는 것이 보고되었 다(Radomski 등, Biochim . Biophys . Acta. 1590: 93-102, 2002). 이는 아데노실호모시스테이나제가 생물학적 효소로서의 기능 뿐만아니라 배발생에서도 중요한 기능을 수행함을 나타내는 것이다(Cooper 등, J. Biol . Chem. 281: 22471-22484, 2006). 또한, 아데노실호모시스테이나제의 가역적 가수분해에 의해 아데노실호모시스테인으로부터 생성된 아데노신은 세포분화를 조절하고(Barry 등, Cancer Res. 60: 1887-1894, 2000; Ethier 등, Am . J. Physiol. 265: H131-H138, 1993), 세포사멸(apoptosis)을 유도한다고 보고되었다(Dawicki 등, Am . J. Physiol. 273: L485-L494, 1997; Harrington 등, Am . J. Physiol. 279: L733-L742, 2000; Rounds 등, Am. J. Physiol. 275: L379-L388, 1998; Saitoh 등, Biochem . Pharmacol. 67: 2005-2011, 2004; Wen 등, Br . J. Pharmacol. 140: 1009-1018, 2003). 이 외에도 아데노실호모시스테이나제가 상기한 바와 같은 아데노신 유도성 세포사멸을 조절한다는 것이 보고된 바 있다(Hermes 등, Exp . Cell Res. 313: 264-283, 2007).

암과 관련된 아데노실호모시스테이나제에 대한 연구로 난소암에서 이 유전자의 발현이 증가됨이 보고되었고(Peters 등, Cancer Eidermiol . Biomarker. 14: 1717-1723, 2005), 대장암 세포주에 항암제인 5-플로오르유라실(5-Fluoruracil)을 처리한 후 변화된 유전자 목록에 이 유전자가 포함되어 보고되었다(Paula 등, Mol . Cancer 5: 20, 2006). 하지만, 아데노실호모시스테이나제의 유전자 발현량에 대한 연구만 보고되었을 뿐 단백질의 발현에 대한 연구는 미비한 실정이다. 지금까지 질병과 관련하여 아데노실호모시스테이나제의 단백질 발현량의 변화와 단백질 마커로서의 연구는 수행된 바 없으며, 특히 암과 관련하여 혈액에서의 변화 연구는 보 고되어진 사례가 없다.

이에, 본 발명자들은 대장암의 조기 진단과 관련한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여 연구를 계속하던 중, 대장암 환자로부터 얻어진 생물학적 검체 시료 내에서 특이하게 변화하는 단백질을 발굴하고 이를 대장암의 조기 진단에 이용하는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구 노력한 결과, 아데노실호모시스테이나제 단백질이 비환자 대조군에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 특이적으로 그 양이 증가하여 존재한다는 사실을 발견하고, 이의 항체를 이용한 면역화학적 방법으로 대장암을 간편하게 진단할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 혈장 내 존재하는 아데노실호모시스테이나제를 이용하여 간편하게 대장암을 진단할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 대장암 진단용 아데노실호모시스테이나제 단백질 마커를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 아데노실호모시스테이나제 단백질 마커를 선택적으로 인식하는 항체를 포함하는 대장암 진단키트를 제공한다.

아울러, 본 발명은 검체에서 항원-항체 결합반응을 통해 아데노실호모시스테이나제 단백질 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서 대장암 진단용 마커 단백질로 선발된 아데노실호모시스테이나제를 특이적으로 인식하는 항체를 이용한 대장암 진단키트는 비교적 채취가 용이한 혈장을 검체로 사용하기 때문에 생검을 대상으로 하는 기존의 대장암 진단방법과는 달리 환자에게 부담을 주지 않으면서 매우 간편하게 대장암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 의하면, 본 발명은 대장암 진단을 위한 단백질 마커로서 서열번호: 6의 아미노산 서열을 갖는 아데노실호모시스테이나제 단백질 마커를 제공한다.

본 발명은 대장암 특이적인 양적 변화를 나타내는 표지 단백질을 선발하기 위하여, 대장암 환자를 수술한 후 적출한 암조직과 동일한 수술 부위에서 암세포가 없는 정상조직의 단백질체를 DIGE(Difference In Gel Electrophoresis) 이차원 전기영동(Two-dimensional electrophoresis)을 이용하여 비교, 분석하였다(Alfonso 등, Proteomics 5: 2602-2611, 2005; Friedman 등, Proteomics 4: 793-811, 2004; Katayama 등, Surg . Today 36: 1085-1093, 2006; Tan 등, J. Proteome Res. 5: 1098-1106, 2006). DIGE는 기존의 이차원 전기영동의 단점을 보완한 새로운 프로테오믹스 기법으로, 서로 다른 형광 색호 라벨을 각각의 시료에 표지한 후 표지된 시료를 서로 혼합하여 동일한 IEF(isoelectricfocusing)와 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동법으로 등전점과 질량에 따라 분리한다. 이는 하나의 겔에서 두 종류 시료의 동시분석을 가능하게 함으로써 기존의 이차원 전기영동의 단점으로 지목되었던 겔간의 편차와 통계적 처리의 어려움을 보완한 것이다. 분리된 단백질을 컴퓨터 프로그램으로 비교, 분석하고 정상조직과 비교하여 특이적으로 변화가 있는 단백질 스팟을 선별한다. 선별된 단백질을 동정하기 위해 이를 트립신으로 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리한 다음, 각 절편과 그 절편으로부터 유래한 딸이온의 질량을 탠덤질량분석기(tandem mass spectrometry)로 측정하고 컴퓨터 분석 프로그램을 사용하여 데이터베이스를 검색한다. 그 결과, 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 것으로 검출된 서열번호: 2 내지 21의 아미노산 서열을 갖는 트립틱 펩티드들은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.74, 분자량이 48 kDa인 아데노실호모시스테이나제인 것으로 동정된다(도 1 내지 2 참조).

대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가하는 것으로 확인된 아데노실호모시스테이나제의 mRNA 및 단백질 발현수준을 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역블롯팅을 수행하여 조직 내에서 검사한다. 그 결과, 대장암 조직에서 아데노실호모시스테이나제의 mRNA 발현이 유의성 있게 증가할 뿐만 아니라, 이들을 선택적으로 인식하는 항체를 이용하여 측정한 단백질의 농도 역시 대장암 조직에서만 특이적으로 증가함을 확인한다(도 3 및 4 참조).

또한 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위 정상조직을 면역조직화학 염색법을 수행하여 암조직 특이적으로 아데노실호모시스테이나제가 증가하는 것을 확인한다 (도 5 참조).

상기와 같이 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가하는 아데노실호모시스테이나제가 혈액을 대상으로 하는 분석에도 유용하게 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 혈장에서의 발현 유무를 탠덤질량분석기로 확인한 후, 면역블롯팅을 이용하여 혈장 내 아데노실호모시스테이나제의 농도를 검출한다.

먼저, 대장암 환자의 혈장과 비환자의 혈장을 각각 따로 모아 대장암 환자군과 비환자 대조군 혈장 시료를 준비한다. 사람의 혈장에는 소수의 단백질이 혈장 내 단백질 농도의 대부분을 차지하기 때문에, 소량의 대다수 단백질을 동정하기 위해서는 먼저 상대적으로 양이 많은 단백질을 제거해야 한다(Anderson NL. 등, Mol . Cell . Proteomics, 1: 845-867, 2002; Somiari RI. 등, J. Chromatogr. B Analyt . Technol . Biomed . Life Sci ., 815: 215-225, 2005). 준비된 대장암 환자군과 비환자 대조군의 혈장 시료로부터 상대적으로 양이 많은 단백질, 예컨대 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 헵토글로빈(heptoglobin), 트랜스페린(trasnferrin), 트립신 저해제(trypsin inhibitor) 등을 제거하기 위해 다중 친화 컬럼(multiple affinity column)을 이용하여 액체 크로마토그래피를 수행한다. 상기 컬럼에 결합하지 않은 단백질 구획을 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 모으고 컬럼에 결합한 단백질들을 제거한다. 이와 같이 상대적으로 양이 많은 6종의 단백질들이 대부분 제거된 혈장 단백질 구획을 모아 농축한 후, 대장암 조직과 함께 SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행한다. 아데노실호모시스테이나제의 분자량에 해당하는 48 kDa 크기의 스팟을 선별해 트립신으로 처리하고, 탬덤질량분석기로 분석하여 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 아데노실호모시스테이나제를 동정한다(도 6 참조). 혈장에 아데노실호모시스테이나제가 존재함을 확인한 후 혈장 단백질을 SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동하고, 분리된 혈장 단백질을 PVDF 막으로 전이시키고 이를 항-아데노실호모시스테이나제 항체와 반응시킨 후 마우스의 면역글로불린 G와 결합하는 마우스 IgG-HRP와 반응시킨다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 발색기질과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 아데노실호모시스테이나제 항원의 농도를 측정한다.

그 결과, 아데노실호모시스테이나제 단백질은 대장암 조직에서와 동일한 발현 양상을 나타내는데, 비환자 대조군의 혈장에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 아데노실호모시스테이나제의 발현이 1.88배 증가한다(도 7 및 8 참조). 또한, 이러한 결과는 민감성과 정확성을 갖춘 ROC 그래프에서도 확인된다(도 9 참조). 상기 결과들로부터 혈장 내에 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 이를 비환자 대조군과 비교하여 상대적으로 증가한 값을 나타내는 피시험자를 대장암 환자로 진단할 수 있음을 확인한다.

아데노실호모시스테이나제와 세포 내 암의 진행과 관련하여 조직뿐만 아니라 혈액에서 발현량의 변화를 살펴보고, 이를 대장암의 진단 마커로 이용하는 것은 본 발명이 최초이다. 또한, 상기 단백질은 혈장에서 검출이 가능하기 때문에 생검(biopsy)을 통해서만 진단이 가능하던 기존의 단백질과는 달리 환자에게 불편을 초래하지 않으면서 간편한 방법으로 대장암을 진단하는데 활용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 피검자의 혈장 시료를 채취하고, 피검자의 혈장 시료에 함유된 상기 대장암 진단 마커인 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체를 이용하여 검출함으로써 대장암의 발병 여부를 확인할 수 있다.

따라서, 본 발명의 아테노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 대장암의 발병 확인방법은 환자의 혈장을 이용하는 새로운 면역학적 진단도구로서 민감도가 우수할 뿐만 아니라 생검을 이용하지 않고 혈장을 대상으로 간편하게 분석할 수 있어, 대장암의 조기 진단에 유용하게 사용될 수 있다.

이에, 본 발명의 다른 측면에 의하면, 본 발명은 대장암 진단용 마커 단백질인 아데노실호모시스테이나제에 선택적으로 결합하는 항체를 포함하는 대장암 진단키트를 제공한다.

아데노실호모시스테이나제 마커 단백질에 선택적으로 결합하는 항체를 제조하기 위해서는 아데노실호모시스테이나제의 입수가 선행되어야 하며, 이는 서열번 호: 1의 아데노실호모시스테이나제 단백질의 아미노산 서열을 이용하여 합성하거나 유전자 재조합을 이용하여 미생물에서 생산할 수 있고, 또는 혈장으로부터 직접 분리하여 준비할 수도 있다.

본 발명의 목적상, 상기 항체는 아데노실호모시스테이나제의 다클론 항체 및 단클론 항체를 모두 포함할 수 있으나, 항원과 보다 특이적으로 결합할 수 있는 단클론 항체가 바람직하다.

다클론 항체는 당업자에 알려진 종래 방법에 따라 면역원(antigen)으로 아데노실호모시스테이나제 마커 단백질 또는 그의 단편을 외부 숙주에 주사함으로써 제조될 수 있다. 이러한 외부 숙주로는 마우스, 랫트, 양, 토끼와 같은 포유동물을 예로 들 수 있으며, 면역원은 일반적으로 항원성을 증가시키기 위한 보조제(adjuvant)와 함께 근육내, 복강내 또는 피하주사 등의 방법으로 투여되어 외부 숙주를 면역화시킨다. 면역화된 외부 숙주로부터 정기적으로 혈청을 채취하여 향상된 역가 및 항원에 대한 특이성을 보이는 혈청을 수거하거나 이로부터 항체를 분리·정제하여 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 다클론 항체를 제조할 수 있다.

단클론 항체는 당업자에 알려진 융합(fusion)에 의한 불멸화된 세포주 생성방법(Koeher 및 Milstein, Nature 256: 495, 1975)을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법을 간략히 설명하면, 먼저 순수한 아데노실호모시스테이나제 마커 단백질 또는 그의 단편으로 마우스를 면역화시키거나, 이의 펩티드를 합성하여 소혈청 알부민과 결합시켜 마우스에 면역화시킨다. 면역화된 마우스로부터 분리한 항원-생산 B 임파구를 인간 또는 마우스의 골수종세포와 융합하여 불멸화된 하이브리도마 세포를 생성한다. 이어, 효소면역분석법(ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay)으로 하이브리도마 세포의 단클론 항체의 생성 여부를 조사하여 양성 클론을 선발하고 이를 배양한 후 항체를 분리, 정제하거나 마우스의 복강에 주입한 후 복수를 채취하여 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 단클론 항체를 제조할 수 있다.

본 발명의 아데노실호모시스테이나제 단백질의 검출에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합능을 보유하고 있는 단편을 의미하며, Fab, F(ab'), F(ab')₂, Fv 등을 포함한다.

본 발명의 대장암 진단키트에는 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체뿐만 아니라 당분야에서 면역학적 분석에 일반적으로 사용되는 도구, 시약 등이 포함된다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 대장암 진단키트는 아데노실호모시스테이나제 단백질에 특이적인 항체; 기질과의 반응에 의해서 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체(conjugate); 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지용액을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 대장암 진단키트는 아데노실호모시스테이나제 표준 항원을 포함하는 양성 대조군과 상기 항원이 주입되지 않은 동물의 항혈청을 포함하는 음성 대조군을 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 대장암 진단키트는 항원-항체 결합반응을 통하여 항체 단백질에 대한 항원을 정량 또는 정성적으로 분석함으로써 대장암을 진단할 수 있으며, 상기 항원-항체 결합반응은 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등의 방법을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 검체 및 대조군을 표면에 코팅시킨 96-웰 마이크로타이터 플레이트 등을 이용하여 재조합 단클론 항체 단백질과 반응하는 효소면역분석법을 수행하도록 상기 진단키트를 제공할 수 있다.

항원-항체 결합반응을 위한 고정체로는 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 수지 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트(well plate), 유리로 된 슬라이드 글래스 등이 사용될 수 있다.

이차항체의 표지체는 발색반응을 하는 통상의 발색제가 바람직하며, HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), FITC(poly L-lysine-fluorescein isothiocyanate), RITC(rhodamine-B-isothiocyanate) 등의 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye) 등의 표지체가 사용될 수 있다.

발색을 유도하기 위한 발색기질은 발색반응을 하는 표지체에 따라 사용하는 것이 바람직하며, TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)], OPD(o-phenylenediamine) 등을 사용할 수 있다. 이때, 발색기질은 완충용액(0.1 M NaAc, pH 5.5)에 용해된 상태로 제공되는 것이 더욱 바람직하다. TMB와 같은 발색기질은 이차항체 접합체의 표지체로 사용된 HRP에 의해 분해되어 발색 침적체를 생성하고, 이 발색 침적체의 침적 정도를 육안으로 확인함으로써 아데노실호모시스테이나제 단백질 항원의 존재 유무를 검출한다.

세척액은 인산염 완충용액, NaCl 및 트윈 20(Tween 20)을 포함하는 것이 바람직하며, 0.02 M 인산염 완충용액, 0.13 M NaCl, 및 0.05% 트윈 20으로 구성된 완충용액(PBST)이 더욱 바람직하다. 세척액은 항원-항체 결합반응 후 항원-항체 결합체에 이차항체를 반응시킨 다음 적당량을 고정체에 첨가하여 3 내지 6회 세척한다. 반응 정지용액은 황산용액(H₂SO₄)이 바람직하게 사용될 수 있다.

아울러, 본 발명의 또 다른 측면은 검체에서 대장암 진단용 마커 단백질인 아데노실호모시스테이나제를 항원-항체 결합반응을 이용하여 검출하는 방법을 제공 한다.

상기 검출방법은 혈장 내 단백질을 고정화시키거나 전기영동(SDS-PAGE)으로 분리시킨 후 PVDF 막으로 전이시키고 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체와 접촉시켜 항원-항체 결합반응을 통해 아데노실호모시스테이나제 단백질의 존재를 간접적으로 확인하는 것을 포함한다. 상기 항원-항체 결합반응으로는 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(RIA), 샌드위치 측정, 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법, 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법 등을 예로 들 수 있다. 검체로서는 혈청 또는 혈장을 사용할 수 있고, 혈장이 더 바람직하다.

본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 검출방법은,

1) 검체 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 고정체에 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 검출방법을 구체적으로 설명하면, 먼저 검체로부터 혈장단백질을 분자량에 따라 분리한다. 아데노실호모시스테이나제는 분자량이 대략 48 kDa 내외 이므로 10% 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 이로부터 분리된 단백질들을 PVDF 막과 같은 고정체로 전이시켜 고정한다. 이어, 고정된 단백질 항원에 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 항체를 가하여 항원-항체 결합반응을 수행한다. 검체에 아데노실호모시스테이나제 단백질이 존재한다면, 상기 단백질이 고정된 막에 항체가 가해졌을 때 항원-항체 결합반응이 일어나게 된다. 아데노실호모시스테이나제와 이에 대한 항체의 결합 정도를 측정하기 위해서, 각 항체에 친화성을 갖는 이차항체와 결합시키는 단계를 수행하는데, 이차항체에 접합된 HRP(horseradish peroxidase)가 기질인 ECL(enhanced chemiluminescence)과 반응하여 발색반응을 일으키는지의 여부와 그 정도를 대조군과 비교함으로써 검체 시료내 대장암 진단 마커인 아데노실호모시스테이나제단백질의 존재 여부를 검출하게 된다.

한편, 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 항체를 생물학적 마이크로칩(biological microchip) 상에 고정시킨 후 대상자로부터 분리된 검체 시료와 반응시켜 상기 항체 단백질에 대한 항원을 검출할 수 있는 생물학적 마이크로칩 및 자동화된 미세배열 시스템(microarray system)을 이용하면, 한 번의 분석으로 대량의 시료를 분석할 수 있는 장점이 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: 대장암 특이적 진단 마커로서 아데노실호모시스테이나제의 동정

본 발명자들은 대장암 특이적인 양적 변화를 나타내는 표지 단백질을 선발하 기 위하여, 6명의 대장암 환자를 수술한 후 적출한 암조직과 동일한 수술 부위에서 암세포가 없는 정상조직의 단백질체를 DIGE 이차원 전기영동법으로 분리하였다. 분리된 단백질을 디사이더(Decyder) 컴퓨터 프로그램으로 비교, 분석하고 정상조직에 비하여 암조직에서 특이적으로 변화가 있는 단백질 스팟을 선별하였다(도 1). 선별된 단백질을 동정하기 위해 이를 트립신(10 ng/㎕)으로 37℃에서 12시간 동안 처리하여 다수의 펩티드 절편으로 분리한 다음, 각 절편과 그 절편으로부터 유래한 딸이온의 질량을 탠덤질량분석기로 측정하고, 컴퓨터 분석 프로그램을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 서열번호: 2 내지 21로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 20개의 트립틱 펩티드들(tryptic peptides)은 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖고 등전점이 5.74, 분자량이 48 kDa인 아데노실호모시스테이나제 단백질로 동정되었다.

도 2는 상기 과정에서 트립신 절단에 의해 수득된 펩티드들 중의 하나인 서열번호: 6의 펩티드에 대한 탠덤질량분석 스펙트럼 결과를 나타낸 것으로, 이로부터 질량분석기에 의해 동정된 스팟에 해당하는 단백질이 아데노실호모시스테이나제임을 확인할 수 있다.

실시예 2: 역전사 -중합효소 연쇄반응( RT - PCR )과 면역블롯팅을 이용한 조직 내 아데노실호모시스테이나제의 검출

대장암 특이적으로 양적 변화를 나타내는 아데노실호모시스테이나제의 mRNA 및 단백질 발현수준을 역전사-중합효소 연쇄반응과 면역블롯팅을 수행하여 조직 내에서 검사하였다. 역전사-중합효소 연쇄반응은 11명의 대장암 환자로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직에서 mRNA를 추출한 후 그 양을 측정하였다.

간략히 설명하면, 먼저 1 ㎍의 총 RNA를 무작위 헥사머(random hexamer, Invitrogen사) 및 M-MLV 역전사효소(reverse transcriptase, Invitrogen사)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 cDNA를 합성한 후, 최종 합성된 cDNA 용액의 부피를 50 ㎕가 되도록 맞추었다. 2 ㎕의 cDNA 용액을 주형으로 하여 총 20 ㎕가 되도록 1.5 mM MgCl₂, 각각 20 pM의 아데노실호모시스테이나제에 대한 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 22 및 23), 10 mM dATP, dGTP, dTTP 및 dCTP, 1× PCR 완충용액, 및 1 U 중합효소(AmpliTaq Gold with GeneAmp polymerase, Applied Biosystems사)를 첨가하여 PCR 반응을 실시하였다. 이때, 각각의 PCR 반응용액에 RNA의 양질에 대한 내부 대조군으로서 2 내지 10 pM의 β-액틴에 대한 정방향 및 역방향 프라이머(서열번호: 24 및 25)를 첨가하여 PCR을 수행하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분간 예비변성 후, 95℃에서 30초, 55℃에서 30초의 반응을 25회 반복한 후 최종적으로 72℃에서 30초간 증폭하였다. 반응이 종결된 후, PCR 산물을 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)가 첨가된 1.5 내지 2% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동을 수행하여 정량한 후 β-액틴의 PCR 산물의 양과 비교하여 유전자의 발현 정도를 평가하였다.

아데노실호모시스테이나제에 대한 면역블롯팅은 실시예 1의 DIGE 이차 전기영동법에 사용된 6개 시료를 대상으로 수행하였다. 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용한 전기영동을 수행하여 검체에 들어 있는 단백질을 분자량에 따라 분리 하였다. 분리된 단백질을 50 mM 트리스-HCl(Tris-HCl), 130 mM 글리신(glycine), 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 전이시키고 전이된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기와 같은 과정으로 PVDF 막을 준비한 후, PVDF 막에 아데노실호모시스테이나제의 항체(1:500, Abnova사)를 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척한 후 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 그 뒤, 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience사)과 반응시킨 후 X-ray 필름에 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 3은 아데노실호모시스테이나제의 mRNA 발현량이 대장암 환자의 주위 정상조직에 비하여 대장암 조직에서 2.5배 증가하는 양상을 보여주는 RT-PCR 결과이고, 도 4는 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체를 이용한 면역블롯팅 분석에서 단백질의 농도가 대장암 환자의 주위 정상조직에 비하여 대장암 조직에서 3배 증가함을 보여주는 결과이다.

실시예 3: 면역조직화학염색을 이용한 조직 내 아데노실호모시스테이나제의 검출

대장암 환자의 암조직과 대조군으로서 암조직 주변의 정상조직에서 아데노실호모시스테이나제의 발현 정도를 알아보기 위하여 하기와 같은 면역조직화학염색을 수행하였다.

먼저, 채취한 조직을 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde, PFA) 고정액에 넣어 4℃에서 24시간 동안 고정시킨 후, 고정된 조직을 파라핀 블록으로 만들어 마이크로톰(Rotary microtome, LEICA, 독일)을 이용하여 4 ㎛ 두께의 조직절편으로 제작하였다. 상기 조직절편을 트라이에톡시 실란(triethoxy silane)으로 코팅(Coating) 된 슬라이드에 부착시켜 제조한 조직절편 슬라이드를 60℃에서 1시간 동안 전처리하여 파라핀의 일부를 미리 제거(pre-deparaffin)한 후, 자일렌(Xylene) 및 알콜(Alcohol)로 처리하여 파라핀을 완전히 제거(deparaffin)하였다. 이 조직절편 슬라이드를 3차 증류수로 2회 세척하고 인산염 완충용액(phosphate buffered saline, PBS)에 10분간 방처리 후, 일차항체로서 1：50의 비율로 희석된 아데노실호모시스테이나제에 대한 항체(Abnova사)를 상기 슬라이드에 첨가하고 이를 실온에서 30분동안 반응시켰다. 비특이적인 단백질의 결합을 막기 위해 켐메이트 엔비젼 키트(ChemMate Envision Kit, DAKO사)를 사용하여 조직 내 퍼옥시다제(peroxidase)의 활성을 억제하였다. 이 조직절편 슬라이드를 키트 내 S3006 세척용액으로 헹구고 PBS 용액으로 10분간 세척한 후 엔비젼/HRP 용액을 떨어뜨려 실온에서 30분간 면역조직화학염색을 수행하였다. 반응이 종결된 후 조직절편 슬라이드를 다시 S3006 세척용액으로 헹구고 PBS 용액으로 10분간 세척한 후 기질-크로모젠(Substrate-chromogen) 용액과 실온에서 20분간 반응시켰다. 반응이 종결된 조직절편 슬라이드를 헤마톡실린(Hematoxylin, S3309, DACO사)을 이용하여 대조 염색한 후 알코올, 아세톤 및 자일렌으로 각각 10분씩 처리하고 광학현미경으로 관찰하였다.

도 5는 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위 정상조직에 대해 면 역조직화학염색법을 수행한 결과로, 대장암 환자군의 암조직에서는 아데노실호모시스테이나제가 암세포 특이적으로 강하게 (진한 갈색) 염색되는 반면, 암세포 주위의 정상조직 세포들은 항-아데노실호모시스테이나제 항체에 의해 염색되지 않고 푸른색을 띄는 것을 확인할 수 있다.

실시예 4: 면역블롯팅을 이용한 혈장 내 아데노실호모시스테이나제의 검출

대장암 환자군 10명 및 비환자 대조군 10명으로부터 각각 혈장을 30 ㎕씩 취하고 혈장 단백질의 대부분을 차지하는 6종의 단백질인 알부민, 면역글로불린 A, 면역글로불린 G, 트랜스페린, 트립신 저해제 및 헵토글리빈을 제거하기 위해서 MARS(multiple affinity removal system, Agilent사) 컬럼을 장착한 크로마토그래피를 수행하였다. 상기 컬럼에 결합하지 않은 단백질 구획을 자외선 흡광도 280 ㎚로 추적하여 모으고 컬럼에 결합한 단백질들을 제거하였다. 이와 같이 6종의 단백질이 대부분 제거된 구획을 모아 3 kDa 이상의 크기를 갖는 단백질들만을 농축하여 대장암 환자군 및 비환자 대조군의 혈장 단백질 시료를 준비하였다.

상기에서 준비된 대장암 환자군의 혈장 단백질을 대장암 조직과 함께 SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 아데노실호모시스테이나제의 분자량에 해당하는 48 kDa 크기의 스팟을 선별해 트립신(10 ng/㎕)으로 처리하고, 이로부터 얻은 펩티드들을 탬덤질량분석기로 분석하여 이들이 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 아데노실호모시스테이나제 단백질임을 확인하였다(도 6). 아데노실호모시스테이나제가 존재하는 것이 확인된 대장암 환자군의 혈장 단백질 시료와 비환자 대조군의 혈장 단백질 시료 각 5 ㎍과 1% SDS가 포함된 완충용액을 혼합한 후 10% SDS 폴리아크릴아마이드 겔을 이용하여 전기영동을 수행하였다. 분리된 혈장 단백질을 50 mM 트리스-HCl(Tris-HCl), 130 mM 글리신(glycine), 0.05% SDS 및 12.5% 메탄올(methanol)이 포함된 용액 내에서 PVDF 막으로 전이시키고 전이된 막을 5% 탈지분유가 함유된 TBST(Tris-buffered saline Tween 20)에서 1시간 동안 반응시켰다.

이렇게 PVDF 막을 두 장 준비한 후, 각각의 PVDF 막에 아데노실호모시스테이나제에 대한 항체(1:500, Abnova사)를 따로 따로 4℃에서 12시간 동안 반응시키고 TBST로 3회 세척한 후 마우스 면역글로불린과 결합하는 마우스 IgG-HRP(1:4000, GE Healthcare사)로 25℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 종결된 후, 상기 PVDF 막을 ECL(enhanced chemiluminescence, Amersham Bioscience사)과 반응시키고 X-ray 필름에 감광시켜 각각의 단백질 농도를 측정하였다.

도 6은 대장암 환자의 조직과 혈장을 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석한 후 아데노실호모시스테이나제 스팟에 트립신을 처리하고, 이로부터 수득된 펩티드들 중에서 서열번호: 6의 펩티드를 탠덤질량분석기(tandem mass spectrometry)로 분석하여 얻은 스펙트럼을 나타낸 것이다. 스펙트럼 하단의 표는 서열번호: 6의 펩티드에서 이론적으로 나올 수 있는 딸이온의 질량값을 나타낸 것으로, 탠덤질량분석에서 나온 딸이온의 질량값이 이론치와 일치할 경우 딸이온의 질량값을 바탕색이 들어간 굵은 글씨체로 나타내었다. 조직에서는 스펙트럼이 매우 깨끗하여 많은 딸이온들이 이론치와 일치하는 반면, 혈장에서는 스펙트럼의 이 미지가 깨끗하지 않았는데, 이는 아데노실호모시스테이나제의 양적 차이에 기인한 결과일 뿐으로, 정확한 펩티드 절편과 그 절편으로부터 유래한 딸이온의 질량이 대장암 조직과 혈장에서 모두 일치하여 서열번호: 1의 아데노실호모시스테이나제로 동정되었다.

도 7은 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장을 전기영동으로 분석한 후 항-아데노실호모시스테이나제 항체로 면역블럿팅을 수행한 결과와 각각의 항원 농도를 그래프로 나타낸 것이고, 도 8은 상기 도 7의 면역블럿팅에 의해 측정된 항원 농도의 평균을 통계적으로 처리하여 나타낸 결과이다. 도 7에서는 면역블럿팅을 수행한 두 겔간의 편차를 줄이고자, 비환자 대조군 10명의 혈장을 동일 농도씩 혼합한 대조군 혼합물과 대장암 환자군 10명의 혈장을 동일 농도씩 혼합한 대장암 혼합물을 첨가하여 면역블럿팅 결과의 신뢰도를 높였다. 도 7 및 8에 나타난 바와 같이, 대장암 환자군의 혈장에서의 아데노실호모시스테이나제 단백질은 대장암 조직에서와 동일한 발현 양상을 나타내는데, 비환자 대조군의 혈장에 비하여 대장암 환자의 혈장에서 아데노실호모시스테이나제의 발현이 1.88배 증가하였다.

도 9는 상기 도 7에서 측정된 항원의 농도를 수용자-조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 그래프로 나타낸 것이다. ROC 그래프는 관찰된 데이터의 전 범위에 걸친 판정 역치를 연속적으로 변화시켜 수득되는 모든 감수성/특이성 쌍의 그래프로 주로 시험의 정확도를 나타낸다(Zweig 등, Clin . Chem. 39: 561-577, 1993). ROC 그래프에서 아데노실호모시스테이나제의 AUC(area under the curve)는 0.859로 나타나 상기 분석이 민감성과 정확성을 모두 갖추고 있음을 알 수 있다.

상기 결과들로부터 혈장 내 아데노실호모시스테이나제를 선택적으로 인식하는 항체를 사용하여 각 항원의 농도를 측정하고 이를 비환자 대조군과 비교함으로써 상대적으로 증가한 아데노실호모시스테이나제 단백질의 농도를 나타내는 피시험자를 대장암 환자로 진단할 수 있음을 확인하였다.

도　1은 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 각각 형광으로 표지한 후 이차원 전기영동으로 비교, 분석하여 대장암 조직에서 특이적으로 발현이 증가한 한 개의 스팟을 도식화한 결과이고,

도　2는 상기 도 1에서 대장암 조직 특이적으로 발현이 증가한 한 개의 스팟을 트립신으로 처리하여 얻은 다양한 트립틱 펩티드들 중에서 서열번호: 6의 펩티드를 탠덤질량분석기(tandem mass spectrometry)로 분석하여 얻은 스펙트럼 결과이고,

도 3은 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 대상으로 정량적 역전사-중합효소 연쇄반응(RT-PCR; reverse transcription polymerase chain reaction)을 이용하여 아데노실호모시스테이나제의 mRNA 발현 수준을 비교, 분석한 결과이고,

도 4는 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위의 정상조직을 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)으로 분석한 후 항-아데노실호모시스테이나제 항체로 면역블럿팅을 수행한 결과이고,

도 5는 대장암 환자군으로부터 적출한 암조직과 그 주위 정상조직에서 면역조직화학염색법을 이용하여 아데노실호모시스테이나제의 발현 정도를 비교, 분석한 결과이고,

도 6은 대장암 환자의 암조직과 혈장을 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석한 후 아데노실호모시스테이나제 크기에 해당하는 부위를 각각 트립신 처 리하여 얻은 서열번호: 6의 펩티드의 탠덤질량분석기로 분석한 결과이고,

도 7은 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장을 각각 SDS-폴리아크릴아미드 전기영동으로 분석한 후 항-아데노실호모시스테이나제 항체로 면역블럿팅을 수행한 결과와 각각의 항원 농도를 그래프로 나타낸 것이고,

도 8은 상기 도 7의 면역블럿팅에 의해 측정된 비환자 대조군의 혈장과 대장암 환자군의 혈장에서 아데노실호모시스테이나제의 항원 농도의 평균을 통계적으로 처리하여 나타낸 것이고,

도 9는 상기 도 7에서 얻은 아데노실호모시스테이나제의 항원 농도를 수용자-조작 특성(ROC: receiver operating characteristic) 그래프로 나타낸 것이다.

<110> Korea Institute of Science and Technology <120> PROTEIN MARKER ADENOSYLHOMOCYSTEINASE FOR COLON CANCER DIAGNOSIS AND DIAGNOSIS KIT FOR COLON CANCER USING ANTIBODIES AGAINST THE SAME <130> KC071182 <160> 25 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> human adenosylhomocysteinase <400> 1 Met Ser Asp Lys Leu Pro Tyr Lys Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala 1 5 10 15 Trp Gly Arg Lys Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu 20 25 30 Met Arg Met Arg Glu Arg Tyr Ser Ala Ser Lys Pro Leu Lys Gly Ala 35 40 45 Arg Ile Ala Gly Cys Leu His Met Thr Val Glu Thr Ala Val Leu Ile 50 55 60 Glu Thr Leu Val Thr Leu Gly Ala Glu Val Gln Trp Ser Ser Cys Asn 65 70 75 80 Ile Phe Ser Thr Gln Asp His Ala Ala Ala Ala Ile Ala Lys Ala Gly 85 90 95 Ile Pro Val Tyr Ala Trp Lys Gly Glu Thr Asp Glu Glu Tyr Leu Trp 100 105 110 Cys Ile Glu Gln Thr Leu Tyr Phe Lys Asp Gly Pro Leu Asn Met Ile 115 120 125 Leu Asp Asp Gly Gly Asp Leu Thr Asn Leu Ile His Thr Lys Tyr Pro 130 135 140 Gln Leu Leu Pro Gly Ile Arg Gly Ile Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly 145 150 155 160 Val His Asn Leu Tyr Lys Met Met Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Pro 165 170 175 Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys Ser Lys Phe Asp Asn Leu 180 185 190 Tyr Gly Cys Arg Glu Ser Leu Ile Asp Gly Ile Lys Arg Ala Thr Asp 195 200 205 Val Met Ile Ala Gly Lys Val Ala Val Val Ala Gly Tyr Gly Asp Val 210 215 220 Gly Lys Gly Cys Ala Gln Ala Leu Arg Gly Phe Gly Ala Arg Val Ile 225 230 235 240 Ile Thr Glu Ile Asp Pro Ile Asn Ala Leu Gln Ala Ala Met Glu Gly 245 250 255 Tyr Glu Val Thr Thr Met Asp Glu Ala Cys Gln Glu Gly Asn Ile Phe 260 265 270 Val Thr Thr Thr Gly Cys Ile Asp Ile Ile Leu Gly Arg His Phe Glu 275 280 285 Gln Met Lys Asp Asp Ala Ile Val Cys Asn Ile Gly His Phe Asp Val 290 295 300 Glu Ile Asp Val Lys Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys Val Asn 305 310 315 320 Ile Lys Pro Gln Val Asp Arg Tyr Arg Leu Lys Asn Gly Arg Arg Ile 325 330 335 Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg Leu Val Asn Leu Gly Cys Ala Met Gly 340 345 350 His Pro Ser Phe Val Met Ser Asn Ser Phe Thr Asn Gln Val Met Ala 355 360 365 Gln Ile Glu Leu Trp Thr His Pro Asp Lys Tyr Pro Val Gly Val His 370 375 380 Phe Leu Pro Lys Lys Leu Asp Glu Ala Val Ala Glu Ala His Leu Gly 385 390 395 400 Lys Leu Asn Val Lys Leu Thr Lys Leu Thr Glu Lys Gln Ala Gln Tyr 405 410 415 Leu Gly Met Ser Cys Asp Gly Pro Phe Lys Pro Asp His Tyr Arg Tyr 420 425 430 <210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 2 Gly Ile Ser Glu Glu Thr Thr Thr Gly Val His Asn Leu Tyr Lys 1 5 10 15 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 3 Met Met Ala Asn Gly Ile Leu Lys Val Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp 1 5 10 15 Ser Val Thr Lys 20 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 4 Val Ala Asp Ile Gly Leu Ala Ala Trp Gly Arg 1 5 10 <210> 5 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 5 Ala Leu Asp Ile Ala Glu Asn Glu Met Pro Gly Leu Met Arg 1 5 10 <210> 6 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8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 13 Phe Asp Asn Leu Tyr Gly Cys Arg 1 5 <210> 14 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 14 Arg Ile Ile Leu Leu Ala Glu Gly Arg 1 5 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 15 Trp Leu Asn Glu Asn Ala Val Glu Lys 1 5 <210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 16 Arg Ala Thr Asp Val Met Ile Ala Gly Lys 1 5 10 <210> 17 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 17 Ala Gly Ile Pro Val Tyr Ala Trp Lys 1 5 <210> 18 <211> 20 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 18 Gln Ala Gln Tyr Leu Gly Met Ser Cys Asp Gly Pro Phe Lys Pro Asp 1 5 10 15 His Tyr Arg Tyr 20 <210> 19 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> tryptic peptide <400> 19 Val Pro Ala Ile Asn Val Asn Asp Ser Val Thr Lys 1 5 10 <210> 20 <211> 9 <212> PRT 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Claims

대장암 진단용 단백질 마커인 서열번호: 1의 아미노산 서열을 갖는 아데노실호모시스테이나제(Adenosylhomocysteinase)에 특이적인 항체를 포함하는 대장암 진단키트.
제1항에 있어서,

상기 항체가 다클론 항체 또는 단클론 항체인 것을 특징으로 하는 대장암 진단키트.
제2항에 있어서,

기질과의 반응에 의하여 발색하는 표지체가 접합된 이차항체 접합체; 상기 표지체와 발색 반응할 발색기질 용액; 세척액; 및 효소반응 정지액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대장암 진단키트.
제3항에 있어서,

이차항체 접합체의 표지체가 HRP(horseradish peroxidase), 염기성 탈인산화효소(alkaline phosphatase), 콜로이드 골드(coloid gold), 형광물질(fluorescein) 및 색소(dye)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
제3항에 있어서,

발색기질이 TMB(3,3',5,5'-tetramethyl benzidine), ABTS[2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)] 및 OPD(o-phenylenediamine)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 진단키트.
검체로부터 항원-항체 결합반응을 이용하여 아데노실호모시스테이나제 단백질 마커를 검출하는 방법.
제6항에 있어서,

1) 검체 및 대조군의 단백질을 고정체에 코팅시키는 단계;

2) 상기 고정체에 아데노실호모시스테이나제에 특이적인 항체를 첨가하여 항원-항체 결합반응을 수행하는 단계;

3) 상기 항원-항체 결합반응을 통해 생성된 항원-항체 결합반응물을 이차항체 접합체(conjugate) 및 발색기질 용액을 이용하여 검출하는 단계; 및

4) 검체와 대조군에 대한 검출 결과를 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

단계 1)의 검체가 혈청 또는 혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

단계 1)의 고정체가 나이트로셀룰로오즈 막, PVDF 막, 폴리비닐(polyvinyl) 또는 폴리스티렌(polystyrene) 수지로 합성된 웰 플레이트 및 유리로 된 슬라이드 글래스로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제9항에 있어서,

단계 2)의 상기 항원-항체 결합반응이 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA), 방사능면역분석법(radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법(sandwich assay), 웨스턴 블롯팅, 면역침강법, 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 형광면역법, 효소기질발색법, 항원-항체 응집법으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

단계 3)의 이차항체 접합체의 표지체가 HRP, 염기성 탈인산화효소, 콜로이드 골드, 형광물질 및 색소로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

단계 3)의 발색기질이 TMB, ABTS 및 OPD로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.