CN111638368A - 一种用于早期筛查诊断的试剂盒 - Google Patents

一种用于早期筛查诊断的试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物工程领域,提供了环瓜氨酸肽(CCP)抗原在制备检测外周血清、全血和末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、肿瘤标志物:甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌细菌感染或者病毒感染的试剂盒的新用途。本发明通过CCP抗原‑抗体结合反应的原理进行检测,采用免疫胶乳增强法、Poct即时检验、ELISA法、化学发光法、微流控芯片方法、胶体金渗滤法及层析法,可应用于心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和肿瘤标志物的诊断。采用本发明的试剂盒当天能收到检测报告,检测结果准确而且方便。

Description

一种用于早期筛查诊断的试剂盒
技术领域
本发明生物工程领域,尤其涉及试剂盒,特别是采用环瓜氨酸肽(CCP) 抗原的试剂盒用于检测外周血清、全血和末梢血诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染、病毒感染、肿瘤标志物:甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌。
背景技术
环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)是将含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段中的两个丝氨酸替换成半胱氨酸,形成与β-转角结构相似的二硫键而成为环瓜氨酸肽。
瓜氨酸是类风湿病患者血清中抗丝聚蛋白相关抗体识别的主要组成性抗原决定簇成分。采用CCP为抗原基质检测类风湿患者血清中的CCP抗体,具有较高的敏感性和极高的特异性。有研究提示CCP参与了类风湿发病过程。除此之外,CCP抗体阳性的类患者更容易出现关节的骨质损坏。因此,CCP抗体阳性者的愈后可能较差,应采取更积极的治疗措施。
环瓜氨酸肽抗原是以合成的环化瓜氨酸多肽(CCP)为抗原的自身抗体,对类风湿关节炎(RA)具有较高的敏感性和特异性,是RA早期诊断的一个高度特异指标。临床多采用酶联免疫吸附法检测(ELISA)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测外周血清、全血和末梢血诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染、甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的早期诊断的试剂盒所述的这种用于检测外周血清、全血和末梢血诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染、甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌早期筛查的试剂盒。
本发明提供了环瓜氨酸肽抗原在制备用于检测外周血清、全血和末梢血诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染、甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的早期诊断的试剂盒的新用途。
进一步的,测定环瓜氨酸肽采用金标Poct即时检验方法、胶体金渗滤法及层析法、免疫胶乳增强比浊法、采用化学发光法、采用ELISA法或者微流控芯片进行检测。
进一步的,采用环瓜氨酸肽抗原-抗体结合反应进行检测。
进一步的,所述的试剂盒包括检测板、环瓜氨酸肽抗原、由重组金黄色葡萄球菌A蛋白标记的胶体金结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品,所述的检测板由一个塑料盒底盒构成,所述的塑料盒底盒中设置有一个检测反应孔,所述的检测反应孔上设置有一层吸水层,所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜,在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加环瓜氨酸肽抗原,所述的塑料盒底盒上设置有一个塑料盒面盖。
进一步的,所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液,磷酸盐溶液的pH在7.0-7.5之间,牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1%。
进一步的,所述的洗涤液是含有Tween20的Tris-HCl溶液,Tris-HCl溶液的pH在7.0-7.5之间,Tween20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0.05%。
进一步的,在每毫升胶体金结合物中,重组金黄色葡萄球菌A蛋白的质量为0.025毫克。
进一步的,所述的阳性参考品为浓度大于6RU/ml的兔抗CCP抗体。
进一步的,所述的阴性参考品为浓度小于6RU/ml的兔抗CCP抗体。
本发明的工作原理是:本试剂盒采用间接法免疫吸附法原理用以检测人血清中的CCP抗体。将CCP抗原包被于硝酸纤维素膜,制成固相抗原,用以捕获人血清中可能存在的CCP抗体。再将SPA标记于胶体金,形成胶体金结合物作为示踪物。如被测人血清中含有CCP抗体,则形成固相抗原—CCP抗体—胶体金结合物,呈红色斑点反应,其颜色深浅与被测血清中含有的CCP抗体的浓度有关,但不呈比例关系。
本发明也可用于修饰环瓜氨酸环化多肽抗原为:
Figure BDA0002537180060000031
本发明涉及到CCP抗原-抗体结合方法诊断上述疾病。
本发明和已有技术相比,其技术进步是显著的。本发明的环瓜氨酸肽 (CCP)抗体间接捕获法原理及胶体金渗滤检测技术定性体外检测试剂盒,用以检测人血清中的CCP抗体,其中的瓜氨酸肽是有18个多肽组成,无生物毒性。本发明同时可应用在免疫胶乳增强法、胶体金渗滤法及层析法、Poct即时检验、ELISA法、化学发光法,在同时扩展到CCP抗原-抗体结合反应、微流控芯片的方法,可应用于检测外周血清、全血和末梢血诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染、甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的早期诊断。采用本发明的试剂盒当天能收到检测报告,检测结果准确而且方便。
附图说明
图1显示了检测板反应孔中心检测点有红色斑点,检测板反应孔C端控制点显示红色斑点,为阳性结果。
图2显示了检测板反应孔中心检测点无红色斑点,检测板反应孔C端控制点显示红色斑点,为阴性结果。
图3显示了检测板反应孔中检测点、检测板反应孔C端控制点均无红色斑点显示,则该试验无效。
具体实施方式
实施例1生产工艺
1.1胶体金结合物制备工艺
1.1.1制备胶体金
1.1.1.1 0.05%氯化金溶液300毫升,加热至沸。
1.1.1.2加入5%柠檬酸三钠3.6毫升。
1.1.1.3继续加热煮沸15分钟,停止加热,待冷至室温,用蒸馏水恢复至原体积。
1.1.2胶体金标记
1.1.2.1胶体金100ml。
1.1.2.2加1.0%无水碳酸钠溶液1.2毫升,校pH值6.4-7.2。
1.1.2.3加SPA(1mg/ml)2.5毫升,室温静止30分钟。
1.1.2.4搅拌加入10×Tris-HCl 20毫升调控pH 7.2-7.5。
1.1.2.5搅拌加入BSA 2克、PEG20000 1克、ProClin300 0.2毫升。
1.2检测板制备工艺
1.2.1装配检测板,取塑料盒底盖,放置吸水层,在吸水层上放置硝酸纤维素膜,再覆盖上一层滤网,盖上塑料盒面盖,压紧。
1.2.2检测点抗原:环瓜氨酸肽(CCP)抗原(1mg/ml)1毫升加入1mol/L NaHCO3 0.1毫升,混匀。
1.2.3取检测点抗原2ul,点加在检测板反应孔中心的硝酸纤维素膜上制成检测板。
1.3配制封闭液及洗涤液
1.3.1配制封闭液,1%牛血清白蛋白-0.02mol pH 7.0-7.5磷酸盐溶液。
1.3.2配制洗涤液,0.05%Tween20-0.05mol pH 7.0-7.5Tris-HCl溶液。
1.4制备CCP抗体参考品。
1.4.1阳性参考品制备,将封闭液15毫升加入CCP抗体(200RU/ml)5毫升,混匀,约为CCP抗体50RU/ml。
1.4.2阴性参考品制备,将封闭液13.5毫升加入阳性参考品1.5毫升,混匀,为CCP抗体<6RU/ml。
1.4.3灵敏度参考品制备:将封闭液14.5毫升加入阳性参考品2毫升,混匀,约为CCP抗体6RU/ml。
1.4.4阴、阳及灵敏度参考品CCP抗原浓度均以
环瓜氨酸肽(CCP)抗体测定试剂盒(ELISA)
(沪食药监械(准)字2010的检测结果为依据。
4.5正常参考范围确定,以环瓜氨酸肽(CCP)抗体测定试剂盒(ELISA) 的正常参考范围CCP抗体<6RU/ml为依据,由于本法为定性检测,样品CCP 抗体含量在正常参考范围内检测点不显色,故选择以CCP抗体约为6RU/ml 的样品做灵敏度参考品。
实施实例1:环瓜氨酸肽金标测定试剂盒
检验方法
金标定性法,采用上海北加生化试剂有限公司生产的FT-J5金标读数仪测定。
1、使用前先将试剂和样品取出,在室温中放置15—30分钟,使其恢复至室温。
2、取出检测板。
3、在检测板反应孔中心加入封闭液2滴,待封闭液完全渗入。
4、用移液器在检测板反应孔中心加入待测样品40微升,待样品完全渗入。
5、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴,待洗涤液完全渗入。
6、在检测板反应孔中心加入胶体金结合物3滴,待胶体金结合物完全渗入。
7、在检测板反应孔中心加入洗涤液4滴,待洗涤液完全渗入,目测结果。
【检验结果判读】
使用者在进行样品检测时,可能会出现如下三种情况:
a.检测板反应孔中心检测点有红色斑点,检测板反应孔C端控制点显示红色斑点,为阳性结果。图示1:
b.检测板反应孔中心检测点无红色斑点,检测板反应孔C端控制点显示红色斑点,为阴性结果。图示2:
c.检测板反应孔中检测点、检测板反应孔C端控制点均无红色斑点显示,则该试验无效。图示3:
【检验结果的解释】
1、阴性结果,则提示该样本的CCP抗体含量<6RU/mL是正常范围。
2、阳性结果,则提示该样本的CCP抗体含量≥6RU/mL是不正常范围。
【检验方法的局限性】
1、本方法只能定性测定人血清样本中环瓜氨酸肽(CCP)抗体,仅作为辅助诊断使用。
2、反应斑点的稳定性:在2-30分钟内阳性斑点不会褪色,阴性结果仍无变化。
20例检测结果:(心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞病人)
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
20例健康人(肝功能、肾功能、HBsAg、HIV、丙肝等皆为阴性)以6RU/L以下为阴性。
阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
阴性 阴性 阴性 阴性 阴性
20例心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞病人和20例健康人结果对照,完全符合临床诊断。
10种肿瘤病人的60例结果:(甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌)
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性 阳性
实施实例2:免疫胶乳增强比浊法试剂盒
仪器:7100生化仪
操作方法:将样本采用日立7100生化分析仪进行测定。在所述的一个将样本采用生化分析仪测定的步骤中,将样品加入试剂ⅠR1后,37℃孵育5min,读测第1点样本A1,加入试剂ⅡR2,37℃孵育5min,读测第2点样本A2,样本A=样本A2-样本A1;还包括一个将校准品采用日立7100生化分析仪测定的步骤,在所述的一个将校准品采用生化分析仪测定的步骤中,将校准品加入试剂ⅠR1后,37℃孵育5min,读测第1点校准A1,加入试剂ⅡR2,37℃孵育5min,读测第2点校准A2,校准A=校准A2-校准A1;
Figure 1
上述测定的参数为:温度37℃,波长600或700nm,R1:160uL R2: 40uL。样本或校准品3μl,R1:160μl,R2:40μl,反应时间为10分钟。
测20例正常人(肝功能、肾功能、HBsAg、HIV、丙肝等皆为阴性)
5.2RU/L 4.8RU/L 5.6RU/L 4.8RU/L 4.4RU/L
3.5RU/L 1.6RU/L 5.7RU/L 3.4RU/L 5.8RU/L
5.3RU/L 2.5RU/L 1.3RU/L 4.6RU/L 5.5RU/L
2.7RU/L 4.9RU/L 2.2RU/L 2.4RU/L 2.8RU/L
浓度在6RU/L以下是正常。
20例健康人临床诊断结果在6RU/L以下,为阴性,符合临床诊断标准。
检测60例肿瘤患者(甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结·直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌)
Figure BDA0002537180060000091
浓度在6RU/L以下是正常。
60例临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例3:20例脑溢血的标本(免疫比浊法)
仪器:7100生化仪
操作方法同实施例2
Figure 2
试剂盒参数:波长600或700nm,R1:160uL R2:40uL。
20例检测结果:
45.2RU/L 20.5RU/L 38.4RU/L 23.1RU/L 34.5RU/L
60.8RU/L 64.3RU/L 42.5RU/L 24.5RU/L 37.3RU/L
25.7RU/L 55.6RU/L 22.4RU/L 46.8RU/L 49.8RU/L
52.4RU/L 48.1RU/L 65.9RU/L 37.4RU/L 52.5RU/L
浓度在6RU/L以下是正常。
20例脑溢血病人临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例4:20例心或脑梗塞的标本(免疫胶乳增强比浊法)
仪器:7100生化仪
操作方法同实施实例2
Figure 3
参数:波长600或700nm,R1:160uL R2:40uL。
20例检测结果
39.1RU/L 26.4RU/L 39.6RU/L 45.8RU/L 41.2RU/L
60.9RU/L 39.4RU/L 52.3RU/L 33.9RU/L 43.0RU/L
18.6RU/L 30.7RU/L 48.2RU/L 20.5RU/L 36.8RU/L
26.2RU/L 18.7RU/L 24.1RU/L 55.3RU/L 35.7RU/L
浓度在6RU/L以下是正常。
20例心或脑梗塞病人临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例5:20例心或脑血栓的标本(免疫胶乳增强比浊法)
仪器:7100生化仪
操作方法同实施实例2
Figure 4
参数:波长600或700nm,R1:160uL R2:40uL。
20例检测结果
24.3RU/L 32.4RU/L 52.8RU/L 44.5RU/L 22.7RU/L
19.5RU/L 55.3RU/L 37.5RU/L 57.8RU/L 28.9RU/L
46.2RU/L 27.1RU/L 46.3RU/L 24.9RU/L 37.2RU/L
35.5RU/L 26.5RU/L 28.7RU/L 53.6RU/L 45.5RU/L
浓度在6RU/L以下是正常。
20例心或脑血栓病人临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例6:20例心或脑栓塞的标本(免疫胶乳增强比浊法)
仪器:7100生化仪
操作方法同实施实例2
Figure 5
参数:波长600或700nm,R1:160uL R2:40uL。
20例检测结果:
浓度在6RU/L以下是正常。
44.8RU/L 26.3RU/L 34.5RU/L 55.3RU/L 44.5RU/L
54.2RU/L 45.5RU/L 25.6RU/L 64.8RU/L 37.4RU/L
55.7RU/L 34.8RU/L 47.1RU/L 49.5RU/L 51.5RU/L
39.8RU/L 46.3RU/L 36.2RU/L 65.2RU/L 29.7RU/L
20例心或脑栓塞病人临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例7:20例化学发光法
本发明化学发光法检测方法,其中包括以下步骤:
1、仪器:MPC-1化学发光测定仪
2、将CCP抗原固定在固相表面,加入待测样品,温育,然后用洗涤液洗涤;同时设立CCP标准品的对照;
3、加入化学发光底物工作液,放置一段时间;
4、测量发光值,得到待测样本的CCP浓度值。
20例检测结果:20例脑梗塞病人
39.8RU/L 26.7RU/L 39.4RU/L 45.6RU/L 41.5RU/L
60.4RU/L 39.8RU/L 52.2RU/L 33.5RU/L 43.6RU/L
18.5RU/L 30.5RU/L 48.3RU/L 20.8RU/L 36.3RU/L
26.5RU/L 18.2RU/L 24.9RU/L 55.9RU/L 35.4RU/L
浓度在6RU/L以下是正常。
20例临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
实施实例8:50例革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒感染的标本(化学发光法)
50例检测结果
Figure BDA0002537180060000131
浓度在6RU/L以下是正常。
50例例革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和病毒感染的病人临床诊断结果在6RU/L以上,为阳性,符合临床诊断标准。
本发明的上述实施例仅是为清楚地说明本发明所作的举例,而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等,均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (9)

1.用环瓜氨酸肽抗原制备试剂盒检测外周血清、全血和末梢血用于诊断心或脑血栓、心或脑梗、脑溢血、心或脑栓塞、细菌感染或者病毒感染和甲状腺癌、肝癌、胃癌、子宫癌、宫颈癌、肺癌、乳腺癌、食道癌、鼻咽癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、肾癌、胰腺癌、膀胱癌的早期筛查的试剂盒的新用途。
2.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:测定环瓜氨酸肽采用胶体金渗滤法及层析法、化学发光法、微流控芯片可用于Poct即时检验。并可于ELISA法、免疫比浊法及免疫胶乳增强比浊法进行临床检验常规检测。
3.据权利要求1所述的用途,其特征在于:采用环瓜氨酸肽抗原-抗体结合反应进行检测。
4.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的试剂盒包括检测板、环瓜氨酸肽抗原、由重组金黄色葡萄球菌A蛋白标记的胶体金结合物、封闭液、洗涤液、阳性参考品和阴性参考品,所述的检测板由一个塑料盒底盒构成,所述的塑料盒底盒中设置有一个检测反应孔,所述的检测反应孔上设置有一层吸水层,所述的吸水层上设置有一层硝酸纤维素膜,上面覆盖一层滤网,在检测反应孔对应的硝酸纤维素膜上点加环瓜氨酸肽抗原,所述的塑料盒底盒上设置有一个塑料盒面盖。
5.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的封闭液是含有牛血清白蛋白的磷酸盐溶液,磷酸盐溶液的pH在7.0-7.5之间,牛血清白蛋白在磷酸盐溶液中的重量百分比为1%。
6.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的洗涤液是含有Tween20的Tris-HCl溶液,Tris-HCl溶液的pH在7.0-7.5之间,Tween20在Tris-HCl溶液中的重量百分比为0.05%。
7.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:在每毫升胶体金结合物中,重组金黄色葡萄球菌A蛋白的质量为0.025毫克。
8.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的阳性参考品为浓度大于6RU/ml的兔抗CCP抗体。
9.根据权利要求1所述的用途,其特征在于:所述的阴性参考品为浓度小于6RU/ml的兔抗CCP抗体。
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