KR101138459B1 - 암 마커로서의 ｄｍｂｔ１ 및 켈그라눌린 ｂ 및 이를 이용한 암 진단 및 치료에의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 대장암을 진단하는 기존의 분변잠혈반응검사보다 향상된 층화조합(stratified combination)의 검사법과 마커에 관한 것으로, DMBT1(Deleted in Malignant Brain Tumors1) 및 켈그라눌린 B 마커를 동시에 사용하여 보다 민감도 및 특이도를 향상시킨 대장암 진단용 마커 및 이를 포함한 조성물 및 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

Description

암 마커로서의 ＤＭＢＴ１ 및 켈그라눌린 Ｂ 및 이를 이용한 암 진단 및 치료에의 용도 {DMBT1 and Calgranulin B of marker for diagnosis and prognosis of tumor and diagnosis using same}

본 발명은 암을 진단하는 기존의 분변잠혈반응검사보다 향상된 층화 조합 검사법 (stratified combination of test) 및 마커에 관한 것으로, DMBT1 (Deleted in Malignant Brain Tumors 1) 및 켈그라눌린 B (Calgranulin B) 마커를 동시에 사용하여 민감도 및 특이도를 향상시킨 암 진단용 마커 및 이를 포함한 조성물 및 진단을 위한 정보의 제공방법에 관한 것이다.

암, 특히 소화기관과 관련된 대장암, 식도암, 장암, 및 간암의 경우 진행이 빠르고, 예후가 나빠서 조기 발견과 조기 수술이 가장 중요하다. 그 중, 대장암은 세계에서 3 번째로 흔한 악성 종양이다.

현재 우리나라에서 대장암 발생율은 매우 현저하게 증가하고 있다. 대장암에 의한 사망은, 남성의 경우 위암, 폐암, 간암에 이어 네번째를 차지하고 있으며, 여성의 경우 또한 유사하다. 대장암 빈도는 남성이 여성보다 많은 것으로 조사되고 있다. 연령별로는 50대가 가장 많고, 60대가 그 뒤를 잇고 있다. 우리나라는 유럽이나 미국과 비교했을 때, 발생 연령이 10살 정도 어린 경향이 있다. 5% 내지 10%의 빈도로 30대의 젊은 사람에게서도 발생하며, 이처럼 젊은 층에서 나타나는 대장암은 가족 사이에서 많이 발생하는 경향이 있기도 하다. 대장암의 발생에 영향을 미치는 것으로는 유전인자보다도 환경인자의 비중이 크다고 여겨지고 있는데, 식생활의 급격한 서구화, 특히 동물성 지방이나 단백질의 과다섭취가 원인이라고 인식되고 있다. 그러나 5% 전후의 대장암은 유전적 소인에 의해 발생한다고 알려져 있다. 이를 종합해보면, 대장암에 걸리기 쉬운 위험인자로서는 1) 대장용종에 걸린 경험이 있는 경우, 2) 가족력이 있는 경우, 3) 장기간 궤양성 대장염에 시달리고 있는 경우, 4) 고치기 어려운 치루에 걸린 경우 등이 있다.

대장암에는 Dukes 분류법과 UICC의 stage 분류법이 대표적이다. 그 기준은 암의 크기에 의해서가 아니라, 대장벽 속으로 암이 침습된 깊이 및 원격전이의 유무에 따라 진행도가 규정되어 있다. 하기의 표 1 및 2는 각각 Dukes 분류법 및 stage 분류법의 구분기준을 설명한 것이다.

Dukes 분류법의 특징

명칭	수술 후 5년 생존률	병리적 양상
Dukes A	90%이상	암이 대장벽 내에 머물러 있는 것
Dukes B	60~80%	암이 대장벽을 뚫었지만 림프절전이가 일어나지 않은 것
Dukes C	20~50%	림프절전이가 일어난 것
Dukes D	20%이하	복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것

stage 분류법의 특징

명칭	병리적 양상
0기	암이 점막에 머물러 있는 것
1기	암이 대장벽에 머물러 있는 것
2기	암이 대장벽을 넘어섰지만 인접장기까지 미치지 않은 것
3기	암이 인접장기에 침윤하거나 림프절전이가 일어난 것
4기	복막, 간, 폐 등으로 원격전이가 일어난 것

상기 두 가지의 분류 방식에는 아주 작은 차이가 있을 뿐이기 때문에, Dukes A는 0기, 1기에, Dukes B는 2기에, Dukes C는 3기에, Dukes D는 4기에 해당하는 것이라고 현재 통용되고 있으며, 특히 Dukes분류는 국제적으로 널리 쓰이고 있는 방법이다.

대장암은 조기발견 시 내시경적 절제나 외과요법에 의해 완전히 치유될 수 있으며, 진행되어 간이나 폐로 전이(원격전이)되었더라도 수술이 가능한 시기라면 외과요법에 의한 완치를 기대할 수 있다. 그러나 발견이 늦어지면 폐, 간, 림프절 또는 복막 등 절제하기 어려운 곳으로의 전이가 일어나 외과요법을 사용할 수 없는 바, 궁극적으로 대장암의 효과적인 치료를 위해서는 조기 진단 및 치료가 필수적이다.

한편, 외과적 요법으로서 수술을 받은 이후에는 재발하는 경우가 종종 있으므로, 수술 후에는 3-4개월 간격으로 재발유무를 점검하기 위한 정기검사를 받아야 한다. 신체 내의 장기들 중에서 간, 폐, 복막 등이 재발하기 쉬운 장기이며, 또 절제한 부위에서 국소적으로 재발하기도 한다. 대장암은 다른 암과 비교할 때 빠른 시기에 재발 되며, 재발한 병소를 절제하여 완전히 치료할 수도 있다. 재발의 80%이상은 수술 후 3년 이내에 발견되므로, 수술 후 5년 이내에 재발하지 않는 것이 완치의 기준이 되며, 이처럼 재발 여부에 대한 지속적이고 규칙적인 검진을 위하여 효과적인 검사법이 요구되고 있다.

대장암은 조기인 경우라면 거의 100% 가까이 완치되지만, 일반적으로 자각증상이 없기 때문에 무증상인 시기에 발견하는 것은 매우 어려우므로, 주기적인 검사가 선행 되어야 한다. 대장암의 선별검사(screening)로서 대표적인 것은 분변 잠혈 검사(Fecal Occult Blood Test; FOBT)이나, 이 검사는 대장암에 대한 위양성 및 위음성 비율이 높아 정확한 진단용도로 사용되기에는 한계가 있다. 그 밖의 현재 사용되고 있는 대장암 검사법은 아래 표 3과 같다.

대장암 검사법

검사명	검사방법 및 특징
대장조영검사	식사 제한 후에 장기를 충분히 비운 후 항문으로부터 바륨과 공기를 주입하여 X-ray 사진을 찍어 장의 모양을 검사
대장내시경	S-결장까지를 관찰하는 짧은 내시경과, 맹장까지 모든 대장을 관찰할 수 있는 긴 내시경이 있음 검사와 동시 바로 용종을 절제할 수도 있음
종양표지자	혈액 검사를 통해 신체 어딘가에 숨어 있는 암을 진단해내는 방법 그러나 현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 종양 표지자는 아직 없음 CEA라고 불리는 표지자가 일반적이지만, 대장암이 있어도 약 반수가 양성을 나타낼 뿐임 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용
방사선 진단 (CT, MRI, 초음파 등)	원발 병소의 진전 정도와 간으로의 원격전이 여부를 알아보기 위해 사용

현재까지 대장암을 조기에 발견할 수 있는 대장암 특유의 효과적 종양 표지자는 밝혀진 바 없다. 물론, CEA(carcinoembryonic antigen)라고 불리는 표지자가 있으나, 상기의 표 3에서도 언급한 바와 같이 대장암에 있어서 반수 정도 만이 양성을 나타낼 뿐이므로, 주로 대장암의 진행도와 치료효과를 판정하는 지표로서 사용되고 있을 뿐, 초기의 진단을 위한 표지자로 사용하기에는 여전히 무리가 있다. 현재의 대장암 선별 검사는 분변에서 혈액의 검출 또는 대장 내시경 검사를 통한 전반적 이상소견을 직접적으로 확인하는 것이지만, 이 방법은 침습적이라는 점, 환자의 허락을 요한다는 점, 고가의 비용이 발생한다는 점 때문에 제약이 있다.

최근, 비침습성이고 장준비를 필요로 하지 않으며 전체 대장을 포괄하여 대량 스크리닝 및 샘플시료의 운반이 가능한 분변 검사가 광범위하게 연구되고 있다. 현재까지, 분변 마커는 종양으로부터 흘러나오거나, 분비되거나, 또는 박리된 것들로 분류되어 왔으며, 기존 FOBT를 이용하여 헤모글로빈 및 칼프로텍틴(calprotectin)이 대규모 대장암 진단 마커로 사용되어 왔으나, 이들 역시 만족할 만한 높은 민감도와 특이도를 갖지는 못하여 비침습성 대장암 선별마커가 여전히 요구되고 있다.

이에 본 발명자들은 FOBT의 강도를 높일 수 있는 암 마커를 찾기 위해 예의 노력한 결과, 대장암 환자의 분변에서 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현이 증가함을 확인하였고, 단독 마커 대신 상기 2 개의 마커 조합을 사용할 경우 암 진단 능력이 더욱 강력해 질 것이라는 가정 하에, FOBT 검사 후 분변의 DMBT1 및 켈그라눌린 B를 추가적으로 검사하는 층화 조합 검사를 통해 기존 분변잠혈반응검사의 민감도 및 특이도가 향상되는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 암 진단용 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질의 수준을 측정하는 단계 및 상기 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는 암 진단을 위한 정보의 제공방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 암 진단 마커인 DMBT1 및 켈그라눌린 B의 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 진단용 조성물에 관한 것이다.

DBMT1 단백질은 SRCR-인터스펄스드 도메인(SID)에 의해 분리된 복수의 스캐빈저 수용체 시스테인-리치(SRCR) 도메인을 포함하는 당단백질이며 암환자에게 있어서 이들을 코딩하는 유전자 서열이 일부 결손되어 있는 것으로 알려져 있다. 한편 켈그라눌린 B는 2 EF-핸드 칼슘-결합 모티프(EF-hand calcium-binding motif)를 갖는 S100 단백질의 패밀리이다. 본 발명자들은 DMBT1 및 켈그라눌린 B를 동시에 사용하여 암 진단을 위한 마커로서 사용할 수 있음을 최초로 규명하였고 본 발명의 일 구현 예에 따르면, DMBT1 및 켈그라눌린 B가 암 그룹에서 발현이 특이적으로 증가하는 것을 확인하였다.

바람직하게는, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 암 진단용 조성물이다.

상기 암은 DMBT1 및 켈그라눌린 B 발현이 특이적으로 높은 암은 제한 없이 포함되나, 바람직하게는 소화관과 관련된 암, 그 예로 대장암, 식도암, 장암, 간암, 또는 위암일 수 있으며, 가장 바람직하게는 대장암 일 수 있다.

원발(primary) 종양의 크기나 범위를 숫자로 구분하여 표시한 것을 T 병기라고 명칭한다.

본 발명에서 용어, 대장암(colon cancer)은 대장의 가장 안쪽 표면인 점막에서 발생한 암으로, 직장암, 결장암 및 항문암을 통칭한 것을 의미하며 대장의 구역에 따라 2 부분으로 나뉜다. 우측 대장암, 다시 말하면 우측 결장암은 증상이 거의 없으며 있다고 하더라도 변비보다는 설사가 많다. 대부분 체중감소와 빈혈 등의 증상으로 쇠약해졌다는 느낌이 든다. 복부팽만, 식사후 트림 등을 호소하여 담낭염, 만성 충수염 위궤양으로 오진되기도 하며 우측 아랫배에 혹이 만져지기도 한다. 혈변이나 점액 변은 거의 없는 것이 특징이다. 좌측 대장암, 즉 좌측 결장암의 증상은 변비가 심해지고 전에 먹던 변비약이 효과가 떨어지면서 통증을 느끼게 된다. 가끔 설사를 하기도 하나 다시 변비로 바뀐다. 배에서 소리가 나고 소화불량 증세를 보이며, 체중이 빠지면서 건강이 점점 나빠지는 특징이 있다.

본 발명에서 용어, "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 대장암, 식도암, 장암, 간암, 또는 위암의 발병 여부를, 바람직하게는 대장암 발병 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "FOBT(분변잠혈반응검사)"란 소화관 출혈의 유무를 알기 위한 검사법으로 암 종양에서는 87%에서 잠혈 반응 양성이 나타나는 것으로 알려져 있다. 이러한 FOBT는 특히 소화관 관련 암의 진단 방법으로 사용되는 방법이나, 위양성 및 위음성 비율이 높아 정확한 진단용도로 사용되기에는 한계가 있다. 따라서 추가적인 방법 또는 FOBT로 검출이 가능한 민감도 및 특이도가 높은 마커의 발굴이 요구되고 있다. 본 발명의 일 구현 예에 따르면, FOBT에서 음성으로 판정된 암 의심 환자의 시료를 DMBT1 및 켈그라눌린 B 마커의 발현 여부를 추가적으로 검사할 경우, 암 검출의 민감도 및 특이도가 높아짐을 확인하였다.

본 발명에서 용어, "층화 조합 검사법(Stratified Combination of Test)"이란 특정 증상을 갖는 환자의 진단을 위해 FOBT 검사법 및 2개 이상의 분자 마커를 병용하여 실시하는 검사법을 나타낸다. 본 발명에서는 바람직하게는 FOBT 검사 후, DMBT1 및 켈그라눌린 B의 발현 여부를 검사하는 것이다.

본 발명에서 용어, "민감도(sensitivity)"란 해당 질환에 걸렸을 때 그 진단검사 결과가 양성으로 나타나게 될 확률을 나타내며, "특이도(specificity)"란 어떤 질환에 걸려 있지 않을 경우 검사결과가 음성이 될 가능성의 정도를 나타낸다.

본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)"란 암 세포를 정상 세포와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포에 비하여 암을 가진 세포에서 증가양상을 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 지질 , 당지질, 당단백질, 당(단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자 등을 포함한다. 본 발명의 목적상, 암 진단 마커는 DMBT1 및 켈그라눌린 B로, 암 세포에서 발현이 증가하는 단백질이다.

본 발명에서, 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 마커 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.

상기한 바와 같이 본 발명의 암 마커 단백질의 발현 수준을 측정하기 위한 제제로서 항체는 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 다클론 항체는 상기한 암 마커 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다.

단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(hybridoma method)(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다.

또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 평균 발현 수준을 대조군(p<0.001) 및 선종(adenoma) 그룹(p<0.001)과 비교할 경우, 암 그룹에서 훨씬 더 높은 발현 결과를 확인하였다(도 1). 선종 그룹에서 진행성 선종 (AA) 그룹 간의 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현 수준의 차이는 거의 없음을 확인하여, 켈그라눌린 B 및 DMBT1이 암 마커임을 확인하였다(표 8). 또한 암 환자에서, 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현 수준은 T 병기(T stages) 또는 암 위치와 관련되지 않았는 바(표 5), 구체적인 병기와 위치에 무관하게 암 마커로 사용할 수 있음을 확인하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명에 따른 상기 암 진단용 조성물을 포함하는 암 진단 키트를 제공한다. 바람직하게, 상기 암 진단용 키트는 분석 방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 더 포함하여 구성될 수 있다.

다른 실시 양태로서, 단백질 칩을 수행하기 위해 필요한 필수요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. 단백질 칩은 센서칩과 단백질 결합 분석 장치로 구성되어 있을 수 있다. 또한, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 진단 키트일 수 있다. ELISA 키트는 마커 단백질에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커 단백질에 대한 특이도 및 친화성이 높고 다른 단백질에 대한 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론 항체, 다클론 항체 또는 재조합 항체이다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromophores), 효소(예: 항체와 컨주게이트됨) 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.

바람직하게는, 상기 단백질과 반응할 수 있는 항체, 수용기, 핵산, 탄수화물 등의 관련 물질을 단일 칩상에 고밀도로 고정화시킨 단백질 칩일 수 있다. 이는 FOBT 검사용 밴드, DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질을 검출할 수 있는 단백질 칩일 수 있다(도 4).

또 다른 양태로서, 본 발명은 암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질의 수준을 측정하는 단계 및 상기 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 암 진단을 위한 정보의 제공방법일 수 있다.

바람직하게는 상기 암 의심 환자는 분변잠혈반응검사에서 암 의심 환자로 판명된 환자일 수 있다. 본 발명에서 암 의심 환자란 FOBT에서 양성으로 나온 환자뿐만 아니라, 음성으로 나타난 환자도 포함될 수 있으며, 이는 FOBT에 의한 위음성의 위험성을 제거하여, DMBT1 및 켈그라눌린 B의 발현 양상을 검사하여 암 진단의 특이도 및 민감도를 증가시키기 위함이다. 상기 암은 DMBT1 및 켈그라눌린 B 발현이 특이적으로 높은 암은 제한 없이 포함되나, 소화관과 관련된 그 예로 대장암, 식도암, 장암, 간암, 또는 위암일 수 있으며, 바람직하게는 대장암일 수 있다.

본 발명에서 용어 생물학적 시료란 암 발병에 의해 대장암 마커의 단백질 발현 수준이 차이가 나는 조직, 세포 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액, 뇨 또는 분변 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 분변일 수 있다. 시료를 분변으로 사용할 경우, 기존의 침습적 방법으로 인해 환자에게 고통을 주었던 방법들과 달리 비침습적 검사를 수행할 수 있어서 환자의 고통 없이 진단을 위한 정보를 제공할 수 있다는 이점이 있다.

바람직하게는, 상기 단백질 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 암 진단을 위한 정보의 제공방법일 수 있다.

단백질 수준을 측정하기 위한 분석 방법으로는, 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS, 단백질 칩 등이 있으나 이로 제한되는 것은 아니다.

상기 분석 방법들을 통하여, 정상 대조군에서의 항원-항체 복합체의 형성량과 암 의심 환자에서의 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 암 마커 단백질 발현량의 증가 여부를 판단하여, 암 의심 환자의 실제 암 발병 여부를 진단할 수 있다.

본 발명에서 용어 항원-항체 복합체란 암 마커 단백질과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.

이러한 검출 라벨은 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

또한, 바람직하게는, 상기 암 마커에 대한 하나 이상의 항체가 기판 위의 정해진 위치에 배열되어 고밀도로 고정화되어 있는 단백질 칩을 이용하는 것이다. 단백질 칩을 이용하여 시료를 분석하는 방법은, 시료에서 단백질을 분리하고, 분리한 단백질을 단백질 칩과 혼성화시켜서 항원-항체 복합체를 형성시키고, 이를 판독하여, 단백질의 존재 또는 발현 정도를 확인하여, 암 발병 여부를 확인할 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 따르면, 대장암 진단에 있어서 켈그라눌린 B는 중간 수준의 특이도 및 높은 민감도를 나타냈고, DMBT1 마커 및 FOBT는 낮은 민감도는 낮고 특이도는 높다는 것을 확인하였다(표 6). 따라서, 켈그라눌린 B 및 DMBT1를 병용하여 함께 분변마커로 사용하여 본 결과, FOBT의 민감도 및 특이도를 함께 증가시킬수 있음을 확인하였다(도 3). 10594.95 (OD/mm³) 켈그라눌린 B/mg 분변 단백질의 컷오프에서, 대장암 진단의 민감도와 특이도는 83.1% 및 58.8% 였다. 한편, 21671.15(OD/mm³) DMBT1/mg 분변 단백질인 컷오프에서 대장암 진단을 위한 DMBT1의 민감도와 특이도는 25.3% 및 96.1% 였다. 또한 FOBT의 민감도 및 특이도는 51.9% 및 98.0% 였다(표 6). 한편 켈그라눌린 B 에 대한 양성예측도(PPV; positive predictive value) 및 음성예측도(NPV; negative predictive value)는 각각 76.7% 및 68.2% 값을 나타냈다. DMBT1에 대한 PPV 및 NPV는 각각 91.3% 및 44.1% 였고, 이들 수치는 FOBT 검사의 값(PPV 및 NPV에 대해 각각 97.6% 및 56.1%)과 유사하였다(표 6). 뿐만 아니라, 진행성 선종을 갖는 환자에 있어서, 각 분변 마커의 민감도, 특이도, 및 PPV, NPV는 오직 대장암만을 갖는 환자와 비교하여 크게 다르지 않았다. 더욱이, 대장암 진단에 대해, 켈그라눌린 B는 중간의 특이도 및 높은 민감도를 갖고 있었으나, DMBT1 마커 및 FOBT는 낮은 민감도 및 높은 특이도를 갖고 있었다(표 6). 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 양성률(positive rate)은 T 병기 또는 암 위치에 따른 대장암 및 선종(AA 대 비-AA) 하위그룹 간에 차이는 없으나, FOBT의 양성률은 T1-T3보다 T4 암에서 더 높았다(p=0.001)(표 7).

상기에서 기술한 바와 같이, 민감도는 해당 질환에 걸렸을 때 그 진단검사 결과가 양성으로 나타나게 될 확률을 나타내며, 특이도는 어떤 질환에 걸려 있지 않을 경우 검사결과가 음성으로 나올 확률을 나타낸다. 표 8에서, FOBT만을 사용했을 경우, 등록된 암환자 총 81 명중 42명(51.9 %)이 양성으로 곧, 암에 걸린 것으로 확인되었다. 층화조합검사의 일환으로 켈그라눌린 또는 DMBT1를 추가적인 마커로 사용하였을 때에는 33명이 암 환자로 더 선별되어 암 환자 81명 중 75 명(92.6 %)을 양성으로 감지하는 민감도 상승을 보여주었다. 그리고, FOBT만을 사용하여 암에 대한 음성 반응을 조사할 경우, 총 81명의 암 환자 중 6명(7.4 %)을 음성으로 판단하는 위음성을 보여주고 있으나, 켈그라눌린 및 DMBT1를 추가적인 마커로 사용하였을 때에는, 암을 갖지 않은 대조군 환자 총 51 명 중에서 29명(56.9 %)을 음성으로 감지하여 특이도가 상승하였다(표 8).

이로써, 켈그라눌린 B 및 및 DMBT1 단백질 마커를 FOBT 검사와 동시에 사용할 경우, 암 진단에 있어서 가장 중요한 특이도 및 민감도를 높일 수 있는 것을 확인하였고, 이는 곧, 암에 걸린 환자는 보다 더 정확하게 양성으로 선별할 수 있는 능력 및 암에 걸리지 않은 환자는 보다 더 정확하게 음성으로 선별할 수 있는 능력을 향샹시키는 방법을 제공할 수 있음을 의미한다.

본 발명은 암의 초기진단 및 예후를 판단할 수 있는 진단 마커들을 제공함으로써, 암의 치료 및 예후관리에 유용한 자료를 제공한다. 또한, 상기 암 진단 마커들은 암 특이적 항암제 개발연구에 이용될 수 있다. 또한 기존의 위음성 반응이 있던 FOBT와 비교하여 높은 특이도와 민감도를 지닌 검사방법을 제공하여 비침습적 방법으로 환자에게 부담을 주지 않고 간편하게 암을 진단할 수 있을 뿐만 아니라 진단의 정확도 및 민감도가 높아 암의 초기 진단에 유용하게 이용할 수 있다.

도 1은 대장질환에 따른 분변 마커의 발현 패턴을 도식화한 그림이다. DMBT1은 Deleted in Malignant Brain Tumors 1을, IBD는 염증성 장질환을, OD/mm³은 광학밀도를 의미한다.
도 2는 대장암 환자를 선별하는데 사용한 켈그라눌린 B와 DMBT1에 대한 ROC(receiver operator characteristics) 커브를 도식화한 그림이다. 커브는 50% 보다 더 큰 면적의 아래 지역에서 통계적으로 유의하였고, p 값은 0.0001 이하였다. 그리고 대장암 선별의 민감도 및 특이도에 대한 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 증가된 컷오프 레벨 효과를 도식화하고 있다. ROC 커브와 통계학을 이용하여 컷오프에서 10594.95 (OD/mm³)의 켈그라눌린 B/mg 분변 단백질과 21671.15 (OD/mm³)의 DMBT1/mg 분변 단백질 값을 결정하였다. 각 마커인 켈그라눌린 B, DMBT1, 및 FOBT의 커브 아래 면적은 각각 0.780, 0.626, 그리고 0.748이다. ROC 커브를 사용하여 컷오프 값 레벨을 결정하였다. 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 컷오프 값은 각각 10594.95 (OD/mm³) 및 21671.15 (OD/mm³)였다.
도 3은 각 마커에 근거하여 층화 조합 검사법을 도식한 그림이다.
도 4는 분변 층화 조합 검사법에 대한 시제품 진단 키트를 도식화한 그림이다. FOBT는 면역화학 분변잠혈검사(immunochemical fecal occult blood test)를, Cal B는 켈그라눌린 B, DMBT1는 deleted in malignant brain tumor 1을 의미한다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 실험 방법 및 준비

<1-1> 대장암 환자 및 정상인으로 부터의 분변 샘플 준비

본 발명의 실험을 위해 대장암 환자 83명, 대조군 환자 51명, 및 대장선종(colorectal adenoma) 환자 32명을 등록하였다. 등록된 환자들의 전반적인 기본적 특성을 하기 표 4에 나타냈다. 대장 내시경 검사 및 조직병리학을 바탕으로 대장암과 대장선종 환자들을 진단하였다. 수술 및 대장 내시경 검사를 통해 얻은 각각의 암종 및 선종 조직을 동일한 병리학자가 조직병리학적으로 검사하였고 AJCC 분류법에 따라 분류하였다. 본 발명자들은 진행성 선종(Advanced Adenoma; AA)을 1cm 이상 크기의 돌기(polyp), 또는 융모 조직 병리학(villous histopathology), 또는 암종(carcinoma)을 가진다고 정의하였다. 구역을 좌측 (left colon) 및 우측 결장(right colon)으로 나누었다. 우측 결장을 맹장으로부터 비장만곡(splenic flexus)까지로 정의하였다. 좌측 결장은 하류 결장부터 직장(rectum)까지로 정의하였다. 대장 내시경 검사 결과 아무것도 발견되지 않은 환자를 대조군 환자로 등록하였다. 환자의 특성에 따라 대장 전처리와 진정작용 후 각 환자에 대장 내시경 검사를 시행하였다. 대장 전처리 전에 분변시료를 수득하였다. 본 발명의 실험절차는 한국 국립 암센터의 심의위원회에 의해 심의 및 승인되었다(NCCNTS-08-354).

<1-2> 분변 시료 준비, 분석

분변 0.1g으로부터 프로테아제 저해제를 포함한 PBS에서 볼텍싱(vortexing) 및 10분간 12,000g에서 원심분리 과정을 거쳐서 분변 단백질을 추출하였다. 떨어진 펠릿(pellet)을 깨트리지 않으면서 상등액을 조심스럽게 수거하였고, 이를 웨스턴 블랏과 이온 트랩 질량 분석에 사용하였다.

<1-3> 웨스턴 블랏 분석

동일한 양의 분변 단백질(10 g)을 SDS-PAGE에 사용하였다. 전기영동 후, 단백질을 1.5% 탈지분유(Bio-Rad) 및 1 mM MgCl₂을 포함한 1% Tween 20-TBS 버퍼에서 4℃, 2시간 동안의 반응으로 블로킹된 PVDF (polyvinylidene fluoride) 막(Millipore)에 옮겼다. 이 막을 실온 하에서 2시간 동안 켈그라눌린 B (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) 또는 DMBT1 (Santa Cruz Biotechnology, Inc.)에 대한 1차 항체와 반응시켰다. 그 다음, 블로킹 용액으로 15분 동안 막을 3회 세척하였고, 실온에서 1시간 동안 희석된 HRP-결합 2차 항체(Southern Biotech, Birmingham, UK)와 반응시켰다. 그 후 블로킹 용액으로 15분간 막을 3회 세척하였고 WEST-ZOL플러스 화학발광(WEST-ZOLplus chemiluminescence; 인트론 바이오테크놀로지, 경기도, 한국) 시약과 1분간 반응 후 필름(Kodak BlueXB-1)에 노출하였다.

<1-4> 분변 단백질의 이온 트랩 분석

분변 단백질을 포함한 SDS-PAGE 겔을 절단하여 0.1 M 암모니움 바이카보네이트에 녹인 50% 아세톤나이트릴 용액으로 디스테인(destain)하고 SpeedVac 증발기로 건조하였다. 건조된 겔 조각을 37^oC 에서 밤새 50 ng 트립신(Promega, Madison, WI)을 포함한 pH 8.8의 25 mM 소디움 바이카보네이트 30μl를 사용하여 다시 스웰링(reswell)하였다. α-사이아노 4 하이드록시사이나믹 산(a-Cyano 4 hydroxycinnamic acid; BrukerDaltonics,Bremen,Germany) 20mg을 아세톤 : 에탄올(1:2, v/v) 1ml에 녹였고, 매트릭스 용액 0.5 μl를 시료와 동량으로 혼합하였다.

펩타이드 분리는 아질런트 1100 시스템(Agilent, Santa Clara, CA)으로 수행하였다. 단백질 분해 혼합액의 2μl를 C18-PepMap 컬럼(150mm, id 75 m; LC Packings)에 주입한 후, 60분간 0.1% FA에서 5 내지 50% ACN의 농도 구배로 분리하였다. 질량 분석기는 포지티브 모드에서 ESI로 세팅하였다. 실린지 펌프를 사용하여 자동 튜닝 및 ESI 포지티브 모드에서의 이온 트랩 질양 분석기(LTQ-XL, Thermo Electron Corporation, San Jose, CA) 보정을 위해 보정 용액을 주입하였다. 분해된 시료(트립신)의 질량 분석기 이온화 소스로의 주입을 액상 크로마토그래피 분리를 통해 수행하였다. 모세관 온도가 200 로 세팅되었을 경우 스프레이 전압을 +1.1 kV로 세팅하였으며, 모세관 전압을 +20 V 그리고 튜브 렌즈 전압을 +100 V에 세팅하였다. 보조 가스는 0으로 세팅하였다. 전 범위 스캔 실험을 수행하여 m/z 150 내지 2000 범위에서 선형적으로 트랩하였다. 상대적인 충돌 에너지를 변화 시키면서 조각 이온들의 강도를 측정하여, 체계적인 MS/MS 실험을 수행하였다. 분변 시료로부터 MS/MS 테이터를 획득하였다.

<1-5> 분변 잠혈 검사 (FOBT)

OC-센서 키트(EIKEN chemical Co. Ltd., Tokyo, Japan)를 사용하여, 블라인드 방식(blind fashion)으로 제작사 지시에 따라 FOBT를 수행하였다. 본 발명에 사용된 FOBT는 식이조절을 필요로 하지 않고, FOBT 양성반응에 대한 분석 컷오프 (cut-off)는 100ng Hb/mL였다.

<1-6> 통계 분석

리시버 오퍼레이터 특성 (receiver operator characteristics (ROC)) 곡선을 사용하여 분변 단백질의 진단능력을 평가하였다. ROC 곡선의 각 밑면적(AUC; Area Under the Curve)은 분석 프로그램을 사용하여 계산하였다. AUC 및 ROC 곡선을 바탕으로 각 마커의 컷오프 값을 결정하였다. 정량 테이터는 t-테스트를 사용하여 분석하였다. 비모수적(chi-square) 또는 Fisher의 정밀(Fishers Exact test) 검증을 사용하여 카테고리별 데이터를 분석하였다. P 값이 < 0.05 이면, 통계적으로 유의한 것으로 고려하였다. 모든 통계분석은 윈도우용 SPSS 소프트웨어 버전 14.0을 사용하여 실시하였다(Chicago, IL, USA).

실험예 1 : 각각 다른 그룹에 따른 분변 내 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현 분석

암, 대조군, 및 선종인 각각의 그룹에서 켈그라눌린 B의 평균 발현 수준은 각각 17919.19, 7960.73, 및 5477.52 (OD/mm³) 였다. 켈그라눌린 B의 평균 수준은 대조군(p<0.001) 또는 선종 그룹(p<0.001) 보다 암 그룹에서 현저하게 높았다(도 1). DMBT1의 평균 발현 수준은 대조군(p=0.003), 및 대장선종 그룹(p=0.048) 보다 암 그룹에서 더 높았다.

암 환자에서, 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현 수준은 T 병기(T stages) 또는 암 위치는 연관되지 않았다(표 5). 선종 그룹에서, 진행성 선종 (AA) 그룹 간의 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 발현 수준의 차이는 거의 없었다(표 5).

실험예 2: 대장암 진단에 있어서 각 분변 마커의 민감도 및 특이도 분석

ROC 곡선을 사용하여 대장암 각 마커의 컷오프 수준을 결정하였다. ROC 곡선과 통계학을 사용하여, 컷오프에서 10594.95 (OD/mm³)의 켈그라눌린 B/mg 분변 단백질 및 21671.15 (OD/mm³)의 DMBT1/mg 분변 단백질 값을 결정하였다. 각 마커인 켈그라눌린 B 및 DMBT1 그리고 FOBT의 AUC는 각각 0.780, 0.626, 및 0.748을 나타냈다(도 2).

10594.95 (OD/mm³) 켈그라눌린 B/mg 분변 단백질의 컷오프에서, 대장암 진단의 민감도와 특이도는 83.1% 및 58.8% 였다. 21671.15(OD/mm³) DMBT1/mg 분변 단백질인 컷오프에서 대장암 진단을 위한 DMBT1의 민감도와 특이도는 25.3% 및 96.1% 였다. 또한 FOBT의 민감도 및 특이도는 51.9% 및 98.0% 였다(표 6). 켈그라눌린 B 에 대한 양성예측도(PPV; positive predictive value) 또는 음성예측도(NPV; negative predictive value)는 각각 76.7% 및 68.2% 값을 나타냈다. DMBT에 대한 PPV 및 NPV는 각각 91.3% 및 44.1% 이였고, 이들 수치는 FOBT 검사의 값(PPV 및 NPV에 대해 각각 97.6% 와 56.1%)과 유사하였다(표 6).

게다가, 진행성 선종을 갖는 대장암 환자에 있어서, 각 분변 마커의 민감도, 특이도, 그리고 PPV, NPV는 대장암만을 갖는 환자와 비교하여 크게 다르지 않았다. 더욱이, AA를 포함한 대장암 진단에 있어서, 켈그라눌린 B는 중간의 특이도 및 높은 민감도를 갖고 있었으나, DMBT1 마커 및 FOBT는 낮은 민감도 및 높은 특이도를 갖고 있었다(표 6). 켈그라눌린 B 및 DMBT1의 양성률(positive rate)은 T 병기 또는 암 위치에 따른 대장암 및 선종(AA 대 비-AA) 하위그룹 간에 차이는 없으나, FOBT의 양성률은 T1-T3보다 T4 암에서 더 높았다(p=0.001)(표 7).

실험예 3: DMBT1 및 켈그라눌린 B 조합 분변 검사를 바탕으로한 FOBT 를 사용한 대장암 층화 조합 검사

대장암 스크리닝 방법으로 널리 사용되는 FOBT는 높은 특이도 및 낮은 민감도의 특성을 갖는다. FOBT 검사에서 양성반응을 보인 환자는 대장 내시경 검사를 하도록 권유 받아야 한다. 그러나, FOBT 검사가 음성반응을 보였더라도, 위음성(false negative)의 부분이 존재한다. 이에 본 발명의 켈그라눌린 B 및 DMBT1를 추가적인 분변마커로 사용할 경우 FOBT 검사의 민감도를 증가시킬 수 있음을 확인하였다(도 3).

층화 조합 검사법은, 대장암에서 단독으로 켈그라눌린 B 마커 또는 FOBT를 사용할 경우와 비교하여, 민감도를 증가시켰다. 본 발명의 층화 조합 검사법의 민감도 및 특이도는 대장암에서 92.6% 및 56.9%를 나타냈다(표 8). AA를 포함한 대장암의 추가적인 검사에서, 또한 층화 조합 검사법도, 단독 분변 마커(즉, FOBT, 켈그라눌린 B 또는 DMBT1 마커)만을 사용할 경우와 비교하여, 역시 민감도를 증가시켰다(표 8).

Claims (11)

1. DMBT1(Deleted in Malignant Brain Tumors 1) 및 켈그라눌린 B (Calgranulin B) 단백질의 수준을 측정하는 제제를 포함하는 대장암 진단용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서, 상기 단백질의 수준을 측정하는 제제는 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것인 대장암 진단용 조성물.
   
3. 삭제
4. 제1항 또는 제2항에 따른 조성물을 포함하는 대장암 진단용 키트.
   
5. 제4항에 있어서, 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 대장암 진단용 키트.
   
6. 대장암 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 DMBT1 및 켈그라눌린 B 단백질의 수준을 측정하는 단계;
   상기 단백질의 수준을 정상 대조군 시료의 단백질 수준과 비교하는 단계; 및
   상기 단백질의 수준이 정상 대조군 시료의 단백질 수준보다 증가 시 대장암으로 판단하는 단계를 포함하는 대장암 진단을 위한 정보의 제공방법.
   
7. 제6항에 있어서 상기 대장암 의심 환자는 분변잠혈반응검사(FOBT)에서 대장암 의심 환자로 판정된 환자인 것인 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
   
8. 제6항에 있어서, 상기 단백질 수준은 해당 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것인 대장암 진단을 위한 정보의 제공방법.
   
9. 제6항에 있어서, 상기 단백질 수준을 측정하기 위한 방법은 웨스턴 블랏, ELISA, 방사선면역분석, 방사 면역 확산법, 오우크테로니 면역 확산법, 로케트 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법, 보체 고정 분석법, FACS 또는 단백질 칩 방법 중 어느 하나를 이용하는 것인 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
   
10. 제6항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 분변인 대장암 진단을 위한 정보의 제공 방법.
    
11. 삭제

Images