CN109541213A - 一种食管癌筛查试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种食管癌筛查试剂盒，属于生物医学技术领域。本发明的试剂盒包括试剂：包括RARβ蛋白抗体、sPLA2‑IIA蛋白抗体和XPC蛋白抗体、柠檬酸钠抗原修复液、羊血清、3％过氧化氢、PBS缓冲液、DAB染色液，该试剂盒可以有效的评估食管癌组织中蛋白表达水平，可作为临床食管癌的辅助诊断手段，进而可以更准确地分析食管癌的发生风险。
Description
技术领域
本发明涉及一种食管癌筛查试剂盒，属于生物医学技术领域。
背景技术
我国是食管癌发生人数最多的国家，其中太行山脉地区为我国食管癌高发地区。据中国恶性肿瘤评估结果显示，我国食管癌的平均每天新发病例和平均每天死亡病例在恶性肿瘤中排行前四位，多年的大量研究表明食管癌受遗传因素和环境因素的影响。
目前，食管癌根据病理特征主要分为食管鳞癌和食管腺癌。我国的食管癌患者主要以患食管鳞癌为主。食管鳞癌好发于食管中段，早期患者常无明显症状，中晚期患者有进行性吞咽困难等症状。目前食管癌的治疗方法主要以手术为主，或者/同时伴有手术前后的放化疗。
食管癌患者的预后与其发现日期密切相关，但临床上首次被确诊为食管癌的患者中，95％以上为中晚期。研究表明：早期食管癌的五年生存率大约为90％，而中晚期患者的5年生存率约为10％。因此，筛选食管癌高危人群以及建立食管癌风险预警是降低食管癌患者死亡率的关键所在。
食管癌发生及发展的分子机制目前尚不清楚，找寻有效的食管癌分子诊断标志物对于筛选食管癌高危人群及建立食管癌风险预警，进而提高食管癌患者预后具有重要意义。
现有技术中存在对食管癌患者预后评估的研究，申请公布号为CN107966566A的中国发明专利申请公开了一种用于检测新疆地区食管鳞癌患者预后效果的试剂盒，该试剂盒包括磷脂酶ε1蛋白、IKBα蛋白和突变型P53蛋白。授权公告号CN105891495B的中国发明专利公开了5-脂氧合酶通路蛋白联合预测食管癌患者预后试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种食管癌筛查试剂盒，该试剂盒可以评估食管癌的发生风险。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
一种食管癌筛查试剂盒，包括RARβ蛋白抗体、sPLA2-IIA蛋白抗体和XPC蛋白抗体。RARβ、sPLA2-IIA、XPC蛋白可以作为食管癌风险预警的一个分子诊断标志物，这三种蛋白的表达水平差异可以作为评估食管癌发生风险的一个辅助诊断手段。
上述食管癌筛查试剂盒还包括柠檬酸钠抗原修复液、羊血清、3％过氧化氢、PBS缓冲液、DAB染色液。该试剂盒可以有效的评估被检者食管癌组织相关蛋白表达水平，可作为临床食管癌的辅助诊断手段。
附图说明
图1为本发明试验例中RARβ免疫组化半定量的评分结果图；
图2为本发明试验例中sPLA2-IIA免疫组化半定量的评分结果图；
图3为本发明试验例中XPC免疫组化半定量的评分结果图；
图4为本发明试验例中RARβ在正常食管组织中的免疫组化结果图；
图5为本发明试验例中RARβ在食管鳞癌组织中的免疫组化结果图；
图6为本发明试验例中sPLA2-IIA在正常食管组织中的免疫组化结果图；
图7为本发明试验例中sPLA2-IIA在食管鳞癌组织中的免疫组化结果图；
图8为本发明试验例中XPC在正常食管组织中的免疫组化结果图；
图9为本发明试验例中XPC在食管鳞癌组织中的免疫组化结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的实施方式作进一步说明。
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实验材料及试剂来源
患者正常食管组织和食管癌样本均来自河南省食管癌重点开放实验室，其中包括正常食管组织512例，早期食管癌98例，中期食管癌146例，晚期食管癌268例；RARβ蛋白抗体购买于Abcam公司，货号为ab53161，RARβ参与了维甲酸的多个生物学效应，RARβ的异常甲基化与多种肿瘤的发生有密切的关系；XPC蛋白抗体购买于Abcam公司，货号为ab203693，XPC参与了DNA损伤修复过程，其表达缺失或者功能异常可影响正常的DNA损伤修复能力，从而可导致肿瘤的发生；sPLA2-IIA蛋白抗体购买于Santa Cruz公司货号为sc58363，sPLA2-IIA可以促进大肠癌细胞的增殖，并参与肿瘤的免疫过程；RARβ蛋白抗体和XPC蛋白抗体的二抗购买于Abcam公司，货号为ab6741；sPLA2-IIA蛋白抗体的二抗购买于Santa Cruz公司，货号为sc516102；其他相关试剂购于碧云天生物技术有限公司。
食管癌筛查试剂盒的实施例
本实施例的食管癌筛查试剂盒，主要包括试剂：柠檬酸钠抗原修复液200mL、山羊血清1mL、3％过氧化氢1mL、PBS缓冲液100mL、DAB染色液0.2mL、无水乙醇200mL、二甲苯200mL、RARβ蛋白抗体0.1mL、sPLA2-IIA蛋白抗体0.1mL、XPC蛋白抗体0.1mL、RARβ蛋白二抗0.1mL、sPLA2-IIA蛋白二抗0.1mL、XPC蛋白二抗0.1mL。
试验例
本试验例为食管癌筛查试剂盒的实施例中的试剂盒的使用方法。
1、食管鳞癌组织中的RARβ蛋白、sPLA2-IIA蛋白、XPC蛋白表达量的检测，包括以下步骤：
(1)切片的制备：分别选取512例正常人食管组织、98例早期食管癌患者食管鳞癌组织、146例中期食管癌患者食管鳞癌组织、268例晚期食管癌患者食管鳞癌组织，制作石蜡切片。
(2)切片的脱蜡与水化：用二甲苯冲洗石蜡切片，冲洗15min；再换新的二甲苯冲洗石蜡切片，冲洗15min；然后依次用100％的乙醇冲洗5min，95％的乙醇冲洗3min，80％的乙醇冲洗3min，75％的乙醇冲洗3min；最后用蒸馏水冲洗3次，每次冲洗3min。
(3)热抗原修复：将柠檬酸钠抗原修复液用烧杯加热，温度控制在97℃；然后将步骤(2)得到的切片放入烧杯中，放置15min后自然冷却至室温；最后用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min，再用蒸馏水冲洗切片3次，每次3min。
(4)内源酶的灭活：在放有切片的烧杯中加入200mL蒸馏水，再加入5mL3％的过氧化氢，室温孵育10min；然后用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min，再用蒸馏水冲洗3min。
(5)非特异性位点的封闭：用吸水纸吸干切片上的水分后将切片放入湿盒中，在各张切片上滴加两滴山羊血清封闭液，室温封闭10min。
(6)一抗的加入：除去封闭液，分别用RARβ、sPLA2-IIA、XPC三种蛋白对应的一抗覆盖切片组织，然后放入湿盒内，4℃反应12h；然后将湿盒在室温下复温30min，再用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min；最后用蒸馏水洗涤3min。
(7)二抗的加入：甩干切片上的蒸馏水，吸干水珠，分别滴加RARβ、sPLA2-IIA、XPC三种蛋白一抗对应的二抗，室温孵育10min；然后用PBS缓冲液冲洗切片3次，每次3min，再用蒸馏水冲洗3min。
(8)切片的染色：分别在各张切片上滴加100μL DAB染色液，显微镜下观察，当观察到间质未着色，癌巢呈黄褐色的时候，即可终止染色，用自来水冲洗切片。
(9)切片的复染：用苏木素复染切片1～2min，观察到细胞核变蓝色即可终止，用自来水冲洗反蓝(也可用0.5％氨水反蓝)；然后用1％的盐酸酒精分化液分化3s，再用自来水冲洗3min。
(10)切片的脱水：将各张切片依次用70％的乙醇冲洗1min、80％的乙醇冲洗1min、95％的乙醇冲洗2min、100％的乙醇冲洗4min、二甲苯冲洗3min、再换新的二甲苯冲洗3min。
(11)切片的封片：将切片晾干后滴加两滴中性树胶进行封片，盖上盖玻片，盖盖玻片时应避免有气泡产生，晾干半天即可在显微镜下观察拍照。
(12)对切片进行半定量和显微镜结果分析。
2、食管癌组织切片半定量和显微镜观察结果分析
(1)半定量分析
对免疫组化染色的组织蛋白进行半定量分析，当细胞染色呈黄棕色时判定为阳性细胞，根据着色程度将细胞分为四个等级：阴性为0、弱阳性为1、阳性为2、强阳性为3；阳性细胞百分比为0％时记为0分、阳性细胞百分比为0～25％时记为1分、阳性细胞百分比为25～50％时记为2分、阳性细胞百分比为50～75％时记为3分、阳性细胞百分比为75～100％时记为4分。半定量评分＝着色程度*阳性百分比分值，半定量得分为0-12。用ImageJ软件对免疫组化结果进行半定量分析，并用Graphpad对半定量评分进行统计学分析，p＜0.05为有统计学意义。
(2)半定量分析结果
RARβ组织蛋白的半定量分析结果如图1所示，结果表明，512例正常食管组织中，RARβ的免疫组化平均得分为3.22±0.93；食管癌组织中，98例早期食管癌组织RARβ的平均得分为5.23±0.61，146例中期食管癌组织RARβ的平均得分为7.32±0.65，268例晚期食管癌组织RARβ的平均得分为9.53±0.61，与正常食管组织相比，表达水平差异具有统计学意义(p＜0.05)。
sPLA2-IIA组织蛋白的半定量分析结果如图2所示，结果表明，512例正常食管组织中，sPLA2-IIA的免疫组化平均得分为3.89±0.67；食管癌组织中，98例早期食管癌组织中sPLA2-IIA的平均得分为6.39±0.4，146例中期食管癌组织中sPLA2-IIA的平均得分为8.34±0.29，268例晚期食管癌组织中sPLA2-IIA的平均得分为10.28±0.75，与正常食管组织相比，表达水平差异具有统计学意义(p＜0.05)。
XPC组织蛋白的半定量分析结果如图3所示，结果表明，512例正常食管组织中，XPC的免疫组化平均得分为10.39±1.02；食管癌组织中，98例早期食管癌组织中XPC的平均得分为8.69±0.72，146例中期食管癌组织中XPC的平均得分为6.89±0.73，268例晚期食管癌组织中XPC的平均得分为5.05±0.93，与正常食管组织相比，表达水平差异具有统计学意义(p＜0.05)
与正常食管组织相比，食管癌组织的RARβ和sPLA2-IIA的表达水平显著升高，而XPC蛋白表达水平显著降低，说明食管癌与RARβ、sPLA2-IIA、XPC表达水平相关。在临床上，对于食管组织异常者，可分别取异常部位和正常部位组织，检测RARβ、sPLA2-IIA、XPC蛋白表达水平，根据检测结果相对于正常部位的表达量的高低评测其患食管癌的可能性，可作为临床上食管癌的辅助诊断手段。
(3)显微镜观察结果
从显微镜观察结果如图4～9所示，从图中可以看出，正常食管上皮细胞的细胞结合紧密，细胞间质少；食管鳞癌细胞核质比失调，HE染色下核大深染，核有分裂象。
Claims (2)
1.一种食管癌筛查试剂盒，其特征在于：包括RARβ蛋白抗体、sPLA2-IIA蛋白抗体和XPC蛋白抗体。
2.根据权利要求1所述的食管癌筛查试剂盒，其特征在于：还包括柠檬酸钠抗原修复液、羊血清、3％过氧化氢、PBS缓冲液、DAB染色液。
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