KR101570655B1 - 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로서, 상기 바이오마커 조성물 및 진단방법을 통해, 패혈증의 진행 여부를 용이하게 진단할 수 있다. 또한, 상기 방법을 통해 패혈증의 진행을 조기에 진단하고 이와 관련된 치료를 효과적으로 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

Description

패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법 {Biomarker composition for diagnosis of sepsis and the method of diagnosis using the same}

본 발명은 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것이다.

패혈증(sepsis, 敗血症)은 녹농균, 대장균, 연쇄상구균, 포도상구균, 폐렴균 같은 미생물에 감염되었을 때 미생물이나 그 미생물이 생산한 독소에 의해 오한과 함께 고열, 관절통, 두통, 권태감 등의 전신적인 증상이 나타나는 상태를 말한다. 이러한 증상이 심해지면 저혈압이 동반되고 소변량이 줄며 패혈성 쇼크가 나타나기도 한다(Riedemann, N.C. et al., 2003). 미생물의 감염 경로를 잘 알 수 없는 경우도 있으나 맹장염, 중이염, 피부화농증, 욕창, 폐질환, 담낭염, 신우염, 골수염 등이 패혈증의 원인 병소로 알려져 있다. 혈액검사와 소변검사, 뇌척수액 검사 등을 통해 패혈증을 진단할 수 있으며 백혈구 수와 급성염증성물질이 증가한 경우도 패혈증을 진단하는데 도움을 준다.

아직까지 패혈증의 치료를 위한 근본적인 치료제는 확인되지 않은 상태이다. 패혈증은 통상적인 염증 억제 치료방법으로는 잘 낫지 않으며, 유일하게 FDA 승인을 받은 드로트레코긴 알파(drotrecogin alfa, Xigris^®, Engl. Ranieri, V.M. et al., 2012)조차도 임상단계에서 패혈증에 대한 치료 효과가 명확하지 않아 이에 대한 연구가 중단되어 있는 실정이다. 현재 패혈증은 주로 항생제나 항진균제 주사로 치료하고, 치료 약제와 기간은 미생물의 종류에 따라 결정한다. 또 환자의 상태에 따라 혈액투석 또는 수혈을 하기도 한다. 항생제와 항진균제가 잘 들으면 패혈증은 완치되기도 하지만, 약제에 내성이 있는 미생물에 감염된 경우와 면역력이 약한 환자인 경우, 또 너무 늦게 치료를 시작한 경우 등에서는 치료가 어려워 환자가 사망하기도 한다. 또한, 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크는 항생제 치료(antibiotic therapy)를 비롯한 다양한 집중 치료(intensive care)(Anderson, R.N. 2002; Andreu Ballester, J.C. et al., 2008; Angus, D.C. et al., 2001)의 발전에도 불구하고, 선진국에서 세번째로 사망률이 높은 질병이다. 따라서, 초기 패혈증 증상이 중증 패혈증이나 패혈성 쇼크로 이어지기 전에 이를 진단 및 치료하는 것이 이러한 패혈성 사망률을 낮추는 매우 중요한 요건이 될 수 있다. 한편, 패혈증은 이를 진단하는 마커가 잘 알려져 있지 않아 초기 패혈증 증상을 진단하는데 많은 어려움이 있다.

한편, 본 발명자들은 패혈증의 진행 과정에 비례하여 각종 단백질이 증가하는 것을 확인함으로써, 패혈증의 진단용 바이오마커 조성물로 하는 본 발명을 완성할 수 있었다.

Anderson, R.N. 2002. Deaths: leading causes for 2000. Natl Vital Stat Rep 50: 1-85. Andreu Ballester, J.C. et al., 2008. Epidemiology of sepsis in the Valencian Community (Spain), 1995-2004. Infect Control Hosp Epidemiol 29: 630-634. Angus, D.C. et al., 2001. Epidemiology of severe sepsis in the United States: analysis of incidence, outcome, and associated costs of care. Crit Care Med 29: 1303-1310. Bone, R.C. et al., 1992. The ACCP-SCCM consensus conference on sepsis and organ failure. Chest 101: 1481-1483. Chien, J.Y. et al., 2005. Low serum level of high-densit lipoprotein cholesterol is a poor prognostic factor for severe sepsis. Crit Care Med 33: 1688-1693. Clackson, T. et al., 1991. Making antibody fragments using phage display libraries. Nature 352: 624-628. Gibot, S., A. et al., 2005. Time-course of sTREM (soluble triggering receptor expressed on myeloid cells)-1, procalcitonin, and C-reactive protein plasma concentrations during sepsis. Crit Care Med 33: 792-796. Hanley, J.A. et al., 1983. A method of comparing the areas under receiver operating characteristic curves derived from the same cases. Radiology 148: 839-843. Kohler, G. et al., 1976. Derivation of specific antibody-producing tissue culture and tumor lines by cell fusion. European J Immunology 6: 511-519. Marshall, J.C. et al., 2003. Measures, markers, and mediators: toward a staging system for clinical sepsis. A report of the Fifth Toronto Sepsis Roundtable, Toronto, Ontario, Canada, October 25-26, 2000. Crit Care Med 31: 1560-1567. Ranieri, V.M. et al., 2012. Drotrecogin alfa (activated) in adults with septic shock., Engl J Med 366: 2055-2064. Riedemann, N.C. et al., 2003. Novel strategies for the treatment of sepsis., Nat Med 9: 517-524.

본 발명의 목적은 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 유효성분으로 포함하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물을 제공한다.

<패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군>

Cystatin-SN (Accession No. IPI00305477.6);

Isoform 2 of Alpha-actinin-1 (Accession No. IPI00909239.1);

Profilin-1 (Accession No. IPI00216691.5);

TUBA1B protein (Accession No. IPI00793930.1);

Triose phosphate isomerase (Accession No. IPI01013543.1);

L-lactate dehydrogenase B chain (Accession No. IPI00219217.3);

Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Accession No. IPI00795257.3);

Moesin (Accession No. IPI00219365.3);

Isoform 1 of L-lactate dehydrogenase A chain (Accession No. IPI00217966.9);

Pyruvate kinase (Accession No. IPI00847989.3);

Elongation factor 2 (Accession No. IPI00186290.6);

Pigment epithelium-derived factor (Accession No. IPI00006114.5);

Alpha-fetoprotein (Accession No. IPI00022443.1);

Thyroxine-binding globulin (Accession No. IPI00292946.1);

Alpha-2-macroglobulin (Accession No. IPI00478003.3);

Vitamin D-binding protein isoform 1 precursor (Accession No. IPI00555812.5);

Complement C3(Fragment) (Accession No. IPI00783987.2);

Alpha-2-HS-glycoprotein (Accession No. IPI00953689.1); 및,

Vimentin variant 3 (Accession No. IPI00975690.1).

상기 면역원성 단편은 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 단백질에 대한 항체에 결합(인식)되는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편을 의미한다.

또한, 본 발명은 상기 '패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편'을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 패혈증 진단제를 제공할 수 있다.

또 다른 양태에서 본 발명은 상기 '패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편'을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 패혈증 진단용 단백질칩을 제공할 수 있다.

이에, 본 발명은 상기 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 마찬가지로, 본 발명은 상기 항체를 함유하는 진단제를 이용한 패혈증 진단방법과 상기 단백질칩을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다.

상기 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법은,

(1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하고, 상기 바이오마커 조성물을 준비하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질 또는 바이오마커 조성물에, 상기 바이오마커 조성물(패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편)에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 상기 바이오마커 조성물의 단백질량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있다. 이 때, 상기 바이오마커 조성물은 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물, 또는 패혈증에 걸리지 않은 건강한 사람 또는 동물의 체내 혈중 농도로 적절하게 희석되어 사용될 수 있다.

상기 진단제를 이용한 패혈증 진단방법은,

(1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 건강한 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질에, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 상기 진단제를 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 진단제를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와, 건강한 사람 또는 동물의 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있다.

상기 단백질칩을 이용한 패혈증 진단방법은,

(1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 건강한 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질과, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 상기 단백질칩을 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 단백질칩을 정량 검출 및 분석하여 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 건강한 사람 또는 동물의 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있다.

이하 본 발명을 자세하게 설명한다.

패혈증 증상 세포는 패혈증이 진행되고 있는 사람(환자) 또는 동물의 세포를 말하는 것이다. 따라서, 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에 속하는 단백질은 패혈증 환자 또는 패혈증 증상을 갖는 동물의 혈관내피세포에서 세포 외로 분비되는 단백질로서, 패혈증 증상이 없는 대조군과 비교하여 상기 단백질 군에 속하는 단백질 3종 이상이 혈액, 혈장, 체액 등에서 증가할 수 있다.

본 발명에서는 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 단백질들을 3종 이상 선택하여 진단함으로써 패혈증 증상을 보다 정확하게 진단할 수 있으며, 다른 증상으로 인해 개개의 단백질이 개별로 증가하는 현상을 통해 패혈증 증상을 잘못 진단하는 것을 방지할 수 있다. 따라서, 보다 정확한 패혈증 증상을 진단하기 위해서는 4종 이상, 더 바람직하게는 5종 이상의 단백질을 선택하여 패혈증을 진단하는 것이 좋다.

상기 항체를 함유하는 진단제에는, 표지된 2차 항체, 발색단, 항체와 컨쥬게이트된 효소 및 그 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등이 포함될 수 있다.

상기 항체는 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 바람직하게는 상기 항체는 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식(결합)하는 항체를 의미하며, 폴리클론 항체, 모노클론 항체 및 재조합 항체를 모두 포함할 수 있다. 상기 항체를 생성하는 것은 당업계에 널리 공지된 기술을 이용하여 용이하게 제조할 수 있다. 상기 폴리클론 항체는 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질에서 선택되는 단백질 또는 이의 면역원성 단편(항원)을 동물에 주사한 뒤 채혈한 혈청에서 얻을 수 있다. 상기 동물로는 염소, 토끼, 돼지, 양 등 임의의 동물 숙주를 이용할 수 있다. 상기 모노클론 항체는, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 알려진 대로, 하이브리도마 방법(Kohler, G. et al., 1976), 또는, 파지 항체 라이브러리(Clackson, T. et al., 1991) 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 상기 하이브리도마 방법을 수행하기 위해서는 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주동물의 세포와, 암 또는 골수종 세포주를 이용할 수 있다. 이 후, 폴리에틸렌글라이콜 등을 이용하는 방법, 즉, 본 발명이 속하는 기술분야에 널리 공지된 방법으로, 이러한 두 종류의 세포들을 융합시킨 후, 항체 생산 세포를 표준적인 조직 배양방법으로 증식시킬 수 있다. 이 후, 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 서브클로닝에 의해 균일한 세포 집단을 얻은 후, 본 발명의 단백질에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내 또는 생체 내에서 대량 배양할 수 있다. 상기 파지 항체 라이브러리 방법은, 본 발명의 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편에 대해 특이적으로 결합되는 항체 유전자를 획득하여, 이를 파지(phage)의 표면에 융합 단백질 형태로 발현하여 항체 라이브러리를 시험관 내에서 제작하고, 상기 라이브러리로부터 본 발명의 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 결합하는 모노클론 항체를 분리 및 제작하여 수행할 수 있다. 상기 방법들에 의하여 제조된 항체는 전기영동, 투석, 이온교환 크로마토그래피, 친화 크로마토그래피 등의 방법으로 분리할 수 있다.

상기 항체는 2개의 전체 길이 경쇄(light chain) 및 2개의 전체 길이 중쇄(heavy chain)를 가지는 완전한 형태 뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함할 수 있다. 항체 분자의 기능적 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2, F(ab)2, Fv 등이 있다.

한편, 본 발명의 항체를 함유하는 진단제는 통상적인 진단제 조성물에 포함되는, 동결건조형태의 항체, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 포함할 수 있다. 상기 항체는 방사종, 형광원, 효소 등에 의해 표지화될 수 있는 것으로서, 상기 항체는 이뮤노어세이 키트(immunoassay 키트 : ELISA, antibody coated tube test, lateral-flow test, potable biosensor), 웨스턴블롯(western blot) 키트, 단백질칩 등에 다양하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 함유하는 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 또는, 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 진단제를 이용한 패혈증 진단방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 진단방법은,

(1공정) 패혈증 관련 시료(패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람[환자] 또는 동물의 시료)와 대조군 시료(건강한 사람 또는 동물의 시료)에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질에, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증 관련 시료와 대조군 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있다.

더 바람직하게는,

(1공정) 패혈증 관련 시료(패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람[환자] 또는 동물의 시료)에서 단백질을 분리하고, 본 발명의 바이오마커 조성물을 준비하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질 또는 바이오마커 조성물에, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증 관련 시료와 본 발명의 바이오마커 조성물의 단백질량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있다. 또는,

(1공정) 패혈증 관련 시료(패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람[환자] 또는 동물의 시료)와 대조군 시료(건강한 사람 또는 동물의 시료)에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질에, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 본 발명의 진단제를 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 진단제를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증 관련 시료와 대조군 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수 있으며, 또 다른 양태로서,

(1공정) 패혈증 관련 시료(패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람[환자] 또는 동물의 시료)와 대조군 시료(건강한 사람 또는 동물의 시료)에서 단백질을 분리하는 단계;

(2공정) 상기 1공정의 단백질과, 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 본 발명의 단백질칩을 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,

(3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 단백질칩을 정량 검출 및 분석하여, 패혈증 관련 시료와 대조군 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;

를 포함할 수도 있다.

상기 1공정의 패혈증 관련 시료는 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람(환자) 또는 동물에게서 추출할 수 있다. 대조군 시료는 건강한 사람 또는 동물에게서 추출할 수 있거나, 본 발명의 바이오마커 조성물을 이용할 수도 있다.

또한, 바람직하게는, 상기 시료는 사람 또는 동물의 조직, 세포 등일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 뇨, 혈액, 혈장, 혈청 등일 수 있으며, 가장 바람직하게는 혈청인 것이 더 좋으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 동물은 패혈증이 발병할 수 있는 동물이라면 무엇이든지 다 가능하며, 바람직하게는, 돼지, 소, 염소, 토끼, 개, 양, 말, 쥐(마우스, 레트), 원숭이를 비롯한 포유동물이라면 무엇이든지 다 가능하다. 상기 대조군 시료에서 단백질을 분리하는 대신에 상기 본 발명의 바이오마커 조성물에 포함된 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 이용할 수도 있다.

상기 1공정에서 단백질을 분리하는 과정은 공지된 공정을 이용하여 수행할 수 있으며, 단백질의 양은 당업자에게 알려진 다양한 방법으로 측정할 수 있다.

상기 2공정의 항원-항체 복합체란 본 발명의 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편과 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미한다. 즉, 상기 항원은 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 뜻할 수도 있다.

즉, 상기 분석방법을 통하여 대조군 시료의 항원-항체 복합체의 형성량과 패혈증이 진행되고 있을 것이라고 의심되는 시료에서 항원-항체 복합체의 형성량을 비교할 수 있고, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질의 발현량을 판단하여 실제 패혈증이 진행되고 있는지의 여부를 진단할 수 있다.

상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 신호 크기를 통하여 정량적으로 측정할 수 있다. 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물질, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 라벨로 효소를 사용하는 경우, 이용할 수 있는 효소로는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제 또는 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스터라아제, 글루코스 옥시다아제, 헥소키나아제 등이 있으나, 상기 기재된 범위로 제한되지는 않는다. 상기 형광물질로는 플루오레신, 피코시아닌, 플루오레스카민 등이 있으나, 상기 기재된 물질로 제한되는 것은 아니다. 상기 리간드로는 바이오틴 유도체 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 발광물질로는 루시페린 등이 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 미소입자로는 콜로이드, 금 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 레독스 분자로는 퀴논, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 방사선 동위원소에는 ³H, ¹⁴C 등이 포함되나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 진단방법은, 웨스턴 블롯(western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), RIA(radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오크털로니면역확산법(ouchterlony immunodiffusion), 로켓면역전기영동법(rocket immunoelectrophoresis), 조직면역염색법(immunohistochemistry), 면역침전분석법(immunoprecipitation), 보체고정분석법(complement fixation assay), FACS(fluorescense activated cell sorter), 단백질 칩(protein chip) 등에 적용할 수 있으나, 기재된 방법에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 함유하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물 및 이를 이용한 진단방법에 관한 것으로서, 상기 바이오마커 조성물 및 진단방법을 통해, 패혈증의 진행 여부를 용이하게 진단할 수 있다. 또한, 상기 방법을 통해 패혈증의 진행을 조기에 진단하고 이와 관련된 치료를 효과적으로 할 수 있는 방법을 제공할 수 있다.

도 1은 SILAC법에 기반한 LPS 처리된 EA.hy926 세포에서의 프로테오믹스 분석 결과를 나타낸다.
도 2는 LPS 처리된 HUVEC의 세포배양액(Media) 또는 세포용출액(Lysate)에서의 모에신 단백질 발현량을 확인한 웨스턴 블롯 결과이다.
도 3A는 건강한 사람과 증상별 패혈증 환자들의 모에신 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 3B는 도 3A의 패혈증 환자들을 15일 후에 생존자와 사망자들로 분류하여 모에신 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.
도 3C은 CLP 수술을 한 마우스의 혈청에서의 모에신 단백질 발현량을 확인한 ELISA 결과이다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1. 프로테오믹스>

실시예 1-1. 세포 준비

HUVEC의 일종인 인간내피세포주(transformed human endothelial cell line)인 EA.hy926를 노스캐롤라이나 대학에서 공급받아 사용하였다(Dr. C. Edgell, University of North Carolina at Chapel Hill, NC, USA). EA.hy926 세포는 FBS(fetal bovine serum) 10%(w/v)와 항생제(페니실린 G 및 스트렙토마이신)가 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium, Invitrogen; Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 37℃에서 배양하였다.

실시예 1-2. 세포용출액으로부터 단백질 샘플 준비

패혈증 증상에서의 단백질 변화를 확인하기 위한 대조군 구성을 위해 먼저 SILAC(stable isotope labeling by/with amino acids in cell culture) 실험을 수행하였다. 이를 위해 EA.hy926 세포를 SILAC 배지에서 7번 계대배양하여 방사성동위원소가 결합된 아미노산(heavy amino acid)을 이용하여 EA.hy926 세포 내의 단백질에 표지하였다. *SILAC 배지 : DMEM에 100㎎/ℓ의 L-Lysine-¹³C₆-¹⁵N₂ 및 100㎎/ℓ의 L-Arginine-¹³C₆-¹⁵N₄(Cambridge Isotope Laboratories; Andover, MA, USA)이 함유된 배지.

한편, 이와는 별개로 EA.hy926 세포를 방사성동위원소가 없는 DMEM 배지에서 유지배양하였으며, 패혈증 증상을 유도하기 위해서 1㎍/㎖의 LPS(lipopolysaccharide, Sigma; St. Louis, MO, USA)를 12시간 또는 24시간 동안 처리하였다.

상기 SILAC 배지에서 배양된 세포와 LPS를 처리한 세포에서 세포배양액을 각각 별도로 수집하였다. 배양액이 제거된 세포들은 각각 RIPA 완충액(25mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1%[w/v] NP-40, 1% sodium deoxycholate[w/v] 및 0.1% sodium dodecyl sulfate[w/v])에 넣고 5초 동안 3번씩 초음파를 이용하여 세포를 분쇄후 14,000g, 4℃에서 10분간 원심분리하여 상등액을 수거하여 세포용출액(cell lysates)을 얻었고, 세포용출액 내의 총단백질은 BCA 어세이 키트로 확인하였다. 이 후, 방사성동위원소가 표지된 EA.hy926 세포의 용출액(100㎍의 단백질)과 LPS 처리된 EA.hy926 세포의 용출액(100㎍의 단백질)을 혼합하였다(대조군은 LPS 처리된 것 대신 무처리군 혼합). 상기 세포용출액의 혼합물에 TCA(trichloroacetic acid)를 10%(v/v)가 되도록 첨가하여 혼합하고, TCA가 첨가된 세포용출액의 혼합물을 4ㅀC에서 밤새 보관하여 단백질이 침강되도록 하였다. 이 후 14,000g, 4℃ 조건에서 10분간 원심분리하여 펠렛(pellets)을 얻은 후, 상기 펠렛을 아세톤(ice-cold 상태로서 4℃ 내외)으로 2번 세척하여 50mM 탄산수소암모늄(ammonium bicarbonate)에 현탁하여 세포용출액으로부터 단백질 샘플을 얻었다.

실시예 1-3. 세포배양액으로부터 단백질 샘플 준비

다음으로는 세포 외로 분비된 단백질을 분석하기 위해 실시예 1-2에서 수집했던 세포배양액을 방사성동위원소가 표지된 것과 LPS 처리한 것을 각각 50㎖ 튜브에 넣은 후, 세포용출액에서 단백질을 침강시켰던 것과 동일한 방법을 이용하여 단백질을 침강시켰다. 세포배양액에서 침강된 단백질을 50mM 탄산수소암모늄에 현탁한 후, BCA 어세이로 단백질 농도를 측정하였다. 단백질 농도가 측정되면, 방사성동위원소가 표지된 세포배양액의 단백질 100㎍과 LPS가 처리된 세포배양액의 단백질 100㎍을 혼합하여 세포배양액으로부터 단백질 샘플을 얻었다(대조군은 LPS 처리된 것 대신 무처리군 혼합).

실시예 1-4. 단백질의 펩타이드화

실시예 1-2의 세포용출액으로부터 얻은 단백질과 실시예 1-3의 세포배양액으로부터 얻은 단백질(재용해한 현탁액)에, 각 단백질(재용해한 현탁액) 중량의 1/50이 되도록 트립신(Mass Sequence grade, Promega사)을 가한 후 이를 37℃에서 밤새 반응시켜 단백질을 펩타이드화하였다. 트립신의 소화작용으로 생성된 펩타이드(tryptic peptides) 용액에는 100㎕의 15mM 디티오트레이톨(15mM dithiothreitol in 25 mM ammonium bicarbonate)을 가하여 56℃에서 30분간 반응하여 펩타이드간의 이황화결합(disulfide bonds)을 제거하였다. 그 다음으로는 100㎕의 60mM 요오드아세트아미드(100㎕ of 60mM iodoacetamide in 25mM ammonium bicarbonate)를 가해 30분간 실온의 암실에서 반응시켜 펩타이드를 알킬화하였다. 이 후 알킬화된 펩타이드 용액에 100㎕의 75mM 시스테인(100㎕ of 75mM cysteine)을 가하고 30분 동안 실온의 암실에서 반응시켰다. 시스테인 반응 후 펩타이드 용액 중량의 1/100의 트립신을 가하고 이를 37℃에서 4시간 동안 반응시킨 후 50% 아세토니트릴(50%[v/v] acetonitrile in 5% trifluoroacetic acid) 용액을 가해 모든 반응을 중단시켜 펩타이드를 얻었다. 이렇게 얻은 펩타이드는 원심진공농축기(centrifugal vacuum concentrator)를 이용하여 건조함으로써, 최종적으로 트립신으로 분해된 펩타이드를 수득하였다('세포용출액으로부터 얻은 펩타이드' 및 '세포배양액으로부터 얻은 펩타이드'). 상기 트립신으로 분해된 펩타이드는 Pierce C18 Tips(Thermo Scientific; Rockford, IL, USA)을 이용하여 염 성분을 제거한 후 온라인 2D LC-MS/MS(online 2D LC-MS/MS analysis) 분석에 사용하였다.

실시예 1-5. 2D LC-MS/MS 분석

실시예 1-4에서 얻은 트립신으로 분해된 펩타이드는 온라인 2D-LC-MS/MS 시스템(online 2D-LC-MS/MS system, online 2 dimensional liquid chromatography tandem mass spectrometry)을 이용하여 분석하였다. 상기 온라인 2D-LC-MS/MS 시스템은 나노스케일의 LC 시스템(nanoscale ACQUITY Ultra Performance LC System, Waters Corporation; Milford, MA, USA) 및 나노-전자스프레이 소스(nano-electrospray source)를 탑재한 질량분석기(hybrid linear ion trap/Fourier transform-ion cyclotron resonance mass spectrometer, LTQ FT, Thermo Scientific)와 연결되어 있다.

각각의 0.1% 개미산(0.1 formic acid, w/v) 용액에 용해시킨 펩타이드 용액은 5㎕씩 소분하여 컬럼에 주입하였고, 강한 양이온 교환 상(cation exchange phase)에서 C18상(C18 phase)으로 염의 농도차(salt gradient)를 이용하여 분리하였다. 처음 10분 동안은 샘플로부터 염을 제거하였고, 염이 제거된 펩타이드 샘플은 5㎕/min의 유속으로 오토샘플러 루프(autosampler loop)에 주입하였다. 이렇게 주입된 펩타이드는 온라인 2D-LC 분리(online 2D-LC separation)의 양이온 교환 컬럼(5μm, 3cm)을 이용하여 6단계로 염농도를 달리한 조건으로 용출하여 재분리된 펩타이드를 얻었다. 6단계로 염농도를 달리한 조건은 5㎕씩의 0, 50, 100, 250, 500mM 암모늄아세테이드(용매 : 0.1%[w/v] 개미산 및 5%[w/v] 아세토니트릴) 용액을 각각 가한 후, 9㎕의 500mM 암모늄 아세테이트(용매 : 0.1%[w/v] 개미산 및 30%[w/v] 아세토니트릴)를 가하여 설정하였다.

상기에서 용출된 재분리 펩타이드는 5μm 직경의 오리피스(orifice)를 갖는 100-μm 실리카 튜브가 적층된 미세컬럼(50-㎜ homemade microcapillary column consisting of C18, Aqua; particle size 3μm)을 이용하여 다시 분리하였다. 이 때의 이동상 용매 A와 용매 B는 0.1%(w/v) 개미산을 포함하는 0% 아세토니트릴과 100% 아세토니트릴 용액을 이용하였다. 이 후 펩타이드는 200nℓ/min의 속도로서 5~35%(w/v)의 상기 용매 B에서 90분간 용출하였고 35~95%(w/v)의 용매 B를 이용하여 10분간 용출하였다. 크로마토그래피를 수행하는 동안 질량분석기(LTQ FT)를 데이터-의존 모드(data-dependent mode)로 작동시켰다.

MS 데이터는 다음의 파라미터(parameters)를 이용하여 얻었다. 컬럼을 통해 용출되는 펩타이드 이온의 아미노산 서열 확인을 위해 용출되는 시점을 크기별 5개 이온을 선택하여 깨뜨려서 생성되는 스팩트럼을 확보하고, 차순위에 용출되는 펩타이드이온 전체 양을 확인 크기별 5개 이온을 선택하는 과정을 반복하였다. CID 스캔은 35% 정규화된 충돌 에너지(35% normalized collision energy)와 3-마이크로스캔 평균(3-microscan averaging)을 갖는 선형이온트랩(linear ion trap)을 이용하여 얻었다. 전체 스캔(full scan)은 100,000의 질량 해상도(mass resolution)를 갖는 FT-IRC(fourier transform ion cyclotron resonance)을 이용하여 얻었다. 분리창(isolation window)은 ±1Da에 세팅되었다. 이전에 검출된 이온(fragmented ion)들은 60초 동안 재검출 되지 않았다.

실시예 1-6. 단백질 동정 및 정량

실시예 1-5에서 얻은 스팩트럼 정보를 이용하여 펩타이드와 단백질의 동정은 Mascot(version 2.3; Matrix Science; London, UK)에 연결된 Proteome Discoverer(version 1.3; Thermo Scientific)를 이용하여 수행하였다. 이에 대한 데이터베이스로는 International Protein Index(version 3.87, 91,464 단백질 정보를 포함;ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/IPI)를 이용하였다. 검색 파라미터로는 모노이소토픽 매스(monoisotopic mass : precursor mass error of 50 ppm, fragment ion mass error of 0.8 Da에서 선택됨)를 사용하였다. 이 때, 트립신이 잘려지지 않고 남은 펩타이드의 분해를 위한 효소로서 사용되었다. 시스테인 카르바미도메틸레이션(Cysteine carbamidomethylation, 57.021 Da)이 고정 수식(fixed modification)으로 사용되었고, 메티오닌 산화(15.995 Da), ¹³C₆-¹⁵N₂가 표지된 라이신(¹³C₆-¹⁵N₂ labeled lysine, 8.014 Da) 및 ¹³C₆-¹⁵N₄ 표지된 아르기닌(¹³C₆-¹⁵N₄ labeled arginine, 10.008 Da)이 변화 수식(variable modification)으로 사용되었다. 디코이 검색(decoy search)이 수행되었고, 0.05의 FDR(false discovery rate)과 20 이상의 Mascot scores를 위해 펩타이드를 여과하였다. 정확한 단백질의 동정을 위해서는 단백질을 이루는 펩타이드가 최소 두 개 이상 요구되었다.

지금까지 얻은 SILAC 샘플 단백질의 정량분석을 위해서는 Proteome Discoverer의 이벤트 분석기(event detector) 및 전구체 이온 정량자 알고리즘(precursor ion quantifier algorithms)을 사용하였다. 이 때의 전구체 이온쌍(precursor ion pairs)은 2ppm 질량 가변성(mass variability) 및 0.2분 지연시간 저항력(retention time tolerance)을 갖는다. 단백질 비율은 'LPS-자극된 단백질'과 '방사성동위원소가 결합된 아미노산으로 표지된 단백질'을 비교한 비율로 계산하였다('LPS-자극된 단백질'/'방사성동위원소가 결합된 아미노산으로 표지된 단백질').

실시예 1-7. 바이오인포매틱스

유전자 온톨로지(Gene Ontology) 분석을 위해서는 본 발명자들이 작성한 Perl script를 이용하여 모든 종류의 인간 단백질들의 강화값(enrichment values)을 계산하기 위한 기초자료로서 이용되었다. 피셔 검정법(two-tailed Fisher's exact test)이 강화값의 정확성을 위한 테스트를 위해 사용되었으며, FDR(false discovery rate) 대조군이 사용되었다. 적외선 열지도(heat map)를 이용하여 유전자 온톨로지 강화 유의성(Gene Ontology enrichment significance)이 표현되었다. KEGG PATHWAY 데이터베이스(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes PATHWAY database)를 이용하여 경로 분석(pathway analysis)이 수행되었다.

실시예 1-8. 분석결과

상기 실시예 1-1 내지 1-7의 전체과정을 통해 패혈증 증상에서 변화되는 단백질의 증감을 각 생리학적인 활성에 따라 그룹화하여 도 1과 같이 나타내었으며, 이 결과 중에서 패혈증 증상으로 인해 현저하게 증가하는 단백질만을 선정하여 하기 표 1에 나타내었다.

Accession	Description	fold (Light/Heavy)
		세포 용출액		세포 배양액
		12 h	24 h	12 h	24 h
IPI00305477.6	Cystatin-SN	-	-	-	4.695
IPI00909239.1	Isoform 2 of Alpha-actinin-1	1.047	1.037	-	3.861
IPI00216691.5	Profilin-1	0.979	0.961	-	3.663
IPI00793930.1	TUBA1B protein	-	-	-	3.610
IPI01013543.1	Triose phosphate isomerase	-	-	-	3.135
IPI00219217.3	L-lactate dehydrogenase B chain	0.941	0.914	1.074	3.067
IPI00795257.3	Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase	-	-	Only light	3.021
IPI00219365.3	Moesin	0.955	0.955	-	3.012
IPI00217966.9	Isoform 1 of L-lactate dehydrogenase A chain	0.938	0.929	-	2.915
IPI00847989.3	Pyruvate kinase	-	0.935	-	2.865
IPI00186290.6	Elongation factor 2	1.055	1.044	-	Only light
IPI00006114.5	Pigment epithelium-derived factor	-	-	Only light	Only light
IPI00022443.1	Alpha-fetoprotein	-	-	Only light	Only light
IPI00292946.1	Thyroxine-binding globulin	-	-	Only light	Only light
IPI00478003.3	Alpha-2-macroglobulin	-	-	Only light	Only light
IPI00555812.5	Vitamin D-binding protein isoform 1 precursor	-	-	Only light	Only light
IPI00783987.2	Complement C3 (Fragment)	-	-	Only light	Only light
IPI00953689.1	Alpha-2-HS-glycoprotein	-	-	-	Only light
IPI00975690.1	Vimentin variant 3	-	-	-	Only light

상기 표 1의 결과에서 단백질의 양은 세포 용출액과 세포 배양액 각각에서의 단백질 검출량을 fold값(Light/Heavy ; Light는 LPS를 처리한 세포에서의 단백질 검출량, Heavy는 SILAC 배양된 세포에서의 단백질 검출량)으로 기재하였다. LPS 무처리(SILAC 배양 조건)시에는 검출되지 않다가 LPS 처리 12시간이나 24시간 째에 검출되는 단백질은 'Only light'로 기재하였다. 따라서, 상기 표 1에서 1보다 큰 값 또는 Only light는 LPS를 처리한 세포, 즉, 패혈증 증상 세포에서 패혈증 증상이 나타나지 않는 세포(LPS 무처리)에 비해 각각의 단백질 발현이 증가함을 나타낸다.

이에, 상기 표 1에 개시된 19개의 단백질이 LPS로 유도된 패혈증 세포의 배양액에서 현저하게 증가하는 단백질임을 알 수 있다. 또한, 상기 단백질들은 세포 배양액에서 증가하는 것들이기 때문에 환자들의 혈청 샘플만을 분석하더라도 패혈증의 진행여부를 용이하게 진단할 수 있다.

실시예 2. LPS 처리된 HUVEC을 이용한 웨스턴 블롯 수행

실시예 1에서 확인된 단백질들이 패혈증 증상의 지표가 될 수 있는지를 검증하기 위해 대표적으로 모에신 단백질을 이용하여 패혈증 증상에서의 모에신 발현정도를 확인하였다. 이를 위해 1차 배양(primary culture)된 HUVEC(human umbilical cord vein endothelial cells)을 Cambrex Bio Science(Charles City, IA, USA)에서 구입하였으며, EBM-2 기본 배지(basal media) 및 이에 공급되는 성장 보충물(Cambrex Bio Science)을 첨가하여 배양하였고 3~5번째 계대배양된 HUVEC을 실험에 사용하였다.

상기 3~5번째 계대배양된 HUVEC에 LPS를 100ng/㎖으로 0~24시간 동안 처리하고(대조군은 saline 처리) 세포배양액을 수집한 후 남은 세포로부터 세포용출액을 얻었다. 상기 HUVEC의 세포용출액은 1mM PMSF, 1mM Na₃VO₄, 1mM NaF, 1㎍/㎖ 아프로티닌(aprotinin), 1㎍/㎖ 펩스타틴(pepstatin), 1㎍/㎖ 류펩틴(leupeptin) 및 10%(w/v) RIPA 완충액(Upstate Biotechnology, USA)을 함유하고 있는 단백질 분리 시약을 이용해 4℃에서 1시간 동안 볼텍싱(vortexing)하여 분해시킨 후 원심분리(15000rpm, 4℃, 20분)하여 얻은 상층액이다.

상기 HUVEC의 세포용출액 또는 세포배양액을 10% SDS-PAGE(10% [w/v] sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis) 전기영동을 실시하고 트랜스퍼 키트를 이용하여 나이트로셀룰로오스 트랜스퍼 멤브레인에 단백질을 고착시켰다. 상기 멤브레인은 5% 스킴밀크(5%[w/v] skim milk)에서 1시간 동안 상온 조건으로 블로킹(blocking)하고, 모에신 단백질에 대한 1차 항체(항-모에신 항체) 및 이에 대한 2차 항체를 반응시킨 후, 모에신 단백질의 발현량 변화를 확인하였다. 이에 대한 결과는 도 2에 나타내었는데, 도 2를 참고하면, 모에신 단백질이 LPS 처리 시간에 따라 세포배양액(Media) 에서 발현량이 현저하게 증가하고 있음을 알 수 있다.

<실시예 3. 패혈증 환자에서의 모에신 생성량 확인>

다음으로는 패혈증 환자들에서의 모에신 생성량을 확인하여, 실시예 1에서 확인된 단백질들이 패혈증 증상의 지표가 될 수 있는지를 검증하였다. 21명의 건강한 사람과 132명의 패혈증 환자의 혈청을 채취하였다. 패혈증 환자는 경증 패혈증 상태(sepsis, 72명), 중증 패혈증 상태(severe sepsis, 19명), 패혈성 쇼크 상태(septic shock, 41)로 그룹화하였다(1992년의 Sepsis Consensus Conference Committee의 지침을 따라 그룹화함, Bone, R.C. et al., 1992; Hanley, J.A. et al., 1983).

각 사람들에게서 채취한 혈액을 48시간 이내에 2000×g에서 5분간 원심분리하여 혈청 샘플을 얻었고, 실험 전까지 -20℃에 보관하였다. 상기 혈청 샘플에서의 모에신의 분석은 ELISA(competitive enzyme-linked immunosorbent assays)로 확인하였고 이는 도 3A에 나타내었다.

96웰 플레이트(96-well plastic flat microtiter plates, Corning, NY, USA)에 모에신 단백질(Origene, moesin in 20mM carbonate/bicarbonate buffer[pH 9.6] containing 0.02%[w/v] sodium azide)을 코팅하여 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 반응하였다. 이 후, 플레이트를 PBS-T(PBS-0.05%[w/w] Tween 20)로 3번 세척한 후, PBS-T를 넣어서 4℃에서 18시간 이상 밤을 지새워 보관하였다.

한편, 모에신 단백질(단백질 정량용, PBS-T에 희석), 각 조건의 사람 혈청은 각각 96웰 플레이트에서 항-모에신 항체(PBS-T에 1:1000 희석)와 37℃에서 90분간 전반응시켰다. 상기 항체가 전반응된 모에신 단백질, 각각의 사람 혈청을 모에신이 코팅된 플레이트로 옮겨 실온에서 30분간 반응시켰다. 이 후, 각 플레이트들은 PBS-T로 3번 세척하였고, 실온에서 90분간 2차 항체(peroxidase-conjugated anti-goat IgG antibodies, R&D Systems, PBS-T에 1:2000 희석)와 반응시켰다.

각 플레이트들을 PBS-T로 3번 세척한 후, 실온의 암실에서 60분간 200㎕씩의 기질용액(100㎍/㎖ o-phenylenediamine & 0.003%[w/v] H₂O₂)을 처리하였다. 다음으로는 50㎕의 8N H₂SO₄으로 모든 반응을 중단시킨 후, 490nm에서 흡광도를 확인하였다.

도 3A를 참고하면, 건강한 사람의 혈청 내의 모에신 단백질 함량은 0.90ng/㎖(0.84~1.05ng/㎖)인 것으로 확인되지만, 경증 패혈증 상태(sepsis) 환자의 혈청 모에신은 1.68ng/㎖(0.83-9.05ng/㎖, n=72), 중증 패혈증 상태(severe sepsis) 환자의 혈청 모에신 단백질 함량은 4.23ng/㎖(4.37~12.31ng/㎖, n=19), 패혈성 쇼크 상태(septic shock) 환자의 혈청 모에신 단백질 함량은 8.76ng/㎖(4.14~19.37ng/㎖, n=41)로서, 모에신 단백질의 혈청 내 수치가 패혈증 증상에 비례하여 급격하게 증가된 상태임을 알 수 있다.

한편, 상기 혈액을 수집한 패혈증 환자들을 15일 후 생존자(Alive, 124명)와 사망자(Dead, 8명)로 다시 구분하여 혈액을 재수집한 후 혈청 내의 모에신 단백질의 함량을 상기와 동일한 ELISA 방법으로 확인하였고, 이에 대한 결과는 도 3B에 나타내었다. 도 3B를 참고하면 생존자는 모에신이 3.71ng/㎖(0.83-11.87ng/㎖), 사망자는 모에신이 12.74ng/㎖(5.82-19.37ng/㎖)으로 확인되었다. 상기 결과를 통해서도 모에신과 같은 단백질의 함량이 패혈증 증상을 구분할 수 있는 지표가 됨을 알 수 있다.

<실시예 4. 패혈증 모델 마우스에서의 모에신 생성량 확인>

마우스의 맹장을 터트리는 CLP 수술법(cecal ligation and puncture operation)을 이용하여 마우스에 패혈증을 유도하였다. CLP 수술에 이용된 마우스는 수컷 C57BL/6 마우스를 이용하였고, 각 군당 10마리씩 이용하였다(6~7주령 및 체중 18~20g의 마우스를 구입하고 12일간 실험실에서 순응화한 후 사용, Orient Bio Co., Sungnam, Kyungki-Do, Republic of Korea). 마우스를 졸레틸 50(zoletil 50) 및 3%(w/v) 이소플루란(isoflurane, Forane^®, Choongwae Pharma. Corp., Seoul, Korea)으로 마취시켰다. 패혈증 모델을 유도하기 위해 배 부위 2㎝ 절개를 하여 맹장과 근처의 창자를 노출시켰다. 맹장 끝으로부터 5㎜ 부위의 맹장을 3.0-실크 봉합선으로 강하게 묶고, 22-게이지 바늘로 이를 터트렸다. 맹장을 부드럽게 짜 내어 천공 부위를 통해 소량의 배설물이 누출되게 하였고, 이 배설물을 복강에 노출시켰으며, 개복부위를 4.0-실크 봉합선으로 봉합하였다. 음성대조군(sham)은 맹장을 묶고 터트리는 단계를 수행하지 않고 단순히 배만 절개하고 다시 봉합하였다. 각 마우스들은 CLP 수술 24시간 후부터 패혈증 증상에 노출되었는데, 전율(shivering)이 있거나 털이 곤두서거나(bristled hair) 또는 무기력증(weakness) 등의 현상이 나타났다. CLP 수술 이후, 4일간 매일 마우스로부터 혈액을 채취하여 혈청 내 모에신의 생성량을 실시예 3에 개시된 ELISA 방법을 이용하여 확인하였고 이에 대한 결과는 도 3C에 나타내었다.

도 3C를 참고하면, CLP 수술을 한 패혈증 마우스의 혈청 모에신 단백질이 시간의존적으로 증가하는 것으로 확인된다.

한편, CRP(C-reactive protein), 프로칼시토닌(procalcitonin), sICAM-1(serum intercellular adhesion molecule), IL-6(interleukin-6), vWF(von Willebrand factor protein), HDL(high-density lipoprotein cholesterol), NT-proBNP(N-terminal pro-brain natriuretic peptide) 등이 패혈증의 진단마커로서 제안된 바 있지만, 이들의 발현량 증가는 패혈증 이외에도 다양한 원인이 될 수 있어 임상적인 승인까지는 받지 못하고 있는 실정이다(Marshall, J.C. et al., 2003; Chien, J.Y. et al., 2005; Gibot, S., A. et al., 2005). 그러나, 본 발명의 단백질들은 다른 외부적인 요인에 영향을 받지 않으면서도 패혈증 증상의 정도에 비례하여 그 수치가 증가하는 것으로 확인되기에, 패혈증 증상을 진단하기에 적합한 마커로 사용할 수 있다는 장점이 있다.

Claims (12)

1. 하기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 유효성분으로 포함하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물.
   <패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군>
   Cystatin-SN (Accession No. IPI00305477.6);
   Isoform 2 of Alpha-actinin-1 (Accession No. IPI00909239.1);
   Profilin-1 (Accession No. IPI00216691.5);
   TUBA1B protein (Accession No. IPI00793930.1);
   Triose phosphate isomerase (Accession No. IPI01013543.1);
   L-lactate dehydrogenase B chain (Accession No. IPI00219217.3);
   Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Accession No. IPI00795257.3);
   Moesin (Accession No. IPI00219365.3);
   Isoform 1 of L-lactate dehydrogenase A chain (Accession No. IPI00217966.9);
   Pyruvate kinase (Accession No. IPI00847989.3);
   Elongation factor 2 (Accession No. IPI00186290.6);
   Pigment epithelium-derived factor (Accession No. IPI00006114.5);
   Alpha-fetoprotein (Accession No. IPI00022443.1);
   Thyroxine-binding globulin (Accession No. IPI00292946.1);
   Alpha-2-macroglobulin (Accession No. IPI00478003.3);
   Vitamin D-binding protein isoform 1 precursor (Accession No. IPI00555812.5);
   Complement C3(Fragment) (Accession No. IPI00783987.2);
   Alpha-2-HS-glycoprotein (Accession No. IPI00953689.1); 및,
   Vimentin variant 3 (Accession No. IPI00975690.1).
2. 제1항에 있어서,
   상기 면역원성 단편은 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 단백질에 대한 항체에 결합하는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편인 것을 특징으로 하는 패혈증 진단용 바이오마커 조성물.
3. 하기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단제.
   <패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군>
   Cystatin-SN (Accession No. IPI00305477.6);
   Isoform 2 of Alpha-actinin-1 (Accession No. IPI00909239.1);
   Profilin-1 (Accession No. IPI00216691.5);
   TUBA1B protein (Accession No. IPI00793930.1);
   Triose phosphate isomerase (Accession No. IPI01013543.1);
   L-lactate dehydrogenase B chain (Accession No. IPI00219217.3);
   Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Accession No. IPI00795257.3);
   Moesin (Accession No. IPI00219365.3);
   Isoform 1 of L-lactate dehydrogenase A chain (Accession No. IPI00217966.9);
   Pyruvate kinase (Accession No. IPI00847989.3);
   Elongation factor 2 (Accession No. IPI00186290.6);
   Pigment epithelium-derived factor (Accession No. IPI00006114.5);
   Alpha-fetoprotein (Accession No. IPI00022443.1);
   Thyroxine-binding globulin (Accession No. IPI00292946.1);
   Alpha-2-macroglobulin (Accession No. IPI00478003.3);
   Vitamin D-binding protein isoform 1 precursor (Accession No. IPI00555812.5);
   Complement C3(Fragment) (Accession No. IPI00783987.2);
   Alpha-2-HS-glycoprotein (Accession No. IPI00953689.1); 및,
   Vimentin variant 3 (Accession No. IPI00975690.1).
4. 제3항에 있어서,
   상기 면역원성 단편은 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 단백질에 대한 항체에 결합하는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편인 것을 특징으로 하는 패혈증 진단제.
5. 하기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택된 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 인식하는 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는 패혈증 진단용 단백질칩.
   <패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군>
   Cystatin-SN (Accession No. IPI00305477.6);
   Isoform 2 of Alpha-actinin-1 (Accession No. IPI00909239.1);
   Profilin-1 (Accession No. IPI00216691.5);
   TUBA1B protein (Accession No. IPI00793930.1);
   Triose phosphate isomerase (Accession No. IPI01013543.1);
   L-lactate dehydrogenase B chain (Accession No. IPI00219217.3);
   Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (Accession No. IPI00795257.3);
   Moesin (Accession No. IPI00219365.3);
   Isoform 1 of L-lactate dehydrogenase A chain (Accession No. IPI00217966.9);
   Pyruvate kinase (Accession No. IPI00847989.3);
   Elongation factor 2 (Accession No. IPI00186290.6);
   Pigment epithelium-derived factor (Accession No. IPI00006114.5);
   Alpha-fetoprotein (Accession No. IPI00022443.1);
   Thyroxine-binding globulin (Accession No. IPI00292946.1);
   Alpha-2-macroglobulin (Accession No. IPI00478003.3);
   Vitamin D-binding protein isoform 1 precursor (Accession No. IPI00555812.5);
   Complement C3(Fragment) (Accession No. IPI00783987.2);
   Alpha-2-HS-glycoprotein (Accession No. IPI00953689.1); 및,
   Vimentin variant 3 (Accession No. IPI00975690.1).
6. 제5항에 있어서,
   상기 면역원성 단편은 상기 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 단백질에 대한 항체에 결합하는 하나 이상의 에피토프(epitope)를 가지고 있는 단백질 단편인 것을 특징으로 하는 패혈증 단백질칩.
7. 제1항의 바이오마커 조성물을 이용한 패혈증 진단방법.
8. 제7항에 있어서,
   상기 진단방법은, (1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하고, 상기 바이오마커 조성물을 준비하는 단계;
   (2공정) 상기 1공정의 단백질 또는 바이오마커 조성물에, 상기 바이오마커 조성물에 특이적으로 결합하는 항체를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,
   (3공정) 상기 2공정에서 생성된 항원-항체 복합체를 정량 검출 및 분석하여 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 상기 바이오마커 조성물의 단백질량을 비교 분석하는 단계;
   를 포함하는 패혈증 진단방법.
9. 제3항의 진단제를 이용한 패혈증 진단방법.
10. 제9항에 있어서,
    상기 진단방법은, (1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와, 건강한 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하는 단계;
    (2공정) 상기 1공정의 단백질에, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 상기 진단제를 접촉시켜 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,
    (3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 진단제를 정량 검출 및 분석하여, 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와, 건강한 사람 또는 동물의 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;
    를 포함하는 패혈증 진단방법.
11. 제5항의 단백질칩을 이용한 패혈증 진단방법.
12. 제11항에 있어서,
    상기 진단방법은, (1공정) 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 건강한 사람 또는 동물의 시료에서 단백질을 분리하는 단계;
    (2공정) 상기 1공정의 단백질과, 패혈증 증상 세포에서 세포외로 분비가 증가하는 단백질 군에서 선택되는 3종 이상의 단백질 또는 이의 면역원성 단편을 특이적으로 결합하는 항체가 포함된 상기 단백질칩을 접촉시켜, 항원-항체 복합체를 형성하는 단계; 및,
    (3공정) 상기 2공정의 항원-항체 복합체가 형성된 단백질칩을 정량 검출 및 분석하여, 패혈증이 진행되고 있다고 의심되는 사람 또는 동물의 시료와 건강한 사람 또는 동물의 시료의 단백질 발현량을 비교 분석하는 단계;
    를 포함하는 패혈증 진단방법.
    
    
    
    

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