CN108562746A - Cnpy2异构体2在结直肠癌诊断、预后、复发转移及放化疗疗效预测中的应用 - Google Patents

Cnpy2异构体2在结直肠癌诊断、预后、复发转移及放化疗疗效预测中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了CNPY2异构体2在结直肠癌诊断、预后预测及放化疗疗效预测中的应用。本发明采用酶联免疫吸附测定方法(ELISA)来检测CNPY2异构体2在人血清中的浓度，由此发现CNPY2异构体2血清浓度对结直肠癌具有诊断价值、对III‑IV结直肠癌患者总生存时间的预后具有预测价值，同时，CNPY2异构体2血清浓度对患者术后复发转移以及病理完全缓解也具有预测价值。因此，本发明为结直肠癌的诊断、预后、术后复发转移及放化疗疗效的预测提供了有效的工具，具有巨大的医学及商业价值。

Description

CNPY2异构体2在结直肠癌诊断、预后、复发转移及放化疗疗效 预测中的应用
技术领域
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，本发明涉及CNPY2异构体2在制备用于诊断结直肠癌、用于预测结直肠癌患者总生存时间预后、预测放化疗后结直肠癌患者术后复发转移、预测结直肠癌患者病理是否能完全缓解的试剂盒中的用途。本发明还涉及上述试剂盒。
背景技术
结肠直肠癌(carcinoma of colon and rectum)是胃肠道中常见的恶性肿瘤，早期症状不明显，随着癌肿的增大而表现排便习惯改变、便血、腹泻、腹泻与便秘交替、局部腹痛等症状，晚期则表现贫血、体重减轻等全身症状。其发病率和病死率在消化系统恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌。
本病和其他恶性肿瘤一样，发病原因仍不十分清楚，可以发生在结肠或直肠的任何部位，但以直肠、乙状结肠最为多见，其余依次见于盲肠、升结肠、降结肠及横结肠。癌瘤大多数为腺癌，少数为鳞状上皮癌及粘液癌。本病可以通过淋巴、血液循环及直接蔓延等途径，播散到其他组织和脏器。治疗的关键在于早期发现、及时诊断和手术根治。本病的预后取决于早期诊断和及时手术治疗。
然而，据有关资料统计，结直肠癌早期不易被发现，且误诊率高，为约30％，这必须引起医务人员的高度重视，造成误诊的原因是多方面的。结直肠癌最容易被误诊为内痔出血、息肉出血、细菌性痢疾、阿米巴痢疾、直肠炎症等，有70％的病人在确诊为直肠癌以前，曾接肠炎、痔核治疗，40％患者曾经过痔的手术治疗，这些数据是很惊人的，导致患病不能被及时诊治，错过最佳时期。
临床上目前肠癌的唯一可靠的确诊手段只有肠镜，但肠镜检测患者需要提前三天开始清肠并在当天全身麻醉，这带给病人带来很大的痛苦与不适。在没有出现明显的临床症状前，比如便血，一般很少有人会主动要求做肠镜检查，但有了便血症状又往往又太晚了，错过了治疗的理想时段。
所以如果能够研发出来一种诊断性的分子标识物，比如某个或者某几个基因的分泌型蛋白产物，根据蛋白产物在正常人和肠癌患者血液中表达的差异，在患者做痛苦不适的肠镜检测之前，通过简单的一毫升血清检测就能够预测肠癌的危险性，然后再去做肠镜以进一步确诊，早手术切除，早放疗及化疗。这样的分子标识物也就是目前常说的精准医疗的一个重要环节，将会带来无法估量的广大市场前景，同时也能造福人类健康。
本申请发明人发现了一个新基因叫CNPY2(canopy FGF signaling regulator2)。这个基因有2个异构体(isoform)：异构体1和异构体2，能够翻译成2个长短不同且序列也不一样的蛋白质。异构体1的Genbank登记号是NM_014255，具有182个氨基酸序列；异构体2的Genbank登记号是NM_001190991，只有84个氨基酸序列。异构体2非常短，理论上预测的蛋白大小只有～9KDa。
在本申请人早前的专利申请中公开了CNPY2蛋白异构体2可用作用于检测肠癌的分子标识物。在本申请中，发明人通过大量的临床病例对CNPY2异构体2做了进一步深入的研究，探索了CNPY2蛋白异构体2血清浓度对结直肠癌不同阶段的诊断价值以及预后、复发转移和结直肠癌放化疗疗效的预测价值，得到了有意义的临床诊断和预测数据，具有指示作用。
发明内容
在一个技术方案中，本发明提供了CNPY2异构体2在制备用于诊断结直肠癌的试剂盒中的用途，其特征在于，
所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体，
所述试剂盒包含使用说明书，所述说明书表明：诊断的界值为5.566pg/ml，此时敏感度＝67.3％，特异度＝63.1％，假阳性率＝36.9％和假阴性率＝33.0％。
进一步地，所述说明书进一步表明，血清中CNPY2异构体2浓度对I期结直肠癌的诊断价值最高，当浓度为5时，此时敏感度＝82.4％，特异度＝57.6％，而对IV期结直肠癌诊断价值最低。
在又一个技术方案中，本发明提供了CNPY2异构体2在制备用于预测结直肠癌患者总生存时间预后的试剂盒中的用途。
优选地，所述结直肠癌患者为III-IV结直肠癌患者。
进一步地，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
更进一步地，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明CNPY2异构体2血清水平越高，总生存时间明显缩短。
在又一个技术方案中，本发明提供了CNPY2异构体2在制备用于预测放化疗后结直肠癌患者术后复发转移的试剂盒中的用途。
进一步地，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
进一步地，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗后CNPY2异构体 2血清水平越高越有可能发生术后复发转移，当放化疗后CNPY2异构体2血清浓度>18时，患者无病生时间明显缩短。
在又一个技术方案中，本发明提供了CNPY2异构体2在制备用于预测结直肠癌患者病理是否能完全缓解的试剂盒中的用途。
进一步地，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
在一个实施方式中，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗前CNPY2 异构体2血清水平越高，越有可能获得病理完全缓解。
在另一个实施方式中，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗前后 CNPY2异构体2血清水平差异越大，越有可能获得病理完全缓解。
本发明取得了有益的技术效果，本发明采用酶联免疫吸附测定方法来检测CNPY2异构体2在人血清中的浓度，由此发现：
(1)CNPY2异构体2血清浓度对结直肠癌具有诊断价值，灵敏度高，特异度强，这为结直肠癌的及时发现提供有效的工具，从而做到“早发现，早治疗”；
(2)CNPY2异构体2血清浓度对III-IV结直肠癌患者总生存时间的预后具有显著的预测价值，从而有针对性的改善不良的治疗预后，提高医疗水平，提高生活质量；
(3)CNPY2异构体2血清浓度对患者术后复发转移具有预测价值，从而可以为潜在的结直肠癌的复发转移采取预防措施；
(4)CNPY2异构体2血清浓度对病理能否完全缓解也具有预测价值，从而可以制定相应的治疗方案。
附图说明
图1，结直肠癌患者和正常人群血清中CNPY2异构体2水平比较。
图2，结直肠癌各个分期患者和正常人群血清中CNPY2异构体2水平比较。
图3，CNPY2异构体2血清水平诊断总体结直肠癌的ROC曲线。
图4，CNPY2异构体2血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。
图5，CNPY2异构体2血清水平诊断II期结直肠癌的ROC曲线。
图6，CNPY2异构体2血清水平诊断III期结直肠癌的ROC曲线。
图7，CNPY2异构体2血清水平诊断I+II期结直肠癌的ROC曲线。
图8，CNPY2异构体2血清水平诊断非转移性(I-III期)结直肠癌的ROC曲线。
图9，CNPY2异构体2血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。
图10，CEA血清水平诊断结直肠癌的ROC曲线。
图11，CEA血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。
图12，CEA血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。
图13，CA199血清水平诊断结直肠癌的ROC曲线。
图14，CA199血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。
图15，CA199血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。
图16，CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断结直肠癌的ROC 曲线。
图17，CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断I期结直肠癌的 ROC曲线。
图18，CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。
图19，全组患者总生存时间(OS，Overall Survival)比较。
图20，I期患者OS比较。
图21，II期患者OS比较。
图22，III期患者OS比较。
图23，IV期患者OS比较。
图24，I-III期患者DFS比较。
图25，II期患者DFS比较。
图26，III期患者DFS比较。
图27，直肠癌放化疗前后血清中CNPY2异构体2水平比较。
图28，CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗术后复发转移的ROC曲线。
图29，放化疗后CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗DFS的界值。
图30，CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗术后肿瘤死亡的ROC曲线。
图31，CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗病理完全缓解的ROC曲线。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行进一步的阐述，应理解，下述具体实施例仅是为了用于说明本发明，并不对本发明内容进行限定。
实施例中所用原料和设备均为本领域技术人员熟知，且均为市场上能够购买到或容易获得或制得。
CNPY2异构体2ELISA试剂盒来自深圳市盛波尔生命科学技术有限责任公司，或可使用由如下方法制备得到的试剂盒。
实施例一、CNPY2异构体2ELISA试剂盒的制备
1.单克隆抗体(Mab)的开发
步骤1.动物免疫
将6只动物(3Balb/C小鼠+3C57小鼠)用CNPY2蛋白免疫。
1)测试放血：在每次增强免疫之后7天，用免疫血清通过ELISA测试免疫应答。通过ELISA用目标蛋白和肽测试放血。
2)利用抗血清，进行内部测试。
3)维持免疫的动物，直到项目完成。
步骤2.细胞融合和筛选
1)动物选择：根据测试放血结果，选择针对目标肽具有最好免疫应答的头两只动物，以进行细胞融合。融合可以交错进行。
2)细胞融合和克隆铺板：通过电融合进行2次融合。观察到大约1杂交瘤/5000B细胞的融合效率。根据此经验，以每个免疫小鼠的脾脏平均1×108B细胞，期望的杂交瘤克隆回收率为约2×104。将每个细胞融合的所有融合细胞铺到10个96孔板。
3)初次阳性筛选：用目标蛋白通过ELISA筛选上清液，以进行阳性筛选。
4)确定性筛选：通过间接ELISA，针对目标蛋白和肽，通过测试初次筛选中鉴定的所有阳性克隆的上清液，进行确定性筛选。
5)克隆选择和冷冻：上达10个阳性亲代克隆，预测哪个对CNPY2蛋白具有特异性。将所有阳性克隆扩大到24-孔板。每一个克隆收集2ml上清液(条件培养基)，并冷冻细胞。如果需要，将杂交瘤培养上清液的样品(每个克隆2ml)进行内部测试。冷冻所有特异性阳性克隆，以避免克隆损失。
步骤3.亚克隆、扩大培养和冻干
1)亚克隆选择：通过限制性稀释，将选择的最多5个阳性初次克隆进行亚克隆，以确保亚克隆来自单个亲代细胞。将克隆进行最多3代。可以预期，最多4个初次克隆(约80％的成功率)将在亚克隆阶段存活，并稳定生长(如果阳性克隆不满足特异性要求，则选择额外的亲代克隆以重复亚克隆)。
2)亚克隆筛选：通过ELISA筛选亚克隆。
3)单克隆冻干：根据确定的抗原-识别和正常的成倍时间，每个初次克隆选择两个稳定的亚克隆细胞系进行冻干。
4)同种型识别：对所有亚克隆细胞系进行同种型识别。保存所有得到的克隆。优选IgG 同种型。
步骤4.单克隆抗体产生
1)抗体产生：对每一个选择的细胞系(最多5个细胞系)，利用滚筒培养物或腹水产物，生产抗体，通过蛋白质A/G亲和柱纯化产生的抗体。每个选择的克隆，产生2-5mg纯化的抗体。
2)抗体验证：通过SDS-PAGE测试产生的抗体的纯度，通过OD280nm测试浓度，通过ELISA测试反应性。
2.ELISA开发
步骤1.概念验证(POC)
1)对于每个选择的检测抗体，HRP或生物素结合，多达5个抗体。
2)鉴定最佳配对，评估灵敏度和特异性表现。
3)选择用于夹心ELISA的最佳配对。
4)利用ELISA来研究最佳配对的可行性。
5)评估与发明人的一致性数据。
步骤2.检测开发
1)以根据步骤2的选择的抗体，设定最合适的免疫检测。
2)选择最合适的检测方式，优化检测条件以及参数，例如包被抗体和检测抗体的浓度，封闭缓冲液、封闭时间、反应时间和温度、工作缓冲液等。
3)制备和验证检测条件，测定检测灵敏性和其他性能。
4)灵敏性：通过加入三个标准偏差到二十个0标准重复的平均相对光单位(RLU)以及计算相应浓度，测定最小可检测剂量(MDD)。
步骤3.检测验证
1)检测试剂盒(10个试剂盒)的中试生产。
2)使用验证的校正仪和验证的方法，制备黄金标准。
3)验证稳定性、准确度和检测试剂盒的变异，检测试剂盒的标准是：
a.批内精确度(批内部的精确度)≤5％。
在板上测试三个已知浓度的样品八次，以评估批内情况。
b.批间精确度(批之间的精确度)≤10％。
在四个独立的检测中，测试三个已知浓度的样品，以评估批间情况。
c.回收率范围：100±15％。
在各种矩阵中，在整个检测范围内，评估在样品的三个不同水平的肽回收率。
4)验证临床或领域样品的灵敏度和特异性。
步骤4.检测试剂盒生产
生产45个96-测试形式的免疫检测试剂盒
经过反复的配对测试和调试，最终定下了最佳配对的单克隆做铺板(浓度为2μg/ml) (本发明中为13G11B9)，生物素标记的单克隆(本发明中为2B11D11)做检测(浓度为1 μg/ml)，用于生产夹心ELISA试剂盒。
3.试剂盒制备及检测
试剂盒组成
试剂盒提供样品检测所需要的全部试剂，见下表1，试剂量足够一块板的检测。
表1
试剂盒制备
步骤(一).试剂准备
1×洗液
用去离子水或双蒸水按1:20稀释20×洗液。例如取10mL的20x洗液加入190mL的去离子水中，配成200mL的1×洗液，2-8℃条件下保存。
1×样品稀释液
用去离子水或双蒸水按1:5稀释5x样品稀释液。例如取20mL的5x样品稀释液加入80mL的去离子水中，配成100mL的1x样品稀释液，2-8℃条件下保存。
CNPY2标准品溶液
用450μl去离子水或双蒸水将CNPY2标准品冻干粉复溶。复溶标准品浓度为32ng/ml。
检测抗体工作液
将检测抗体浓缩液用1x样品稀释液按1:50稀释至工作浓度。例如取100ul检测抗体浓缩液加入4.9ml的1x样品稀释液配成检测抗体工作液。
HRP标记链霉亲和素工作液
将HRP标记链霉亲和素用1×样品稀释液按1:50稀释至工作浓度。例如取100μl检测抗体浓缩液加入4.9ml的1x样品稀释液配成HRP标记链霉亲和素。
显色液
将显色液A和显色液B按1:1混合，例如，显色液体积是5ml，则取2.5ml显色液A 和2.5ml显色液B加入离心管，手动轻轻混匀。(注意显色液需要现配现用，显色步骤时再配制)
步骤(二).样品准备
在准备样品时需要注意以下几点：
1.检测样品的pH应为中性，样品中不含有颗粒物质，若含有不溶物质可通过离心或过滤去除。
2.通过预实验来确定样品的最佳检测稀释倍数，例如用样品稀释液按1:2、1:5、1:10、1:20等倍数稀释样品。
步骤(三).捕获板的准备
1.实验开始前，确保所有的试剂和样品以及酶标板(未开封)都恢复至温室。
2.计算实验所需要的板条数量，将不需要的板条拆卸下来，放回铝箔袋中，封好后2-8℃保存(拆封过的板条在两周内使用完毕)。
3.确定板条紧紧固定在板架上。
步骤(四).检测过程
用盖板膜封板时，手指从板架和板条上滑过以确保板孔完全封闭。
用计时器计量反应时间。
用全自动洗板机或多通道微量移液器洗板。
标准品/待测样品温育
1.向酶标板各孔分别加入100μl样品缓冲液，同时将稀释好的CNPY2标准品和处理好的待测样品各100μl加入对应板孔中。
2.用盖板膜封板，4℃温育90分钟。
3.移去盖板膜，弃去板孔中液体。
4.洗板：每孔加入1×洗液260μl，浸泡30秒，弃去洗液，重复洗涤4次。
5.在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
检测抗体温育
6.每孔加入检测抗体工作液200μl。
7.用盖板膜封板，4℃温育60分钟。
8.移去盖板膜，弃去板孔中液体。
9.洗板，同第4步。
10.在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
HRP标记链霉亲和素温育
11.每孔加入稀释好的HRP标记链霉亲和素工作液200μL。
12.用盖板膜封板，37℃温育10分钟。
13.移去盖板膜，弃去板孔中液体。
14.洗板，同第4步。
15.在平板纸上拍板，彻底去除板孔中的残留液体。
底物反应和吸光值检测
16.每孔加入混合好的显色液200uL。
17.用盖板膜封板，25℃下避光反应15分钟(从加入显色液至第一孔时开始计时)。
18.移去盖板膜，每孔加入终止液50uL。
19.终止后立即用酶标仪在450nm处测量吸光值。
灵敏度
四次检测的平均值，灵敏度计算方法为20个0孔的平均OD450加上3倍的标准差的值所对应的浓度(本发明试剂盒的灵敏度为2.369pg/ml)。
精密度
批内精密度：高中低三个不同浓度的CNPY2样品在同一块板上检测10个重复，计算对应浓度的变异。
批间精密度：高中低三个不同浓度的CNPY2样品分别在四次实验中检测值之间的变异。
本试剂盒的批内差平均变异小于5％，批间平均差异小于10％。
实施例二、CNPY2异构体2的诊断效能结果
方法：
(1)选择人群
437例结直肠癌患者和203例非恶性肿瘤正常人群，共603例；
437例结直肠癌患者中，I期108例，II期110例，III期108例，IV期111例。
(2)样本
结直肠癌患者术前血清标本和正常人群体检血清标本各200μl。
(3)检测方法
建立标准曲线，将100μl血清样品加入CNPY2异构体2ELISA试剂盒(来自深圳市盛波尔生命科学技术有限责任公司)，根据说明书步骤，使用酶标仪检测OD值，对应标准曲线获得样品中CNPY2异构体2血清浓度。
(4)统计学方法
应用SPSS 21.0软件进行数据分析。结直肠癌患者和正常人群血清中CNPY2异构体2 水平采用t检验进行比较；采用受试者工作特征曲线(Receiver operatingcharacteristic curve， ROC)计算CNPY2异构体2预测结直肠癌的灵敏度，特异度，判读其诊断价值及准确性，计算临界值。
结果如下：
图1是结直肠癌患者和正常人群血清中CNPY2异构体2水平比较。得出，结直肠癌患者血清CNPY2异构体2平均浓度为8.301±0.285pg/ml，正常人群均浓度为6.045±0.399pg/ml，两者具有显著差异(P<0.0001)。
图2是结直肠癌各个分期患者和正常人群血清中CNPY2异构体2水平比较。I期结直肠癌患者血清CNPY2异构体2平均浓度为8.520±0.4569pg/ml，正常人群均浓度为 6.045±0.399pg/ml，两者具有显著差异(P＝0.0001)；II期结直肠癌患者血清CNPY2异构体 2平均浓度为8.607±0.7090pg/ml，正常人群均浓度为6.045±0.399pg/ml，两者具有显著差异(P＝0.0007)；III期结直肠癌患者血清CNPY2异构体2平均浓度为8.477±0.518pg/ml，正常人群均浓度为6.045±0.399pg/ml，两者具有显著差异(P＝0.0003)；IV期结直肠癌患者血清CNPY2异构体2平均浓度为7.598±0.5689pg/ml，正常人群均浓度为6.045±0.399pg/ml，两者具有显著差异(P＝0.0243)。结直肠癌各期患者的CNPY2异构体水平未见明显差异 (P＝0.5646)。
图3是CNPY2异构体2血清水平诊断总体结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积(areaunder the ROC curve，AUC)为0.669，95％置信区间为：0.621-0.716，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5.566时，Youden指数最大，为0.304，此时敏感度＝67.3％，特异度＝63.1％，假阳性率＝36.9％和假阴性率＝33.0％。
图4是CNPY2异构体2血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.703，95％置信区间为：0.645-0.761，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝82.4％，特异度＝57.6％。
图5是CNPY2异构体2血清水平诊断II期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.660，95％置信区间为：0.599-0.722，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝72.7％，特异度＝57.6％。
图6是CNPY2异构体2血清水平诊断III期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.685，95％置信区间为：0.625-0.745，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝75.9％，特异度＝57.6％。
图7是CNPY2异构体2血清水平诊断I+II期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.683，95％置信区间为：0.631-0.735，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝77.9％，特异度＝57.6％。
图8是CNPY2异构体2血清水平诊断非转移性(I-III期)结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.683，95％置信区间为：0.634-0.731，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝77.0％，特异度＝57.6％。
图9是CNPY2异构体2血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.629，95％置信区间为：0.566-0.692，P<0.001。表明，CNPY2异构体2血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝61.3％，特异度＝57.6％。
图10是CEA血清水平诊断结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.775，95％置信区间为：0.737-0.813，P<0.001。表明，CEA血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝41.5％，特异度＝95.7％。
图11是CEA血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.636，95％置信区间为：0.569-0.704，P<0.001。表明，CEA血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝18.5％，特异度＝95.7％。
图12是CEA血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.861，95％置信区间为：0.813-0.909，P<0.001。表明，CEA血清水平对结直肠癌有较好的诊断价值。当浓度为5时，此时敏感度＝62.7％，特异度＝95.7％。
图13是CA199血清水平诊断结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.638，95％置信区间为：0.585-0.692，P<0.001。表明，CA199血清水平对结直肠癌有一定的诊断价值。当浓度为35时，此时敏感度＝19.6％，特异度＝99.0％。
图14是CA199血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.566，95％置信区间为：0.487-0.645，P＝0.104.CA199血清水平对I期结直肠癌没有诊断价值。当浓度为35时，此时敏感度＝4.6％，特异度＝99.0％。
图15是CA199血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。曲线下面积为0.705，95％置信区间为：0.633-0.776，P<0.001。表明，CA199血清水平对IV期结直肠癌有一定诊断价值。当浓度为35时，此时敏感度＝36.7％，特异度＝99.0％。
图16是CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断结直肠癌的 ROC曲线。
表2
曲线下的面积
CEA血清水平对结直肠癌的诊断价值最高。当浓度为5时，此时敏感度＝41.5％，特异度＝95.7％。
图17是CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断I期结直肠癌的ROC曲线。
表3
曲线下的面积
CNPY2异构体2+CEA血清水平对I期结直肠癌的诊断价值最高。CNPY2异构体2或CEA其中一个大于5时，此时敏感度＝86.0％，特异度＝53.7％。
图18是CNPY2异构体2，CEA及CNPY2异构体2+CEA血清水平诊断IV期结直肠癌的ROC曲线。
表4
曲线下的面积
CEA血清水平对IV期结直肠癌的诊断价值最高。此时敏感度＝62.7％，特异度＝95.7％。
结论
1.各期结直肠癌患者血清中CNPY2异构体2水平显著比正常人群高，各期之间CNPY2 异构体2水平无显著差异。
2.血清中CNPY2异构体2浓度对结直肠癌有一定的诊断价值。诊断的界值为5.566pg/ml，此时敏感度＝67.3％，特异度＝63.1％，假阳性率＝36.9％和假阴性率＝33.0％。
3.血清中CNPY2异构体2浓度对I期结直肠癌的诊断价值最高，当浓度为5时，此时敏感度＝82.4％，特异度＝57.6％。对IV期结直肠癌诊断价值最低。
实施例三、预后预测结果
方法：
(1)选择人群
425例结直肠癌患者(1.原发灶已切除2.随访时间>3个月)；
425例结直肠癌患者中，I期107例，II期104例，III期105例，IV期109例。
(2)样本
结直肠癌患者术前血清标本和正常人群体检血清标本各200μl。
(3)检测方法
建立标准曲线，将100μl血清样品加入CNPY2异构体2ELISA试剂盒(来自深圳市盛波尔生命科学技术有限责任公司)，根据说明书步骤，使用酶标仪检测OD值，对应标准曲线获得样品中CNPY2异构体2血清浓度。
(4)终点指标
全组患者：总生存时间(Overall survival,OS)定义为手术日期至出现死亡或随访截止日期的时间间隔。
I-III期患者：无病生时间(Disease-free survival，DFS)：定义为根治性手术日期至出现肿瘤复发、死亡或随访截止日期的时间间隔。
(5)统计学方法
应用SPSS 21.0软件进行数据分析。以CNPY2异构体2水平的中位值作为界值，分成高水平及低水平两组。两组的DFS和OS采用Kaplan-Meier方法比较。
结果
CNPY2异构体2水平中位值为7pg/ml(0-244.967pg/ml)；
全组患者中位随访时间42个月(4-121个月)。
图19是全组患者OS比较。低水平组3年OS为85.7％，高水平组3年OS为79.9％，两组无统计学差异(P＝0.308)。
图20是I期患者OS比较。低水平组3年OS为100％，高水平组3年OS为98.3％，两组无统计学差异(P＝0.377)。
图21是3II期患者OS比较。低水平组3年OS为98.1％，高水平组3年OS为97.7％，两组无统计学差异(P＝0.965)。
图22是III期患者OS比较。低水平组3年OS为98.1％，高水平组3年OS为90.4％，两组无统计学差异(P＝0.038)。
图23是IV期患者OS比较。低水平组3年OS为50.6％，高水平组3年OS为26.0％，两组无统计学差异(P＝0.021)。
图24是I-III期患者DFS比较。低水平组3年OS为93.9％，高水平组3年OS为93.0％，两组无统计学差异(P＝0.910)。
图25是II期患者DFS比较。低水平组3年OS为92.2％，高水平组3年OS为100％，两组无统计学差异(P＝0.052)。
图26是III期患者DFS比较。低水平组3年OS为92.0％，高水平组3年OS为80.6％，两组无统计学差异(P＝0.148).
结论
CNPY2异构体2血清水平对III-IV结直肠癌患者OS有预后预测价值，即CNPY2异构体2血清水平越高，OS明显缩短。
实施例四、CNPY 2异构体2血清浓度对直肠癌放化疗疗效预测
方法：
(1)选择人群
82例直肠癌放化疗接受根治术患者
(2)样本
放化疗前及放化疗后术前患者的血清标本各200μl
(3)检测方法
建立标准曲线，将100μl血清样品加入CNPY2异构体2ELISA试剂盒(来自深圳市盛波尔生命科学技术有限责任公司)，根据说明书步骤，常温静置1小时，使用紫外分光光度计检测OD值，对应标准曲线获得样品中CNPY2异构体2血清浓度。
(4)终点指标
无病生时间(Disease-free survival,DFS)：定义为手术日期至出现肿瘤复发、死亡或随访截止日期的时间间隔。
总生存时间(Overall survival,OS)定义为手术日期至出现死亡或随访截止日期的时间间隔。
病理完全缓解(Pathological complete response，PCR)定义肿瘤经过放化疗后完全消退。
(5)统计学方法
应用SPSS 21.0软件进行数据分析。放化疗前后CNPY2异构体2水平采用t检验进行比较；采用受试者工作特征曲线(Receiver operating characteristic curve，ROC)分别计算放化疗前，放化疗后CNPY2异构体2以及放化疗前后差异预测结直肠癌复发转移，生存死亡以及是否病理完全缓解的AUC，判读其诊断价值及准确性。采用X-tile软件(version3.6.1； Yale University,New Haven,CT,USA)计算预测临界值。
结果如下：
图27是直肠癌放化疗前后血清中CNPY2异构体2水平比较。放化疗血清CNPY2异构体2平均浓度为11.62±1.913pg/ml，正常人群均浓度为11.87±1.871pg/ml，两者无显著差异(P＝0.788)。
图28是CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗术后复发转移的ROC曲线。放化疗前CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.557，95％置信区间为：0.367-0.747，P＝0.545，判读对复发转移无预测价值；放化疗后CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.699， 95％置信区间为：0.529-0.869，P＝0.034，判读对复发转移有一定的预测价值,即放化疗后CNPY2异构体2血清水平越高越有可能发生术后复发转移；放化疗前后CNPY2异构体2 血清水平差异：AUC面积为0.611，95％置信区间为：0.417-0.804，P＝0.239，判读对复发转移无预测价值。
图29是放化疗后CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗DFS的界值。当治疗后放化疗后CNPY2异构体2血清水平为18时，log rank test卡方最大，故界值为18Pg/ml。当放化疗后CNPY2异构体2血清浓度>18时，患者DFS明显缩短(P＝0.001)。
图30是CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗术后肿瘤死亡的ROC曲线。放化疗前CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.477，95％置信区间为：0.294-0.660，P＝0.807，判读对肿瘤死亡无预测价值；放化疗后CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.602，95％置信区间为：0.423-0.781，P＝0.279，判读对肿瘤死亡无预测价值；放化疗前后CNPY2异构体2血清水平差异：AUC面积为0.583，95％置信区间为：0.397-0.768，P＝0.380，判读对肿瘤死亡无预测价值。
图31是CNPY2异构体2血清水平预测直肠癌放化疗病理完全缓解的ROC曲线。放化疗前CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.676，95％置信区间为：0.540-0.813，P＝0.009，判读对病理完全缓解有一定的预测价值,即放化疗前CNPY2异构体2血清水平越高，越有可能获得病理完全缓解；放化疗后CNPY2异构体2血清水平：AUC面积为0.580，95％置信区间为：0.443-0.717，P＝0.237，判读对病理完全缓解无预测价值；放化疗前后CNPY2 异构体2血清水平差异：AUC面积为0.356，95％置信区间为：0.227-0.486，P＝0.034，判读对病理完全缓解有一定的预测价值，即放化疗前后CNPY2异构体2血清水平差异越大，越有可能获得病理完全缓解。
结论
1.直肠癌放化疗前后CNPY2异构体2血清浓度无显著差异。
2.放化疗后CNPY2异构体2血清水平对患者术后复发转移有一定的预测价值，即放化疗后CNPY2异构体2血清水平越高越有可能发生术后复发转移，同时当放化疗后CNPY2 异构体2血清浓度>18时，患者DFS明显缩短。
3.CNPY2异构体2血清水平对直肠癌放化疗术后肿瘤死亡无预测价值。
4.放化疗前CNPY2异构体2血清水平对病理完全缓解有一定的预测价值,即放化疗前 CNPY2异构体2血清水平越高，越有可能获得病理完全缓解。
5.放化疗前后CNPY2异构体2血清水平差异：对病理完全缓解有一定的预测价值,即放化疗前后CNPY2异构体2血清水平差异越大，越有可能获得病理完全缓解。

Claims (13)

1.CNPY2异构体2在制备用于诊断结直肠癌的试剂盒中的用途，其特征在于，
所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体，
所述试剂盒包含使用说明书，所述说明书表明：所述诊断的界值为5.566pg/ml，此时敏感度＝67.3％，特异度＝63.1％，假阳性率＝36.9％和假阴性率＝33.0％。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述说明书进一步表明，血清中CNPY2异构体2浓度对I期结直肠癌的诊断价值最高，当浓度为5时，此时敏感度＝82.4％，特异度＝57.6％，而对IV期结直肠癌诊断价值最低。
3.CNPY2异构体2在制备用于预测结直肠癌患者总生存时间预后的试剂盒中的用途。
4.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述结直肠癌患者为III-IV结直肠癌患者。
5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明CNPY2异构体2血清水平越高，总生存时间明显缩短。
7.CNPY2异构体2在制备用于预测放化疗后结直肠癌患者术后复发转移的试剂盒中的用途。
8.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
9.根据权利要求7所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗后CNPY2异构体2血清水平越高越有可能发生术后复发转移，当放化疗后CNPY2异构体2血清浓度>18时，患者无病生时间明显缩短。
10.CNPY2异构体2在制备用于预测结直肠癌患者病理是否能完全缓解的试剂盒中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其特征在于，所述试剂盒包含至少一种与CNPY2异构体2特异性结合的抗体。
12.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗前CNPY2异构体2血清水平越高，越有可能获得病理完全缓解。
13.根据权利要求11所述的用途，其特征在于，所述试剂盒还包括使用说明书，所述说明书表明，放化疗前后CNPY2异构体2血清水平差异越大，越有可能获得病理完全缓解。
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