CN105112515A - Fbxw7基因及表达产物在肾癌检测、肾癌药物制备中的用途 - Google Patents

Fbxw7基因及表达产物在肾癌检测、肾癌药物制备中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备检测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途。还公开一种检测肾癌的试剂盒、一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途、一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的装置以及一种非治疗目的的抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的方法。

Description

FBXW7基因及表达产物在肾癌检测、肾癌药物制备中的用途
技术领域
本发明涉及生物检测领域，具体的，本发明涉及FBXW7基因及表达产物在肾癌检测、肾癌药物制备中的用途，更具体的，本发明涉及一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备检测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途、一种检测肾癌的试剂盒、一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途、一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的装置以及一种非治疗目的的抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的方法。
背景技术
FBXW7基因(F-box和WD-40域蛋白7)又称HCDC4。
FBXW7作为泛素蛋白酶体降解途径的重要识别因子之一，其作用的很多底物都是癌基因，如重要的cyclinE，c-Myc，c-Jun和Notch都通过FBXW7介导的泛素蛋白酶体途径进行降解的。研究显示，FBXW7突变和缺失会导致与癌细胞增殖相关的蛋白累积，如Myc和Cyclin-E。FBXW7可以通过降解在细胞生长和分化过程中具有重要作用的蛋白质来调节细胞周期、增殖和分化。
Sahoko和一些人发现FBXW7是造血系统中一种重要的防御因子，它的缺失会导致造血细胞难以成熟和急性淋巴性白血病的发生。Takehiko发现P5调节FBXW7的转录，这会导FBXW7表达障碍和预后不良。Lwatukim表示在结直肠癌组织中FBXW7表达与正常组织相比明显降低是预后不良的标志。宫颈癌中FBXW7突变导致其与cyclinE中的CDPS关联减弱，并诱导cyclinE不降解，这种调节缺失会导致细胞周期异常和肿瘤的发生。晚期胶质细胞瘤中FBXW7的缺失导致有丝分裂的异倍体增加。
肿瘤的分级和分期对临床上制定治疗方案和估计预后有参考价值。病理分级是根据组织分化程度即高、中、低以及未分化相对应的Ⅳ、Ⅲ、Ⅱ和Ⅰ级。而肿瘤的分期，TNM分期系统是目前国际上最为通用的肿瘤分期系统。每一种肿瘤的TNM分期系统各不相同，因此TNM分期中字母和数字的含义在不同肿瘤所代表的意思不同。TNM分期中T,N,M确定后就可以得出相应的总的分期，即I期，II期，III期，IV期等。有时候也会与字母组合细分为IIa或IIIb等等。I期的肿瘤通常是相对早期的肿瘤有着相对较好的预后。分期越高意味着肿瘤进展程度越高。
TNM分期系统中：1，T(“T”是肿瘤一词英文“Tumor”的首字母)指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示；2，N(“N”是淋巴结一词英文“Node”的首字母)指区域淋巴结(regionallymphnode)受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示，随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1～N3表示；3，M(“M”是转移一词英文“metastasis”的首字母)指远处转移(通常是血道转移)，没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。在此基础上，用TNM三个指标的组合(grouping)划出特定的分期(stage)。
目前，未见关于FBXW7在肾癌进展程度中生物学功能的研究报道。
发明内容
依据本发明的第一方面，本发明提供一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备检测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途。该用途是基于发明人的以下发现而作出的：FBXW7基因在肾癌中为抑癌基因，FBXW7高表达的肾癌患者预后远优于FBXW7低表达肾癌患者人群，FBXW7蛋白表达上调与RCC(肾细胞癌)临床病理分级之间具有高度相关性(p＝0.0094)以及FBXW7表达上调与肿瘤-淋巴结-转移(TNM)阶段也有很强的相关性(p＝0.0080)。FBXW7基因和/或FBXW7蛋白，包括其定性或定量信息能够作为检测肾癌发展的标志物。
依据本发明的第二方面，本发明提供一种检测肾癌的试剂盒，其包括检测FBXW7mRNA和/或FBXW7蛋白的试剂。
该试剂盒包括的试剂能够检测定量FBXW7mRNA和/或FBXW7蛋白。根据本发明实施例，所称试剂包括定量FBXW7mRNA的qPCR引物SEQIDNO：1和2，以及内参基因引物SEQIDNO：3和4，，选择的内参基因为GAPDH基因，SEQIDNO：1-4分别为AAGGGCAACAACGACG，AGGGAGCAATGAAATGAAGT，CTGGGCTACACTGAGCACC和AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG；和/或所称试剂包括检测FBXW7蛋白的免疫组织化学试剂。所称的qPCR或者qRT-PCR，是通过实时(realtime)的方法，测定样品中某个模版的起始量ct值，即循环阈值。由于前面RNA提取、反转等步骤，各个步骤存在不同的效率，ct值并无法真实反应样品中模版的绝对量，因此，需要一个内参来做为参考。选择的内参基因应是稳定的，在不同样品中被认为是表达量一致的，通过测量内参基因，可以在后面分析过程中将不同样品的起始量均一化。选择的内参需要实在不同样品中有稳定表达量的基因，在该实施例中，经过试验验证，选择GAPDH基因作为内参，以及利用SEQIDNO：1-4，能够很好的用于相对定量FBXW7mRNA。免疫组织化学，(Immunohistochemistry，IHC)又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项技术，其是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。
根据本发明的实施例，所称试剂盒还包括标签或者说明书，所述标签或者说明书注有以下内容，以对检测结果进行说明：当所检肾癌患者的FBXW7蛋白为低表达，则提示其术后的五年生存率低于0.3的概率远高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群，和/或提示其处于TNM分期的中后期的概率高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群；所称FBXW7蛋白为高表达或者为低表达是通过对免疫组织化学结果进行评分来判定的，所述免疫组织化学结果的分值为axb，定义axb≤4为低表达，axb>4为高表达，其中，a、b均为整数，a为切片的染色强度的等级，a的取值范围为0-3，0-3等级依次分别对应的切片的染色强度为阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性，b为阳性细胞百分比得分，b的取值范围为1-5，1-5分数依次对应于阳性细胞百分比[1％，5％]、(5％，25％]、(25，50％]、(50％，75％]和(75％，100％]。在本发明的一个实施例中，该试剂盒进一步包括，切片的苏木精染色强度阴性对照图和中度阳性对照图，用作a取值时的参考，有利于将FBXW7蛋白的量准确定为高表达或低表达。
利用该试剂盒及其包含的检测结果说明或对照，来检测肾癌患者，能够用以预估判断或者辅助判断该个体的肾癌的发展阶段、术后肾癌发展情况等，能够用以辅助临床诊断监测、选择适合的治疗方式。
依据本发明的第三方面，本发明提供一种FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途。该用途是基于发明人发现FBXW7基因高表达会抑制肾癌的增殖以及诱导肾癌细胞凋亡而作出的。FBXW7基因能够用于治疗肾癌的潜在靶点，肾癌药物作用的目标基因。
依据本发明的第四方面，本发明提供一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的装置，该装置包括：基因表达调节单元，用以使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调，以抑制所述肾癌细胞和/或诱导所述肾癌细胞凋亡。该装置是基于发明人体外试验发现FBXW7基因高表达能够抑制肾癌的增殖以及诱导肾癌细胞凋亡而作出的，在肾细胞癌转染FBXW7质粒后，通过CCK8、集落形成和流式细胞仪检测技术，显示肾癌细胞ACHN和A704细胞系增殖活性降低，细胞凋亡增加；而通过Westernblot分析，FBXW7高表达的肾癌细胞与阴性对照组细胞相比，其细胞增殖活化蛋白c-Myc和c-Jun的表达均下调。FBXW7基因表达上调能够抑制肾癌的增殖或者诱导肾癌细胞凋亡，FBXW7基因能够用于治疗肾癌的潜在靶点。
根据本发明的实施例，利用FBXW7质粒转染所述肾癌细胞，使肾癌细胞中的FBXW7基因过表达，以实现肾癌细胞中的FBXW7基因的表达上调。
依据本发明的第五方面，本发明提供一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的方法，所述方法用于非治疗目的，该方法包括使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调的步骤。该方法是基于发明人体外试验发现FBXW7基因高表达能够抑制肾癌的增殖以及诱导肾癌细胞凋亡而作出的。FBXW7基因表达上调能够抑制肾癌的增殖或者诱导肾癌细胞凋亡，FBXW7基因能够用于治疗肾癌的潜在靶点。
根据本发明的实施例，利用FBXW7质粒转染所述肾癌细胞，使肾癌细胞中的FBXW7基因过表达，以实现其中的FBXW7基因表达上调。
上述本发明的FBXW7基因/蛋白在肾癌相关检测试剂盒、药物制备中的用途，抑制肾癌细胞增殖和/或诱导细胞凋亡的方法以及装置，是发明人基于体外试验研究探讨在肾癌组织中FBXW7蛋白的表达水平和临床病理特点的相关性，研究FBXW7基因过表达对肾癌细胞的凋亡、增殖、细胞周期的影响，并评估其对肾细胞癌生长和肾细胞癌患者预后的影响之后而作出的。检测或者定量FBXW7基因/蛋白，能够用于辅助肾癌检测诊断以及预后情况判断。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施方式的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1是本发明一个实施例中的FBXW7在肾透明细胞癌和癌旁正常组织的表达的示意图；图1A显示FBXW7在肾癌组织的阴性染色照片(400×)，图1B显示FBXW7在肾癌组织的弱阳性染色照片(400×)，图1C显示FBXW7在癌旁组织的中等强染色照片(400×)，图1D显示FBXW7在肾癌旁组织的强染色照片(400×)，图1E显示正常组织和肾透明细胞癌中FBXW7蛋白表达量的箱式图(n＝105，P<0.0001)。
图2是本发明一个实施例中的肾透明细胞癌病人的生存分析示意图(n＝81)；图2A显示肾透明细胞癌FBXW7低表达组(n＝22)和高表达组(n＝59)的术后的生存率对比曲线；图2B显示TNMI期病患FBXW7低表达组和高表达组的术后生存率对比曲线；图2C显示TNMII期病患FBXW7低表达组和高表达组的术后生存率对比曲线；图2D显示TNMIII–IV期病患FBXW7低表达组和高表达组的术后生存率对比曲线。
图3是本发明一个实施例中的四种肾癌细胞系ACHN、A498、ACHN和A704中的FBXW7mRNA和蛋白的表达量示意图；图3A显示四种肾癌细胞系中的FBXW7mRNA的表达量检测结果，图3B显示westernblot检测四种肾癌细胞系中的FBXW7蛋白表达量结果，图3C显示转染后的肾癌细胞系A704和ACHN中的FBXW7mRNA的表达量检测结果，图3D显示westernblot检测转染后的肾癌细胞系A704和ACHN中的FBXW7蛋白的表达量结果。
图4是本发明一个实施例中的FBXW7高表达对细胞活性和细胞增殖的影响示意图；图4A显示FBXW7质粒和空载体转染后的ACHN和A704细胞的细胞活性变化，图4B显示FBXW7质粒和空载体转染后的ACHN和A704细胞的平板克隆的实验结果。
图5显示本发明一个实施例中的流式细胞仪PI法检测FBXW7质粒和空载体转染后肾癌细胞系的细胞周期和细胞凋亡的变化示意图。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例对本发明的FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备肾癌检测试剂、制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途，抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的非治疗目的的方法或装置等进行详细的描述。下面示例，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
除另有交待，以下实施例中涉及的未特别交待技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品说明书进行，未特别交待的试剂、序列、载体和细胞等也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公职的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例一
1、样本
涉及的105对石蜡样本来自广东省第二人民医院。所有组织学诊断和病理分级由广东省二院病理学系独立的两位高级病理医生完成。所有病变未经任何手术前化疗和放疗处理。所有的临床信息皆从患者病历资料中收集得到。
2、免疫组织化学
手术标本固定于10％福尔马林中，石蜡包埋。对石蜡块进行4μm连续切片制片。切好的薄片在67℃下放置2h，在二甲苯中脱蜡，梯度酒精中脱水，在加有0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH值6.0)的高压釜中加热进行抗原修复。切片在37℃的3％过氧化氢下培养10分钟灭活内源性过氧化物酶,并在正常山羊血清中，37℃下孵育10分钟以防止非特异性染色。滴加第一抗体FBXW7(1:500，Abcam，美国)，并在4℃下孵育过夜。以抗体稀释液取代一抗作为阴性对照。Elivisionplus试剂盒(迈新、福建、中国)检测抗体结合。切片经二氨基联苯胺(DAB)染色，流水冲洗，再进行苏木精染色，脱水、透明、干燥和封片。所有肿瘤切片由2名独立的观察者随机审查。每个切片选取五个区域观察，每个区域在400倍镜下观察100个细胞。FBXW7的免疫分数由每个切片的染色强度和阳性细胞百分比确定。FBXW7染色强度分级为0(阴性)、1(弱阳性)、2(中度)和3(强阳性)。阳性细胞百分比分级为1(1-5％)、2(5-25％)、3(25-50％)、4(50-75％)和5(75-100％)。每个切片的最终分级为上述两种分级的乘积，范围为0-15。最后数值≤4被视为FBXW7低表达，数值>4则为FBXW7高表达。
3、结果
3.1统计分析
采用Prism5(GraphPad,圣地亚哥,CA公司，美国)及SPSS18.0(SPSS,芝加哥,IL公司,USA)统计软件进行分析，计量资料以均值±标准差()表示。根据数据处理的不同方法及统计学处理的不同要求，选用方差分析或t检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
3.2FBXW7在肾细胞癌、癌旁组织中的表达及与临床病理因素的联系
我们通过免疫组化染色研究了FBXW7在105对肾癌组织中的表达。FBXW7主要表达于肾细胞癌癌细胞和癌旁组织的细胞核中，如图1所示，肿瘤染色明显低于癌旁正常组织。图1显示FBXW7在肾透明细胞癌和癌旁正常组织的表达，FBXW7主要位于细胞核。图1A显示FBXW7在肾癌组织的阴性染色照片(400×)，图1B显示FBXW7在肾癌组织的弱阳性染色照片(400×)，图1C显示FBXW7在癌旁组织的中等强染色照片(400×)，图1D显示FBXW7在肾癌旁组织的强染色照片(400×)，FBXW7在肾癌组织和癌旁组织的染色形成了强烈的对比。图1E显示出正常组织FBXW7蛋白表达增多，正常组织FBXW7蛋白表达远远高于肾透明细胞癌(n＝105，P<0.0001)，箱式图的两端分别是上四分位数和下四分位数，中间横线是中位数，两端的连线分别是除了离群值外的最大值和最小值。
癌旁正常组织中FBXW7蛋白表达水平比肾癌组织高得多，如图1e所示(N＝105，P＜0.0001)。105例肾细胞癌标本中，77例强阳性染色，28例为弱阳性染色。我们分析了FBXW7过表达与肾癌细胞临床病理因素的联系。如表1所示，FBXW7蛋白表达上调与RCC(肾细胞癌)临床病理分级之间具有高度相关性(p＝0.0094)。肿瘤-淋巴结-转移(TNM)阶段也与FBXW7表达上调(p＝0.0080)间有很强的相关性。然而，年龄，性别，肿瘤大小(小：小于7厘米，大：>7cm)和FBXW7蛋白表达水平之间无相关性。所有上述FBXW7的表达与肾透明细胞癌临床病理的相关性内容被总结在表1中。
表1
实施例二
1、免疫组织化学
手术标本固定于10％福尔马林中，石蜡包埋。对石蜡块进行4μm连续切片制片。切好的薄片在67℃下放置2h，在二甲苯中脱蜡,梯度酒精中脱水，在加有0.01M柠檬酸盐缓冲液(pH值6.0)的高压釜中加热进行抗原修复。切片在37℃的3％过氧化氢下培养10分钟灭活内源性过氧化物酶,并在正常山羊血清中，37℃下孵育10分钟以防止非特异性染色。滴加第一抗体FBXW7(1:500，Abcam，美国)，并在4℃下孵育过夜。以抗体稀释液取代一抗作为阴性对照。Elivisionplus试剂盒(迈新、福建、中国)检测抗体结合。切片经二氨基联苯胺(DAB)染色，流水冲洗，再进行苏木精染色，脱水、透明、干燥和封片。所有肿瘤切片由2名独立的观察者随机审查。每个切片选取五个区域观察，每个区域在400倍镜下观察100个细胞。FBXW7的免疫分数由每个切片的染色强度和阳性细胞百分比确定。FBXW7染色强度分级为0(阴性)，1(弱阳性)，2(中度)和3(强阳性)。阳性细胞百分比分级为1(1-5％)，2(5-25％)，3(25-50％)，4(50-75％)和5(75-100％)。每个切片的最终分级为上述两种分级的乘积，范围为0-15。最后数值≤4被视为FBXW7低表达，数值>4则为FBXW7高表达。
2、生存分析
FBXW7表达下调对肾细胞癌患者生存的影响可用kaplan-meier法和Log-rank检验进行分析。图2显示肾透明细胞癌病人的生存分析结果(n＝81)。图2A为运用Kaplan-Meier法分析肾透明细胞癌FBXW7低表达组(n＝22)和高表达组(n＝59)的术后的生存情况，高表达FBXW7组的生存率要明显好于低表达组(log-ranktest，P<0.001)图2B-D分别为TNMI、TNMII和TNMIII–IV中高表达FBXW7肾透明细胞癌和低表达组的不同生存情况。
FBXW7低表达的患者五年生存率比FBXW7高表达的患者低得多(图2A，P＜0.001)。FBXW7表达上调患者的总体生存时间长于FBXW7表达低下患者。所有患者基于TNM分期分为三组(I，II，III-IV)，比较同一组中FBXW7高表达和低表达患者的生存率，结果分别如图2B(P＜0.001)、图2C(P＝0.030)和图2D(P＝0.025)所示。
实施例三
1、试验
1.1细胞培养与FBXW7质粒转染
人类肾细胞癌细胞系AHCN和A704使用RPMI-1640培养基(Gibco,Invitrogen公司，纽约，美国)进行培养，RPMI-1640培养基中添加10％胎牛血清(FBS)(Gibco，Invitrogen公司，纽约，美国)，100U/ml青霉素(Gibco，Invitrogen公司，纽约，美国)和100mg/ml链霉素(Gibco，Invitrogen公司，纽约，美国)。置37℃、含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。FBXW7质粒购自上海吉凯，按照说明书的指示，采用脂质体2000将FBXW7质粒转染到肾细胞癌细胞系中。重复实验3次。
1.2实时聚合酶链反应
按照说明书的指示，采用RNA分离试剂盒(天根生化科技)提取总RNA，采用RT-PCR试剂盒(TakaraBio)合成cDNA。实时PCR定量FBXW7mRNA水平使用一对自设计合成的qPCR引物序列：上游引物为5’-AAGGGCAACAACGACG-3’(SEQIDNO：1)；下游引物5‘-AGGGAGCAATGAAATGAAGT-3’(SEQIDNO：2)。FBXW7mRNA相对表达水平的引物参考管家基因GAPDH的序列：上游引物为5'-CTGGGCTACACTGAGCACC-3'(SEQIDNO：3)；下游引物为5'-AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3’(SEQIDNO：4)。重复实验3次。
1.3Westernblot检测
收集转染24h后的细胞，PBS缓冲液洗涤3次，使用RIPA裂解液(BeyotimeBiotechnology)提取总蛋白，BCA法测定总蛋白浓度。将一定量的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳缓冲液加入总量为30μg的蛋白质样品中，煮沸5分钟，冷却至室温后，装入SDS-PAGE凝胶电泳槽，转移至PVDF膜。膜用WB封闭液阻滞，加入兔抗FBXW7(1：500，Abcam公司，美国)，c-myc(1：500，GeneTex公司，美国)和c-Jun(1：500，Abcam公司，美国)，4℃孵育过夜。洗涤膜，用辣根过氧化物酶标记的二抗在4℃下孵育1h。采用ECL(Beyotime生物技术)检测蛋白质，Bandscan5.0分析法检测蛋白质带。β-actin用作FBXW7的阴性对照。
1.4细胞活力检测
质粒转染细胞24小时后，将细胞接种于96孔板(3×103细胞/孔)，置37℃、含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养24h。在每个加样孔中滴加10μlCCK-8试剂盒(CCK-8，Dojindo公司，熊本，日本)，再置37℃、含5％CO2的饱和湿度培养箱中培养2h，然后用紫外分光光度计检测450nm波长处的吸光度。重复实验3次。
1.5细胞周期分析
取转染24h后的ACHN和A704细胞，PBS缓冲液洗涤3次，按照说明书用PI单染色法(KeyGEN，南京，中国)检测细胞周期。实验重复3次。
1.6细胞凋亡
采用PI检测试剂盒(KeyGEN,南京，中国)检测细胞凋亡。取转染24h后的细胞，以无EDTA的胰蛋白酶消化，收集细胞，PBS缓冲液洗涤2次，再悬浮于500μL的再悬浮缓冲液中，并加入Annexin-KeyFour488和PI各5μl，充分混合后，黑暗环境中放置5-15分钟。用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。重复实验3次。
1.7集落形成实验
取转染24h后的细胞，接种于6孔板(1000细胞/孔)，37℃、5％CO2的饱和湿度培养箱中培养。两周后，龙胆紫染色，计算菌落数大于50的孔数。实验重复3次。
2、结果
2.1统计分析
采用Prism5(GraphPad,圣地亚哥,CA公司，美国)及SPSS18.0(SPSS,芝加哥,IL公司,USA)统计软件进行分析，计量资料均值±标准差()表示。根据数据处理的不同方法及统计学处理的不同要求，选用方差分析或t检验进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2.2FBXW7的过表达可抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡
FBXW7mRNA和蛋白的表达量检测结果如图3所示，图3A显示4种肾癌细胞系ACHN,A498,ACHN,A704中相关的mRNA表达量，图3B显示westernblot检测FBXW7在4中种肾癌细胞系中的表达情况，图3C显示A704和ACHN转染后FBXW7mRNA的表达量，图3D显示A704和ACHN转染过后，westernblot检测相关的蛋白表达的结果。图中mRNA定量的纵坐标——相对表达倍数的计算方式：在QPCR仪器上获得数值后用目的基因的数值减去对应的管家基因GAPDH的数值所得结果的负数作为2的指数，例如目的基因的数值是30，对应的GAPDH是25，最后的数值就是2-5。图中，载体(vetor)和质粒(pasimid)分别指转染空载体和转染FBXW7质粒的细胞。
从肾细胞癌细胞系ACHN，A704，A498和786-0中提取的RNA反转录成cDNA，实时PCR得到FBXW7RNA表达水平相关的四个细胞系，结果是786-0>A498>A704>ACHN，如图3A所示。免疫印迹实验结果中FBXW7蛋白表达水平与实时PCR结果一致，如图3B所示。
为了进一步研究FBXW7对肾细胞癌细胞系的调节，选择细胞系A704和ACHN为研究对象。我们使用FBXW7质粒转染ACHN和A704进行CCK8检测和菌落形成实验，来研究FBXW7表达量对肾细胞癌细胞系增殖、细胞凋亡和细胞周期的影响。
FBXW7转染后，用实时PCR和Westernblot检测FBXW7RNA，结果如图3C所示，以及FBXW7和其下游靶蛋白c-Myc和c-Jun蛋白的相对表达水平，结果如图3D所示，以此来证明FBXW7质粒转染的有效性。
图4显示出高表达FBXW7促进细胞的凋亡，延长细胞的周期，抑制细胞的增殖。图4A显示CCK8实验结果，用转染入FBXW7plasmid和Vector的ACHN,A704细胞来做，通过检测发现转染入FBXW7plasmid的细胞的OD值要低于对照组，细胞活力比对照组差。图4B显示平板克隆实验结果，也是用转染入FBXW7plasmid和Vector的细胞来做，可以观察到转染入FBXW7plasmid组细胞明显要少于对照组。
FBXW7表达上调促进了ACHN和A704的细胞凋亡，抑制了其细胞增殖，如显示于CCK8分析，结果如图4a所示，其中空载体与FBXW7质粒转染后比较：A704为1.327±0.036vs.1.035±0.042(p<0.05)，ACHN为1.403±0.024vs.1.166±0.029(p<0.05)。菌落形成实验结果如图4b所示，其中空载体与FBXW7质粒转染后比较：ACHN为567±19vs.412±21(P<0.05)，A704为279±13vs.144±7(P<0.05)。
图5显示转染入FBXW7Plasmid的肾癌细胞系G0/G1所占的比例更高，转染入FBXW7Plasmid的肾癌细胞系早期和晚期凋亡所占的比例更高。
图5A显示了用流式细胞仪PI法检测细胞周期的变化的结果，ACHN和A704中FBXW7的高表达与对照组相比，G0/G1比值更高，转染入空载体与FBXW7质粒相比：ACHN为51.93％vs.63.25％(p<0.05)，A704为60.31％vs.68.32％(p<0.05)。图5B显示出FBXW7高表达的ACHN和A704比对照组具有更高比例的早期和晚期凋亡细胞，转染空载体与FBXW7质粒相比：ACHN为5.1％vs.8.5％(p＜0.05)，A704为14.1％vs.20.4％(p＜0.05)。
从以上实施例可看出，在RCC(肾细胞癌)中FBXW7的高表达，其病理分级和临床分期具有高度相关性。FBXW7高表达的患者与FBXW7低表达的患者相比有良好的整体生存率。在肾细胞癌的细胞系中，FBXW7过表达抑制细胞增殖和细胞周期的正常进行，增加细胞凋亡。FBXW7下游蛋白c-Jun和c-Myc在FBXW7转染后表达也减少。免疫组化和细胞实验数据相互支持。
在分子生物学水平，c-Myc的基因转录产物c-Myc蛋白质与细胞周期的调控，DNA聚合酶的活性和细胞增殖分化具有高度相关性。在细胞固定和终末分化阶段，c-Myc的转录受到抑制，mRNA水平下降；在正常增殖期，c-Myc的转录短暂激活并且在蛋白质翻译之前被抑制。磷酸化激活的c-Jun诱导细胞增殖、分化和癌变。它还通过AP-1调节下游靶基因，并降解细胞外基质，增加肿瘤迁移能力和侵袭活性，转移细胞的血管形成和细胞周期的异常促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。从以上我们试验研究结果可看出，FBXW7是一个重要的肿瘤抑制基因，在RCC(肾细胞癌)细胞系中FBXW7的高表达可诱导c-Myc和c-Jun蛋白质的泛素化和降解，并抑制肿瘤细胞的生长。此外，mTOR也是FBXW7的靶蛋白，并且可以通过泛素化被降解。mTOR是一种蛋白激酶，其通过调控蛋白质的合成和自噬来诱导细胞生长和分化。细胞的mTOR信号通路主要涉及经典的PI3K/AKT/mTOR信号通路，该通路在mTOR蛋白被FBXW7降解后被抑制，从而延长细胞G1期，抑制细胞增殖。
综上，上面结果阐明FBXW7表达水平在很大程度上与RCC(肾细胞癌)临床病理分级和TNM分期相关。FBXW7高表达病人与低表达病人相比有更好的总体预后。FBXW7高表达的RCC细胞系ACHN和A704增殖活性降低，G1期延长，细胞凋亡诱导增加，这可能是通过FBXW7调节c-Myc，c-Jun和mTOR实现的。FBXW7在RCC(肾细胞癌)中是显著的肿瘤抑制基因，FBXW7基因的分子机制有待进一步研究。
实施例四
另外97对石蜡样本来自广东省第二人民医院。所有组织学诊断和病理分级由广东省二院病理学系独立的两位高级病理医生完成。所有病变未经任何手术前化疗和放疗处理。所有的临床信息皆从患者病历资料中收集得到。
参照实施例一中的2免疫组织化学，检测各样本中的FBXW7蛋白相对含量，FBXW7蛋白的高表达或者低表达是通过对免疫组织化学结果进行评分来判定的，免疫组织化学结果的分值为axb，定义axb≤4为低表达，axb>4为高表达，其中，a、b均为整数，a为切片的染色强度的等级，a的取值范围为0-3，0-3等级依次分别对应的切片的染色强度为阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性，b为阳性细胞百分比得分，b的取值范围为1-5，1-5分数依次对应于阳性细胞百分比[1％，5％]、(5％，25％]、(25，50％]、(50％，75％]和(75％，100％]。
若检测结果为FBXW7蛋白低表达，则判定其处于TNM分期的中后期的概率相对高，如高于50％。或者判定其的术后五年生存率相对低，如低于50％。
对97个样本的检测判定的结果与各样本实际所处病理阶段或所处的TNM时期基本一致。判定的生存率也与样本来自的个体病例中记录的术后生存状况相吻合。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备检测肾癌的试剂或者试剂盒中的用途。
2.一种检测肾癌的试剂盒，其包括检测FBXW7mRNA和/或FBXW7蛋白的试剂。
3.权利要求2的试剂盒，其特征在于，所述试剂包括FBXW7mRNAqPCR引物对SEQIDNO：1和2以及内参基因引物对SEQIDNO：3和4，所述内参基因为GAPDH基因；和/或
所述试剂包括检测FBXW7蛋白的免疫组织化学试剂。
4.权利要求3的试剂盒，其特征在于，还包括标签或者说明书，所述标签或者说明书注有以下内容：
当所检肾癌患者的FBXW7蛋白为低表达，则提示其术后的五年生存率低于0.3的概率高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群和/或提示其处于TNM分期的中后期的概率高于FBXW7蛋白为高表达的肾癌患者人群，
所述FBXW7蛋白为高表达或者为低表达是通过对免疫组织化学结果进行评分来判定的，所述免疫组织化学结果的分值为axb，定义axb≤4为低表达，axb>4为高表达，其中，
a、b均为整数，
a为切片的染色强度的等级，a的取值范围为0-3，0-3等级依次分别对应的切片的染色强度为阴性、弱阳性、中度阳性和强阳性，
b为阳性细胞百分比得分，b的取值范围为1-5，1-5分数依次对应于阳性细胞百分比[1％，5％]、(5％，25％]、(25，50％]、(50％，75％]和(75％，100％]。
5.权利要求4的试剂盒，其特征在于，还包括切片的染色强度阴性对照图和中度阳性对照图。
6.FBXW7基因和/或FBXW7蛋白在制备抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的药物中的用途。
7.一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的装置，其特征在于，包括：
基因表达调节单元，用以使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调，以抑制所述肾癌细胞和/或诱导所述肾癌细胞凋亡。
8.权利要求7的装置，其特征在于，利用FBXW7质粒转染所述肾癌细胞以使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调。
9.一种抑制肾癌细胞增殖和/或诱导肾癌细胞凋亡的方法，所述方法用于非治疗目的，其特征在于，包括使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调的步骤。
10.权利要求9的方法，其特征在于，利用FBXW7质粒转染所述肾癌细胞以使所述肾癌细胞中的FBXW7基因表达上调。
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