CN101101290A

CN101101290A - 肿瘤血清标志物及其应用

Info

Publication number: CN101101290A
Application number: CNA2006100703924A
Authority: CN
Inventors: 常晓天; 朱有名; 韩金祥; 朱波
Original assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Current assignee: Shandong Provincial Pharmaceutical Biological Tech Research Center
Priority date: 2006-11-30
Filing date: 2006-11-30
Publication date: 2008-01-09

Abstract

本发明公开了一种肿瘤血清标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4组成；其中：所述肿瘤指乳腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌之一。本发明还公开了所述肿瘤血清标志物在制备检测肿瘤的临床诊断试剂中的应用。利用本发明提出的肿瘤血清标志物制备的肿瘤临床诊断试剂或试剂盒可以只检测一个指标而实现对被检者是否患有恶性肿瘤的初步确定，以较少的费用在较短的检测时间里完成健康普查工作，并为临床诊断提供了可靠的依据。

Description

肿瘤血清标志物及其应用

技术领域

本发明涉及一种血清标志物及其应用，尤其涉及一种肿瘤血清标志物及其应用。

背景技术

肿瘤标记物是指肿瘤细胞直接合成和分泌的肿瘤相关抗原、活性蛋白、激素、受体、酶或同工酶，它们当中的一些可以通过循环进入血液或体液。血液和体液中的肿瘤标志物可通过生物化学反应、放免法、酶免法、电化学发光等方法检测出来。

发现肿瘤标记物对肿瘤诊断、治疗、监测复发、判断疗效和抗癌药物设计有十分重要的意义。当前，医院通常使用的肿瘤标记物多达数十种，如血清中的AFP(甲胎蛋白)、CEA(癌胚抗原)、CA125(糖类抗原125)、CA199(糖类抗原199)、CA153(糖类抗原153)、CA50(糖类抗原50)、CA242(糖类抗原242)、CA72-4(糖类抗原72-4)、NSE(神经原特异性烯醇化酶)、SCC(鳞癌相关抗原)、HTG(甲状腺球蛋白)、TPS(组织多肽特异性抗原)、PSA(前列腺特异抗原)、fPSA(游离前列腺特异抗原)、cPSA(结合型前列腺特异抗原)、FT3(三碘甲状腺原氨酸)、FT4(甲状腺素)、TSH(促甲状腺素)、CT(降钙素)、PTH(甲状旁腺素)、β-HCG(绒毛膜促性腺激素)、E2(雌二醇)、P(孕酮)、LH(黄体生成素)、FSH(促卵泡生成素)、PRL(催乳素)、GH(生长激素)、ACTH(促肾上腺皮质激素)、VMA(尿香草扁桃酸)等，但这些标记物的特异性和识别范围并不十分理想，肿瘤的不同时期和肿瘤细胞的类型差别会出现不同的预后结果。在肿瘤检测中，由于单项肿瘤标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，通常采用有针对性的联合检测才能为临床诊断提供有价值的数据；例如，检测肝癌时通常联合检测AFP、CEA、SF和CA199，检测大肠癌时测CEA、SF、CA199和CA50，检测卵巢癌时测CEA、AFP和CA125，检测肺癌时测CEA、CA50和CY211，检测乳腺癌时测CEA、SF、CA153和CA50，检测前列腺癌时测PSA和FPSA。这样势必导致患者为获得对临床诊断有意义的数据需要检测多项生理指标，而检查这些指标时通常需付千元以上的检测费，对患者本人和社会均带来很大的负担。所以，研发新的检测范围更加广泛的肿瘤标志物是当前许多著名研究机构和制药企业的重点研究课题。

近期的研究发现肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4或PADI4)是类风湿性关节炎的关联基因，其编码的酶在该病发病过程发挥非常重要的作用。PADI4可以在钙离子存在的情况下对其它一些蛋白进行翻译后修饰，将肽中精氨酸转化成瓜氨酸(citrulline)，此过程称之为瓜氨酸化(citrullination)。许多研究证明类风湿性关节炎关节滑膜与肿瘤在组织学上有很多相似性，包括纤维蛋白大量沉淀、细胞异常增殖和分化、毛细血管过量增生和高凝血活性，但这两种疾病在分子水平上的内在联系还不清楚。

申请人用免疫组织化学法对含有48种癌组织204个标本的组织芯片进行了检测，发现PADI4在许多种癌组织特别是各器官的腺癌癌细胞中有非常明显的表达，但该基因在健康组织和非肿瘤病变组织中均无明显表达。申请人进一步用Western blot法对许多肿瘤组织进行了检测，实验结果证实了以上免疫组化的发现。这是首次发现PADI4特异地表达于多种肿瘤组织，其相关研究成果已发表在美国《Molecular Carcinogenesis》(2006；45：183-196)上，并申报了中国国家发明专利(公开号CN1712964A)。

在以上研究基础之上，申请人又制备了4个针对PADI4不同氨基酸片段的多克隆抗体，利用免疫组织化学对表达PADI4的肿瘤组织做进一步细致的观察和分析。通过对山东各地区医院病理科提供的1000余例术后组织标本进行分析，发现PADI4只在恶性肿瘤组织中广泛表达；而在各类良性肿瘤(例如乳腺纤维瘤、肌瘤)和一般炎症组织(如胃炎、胃溃疡、肠炎、前列腺增生)中，PADI4只在一些组织的部分间充质细胞和腺体内皮细胞中表达。同时，我们还发现PADI4在一些临床诊断上未确诊疑似肿瘤标本中有大量表达。

以上工作阐明了PADI4在肿瘤组织中的表达以及可能的致病机制，该研究成果可帮助医生通过免疫组织化学方法掌握肿瘤组织结构和特征，从而做出正确的临床诊断。但是，在临床诊断肿瘤发病与否和健康普查时，通常都是首先检测患者或被检人员血液，然后依据该检验结果再做进一步的生理、生化和病理组织检测。鉴于PADI4在肿瘤组织中特异地存在，申请人因此研究PADI4在肿瘤患者血清中的表达和PADI4成为潜在的肿瘤血清标志物的可能性。经检索，还未见此类相关的报道。

发明内容

针对现有肿瘤血清标志物敏感性和特异性不能满足临床诊断的需要，本发明在研究肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)在肿瘤组织中的表达及作用机制的基础上提出一种肿瘤血清标志物及其在制备检测肿瘤的临床诊断试剂或试剂盒中的应用。

本发明所述的肿瘤血清标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylargininedeiminase 4，PAD4或PADI4)组成；其中所述肿瘤优选指乳腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌。

确定和支持上述肿瘤血清标志物是肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)的实验证据：

申请人用酶联免疫吸附分析(ELISA)方法对多种肿瘤患者的血清进行了分析。与同器官的良性肿瘤、肿瘤切除手术后患者血清和健康人血清相比较，申请人发现PADI4在乳腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌等恶性肿瘤患者血清中的表达水平明显增高。虽然研究证明PADI4是类风湿性关节炎的关联基因并在该病滑膜组织和滑膜液中呈现高水平表达(见附图)，但我们的实验发现类风湿关节炎、骨关节炎、强直性脊柱炎患者血清中的PADI4表达水平与健康人的表达水平接近(见附图)。同时，我们的实验也显示PADI4在食道癌、胃癌、肠癌、肺癌患者血清中表达无显著变化。

以上发现对研发肿瘤检测试剂和诊断试剂具有潜在的重要的意义。虽然实验显示PADI4并不是在所有肿瘤患者的血清中都有表达，但是，PADI4能同时在如此之多的恶性肿瘤患者的血清中表达，在目前使用的肿瘤标记物中已属罕见，PADI4应符合标记物的特征要求，因此，肽基精氨酸脱亚胺酶4(PADI4)可以确定为一种检测范围很广的肿瘤血清标志物。

上述肿瘤血清标志物在制备检测肿瘤的临床诊断试剂中的应用。

鉴于PADI4在多种肿瘤患者的血清中都呈现高水平表达，因此，本领域技术人员可以通过抗原抗体特异结合为原理的生化反应、放免法、酶免法、电化学发光等方法，以抗PADI4抗体为中心研发临床诊断试剂或试剂盒，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法，用于检测患者血清PADI4表达水平，为医生临床诊断肿瘤提供快速、有力的诊断依据。另外，利用肽基精氨酸脱亚胺酶4(Peptidylarginine deiminase 4，PAD4或PADI4)作为肿瘤血清标志物，临床普查中可以只检测PADI4一个指标而实现对被检者是否患有恶性肿瘤的初步筛查，以较少的费用在较短的检测时间里完成健康普查工作，并为临床诊断提供了可靠地依据。

附图说明

用ELISA方法检测PADI4在各种肿瘤患者血清中的表达水平。

ELISA实验采用兔抗PADI4多克隆抗体为第一抗体，碱性磷酸酶标记的鼠抗兔免疫球蛋白抗体为第二抗体，对硝基苯磷酸二钠盐(p-Nitrophenyl phosphate，pNpp)为显色剂，在405nm下测定吸收峰值(O.D.)，吸收值代表PADI4表达水平。

柱状图中的每个柱代表一个患者或健康人血清在405nm下的吸收值。

■代表恶性肿瘤血清中PADI4的表达水平，

■代表恶性肿瘤手术后血清中PADI4的表达水平，

代表同器官良性肿瘤血清中PADI4的表达水平，

□代表对照组健康人血清中PADI4的表达水平。

图1.PADI4在乳腺癌患者血清、乳腺癌术后患者血清、乳腺纤维患者血清和健康人血清中的表达水平。

图2.PADI4在PADI4在肝癌、肝癌术后、肝海绵状血管瘤患者血清和健康人血清中的表达。

图3.PADI4在肾癌、肾癌术后患者血清和健康人血清中的表达。

图4.PADI4在卵巢癌、卵巢癌术后患者和健康人血清中的表达。

图5.PADI4在PADI4在膀胱癌、膀胱癌术后患者和健康人血清中的表达。

图6.PADI4在PADI4在前列腺癌、前列腺癌术后、前列腺增生患者和健康人血清中的表达。

图7.PADI4在类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、骨关节炎患者血清中的表达。

具体实施方式

实施例1.酶联免疫吸附实验(ELISA)测定PADI4在血清中的表达

1.试剂准备

(1)0.05M碳酸盐缓冲液(Carbonate-bicarbonate buffer)包被稀释液，pH9.6：

碳酸钠(Na₂CO₃)1.59g，碳酸氢钠(NaHCO₃)2.93g，叠氮化钠(sodium azide)0.2g，加水至1000毫升，pH调至9.6。

(2)PBS缓冲液(pH7.4-7.6)：

氯化钠(NaCl)8g，无水磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.15g，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.2g，氯化钾(KCl)0.2g，加水至1升。

(3)封闭液：

100毫升PBS缓冲液(pH7.4)溶液加脱脂奶粉3g。

(4)PBS-Tween buffer(PBST)洗涤液，pH7.4：

以上PBS缓冲液(pH7.4)溶液1升加吐温20(Tween-20)0.5毫升，加水至1升，pH调至7.4。

2.实验按常规ELISA步骤进行，具体步骤如下：

(1)将血清用包被稀释液稀释10-20倍，向酶标板每孔中加入稀释样品100ul。酶标板摄氏4度下放在湿盒里过夜，此步骤将血清蛋白吸附在酶标板孔上。

(2)弃去样品液，向每孔中加入PBST 200ul，然后弃去PBST。以同样方式洗酶标板三次。

(3)向每孔加入封闭液200ul，封闭蛋白非特异性吸附。酶标板室温下在湿盒中反应半小时。

(4)弃去封闭液，向每孔中加入PBS稀释的抗PADI4抗体100ul。酶标板室温下在湿盒中反应2小时，血液中PADI4抗原物质与抗PADI4抗体特异性结合。

(5)弃去第一抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(6)向每孔中加入PBS稀释的碱性磷酸酶标记的抗兔IgG抗体(即抗抗体或二抗，如goatAP-conjugated anti-rabbit IgG，Sigma，A3687)100ul。酶标板室温湿盒中反应1小时。

(7)弃去抗抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(8)向酶标板每孔加入显色剂对硝基苯磷酸二钠盐(如Alkaline Phosphatase YellowpNpp Liquid Substrate System for ELISA，Sigma，A3469)100ul，在摄氏37度下进行发色反应。

(9)用酶标仪检测反应结果，在405nm下测定吸收值。吸收值代表血液中PADI4表达水平。

实施例2：制备ELISA(直接法)检测血清PADI4试剂盒

血清PADI4检测试剂盒包含：

(1)酶标板(条)；

(2)0.05M碳酸盐缓冲液样本包被稀释液，pH9.6；

(3)封闭液：PBS缓冲液(pH7.4)含3％脱脂奶粉；

(4)抗PADI4抗体，抗体用辣根过氧化物酶常规标记；

(5)PBS抗体稀释液：PBS缓冲液含2％BSA；

(6)洗涤液：PBS缓冲液含0.05％Tween-20(PBST)；

(7)显色剂：0.4％四甲基联苯胺(TMB)；

(8)终止液：2％H₂SO₄。

(9)PADI4重组蛋白或阳性和阴性对照物质。

实施例3：ELISA(直接法)检测血清PADI4试剂盒的应用

(1)取所需用量的预包被板(条)，将待检血清用样品稀释液稀释10-20倍加入酶标板孔中每孔100ul，酶标板摄氏4度下放在湿盒里过夜。

(2)弃去样品液，向每孔加入PBST 200ul，然后弃去PBST。用洗涤液洗酶标板3次。

(3)向每孔加入封闭液200ul，酶标板室温下在湿盒中反应半小时。

(4)弃去封闭液，向每孔加入抗PADI4抗体100ul。酶标板室温下在湿盒中反应2小时。

(5)弃去第一抗体溶液，用PBST洗酶标板三次。

(6)向每孔中加入显色剂100ul，在摄氏37度下进行发色反应。

(7)每孔加终止液50ul。

(8)用酶标仪检测反应结果，在450nm下测定吸收值。

(9)根据各孔吸光度值大小，与对照组吸光度值比较，计算结果。

实施例4：ELISA(双抗体夹心法)检测血清PADI4

(1)用0.05M pH9.6碳酸盐包被缓冲液将抗PADI4单克隆抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。向酶标板反应孔中加入稀释抗体100ul。酶标板4℃过夜。

(2)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗酶标板反应孔3次。

(3)加PBS稀释20倍的待检血清样品100ul于上述已包被酶标板的反应孔中。置酶标板于37℃孵育1小时。同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔。

(4)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。

(5)用辣根过氧化物酶常规标记兔抗PADI4抗体。加100ul酶标兔抗PADI4抗体于各反应孔中。酶标板于37℃孵育0.5～1小时。

(6)弃去孔内溶液，用PBST洗涤缓冲液洗3次。

(7)加100ul底物液显色TMB溶液于各反应孔中，发色反应37℃下进行10～30分钟。

(8)于各反应孔中加50ul 2M硫酸终止发色反应。

(8)用酶标仪检测反应结果，在450nm下测定吸收值。

(9)根据各孔吸光度值大小，与对照孔吸光度值比较，按常规方法计算结果。

实施例5：检测PADI4金标试纸的制备及金标法快速检测血清中PADI4表达水平

金标试纸采用双抗原夹心法免疫测定原理。

制备PADI4金标试纸时，可以先将胶体金与抗PADI4单克隆抗体结合，同时将兔抗PADI4抗体和羊抗鼠IgG抗体分别点样于硝酸纤维素膜检测区和质控区。当待检标本中含有PADI4蛋白时，金标记抗体与PADI4抗原抗体结合，形成金标-抗体-抗原-复合物。由于层析作用，反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动。当遇到兔抗PADI4抗体时，形成金标抗PADI4单克隆抗体-PADI4抗原-兔抗PADI4多克隆抗体复合物，产生红色金颗粒沉淀线。如果样本中无PADI4抗原，检测区中就不会有色带出现。在任何情况下，质控区都应出现色带。

Claims

1.一种肿瘤血清标志物，由肽基精氨酸脱亚胺酶4组成；其中：所述肿瘤指乳腺癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、膀胱癌之一。

2.权利要求1所述肿瘤血清标志物在制备检测肿瘤的临床诊断试剂中的应用。

3.如权利要求2所述肿瘤血清标志物的应用，其特征是，以常规方法制备抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体，建立检测肽基精氨酸脱亚胺酶4的定性或定量方法。

4.如权利要求3所述肿瘤血清标志物的应用，其特征是，以抗肽基精氨酸脱亚胺酶4抗体为中心，以常规方法制备临床诊断试剂或试剂盒。