CN104991066A - 一种大肠癌预后诊断生物标记物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大肠癌预后诊断生物标记物OCT1蛋白，还公开了该标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用以及相应的试剂盒。与目前已应用于临床或申请专利的生物标记物相比，本发明中的OCT1蛋白的表达与大肠癌的预后更为相关，其在大肠癌组织中的表达明显高于正常组织p<0.0001，并与肿瘤的体积呈正相关；与AJCC分期系统相比较，OCT1表达水平可更好地评估大肠癌患者的预后，对大肠癌也有更好的诊断效能。经COX多因素回归分析，OCT1的过表达具有独立的预后价值。

Description

一种大肠癌预后诊断生物标记物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明涉及癌症预后领域，具体涉及一种与大肠癌预后相关的生物标记物。

背景技术

目前大肠癌的预后和治疗依赖于诊断时肿瘤的临床分期，然而单纯临床分期并不能准确预测患者的预后。大肠癌的发生、发展中伴随着一系列分子生物学的改变，理想的肿瘤标记物应具有较高的敏感性和特异性，并能反映肿瘤的进展及治疗效果。如果患者的预后能准确地被预测，就能制定很好的治疗方案，避免治疗不足而导致的疾病再发，或仅需手术治疗而不必要的额外过度治疗。因此，筛选大肠癌预后诊断相关的生物标记物，是能提高肿瘤临床治疗的针对性，降低患者的治疗费用，节省宝贵的治疗时间的前提条件。

目前，已有一部分肿瘤预后相关的生物标记物在临床上得到应用：①血清癌胚抗原CEA测定：1965年发现血清中检测CEA筛查大肠癌的方法。在大肠癌患者血清中，可以检测到癌胚抗原CEA，这是一种糖蛋白，常出现与恶性肿瘤患者血清中，并非大肠癌的特异性相关抗原，故血清CEA测定对本病的诊断不具有特异性。但用放射免疫法测定CEA，做定量动态观察，对判定大肠癌的手术效果与检测术后复发有一定意义。如大肠癌经手术将肿瘤完全切除后，血清CEA则逐渐下降；若复发，又可再度升高。然而在浸润性肿瘤中CEA的敏感性低于35％，它也不能用于检测早期大肠癌，特异性不够，在许多病理中都有CEA水平的升高。②最近还发现CA19-9抗原(Ritts 1984)，CA19-9是一种糖蛋白类的肿瘤标记物，在消化道肿瘤患者的血清中含量明显升高。血清CA-19-9浓度与Duke分期呈正相关，随着分期的升级浓度升高，因此浓度的大小对于判断大肠癌的预后有临床应用价值。但血清检测CA19-9的阳性率较低，仅有22.39％，在各Duke分期中，血清与组织中CA19-9的阳性率差异情况与CEA相同。Duke A～Duke C期中，通过血清检测CA19-9的阳性率均明显低于术后组织，尤其是在Duke A期患者，检测血清CA19-9的结果为阴性。CA19-9对大肠癌的早期诊断价值不高，但对结直肠的疗效观察和复发监测具有重要临床意义。③CA50以脂或脂蛋白结合的形式存在于细胞膜，属于鞘糖脂类标记物，是胰腺和大肠癌的标记物，特异性不够。

目前，申请专利的“大肠癌预后相关的分子标记物”有如下几种：①Vitronectin(专利号：US 20130071864 A1)ROC曲线下面积AUC＝0.673；②SATB2(专利号：US 8465934 B2)，SATB2表达水平与患者生存期呈正相关P＝0.14；③基因signature(专利号：WO 2013052480 A1)经多因素COX回归生存分析表明HR＝3.08(1.33-7.14)，P＝0.008④染色体I8Q缺失：模型1染色体I8Q缺失HR＝2.46(1.06-5.71),P＝0.036，模型2染色体I8Q缺失HR＝2.48(1.05-5.84),P＝0.038，模型3染色体I8Q缺失HR＝3.32(1.43-7.73),P＝0.005。这些分子标记物与大肠癌的预后相关性有限，在大肠癌的预后评估中仍存在不准确的缺陷。

发明内容

有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种与大肠癌的预后更为相关并且具有独立预后意义的生物标记物，并将其应用于制造大肠癌预后诊断试剂盒。所采用的技术方案如下：

一种大肠癌预后诊断生物标记物，所述大肠癌预后诊断生物标记物为OCT1蛋白。

进一步地，所述OCT1蛋白在大肠癌组织中的表达水平显著高于所述OCT1蛋白在正常肠上皮组织中的表达水平，P<0.0001。

进一步地，所述OCT1蛋白的表达水平与肿瘤体积呈正相关，所述OCT1蛋白的表达水平与AJCC分期相关，所述OCT1蛋白的表达水平与年龄性别无关。

进一步地，所述OCT1蛋白的表达水平与大肠癌患者的生存期呈显著负相关，P<0.0001。

一种大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，包括以下步骤：

a)提供取自大肠癌受试者的样品和对照品；

b)对步骤a)的所述样品和所述对照品中的所述OCT1蛋白进行定量测定，得到样品值和对照值；

c)将步骤b)中得到的所述样品值与所述对照值进行比较；

d)如果所述样品值高于所述对照值，则判断所述大肠癌受试者的预后不良。

进一步地，所述步骤a)中的所述样品取自受试者的大肠癌组织，所述对照品取自受试者对应的癌旁组织。

进一步地，所述步骤b)中使用免疫组化检测法对所述OCT1蛋白进行定量测定。

进一步地，所述免疫组化检测法的结果根据阳性细胞染色强度和所述阳性细胞占所有同类细胞的百分比综合判断。

进一步地，染色系数用于判断所述免疫组化检测法的结果，所述染色系数定义为(I)＝0×f0+1×f1+2×f2+3×f3，其中f0-f3是指所述染色强度为0分～3分的细胞所占百分比。

一种用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒，所述试剂盒包括所述OCT1蛋白的抗体。

本发明的第一方面是基于以往未认识到的事实，即取自患有大肠癌的受试者的样品中OCT1蛋白的表达可作为受试者疾病状态的指示物。更具体地，本发明第一次指出一方面的OCT1的高表达值与另一方面的更具攻击性或高风险的形式的大肠癌之间的关联性。基于以OCT1表达作为大肠癌预后指示物的本发明有若干优点。与目前“已应用于临床的生物标记物”及“已申请专利的分子标记物”相比，OCT1的表达与大肠癌的预后更为相关。OCT1蛋白作为预后标记物，其表达水平与大肠癌的疾病进程相关，OCT-1在正常肠上皮中表达中等强度，但是在大肠癌组织中OCT-1的表达明显升高，P<0.0001。OCT-1表达强阳性的部位是在大肠癌组织的细胞核，说明作为转录因子的OCT-1在大肠癌中是活化的。OCT-1表达与大肠癌临床病理特点的相关性。OCT-1高表达与肿瘤体积呈正相关，此外，OCT-1的表达水平与AJCC分期相关P＝0.029，与年龄性别无关。Kaplan-Meier生存曲线分析，OCT-1的表达水平与大肠癌患者的生存期呈显著负相关p<0.0001，与AJCC分期系统相比较，OCT-1表达水平可更好地评估大肠癌患者的预后p＝0.001vs.p<0.0001。我们利用ROC曲线评估AJCC分期和OCT-1表达对大肠癌预后的价值，发现与AJCC分期系统相比较，OCT-1表达水平对大肠癌也有更好的诊断效能。将OCT-1、AJCC分期、肿瘤体积、性别、年龄均被纳入Cox回归模型，可见OCT-1过表达与生存呈明显的负相关P<0.000,HR＝5.243,95％CI＝2.235～12.302，OCT-1的过表达具有独立的预后意义。OCT1与肿瘤的发展、转移与侵袭相关联，使用OCT1作为诊断的指标，可以提高原先诊断的敏感性、减少漏诊率，作为预后指标及判断结肠癌病情发展的参考。

以下将结合附图对本发明作进一步说明，以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。

附图说明

图1a是90对正常和大肠癌组织芯片中，用免疫组化检测OCT-1的表达,OCT-1表达于细胞核，A 100×，B 200×，C 400×，为正常结肠组织；D 100×，E 200×，F400×为大肠癌组织。图1b是OCT-1免疫组化检测的统计分析结果，可见大肠癌组织中OCT-1的表达明显高于正常的肠上皮组织p<0.0001，曼-惠特尼检验Mann Whitneytest；

图2将90例大肠癌组织按照OCT-1的表达水平中位数，分成OCT-1低表达组和OCT-1高表达组。图2a为曼-惠特尼检验Mann Whitney test的图示结果，统计发现：OCT-1高表达组的肿瘤体积明显大于OCT-1低表达组P＝0.0016；图2b利用表格所示的统计方法比较分析OCT-1的表达水平与大肠癌临床病理特点的关系；

图3a根据OCT-1的表达水平中位数将大肠癌组织分成两组，做Kaplan-Meier生存分析；图3b将大肠癌组织按照AJCC分期分成AJCCⅠ-Ⅱ组和AJCCⅢ-Ⅳ组，进行Kaplan-Meier生存分析；

图4a利用ROC曲线评价AJCC分期对大肠癌的预后价值；图4b利用ROC曲线评价OCT-1表达对大肠癌的预后价值。曲线下面积AUC和相应的95％CI如图所示；

图5显示了多因素COX回归生存分析表明OCT-1具有独立预后价值。OCT-1、AJCC分期、肿瘤体积、性别、年龄均被纳入Cox回归模型，分析这些因素与大肠癌患者生存的关系。P值、Exp(b)和95％CI见于列表。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作详细说明。

病人和组织样本：90例、180点大肠癌组织芯片是从上海芯超生物科技有限公司购得，随访时间为6.3年～7.1年，手术时间2006年7月～2007年5月，随访时间至2013年8月。这些病人未经过放化疗治疗。90例大肠癌组织和对应癌旁组织，去除无临床分期病例和失访病例，剩余81个病例。

免疫组化：(1)烤片：组织芯片置于72℃烤箱烘烤1小时；(2)全自动染片机脱蜡、水化：二甲苯10分钟×2次，100％酒精5分钟×2次，95％酒精5分钟×2次，80％酒精5分钟×1次，70％酒精5分钟×1次；(3)微波抗原修复：将组织切片浸入由柠檬酸钠、柠檬酸三钠和纯水配制的0.01M柠檬酸盐抗原修复液中，于微波加热使液温维持在95℃左右10分钟。室温自然冷却；(4)PBS冲洗5分钟×4次，动作轻柔，避免组织掉片；(5)消除内源性过氧化物酶活性：3％过氧化氢溶液孵育10～15分钟。(6)蒸馏水冲洗3分钟×3次后，PBS冲洗5分钟×4次；(7)封闭：将组织切片擦洗干净，在每张组织切片上滴加50微升封闭液即非免疫羊血清，室温孵育30分钟，封闭非特异性抗原；(8)滴加一抗：OCT-1一抗(Abcam，ab15112)用PBS按1:50稀释，倾去封闭液，滴加适当稀释比例的一抗，置于湿盒中4℃孵育过夜。小心加抗体，避免气泡产生，如有气泡可用牙签去除；(9)次日，将湿盒置于室温下复温30分钟；(10)倾去一抗，PBS冲洗5分钟×4次；(11)滴加二抗：抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒即以下简称二抗试剂盒，将切片置于湿盒中，用滤纸将组织周围的水分吸去，每张组织切片滴加二抗一滴，室温下孵育半小时；(12)倾去二抗，PBS冲洗洗5分钟×4次；(13)DAB显色：1ml蒸馏水中加上海长岛公司DAB试剂盒中A液和B液各一滴，新鲜配置的DAB显色液避光放置，每张组织切片加入50ul的显色液，显色1分钟左右，在显微镜下控制显色时间，观察到出现阳性结果又无明显背景着色时终止反应，将切片迅速置入流动自来水中冲洗约10分钟；(14)复染：苏木素复染10秒染细胞核，显微镜下观察苏木素染核效果，如着蓝色可及时终止反应，后置缓慢流动自来水中冲洗15分钟；(15)封片：自然晾干，中性树胶封片。

免疫组化结果判断标准：对活检及手术组织标本，每张切片在400倍的高倍镜下观察，计算阳性细胞数占所有同类细胞的百分比。染色结果根据阳性细胞染色强度(0分～3分)和所占百分比(f)综合判断：根据阳性染色强度进行计分：0分为无染色；1分为染色弱但仍能检测到；2分为明显阳性但仍然染色弱；3分为染色很强。染色系数(I)＝0×f0+1×f1+2×f2+3×f3，f0-f3是指染色强度为0分～3分细胞所占百分比(％)。将大肠癌组织和对应癌旁组织的染色系数进行比较，得出结论。

以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。

Claims (10)

1.一种大肠癌预后诊断生物标记物，其特征在于，所述大肠癌预后诊断生物标记物为OCT1蛋白。

2.根据权利要求1所述的大肠癌预后诊断生物标记物，其特征在于，所述OCT1蛋白在大肠癌组织中的表达水平显著高于所述OCT1蛋白在正常肠上皮组织中的表达水平，P<0.0001。

3.根据权利要求1所述的大肠癌预后诊断生物标记物，其特征在于，所述OCT1蛋白的表达水平与肿瘤体积呈正相关，所述OCT1蛋白的表达水平与AJCC分期相关，所述OCT1蛋白的表达水平与年龄性别无关。

4.根据权利要求1所述的大肠癌预后诊断生物标记物，其特征在于，所述OCT1蛋白的表达水平与大肠癌患者的生存期呈显著负相关，P<0.0001。

5.根据权利要求1所述的大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

a)提供取自大肠癌受试者的样品和对照品；

b)对步骤a)的所述样品和所述对照品中的所述OCT1蛋白进行定量测定，得到样品值和对照值；

c)将步骤b)中得到的所述样品值与所述对照值进行比较；

d)如果所述样品值高于所述对照值，则判断所述大肠癌受试者的预后不良。

6.根据权利要求5所述的大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述步骤a)中的所述样品取自受试者的大肠癌组织，所述对照品取自受试者对应的癌旁组织。

7.根据权利要求5所述的大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述步骤b)中使用免疫组化检测法对所述OCT1蛋白进行定量测定。

8.根据权利要求7所述的大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，所述免疫组化检测法的结果根据阳性细胞的染色强度和所述阳性细胞占所有同类细胞的百分比综合判断。

9.根据权利要求7所述的大肠癌预后诊断生物标记物在制造用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，染色系数用于判断所述免疫组化检测法的结果，所述染色系数定义为(I)＝0×f0+1×f1+2×f2+3×f3，其中f0-f3是指染色强度为0分～3分的细胞所占百分比。

10.一种用于大肠癌受试者预后诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的OCT1蛋白的抗体。