CN107340385B - 生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途，腺性膀胱炎分为慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型和肠腺瘤样型，生物标记包括甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸。联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.958，灵敏度和特异性分别为96.6％和96.1％，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7。使用本发明诊断试剂不通过介入手段就可对腺性膀胱炎诊断分型，仅需患者少量血浆，检查时没有禁忌，克服了膀胱镜检查的不足。
Description
技术领域
本发明属于诊断试剂领域，具体涉及生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断分型试剂的用途。
背景技术
腺性膀胱炎(cystitis glandularis，CG)是一种比较少见的非肿瘤性炎性病变，是一种上皮增生与化生同时存在的病变，其过程为上皮增生凹入成Brunn巢，其内出现裂隙，形成分支状、环状管腔，中心出现腺性化生形成腺体结构，与此时同时存在淋巴细胞和浆细胞的浸润，因此称之为腺性膀胱炎。简单来说，腺性膀胱炎就是一种膀胱黏膜及黏膜下层黏液腺体异常增殖、化生性病变，其发病率日益增高，且与膀胱癌关系密切(杨安卿等，p27蛋白在不同分型腺性膀胱炎中的表达及其临床意义，2016)。腺性膀胱炎是否为癌前病变，目前存在争议。虽然其恶变率较低，但临床上仍具有潜在恶变倾向(杨安卿等，p27蛋白在腺性膀胱炎的表达及其与膀胱癌的关联，2016)。
腺性膀胱炎具有特殊的病理发展过程和临床发病特点，病因目前仍不清楚，可能与膀胱慢性炎症、结石、梗阻、神经源性膀胱、膀胱外翻等疾病有关。在膀胱三角区、膀胱颈部及输尿管口周围等位置较易发生。
腺性膀胱炎的诊断方法主要有三种：膀胱镜、超声和CT。不同发展阶段的腺性膀胱炎的临床及声像学表现各异，超声检查容易发生漏诊或误诊为膀胱癌。腺性膀胱炎的超声分型包括结节型、结节增厚型、片状增厚型及弥漫增厚型，其中结节型容易误诊为膀胱癌，而膀胱壁无明显增厚或结节状突起者超声检査容易发生漏诊(柯丽明等，腺性膀胱炎的超声分型与误诊漏诊分析，2014)。CT检查简便、快捷、无创，能从不同角度观察病灶，可作为早期发现腺性膀胱炎或治疗后随访的有效手段，CT的特征性表现在一定程度上能明确诊断，但对于一些表现不典型的病例只能依赖膀胱镜活检(黄丹江等，腺性膀胱炎的CT诊断影像学表现，2011)。因此，腺性膀胱炎最权威的诊断方法还是膀胱镜。临床主要根据膀胱镜检查及组织病理学类型分别对腺性膀胱炎进行分组。膀胱镜所见分组为慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型、肠腺瘤样型四种；组织病理学分组为无化生型、肠化生型、前列腺型三种(方海伟等，p53、Ki67肿瘤标志物在不同分型腺性膀胱炎中的表达及临床意义，2010)。
如前所述，现有技术对腺性膀胱炎分型需要借助于膀胱镜，是公认的标准。但是，膀胱镜检查有很多禁忌，如尿道、膀胱处于急性炎症期不宜进行检查，膀胱容量过小不宜进行检查，妇女月经期或妊娠3个月以上不宜进行检查。而且，术前准备和术后处理繁琐。这些增加了检查者的身体和心理痛苦。
生物标志物可评估人体对疾病的易感性或检出机体的异常，常用于病理状态的诊断和检测，预测疾病的进展，或评估疗效。与一些在疾病中发挥作用的危险因素不同(如年龄、肥胖、吸烟等与疾病有关的因素)，生物标志物不需要参与疾病的进展过程。生物标记物的筛选方法多种多样，如通过代谢组学法、基因组学法、蛋白质组学法发现小分子代谢标志物、基因标志物和蛋白质标志物，循环microRNA和组织microRNA等。
MiRNA可通过与靶基因3'-UTR区的配对(完全配对或部分配对)结合来降解mRNA或抑制mRNA翻译，从而调控靶基因表达水平。作为调控分子，多数miRNA具有与其他基因表达调控分子共同的特点，即细胞和组织特异性、表达时序性、结构可变性及不同物种间的高度同源性。血液、尿液、胃液等体液中也存在着与循环DNA、循环细胞类似，且源自原发病灶的循环miRNA分子。这些循环miRNA具有良好的稳定性，在室温放置24h、多次冻融、RNA酶和DNA酶作用及保存温度改变等条件下均无明显降解，考虑与miRNA存在于凋亡小体、微泡、外染色体等脂质或脂蛋白复合物中密切相关。因此，相对于其他诊断方法，循环miRNA检测创伤小，且具备一定的疾病相关特异度和稳定性，有成为新型诊断标志物的潜在价值(李越等，循环microRNA在人类疾病诊断标志物筛选中的研究进展，2014)。
代谢组学的概念是Nicholson等在1999年率先提出的。相对于基因组学、转录组学以及蛋白质组学，代谢组学更关注生物体的表型，因此也是疾病潜在生物标志物筛选中最有前景的发展方向。它借助于核磁共振波谱法、质谱结合多种分离手段对生物体系在生理或病理状态下所有内源性小分子代谢产物的动态变化进行分析，从而描绘出生物体代谢轮廓，探索内源性小分子物质与疾病发生发展间的关系。分子量小于1000道尔顿的小分子化合物是代谢组学关注的主要目标。相比较于基因、转录和蛋白质研究，代谢组学反映的是细胞活动的最终产物，所以也最稳定。由于细胞在维持功能时时刻都在发生代谢，因此代谢组学分析能反映有机体在一定时间段内的功能和状态，在某种疾病状态下基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物上得到放大，许多不能从这两种物质上体现的变化可以在代谢组学中得到检测。目前研究已证实疾病的发生和进展与代谢异常密切相关，代谢组学可以分析疾病发生发展中产生的所有代谢物，识别有价值的潜在标志物，从而为疾病的诊断和分型开辟新途径(吴杰等，代谢组学分析在肿瘤标志物筛选中的应用进展，2016)。
申请人以“腺性膀胱炎”和“标志物”在中文期刊数据库进行检索，检索到3篇相关文献：(1)方海伟等将40例患者按膀胱镜检及组织病理学类型进行分组，采用免疫组织化学SABC法，检查p53、Ki67在各分型腺性膀胱炎中的表达，并与10例正常膀胱黏膜组进行比较，结果发现乳头状瘤型、肠腺瘤型腺性膀胱炎有较高的p53、Ki67表达率，并与正常膀胱黏膜比较有显著性差异；慢性炎症型、滤泡水肿型则p53、Ki67表达率较低，与正常膀胱黏膜无差异；肠上皮型、前列腺型腺性膀胱炎p53表达率较高，并且与正常膀胱黏膜组比较有显著性差异；肠上皮型、前列腺型腺性膀胱炎Ki67表达率较高，与膀胱正常黏膜组比较，前列腺型组有显著性差异，肠上皮型无显著性差异(方海伟等，p53、Ki67肿瘤标志物在不同分型腺性膀胱炎中的表达及临床意义，2010)；(2)程跃等取96例确定有异常病理改变并行手术治疗的患者标本，其中腺性膀胱炎(GC)40例，膀胱黏膜鳞状上皮化生(SMBM)32例，合并两种病理改变(GC-SMBM)24例，另取21例正常膀胱黏膜为对照组，利用免疫组织化学法检测活检标本中P53、RasP21的表达情况，结果GC组及SMBM组P53及RasP21阳性率表达与对照组差异均无统计学意义，GC-SMBM组P53、RasP21及两者同时表达阳性表达率与对照组差异均有统计学意义(程跃等，单克隆抗体P53及RasP21在腺性膀胱炎及膀胱黏膜鳞状上皮化生中的表达研究，2012)；(3)宋亚辉等从病理学角度支持腺性膀胱炎是正常膀胱组织向膀胱癌发展的中间阶段，Survivin可考虑作为诊断早期膀胱腺癌的敏感指标(宋亚辉等，Survivin在腺性膀胱炎与膀胱腺癌中的表达及临床意义，2014)。
申请人以“cystitis glandularis”和“biomarker”在Web of Science数据库进行检索，检索到2篇相关文献：(1)Wei ZF等发现乳头状腺性膀胱炎患者膀胱粘膜组织中的hTERT、p53和PCNA比膀胱正常人膀胱粘膜的水平明显较高，提示乳头状腺性膀胱炎比较容易发生癌变(Expression of hTERT,p53 and PCNA in cystitisglandularis,2007)；(2)Velickovic,LJ等使用免疫组化的方法发现黏蛋白CD10在肠化生型腺性膀胱炎的粘膜组织中不表达，可以用于区分肠化生型和无化生型腺性膀胱炎(Differences in theexpression of mucins in various forms of cystitis glandularis,2007)。
申请人检索未发现现有技术采用代谢组学和循环miRNA分子对腺性膀胱炎进行诊断，并对不同类型腺性膀胱炎进行区分，更没有公开相关相关生物标志物在这方面的应用。由于腺性膀胱炎临床表现缺乏特征性，现有检查手段又存在各自的缺陷和不足，有必要开发相关的诊断试剂对腺性膀胱炎进行诊断分型。
发明内容
本发明的目的在于提供生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断分型试剂的用途，具体地：本发明第一目的在于提供血液循环miRNA分子用于诊断腺性膀胱炎，并对不同类型(以膀胱镜所见分型，即慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型、肠腺瘤样型四种)的腺性膀胱炎进行区分；本发明第二目的在于提供血液代谢小分子用于诊断腺性膀胱炎，并对不同类型(以膀胱镜所见分型，即慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型、肠腺瘤样型四种)的腺性膀胱炎进行区分；本发明可以从不同角度提供腺性膀胱炎诊断分型的诊断试剂。
本发明的上述目的是通过下面的技术方案得以实现的：
一种用于诊断腺性膀胱炎的生物标志物群，所述腺性膀胱炎分为慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型和肠腺瘤样型，该生物标志物群包括SEQ ID NO.1所示的miR-372-3p、SEQ ID NO.2所示的miR-383-3p和SEQ ID NO.3所示的miR-377-3p。联合应用miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积(AUC)为0.964，在最佳cutoff值下，灵敏度和特异性分别为96.2％和95.6％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为慢性炎症型，生物标志物群还包括SEQ ID NO.4所示的miR-485-3p和SEQ ID NO.5所示的miR-501-3p。在miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p基础上，进一步联合应用miR-485-3p和miR-501-3p诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.943，灵敏度和特异性分别为95.3％和94.2％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为滤泡水肿型，生物标志物群还包括SEQ ID NO.6所示的miR-96-3p和SEQ ID NO.7所示的miR-93-5p。在miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p基础上，进一步联合应用miR-96-3p和miR-93-5p诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.969，灵敏度和特异性分别为96.5％和95.8％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为乳头状瘤型，生物标志物群还包括SEQ ID NO.8所示的miR-223-5p和SEQ ID NO.9所示的miR-183-3p。在miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p基础上，进一步联合应用miR-223-5p和miR-183-3p诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.984，灵敏度和特异性分别为96.2％和96.6％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为肠腺瘤样型，生物标志物群还包括SEQ ID NO.10所示的miR-584-3p和SEQ ID NO.11所示的miR-128-3p。在miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p基础上，进一步联合应用miR-584-3p和miR-128-3p诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.973，灵敏度和特异性分别为96.0％和95.8％。
进一步地，所述生物标志物源于血浆。
上述生物标志物群在制备腺性膀胱炎诊断试剂方面的用途。
一种用于诊断腺性膀胱炎的生物标志物群，所述腺性膀胱炎分为慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型和肠腺瘤样型，该生物标志物群包括甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸。联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积(AUC)为0.958，灵敏度和特异性分别为96.6％和96.1％，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7。
进一步地，所述腺性膀胱炎为慢性炎症型，生物标志物群还包括硫酸吲哚酚和咖啡因。在甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基础上，进一步联合应用硫酸吲哚酚和咖啡因诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.952，灵敏度和特异性分别为96.3％和95.4％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为滤泡水肿型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂。在甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基础上，进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.962，灵敏度和特异性分别为95.8％和95.2％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为乳头状瘤型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮。在甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基础上，进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.979，灵敏度和特异性分别为95.5％和96.0％。
进一步地，所述腺性膀胱炎为肠腺瘤样型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸。在甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸基础上，进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.981，灵敏度和特异性分别为96.7％和96.1％。
进一步地，所述生物标志物源于血浆。
上述生物标志物群在制备腺性膀胱炎诊断试剂方面的用途。
本发明对现有技术的贡献：
(1)本发明证明，联合应用miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-485-3p和miR-501-3p可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-96-3p和miR-93-5p可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-223-5p和miR-183-3p可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-584-3p和miR-128-3p可以准确诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人。通过这11个miRNAs即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型，可以将其制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂。
(2)本发明证明，联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用硫酸吲哚酚和咖啡因可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人。通过这13个血浆代谢物即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型，可以将其制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂。
(3)使用本发明提供的诊断试剂不通过介入手段就可以对腺性膀胱炎诊断分型，仅需患者少量血浆，检查时没有禁忌，克服了膀胱镜检查的不足。
具体实施方式
下面结合实施例具体介绍本发明的实质性内容，但并不以此限定本发明的保护范围。实验中未详述的试验操作均为本领域技术人员所熟知的常规试验操作。
实施例1 基于血液循环miRNA分子的诊断试剂
第一部分：筛选阶段
一、实验材料和实验方法
1、血浆样本：研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁；男12例，女11例。经膀胱镜确诊分组：慢性炎症组(慢性炎症型6例，3M/3F)、滤泡水肿组(滤泡水肿型5例，3M/2F)、乳头状瘤组(乳头状瘤型5例，2M/3F)、肠腺瘤样组(肠腺瘤样型7例，4M/3F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。另有5例膀胱正常人为对照组。各组研究对象的年龄无显著性差异。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝肾及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下层黏液腺体无异常增殖、无化生性病变的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
2、血浆总RNA提取：取400μL血浆，使用mirVanaTM RNA Isolation试剂盒(Ambion公司)抽提总RNA，依照试剂盒说明书操作，采用分光光度计测定所提取RNA的质量。
3、分离标记：将1μg RNA，7μL DEPC水，2μL RNA Spike Control Oligospoly，5μLATP浓度为1mmol/L Tris的溶液混合后快速离心。向上述溶液加入1.5μL 25mmol/L MnCl2，1.5μL 10×reaction buffer，1.0μL酸性磷酸酶，1.0μL diluted ATP Mix后37℃孵育15min；荧光标记连接，取上述混合物15μL快速离心后置冰浴上，加入2μL T4DNA连接酶，4μL5×FlashTag连接Mix生物素，混匀后快速离心，25℃孵育0.5h。
4、芯片杂交：采用Affymetrix公司miRNA芯片试剂盒，遵从试剂盒说明书进行操作。.杂交液的配制：50μL 2×杂交Mix，5μL 20×杂交对照物，5μL去离子甲酰胺，10μL DEPC水，1.7μL对照物寡聚核苷酸B2及10μL二甲基亚砜。将上述杂交液与生物素样本混合后99℃孵育5min，45℃孵育5min，取100μL用于微阵列杂交，48℃，60r/min孵育16h。
5、芯片扫描及图像数据处理：通过GenePix 4000B microarray scanner(AxonInstruments，Foster City，CA)扫描仪对芯片扫描，并采集荧光强度。然后再通过GenepixPro 6.0 software(Axon)图像分析软件对采集的杂交图像进行数字化分析，用每个探针的原始信号值减去该点的背景值得到每个探针的修正值；用同一批次实验中在每张芯片上修正值≥50的非对照探针做标准化，以这部分探针中值作为标准化因子对整张芯片的点做标准化处理。经过标准后处理后，分别用慢性炎症组/对照组、滤泡水肿组/对照组、乳头状瘤组/对照组、肠腺瘤样组/对照组计算相应miRNAs分子的差异倍数，挑选差异大于1.5或小于0.5的miRNA作为有表达差异的miRNAs，即获得初筛结果，用于进一步验证。
6、表达验证：对初筛有表达差异的miRNAs进行验证，其引物参照GenBank数据库基因序列进行设计。按照qPCR逆转录试剂盒说明书，20μL反应体系，37℃孵育60min，95℃温育5min终止反应，逆转录成cDNA后-20℃储存备用。遵照qPCR试剂盒说明书，20μL反应体系，95℃预变性2min，40个循环，反应条件为95℃，15s及60℃，60s。通过ABI 7500定量PCR仪获得Ct值，单个反应重复2次。
二、实验结果
1、患者与膀胱正常人相比有差异性表达的miRNA
芯片结果的分析结果显示：与对照组相比，慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组和肠腺瘤样组血浆中miR-222-3p、miR-146a-5p、miR-485-3p、miR-501-3p、miR-96-3p、miR-93-5p、miR-223-5p、miR-183-3p、miR-584-3p、miR-128-3p、miR-425-3p、miR-372-3p、miR-342-3p、miR-124-5p、miR-155-5p、miR-183-5p、miR-383-3p、miR-377-3p这18种miRNAs表达上调或下调，表达差异显著(P＜0.05)。
2、qPCR表达验证结果
对疾病组和对照组血浆中的上述差异性miRNA进行qPCR验证，结果显示：
与对照组比，慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组和肠腺瘤样组血浆中miR-372-3p下调0.3～0.5倍，miR-383-3p上调1.8～2.2倍，miR-377-3p下调0.2～0.4倍；与对照组比，慢性炎症组血浆中miR-485-3p上调1.9～2.3倍，miR-501-3p上调1.7～2.0倍；与对照组比，滤泡水肿组血浆中miR-96-3p上调2.1～2.4倍，miR-93-5p上调2.5～2.8倍；与对照组比，乳头状瘤组血浆中miR-223-5p上调2.6～2.9倍，miR-183-3p上调1.8～2.1倍；与对照组比，肠腺瘤样组血浆中miR-584-3p上调3.2～3.4倍，miR-128-3p上调2.4～2.6倍。验证结果如表1所示。
表1 差异性miRNA的qPCR表达验证结果
第二部分：验证阶段
血浆样本：研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁；男42例，女39例。经膀胱镜确诊分组：慢性炎症组(慢性炎症型20例，11M/9F)、滤泡水肿组(滤泡水肿型22例，11M/11F)、乳头状瘤组(乳头状瘤型21例，11M/10F)、肠腺瘤样组(肠腺瘤样型18例，8M/10F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。另有15例膀胱正常人为对照组。各组研究对象的年龄无显著性差异。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝肾及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下层黏液腺体无异常增殖、无化生性病变的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
其它试验材料和方法同筛选阶段。
受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述qPCR表达验证的miRNAs对腺性膀胱炎诊断分型的能力。
结果显示：联合应用miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积(AUC)为0.964，灵敏度和特异性分别为96.2％和95.6％(在最佳cutoff值下，下同)，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7；进一步联合应用miR-485-3p和miR-501-3p诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.943，灵敏度和特异性分别为95.3％和94.2％；进一步联合应用miR-96-3p和miR-93-5p诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.969，灵敏度和特异性分别为96.5％和95.8％；进一步联合应用miR-223-5p和miR-183-3p诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.984，灵敏度和特异性分别为96.2％和96.6％；进一步联合应用miR-584-3p和miR-128-3p诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.973，灵敏度和特异性分别为96.0％和95.8％。由于miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p在慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组、肠腺瘤样组中的上调或下调情况基本一致，所以仅通过miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p联合应用无法区分慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组和肠腺瘤样组。
结论分析：ROC曲线评价方法中，ROC曲线下的面积值AUC在大于0.5的情况下，越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。上述结果表明，联合应用miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-485-3p和miR-501-3p可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人，灵敏度高，特异性强；进一步联合应用miR-96-3p和miR-93-5p可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人，灵敏度高，特异性强；进一步联合应用miR-223-5p和miR-183-3p可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人，灵敏度高，特异性强；进一步联合应用miR-584-3p和miR-128-3p可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人，灵敏度高，特异性强。通过这11个miRNAs即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型。ROC曲线评价结果见表2。
表2 ROC曲线评价结果(循环miRNAs)
本实施例的贡献：
本实施例证明，联合应用miR-372-3p、miR-383-3p和miR-377-3p可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-485-3p和miR-501-3p可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-96-3p和miR-93-5p可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-223-5p和miR-183-3p可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人；进一步联合应用miR-584-3p和miR-128-3p可以准确诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人。通过这11个miRNAs即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型，可以将其制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂。
实施例2 基于血浆小分子代谢物的诊断试剂
第一部分：筛选阶段
一、实验材料和实验方法
1、血浆样本：研究对象23例，年龄45～55岁，平均51.3岁；男12例，女11例。经膀胱镜确诊分组：慢性炎症组(慢性炎症型6例，3M/3F)、滤泡水肿组(滤泡水肿型5例，3M/2F)、乳头状瘤组(乳头状瘤型5例，2M/3F)、肠腺瘤样组(肠腺瘤样型7例，4M/3F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。另有5例膀胱正常人为对照组。各组研究对象的年龄无显著性差异。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝肾及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下层黏液腺体无异常增殖、无化生性病变的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
2、LC-MS分析用样品的制备
取血浆50μl，加入200μl乙腈，手动混合30s后超声混合20min，再以10,000×g离心30min，收集上清液于分离式玻璃管中，沉淀继续用200μl体积浓度50％的甲醇萃取，将甲醇萃取的上清液与乙腈萃取的上清液合并，氮气吹干，残留物于-80℃保存。LC-MS分析前，用100μl体积浓度5％的乙腈水溶液将残留物溶解，14,000×g离心5min，上清液进样分析(8h内有效)。
3、LC-MS分析参数
色谱系统：WatersAcquity HPLC/Q-TOF Micro MS
色谱柱：Acquity UPLCTM BEH C18(2.1m×100mm×1.7μm)
流动相：A相为水(含0.1％甲酸)；B相为乙腈(含0.1％甲酸)
梯度条件：0-2min，2-50％B；2-3min，50-98％B；3-4.5min，98％B；4.5-6min，2％B。
流速：0.5mL/min；柱温：45℃。
MS条件：电喷雾(UPLC/Q-TOF/MS ESI)离子源，在正、负离子模式下，扫描范围m/z100-1000；毛细管电压3.0kV，锥孔电压35kV，离子源温度100℃，干燥气温度为450℃，干燥气流速900L/h，锥孔气流量50L/h。
4、数据处理分析和差异代谢结构鉴定
将LC-MS得到的数据导入SIMCA软件(version 13.0.2，Umetrics)进行多元统计分析。通过建立OPLS-DA模型，寻找慢性炎症组与对照组、滤泡水肿组与对照组、乳头状瘤组与对照组、肠腺瘤样组与对照组之间代谢轮廓贡献较大(VIP＞1.0且p＜0.01)的代谢物，然后将这些代谢物的确切分子质量数据提交至在线数据库KEGG(http://wwwkeg.com)、METLIN(http://www.metlin.scipps.edu)、HMDB(http://www.hmdb.ca)搜寻，解析化合物质谱，对化合物进行结构鉴定，最终通过这些化合物标准品确证差异代谢物的结构。
5、定量验证：采用质谱对差异代谢物定量，测定差异代谢物在各组样本中的浓度水平。
二、实验结果
质谱定量结果显示：与对照组比，慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组和肠腺瘤样组血浆中甲基巴豆酰肉碱上调2.4～2.6倍，溶血磷脂酰乙醇胺下调0.5～0.6倍，花生四烯酸上调3.6～3.9倍；与对照组比，慢性炎症组血浆中硫酸吲哚酚下调0.4～0.5倍，咖啡因上调1.8～2.0倍；与对照组比，滤泡水肿组血浆中溶血磷脂酰胆碱(18:1)下调0.5～0.6倍，鹅去氧胆酸上调2.7～2.8倍，神经节苷脂上调2.3～2.5倍；与对照组比，乳头状瘤组血浆中溶血磷脂酰胆碱(18:1)下调0.5～0.6倍，磷脂酰丝氨酸下调0.5～0.6倍，磷酸二氢丙酮上调1.7～1.9倍；与对照组比，肠腺瘤样组血浆中溶血磷脂酰胆碱(16:0)下调0.4～0.5倍，透明质酸上调3.1～3.3倍。质谱定量验证结果如表3所示。
表3 差异性血浆代谢物的质谱定量验证结果
第二部分：验证阶段
血浆样本：研究对象81例，年龄45～55岁，平均50.4岁；男42例，女39例。经膀胱镜确诊分组：慢性炎症组(慢性炎症型20例，11M/9F)、滤泡水肿组(滤泡水肿型22例，11M/11F)、乳头状瘤组(乳头状瘤型21例，11M/10F)、肠腺瘤样组(肠腺瘤样型18例，8M/10F)。各病例均为初诊，无药物治疗史。另有15例膀胱正常人为对照组。各组研究对象的年龄无显著性差异。所有患者和膀胱正常人均有正常的心肺肝肾及造血功能。膀胱正常人是指膀胱黏膜及黏膜下层黏液腺体无异常增殖、无化生性病变的健康志愿者。收集上述患者和膀胱正常人的外周静脉血血浆，采血时间均为清晨空腹状态。
其它试验材料和方法同筛选阶段。
受试者工作特征曲线(ROC)分析：构建ROC曲线来验证上述质谱定量验证的差异代谢物对腺性膀胱炎诊断分型的能力。
结果显示：联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积(AUC)为0.958，灵敏度和特异性分别为96.6％和96.1％，单个应用时ROC曲线下面积均小于0.7；进一步联合应用硫酸吲哚酚和咖啡因诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.952，灵敏度和特异性分别为96.3％和95.4％；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.962，灵敏度和特异性分别为95.8％和95.2％；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.979，灵敏度和特异性分别为95.5％和96.0％；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人时，ROC曲线下面积为0.981，灵敏度和特异性分别为96.7％和96.1％。由于甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸在慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组、肠腺瘤样组中的上调或下调情况基本一致，所以仅通过甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸联合应用无法区分慢性炎症组、滤泡水肿组、乳头状瘤组和肠腺瘤样组。
上述结果表明，联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用硫酸吲哚酚和咖啡因可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸可以准确诊断区分肠腺瘤样型患者与膀胱正常人。通过这13个血浆代谢物即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型。ROC曲线评价结果见表4。
表4 ROC曲线评价结果(血浆代谢物)
本实施例的贡献：
本实施例证明，联合应用甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸可以准确诊断区分腺性膀胱炎患者与膀胱正常人；进一步联合应用硫酸吲哚酚和咖啡因可以准确诊断区分慢性炎症型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂可以准确诊断区分滤泡水肿型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人；进一步联合应用溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸可以准确诊断区分乳头状瘤型患者与膀胱正常人。通过这13个血浆代谢物即可对腺性膀胱炎进行诊断并分型，可以将其制备成诊断区分腺性膀胱炎的诊断试剂。
上述实施例的作用在于具体介绍本发明的实质性内容，但本领域技术人员应当知道，不应将本发明的保护范围局限于该具体实施例。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京拓睿谱基因科技有限公司
<120> 生物标记用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途
<130> 1
<160> 11
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 智人
<400> 11
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Claims (6)
1.生物标志物群用于制备腺性膀胱炎诊断试剂的用途，所述腺性膀胱炎分为慢性炎症型、滤泡水肿型、乳头状瘤型和肠腺瘤样型，其特征在于：该生物标志物群包括甲基巴豆酰肉碱、溶血磷脂酰乙醇胺和花生四烯酸。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述腺性膀胱炎为慢性炎症型，生物标志物群还包括硫酸吲哚酚和咖啡因。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述腺性膀胱炎为滤泡水肿型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(18:1)、鹅去氧胆酸和神经节苷脂。
4.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述腺性膀胱炎为乳头状瘤型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(18:1)、磷脂酰丝氨酸和磷酸二氢丙酮。
5.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述腺性膀胱炎为肠腺瘤样型，生物标志物群还包括溶血磷脂酰胆碱(16:0)和透明质酸。
6.根据权利要求1-5任一所述的用途，其特征在于：生物标志物源于血浆。
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| Antitumor Effects of Lipoxygenase Inhibitors on Murine Bladder Cancer Cell Line (MBT-2);SHINICHI IKEMOTO et al;《ANTICANCER RESEARCH》;20041231;第24卷;733-736页 * |
| p53、Ki67肿瘤标志物在不同分型腺性膀胱炎中的表达及临床意义;方海伟等;《中国中西医结合外科杂志》;20100430;第16卷(第2期);183-185页 * |
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