BR112014006432B1 - Método in vitro para diagnosticar se um indivíduo tem ou não câncer, método implementado por computador, produto de programa de computador - Google Patents

Abstract

métodos in vitro para diagnosticar se um indivíduo tem ou não o câncer de pulmão de não pequenas células (nsclc) e para examinar um indivíduo de alto risco assintomático quanto ao nsclc. o pedido inclui biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas, kits para detecção e diagnose de câncer de pulmão de não pequenas células e câncer geral. o pedido proporciona biomarcadores que podem ser usados sozinhos ou em diversas combinações para diagnosticar câncer de pulmão de não pequenas células/câncer geral. proporcionam-se ainda métodos para diagnosticar câncer de pulmão de não pequenas células em indivíduos, onde os métodos incluem detectar, em uma amostra biológica de indivíduos, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado do grupo de biomarcadores proporcionados na tabela 1, onde o indivíduo é classificado co mo tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade do indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base no pelo menos um valor de biomarcador. proporcionam-se ainda métodos para diagnosticar câncer em indivíduos, onde os métodos incluem detectar, em amostras biológicas de indivíduos, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado do grupo de biomarcadores proporcionados na tabela 19, onde o indivíduo é classificado como tendo câncer, ou a probabilidade do indivíduo ter câncer é determinada, com base no pelo menos um valor de biomarcador.

Description

MÉTODO IN VITRO PARA DIAGNOSTICAR SE UM INDIVÍDUO TEM OU NÃO CÂNCER, MÉTODO IMPLEMENTADO POR COMPUTADOR, PRODUTO DE PROGRAMA DE COMPUTADOR CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] O presente pedido refere-se, em geral, à detecção de biomarcadores e à diagnose de câncer em um indivíduo e, mais especificamente, a um ou mais biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas, e kits para diagnosticar o câncer, mais particularmente o câncer de pulmão, em um indivíduo.

ANTECEDENTES

[0002] A descrição a seguir proporciona um sumário da informação relevante para o presente pedido e não é uma admissão que quaisquer das informações proporcionadas ou publicações referidas neste documento sejam técnica anterior ao presente pedido.

[0003] Mais pessoas morrem de câncer de pulmão do que qualquer outro tipo de câncer. Isto é verdade tanto para os homens quanto as mulheres. O câncer de pulmão é responsável por mais mortes do que o câncer de mama, o câncer da próstata, e o câncer do cólon combinados. O câncer de pulmão é responsável por umas 157.300 mortes estimadas ou 28% de todas as mortes por câncer nos Estados Unidos, em 2010. Estima-se que em 2010, 116.750 homens e 105.770 mulheres serão diagnosticados com câncer de pulmão, e 86.220 homens e 71.080 mulheres morrerão de câncer de pulmão (Jemal, CA Cancer J Clin 2010;60:277). Entre os homens nos Estados Unidos, o câncer de pulmão é o segundo câncer mais comum entre os homens brancos, negros, asiáticos/das ilhas do Pacífico, indígenas americanos/nativos do Alasca, e hispânicos. Entre as mulheres nos Estados Unidos, o câncer de pulmão é o segundo câncer mais comum entre as mulheres brancas, negras, e indígenas americanas/nativas do Alasca, e o terceiro câncer mais comum entre as mulheres asiáticas/das ilhas do Pacífico e hispânicas. Para os que não deixam de fumar, a probabilidade de morte de câncer de pulmão é 15% e permanece acima de 5% mesmo para os que deixam na idade de 50-59. O custo anual com os cuidados com a saúde de câncer de pulmão nos E.U.A sozinho é 95 bilhões de dólares.

[0004] Noventa e um por cento do câncer de pulmão causado pelo fumo são câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC), o que representa aproximadamente 85% de todos os cânceres de pulmão. Os 15% restantes de todos os cânceres de pulmão são cânceres de pulmão de pequenas células, embora não ocorram cânceres de pulmão de células mistas. Porque o câncer de pulmão de pequenas células é raro e rapidamente fatal, é pequena a oportunidade para a detecção inicial.

[0005] Existem três tipos principais de NSCLC: carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula grande, e adenocarcinoma. O adenocarcinoma é a forma mais comum de câncer de pulmão (30% - 65%) e é o câncer de pulmão mais frequentemente verificado tanto nos fumantes quanto nos não fumantes. O carcinoma de células escamosas é responsável por 25-30% de todos os cânceres de pulmão e é, em geral, verificado em um brônquio proximal. O estágio inicial do NSCLC tende a ser localizado, e se detectado inicialmente, ele pode frequentemente ser tratado por cirurgia, com um resultado favorável e uma sobrevivência aperfeiçoada. As outras opções de tratamento incluem o tratamento com radiação, a terapia de fármaco, e uma combinação destes métodos.

[0006] O NSCLC tem seus estágios especificados pelo tamanho do tumor e por sua presença em outros tecidos, incluindo os linfonodos. No estágio oculto, as células de câncer podem ser encontradas nas amostras de saliva ou nas amostras de lavagem interna e nenhum tumor é detectável nos pulmões. No estágio 0, somente o revestimento mais profundo dos pulmões exibe células de câncer e o tumor não se desenvolveu através do revestimento. No estágio IA, o câncer é considerado localmente invasivo e se desenvolveu profundamente no tecido do pulmão, porém o tumor é menos do que 3 cm transversalmente. Neste estágio, o tumor não é encontrado no brônquio principal ou nos linfonodos. No estágio IB, o tumor é maior do que 3 cm transversalmente ou desenvolveu-se no brônquio ou na pleura, porém não se desenvolveu nos linfonodos. No estágio IIA, o tumor é menos do que 7 cm transversalmente e pode ter se desenvolvido nos linfonodos. No estágio IIB, o tumor é encontrado nos linfonodos e é maior do que 5 cm transversalmente ou desenvolveu-se no brônquio ou na pleura; ou o câncer não está nos linfonodos, porém é encontrado na parede do tórax, no diafragma, na pleura, no brônquio, ou no tecido que circunda o coração, ou nódulos de tumor separados estão presentes no mesmo lobo do pulmão. No estágio IIIA, as células de câncer são encontradas nos linfonodos próximos ao pulmão e aos brônquios e naqueles entre os pulmões, porém sobre o lado do tórax em que o tumor está localizado. O estágio IIIB, as células de câncer estão localizadas sobre o lado oposto do tórax a partir do tumor ou no pescoço. Outros órgãos próximos aos pulmões podem também ter células de câncer e podem ser encontrados múltiplos tumores em um lobo dos pulmões. No estágio IV, os tumores são encontrados em mais do que um lobo do mesmo pulmão ou ambos os pulmões e as células de câncer são encontradas em outras partes do corpo.

[0007] Os métodos atuais de diagnose para o câncer de pulmão incluem o teste da saliva quanto a células cancerosas, os raios X do tórax, a avaliação por fibra óptica e a biopsia das vias aéreas, e a tomografia computadorizada (CT) espiral de baixa dose. A citologia da saliva tem uma sensibilidade muito baixa. Os raios X do tórax é também relativamente insensível, requerendo que as lesões sejam de um tamanho maior do que 1 cm para serem visíveis. A broncoscopia requer que o tumor seja visível dentro das vias aéreas acessíveis ao broncoscópio. O método diagnóstico mais amplamente reconhecido é a CT do tórax de baixa dose, porém, em comum com os raios X, o uso de CT envolve a radiação ionizante, que, ela própria, pode causar câncer. A CT também tem limitações significativas: as varreduras requerem um alto nível de habilidade técnica para interpretar e muitas das anormalidades observadas não são, na realidade, o câncer de pulmão e são agregados custos substanciais de saúde no acompanhamento dos resultados da CT. O rsultado incidental mais comum é um nódulo do pulmão benigno.

[0008] Os nódulos do pulmão são lesões relativamente redondas, ou áreas de tecido anormal, localizadas dentro do pulmão e podem variar no tamanho. Os nódulos do pulmão são benignos ou cancerosos, porém a maior parte é benigna. Se um nódulo for abaixo de 4 mm, a prevalência é somente 1,5%, se 4-8 mm, a prevalência é aproximadamente 6%, e se acima de 20 mm, a incidência é aproximadamente 20%. Para os nódulos de tamanhos pequenos e médios, o paciente é avisado para ser submetido a uma varredura de repetição dentro de três meses a um ano. Para muitos nódulos grandes, o paciente recebe uma biopsia (que é invasiva e pode resultar em complicações), embora a maior parte destes seja benigna.

[0009] Portanto, são necessários métodos diagnósticos que possam substituir ou complementar a CT, para reduzir o número de procedimentos cirúrgicos conduzidos e minimizar o risco de complicações cirúrgicas. Além disso, mesmo quando os nódulos do pulmão estiverem ausentes ou forem desconhecidos, são necessários métodos para detectar o câncer de pulmão em seus estágios iniciais, para melhorar os resultados no paciente. Somente 16% dos casos de câncer de pulmão são diagnosticados como câncer no estágio inicial, localizado, em que a taxa de sobrevivência de 5 anos é 46%, comparada com 84% daqueles diagnosticados no estágio final, em que a taxa de sobrevivência de 5 anos é somente 13%. Isto demonstra que não é proveitoso contar com os sintomas para a diagnose, porque muitos deles são comuns a outras doenças do pulmão e estão presentes com frequência somente nos estágios mais finais do câncer de pulmão. Estes sintomas incluem uma tosse persistente, saliva sangrenta, dor no peito, e bronquite ou pneumonia recorrente.

[0010] Em que existirem métodos de diagnose inicial no câncer, os benefícios são, em geral, aceitos pela comunidade médica. Os cânceres que têm utilizado amplamente os protocolos de triagem têm as mais altas taxas de sobrevivência de 5 anos, tais como o câncer de mama (88%) e o câncer de cólon (65%) versus 16% para o câncer de pulmão. Entretanto, até 88% dos pacientes com câncer de pulmão sobrevivem dez anos ou mais tempo se o câncer for diagnosticado no Estágio I através de triagem. Isto demonstra a clara necessidade por métodos diagnósticos que possam detectar com segurança o NSCLC nos estágios iniciais.

[0011] A seleção de biomarcadores para um estado de doença específico envolve primeiramente a identificação dos marcadores que tenham uma diferença mensurável e estatisticamente significativa em uma população de doenças, comparada a uma população de controle, para uma aplicação médica específica. Os biomarcadores podem incluir moléculas secretadas ou espalhadas que correspondam ao desenvolvimento ou à progressão da doença e prontamente se difundam na corrente sanguínea a partir do tecido do pulmão ou a partir de tecidos distais, em resposta a uma lesão. Eles podem também incluir proteínas feitas pelas células em resposta ao tumor. O biomarcador ou o conjunto de biomarcadores identificado é, em geral, clinicamente validado ou mostrado ser um indicador confiável para o uso original pretendido para o qual ele foi selecionado. Os biomarcadores podem incluir as moléculas pequenas, os metabólitos, os peptídeos, as proteínas, e os ácidos nucléicos. Algumas das questões chave que afetam a identificação dos biomarcadores incluem o superajuste dos dados disponíveis e a distorção nos dados.

[0012] Tem sido utilizada uma variedade de métodos em uma tentativa de identificar os biomarcadores e diagnosticar a doença. Para os marcadores à base de proteínas, estes incluem os métodos de eletroforese bidimensional, espectrometria de massa, e imunoensaios. Para os marcadores de ácidos nucléicos, estes incluem os perfis de expressão de mRNA, os perfis de microRNA, a FISH, a análise em série da expressão gênica (SAGE), e as disposições de expressão gênica em grande escala.

[0013] A utilidade da eletroforese bidimensional está limitada pela baixa sensibilidade de detecção; as questões com a solubilidade da proteína, a carga, e a hidrofobicidade; a reprodutibilidade em gel; e a possibilidade de um único ponto representando múltiplas proteínas. Para a espectrometria de massa, dependendo do formato usado, as limitações giram em torno do processamento e da separação da amostra, da sensibilidade a proteínas de baixa abundância, das considerações de sinal para ruído, e da incapacidade de identificar imediatamente a proteína detectada. As limitações nas abordagens de imunoensaio para a descoberta do biomarcador estão centradas na incapacidade dos ensaios multiplexes baseados em anticorpos de medir um grande número de analitos. Poder-se-ia simplesmente fixar uma disposição de anticorpos de alta qualidade e, sem sanduiches, medir os analitos ligados aos anticorpos. (Este seria o equivalente formal de usar um genoma inteiro de sequências de ácidos nucléicos para medir por hibridização todas as sequências de DNA ou RNA em um organismo ou uma célula. Este experimento de hibridização funciona porque a hibridização pode ser um teste rigoroso para a identificação. Mesmo anticorpos muito bons não são severos o suficiente na seleção de seus pares de ligação para atuar no contexto de sangue ou mesmo extratos de células, porque a totalidade de proteínas naquelas matrizes tem abundâncias extremamente diferentes). Desse modo, deve-se usar uma abordagem diferente com as abordagens baseadas em imunoensaios para a descoberta de biomarcadores; necessitar-se-ia usar ensaios ELISA multiplexada (ou seja, sanduiches) para obter o rigor suficiente para medir muitos analitos simultaneamente, para decidir quais analitos são de fato biomarcadores. Os imunoensaios de sanduiches não escalonam para alto teor e, desse modo, não é possível a descoberta de biomarcadores utilizando os imunoensaios de sanduiches rigorosos usando os formatos de disposições padrões. Por último, os reagentes de anticorpos são submetidos a uma variabilidade substancial dos lotes e uma instabilidade dos reagentes. A presente plataforma para a descoberta de biomarcadores de proteínas supera este problema.

[0014] Muitos destes métodos baseiam-se ou requerem algum tipo de fracionamento da amostra antes da análise. Desse modo, é extremamente difícil, onerosa, e demorada a preparação da amostra, requerida para efetuar um estudo suficientemente eficiente, projetado para identificar/descobrir biomarcadores estatisticamente relevantes em uma série de populações de amostras bem definidas. Durante o fracionamento, uma ampla faixa de variabilidade pode ser introduzida nas diversas amostras. Por exemplo, um marcador potencial poderia ser instável ao processo, a concentração do marcador poderia ser alterada, a agregação ou a desagregação inadequada poderia ocorrer, e a contaminação acidental da amostra poderia ocorrer e, assim, encobrir as alterações sutis antevistas na doença inicial.

[0015] Se aceita amplamente que os métodos de descoberta e detecção de biomarcadores que utilizam estas tecnologias têm sérias limitações para a identificação de biomarcadores diagnósticos. Estas limitações incluem uma incapacidade de detectar biomarcadores de baixa abundância, uma incapacidade de cobrir consistentemente a faixa dinâmica inteira do proteoma, a não reprodutibilidade no processamento e no fracionamento da amostra, e a não reprodutibilidade geral e a ausência de força do método. Ademais, estes estudos introduziram distorções nos dados e não enfocaram adequadamente a complexidade das populações de amostra, incluindo os controles apropriados, em termos da distribuição e da aleatorização requeridas para identificar e validar os biomarcadores dentro uma população de doenças-alvo.

[0016] Embora os esforços intencionados para a descoberta de biomarcadores novos e efetivos continuassem por diversas décadas, os esforços têm sido bastante infrutíferos. Os biomarcadores para diversas doenças tipicamente têm sido identificados em laboratórios acadêmicos, normalmente através de uma descoberta acidental enquanto se faz uma pesquisa básica sobre o processo da doença. Com base na descoberta e com pequenas quantidades de dados clínicos, foram publicados artigos que sugeriam a identificação de um novo biomarcador. A maior parte destes biomarcadores propostos, entretanto, não foi confirmada como biomarcadores reais ou úteis, principalmente porque o número pequeno de amostras clínicas testadas proporciona somente uma prova estatística fraca que um biomarcador efetivo foi na realidade descoberto. Ou seja, a identificação inicial não era rigorosa em relação aos elementos básicos da estatística. Em cada um dos anos 1994 até 2003, uma pesquisa da literatura científica mostra que foram publicadas milhares de referências dirigidas para os biomarcadores. Durante este mesmo quadro de tempo, entretanto, a FDA aprovou para uso diagnóstico, no máximo, três novos biomarcadores de proteínas ao ano, e em diversos anos não foi aprovado qualquer biomarcador de proteína novo.

[0017] Com base na história de esforços frustrados de descoberta de biomarcadores, têm sido propostas teorias matemáticas que promovem adicionalmente o entendimento geral que os biomaracores para doença são raros e difíceis de encontrar. A pesquisa de biomarcadores com base em géis 2D ou espectrometria de massa suporta estas ideias. Muito pouco biomarcadores úteis foram identificados através destas abordagens. Entretanto, é normalmente ignorado que o gel 2D e a espectrometria de massa medem proteínas que estão presentes no sangue em concentrações de aproximadamente 1 nM e maior, e que este conjunto de proteínas pode bem ser o menos provável de alterar com a doença. Exceto a presente plataforma de descoberta de biomarcadores, não existem plataformas de descoberta de biomarcadores proteômicos que sejam capazes de medir acuradamente os níveis de expressão das proteínas em concentrações muito menores.

[0018] Muito é conhecido sobre as vias bioquímicas para a biologia humana complexa. Muitas vias bioquímicas culminam em, ou são iniciadas por, proteínas secretadas que atuam localmente dentro da patologia, por exemplo, os fatores de crescimento são secretados para estimular a replicação de outras células na patologia, e outros fatores são secretados para repelir o sistema imune, e assim por diante. Embora muitas destas proteínas secretadas atuem em um modo parácrino, algumas operam de modo distal no corpo. Alguém versado na técnica com um entendimento básico de vias bioquímicas entenderia que muitas proteínas específicas para a patologia devem existir no sangue em concentrações abaixo (mesmo demasiado abaixo) dos limites de detecção dos géis 2D e da espectrometria de massa. O que deve preceder a identificação deste número relativamente abundante de biomarcadores de doenças é uma plataforma proteômica que possa analisar as proteínas em concentrações abaixo daquelas detectáveis por géis 2D ou espectrometria de massa.

[0019] Consequentemente, existe uma necessidade por biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas, e kits que capacitem (a) o exame de fumantes de alto risco quanto ao câncer de pulmão; (b) a diferenciação de nódulos pulmonares benignos de nódulos pulmonares malignos; (c) a detecção de biomarcadores de câncer de pulmão; e (d) a diagnose de câncer de pulmão.

SUMÁRIO

[0020] O presente pedido inclui biomarcadores, métodos, reagentes, dispositivos, sistemas, e kits para a detecção e a diagnose de cãncer e, mais particularmente, NSCLC. Os biomarcadores do presente pedido foram identificados usando um ensaio baseado em aptâmero multiplex, o qual é descrito em detalhe no Exemplo 1. Por utilização do método de identificação de biomarcadores com base em aptâmeros, descrito neste documento, este pedido descreve um número surpreendentemente grande de biomarcadores de NSCLC que são úteis para a detecção e a diagnose de NSCLC, bem como um grande número de biomarcadores de câncer que são úteis para a detecção e a diagnose de câncer mais em geral. Na identificação destes biomarcadores, mais de 1000 proteínas das centenas de amostras individuais foram medidas, algumas das quais estavam em concentrações na faixa baixa de femtomolar. Isto é aproximadamente quatro ordens de magnitude menor do que os experimentos de descoberta de biomarcadores feitos com géis 2D e/ou espectrometria de massa.

[0021] Embora certos dos biomarcadores de NSCLC descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o NSCLC, são descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de NSCLC que são úteis como um painel de biomarcadores. Assim que um biomarcador individual ou subgrupo de biomarcadores tiver sido identificado, a detecção ou a diagnose de NSCLC em um indivíduo pode ser efetuada usando qualquer plataforma ou formato de ensaio que seja capaz de medir as diferenças nos níveis do biomarcador, ou biomarcadores, selecionado em uma amostra biológica.

[0022] Entretanto, foi somente pelo uso do método de identificação de biomarcador baseado em aptâmero descrito neste documento, em que acima de 1000 valores de biomarcadores potenciais separados foram individualmente examinados a partir de um grande número de indivíduos tendo sido previamente diagnosticados como tendo ou não tendo NSCLC, que foi possível identificar os biomarcadores de NSCLC divulgados neste documento. Esta abordagem de descoberta está em contraste total com a descoberta de biomarcadores a partir de meios condicionados ou células lisadas, visto que questiona um sistema mais relevante para o paciente que não requer nenhuma tradução para a patologia humana.

[0023] Desse modo, em um aspecto do presente pedido, um ou mais biomarcadores são proporcionados para uso sozinhos ou em diversas combinações para diagnosticar o NSCLC ou permitir a diagnose diferencial do NSCLC a partir de condições benignas, tais como aquelas encontradas em indivíduos com nódulos pulmonares indeterminados, identificados com uma varredura por CT ou outro método de imageamento, o exame de fumantes de alto risco quanto ao NSCLC, e a diagnose de um indivíduo com NSCLC. As modalidades ilustrativas incluem os biomarcadores proporcionados na Tabela 1, que, conforme observado acima, foram identificados usando um ensaio baseado em aptâmero multiplex, conforme descrito em geral no Exemplo 1 e mais especificamente nos Exemplos 2 e 5. Os marcadores proporcionados na Tabela 1 são úteis em diagnosticar o NSCLC em uma população de alto risco e para distinguir doenças pulmonares benignas em indivíduos com nódulos pulmonares indeterminados de NSCLC.

[0024] Embora certos dos biomarcadores de NSCLC descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o NSCLC, são também descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de NSCLC que são, cada um, úteis como um painel de dois ou mais biomarcadores. Desse modo, as diversas modalidades do presente pedido proporcionam combinações compreendendo N biomarcadores, em que N é pelo menos dois biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-59 biomarcadores.

[0025] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, ou 2-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55, ou 3-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-5, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55, ou 4-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, ou 5-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6- 55, ou 6-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7- 25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7- 50, 7-55, ou 7-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55, ou 8-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-10, 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55, ou 9-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, ou 10-59. Será apreciado que N pode ser selecionado para incluir faixas similares, porém de ordem maior.

[0026] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1, em que o indivíduo é classificado como tendo NSCLC com base no pelo menos um valor de biomarcador.

[0027] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que a probabilidade do indivíduo ter NSCLC é determinada com base nos valores de biomarcadores.

[0028] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que o indivíduo é classificado como tendo NSCLC com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[0029] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que a probabilidade do indivíduo ter NSCLC é determinada com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[0030] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar que um indivíduo não tem NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que o indivíduo é classificado como não tendo NSCLC com base no pelo menos um valor de biomarcador.

[0031] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar que um indivíduo não tem NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que o indivíduo é classificado como não tendo NSCLC com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[0032] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de N biomarcadores, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem NSCLC, e em que N = 3-10.

[0033] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis apresentados nas Tabelas 2- 11, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem NSCLC.

[0034] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de N biomarcadores, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de NSCLC no indivíduo, e em que N = 3-10.

[0035] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de N biomarcadores, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de NSCLC no indivíduo, e em que N = 3-10.

[0036] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de NSCLC, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de paneis proporcionados nas Tabelas 2-11, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de NSCLC no indivíduo.

[0037] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que o indivíduo é classificado como tendo NSCLC com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um limite predeterminado, e em que N = 2-10.

[0038] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de NSCLC em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo NSCLC com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um limite predeterminado, e em que N = 2-10.

[0039] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O método compreende: obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1; efetuar com o computador uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicar uma probabilidade que o indivíduo tem NSCLC com base em uma pluralidade de classificações.

[0040] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo NSCLC. O método compreende: obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1; efetuar com o computador uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicar se o indivíduo tem NSCLC com base em uma pluralidade de classificações.

[0041] Em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha NSCLC como uma função dos valores de biomarcadores.

[0042] Em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma situação de NSCLC de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de NSCLC do indivíduo como uma função dos valores de biomarcadores.

[0043] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O método compreende obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1; efetuar com o computador uma classificação do valor de biomarcador; e indicar uma probabilidade que o indivíduo tem NSCLC com base na classificação.

[0044] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo NSCLC. O método compreende obter de um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1; efetuar com o computador uma classificação do valor de biomarcador; e indicar se o indivíduo tem NSCLC com base na classificação.

[0045] Ainda em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador na amostra biológica selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha NSCLC como uma função do valor de biomarcador.

[0046] Ainda em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma situação de NSCLC de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador na amostra biológica selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de NSCLC do indivíduo como uma função do valor de biomarcador.

[0047] Embora certos dos biomarcadores descritos sejam também úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o câncer geral, são descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores que são úteis como um painel de biomarcadores para detectar e diagnosticar o câncer em geral. Assim que um biomarcador individual ou subgrupo de biomarcadores tiver sido identificado, a detecção ou a diagnose de câncer em um indivíduo pode ser efetuada usando qualquer plataforma ou formato de ensaio que seja capaz de medir as diferenças nos níveis do biomarcador, ou biomarcadores, selecionado em uma amostra biológica.

[0048] Entretanto, foi somente pelo uso do método de identificação de biomarcador baseado em aptâmero descrito neste documento, em que acima de 1000 valores de biomarcadores potenciais separados foram individualmente examinados a partir de um grande número de indivíduos tendo sido previamente diagnosticados como tendo ou não tendo câncer, que foi possível identificar os biomarcadores de câncer divulgados neste documento. Esta abordagem de descoberta está em contraste total com a descoberta de biomarcadores a partir de meios condicionados ou células lisadas, visto que questiona um sistema mais relevante para o paciente que não requer nenhuma tradução para a patologia humana.

[0049] Desse modo, em um aspecto do presente pedido, um ou mais biomarcadores são proporcionados para uso sozinhos ou em diversas combinações para diagnosticar o câncer. As modalidades ilustrativas incluem os biomarcadores proporcionados na Tabela 19, os quais foram identificados usando um ensaio baseado em aptâmero multiplex, conforme descrito em geral no Exemplo 1 e mais especificamente no Exemplo 6. Os marcadores proporcionados na Tabela 19 são úteis em diagnosticar indivíduos que tenham câncer daqueles que não tenham câncer.

[0050] Embora certos dos biomarcadores de câncer descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o câncer, são também descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de câncer que são, cada um, úteis como um painel de três ou mais biomarcadores. Desse modo, as diversas modalidades do presente pedido proporcionam combinações compreendendo N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-23 biomarcadores.

[0051] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-5, 2-10, 2-15, 2- 20, ou 2-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-5, 3-10, 3-15, 3- 20, ou 3-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-5, 4-10, 4-15, 4- 20, ou 4-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-10, 5-15, 5-20, ou 5-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, ou 6-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, ou 7-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, ou 8-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-10, 9-15, 9-20, ou 9-23. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10- 20, ou 10-23. Será apreciado que N pode ser selecionado para incluir faixas similares, porém de ordem maior.

[0052] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer com base no pelo menos um valor de biomarcador.

[0053] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que a probabilidade do indivíduo ter câncer é determinada com base nos valores de biomarcadores.

[0054] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 3-10.

[0055] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que a probabilidade do indivíduo ter câncer é determinada com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 3- 10.

[0056] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um valor de biomarcador correspondendo a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer com base no pelo menos um valor de biomarcador.

[0057] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer com base nos valores de biomarcadores, e em que N = 3- 10.

[0058] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de N biomarcadores, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer, e em que N = 3-10.

[0059] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis apresentados nas Tabelas 20- 29, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer.

[0060] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de N biomarcadores, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer no indivíduo, e em que N = 3-10.

[0061] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de câncer, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que, cada um, corresponda a um biomarcador sobre um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis proporcionados nas Tabelas 20-29, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer no indivíduo.

[0062] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar o câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um limite predeterminado, e em que N = 3-10.

[0063] Em outro aspecto, proporciona-se um método para diagnosticar uma ausência de câncer em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de biomarcadores que correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um limite predeterminado, e em que N = 3-10.

[0064] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para indicar uma probabilidade de câncer. O método compreende: obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; efetuar com o computador uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicar uma probabilidade que o indivíduo tem câncer com base em uma pluralidade de classificações.

[0065] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo câncer. O método compreende: obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 19; efetuar com o computador uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicar se o indivíduo tem câncer com base em uma pluralidade de classificações.

[0066] Em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer como uma função dos valores de biomarcadores.

[0067] Em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma situação de câncer de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 19; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de câncer do indivíduo como uma função dos valores de biomarcadores.

[0068] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para indicar uma probabilidade de câncer. O método compreende obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; efetuar com o computador uma classificação do valor de biomarcador; e indicar uma probabilidade que o indivíduo tem câncer com base na classificação.

[0069] Em outro aspecto, proporciona-se um método executado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo câncer. O método compreende obter de um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 19; efetuar com o computador uma classificação do valor de biomarcador; e indicar se o indivíduo tem câncer com base na classificação.

[0070] Ainda em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador na amostra biológica selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer como uma função do valor de biomarcador.

[0071] Ainda em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma situação de câncer de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador na amostra biológica selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 19; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de câncer do indivíduo como uma função do valor de biomarcador.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0072] A Figura 1A é um fluxograma para um método ilustrativo para detectar o NSCLC em uma amostra biológica.

[0073] A Figura 1B é um fluxograma para um método ilustrativo para detectar o NSCLC em uma amostra biológica, usando um método de classificação naïve Bayes.

[0074] A Figura 2 mostra uma curva ROC para um único biomarcador, MMP7, usando um classificador naïve Bayes para um teste que detecta o NSCLC.

[0075] A Figura 3 mostra as curvas ROC para os painéis de biomarcadores de dois a dez biomarcadores, usando os classificadores naïve Bayes para um teste que detecta o NSCLC.

[0076] A Figura 4 ilustra o aumento na pontuação de classificação (AUC) à medida que o número de biomarcadores é aumentado de um para dez, usando a classificação naïve Bayes para um painel de NSCLC.

[0077] A Figura 5 mostra as distribuições de biomarcadores medidas para o MMP7 como uma função de distribuição cumulativa (cdf) em RFU transformada em log para os controles de fumantes e nódulos pulmonares benignos combinados (linha sólida) e o grupo de doença de NSCLC (linha pontilhada) juntamente com suas adaptações de curva para uma cdf normal (linhas tracejadas) usada para direcionar os classificadores naïve Bayes.

[0078] A Figura 6 ilustra um sistema de computador ilustrativo para uso com os diversos métodos executados por computador descritos neste documento.

[0079] A Figura 7 é um fluxograma para um método de indicar a probabilidade que um indivíduo tenha NSCLC de acordo com uma modalidade.

[0080] A Figura 8 é um fluxograma para um método de indicar a probabilidade que um indivíduo tenha NSCLC de acordo com uma modalidade.

[0081] A Figura 9 ilustra um ensaio de aptâmero ilustrativo que pode ser usado para detectar um ou mais biomarcadores de NSCLC em uma amostra biológica.

[0082] A Figura 10 mostra um histograma de frequências para as quais os biomarcadores foram usados na construção de classificadores para distinguir entre o NSCLC e o grupo de controle de fumantes e nódulos pulmonares benignos a partir de um conjunto agregado de biomarcadores potenciais.

[0083] A Figura 11A mostra um par de histogramas resumindo todas as pontuações possíveis de classificadores naïve Bayes de proteínas individuais (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (pretos) e um grupo de marcadores aleatórios (cinzas).

[0084] A Figura 11B mostra um par de histogramas resumindo todas as pontuações possíveis de classificadores naïve Bayes de duas proteínas (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (pretos) e um grupo de marcadores aleatórios (cinzas).

[0085] A Figura 11C mostra um par de histogramas resumindo todas as pontuações possíveis de classificadores naïve Bayes de três proteínas (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (pretos) e um grupo de marcadores aleatórios (cinzas).

[0086] A Figura 12 mostra a AUC para os classificadores naïve Bayes usando de 2-10 marcadores selecionados a partir do painel completo e as pontuações obtidas removendo os melhores 5, 10, e 15 marcadores durante a geração dos classificadores.

[0087] A Figura 13A mostra um conjunto de curvas ROC modeladas a partir dos dados na Tabela 14 para os painéis de dois a cinco marcadores.

[0088] A Figura 13B mostra um conjunto de curvas ROC computadas a partir dos dados de direcionamento para os painéis de dois a cinco marcadores como na Figura 12A.

[0089] A Figura 14 mostra uma curva ROC computada a partir do painel de biomarcadores clínicos descrito no Exemplo 5.

[0090] As Figuras 15A e 15B mostram uma comparação do desempenho entre dez biomarcadores de câncer selecionados por um procedimento guloso de seleção descrito no Exemplo 6 (Tabela 19) e 1.000 grupos aleatoriamente amostrados de dez biomarcadores de "não marcadores". A AUC média para os dez biomarcadores de câncer na Tabela 19 é mostrada como uma linha vertical pontilhada. Na Figura 15A, os grupos de dez "não marcadores" foram aleatoriamente selecionados que não foram selecionados pelo procedimento guloso descrito no Exemplo 6. Na Figura 15B, o mesmo procedimento que 15A foi usado; entretanto, a amostragem estava restrita aos 49 biomarcadores de NSCLC restantes da Tabela 1 que não foram selecionados pelo procedimento guloso descrito no Exemplo 6.

[0091] A Figura 16 mostra as curvas características de operação do receptor (ROC) para os 3 classificadores naïve Bayes apresentados na Tabela 31. Para cada estudo, a área sob a curva (AUC) é também mostrada próxima à legenda.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0092] Será feita referência agora em detalhe às modalidades representativas da invenção. Embora a invenção seja descrita em combinação com as modalidades enumeradas, será entendido que não se pretende que a invenção esteja limitada a estas modalidades. Ao contrário, pretende-se que a invenção cubra todas as alternativas, modificações, e equivalentes que possam estar incluídos no escopo da presente invenção, como definida pelas reivindicações.

[0093] Alguém versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos neste documento, os quais podem ser usados no, e estão dentro do, escopo da prática da presente invenção. A presente invenção não está, de modo algum, limitada aos métodos e materiais descritos.

[0094] Salvo definição ao contrário, os termos técnicos e científicos usados neste documento têm o mesmo significado como comumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos, e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou no teste da invenção, os métodos, os dispositivos e os materiais preferidos são agora descritos.

[0095] Todas as publicações, documentos de patentes publicados, e pedidos de patentes citados neste pedido são indicativos do nível de habilidade na(s) técnica(s) à(s) qual(is) o pedido diz respeito. Todas as publicações, documentos de patentes publicados, e pedidos de patentes citados aqui são, pelo presente, incorporados por referência na mesma proporção como se cada publicação, documento de patente publicado, ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.

[0096] Conforme usadas neste pedido, incluindo nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma", "o" e "a" incluem as referências plurais, a não ser que o contexto claramente dite de outro modo, e são usadas de modo intercambiável com "pelo menos um(a)" e "um(a) ou mais". Desse modo, a referência a "um aptâmero" inclui as misturas de aptâmeros, a referência a "uma sonda" inclui as misturas de sondas, e similares.

[0097] Conforme usado neste documento, o termo "cerca de" representa uma modificação ou variação insignificante do valor numérico, de modo tal que a função básica do item ao qual o valor numérico se refere seja inalterada.

[0098] Conforme usados neste documento, pretende-se que os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "contém", "contendo" e quaisquer variações deles cubram uma inclusão não exclusiva, de modo tal que um processo, método, produto por processo, ou composição de matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou lista de elementos não inclua somente estes elementos, porém possa incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, produto por processo, ou composição de matéria.

[0099] O presente pedido inclui biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas, e kits para a detecção e a diagnose de NSCLC e câncer de um modo mais geral.

[00100] Em um aspecto, um ou mais biomarcadores são proporcionados para uso sozinhos ou em diversas combinações para diagnosticar o NSCLC, permitir a diagnose diferencial de NSCLC a partir de condições não malignas verificadas em indivíduos com nódulos pulmonares indeterminados, identificados com uma varredura por CT ou outro método de imageamento, o exame de fumantes de alto risco quanto ao NSCLC, e diagnosticar um indivíduo com NSCLC, monitorar a recorrência de NSCLC, ou lidar com outras indicações clínicas. Conforme descrito em detalhe abaixo, as modalidades ilustrativas incluem os biomarcadores proporcionados na Tabela 1, os quais foram identificados usando um ensaio baseado em aptâmero multiplex que é descrito de modo geral no Exemplo 1 e mais especificamente no Exemplo 2.

[00101] A Tabela 1 apresenta os resultados obtidos a partir da análise de centenas de amostras de sangue individuais de casos de NSCLC, e centenas de amostras de sangue de controle individuais equivalentes de fumantes de alto risco e nódulos pulmonares benignos. O grupo de fumantes e de nódulos pulmonares benignos foi projetado para selecionar as populações com as quais um teste diagnóstico de NSCLC possa ter o maior benefício, incluindo os indivíduos assintomáticos e os indivíduos sintomáticos. Estes casos e os controles foram obtidos de locais clínicos múltiplos para imitar a variedade de condições mundiais reais sob as quais tal teste pode ser aplicado. Os biomarcadores potenciais foram medidos em amostras individuais, em vez de agrupar o sangue com doença e de controle; isto permitiu um melhor entendimento das variações individuais e de grupo nos fenótipos associados com a presença e a ausência da doença (neste caso, o NSCLC). Visto que mais de 1000 medições de proteínas foram feitas sobre cada amostra, e diversas centenas de amostras de cada uma das populações com doença e de controle foram individualmente medidas, a Tabela 1 resultou de uma análise de um conjunto de dados incomumente grande. As medições foram analisadas usando os métodos descritos na seção "Classificação de Biomarcadores e Cálculo das Pontuações da Doença" aqui contida. A Tabela 1 listra os 59 biomarcadores verificados serem úteis em distinguir as amostras obtidas de indivíduos com NSCLC das amostras de "controle" obtidas de fumantes e nódulos pulmonares benignos.

[00102] Embora certos dos biomarcadores de NSCLC descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o NSCLC, são também descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de NSCLC, em que cada seleção de agrupamento ou subgrupo é útil como um painel de três ou mais biomarcadores, referido de modo intercambiável neste documento como um "painel de biomarcadores" e um painel. Desse modo, as diversas modalidades do presente pedido proporcionam combinações compreendendo N biomarcadores, em que N é pelo menos dois biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado a partir de 2- 59 biomarcadores.

[00103] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-5, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, ou 2-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55, ou 3-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-5, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55, ou 4-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, ou 5-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6- 55, ou 6-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7- 25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7- 50, 7-55, ou 7-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55, ou 8-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-10, 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55, ou 9-59. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, ou 10-59. Será apreciado que N pode ser selecionado para incluir faixas similares, porém de ordem maior.

[00104] Em uma modalidade, o número de biomarcadores úteis para um subgrupo ou painel de biomarcadores é baseado no valor de sensibilidade e especificidade para a combinação particular de valores de biomarcadores. Os termos "sensibilidade" e "especificidade" são usados neste documento com relação à capacidade de classificar corretamente um indivíduo, com base em um ou mais valores de biomarcadores detectados em sua amostra biológica, como tendo NSCLC ou não tendo NSCLC. A "sensibilidade" indica o desempenho do(s) biomarcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos que têm NSCLC. A "especificidade" indica o desempenho do(s) biomarcador(es) em relação a classificar corretamente os indivíduos que não têm NSCLC. Por exemplo, 85% de especificidade e 90% de sensibilidade, para um painel de marcadores usados para testar um grupo de amostras de controle e amostras de NSCLC, indica que 85% das amostras de controle foram corretamente classificadas como amostras de controle pelo painel, e 90% das amostras de NSCLC foram corretamente classificadas como amostras de NSCLC pelo painel. O valor mínimo desejado ou preferido pode ser determinado conforme descrito no Exemplo 3. Os painéis representativos são apresentados nas Tabelas 4-11, as quais apresentam uma série de 100 diferentes painéis de 3-10 biomarcadores, que têm os níveis indicados de especificidade e sensibilidade para cada painel. O número total de ocorrências de cada marcador em cada um destes painéis é indicado na Tabela 12.

[00105] Em um aspecto, o NSCLC é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando os valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a pelo menos um dos biomarcadores MMP7, CLIC1 ou STX1A e pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9. Em um aspecto adicional, o NSCLC é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando os valores de biomarcadores que, cada um, correspondam aos biomarcadores MMP7, CLIC1 ou STX1A e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, em que N é igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou 7. Em um aspecto adicional, o NSCLC é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando os valores de biomarcadorrs que, cada um, correspondam ao biomarcador MMP7 e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9. Em um aspecto adicional, o NSCLC é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando os valores de biomarcadorrs que, cada um, correspondam ao biomarcador CLIC1 e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9. Em um aspecto adicional, o NSCLC é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando os valores de biomarcadorrs que, cada um, correspondam ao biomarcador STX1A e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, ou 9.

[00106] Os biomarcadores de NSCLC identificados aqui representam um número relativamente grande de escolhas para os subgrupos ou os painéis de biomarcadores que podem ser usados para detectar ou diagnosticar efetivamente o NSCLC. A seleção do número desejado de tais biomarcadores depende da combinação específica de biomarcadores escolhidos. É importante lembrar que os painéis de biomarcadores para detectar ou diagnosticar o NSCLC podem também incluir biomarcadores não encontrados na Tabela 1, e que a inclusão de biomarcadores adicionais não encontrados na Tabela 1 pode reduzir o número de biomarcadores no subgrupo ou painel particular que for selecionado da Tabela 1. O número de biomarcadores da Tabela 1 usados em um subgrupo ou painel pode também ser reduzido se for usada informação biomédica adicional em combinação com os valores de biomarcadores para estabelecer valores de sensibilidade e especificidade aceitáveis para um dado ensaio.

[00107] Outro fator que pode afetar o número de biomarcadores a serem usados em um subgrupo ou painel de biomarcadores são os procedimentos usados para obter amostras biológicas de indivíduos que estão sendo diagnosticados quanto ao NSCLC. Em um ambiente de procura de amostra cuidadosamente controlado, o número de biomarcadores necessários para atender os valores de sensibilidade e especificidade desejados será menor do que em uma situação em que puder haver mais variação na coleta, no manuseio e na armazenagem da amostra. No desenvolvimento da lista de biomarcadores apresentados na Tabela 1, foram utilizados múltiplos locais de coleta de amostras para coletar dados para o direcionamento do classificador. Isto proporciona biomarcadores mais sólidos, que são menos sensíveis a variações na coleta, no manuseio e na armazenagem da amostra, porém pode também requerer que o número de biomarcadores em um subgrupo ou painel seja maior do que se os dados de direcionamento fossem todos obtidos sob condições muito similares.

[00108] Um aspecto do presente pedido pode ser descrito de modo geral com referência às Figuras 1A e 1B. Uma amostra biológica é obtida de um indivíduo ou indivíduos de interesse. A amostra biológica é então testada para detectar a presença de um ou mais (N) biomarcadores de interesse e para determinar um valor de biomarcador para cada um dos ditos N biomarcadores (referido na Figura 1B como RFU do marcador). Assim que um biomarcador tiver sido detectado e um valor de biomarcador especificado, cada marcador é pontuado ou classificado conforme descrito em detalhe neste documento. As pontuações do marcador são então combinadas para proporcionar uma pontuação diagnóstica total, a qual indica a probabilidade que o indivíduo de quem a amostra foi obtida tem NSCLC.

[00109] Conforme usado neste documento, o "pulmão" pode ser referido de modo intercambiável como "pulmonar".

[00110] Conforme usado neste documento, o "fumante" refere-se a um indivíduo que tem uma história de inalação da fumaça do tabaco.

[00111] A "amostra biológica", a "amostra" e a "amostra de teste" são usadas de modo intercambiável neste documento para referirem-se a qualquer material, fluido biológico, tecido ou célula obtida ou de outro modo derivada de um indivíduo. Isto inclui o sangue (incluindo o sangue total, os leucócitos, as células mononucleares de sangue periférico, a camada de células brancas, o plasma, e o soro), o escarro, as lágrimas, o muco, os líquidos nasais, o aspirado nasal, o ar respirado, a urina, o sémen, a saliva, as lavagens peritoneais, o fluido cístico, o fluido meníngeo, o fluido amniótico, o fluido glandular, o fluindo do linfo, o fluido citológico, o ascite, o fluido pleural, o aspirado do mamilo, o aspirado bronquial, a escovação bronquial, o fluido sinovial, o aspirado da articulação, as secreções de órgãos, as células, um extrato celular, e o fluido cerebrospinal. Isto também inclui as frações separadas experimentalmente de todos os precedentes. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro, plasma ou em frações contendo tipos particulares de células sanguíneas, tais como os glóbulos vermelhos ou os glóbulos brancos (leucócitos). Se desejado, uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um indivíduo, tal como uma combinação de uma amostra de tecido e fluido. O termo "amostra biológica" também inclui os materiais contendo material sólido homogeneizado, tal como de uma amostra de fezes, uma amostra de tecido, ou uma biopsia de tecido, por exemplo. O termo "amostra biológica" também inclui os materiais derivados de uma cultura de tecido ou uma cultura de células. Quaisquer métodos adequados para obter uma amostra biológica podem ser empregados; os métodos ilustrativos incluem, por exemplo, a flebotomia, o "swab" (por exemplo, swab bucal), e um procedimento de biopsia de aspirado com agulha fina. Os tecidos ilustrativos suscetíveis à aspiração com agulha fina incluem o linfonodo, o pulmão, as lavagens de pulmão, a BAL (lavagem broncoalveolar), a pleura, a tireoide, a mama, o pâncreas e o fígado. As amostras podem também ser coletadas, por exemplo, por microdissecação (por exemplo, microdissecação de captura a laser (LCM) ou microdissecação a laser (LMD)), lavagem da bexiga, esfregaço (por exemplo, um esfregaço cervical), ou lavagem de ducto. Uma "amostra biológica" obtida ou derivada de um indivíduo inclui qualquer tal amostra que tenha sido processada em qualquer modo adequado após ser obtida do indivíduo.

[00112] Ademais, deve ser entendido que uma amostra biológica pode ser derivada retirando as amostras biológicas de diversos indivíduos e reunindo-as ou reunindo uma alíquota da amostra biológica de cada indivíduo. A amostra reunida pode ser tratada como uma amostra de um único indivíduo e, se a presença de câncer for estabelecida na amostra reunida, então a amostra biológica de cada indivíduo pode ser testada novamente para determinar qual(is) indivíduo(s) tem(êm) NSCLC.

[00113] Para os propósitos deste relatório descritivo, pretende-se que a expressão "dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo" signifique que os dados em alguma forma são derivados da, ou foram gerados usando a, amostra biológica do indivíduo. Os dados podem ter sido reformatados, revisados, ou matematicamente alterados até alguma proporção após terem sido gerados, tal como por conversão das unidades em um sistema de medição para unidades em outro sistema de medição; porém, os dados são entendidos terem sido derivados da, ou foram gerados usando a, amostra biológica.

[00114] "Alvo", "molécula-alvo" e "analito" são usados de modo intercambiável neste documento para referirem-se a qualquer molécula de interesse que possa estar presente em uma amostra biológica. Uma "molécula de interesse" inclui qualquer variação secundária de uma molécula particular, tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, as variações secundárias na sequência de aminoácidos, a formação de ligação de dissulfeto, a glicosilação, a lipidação, a acetilação, a fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de marcação, que não altere substancialmente a identidade da molécula. Uma "molécula-alvo", um "alvo", ou um "analito" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula ou estrutura multimolecular. As "moléculas-alvo", os "alvos" e os "analitos" referem-se a mais do que um tal conjunto de moléculas.
As moléculas-alvo ilustrativas incluem as proteínas, os polipeptídeos, os ácidos nucléicos, os carboidratos, os lipídios, os polissacarídeos, as glicoproteínas, os hormônios, os receptores, os antígenos, os anticorpos, os affybodies, os autoanticorpos, os imitadores de anticorpos, os vírus, os patógenos, as substâncias tóxicas, os substratos, os metabólitos, os análogos de estados de transição, os cofatores, os inibidores, os fármacos, os corantes, os nutrientes, os fatores de crescimento, as células, os tecidos, e qualquer fragmento ou parte de quaisquer dos precedentes.

[00115] Conforme usados neste documento, o "polipeptídeo", o "peptídeo" e a "proteína" são usados de modo intercambiável neste documento para referirem-se aos polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados, e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também incluem um polímero de aminoácidos que tenha sido modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, a formação de ligação de dissulfeto, a glicosilação, a lipidação, a acetilação, a fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como a conjugação com um componente de marcação. Estão também incluídos na definição, por exemplo, os polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, os aminoácidos não naturais, etc)., bem como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipeptídeos podem ser cadeias individuais ou cadeias associadas. Estão também incluídos na definição as pré-proteínas e as proteínas maduras intactas; os peptídeos ou os polipeptídeos derivados de uma proteína madura; os fragmentos de uma proteína; as variantes de remoção; as formas recombinantes de uma proteína; as variantes de proteínas com modificações, remoções, ou substituições de aminoácidos; os digestos; e as modificações pós-traducionais, tais como a glicosilação, a acetilação, a fosforilação, e similares.

[00116] Conforme usados neste documento, o "marcador" e o "biomarcador" são usados de modo intercambiável para referirem-se a uma molécula-alvo que indique, ou seja, um sinal de um processo normal ou anormal em um indivíduo ou de uma doença ou outra condição em um indivíduo. Mais especificamente, um "marcador' ou "biomarcador" é um parâmetro anatômico, fisiológico, bioquímico, ou molecular associado com a presença de um estado ou processo fisiológico específico, quer seja normal, quer seja anormal, e, se anormal, crônico ou agudo. Os biomarcadores são detectáveis e mensuráveis por uma variedade de métodos, incluindo os ensaios de laboratórios e o imageamento médico. Quando um biomarcador for uma proteína, também é possível usar a expressão do gene correspondente como uma medição substituta da quantidade ou presença ou ausência do biomarcador de proteína correspondente em uma amostra biológica ou o estado de metilação do gene que codifica o biomarcador ou as proteínas que controlam a expressão do biomarcador.

[00117] Conforme usados neste documento, o "valor de biomarcador", o "valor", o "nível de biomarcador" e o "nível" são usados de modo intercambiável para referirem-se a uma medição que é feita usando qualquer método analítico para detectar o biomarcador em uma amostra biológica e que indica a presença, a ausência, a quantidade ou concentração absoluta, a quantidade ou concentração relativa, o título, um nível, um nível de expressão, uma razão de níveis medidos, ou similar, de, para, ou correspondendo ao biomarcador na amostra biológica. A natureza exata do "valor" ou do "nível" depende do projeto e dos componentes específicos do método analítico particular empregado para detectar o biomarcador.

[00118] Quando um biomarcador indicar ou for um sinal de um processo anormal ou uma doença ou outra condição em um indivíduo, este biomarcador é, em geral, descrito como sendo superexpresso ou subexpresso em comparação com um nível ou valor de expressão do biomarcador que indique, ou seja, um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição em um indivíduo. A "suprarregulação", "suprarregulado", a "superexpressão", "superexpresso" e qualquer variação deles são usados de modo intercambiável para referirem-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que seja maior do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é tipicamente detectado em amostras biológicas similares de indivíduos saudáveis ou normais. Os termos podem também referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que seja maior do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que pode ser detectado em um estágio diferente de uma doença particular.

[00119] A "infrarregulação", "infrarregulado", a "subexpressão", "subexpresso" e qualquer variação deles são usados de modo intercambiável para referirem-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que seja menor do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é tipicamente detectado em amostras biológicas similares de indivíduos saudáveis ou normais. Os termos podem também referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que seja menor do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que pode ser detectado em um estágio diferente de uma doença particular.

[00120] Ademais, um biomarcador que seja superexpresso ou subexpresso pode também ser referido como sendo "diferencialmente expresso" ou como tendo um "nível diferencial" ou "valor diferencial", em comparação com um nível ou valor de expressão "normal" do biomarcador que indique, ou seja, um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição em um indivíduo.
Assim, a "expressão diferencial" de um biomarcador pode também ser referida como uma variação de um nível de expressão "normal" do biomarcador.

[00121] Os termos "expressão diferencial de gene" e "expressão diferencial" são usados de modo intercambiável para referirem-se a um gene (ou seu produto de expressão de proteína correspondente) cuja expressão é ativada para um nível maior ou menor em um paciente sofrendo de uma doença específica, em relação à sua expressão em um paciente normal ou de controle. Os termos também incluem os genes (ou os produtos de expressão de proteínas correspondentes) cuja expressão é ativada para um nível maior ou menor em estágios diferentes da mesma doença. Entende-se também que um gene diferencialmente expresso pode ser ativado ou inibido no nível de ácido nucléico ou nível de proteína, ou pode estar sujeito à remoção alternativa para resultar em um produto de polipeptídeo diferente. Tais diferenças podem ser evidenciadas por uma variedade de alterações, incluindo os níveis de mRNA, a expressão de superfície, a secreção ou outra divisão de um polipeptídeo. A expressão diferencial de gene pode incluir uma comparação da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos de genes; ou uma comparação das razões da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos de genes; ou mesmo uma comparação de dois produtos diferentemente processados do mesmo gene, que diferem entre os pacientes normais e os pacientes sofrendo de uma doença; ou entre diversos estágios da mesma doença. A expressão diferencial inclui as diferenças tanto quantitativas como qualitativas no padrão de expressão temporal ou celular em um gene ou seus produtos de expressão entre, por exemplo, as células normais e doenças, ou entre as células que tenham sofrido diferentes eventos de doença ou estágios de doença.

[00122] Conforme usado neste documento, o "individuo" refere-se a uma cobaia ou paciente de teste. O indivíduo pode ser um mamífero ou um não mamífero. Em diversas modalidades, o indivíduo é um mamífero. Um indivíduo mamífero pode ser um ser humano ou não humano. Nas diversas modalidades, o indivíduo é um ser humano. Um indivíduo saudável ou normal é um indivíduo no qual a doença ou condição de interesse (incluindo, por exemplo, as doenças de pulmão, as doenças associadas ao pulmão, ou outras condições de pulmão) não é detectável por métodos diagnósticos convencionais.

[00123] "Diagnosticar", "diagnosticando", "diagnose", e suas variações referem-se à detecção, determinação, ou reconhecimento de uma situação ou condição de saúde de um indivíduo de acordo com um ou mais sinais, sintomas, dados, ou outra informação que diga respeito àquele indivíduo. A situação de saúde de um indivíduo pode ser diagnosticada como saudável/normal (isto é, uma diagnose da ausência de uma doença ou condição) ou diagnosticada como doente/anormal (isto é, uma diagnose da presença, ou uma avaliação das características, de uma doença ou condição). Os termos "diagnosticar", "diagnosticando", "diagnose", etc. incluem, com relação a uma doença ou condição particular, a detecção inicial da doença; a caracterização ou a classificação da doença; a detecção da progressão, remissão, ou recorrência da doença; e a detecção da resposta da doença após a administração de um tratamento ou terapia ao indivíduo. A diagnose do NSCLC inclui distinguir indivíduos que tenham câncer de indivíduos que não tenham. Ela adicionalmente inclui distinguir os fumantes e os nódulos pulmonares benignos do NSCLC.

[00124] "Prognosticar", "prognosticando", "prognóstico", e suas variações referem-se à predição de um curso futuro de uma doença ou condição em um indivíduo que tenha a doença ou a condição (por exemplo, predizer a sobrevivência do paciente), e tais termos incluem a avaliação da resposta da doença após a administração de um tratamento ou terapia ao indivíduo.

[00125] "Avaliar", "avaliando", "avaliação" e as suas variações incluem tanto "diagnosticar" quanto "prognosticar" e também incluem as determinações ou as predições sobre o curso futuro de uma doença ou condição em um indivíduo que não tenha a doença, bem como as determinações ou as predições com relação à probabilidade que uma doença ou condição recorra em um indivíduo que aparentemente tenha sido curado da doença. O termo "avaliar" também inclui avaliar a resposta de um indivíduo a uma terapia, tal como, por exemplo, predizer se um indivíduo é provável de responder favoravelmente a um agente terapêutico ou é improvável de responder a um agente terapêutico (ou sofrerá efeitos tóxicos ou outros efeitos colaterais indesejáveis, por exemplo), selecionar um agente terapêutico para administração a um indivíduo, ou monitorar ou determinar a resposta de um indivíduo a uma terapia que tenha sido administrada ao indivíduo. Desse modo, "avaliando" o NSCLC pode incluir, por exemplo, quaisquer dos seguintes: prognosticar o curso futuro do NSCLC em um indivíduo; predizer a recorrência do NSCLC em um indivíduo que aparentemente tenha sido curado do NSCLC; ou determinar ou predizer a resposta de um indivíduo a um tratamento do NSCLC ou selecionar um tratamento do NSCLC para administrar a um indivíduo com base em uma determinação dos valores de biomarcadores derivados da amostra biológica do indivíduo.

[00126] Quaisquer dos seguintes exemplos podem ser referidos como "diagnosticando" ou "avaliando" o NSCLC: detectando inicialmente a presença ou a ausência de NSCLC; determinando um estágio, tipo ou subtipo específico, ou outra classificação ou característica do NSCLC; determinando se um nódulo ou massa suspeita no pulmão é um NSCLC benigno ou maligno; ou detectando/monitorando a progressão (por exemplo, monitorando o desenvolvimento do tumor ou o espalhamento metastático), a remissão ou a recorrência do NSCLC.

[00127] Conforme usada neste documento, a "informação biomédica adicional" refere-se a uma ou mais avaliações de um indivíduo, que não usar quaisquer dos biomarcadores descritos aqui, que estejam associadas com o risco de câncer ou, mais especificamente, o risco de NSCLC. A "informação biomédica adicional" inclui quaisquer dos seguintes: descritores físicos de um indivíduo, descritores físicos de um nódulo pulmonar observado através de imageamento por CT, a altura e/ou o peso de um indivíduo, o sexo de um indivíduo, a afiliação étnica de um individuo, a história de fumar, a história ocupacional, a exposição a carcinógenos conhecidos (por exemplo, a exposição a quaisquer de amianto, gás radônio, substâncias químicas, fumaça de fogos, e poluição do ar, que pode incluir as emissões de fontes estacionárias ou móveis, tais como as emissões industriais/de fábricas ou de automóveis/marítimas/aeronaves), a exposição à fumaça do cigarro de outra pessoa, a história na família de NSCLC (ou outro câncer), a presença de nódulos pulmonares, o tamanho dos nódulos, a posição dos nódulos, a morfologia dos nódulos (por exemplo, como observados através de imageamento por CT, opacidade do vidro moído (GGO), sólidos, não sólidos), as características das bordas do nódulo (por exemplo, lisas, lobuladas, pontiagudas e lisas, espiculadas, que se infiltram), e similares. A história de fumar é normalmente quantificada em termos de "anos de maços", que se refere ao número de anos em que uma pessoa fumou, multiplicado pelo número médio de maços fumados por dia. Por exemplo, uma pessoa que fumou, em média, um maço de cigarros por dia, por 35 anos, é referida com tendo 35 anos de maços de história de fumar. As informações biomédicas adicionais podem ser obtidas de um indivíduo usando práticas de rotina, conhecidas na técnica, tais como do indivíduo propriamente dito pelo uso de um questionário do paciente de rotina ou questionário da história de saúde, etc., ou de um profissional médico, etc. Alternativamente, a informação biomédica adicional pode ser obtida de técnicas de imageamento de rotina, incluindo o imageamento por CT (por exemplo, imageamento por CT de baixa dose) e os raios X. O teste dos níveis de biomarcadores em combinação com uma avaliação de qualquer informação biomédica adicional pode, por exemplo, melhorar a sensibilidade, a especificidade, e/ou a AUC para detectar o NSCLC (ou outros usos relacionados ao NSCLC), em comparação com o teste do biomarcador sozinho ou a avaliação de qualquer item particular da informação biomédica adicional sozinha (por exemplo, o imageamento por CT sozinho).

[00128] O termo "área sob a curva" ou "AUC" refere-se à área sob a curva de uma curva característica de operação do receptor (ROC), ambas as quais são bastante conhecidas na técnica. As medições da AUC são úteis para comparar a acurácia de um classificador através da faixa de dados completa. Os classificadores com uma AUC maior têm uma maior capacidade de classificar incógnitas corretamente entre dois grupos de interesse (por exemplo, as amostras de NSCLC e as amostras normais ou de controle). As curvas ROC são úteis para representar graficamente o desempenho de uma característica particular (por exemplo, quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento e/ou qualquer item de informação biomédica adicional) em distinguir entre duas populações (por exemplo, casos tendo NSCLC e controles sem NSCLC). Tipicamente, os dados de características através da população inteira (por exemplo, os casos e os controles) são classificados em ordem crescente com base no valor de uma única característica. Então, para cada valor para aquela característica, as taxas de positivo verdadeiro e falso positivo para os dados são calculadas. A taxa de positivo verdadeiro é determinada contando o número de casos acima do valor para aquela característica e então dividindo pelo número total de casos. A taxa de falso positivo é determinada contando o número de controles acima do valor para aquela característica e então dividindo pelo número total de controles. Embora esta definição refira-se às situações nas quais uma característica está elevada em casos comparados aos controles, esta definição também se aplica às situações nas quais uma característica é menor nos casos comparados aos controles (em tal situação, as amostras abaixo do valor para aquela característica seriam contadas). As curvas ROC podem ser geradas para uma única característica, bem como para outras informações individuais, por exemplo, uma combinação de duas ou mais características pode ser matematicamente combinada (por exemplo, adicionada, subtraída, multiplicada, etc). para proporcionar um único valor de soma, e este único valor de soma pode ser representado graficamente em uma curva ROC. Adicionalmente, qualquer combinação de características múltiplas, nas quais a combinação deriva um único valor de informação, pode ser representada graficamente em uma curva ROC. Estas combinações de características podem compreender um teste. A curva ROC é o gráfico da taxa de positivo verdadeiro (sensibilidade) de um teste contra a taxa de falso positivo (especificidade 1) do teste.

[00129] Conforme usado neste documento, "detectando" ou "determinando", com relação a um valor de biomarcador, inclui o uso tanto do instrumento requerido para observar e registrar um sinal correspondendo a um valor de biomarcador, quanto do material/materiais requerido(s) para gerar aquele sinal. Nas diversas modalidades, o valor de biomarcador é detectado usando qualquer método adequado, incluindo a fluorescência, a quimioluminescência, a ressonância plasmônica de superfície, as ondas acústicas superficiais, a espectrometria de massa, a espectroscopia de infravermelho, a espectroscopia de Raman, a microscopia de força atômica, a microscopia de penetração, os métodos de detecção eletroquímicos, a ressonância magnética nuclear, os pontos quânticos, e similares.

[00130] O "suporte sólido" refere-se neste documento a qualquer substrato tendo uma superfície à qual as moléculas podem ser unidas, direta ou indiretamente, através de ligações covalentes ou não covalentes. Um "suporte sólido" pode ter uma variedade de formatos físicos, os quais podem incluir, por exemplo, uma membrana; uma lasca (por exemplo, uma lasca de proteína); uma lâmina (por exemplo, uma lâmina de vidro ou lamínula); uma coluna; uma partícula oca, sólida, semissólida, contendo poros ou cavidades, tal como, por exemplo, um glóbulo; um gel; uma fibra, incluindo um material de fibra óptica; uma matriz; e um receptáculo de amostra. Os receptáculos de amostras ilustrativos incluem os poços, os tubos, os capilares, os frascos pequenos de amostras, e qualquer outro vaso, ranhura ou entalhe capaz de prender uma amostra. Um receptáculo de amostra pode estar contido sobre uma plataforma de múltiplas amostras, tal como uma placa de microtítulo, uma lâmina, um dispositivo de microfluidos, e similares. Um suporte pode ser composto de um material natural ou sintético, um material orgânico ou inorgânico. A composição do suporte sólido, sobre o qual os reagentes de captura estão unidos, geralmente depende do método de ligação (por exemplo, ligação covalente). Os outros receptáculos ilustrativos incluem as emulsões de óleo/aquosas de microgotículas e microfluidos controladas ou em massa, dentro das quais os ensaios e as manipulações relacionadas podem ocorrer. Os suportes sólidos adequados incluem, por exemplo, os plásticos, as resinas, os polissacarídeos, a sílica ou os materiais baseados em sílica, o vidro funcionalizado, o silício modificado, o carbono, os metais, os vidros inorgânicos, as membranas, o náilon, as fibras naturais (tais como, por exemplo, a seda, a lã e o algodão), os polímeros, e similares.
O material que compõe o suporte sólido pode incluir grupos reativos, tais como, por exemplo, grupos carbóxi, amino, ou hidroxila, que são usados para a ligação dos reagentes de captura. Os suportes sólidos poliméricos podem incluir, por exemplo, o poliestireno, o tetraftalato de polietileno glicol, o poli(acetato de vinila), o poli(cloreto de vinila), a polivinil pirrolidona, a poliacrilonitrila, o poli(metacrilato de metila), o politetrafluoretileno, a borracha de butila, a borracha de estirenobutadieno, a borracha natural, o polietileno, o polipropileno, o (poli)tetrafluoretileno, o (poli)fluoreto de vinilideno, o policarbonato, e o polimetilpenteno. As partículas adequadas de suporte sólido que podem ser usadas incluem, por exemplo, as partículas codificadas, tais como as partículas codificadas do tipo Luminex, as partículas magnéticas, e as partículas de vidro.

Usos Ilustrativos dos Biomarcadores

[00131] Nas diversas modalidades ilustrativas, proporcionam-se métodos para diagnosticar o NSCLC em um indivíduo, detectando um ou mais valores de biomarcadores correspondendo a um ou mais biomarcadores que estejam presentes na circulação de um indivíduo, tal como no soro ou no plasma, por qualquer número de métodos analíticos, incluindo quaisquer dos métodos analíticos descritos neste documento. Estes biomarcadores são, por exemplo, diferencialmente expressos nos indivíduos com NSCLC, em comparação com os indivíduos sem o NSCLC. A detecção da expressão diferencial de um biomarcador em um indivíduo pode ser usada, por exemplo, para permitir a diagnose inicial do NSCLC, para distinguir entre um nódulo pulmonar benigno e maligno (tal como, por exemplo, um nódulo observado sobre uma varredura de tomografia computadorizada (CT)), para monitorar a recorrência do NSCLC, ou para outras indicações clínicas.

[00132] Quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento podem ser usados em uma variedade de indicações clínicas para o NSCLC, incluindo quaisquer das que seguem: detecção do NSCLC (tal como em um indivíduo ou população de alto risco); caracterização do NSCLC (por exemplo, determinação do tipo, subtipo, ou estágio do NSCLC), tal como por distinção entre o câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) e o câncer de pulmão de pequenas células (SCLC) e/ou entre o adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas (ou, por outro lado, facilitação da histopatologia); determinação se um nódulo de pulmão é um nódulo benigno ou um tumor de pulmão maligno; determinação do prognóstico do NSCLC; monitoramento da progressão ou da remissão do NSCLC; monitoramento quanto à recorrência do NSCLC; monitoramento da metástase; seleção do tratamento; monitoramento da resposta a um agente terapêutico ou outro tratamento; estratificação dos indivíduos para o exame por tomografia computadorizada (CT) (por exemplo, identificação dos indivíduos em maior risco de NSCLC e, com isso, mais prováveis de beneficiarem-se do exame por CT espiral, desse modo aumentando o valor predito positivo da CT); combinação do teste do biomarcador com a informação biomédica adicional, tal como a história de fumar, etc., ou com o tamanho do nódulo, a morfologia, etc. (tal como para proporcionar um ensaio com desempenho diagnóstico aumentado em comparação com o teste da CT ou o teste do biomarcador sozinho); facilitação da diagnose de um nódulo pulmonar como maligno ou benigno; facilitação de tomar uma decisão clínica assim que um nódulo pulmonar for observado na CT (por exemplo, determinar varreduras por CT repetidas se o nódulo for considerado ser de baixo risco, tal como se um teste baseado em biomarcador for negativo, com ou sem categorização do tamanho do nódulo, ou considerar a biopsia se o nódulo for considerado de risco médio a alto, tal como se um teste baseado em biomarcador for positivo, com ou sem categorização do tamanho do nódulo); e facilitação das decisões com relação ao acompanhamento clínico (por exemplo, executar varreduras por CT repetidas, biopsia com agulha fina, resseção do nódulo ou toracotomia após observar um nódulo não calcificado na CT). O teste do biomarcador pode melhorar o valor predito positivo (PPV) sobre o exame por CT ou de raios X do tórax de indivíduos de alto risco sozinho. Além de suas utilidades em combinação com o exame por CT, os biomarcadores descritos neste documento podem também ser usados em combinação com quaisquer outras modalidades de imageamento usadas para o NSCLC, tais como raios X do tórax, broncoscopia ou broncoscopia fluorescente, varredura por MRI ou PET. Ademais, os biomarcadores descritos podem também ser úteis em permitir certos destes usos antes das indicações de NSCLC serem detectadas por modalidades de imageamento ou outros correlativos clínicos, ou antes dos sintomas surgirem. Ela adicionalmente inclui a distinção de indivíduos com nódulos pulmonares indeterminados, identificados com uma varredura por CT ou outro método de imageamento, o exame de fumantes de alto risco quanto ao NSCLC, e a diagnose de um indivíduo com NSCLC.

[00133] Como um exemplo do modo no qual quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento podem ser usados para diagnosticar o NSCLC, a expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores descritos em um indivíduo que não se sabe ter NSCLC pode indicar que o indivíduo tem NSCLC, com isso capacitando a detecção do NSCLC em um estágio inicial da doença, quando o tratamento é mais efetivo, talvez antes do NSCLC ser detectado por outros meios, ou antes dos sintomas surgirem. A superexpressão de um ou mais dos biomarcadores durante o curso do NSCLC pode ser indicativa da progressão do NSCLC, por exemplo, um tumor de NSCLC está crescendo e/ou está espalhando-se por metástase (e, desse modo, indicar um prognóstico insatisfatório), enquanto uma diminuição no grau até o qual um ou mais dos biomarcadores são diferencialmente expressos (isto é, nos testes dos biomarcadores subsequentes, o nível de expressão no indivíduo está se movendo para, ou se aproximando de, um nível de expressão "normal") pode ser indicativa da remissão do NSCLC, por exemplo, um tumor de NSCLC está diminuindo (e, desse modo, indicar um prognóstico bom ou melhor). Similarmente, um aumento no grau até o qual um ou mais dos biomarcadores são diferencialmente expressos (isto é, nos testes dos biomarcadores subsequentes, o nível de expressão no indivíduo está se movendo mais distante de um nível de expressão "normal"), durante o curso do tratamento do NSCLC, pode indicar que o NSCLC está progredindo e, portanto, indicar que o tratamento é ineficaz, enquanto uma diminuição na expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores durante o curso do tratamento do NSCLC pode ser indicativa da remissão do NSCLC e, portanto, indicar que o tratamento está funcionando com êxito. Adicionalmente, um aumento ou uma diminuição na expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores, após um indivíduo ter aparentemente sido curado do NSCLC, pode ser indicativa da recorrência do NSCLC. Em uma situação tal como esta, por exemplo, o indivíduo pode ser reiniciado na terapia (ou o regime terapêutico modificado de modo tal a aumentar a quantidade e/ou a frequência da dosagem, se o indivíduo tiver mantido a terapia) em um estágio mais cedo do que se a recorrência do NSCLC não fosse detectada até posteriormente. Além disso, um nível de expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores em um indivíduo pode ser preditivo da resposta do indivíduo a um agente terapêutico particular. No monitoramento quanto à recorrência ou progressão do NSCLC, as alterações nos níveis de expressão do biomarcador podem indicar a necessidade por imageamento repetido (por exemplo, varredura por CT repetida), tal como para determinar a atividade do NSCLC ou para determinar a necessidade por alterações no tratamento.

[00134] A detecção de quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento pode ser particularmente útil após, ou em combinação com, o tratamento do NSCLC, tal como para avaliar o sucesso do tratamento ou para monitorar a remissão, a recorrência, e/ou a progressão do NSCLC (incluindo a metástase) após o tratamento. O tratamento do NSCLC pode incluir, por exemplo, a administração de um agente terapêutico ao indivíduo, o desempenho da cirurgia (por exemplo, a resseção cirúrgica de pelo menos uma parte de um tumor de NSCLC ou a remoção do NSCLC e do tecido circundante), a administração de terapia de radiação, ou qualquer outro tipo de tratamento do NSCLC usado na técnica, e qualquer combinação destes tratamentos. O tratamento do câncer de pulmão pode incluir, por exemplo, a administração de um agente terapêutico ao indivíduo, o desempenho da cirurgia (por exemplo, a resseção cirúrgica de pelo menos uma parte de um tumor de pulmão), a administração de terapia de radiação, ou qualquer outro tipo de tratamento do NSCLC usado na técnica, e qualquer combinação destes tratamentos. Por exemplo, as moléculas de siRNA são moléculas de RNA de fita dupla, sintéticas, que inibem a expressão do gene e podem servir como substâncias terapêuticas do câncer de pulmão direcionadas. Por exemplo, quaisquer dos biomarcadores podem ser detectados pelo menos uma vez após o tratamento ou podem ser detectados múltiplas vezes após o tratamento (tal como em intervalos periódicos), ou podem ser detectados tanto antes quanto após o tratamento. Os níveis de expressão diferencial de quaisquer dos biomarcadores em um indivíduo ao longo do tempo podem ser indicativos da progressão, da remissão, ou da recorrência do NSCLC, cujos exemplos incluem quaisquer dos que seguem: um aumento ou diminuição no nível de expressão dos biomarcadores após o tratamento, comparado com o nível de expressão do biomarcador antes do tratamento; um aumento ou diminuição no nível de expressão do biomarcador em um ponto de tempo posterior após o tratamento, comparado com o nível de expressão do biomarcador em um ponto de tempo anterior após o tratamento; e um nível de expressão diferencial do biomarcador em um único ponto de tempo após o tratamento, comparado com os níveis normais do biomarcador.

[00135] Como um exemplo específico, os níveis de biomarcador para quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento podem ser determinados nas amostras de soro ou plasma pré-cirurgia ou póscirurgia (por exemplo, 2-16 semanas após a cirurgia). Um aumento no(s) nível(is) de expressão do biomarcador na amostra pós-cirurgia comparada com a amostra pré-cirurgia pode indicar a progressão do NSCLC (por exemplo, cirurgia malsucedida), enquanto uma diminuição no(s) nível(is) de expressão do biomarcador na amostra pós-cirurgia comparada com a amostra pré-cirurgia pode indicar a regressão do NSCLC (por exemplo, a cirurgia removeu com êxito o tumor de pulmão). Podem ser realizadas análises similares dos níveis de biomarcador antes e depois de outras formas de tratamento, tal como antes e depois da terapia de radiação ou da administração de um agente terapêutico ou vacina de câncer.

[00136] Além de testar os níveis de biomarcadores como um teste diagnóstico independente, os níveis de biomarcadores podem também ser feitos em combinação com a determinação de SNPs ou outras lesões genéticas ou variabilidade que são indicativas do risco aumentado de suscetibilidade da doença. (Ver, por exemplo, Amos e col., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).

[00137] Além de testar os níveis de biomarcadores como um teste diagnóstico independente, os níveis de biomarcadores podem também ser feitos em combinação com o exame radiológico, tal como o exame por CT. Por exemplo, os biomarcadores podem facilitar a justificativa médica e econômica para executar o exame por CT, tal como para examinar grandes populações assintomáticas correndo o risco por NSCLC (por exemplo, os fumantes). Por exemplo, um teste "pré-CT" dos níveis de biomarcadores poderia ser usado para estratificar os indivíduos de alto risco para o exame por CT, tal como para identificar aqueles que estejam em maior risco pelo NSCLC com base em seus níveis de biomarcadores e que seriam priorizados para o exame por CT. Se um teste de CT for executado, os níveis de biomarcadores (por exemplo, conforme determinados por um ensaio de aptâmero de amostras de soro ou plasma) de um ou mais biomarcadores podem ser medidos e a pontuação diagnóstica poderia ser avaliada em combinação com a informação biomédica adicional (por exemplo, parâmetros do tumor determinados pelo teste por CT) para aumentar o valor preditivo positivo (PPV) sobre o teste por CT ou de biomarcador sozinho. Um painel de aptâmeros "pós-CT" para determinar os níveis de biomarcadores pode ser usado para determinar a probabilidade que um nódulo pulmonar observado por CT (ou outra modalidade de imageamento) é maligno ou benigno.

[00138] A detecção de quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento pode ser útil para o teste pós-CT. Por exemplo, o teste de biomarcador pode eliminar ou reduzir um número significativo de testes de falso positivo sobre a CT sozinha. Ademais, o teste de biomarcador pode facilitar o tratamento dos pacientes. A título de exemplo, se um nódulo de pulmão for menos do que 5 mm de tamanho, os resultados do teste de biomarcador podem promover os pacientes de "observar e esperar" para biopsia em um tempo mais cedo; se um nódulo de pulmão for 5-9 mm, o teste de biomarcador pode eliminar o uso de uma biopsia ou toracotomia nas varreduras de falso positivo; e se um nódulo de pulmão for maior do que 10 mm, o teste de biomarcador pode eliminar a cirurgia para uma subpopulação destes pacientes com nódulos benignos. A eliminação da necessidade por biopsia em alguns pacientes com base no teste de biomarcador seria benéfica porque há morbidade significativa associada com a biopsia do nódulo e dificuldade na obtenção de tecido do nódulo, dependendo da posição do nódulo. Similarmente, a eliminação da necessidade por cirurgia em alguns pacientes, tais como aqueles cujos nódulos são de fato benignos, evitaria os riscos e os custos desnecessários associados com a cirurgia.

[00139] Além de testar os níveis de biomarcadores em combinação com o exame radiológico em indivíduos de alto risco (por exemplo, avaliar os níveis de biomarcadores em combinação com o tamanho ou outras características de um nódulo ou massa de pulmão observada em uma varredura de imageamento), a informação com relação aos biomarcadores pode também ser avaliada em combinação com outros tipos de dados, particularmente os dados que indiquem o risco de um indivíduo por NSCLC (por exemplo, história clínica do paciente, história de exposição ocupacional, sintomas, história na família de câncer, fatores de risco, tais como se o indivíduo era um fumante ou não, e/ou posição de outros biomarcadores, etc).. Estes diversos dados podem ser avaliados por métodos automatizados, tais como um programa/software de computador, que pode ser incorporado em um computador ou outro aparelho/dispositivo.

[00140] Quaisquer dos biomarcadores descritos podem também ser usados nos testes de imageamento. Por exemplo, um agente de imageamento pode ser acoplado a quaisquer dos biomarcadores descritos, o que pode ser usado para auxiliar na diagnose do NSCLC, para monitorar a progressão/remissão ou a metástase da doença, para monitorar quanto à recorrência da doença, ou para monitorar a resposta à terapia, entre outros usos.

Detecção e Determinação dos Biomarcadores e dos Valores de Biomarcadores

[00141] Um valor de biomarcador para os biomarcadores descritos neste documento pode ser detectado usando qualquer de uma variedade de métodos analíticos conhecidos. Em uma modalidade, um valor de biomarcador é detectado usando um reagente de captura. Conforme usado neste documento, um "agente de captura" ou "reagente de captura" refere-se a uma molécula que seja capaz de se ligar especificamente a um biomarcador. Nas diversas modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao biomarcador em solução ou pode ser exposto ao biomarcador enquanto o reagente de captura estiver imobilizado sobre um suporte sólido. Em outras modalidades, o reagente de captura contém um componente que é reativo com um componente secundário sobre um suporte sólido. Nestas modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao biomarcador em solução, e então o componente sobre o reagente de captura pode ser usado em combinação com o componente secundário sobre o suporte sólido para imobilizar o biomarcador sobre o suporte sólido. O reagente de captura é selecionado com base no tipo de análise a ser conduzida. Os reagentes de captura incluem, porém não estão limitados aos aptâmeros, anticorpos, antígenos, adnectinas, anquirinas, outros miméticos de anticorpos e outras armações de proteínas, autoanticorpos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento F(ab)2, um fragmento de anticorpo de cadeia individual, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia individual, um ácido nucléico, uma lectina, um receptor de ligação ao ligante, affybodies, nanocorpos, polímeros marcados, avímeros, peptidomiméticos, um receptor de hormônio, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.

[00142] Em algumas modalidades, um valor de biomarcador é detectado usando um complexo de biomarcador/reagente de captura.

[00143] Em outras modalidades, o valor de biomarcador é derivado do complexo de biomarcador/reagente de captura e é detectado indiretamente, tal como, por exemplo, como resultado de uma reação que seja subsequente à interação entre biomarcador/reagente de captura, porém seja dependente da formação do complexo de biomarcador/reagente de captura.

[00144] Em algumas modalidades, o valor de biomarcador é detectado diretamente a partir do biomarcador em uma amostra biológica.

[00145] Em uma modalidade, os biomarcadores são detectados usando um formato multiplexado que permite a detecção simultânea de dois ou mais biomarcadores em uma amostra biológica. Em uma modalidade do formato multiplexado, os reagentes de captura são imobilizados, direta ou indiretamente, covalente ou não covalentemente, em posições distintas sobre um suporte sólido. Em outra modalidade, um formato multiplexado utiliza suportes sólidos distintos, em que cada suporte sólido tem um reagente de captura único associado com aquele suporte sólido, tal como, por exemplo, pontos quânticos. Em outra modalidade, um dispositivo individual é usado para a detecção de cada um de múltiplos biomarcadores a serem detectados em uma amostra biológica. Os dispositivos individuais podem ser configurados para permitir que cada biomarcador na amostra biológica seja processado simultaneamente. Por exemplo, uma placa de microtítulo pode ser usada de modo tal que cada poço na placa seja usado para analisar especificamente um dos múltiplos biomarcadores a ser detectado em uma amostra biológica.

[00146] Em uma ou mais das modalidades precedentes, uma marca fluorescente pode ser usada para marcar um componente do complexo de biomarcador/captura, para capacitar a detecção do valor de biomarcador. Em diversas modalidades, a marca fluorescente pode ser conjugada a um reagente de captura, específico para quaisquer dos biomarcadores descritos neste documento, usando técnicas conhecidas, e a marca fluorescente pode então ser usada para detectar o valor de biomarcador correspondente. As marcas fluorescentes adequadas incluem os quelatos de terras-raras, a fluoresceína e os seus derivados, a rodamina e os seus derivados, o dansil, a aloficocianina, o PBXL-3, o Qdot 605, a Lissamina, a ficoeritrina, o Vermelho Texas, e outros tais compostos.

[00147] Em uma modalidade, a marca fluorescente é uma molécula de corante fluorescente. Em algumas modalidades, a molécula de corante fluorescente inclui pelo menos um sistema de anel de indólio substituído, em que o substituinte sobre o carbono 3 do anel de indólio contém um grupo quimicamente reativo ou uma substância conjugada. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui uma molécula de AlexFluor, tal como, por exemplo, o AlexFluor 488, o AlexFluor 532, o AlexFluor 647, o AlexFluor 680, ou o AlexFluor 700. Em outras modalidades, a molécula de corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo da molécula de corante, tal como, por exemplo, duas moléculas diferentes de AlexFluor. Em outras modalidades, a molécula de corante inclui um primeiro tipo e um segundo tipo da molécula de corante, e as duas moléculas de corante têm diferentes espectros de emissão.

[00148] A fluorescência pode ser medida com uma variedade de instrumentação compatível com uma ampla variedade de formatos de ensaios. Por exemplo, os espectrofluorímetros foram projetados para analisar as placas de microtítulo, as lâminas de microscópios, as disposições impressos, os cadinhos, etc. Ver Principles of Fluorescence Spectroscopy, por J. R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004. Ver Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; editores Philip E. Stanley e Larry J. Kricka, World Scientific Publishing Company, janeiro de 2002.

[00149] Em uma ou mais das modalidades precedentes, uma marca quimioluminescente pode opcionalmente ser usada para marcar um componente do complexo de biomarcador/captura, para capacitar a detecção de um valor de biomarcador. Os materiais quimioluminescentes adequados incluem quaisquer de cloreto de oxalila, Rodamina 6G, Ru(bipy)32+, TMAE (tetraquis(dimetilamino)etileno), Pirogalol (1,3,3- tri-hidroxilbenzeno), Lucigenina, peroxioxalatos, Oxalatos de arila, Ésteres de acridínio, dioxetanos, e outros.

[00150] Ainda em outras modalidades, o método de detecção inclui uma combinação de enzima/substrato que gera um sinal detectável que corresponde ao valor de biomarcador. Em geral, a enzima catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida usando diversas técnicas, incluindo a espectrofotometria, a fluorescência, e a quimioluminescência. As enzimas adequadas incluem, por exemplo, as luciferases, a luciferina, a malato desidrogenase, a urease, a peroxidase da raiz forte (HRPO), a fosfatase alcalina, a betagalactosidase, a glicoamilase, a lisozima, a glicose oxidase, a galactose oxidase, e a glicose-6-fosfato desidrogenase, a uricase, a xantina oxidase, a lactoperoxidase, a microperoxidase, e similares.

[00151] Ainda em outras modalidades, o método de detecção pode ser uma combinação de fluorescência, quimioluminescência, combinações de radionuclídeo ou enzima/substrato que geram um sinal mensurável. A sinalização multimodal pode ter características únicas e vantajosas nos formatos de ensaios de biomarcadores.

[00152] Mais especificamente, os valores de biomarcadores para os biomarcadores descritos neste documento podem ser detectados usando métodos analíticos conhecidos, incluindo os ensaios de aptâmeros individuais ("singleplex"), os ensaios de aptâmeros multiplexados, os imunoensaios individuais ou multiplexados, o perfil de expressão de mRNA, o perfil de expressão de miRNA, a análise espectrométrica de massa, os métodos histológicos/citológicos, etc., como detalhados abaixo.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando Ensaios Baseados em Aptâmeros

[00153] Os ensaios dirigidos para a detecção e a quantificação de moléculas fisiologicamente significativas em amostras biológicas e em outras amostras são ferramentas importantes na pesquisa científica e no campo de cuidado da saúde. Uma classe de tais ensaios envolve o uso de uma microdisposição que inclui um ou mais aptâmeros imobilizados sobre um suporte sólido. Os aptâmeros são, cada um, capazes de se ligar a uma molécula-alvo em um modo altamente específico e com afinidade muito alta. Ver, por exemplo, a Patente U. S. No. 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid Ligands"; ver também, por exemplo, a Patente U. S. No. 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid Ligands"; ver também, por exemplo, a Patente U. S. No. 6.242.246, a Patente U. S. No. 6.458.543, e a Patente U. S. No. 6.503.715, cada uma das quais é intitulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Assim que a microdisposição for contatado com uma amostra, os aptâmeros se ligam às suas moléculas-alvo respectivas, presentes na amostra, e, com isso, capacitam uma determinação de um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador.

[00154] Conforme usado neste documento, um "aptâmero" refere-se a um ácido nucléico que tenha uma afinidade de ligação específica por uma molécula-alvo. Reconhece-se que as interações de afinidade são uma questão de grau; entretanto, neste contexto, a "afinidade de ligação específica" de um aptâmero pelo seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo geralmente com um grau muito maior de afinidade do que se liga a outros componentes em uma amostra de teste. Um "aptâmero" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucléico que tem uma sequência de nucleotídeos particular. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleotídeos, incluindo qualquer número de nucleotídeos quimicamente modificados. Os "aptâmeros" se referem a mais do que um tal conjunto de moléculas. Os aptâmeros diferentes podem ter números iguais ou diferentes de nucleotídeos. Os aptâmeros podem ser o DNA ou o RNA ou os ácidos nucléicos quimicamente modificados e podem ser de fita simples, de fita dupla, ou conter regiões de fitas duplas, e podem incluir estruturas de ordem superior. Um aptâmero também pode ser um fotoaptâmero, em que um grupo funcional fotorreativo ou quimicamente reativo é incluído no aptâmero para permitir que ele seja covalentemente ligado ao seu alvo correspondente. Quaisquer dos métodos de aptâmeros divulgados neste documento podem incluir o uso de dois ou mais aptâmeros que especificamente ligam a mesma molécula-alvo. Conforme adicionalmente descrito abaixo, um aptâmero pode incluir uma marca. Se um aptâmero incluir uma marca, todas as cópias do aptâmero não necessitam ter a mesma marca. Além disso, se os aptâmeros diferentes, cada um, incluírem uma marca, estes aptâmeros diferentes podem ter a mesma marca ou uma marca diferente.

[00155] Um aptâmero pode ser identificado usando qualquer método conhecido, incluindo o processo SELEX. Assim que identificado, um aptâmero pode ser preparado ou sintetizado de acordo com qualquer método conhecido, incluindo os métodos sintéticos químicos e os métodos sintéticos enzimáticos.

[00156] Conforme usado neste documento, um "SOMAmero" ou Aptâmero Modificado de Taxa de Dissociação Lenta refere-se a um aptâmero tendo características de taxa de dissociação aperfeiçoada. Os SOMAmeros podem ser gerados usando os métodos SELEX aperfeiçoados, descritos na Publicação U. S. No. 2009/0004667, intitulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates".

[00157] Os termos "SELEX" e "processo SELEX" são usados de modo intercambiável neste documento para referirem-se, em geral, a uma combinação da (1) seleção dos aptâmeros que interagem com uma molécula-alvo em um modo desejável, por exemplo, a ligação com alta afinidade a uma proteína, com a (2) amplificação daqueles ácidos nucléicos selecionados. O processo SELEX pode ser usado para identificar os aptâmeros com alta afinidade a um alvo ou biomarcador específico.

[00158] O SELEX em geral inclui a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucléicos, a ligação da mistura candidata à molécula-alvo desejada para formar um complexo de afinidades, a separação dos complexos de afinidades dos ácidos nucléicos candidatos não ligados, a separação e o isolamento do ácido nucléico do complexo de afinidades, a purificação do ácido nucléico, e a identificação de uma sequência de aptâmeros específica. O processo pode incluir múltiplas rodadas para refinar adicionalmente a afinidade do aptâmero selecionado. O processo pode incluir etapas de amplificação em um ou mais pontos no processo. Ver, por exemplo, a Patente U. S. No. 5.475.096, intitulada "Nucleic Acid Ligands". O processo SELEX pode ser usado para gerar um aptâmero que liga covalentemente o seu alvo, bem como um aptâmero que liga não covalentemente o seu alvo. Ver, por exemplo, a Patente U. S. No. 5.705.337, intitulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX".

[00159] O processo SELEX pode ser usado para identificar aptâmeros de alta afinidade contendo nucleotídeos modificados que conferem características aperfeiçoadas sobre o aptâmero, tais como, por exemplo, estabilidade in vivo aperfeiçoada ou características de distribuição aperfeiçoadas. Os exemplos de tais modificações incluem a substituição química nas posições de ribose e/ou fosfato e/ou base. Os aptâmeros identificados pelo processo SELEX contendo nucleotídeos modificados são descritos na Patente U. S. No. 5.660.985, intitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que descreve oligonucleotídeos contendo derivados de nucleotídeos quimicamente modificados nas posições 5' e 2' das pirimidinas. A Patente U. S. No. 5.580.737, ver supra, descreve aptâmeros altamente específicos contendo um ou mais nucleotídeos modificados com 2'- amino (2'-NH2), 2'-flúor (2'-F), e/ou 2'-O-metil (2'-OMe). Ver também a Publicação de Patente U. S. 2009/0098549, intitulada "SELEX and PHOTOSELEX", a qual descreve bibliotecas de ácidos nucléicos tendo propriedades físicas e químicas expandidas e o seu uso em SELEX e fotoSELEX.

[00160] O SELEX pode também ser usado para identificar aptâmeros que tenham características desejáveis de taxa de dissociação. Ver a Publicação de Pedido de Patente U. S. 2009/0004667, intitulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off- Rates", que descreve métodos SELEX aperfeiçoados para gerar aptâmeros que podem se ligar a moléculas-alvo. Descrevem-se métodos para produzir aptâmeros e fotoaptâmeros tendo taxas de dissociação mais lentas a partir de suas moléculas-alvo respectivas. Os métodos envolvem contatar a mistura candidata com a molécula-alvo, permitir que ocorra a formação de complexos de ácido nucléico-alvo, e efetuar um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta, em que os complexos de ácido nucléico-alvo com taxas de dissociação rápidas dissociarão e não se formarão novamente, enquanto os complexos com taxas de dissociação lentas permanecerão intactos. Adicionalmente, os métodos incluem o uso de nucleotídeos modificados na produção das misturas de ácidos nucleicos candidatas para gerar aptâmeros com desempenho de taxa de dissociação aperfeiçoada.

[00161] Uma variação deste ensaio emprega aptâmeros que incluem grupos funcionais fotorreativos que capacitam os aptâmeros de ligarem covalentemente ou "fotorreticularem" as suas moléculas-alvo. Ver, por exemplo, a Patente U. S. No. 6.544.776, intitulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip". Estes aptâmeros fotorreativos são também referidos como fotoaptâmeros. Ver, por exemplo, a Patente U. S. No. 5.763.177, a Patente U. S. No. 6.001.577, e a Patente U. S. No. 6.291.184, cada uma das quais é intitulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"; ver também, por exemplo, a Patente U. S. No. 6.458.539, intitulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands". Após a microdisposição ser contatado com a amostra e os fotoaptâmeros terem tido uma oportunidade de ligarem-se às suas moléculas-alvo, os fotoaptâmeros são fotoativados, e o suporte sólido é lavado para remover quaisquer moléculas não ligadas especificamente. As condições de lavagem severas podem ser usadas, visto que as moléculas-alvo que são ligadas aos fotoaptâmeros não são, em geral, removidas devido às ligações covalentes criadas pelo(s) grupo(s) funcional(is) fotoativado(s) sobre os fotoaptâmeros. Neste modo, o ensaio capacita a detecção de um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador na amostra de teste.

[00162] Em ambos estes formatos de ensaios, os aptâmeros são imobilizados sobre o suporte sólido, antes de serem contatados com a amostra. Sob certas circunstâncias, entretanto, a imobilização dos aptâmeros antes de contatar com a amostra pode não proporcionar um ensaio ótimo. Por exemplo, a pré-imobilização dos aptâmeros pode resultar na mistura ineficiente dos aptâmeros com as moléculas-alvo sobre a superfície do suporte sólido, talvez levando a tempos de reação prolongados e, portanto, períodos de incubação estendidos para permitir a ligação eficiente dos aptâmeros às suas moléculas-alvo. Ademais, quando os fotoaptâmeros forem empregados no ensaio e dependendo do material utilizado como um suporte sólido, o suporte sólido pode tender a espalhar ou absorver a luz usada para efetuar a formação de ligações covalentes entre os fotoaptâmeros e as suas moléculas-alvo. Além disso, dependendo do método empregado, a detecção das moléculas-alvo ligadas aos seus aptâmeros pode estar sujeita à imprecisão, visto que a superfície do suporte sólido pode também estar exposta a, e ser afetada por, quaisquer agentes de marcação que forem usados. Finalmente, a imobilização dos aptâmeros sobre o suporte sólido geralmente envolve uma etapa de preparação do aptâmero (isto é, a imobilização) antes da exposição dos aptâmeros à amostra, e esta etapa de preparação pode afetar a atividade ou a funcionalidade dos aptâmeros.

[00163] Os ensaios de aptâmeros que permitem um aptâmero capturar o seu alvo em solução e então empregar etapas de separação que são projetadas para remover componentes específicos da mistura de aptâmero-alvo antes da detecção também tinham sido descritos (ver a Publicação de Pedido de Patente U. S. 2009/0042206, intitulada "Multiplexed Analyses of Test Samples"). Os métodos de ensaios de aptâmeros descritos capacitam a detecção e a quantificação de um alvo que não seja de ácido nucléico (por exemplo, um alvo de proteína) em uma amostra de teste por detecção e quantificação de um ácido nucléico (isto é, um aptâmero). Os métodos descritos criam um substituto de ácido nucléico (isto é, o aptâmero) para detectar e quantificar um alvo que não seja de ácido nucléico, assim permitindo que uma ampla variedade de tecnologias de ácidos nucléicos, incluindo a amplificação, seja aplicada a uma faixa mais ampla de alvos desejados, incluindo os alvos de proteínas.

[00164] Os aptâmeros podem ser construídos para facilitar a separação dos componentes do ensaio de um complexo de aptâmero biomarcador (ou complexo covalente de fotoaptâmero biomarcador) e permitir o isolamento do aptâmero para a detecção e/ou a quantificação. Em uma modalidade, estas construções podem incluir um elemento clivável ou liberável dentro da sequência do aptâmero. Em outras modalidades, uma funcionalidade adicional pode ser introduzida no aptâmero, por exemplo, um componente marcado ou detectável, um componente espaçador, ou uma marca de ligação específica ou elemento de imobilização. Por exemplo, o aptâmero pode incluir uma marca unida ao aptâmero por meio de uma porção clivável, uma marca, um componente espaçador que separa a marca, e a porção clivável. Em uma modalidade, um elemento clivável é um ligador fotoclivável. O ligador fotoclivável pode ser unido a uma porção de biotina e uma seção de espaçador, pode incluir um grupo NHS para a derivação de aminas, e pode ser usado para introduzir um grupo biotina em um aptâmero, com isso permitindo a liberação do aptâmero posteriormente em um método de ensaio.

[00165] Os ensaios homogêneos, feitos com todos os componentes do ensaio em solução, não requerem a separação da amostra e dos reagentes ante da detecção do sinal. Estes métodos são rápidos e fáceis de usar. Estes métodos geram um sinal com base em um reagente de captura molecular ou de ligação que reage com o seu alvo específico. Para o NSCLC, os reagentes de captura molecular seriam um aptâmero ou um anticorpo ou similar e o alvo específico seria um biomarcador de NSCLC da Tabela 1.

[00166] Em uma modalidade, um método para a geração de sinal tira proveito da alteração da anisotropia do sinal devida à interação de um reagente de captura marcado com fluoróforo com o seu alvo de biomarcador específico. Quando a captura marcada reage com o seu alvo, o peso molecular aumentado faz com que o movimento rotacional do fluoróforo unido ao complexo torne-se muito mais lento, alterando o valor da anisotropia. Por monitoramento da alteração da anisotropia, os eventos de ligação podem ser usados para medir quantitativamente os biomarcadores em soluções. Os outros métodos incluem os ensaios de polarização da fluorescência, os métodos de sinais moleculares, a dissipação da fluorescência tempo resolvida, a quimioluminescência, a transferência de energia de ressonância por fluorescência, e similares.

[00167] Um ensaio de aptâmero baseado em solução ilustrativo, que pode ser usado para detectar um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador em uma amostra biológica, inclui o que segue: (a) preparar uma mistura por contato da amostra biológica com um aptâmero que inclui uma primeira marca e tem uma afinidade específica pelo biomarcador, em que é formado um complexo de afinidades do aptâmero quando o biomarcador estiver presente na amostra; (b) expor a mistura a um primeiro suporte sólido que inclui um primeiro elemento de captura, e permitir que a primeira marca se associe com o primeiro elemento de captura; (c) remover quaisquer componentes da mistura não associados com o primeiro suporte sólido; (d) unir uma segunda marca ao componente de biomarcador do complexo de afinidades do aptâmero; (e) liberar o complexo de afinidades do aptâmero do primeiro suporte sólido; (f) expor o complexo de afinidades do aptâmero liberado a um segundo suporte sólido que inclui um segundo elemento de captura e permitir que a segunda marca associe-se com o segundo elemento de captura; (g) remover qualquer aptâmero que não tenha formado complexo da mistura separando o aptâmero que não formou complexo do complexo de afinidades do aptâmero; (h) eluir o aptâmero do suporte sólido; e (i) detectar o biomarcador detectando o componente de aptâmero do complexo de afinidades do aptâmero.

[00168] Qualquer meio conhecido na técnica pode ser usado para detectar o valor de biomarcador por detecção do componente de aptâmero de um complexo de afinidades do aptâmero. Podem ser usados diversos métodos de detecção diferentes para detectar o componente de aptâmero de um complexo de afinidades, tais como, por exemplo, ensaios de hibridização, espectroscopia de massa, ou QPCR. Em algumas modalidades, os métodos de sequenciamento de ácidos nucléicos podem ser usados para detectar o componente de aptâmero de um complexo de afinidades do aptâmero e, com isso, detectar um valor de biomarcador. Resumidamente, uma amostra de teste pode ser submetida a qualquer tipo de método de sequenciamento de ácidos nucléicos para identificar e quantificar a sequência ou as sequências de um ou mais aptâmeros presentes na amostra de teste. Em algumas modalidades, a sequência inclui a molécula de aptâmero inteira ou qualquer parte da molécula que possa ser usada para identificar especificamente a molécula. Em outras modalidades, o sequenciamento de identificação é uma sequência específica adicionada ao aptâmero; tais sequências são frequentemente referidas como "marcas", "códigos de barras", ou "códigos de endereçamento postal". Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui etapas enzimáticas para amplificar a sequência do aptâmero ou para converter qualquer tipo de ácido nucléico, incluindo o RNA e o DNA que contêm modificações químicas em qualquer posição, em qualquer outro tipo de ácido nucléico, apropriado para o sequenciamento.

[00169] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui uma ou mais etapas de clonagem. Em outras modalidades, o método de sequenciamento inclui um método de sequenciamento direto sem clonagem.

[00170] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui uma abordagem dirigida, com primers específicos que alvejam um ou mais aptâmeros na amostra de teste. Em outras modalidades, o método de sequenciamento inclui uma abordagem de espingarda ("shotgun") que alveja todos os aptâmeros na amostra de teste.

[00171] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui etapas enzimáticas para amplificar a molécula alvejada para o sequenciamento. Em outras modalidades, o método de sequenciamento diretamente sequencia moléculas individuais. Um método baseado em sequenciamento de ácidos nucléicos ilustrativo, que pode ser usado para detectar um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador em uma amostra biológica, inclui o que segue: (a) converter uma mistura de aptâmeros que contêm nucleotídeos quimicamente modificados em ácidos nucléicos não modificados com uma etapa enzimática; (b) sequenciar por espingarda os ácidos nucléicos não modificados resultantes com uma plataforma de sequenciamento compactamente paralela, tal como, por exemplo, o Sistema de Sequenciamento 454 (454 Life Sciences/Roche), o Sistema de Sequenciamento Illumina (Illumina), o Sistema de Sequenciamento ABI SOLiD (Applied Biosystems), o Sequenciador de Molécula Individual HeliScope (Helicos Biosciences), ou o Sistema de Sequenciamento de Molécula Individual em Tempo Real Pacific Biosciences (Pacific BioSciences) ou o Sistema de Sequenciamento Polonator G (Dover Systems); e (c) identificar e quantificar os aptâmeros presentes na mistura por sequência específica e contagem de sequência.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando Imunoensaios

[00172] Os métodos de imunoensaios são baseados na reação de um anticorpo com seu alvo ou analito correspondente e podem detectar o analito em uma amostra, dependendo do formato do ensaio específico. Para melhorar a especificidade e a sensibilidade de um método de ensaio baseado em imunorreatividade, os anticorpos monoclonais são frequentemente usados por causa de seu reconhecimento de epítopo específico. Os anticorpos policlonais também têm sido usados com êxito em diversos imunoensaios por causa de sua afinidade aumentada pelo alvo em comparação com os anticorpos monoclonais. Os imunoensaios têm sido projetados para uso com uma ampla variedade de matrizes de amostras biológicas. Os formatos dos imunoensaios têm sido projetados para proporcionar resultados qualitativos, semiquantitativos, e quantitativos.

[00173] Os resultados quantitativos são gerados através do uso de uma curva padrão, criada com concentrações conhecidas do analito específico a ser detectado. A resposta ou sinal de uma amostra desconhecida é representado graficamente sobre a curva padrão, e uma quantidade ou valor correspondendo ao alvo na amostra desconhecida é estabelecido.

[00174] Diversos formatos de imunoensaios têm sido projetados. ELISA ou EIA podem ser quantitativos para a detecção de um analito. Este método vale-se da união de uma marca ao analito ou ao anticorpo e o componente de marca inclui, direta ou indiretamente, uma enzima. Os testes de ELISA podem ser formatados para a detecção direta, indireta, competitiva, ou de sanduiche do analito. Outros métodos valem-se das marcas, tais como, por exemplo, os radioisótopos (I125) ou a fluorescência. As técnicas adicionais incluem, por exemplo, a aglutinação, a nefelometria, a turbidimetria, o Western blot, a imunoprecipitação, a imunocitoquímica, a imuno-histoquímica, a citometria de fluxo, a sorologia, o ensaio com Luminex, e outros (ver ImmunoAssay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicado por Taylor & Francis, Ltd., edição de 2005).

[00175] Os formatos de ensaios ilustrativos incluem o ensaio imunológico por ligação com enzima (ELISA), o radioimunoensaio, o fluorescente, a quimioluminescência, e a transferência de energia de ressonância por fluorescência (FRET) ou os imunoensaios de FRET tempo resolvida (TR-FRET). Os exemplos de procedimentos para detectar os biomarcadores incluem a imunoprecipitação do biomarcador seguida por métodos quantitativos que permitam a diferenciação do tamanho e do nível de peptídeo, tal como a eletroforese em gel, a eletroforese capilar, a eletrocromatografia planar, e similares.

[00176] Os métodos de detectar e/ou quantificar um material gerador de marca ou sinal detectável dependem da natureza da marca. Os produtos de reações catalisadas por enzimas apropriadas (em que a marca detectável for uma enzima; ver acima) podem ser, sem limitação, fluorescentes, luminescentes, ou radioativos ou eles podem absorver luz visível ou ultravioleta. Os exemplos de detectores adequados para detectar tais marcas detectáveis incluem, sem limitação, o filme de raiosX, os contadores de radioatividades, os contadores de cintilação, os espectrofotômetros, os colorímetros, os fluorômetros, os fotômetros, e o densitômetros.

[00177] Quaisquer dos métodos para a detecção podem ser efetuados em qualquer formato que permita qualquer preparação, processamento e análise adequados das reações. Isto pode ser, por exemplo, em placas de ensaios de múltiplos poços (por exemplo, 96 poços ou 384 poços) ou usando qualquer disposição ou microdisposição adequada. As soluções de estoque para diversos agentes podem ser preparadas manual ou roboticamente, e toda a pipetagem, diluição, mistura, distribuição, lavagem, incubação, leitura da amostra, coleta de dados e análise subsequentes podem ser feitas roboticamente usando software de análise comercialmente disponível, robótica, e instrumentação de detecção capaz de detectar uma marca detectável.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando o Perfil de Expressão do Gene

[00178] A medição do mRNA em uma amostra biológica pode ser usada como um substituto para a detecção do nível da proteína correspondente na amostra biológica. Desse modo, quaisquer dos biomarcadores ou painéis de biomarcadores descritos neste documento podem também ser detectados detectando-se o RNA apropriado.

[00179] Os níveis de expressão de mRNA são medidos por reação em cadeia por polimerase quantitativa de transcrição reversa (RT-PCR, seguida com qPCR). A RT-PCR é usada para criar um cDNA a partir do mRNA. O cDNA pode ser usado em um ensaio de qPCR para produzir fluorescência à medida que o processo de amplificação do DNA progride. Por comparação com uma curva padrão, a qPCR pode produzir uma medição absoluta, tal como o número de cópias de mRNA por célula. Os Northern blots, as microdisposiçãos, os ensaios Invader, e a RT-PCR, combinados com a eletroforese capilar, têm todos sido usados para medir os níveis de expressão de mRNA em uma amostra. Ver Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004.

[00180] As moléculas de miRNA são RNAs pequenos que são de não codificação, porém podem regular a expressão do gene. Quaisquer dos métodos adequados para a medição dos níveis de expressão do mRNA podem também ser usados para o miRNA correspondente. Recentemente, muitos laboratórios investigaram o uso de miRNAs como biomarcadores para doença. Muitas doenças envolvem a regulação transcricional ampla, e não é surpreendente que os miRNAs possam encontrar um papel como biomarcadores. A ligação entre as concentrações de miRNA e a doença é frequentemente até menos clara do que as ligações entre os níveis de proteínas e a doença, não obstante o valor dos biomarcadores de miRNA possa ser substancial. Obviamente, como com qualquer RNA expresso diferencialmente durante a doença, os problemas enfrentando o desenvolvimento de um produto diagnóstico in vitro incluirão a exigência que os miRNAs sobrevivam na célula doente e sejam facilmente extraídos para análise, ou que os miRNAs sejam liberados no sangue ou outras matrizes em que eles devem sobreviver por um longo tempo, suficiente para serem medidos. Os biomarcadores de proteínas têm exigências similares, embora muitos biomarcadores de proteínas potenciais sejam secretados intencionalmente no local da patologia e atuem, durante a doença, em um modo parácrino. Muitos biomarcadores de proteínas potenciais são projetados para atuar fora das células dentro das quais estas proteínas são sintetizadas.

Detecção de Biomarcadores Usando Tecnologias de Imageamento Molecular In Vivo

[00181] Quaisquer dos biomarcadores descritos (ver a Tabela 1) podem também ser usados nos testes de imageamento molecular. Por exemplo, um agente de imageamento pode ser acoplado a quaisquer dos biomarcadores descritos, que podem ser usados para auxiliar na diagnose do NSCLC, para monitorar a progressão/remissão ou a metástase da doença, para monitorar a recorrência da doença, ou para monitorar a resposta à terapia, entre outros usos.

[00182] As tecnologias de imageamento in vivo proporcionam métodos não invasivos para determinar o estado de uma doença particular no corpo de um indivíduo. Por exemplo, as partes inteiras do corpo, ou mesmo o corpo inteiro, podem ser vistas como uma imagem tridimensional, com isso proporcionando informação valiosa relativa à morfologia e às estruturas no corpo. Tais tecnologias podem ser combinadas com a detecção dos biomarcadores descritos neste documento para proporcionar informação relativa à situação do câncer, em particular à situação do NSCLC, de um indivíduo.

[00183] O uso de tecnologias de imageamento molecular in vivo está expandindo devido a diversos avanços na tecnologia. Esses avanços incluem o desenvolvimento de novos agentes de contraste ou marcas, tais como as radiomarcas e/ou as marcas fluorescentes, que podem proporcionar sinais fortes dentro do corpo; e o desenvolvimento de nova tecnologia de imageamento de grande eficácia, a qual pode detectar e analisar estes sinais do lado de fora do corpo com sensibilidade e acurácia suficientes para proporcionar informação útil. O agente de contraste pode ser visualizado em um sistema de imageamento apropriado, com isso proporcionando uma imagem da parte ou das partes do corpo nas quais o agente de contraste está localizado. O agente de contraste pode ser ligado a, ou estar associado com, um reagente de captura, tal como um aptâmero ou um anticorpo, por exemplo, e/ou com um peptídeo ou proteína, ou um oligonucleotídeo (por exemplo, para a detecção da expressão gênica) ou um complexo contendo quaisquer destes com uma ou mais macromoléculas e/ou outras formas particuladas.

[00184] O agente de contraste pode também realçar um átomo radioativo que seja útil no imageamento. Os átomos radioativos adequados incluem o tecnécio-99m ou o iodo-123 para os estudos cintigráficos. As outras porções prontamente detectáveis incluem, por exemplo, as marcas de spins para o imageamento por ressonância magnética (MRI), tais como, por exemplo, o iodo-123 novamente, o iodo-131, o índio-111, o flúor-19, o carbono-13, o nitrogênio-15, o oxigênio-17, o gadolínio, o manganês ou o ferro. Tais marcas são bastante conhecidas na técnica e podem facilmente ser selecionadas por alguém de habilidade comum na técnica.

[00185] As técnicas de imageamento padrões incluem, porém não estão limitadas ao imageamento por ressonância magnética, a varredura por tomografia computadorizada, a tomografia por emissão de pósitrons (PET), a tomografia computadorizada por emissão de fótons individuais (SPECT), e similares. Para o imageamento in vivo diagnóstico, o tipo de instrumento de detecção disponível é um fator principal na seleção de um dado agente de contraste, tal como um dado radionuclídeo, e o biomarcador particular que é usado para alvejar (proteína, mRNA, e similar). O radionuclídeo escolhido tipicamente tem um tipo de desintegração que é detectável por um dado tipo de instrumento. Também, quando se seleciona um radionuclídeo para a diagnose in vivo, sua meia-vida deve ser longa o suficiente para capacitar a detecção no momento da captação máxima pelo tecido-alvo, porém curta o suficiente que a radiação deletéria do hospedeiro seja minimizada.

[00186] As técnicas de imageamento ilustrativas incluem, porém não estão limitadas à PET e à SPECT, que são técnicas de imageamento nas quais um radionuclídeo é sintética ou localmente administrado a um indivíduo. A captação subsequente do radiotraçador é medida ao longo do tempo e usada para obter informação sobre o tecido alvejado e o biomarcador. Por causa das emissões de altas energias (raio gama) dos isótopos específicos empregados e da sensibilidade e sofisticação dos instrumentos usados para detectá-las, a distribuição bidimensional da radioatividade pode ser inferida do lado de fora do corpo.

[00187] Os nuclídeos emissores de pósitrons comumente usados na PET incluem, por exemplo, o carbono-11, o nitrogênio-13, o oxigênio15, e o flúor-18. Isótopos que se desintegram por captura de elétrons e/ou emissão gama são usados na SPECT e incluem, por exemplo, o iodo-123 e o tecnécio-99m. Um método ilustrativo para marcar aminoácido com tecnécio-99m é a redução do íon pertecnetato na presença de um precursor quelante, para formar o complexo de tecnécio-99m-precursor instável, que, por sua vez, reage com o grupo de ligação de metal de um peptídeo quimiotático bifuncionalmente modificado para formar um conjugado de tecnécio-99m-peptídeo quimiotático.

[00188] Os anticorpos são frequentemente usados para tais métodos diagnósticos por imageamento in vivo. A preparação e o uso de anticorpos para a diagnose in vivo são bastante conhecidos na técnica. Os anticorpos marcados que especificamente ligam quaisquer dos biomarcadores na Tabela 1 podem ser injetados em um indivíduo suspeito de ter certo tipo de câncer (por exemplo, NSCLC), detectável de acordo com o biomarcador particular usado, para o propósito de diagnosticar ou avaliar a situação da doença dos indivíduos. A marca usada será selecionada de acordo com a modalidade de imageamento a ser usada, como anteriormente descrito. A localização da marca permite a determinação do espalhamento do câncer. A quantidade de marca dentro de um órgão ou tecido também permite a determinação da presença ou da ausência de câncer naquele órgão ou tecido.

[00189] Similarmente, os aptâmeros podem ser usados para tais métodos diagnósticos por imageamento in vivo. Por exemplo, um aptâmero que foi usado para identificar um biomarcador particular descrito na Tabela 1 (e, portanto, se liga especificamente àquele biomarcador particular) pode ser apropriadamente marcado e injetado em um indivíduo suspeito de ter o NSCLC, detectável de acordo com o biomarcador particular, para o propósito de diagnosticar ou avaliar a situação do NSCLC do indivíduo. A marca usada será selecionada de acordo com a modalidade de imageamento a ser usada, conforme anteriormente descrito. A localização da marca permite a determinação do espalhamento do câncer. A quantidade de marca dentro de um órgão ou tecido também permite a determinação da presença ou da ausência do câncer naquele órgão ou tecido. Os agentes de imageamento dirigidos pelos aptâmeros podem ter características únicas e vantajosas em relação à penetração no tecido, distribuição no tecido, cinética, eliminação, potência, e seletividade, comparados aos outros agentes de imageamento.

[00190] Tais técnicas podem também opcionalmente ser efetuadas com oligonucleotídeos marcados, por exemplo, para a detecção da expressão gênica através de imageamento com oligonucleotídeos sem sentido. Estes métodos são usados para a hibridização in situ, por exemplo, com moléculas fluorescentes ou radionuclídeos como a marca. Os outros métodos para a detecção da expressão gênica incluem, por exemplo, a detecção da atividade de um gene relator.

[00191] Outro tipo geral de tecnologia de imageamento é o imageamento óptico, no qual sinais fluorescentes dentro do paciente são detectados por um dispositivo óptico que está externo ao paciente. Estes sinais podem ser devidos à fluorescência real e/ou à bioluminescência. Os aperfeiçoamentos na sensibilidade dos dispositivos de detecção óptica têm aumentado a utilidade do imageamento óptico para os ensaios diagnósticos in vivo.

[00192] O uso de imageamento molecular in vivo de biomarcador está aumentando, incluindo para os ensaios clínicos, por exemplo, para medir mais rapidamente a eficácia clínica nos ensaios por novas terapias de câncer e/ou para evitar o tratamento prolongado com um placebo para estas doenças, tais como a esclerose múltipla, em que tal tratamento prolongado pode ser considerado ser eticamente questionável.

[00193] Quanto a uma revisão de outras técnicas, ver N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando Métodos de Histologia/Citologia

[00194] Para a avaliação do NSCLC, pode ser usada uma variedade de amostras de tecidos nos métodos histológicos ou citológicos. A seleção da amostra depende da localização do tumor primário e dos locais das metástases. Por exemplo, as biopsias endo- e transbronquiais, os aspirados por agulhas finas, as agulhas de corte, e as biopsias de núcleo podem ser usados para a histologia. A lavagem e a escovação bronquial, a aspiração pleural, o fluido pleural, e o escarro podem ser usados para a citologia. Embora a análise citológica seja ainda usada na diagnose do NSCLC, sabe-se que os métodos histológicos proporcionam melhor sensibilidade para a detecção do câncer. Quaisquer dos biomarcadores identificados neste documento que foram mostrados serem suprarregulados (Tabela 1) nos indivíduos com NSCLC podem ser usados para colorir uma amostra histológica como uma indicação da doença.

[00195] Em uma modalidade, um ou mais reagentes de captura, específicos para o(s) biomarcador(es) correspondente(s), são usados em uma avaliação citológica de uma amostra de células do tecido de pulmão e podem incluir um ou mais do que segue: coletar uma amostra de células, fixar a amostra de células, desidratar, limpar, imobilizar a amostra de células sobre uma lâmina de microscópio, permeabilizar a amostra de células, tratar para a recuperação do analito, colorir, descolorir, lavar, bloquear, e tratar com um ou mais reagentes de captura em uma solução tamponada. Em outra modalidade, a amostra de células é produzida a partir de um bloco de células.

[00196] Em outra modalidade, um ou mais reagentes de captura, específicos para o(s) biomarcador(es) correspondente(s), são usados em uma avaliação histológica de uma amostra de tecido de pulmão e podem incluir um ou mais do que segue: coletar uma amostra de tecido, fixar a amostra de tecido, desidratar, limpar, imobilizar a amostra de tecido sobre uma lâmina de microscópio, permeabilizar a amostra de tecido, tratar para a recuperação do analito, colorir, descolorir, lavar, bloquear, reidratar, e reagir com o(s) reagente(s) de captura em uma solução tamponada. Em outra modalidade, a fixação e a desidratação são substituídas pelo congelamento.

[00197] Em outra modalidade, os um ou mais aptâmeros, específicos para o(s) biomarcador(es) correspondente(s), são reagidos com a amostra histológica ou citológica e podem servir como o alvo de ácidos nucléicos em um método de amplificação de ácidos nucléicos. Os métodos de amplificação de ácidos nucléicos adequados incluem, por exemplo, a PCR, a q-beta replicase, a amplificação por círculo ondulante, a substituição de fita, a amplificação dependente de helicase, a amplificação isotérmica mediada por loop, a reação em cadeia por ligase, e a amplificação por círculo ondulante auxiliada por restrição e circularização.

[00198] Em uma modalidade, os um ou mais reagentes de captura, específicos para os biomarcadores correspondentes, para uso na avaliação histológica ou citológica, são misturados em uma solução tamponada que pode incluir quaisquer dos que seguem: materiais de bloqueio, competidores, detergentes, estabilizadores, ácido nucléico veículo, materiais polianiônicos, etc.

[00199] Um "protocolo da citologia" em geral inclui a coleta da amostra, a fixação da amostra, a imobilização da amostra, e a coloração. A "preparação das células" pode incluir diversas etapas de processamento após a coleta da amostra, incluindo o uso de um ou mais aptâmeros de taxas de dissociação lentas para a coloração das células preparadas.

[00200] A coleta da amostra pode incluir colocar diretamente a amostra em um recipiente de transporte não tratado, colocar a amostra em um recipiente de transporte contendo algum tipo de meio, ou colocar a amostra diretamente sobre uma lâmina (imobilização) sem qualquer tratamento ou fixação.

[00201] A imobilização da amostra pode ser melhorada aplicando-se uma parte da amostra coletada a uma lâmina de vidro que esteja tratada com polilisina, gelatina, ou um silano. As lâminas podem ser preparadas espalhando-se uma camada fina e uniforme de células através da lâmina. Em geral, toma-se cuidado para minimizar a deformidade mecânica e os artefatos de secagem. As amostras líquidas podem ser processadas em um método de blocos de células. Ou, alternativamente, as amostras líquidas podem ser misturadas 1:1 com a solução fixadora por cerca de 10 minutos, na temperatura ambiente.

[00202] Os blocos de células podem ser preparados a partir de efusões residuais, catarro, sedimentos da urina, fluidos gastrointestinais, fluidos pulmonares, raspagem de células, ou aspirados com agulhas finas. As células são concentradas ou acondicionadas por centrifugação ou filtração por membrana. Diversos métodos para a preparação de blocos de células foram desenvolvidos. Os procedimentos representativos incluem os métodos de sedimento fixado, ágar bacteriano, ou filtração por membrana. No método de sedimento fixado, o sedimento de células é misturado com um Bouins do tipo fixador, o ácido pícrico, ou a formalina tamponada e então a mistura é centrifugada para peletizar as células fixadas. O sobrenadante é removido, secando a pelota de células tão completamente quanto possível. A pelota é coletada e enrolada em papel de lente e então colocada em um cassete de tecido. O cassete de tecido é colocado em uma jarra com fixador adicional e processado como uma amostra de tecido. O método de ágar é muito similar, porém a pelota é removida e secada sobre toalha de papel e então cortada na metade. O lado cortado é colocado em uma gota de ágar derretido sobre uma lâmina de vidro e então a pelota é coberta com ágar, certificando-se que nenhuma bolha se forme no ágar. O ágar é deixado endurecer e então qualquer ágar em excesso é cortado fora. Este é colocado em um cassete de tecido e o processo de tecido completado. Alternativamente, a pelota pode ser diretamente suspensa em 2% de ágar líquido, a 65°C, e a amostra centrifugada. A pelota de células de ágar é deixada solidificarse por uma hora, a 4°C. O ágar sólido pode ser removido do tubo da centrífuga e cortado na metade. O ágar é enrolado em papel de filtro e então no cassete de tecido. O processamento deste ponto em diante é conforme descrito acima. A centrifugação pode ser substituída em quaisquer destes procedimentos pela filtração por membrana. Quaisquer destes processos podem ser usados para gerar uma "amostra de bloco de células".

[00203] Os blocos de células podem ser preparados usando resina específica, incluindo as resinas Lowicryl, LR White, LR Gold, Unicryl, e MonoStep. Estas resinas têm baixa viscosidade e podem ser polimerizadas em baixas temperaturas e com luz ultravioleta (UV). O processo de incorporação vale-se de esfriar progressivamente a amostra durante a desidratação, transferir a amostra para a resina, e polimerizar um bloco na temperatura baixa final no comprimento de ondas de UV apropriado.

[00204] As seções dos blocos de células podem ser coloridas com hematoxilina-eosina para o exame citomorfológico, enquanto as seções adicionais são usadas para o exame quanto a marcadores específicos.

[00205] Quer o processo seja citológico, quer seja histológico, a amostra pode ser fixada antes do processamento adicional, para impedir a degradação da amostra. Este processo é chamado "fixação" e descreve uma ampla variedade de materiais e procedimentos que pode ser usada de modo intercambiável. O protocolo de fixação da amostra e os reagentes são melhores selecionados empiricamente com base nos alvos a serem detectados e no tipo de célula/tecido específico a ser analisado. A fixação da amostra vale-se de reagentes tais como etanol, polietileno glicol, metanol, formalina, ou isopropanol. As amostras devem ser fixadas o mais breve possível após a coleta e a afixação na lâmina. Entretanto, o fixador selecionado pode introduzir alterações estruturais nos diversos alvos moleculares, tornando mais difícil a sua detecção subsequente. Os processos de fixação e imobilização e a sua sequência podem modificar o aspecto da célula e estas alterações devem ser antecipadas e reconhecidas pelo citotecnologista. Os fixadores podem causar contração de certos tipos de células e fazer com que o citoplasma pareça granular ou reticular. Muitos fixadores atuam por reticulação dos componentes celulares. Isto pode danificar ou modificar epítopos específicos, gerar novos epítopos, causar associações moleculares, e reduzir a permeabilidade da membrana. A fixação com formalina é uma das abordagens citológicas/histológicas mais comuns. A formalina forma pontes de metila entre as proteínas próximas ou dentro das proteínas. A precipitação ou a coagulação é também usada para a fixação e o etanol é frequentemente usado neste tipo de fixação. Uma combinação de reticulação e precipitação pode também ser usada para a fixação. Um processo de fixação forte é melhor na preservação da informação morfológica, enquanto um processo de fixação mais fraco é melhor para a preservação dos alvos moleculares.

[00206] Um fixador representativo é 50% de etanol absoluto, polietileno glicol (PEG) a 2 mM, 1,85% de formaldeído. As variações nesta formulação incluem etanol (50% a 95%), metanol (20% - 50%), e formalina (formaldeído) somente. Outro fixador comum é 2% de PEG 1500, 50% de etanol, e 3% de metanol. As lâminas são colocadas no fixador por cerca de 10 a 15 minutos, na temperatura ambiente, e então removidas e deixadas secar. Assim que as lâminas forem fixadas, elas podem ser enxaguadas com uma solução tamponada como a PBS.

[00207] Uma ampla variedade de corantes pode ser usada para realçar e contrastar ou "colorir" as características celulares, subcelulares, e de tecido ou as estruturas morfológicas. A hematoilina é usada para colorir os núcleos de uma cor azul ou preta. O Orange G-6 e a Eosina Azure ambos colorem o citoplasma da célula. O Orange G colore de amarelo as células contendo queratina e glicogênio. A Eosina Y é usada para colorir os nucléolos, os cílios, os glóbulos vermelhos, e as células escamosas epiteliais superficiais. Os corantes de Romanowsky são usados para as lâminas secadas ao ar e são úteis em aumentar o pleomorfismo e distinguir o material extracelular do intracitoplásmico.

[00208] O processo de coloração pode incluir um tratamento para aumentar a permeabilidade das células ao corante. O tratamento das células com um detergente pode ser usado para aumentar a permeabilidade. Para aumentar a permeabilidade das células e dos tecidos, as amostras fixadas podem ser adicionalmente tratadas com solventes, saponinas, ou detergentes não iônicos. A digestão enzimática pode também melhorar a acessibilidade de alvos específicos em uma amostra de tecido.

[00209] Após a coloração, a amostra é desidratada usando uma sucessão de enxagues com álcool, com concentração de álcool crescente. A lavagem final é feita com xileno ou um substituto do xileno, tal como um terpeno cítrico, que tenha um índice de refração próximo àquele da lamínula a ser aplicada à lâmina. Esta etapa final é referida como limpeza. Assim que a amostra for desidratada e limpa, aplica-se um meio de suporte. O meio de suporte é selecionado para ter um índice de refração próximo ao do vidro e seja capaz de ligar a lamínula à lâmina. Ele também inibirá a secagem, o encolhimento, ou enfraquecimento adicional da amostra de células.

[00210] Independente dos corantes ou do processamento usado, a avaliação final da amostra citológica do pulmão é feita por algum tipo de microscopia, para permitir uma inspeção visual da morfologia e uma determinação da presença ou da ausência do marcador. Os métodos microscópicos ilustrativos incluem o campo brilhante, o contrate de fases, a fluorescência, e o contraste de interferência diferencial.

[00211] Se forem requeridos testes secundários sobre a amostra após o exame, a lamínula pode ser removida e a lâmina descolorida. A descoloração envolve usar os sistemas de corantes originais usados na coloração da lâmina originalmente, sem o corante adicionado e em uma ordem inversa ao procedimento de coloração original. A descoloração pode também ser completada saturando-se a lâmina em um álcool ácido até as células estarem sem cor. Uma vez sem cor, as lâminas são enxaguadas bem em um banho de água e o segundo procedimento de coloração aplicado.

[00212] Além disso, a diferenciação molecular específica pode ser possível em combinação com a análise morfológica celular, através do uso de reagentes moleculares específicos, tais como anticorpos ou sondas ou aptâmeros de ácidos nucléicos. Isto aperfeiçoa a acurácia da citologia diagnóstica. A microdissecação pode ser usada para isolar um subgrupo de células para avaliação adicional, em particular, para avaliação genética de cromossomos anormais, expressão gênica, ou mutações.

[00213] A preparação de uma amostra de tecido para avaliação histológica envolve a fixação, a desidratação, a infiltração, a incrustação, e o secionamento. Os reagentes de fixação usados na histologia são muito similares ou idênticos àqueles usados na citologia e têm os mesmos problemas de preservar as características morfológicas à custa das moleculares, tais como as proteínas individuais. O tempo pode ser economizado se a amostra de tecido não for fixada e desidratada, porém, em vez disso, for congelada e então secionada enquanto congelada. Este é um procedimento de processamento mais suave e pode preservar mais marcadores individuais. Entretanto, o congelamento não é aceitável para a armazenagem de longa duração de uma amostra de tecido, visto que a informação subcelular é perdida devido à introdução de cristais de gelo. O gelo na amostra de tecido congelada também impede que o processo de secionar produza uma lâmina muito fina e, desse modo, alguma resolução microscópica e o imageamento das estruturas subcelulares podem ser pedidos. Além da fixação com formalina, o tetróxido de ósmio é usado para fixar e colorir os fosfolipídios (membranas).

[00214] A desidratação dos tecidos é efetuada com lavagens sucessivas de concentração crescente de álcool. A limpeza emprega um material que seja miscível com o álcool e o material de incrustação e envolve um processo em etapas que começa a 50:50 de álcool:reagente de limpeza e então 100% de agente de limpeza (xileno ou substituto do xileno). A infiltração envolve incubar o tecido com uma forma líquida do agente de incrustação (cera quente, solução de nitrocelulose) primeiro a 50:50 de agente de incrustação: agente de limpeza e os 100% de agente de incrustação. A incrustação é completada colocando-se o tecido em um molde ou cassete e enchendo-se com agente de incrustação derretido, tal como cera, ágar, ou gelatina. O agente de incrustação é deixado endurecer. A amostra de tecido endurecida pode então ser cortada em seção fina para a coloração e o exame subsequente.

[00215] Antes de colorir, a seção de tecido tem a cera removida e é reidratada. O xileno é usado para remover a cera da seção, uma ou mais trocas de xileno podem ser usadas, e o tecido é reidratado por lavagens sucessivas em álcool de concentração decrescente. Antes de remover a cera, a seção de tecido pode ser imobilizada por calor em uma lâmina de vidro, em torno de 80°C, por cerca de 20 minutos.

[00216] A microdissecação por captura a laser permite o isolamento das células para análise adicional de uma seção de tecido.

[00217] Como na citologia, para aumentar a visualização das características microscópicas, a seção ou parte de tecido pode ser colorida com uma variedade de corantes. Um grande menu de corantes comercialmente disponíveis pode ser usado para aumentar ou identificar características específicas.

[00218] Para aumentar adicionalmente a interação dos reagentes moleculares com as amostras citológicas/histológicas, foram desenvolvidas diversas técnicas para a "recuperação do analito". A primeira tal técnica utiliza o aquecimento em alta temperatura de uma amostra fixada. Este método é também referido como recuperação de epítopo induzida por calor ou HIER. Uma variedade de técnicas de aquecimento tem sido usada, incluindo o aquecimento com vapor, o aquecimento por micro-onda, a autoclavagem, os banhos-maria, e o cozimento com pressão ou uma combinação destes métodos de aquecimento. As soluções de recuperação do analito incluem, por exemplo, a água, o citrato, e os tampões de salina normal. O segredo para a recuperação do analito é o tempo em alta temperatura, porém temperaturas menores por tempos mais longos também têm sido usadas com êxito. Outro segredo para a recuperação do analito é o pH da solução de aquecimento. O pH baixo foi verificado proporcionar a melhor imunocoloração, porém também dá origem a perfis que frequentemente requerem o uso de uma segunda seção de tecido como um controle negativo. O benefício mais consistente (imunocoloração aumentada sem aumento no perfil) é geralmente obtido com uma solução de pH alto, independente da composição do tampão. O processo de recuperação do analito para um alvo específico é empiricamente otimizado para o alvo usando o calor, o tempo, o pH, e a composição de tampão como variáveis para a otimização do processo. O uso do método de recuperação do analito por micro-onda permite a coloração sequencial de diferentes alvos com reagentes de anticorpos. Porém o tempo requerido para obter complexos de anticorpo e enzima entre as etapas de coloração também foi mostrado degradar os analitos de membranas celulares. Os métodos de aquecimento por micro-onda melhoraram os métodos de hibridização in situ também.

[00219] Para iniciar o processo de recuperação do analito, a seção primeiramente tem a cera removida e é hidratada. A lâmina é então colocada em tampão de citrato de sódio a 10 mM pH 6,0 em uma placa ou jarra. Um procedimento representativo utiliza um micro-onda de 1100 W e aquece por micro-onda a lâmina em potência de 100% por 2 minutos, seguido por aquecimento por micro-onda das lâminas usando potência de 20% por 18 minutos, após checar para estar certo que a lâmina permanece coberta no líquido. A lâmina é então deixada esfriar no recipiente não coberto e é então enxaguada com água destilada. A HIER pode ser usada em combinação com uma digestão enzimática para melhorar a reatividade do alvo aos reagentes imunoquímicos.

[00220] Tal protocolo de digestão enzimática utiliza a proteinase K. Uma concentração de 20 g/ml de proteinase K é preparada em tampão de Tris Base a 50 mM, EDTA a 1 mM, 0,5% de Triton X-100, pH 8,0. O processo primeiramente envolve remover a cera das seções em 2 trocas de xileno, 5 minutos cada. Então a amostra é hidratada em 2 trocas de 100% de etanol por 3 minutos cada, 95% e 80% de etanol por 1 minuto cada, e então é enxaguada em água destilada. As seções são cobertas com solução de trabalho de proteinase K e incubadas 10-20 minutos, a 37°C, em câmara umidificada (o tempo de incubação opcional pode variar dependendo do tipo de tecido e do grau de fixação). As seções são esfriadas na temperatura ambiente por 10 minutos e então enxaguadas em PBS Tween 20 por 2x2 min. Se desejado, as seções podem ser bloqueadas para eliminar interferência potencial de compostos e enzimas endógenos. A seção é então incubada com anticorpo primário em diluição apropriada em tampão de diluição de anticorpo primário, por 1 hora na temperatura ambiente, ou durante a noite a 4°C. A seção é então enxaguada com PBS Tween 20 por 2x2 min. Um bloqueio adicional pode ser efetuado, se requerido para a aplicação específica, seguido por enxague adicional com PBS Tween 20 por 3x2 min e então finalmente o protocolo de imunocoloração é completado.

[00221] Um tratamento simples com 1% de SDS na temperatura ambiente também demonstrou melhorar a coloração imuno-histoquímica. Os métodos de recuperação do analito têm sido aplicados a seções suportadas em lâmina, bem como a seções de flutuação livre.
Outra opção de tratamento é colocar a lâmina em uma jarra contendo ácido cítrico e 0.1 Nonident P40 em pH 6,0 e aquecer até 95°C. A lâmina é então lavada com uma solução de tampão como a PBS.

[00222] Para a coloração imunológica dos tecidos, pode ser útil bloquear a associação não específica do anticorpo com as proteínas do tecido, impregnando-se a seção em uma solução de proteína como o soro ou o leite seco desnatado.

[00223] As reações de bloqueio podem incluir a necessidade de reduzir o nível de biotina endógena; eliminar os efeitos da carga endógena; inativar as nucleases endógenas; e/ou inativar as enzimas endógenas como a peroxidase e a fosfatase alcalina. As nucleases endógenas podem ser inativadas por degradação com proteinase K, por tratamento térmico, uso de um agente quelante, tal como EDTA ou EGTA, pela introdução de DNA ou RNA veículo, tratamento com um caótropo, tal como ureia, tioureia, cloridrato de guanidina, tiocianato de guanidina, perclorato de lítio, etc., ou pirocarbonato de dietila. A fosfatase alcalina pode ser inativada por tratamento com HCl a 0,1 N por 5 minutos, na temperatura ambiente, ou tratamento com lev-amisol a 1 mM. A atividade da peroxidase pode ser eliminada por tratamento com 0,03% de peróxido de hidrogênio. A biotina endógena pode ser bloqueada impregnando-se a lâmina ou a seção em uma solução de avidina (estreptavidina, neutravidina pode ser substituída) por pelo menos 15 minutos, na temperatura ambiente. A lâmina ou a seção é então lavada por pelo menos 10 minutos, em tampão. Isto pode ser repetido pelo menos três vezes. Então a lâmina ou a seção é impregnada em uma solução de biotina por 10 minutos. Isto pode ser repetido pelo menos três vezes com uma solução de biotina nova, cada vez. O procedimento de lavagem em tampão é repetido. Os protocolos de bloqueio devem ser minimizados para impedir o dano da estrutura da célula ou do tecido ou do alvo ou dos alvos de interesse, porém um ou mais destes protocolos poderiam ser combinados para "bloquear" uma lâmina ou seção antes da reação com um ou mais aptâmeros de taxas de dissociação lentas. Ver Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, escrito por Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando Métodos de Espectrometria de Massa

[00224] Uma variedade de configurações de espectrômetros de massa pode ser usada para detectar valores de biomarcadores. Diversos tipos de espectrômetros de massa estão disponíveis ou podem ser produzidos com diversas configurações. Em geral, um espectrometro de massa tem os seguintes componentes principais: uma entrada da amostra, uma fonte de íons, um analisador de massa, um detector, um sistema a vácuo, e um sistema de controle do instrumento, e um sistema de dados. As diferenças na entrada da amostra, na fonte de íons, e no analisador de massa em geral definem o tipo de instrumento e as suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cromatografia líquida em coluna capilar ou pode ser uma sonda ou estágio direto, tal como usado na dessorção a laser assistida por matriz. As fontes de íons comuns são, por exemplo, eletropulverização, incluindo nanopulverização e micropulverização ou dessorção a laser assistida por matriz. Os analisadores de massa comuns incluem um filtro de massa quadrupolo, analisador de massa de captura de íons e analisador de massa por tempo de voo. Os métodos de espectrometria de massa adicionais são bastante conhecidos na técnica (ver Burlingame e col. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter e Sherman, Nova York (2000)).

[00225] Os biomarcadores de proteínas e os valores de biomarcadores podem ser detectados e medidos por quaisquer dos que seguem: espectrometria de massa por ionização por eletropulverização (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, espectrometria de massa por tempo de voo com ionização por dessorção a laser assistida por matriz (MALDI - TOF - MS), espectrometria de massa por tempo de voo com dessorção/ionização a laser intensificada na superfície (SELDI-TOF-MS), dessorção/ionização sobre silício (DIOS), espectrometria de massa de íons secundários (SIMS), tempo de voo em quadrupolo (Q-TOF), tecnologia de tempo de voo em série (TOF/TOF), chamada TOF/TOF ultraflex III, espectrometria de massa com ionização química por pressão atmosférica (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, espectrometria de massa por fotoionização por pressão atmosférica (APPI-MS), APPI-MS/MS, e APPI-(MS)N, espectrometria de massa em quadrupolo, espectrometria de massa por transformada de Fourier (FTMS), espectrometria de massa quantitativa, e espectrometria de massa por captura de íons.

[00226] São utilizadas estratégias de preparação da amostra para marcar e enriquecer as amostras antes da caracterização espectroscópica de massa dos biomarcadores de proteínas e da determinação dos valores de biomarcadores. Os métodos de marcação incluem, porém não estão limitados à marca isobárica para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) e marcação de isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC). Os reagentes de captura usados para enriquecer seletivamente as amostras para as proteínas biomarcadoras candidatas, antes da análise espectroscópica de massa, incluem, porém não estão limitados aos aptâmeros, anticorpos, sondas de ácidos nucléicos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento F(ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia simples, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples, um ácido nucléico, uma lectina, um receptor de ligação ao ligante, affybodies, nanocorpos, anquirinas, anticorpos de domínio, armações de anticorpos alternativas (por exemplo, diacorpos etc). polímeros gravados, avímeros, peptidomiméticos, peptóides, ácidos nucléicos de peptídeos, ácido nucléico de treose, um receptor de hormônio, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.

Determinação dos Valores de Biomarcadores usando um Ensaio de Ligação por Proximidade

[00227] Um ensaio de ligação por proximidade pode ser usado para determinar os valores de biomarcadores. Resumidamente, uma amostra de teste é contatada com um par de sondas de afinidade, que pode ser um par de anticorpos ou um par de aptâmeros, com cada membro do par estendido com um oligonucleotídeo. Os alvos para o par de sondas de afinidade podem ser dois determinados distintos sobre uma proteína ou um determinado sobre cada uma de duas proteínas diferentes, que podem existir como complexos homo- ou heteromultiméricos. Quando as sondas se ligam aos determinados alvo, as extremidades livres das extensões com oligonucleotídeos são colocadas em proximidade suficientemente íntima para hibridizar conjuntamente. A hibridização das extensões com oligonucleotídeos é facilitada por um oligonucleotídeo ligador comum que serve para unir conjuntamente as extensões com oligonucleotídeos quando elas estiverem posicionadas em proximidade suficiente. Assim que as extensões de oligonucleotídeos das sondas forem hibridizadas, as extremidades das extensões são unidas conjuntamente por ligação enzimática de DNA.

[00228] Cada extensão com oligonucleotídeo compreende um sítio de primer para a amplificação por PCR. Assim que as extensões com oligonucleotídeos forem ligadas conjuntamente, os oligonucleotídeos formam uma sequência de DNA contínua que, através de amplificação por PCR, revela informação referente à identidade e quantidade da proteína-alvo, bem como informação referente às interações de proteína-proteína em que os determinados-alvo estiverem sobre duas proteínas diferentes. A ligação por proximidade pode proporcionar um ensaio altamente sensível e específico para a informação da concentração e da interação da proteína em tempo real através do uso de PCR em tempo real. As sondas que não ligam os determinados de interesse não têm as extensões com oligonucleotídeos correspondentes colocadas em proximidade e nenhuma ligação ou amplificação por PCR pode ocorrer, resultando em nenhum sinal sendo produzido.

[00229] Os ensaios precedentes capacitam a detecção de valores de biomarcadores que são úteis nos métodos para diagnosticar o NSCLC, em que os métodos compreendem detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos N valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um biomarcador selecionado a partir do grupo que consiste nos biomarcadores proporcionados na Tabela 1, em que uma classificação, conforme descrita em detalhe abaixo, usando os valores de biomarcadores indica se o indivíduo tem NSCLC. Embora certos dos biomarcadores de NSCLC descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar o NSCLC, são também descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de NSCLC que são, cada um, úteis como um painel de três ou mais biomarcadores. Desse modo, diversas modalidades do presente pedido proporcionam combinações que compreendem N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-59 biomarcadores. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de quaisquer das faixas acima descritas, bem como faixas similares, porém de ordem superior. De acordo com quaisquer dos métodos descritos neste documento, os valores de biomarcadores podem ser detectados e classificados individualmente ou eles podem ser detectados e classificados coletivamente, como por exemplo, em um formato de ensaio multiplex.

[00230] Em outro aspecto, proporcionam-se métodos para detectar uma ausência de NSCLC, os métodos compreendendo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos N valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um biomarcador selecionado a partir do grupo que consiste nos biomarcadores proporcionados na Tabela 1, em que uma classificação, conforme descrita em detalhe abaixo, dos valores de biomarcadores indica uma ausência de NSCLC no indivíduo. Embora certos dos biomarcadores de NSCLC descritos sejam úteis sozinhos para detectar e diagnosticar a ausência de NSCLC, são também descritos neste documento métodos para o agrupamento de subgrupos múltiplos dos biomarcadores de NSCLC que são, cada um, úteis como um painel de três ou mais biomarcadores. Desse modo, diversas modalidades do presente pedido proporcionam combinações que compreendem N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-59 biomarcadores. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de quaisquer das faixas acima descritas, bem como faixas similares, porém de ordem superior. De acordo com quaisquer dos métodos descritos neste documento, os valores de biomarcadores podem ser detectados e classificados individualmente ou eles podem ser detectados e classificados coletivamente, como por exemplo, em um formato de ensaio multiplex.

Classificação dos Biomarcadores e Cálculo das Pontuações da Doença

[00231] Uma "assinatura" do biomarcador para um dado teste diagnóstico contém um conjunto de marcadores, cada marcador tendo diferentes níveis nas populações de interesse. Os diferentes níveis, neste contexto, podem referir-se às diferentes médias dos níveis dos marcadores para os indivíduos em dois ou mais grupos, ou às diferentes variâncias nos dois ou mais grupos, ou uma combinação de ambas.
Para a forma mais simples de um teste diagnóstico, estes marcadores podem ser usados para designar uma amostra desconhecida de um indivíduo para um de dois grupos, doentes ou não doentes. A designação de uma amostra para um de dois ou mais grupos é conhecida como classificação, e o procedimento usado para efetuar esta designação é conhecido como um classificador ou um método de classificação. Os métodos de classificação podem também ser referidos como métodos de pontuação. Existem muitos métodos de classificação que podem ser usados para construir um classificador diagnóstico a partir de um conjunto de valores de biomarcadores. Em geral, os métodos de classificação são mais facilmente efetuados usando técnicas de aprendizado supervisionado, em que um conjunto de dados é coletado usando amostras obtidas de indivíduos dentro de dois (ou mais, para as situações de classificações múltiplas) grupos distintos que se deseje distinguir. Uma vez que a classe (grupo ou população) à qual cada amostra pertence é conhecida antecipadamente para cada amostra, o método de classificação pode ser treinado para dar a resposta de classificação desejada. Também é possível usar técnicas de aprendizado não supervisionado para produzir um classificador diagnóstico.

[00232] As abordagens comuns para desenvolver classificadores diagnósticos incluem árvores de decisão; bagging, boosting, florestas e florestas aleatórias; aprendizado baseado em inferência da regra; Janelas de Parzen; modelos lineares; logística; métodos da rede neural; agrupamento não supervisionado; K-means; crescente/decrescente hierárquico; aprendizado semissupervisionado; métodos de protótipos; vizinho mais próximo; estimativa da densidade de núcleo (kernel); máquinas de vetor de suporte; modelos escondidos de Markov; Aprendizado de Boltzmann; e os classificadores podem ser combinados de forma simples ou em modos que minimizem funções objetivas particulares. Quanto a uma revisão, ver, por exemplo, Pattern Classification, R. O. Duda, e col., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também, The Elements of Statistical Learning -Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, e col., editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2a edição, 2009; cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

[00233] Para produzir um classificador usando as técnicas de aprendizado supervisionado, obtém-se um conjunto de amostras chamado dados de treinamento. No contexto de testes diagnósticos, o dado de treinamento inclui amostras dos grupos (classes) distintos para os quais as amostras desconhecidas posteriormente serão designadas. Por exemplo, as amostras coletadas de indivíduos em uma população de controle e de indivíduos em uma população de doença particular podem constituir dados de treinamento para desenvolver um classificador que pode classificar as amostras desconhecidas (ou, mais particularmente, os indivíduos de quem as amostras foram obtidas) como tendo a doença ou estando livres da doença. O desenvolvimento do classificador a partir dos dados de treinamento é conhecido como treinamento do classificador. Os detalhes específicos sobre o treinamento do classificador dependem da natureza da técnica de aprendizado supervisionado. Para os propósitos de ilustração, um exemplo de treinamento de um classificador naïve Bayesiano será descrito abaixo (ver, por exemplo, Pattern Classification, R. O. Duda, e col., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, e col., editores, Springer Science+Business Media, LLC, a edição, 2009).

[00234] Visto que tipicamente existem muito mais valores de biomarcadores potenciais do que amostras em um conjunto de treinamento, um cuidado deve ser usado para evitar o treinamento excessivo ("over-fitting"). O treinamento excessivo ocorre quando um modelo estatístico descreve erro ou ruído aleatório em vez da relação básica. O treinamento excessivo pode ser evitado em uma variedade de modos, incluindo, por exemplo, limitando-se o número de marcadores usados no desenvolvimento do classificador, assumindo-se que as respostas dos marcadores são independentes uma da outra, limitandose a complexidade do modelo estatístico básico empregado, e assegurando-se que o modelo estatístico básico conforma-se aos dados.

[00235] Um exemplo ilustrativo do desenvolvimento de um teste diagnóstico usando um conjunto de biomarcadores inclui a aplicação de um classificador naïve Bayes, um classificador probabilístico simples baseado no teorema de Bayes com tratamento independente severo dos biomarcadores. Cada biomarcador é descrito por uma função de densidade de probabilidade (pdf) dependente da classe para os valores de RFU medidos ou os valores de log de RFU (unidades de fluorescência relativa) em cada classe. As pdfs de união para o conjunto de marcadores em uma classe são assumidas serem o produto das pdfs dependentes da classe individuais para cada biomarcador. O treinamento do classificador naïve Bayes neste contexto corresponde a designar parâmetros ("parametrização") para caracterizar as pdfs dependentes da classe. Qualquer modelo básico para as pdes dependentes da classe pode ser usado, porém o modelo deve em geral conformar-se aos dados observados no conjunto de treinamento.

[00236] Especificamente, a probabilidade dependente da classe de medir um valor xi para o biomarcador i na classe de doença é escrita como p(xi|d) e a probabilidade naïve Bayes global de observar n marcadores com valores x̄ = (x1, x2, ....xn) é escrita como p(x̄|d) = ∏ni=1p(xi|d), em que os xis individuais são os níveis de biomarcadores medidos em RFU ou log de RFU. A designação da classificação para um desconhecido é facilitada calculando-se a probabilidade de estar doente p(d|x̄) tendo x̄ medido, comparada à probabilidade de estar livre da doença (controle) p(c|x̄) para os mesmos valores medidos. A razão destas probabilidades é computada a partir das pdfs dependentes da classe por aplicação do teorema de Bayes, isto é,

em que p(d) é o predomínio da doença na população apropriada para o teste. Obtendose o logaritmo de ambos os lados desta razão e substituindo-se as probabilidades dependentes da classe de Bayes do acima descrito, dá

Esta fórmula é conhecida como log da razão das probabilidades e simplesmente determina que o log da probabilidade de estar livre da doença particular versus ter a doença e é principalmente composta do somatório dos logs das razões das probabilidades individuais dos n biomarcadores individuais. Em sua forma mais simples, uma amostra desconhecida (ou, mais particularmente, o indivíduo de quem a amostra foi obtida) é classificada como estando livre da doença se a razão acima descrita for maior do que zero e tendo a doença se a razão for menor do que zero.

[00237] Em uma modalidade ilustrativa, as pdfs do biomarcador dependentes da classe p(xi|c) e p(xi|d) são assumidas serem distribuições normais ou log das distribuições normais nos valores de RFU medidos xi, isto é,

com uma expressão similar para p(xi|d) com µd e σd. A parametrização do modelo requer a estimativa de dois parâmetros para cada pdf dependente da classe, um µ médio e uma variância σ2, a partir dos dados de treinamento. Isto pode ser efetuado em diversos modos, incluindo, por exemplo, as estimativas de probabilidades máximas, por mínimos quadrados, e por quaisquer outros métodos conhecidos para alguém versado na técnica. A substituição das distribuições normais por µ e σ no log da razão das probabilidades definido acima dá a seguinte expressão:

[00238] Assim que um grupo de µs e σ2s tiver sido definido para cada pdf em cada classe a partir dos dados de treinamento e o predomínio da doença na população for especificado, o classificador Bayes é completamente determinado e pode ser usado para classificar amostras desconhecidas com valores medidos x̄.

[00239] O desempenho do classificador naïve Bayes é dependente do número e da qualidade dos biomarcadores usados para construir e treinar o classificador. Um único biomarcador desempenhará de acordo com a sua distância de KS (Kolmogorov-Smirnov), como definida no Exemplo 3, abaixo. Se um indicador do desempenho do classificador for definido como a área sob a curva característica de operação do receptor (AUC), um classificador perfeito terá uma pontuação de 1 e um classificador aleatório, em média, terá uma pontuação de 0,5. A definição da distância de KS entre dois grupos A e B de tamanhos n e m é o valor, Dn,m = supx|FA,n(x) - FB,m(x)|, que é a maior diferença entre duas funções de distribuição cumulativa (cdf) empíricas. A cdf empírica para um grupo A de n observações Xi é definida como,

em que IXi≤x é a função do indicador que é igual a 1 se Xi < x e é, normalmente, igual a 0. Por definição, este valor está ligado entre 0 e 1, em que uma distância de KS de 1 indica que as distribuições empíricas não se sobrepõem.

[00240] A adição dos marcadores subsequentes com boas distâncias de KS (>0,3, por exemplo) em geral melhorará o desempenho da classificação, se os marcadores subsequentemente adicionados forem independentes do primeiro marcador. Usando a área sob a curva ROC (AUC) como uma pontuação do classificador, é natural gerar muitos classificadores de pontuação muito alta como uma variação de um algoritmo guloso. (Um algoritmo guloso é qualquer algoritmo que segue o problema resolvendo a meta-heurística de fazer a escolha localmente ótima em cada estágio, com a esperança de encontrar o ótimo global).

[00241] A abordagem de algoritmo usada aqui é descrita em detalhe no Exemplo 4. Resumidamente, todos os classificadores de analitos individuais são gerados a partir de uma tabela de biomarcadores potenciais e adicionados a uma lista. A seguir, todas as adições possíveis de um segundo analito a cada um dos classificadores de analitos individuais armazenados são então efetuadas, armazenando um número predeterminado dos melhores pares de pontuação, quer dizer, por exemplo, mil, em uma nova lista. Todos os três classificadores de marcadores possíveis são explorados usando esta nova lista dos melhores classificadores de dois marcadores, novamente armazenando o melhor milhar destes. Este processo continua até a pontuação estabilizar-se ou começar a deteriorar-se à medida que marcadores adicionais forem adicionados. Estes classificadores de pontuação alta que permanecem após a convergência podem ser avaliados quanto ao desempenho desejado para um uso pretendido. Por exemplo, em uma aplicação diagnóstica, os classificadores com uma alta sensibilidade e uma especificidade modesta podem ser mais desejáveis do que uma sensibilidade modesta e uma especificidade alta. Em outra aplicação diagnóstica, os classificadores com uma alta especificidade e uma sensibilidade modesta podem ser mais desejáveis. O nível desejado de desempenho é, em geral, selecionado com base em uma escolha que deve ser feita entre o número de falsos positivos e falsos negativos que pode, cada um, ser tolerado para a aplicação diagnóstica particular. Tais escolhas em geral dependem das consequências médicas de um erro, falso positivo ou falso negativo.

[00242] Diversas outras práticas são conhecidas na técnica e podem ser empregadas para gerar muitos classificadores potenciais a partir de uma lista de biomarcadores usando um classificador naïve Bayes. Em uma modalidade, o que é referido como um algoritmo genético pode ser usado para combinar diferentes marcadores usando a pontuação de conveniência como definida acima. Os algoritmos genéticos são particularmente bem adequados para explorar uma grande população diversificada de classificadores potenciais. Em outra modalidade, a assim chamada otimização da colônica de formigas pode ser usada para gerar grupos de classificadores. Outras estratégias que são conhecidas na técnica podem também ser empregadas, incluindo, por exemplo, outras estratégias evolutivas, bem como o anelamento simulado e outros métodos de busca estocástica. Os métodos de metaheurística, tais como, por exemplo, a busca de harmonia, podem também ser empregados.

[00243] As modalidades ilustrativas utilizam qualquer número dos biomarcadores de NSCLC listados na Tabela 1 em diversas combinações para produzir testes diagnósticos para detectar o NSCLC (ver o Exemplo 2 quanto a uma descrição detalhada de como estes biomarcadores foram identificados). Em uma modalidade, um método para diagnosticar o NSCLC utiliza um método de classificação naïve Bayes em combinação com qualquer número dos biomarcadores de NSCLC listados na Tabela 1. Em um exemplo ilustrativo (Exemplo 3), o teste mais simples para detectar o NSCLC a partir de uma população de fumantes e nódulos pulmonares benignos pode ser construído usando um único biomarcador, por exemplo, o MMP7, que é diferencialmente expresso no NSCLC com uma distância de KS de 0,59.
Usando os parâmetros, µc,i, σc,i, µd,i, e σd,i para o MMP7 da Tabela 16 e a equação para o log da probabilidade descrita acima, um teste diagnóstico com uma AUC de 0,803 pode ser derivado, ver a Tabela 15. A curva ROC para este teste é mostrada na Figura 2.

[00244] A adição do biomarcador CLIC1, por exemplo, com uma distância de KS de 0,53, significativamente melhora o desempenho do classificador para uma AUC de 0,883. Observa-se que a pontuação para um classificador construído de dois biomarcadores não é uma simples soma das distâncias de KS; as distâncias de KS não são aditivas quando se combina os biomarcadores e leva muito mais marcadores fracos para atingir o mesmo nível de desempenho que um marcador forte. A adição de um terceiro marcador, STX1A, por exemplo, reforça o desempenho do classificador em uma AUC de 0,901. A adição de biomarcadores adicionais, tais como, por exemplo, CHRDL1, PA2G4, SERPINA1, BDNF, GHR, TGFB1, e NME2, produz uma série de testes do NSCLC resumidos na Tabela 15 e mostrada como uma série de curvas ROC na Figura 3. A pontuação dos classificadores como uma função do número de analitos usados na construção do classificador é mostrada na Figura 4. A AUC deste classificador de dez marcadores ilustrativo é 0,948.

[00245] Os marcadores listados na Tabela 1 podem ser combinados em muitos modos para produzir classificadores para diagnosticar o NSCLC. Em algumas modalidades, os painéis de biomarcadores são compreendidos de diferentes números de analitos dependendo de um critério específico de desempenho diagnóstico que for selecionado. Por exemplo, certas combinações de biomarcadores produzirão testes que são mais sensíveis (ou mais específicos) do que outras combinações.

[00246] Assim que um painel for definido para incluir um grupo particular de biomarcadores da Tabela 1 e um classificador for construído a partir de um conjunto de dados de treinamento, a definição do teste diagnóstico está completa. Em uma modalidade, o procedimento usado para classificar uma amostra desconhecida é resumido na Figura 1A. Em outra modalidade, o procedimento usado para classificar uma amostra desconhecida é resumido na Figura 1B. A amostra biológica é apropriadamente diluída e então corrida em um ou mais ensaios para produzir os níveis de biomarcadores quantitativos relevantes, usados para a classificação. Os níveis de biomarcadores medidos são usados como informações para o método de classificação que produz uma classificação e uma pontuação opcional para a amostra que reflete a segurança da designação da classe.

[00247] A Tabela 1 identifica 59 biomarcadores que são úteis para diagnosticar o NSCLC. Este é um número surpreendentemente maior do que esperado, quando comparado com o que é tipicamente verificado durante os esforços de descoberta de biomarcadores e pode ser atribuível à escala do estudo descrito, que incluiu mais de 1000 proteínas medidas em centenas de amostras individuais, em alguns casos em concentrações na faixa baixa de femtomolar. Presumivelmente, o número grande de biomarcadores descobertos reflete as vias bioquímicas variadas implicadas tanto na biologia do tumor quanto na resposta do corpo à presença do tumor; cada via e processo envolvem muitas proteínas. Os resultados mostram que nenhuma proteína individual de um pequeno grupo de proteínas é exclusivamente informativa sobre tais processos complexos; em vez disso, que múltiplas proteínas estão envolvidas nos processos relevantes, tais como a apoptose ou a restauração da matriz extracelular, por exemplo.

[00248] Dados os numerosos biomarcadores identificados durante o estudo descrito, esperaria ser capaz de derivar grandes números de classificadores de altos desempenhos que pudessem ser usados em diversos métodos diagnósticos. Para testar esta ideia, dezenas de milhares de classificadores foram avaliadas usando os biomarcadores na Tabela 1. Conforme descrito no Exemplo 4, muitos subgrupos dos biomarcadores apresentados na Tabela 1 podem ser combinados para gerar classificadores úteis. A título de exemplo, são proporcionadas descrições para os classificadores contendo 1, 2, e 3 biomarcadores para a detecção do NSCLC. Conforme descrito no Exemplo 4, todos os classificadores que foram construídos usando os biomarcadores da Tabela 1 desempenham distintamente melhor do que os classificadores que foram construídos usando "não marcadores".

[00249] O desempenho dos classificadores obtidos excluindo-se aleatoriamente alguns dos marcadores na Tabela 1, que resultou em menores subgrupos a partir dos quais se constrói os classificadores, foi também testado. Conforme descrito no Exemplo 4, os classificadores que foram construídos a partir de subgrupos aleatórios dos marcadores na Tabela 1 desempenharam similarmente aos classificadores ótimos que foram construídos usando a lista completa de marcadores na Tabela 1.

[00250] O desempenho dos classificadores de dez marcadores obtidos excluindo-se os "melhores" marcadores individuais a partir da agregação de dez marcadores foi também testado. Conforme descrito no Exemplo 4, os classificadores construídos sem os "melhores" marcadores na Tabela 4 também desempenharam bem. Muitos subgrupos dos biomarcadores listados na Tabela 1 desempenharam próximos a otimamente, mesmo após remover o top 15 dos marcadores listados na Tabela. Isto implica que as características de desempenho de qualquer classificador particular são provavelmente não devidas a algum grupo de núcleo pequeno de biomarcadores e que o processo da doença provavelmente impacta diversas vias bioquímicas, o que altera o nível de expressão de muitas proteínas.

[00251] Os resultados a partir do Exemplo 4 sugerem certas conclusões possíveis: Primeira, a identificação de um grande número de biomarcadores capacita a sua agregação em um vasto número de classificadores que oferecem um desempenho similarmente alto. Segunda, os classificadores podem ser construídos de modo tal que biomarcadores particulares possam ser substituídos por outros biomarcadores, em um modo que reflita as redundâncias que certamente impregnam as complexidades dos processos básicos da doença. Isto quer dizer, a informação sobre a doença contribuída por qualquer biomarcador individual identificado na Tabela 1 coincide com a informação contribuída por outros biomarcadores, de modo tal que pode ser que nenhum biomarcador ou grupo pequeno de biomarcadores particular na Tabela 1 possa ser incluído em qualquer classificador.

[00252] As modalidades ilustrativas utilizam classificadores naïve Bayes construídos a partir dos dados na Tabela 16 para classificar uma amostra desconhecida. O procedimento é resumido nas Figuras 1A e 1B. Em uma modalidade, a amostra biológica é opcionalmente diluída e corrida em um ensaio de aptâmero multiplexado. Os dados a partir do ensaio são normalizados e calibrados conforme resumido no Exemplo 3, e os níveis de biomarcadores resultantes são usados como informações para um esquema de classificação Bayes. O log da razão das probabilidades é computado para cada biomarcador medido individualmente e então somado para produzir uma pontuação de classificação final, que é também referida como uma pontuação diagnóstica. A designação resultante, assim como a pontuação de classificação global, pode ser descrita. Opcionalmente, o log dos fatores de risco da probabilidade individual computado para cada nível de biomarcador pode ser descrito também. Os detalhes do cálculo da pontuação de classificação são apresentados no Exemplo 3.

Kits

[00253] Qualquer combinação dos biomarcadores da Tabela 1 (assim como informação biomédica adicional) pode ser detectada usando um kit adequado, tal como para uso em efetuar os métodos divulgados neste documento. Além disso, qualquer kit pode conter uma ou mais marcas detectáveis conforme descritas neste documento, tais como uma porção fluorescente, etc.

[00254] Em uma modalidade, um kit inclui (a) um ou mais reagentes de captura (tais como, por exemplo, pelo menos um aptâmero ou anticorpo) para detectar um ou mais biomarcadores em uma amostra biológica, em que os biomarcadores incluem quaisquer dos biomarcadores apresentados na Tabela 1, e opcionalmente (b) um ou mais produtos de software ou programa de computador, para classificar o indivíduo de quem a amostra biológica foi obtida como tendo ou não tendo NSCLC ou para determinar a probabilidade que o indivíduo tenha NSCLC, como adicionalmente descrito neste documento. Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programa de computador, podem ser proporcionadas uma ou mais instruções para efetuar manualmente as etapas acima descritas por um ser humano.

[00255] A combinação de um suporte sólido com um reagente de captura correspondente e um material gerador de sinal é referida neste documento como um "dispositivo de detecção" ou "kit". O kit pode também incluir instruções para usar os dispositivos e os reagentes, manusear a amostra, e analisar os dados. Ademais, o kit pode ser usado com um sistema de computador ou software para analisar e descrever o resultado da análise da amostra biológica.

[00256] Os kits podem também conter um ou mais reagentes (por exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens, ou tampões) para processar uma amostra biológica. Quaisquer dos kits descritos neste documento podem também incluir, por exemplo, tampões, agentes de bloqueio, materiais de matriz de espectrometria de massa, agentes de captura de anticorpo, amostras de controle positivas, amostras de controle negativas, software e informação, tal como protocolos, orientação e dados de referência.

[00257] Em um aspecto, a invenção proporciona kits para a análise da posição de NSCLC. Os kits incluem primers de PCR para um ou mais biomarcadores selecionados a partir da Tabela 1. O kit pode adicionalmente incluir instruções para uso e correlação dos biomarcadores com o NSCLC. O kit pode também incluir um disposição de DNA contendo o complemento de um ou mais dos biomarcadores selecionados da Tabela 1, reagentes, e/ou enzimas para amplificar ou isolar o DNA da amostra. Os kits podem incluir reagentes para a PCR em tempo real, por exemplo, sondas TaqMan e/ou primers, e enzimas.

[00258] Por exemplo, um kit pode compreender (a) reagentes que compreendem pelo menos o reagente de captura para quantificar um ou mais biomarcadores em uma amostra de teste, em que os ditos biomarcadores compreendem os biomarcadores apresentados na Tabela 1, ou quaisquer outros biomarcadores ou painéis de biomarcadores descritos neste documento, e opcionalmente (b) um ou mais algoritmos ou programas de computador para efetuar as etapas de comparar a quantidade de cada biomarcador quantificado na amostra de teste com um ou mais pontos de corte predeterminados e designar uma pontuação para cada biomarcador quantificado com base na dita comparação, combinar as pontuações designadas para cada biomarcador quantificado para obter uma pontuação total, comparar a pontuação total com uma pontuação predeterminada, e utilizar a dita comparação para determinar se um indivíduo tem o NSCLC. Alternativamente, em vez de um ou mais algoritmos ou programas de computador, podem ser proporcionadas uma ou mais instruções para efetuar manualmente as etapas acima descritas por um ser humano.

Métodos e Software de Computador

[00259] Assim que um biomarcador ou painel de biomarcadores for selecionado, um método para diagnosticar um indivíduo pode compreender o que segue: 1) coletar ou de outro modo obter uma amostra biológica; 2) efetuar um método analítico para detectar e medir o biomarcador ou os biomarcadores no painel na amostra biológica; 3) efetuar qualquer normalização ou padronização de dados requerida para o método usado para coletar os valores de biomarcadores; 4) calcular a pontuação do marcador; 5) combinar as pontuações dos marcadores para obter uma pontuação diagnóstica total; e 6) descrever a pontuação diagnóstica do indivíduo. Nesta abordagem, a pontuação diagnóstica pode ser um único número determinado a partir da soma de todos os cálculos de marcadores, que é comparado com um valor limite predefinido que é uma indicação da presença ou da ausência da doença. Ou a pontuação diagnóstica pode ser uma série de barras que, cada uma, representa um valor de biomarcador e o padrão das respostas pode ser comparado com um padrão predefinido para a determinação da presença ou da ausência da doença.

[00260] Pelo menos algumas modalidades dos métodos descritos neste documento podem ser efetuadas com o uso de um computador. Um exemplo de um sistema de computador 100 é mostrado na Figura 6. Com referência à Figura 6, o sistema 100 é mostrado compreendido de elementos de hardware que estão eletricamente acoplados por meio do barramento 108, incluindo um processador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de saída 103, dispositivo de armazenamento 104, leitora de meio de armazenamento legível por computador 105a, sistema de comunicações 106 aceleração de processamento (por exemplo, DSP ou processadores de usos específicos) 107 e memória 109. A leitora de meio de armazenamento legível por computador 105a está adicionalmente acoplada ao meio de armazenamento legível por computador 105b, a combinação abrangentemente representando dispositivos de armazenamento remotos, locais, fixos e/ou removíveis mais meio de armazenamento, memória, etc. para temporariamente e/ou mais permanentemente conter informação legível por computador, que pode incluir o dispositivo de armazenamento 104, a memória 109 e/ou qualquer outro tal recurso de sistema 100 acessível. O sistema 100 também compreende elementos de software (mostrados como estando no presente momento localizados dentro da memória operacional 191), incluindo um sistema operacional 192 e outro código 193, tal como programas, dados e similares.

[00261] Com relação à Figura 6, o sistema 100 tem flexibilidade e configurabilidade extensas. Desse modo, por exemplo, uma única estrutura poderia ser utilizada para executar um ou mais servidores que possam ser adicionalmente configurados de acordo com os protocolos, as variações de protocolos, as extensões etc. atualmente desejáveis. Entretanto, será aparente para aqueles versados na técnica que as modalidades podem bem ser utilizadas de acordo com exigências de aplicação mais específicas. Por exemplo, um ou mais elementos do sistema poderiam ser executados como subelementos dentro de um componente do sistema 100 (por exemplo, dentro do sistema de comunicações 106). Um hardware personalizado poderia também ser utilizado e/ou elementos particulares poderiam ser executados no hardware, no software ou em ambos. Ademais, embora possa ser empregada uma conexão com outros dispositivos de computação, tais como os dispositivos de entrada/saída de rede (não mostrados), é para ser entendido que poderiam também ser utilizadas uma conexão ou conexões com fios, sem fios, com modem, e/ou outras conexões com outros dispositivos de computação.

[00262] Em um aspecto, o sistema pode compreender um banco de dados contendo aspectos dos biomarcadores característicos do NSCLC. O dado do biomarcador (ou a informação do biomarcador) pode ser utilizado como informações para o computador para uso como parte de um método executado por computador. Os dados dos biomarcadores podem incluir os dados conforme descritos neste documento.

[00263] Em um aspecto, o sistema adicionalmente compreende um ou mais dispositivos para proporcionar dados de entrada para um ou mais processadores.

[00264] O sistema adicionalmente compreende uma memória para armazenar um conjunto de dados de elementos de dados classificados.

[00265] Em outro aspecto, o dispositivo para proporcionar dados de entrada compreende um detector para detectar a característica do elemento de dados, por exemplo, tal como um espectrômetro de massa ou leitora de pedaço de gene.

[00266] O sistema adicionalmente pode compreender um sistema de gerenciamento de banco de dados. Os pedidos ou as consultas do usuário podem ser formatadas em uma linguagem apropriada, entendida pelo sistema de gerenciamento de banco de dados, que processa a consulta para extrair a informação relevante a partir do banco de dados dos grupos de treinamento.

[00267] O sistema pode ser conectável a uma rede á qual um servidor de rede e um ou mais clientes estão conectados. A rede pode ser uma rede local (LAN) ou uma rede de longa distância (WAN), conforme é conhecido na técnica. De preferência, o servidor inclui o hardware necessário para correr os produtos de programa de computador (por exemplo, software) para acessar os dados do banco de dados para processar as consultas do usuário.

[00268] O sistema pode incluir um sistema operacional (por exemplo, UNIX ou Linux) para executar as instruções de um sistema de gerenciamento de banco de dados. Em um aspecto, o sistema operacional pode operar em uma rede de comunicações global, tal como a internet, e utilizar um servidor de rede de comunicações global para conectar-se a tal rede.

[00269] O sistema pode incluir um ou mais dispositivos que compreendem uma interface gráfica da tela compreendendo elementos de interface, tais como botões, menus que se abrem ao serem clicados, barras de rolagem, campos para introduzir o texto, e similares, como são rotineiramente encontrados nas interfaces gráficas do usuário conhecidas na técnica. As consultas introduzidas em uma interface do usuário podem ser transmitidas para um programa aplicativo no sistema para a formação, para buscar quanto a uma informação relevante em um ou mais dos bancos de dados do sistema. Os pedidos ou as consultas introduzidas por um usuário podem ser construídas em qualquer linguagem adequada do banco de dados.

[00270] A interface gráfica do usuário pode ser gerada por um código de interface gráfica do usuário como parte do sistema operacional e pode ser usada para entrar com dados e/ou mostrar dados transmitidos. O resultado dos dados processados pode ser mostrado na interface, impresso em uma impressora em comunicação com o sistema, salvo em um dispositivo de memória, e/ou transmitido na rede ou pode ser fornecido na forma do meio legível por computador.

[00271] O sistema pode estar em comunicação com um dispositivo de entrada para proporcionar dados relativos aos elementos de dados para o sistema (por exemplo, valores de expressão). Em um aspecto, o dispositivo de entrada pode incluir um sistema de perfil de expressão do gene que inclui, por exemplo, um espectrômetro de massa, um pedaço de gene ou leitora de matriz, e similar.

[00272] Os métodos e os aparelhos para analisar a informação dos biomarcadores de NSCLC de acordo com as diversas modalidades podem ser executados em qualquer modo adequado, por exemplo, usando um programa de computador que opera em um sistema de computador. Pode ser usado um sistema de computador convencional compreendendo um processador e uma memória de acesso aleatório, tal como um servidor de aplicativo acessível remotamente, um servidor de rede, um computador pessoal ou uma estação de trabalho. Os componentes adicionais do sistema de computador podem incluir os dispositivos de memória ou os sistemas de armazenamento de informações, tais como um sistema de armazenamento de massa e uma interface do usuário, por exemplo, um monitor, um teclado e um dispositivo de rastreamento convencionais. O sistema de computador pode ser um sistema autónomo ou parte de uma rede de computadores, incluindo um servidor e um ou mais banco de dados.

[00273] O sistema de análise do biomarcador de NSCLC pode proporcionar funções e operações para a análise completa dos dados, tais como coleta de dados, processamento, análise, relato e/ou diagnose. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema de computador pode executar o programa de computador que pode receber, armazenar, buscar, analisar, e relatar a informação referente aos biomarcadores de NSCLC. O programa de computador pode compreender múltiplos módulos efetuando diversas funções ou operações, tais como um módulo de processamento para processar dados brutos e gerar dados suplementares e um módulo de análise para analisar os dados brutos e os dados suplementares para gerar uma situação e/ou uma diagnose de NSCLC. Diagnosticar a situação de NSCLC pode compreender gerar ou coletar qualquer outra informação, incluindo informação biomédica adicional, referente à condição do indivíduo em relação à doença, identificar se podem ser desejáveis mais testes, ou de outro modo avaliar a situação de saúde do indivíduo.

[00274] Com referência agora à Figura 7, pode ser visto um exemplo de um método de utilizar um computador de acordo com os princípios de uma modalidade divulgada. Na Figura 7, mostra-se um fluxograma 3000. No bloco 3004, a informação do biomarcador pode ser obtida para um indivíduo. A informação do biomarcador pode ser obtida de um banco de dados do computador, por exemplo, após ser efetuado o teste da amostra biológica do indivíduo. A informação do biomarcador pode compreender valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir de um grupo que consiste nos biomarcadores proporcionados na Tabela 1, em que N = 2-59. No bloco 3008, um computador pode ser utilizado para classificar cada um dos valores de biomarcadores. E, no bloco 3012, pode ser feita uma determinação quanto à probabilidade que um indivíduo tenha NSCLC com base em uma pluralidade de classificações. A indicação pode ser transmitida para uma tela ou outro dispositivo indicador, de modo que ela seja visualizável por uma pessoa. Desse modo, por exemplo, ela pode ser mostrada sobre uma tela de vídeo de um computador ou outro dispositivo de saída.

[00275] Com referência agora à Figura 8, pode ser ilustrado por meio do fluxograma 3200 um método alternativo de utilizar um computador de acordo com outra modalidade. No bloco 3204, um computador pode ser utilizado para obter a informação do biomarcador para um indivíduo. A informação do biomarcador compreende um valor de biomarcador correspondendo a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1. No bloco 3208, pode ser efetuada uma classificação do valor de biomarcador com o computador. E, no bloco 3212, pode ser feita uma indicação quanto à probabilidade que o indivíduo tenha NSCLC com base na classificação. A indicação pode ser transmitida para uma tela ou outro dispositivo indicador, de modo que ela seja visualizável por uma pessoa. Desse modo, por exemplo, ela pode ser mostrada sobre uma tela de vídeo de um computador ou outro dispositivo de saída.

[00276] Algumas modalidades descritas neste documento podem ser efetuadas de modo a incluir um produto de programa de computador. Um produto de programa de computador pode incluir um meio legível por computador tendo um código de programa legível por computador incorporado no meio, para fazer com que um programa aplicativo execute em um computador com um banco de dados.

[00277] Conforme usado neste documento, um "produto de programa de computador" refere-se a um conjunto organizado de instruções na forma de declarações de linguagem naturais ou de programação que estão contidas em um meio físico de qualquer natureza (por exemplo, escrito, eletrônico, magnético, óptico ou em outros contextos) e que podem ser usadas com um computador ou outro sistema de processamento de dados automatizado. Tais declarações de linguagem de programação, quando executadas por um computador ou um sistema de processamento de dados, fazem com que o computador ou o sistema de processamento de dados atue de acordo com o conteúdo particular das declarações. Os produtos de programa de computador incluem, sem limitação: os programas em código fonte e objeto e/ou as bibliotecas de testes ou de dados incorporadas em um meio legível por computador. Ademais, o produto de programa de computador que capacita um sistema de computador ou dispositivo de equipamento de processamento de dados de atuar nos modos préselecionados pode ser proporcionado em diversas formas, incluindo, porém não limitadas ao código fonte original, código em assembly, código objeto, linguagem da máquina, versões criptografadas ou comprimidas dos precedentes e quaisquer equivalentes.

[00278] Em um aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende valores de biomarcadores que, cada um, correspondam a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1, em que N = 2-59; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de NSCLC do indivíduo como uma função dos valores de biomarcadores.

[00279] Ainda em outro aspecto, proporciona-se um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de NSCLC. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que inclui um código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que obtém dado atribuído a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o dado compreende um valor de biomarcador que corresponda a um biomarcador na amostra biológica, selecionado a partir do grupo de biomarcadores proporcionados na Tabela 1; e código que executa um método de classificação que indica uma situação de NSCLC do indivíduo como uma função do valore de biomarcador.

[00280] Embora diversas modalidades tenham sido descritas como métodos ou aparelhos, deve ser entendido que as modalidades poderiam ser executadas através de código acoplado com um computador, por exemplo, código residente em um computador ou acessível pelo computador. Por exemplo, podem ser utilizados software e banco de dados para executar muitos dos métodos discutidos acima. Desse modo, além das modalidades efetuadas por hardware, observase também que estas modalidades podem ser efetuadas através do uso de um artigo de manufatura compreendido de um meio utilizável por computador tendo um código de programa legível por computador incluído nele, o que causa a capacitação das funções divulgadas nesta descrição. Portanto, deseja-se que as modalidades também sejam consideras protegidas por esta patente em seu meio de código de programa também. Ademais, as modalidades podem ser concretizadas como código armazenado em uma memória legível por computador de virtualmente qualquer tipo, incluindo, sem limitação, RAM, ROM, meio magnético, meio óptico, ou meio magneto-óptico. Ainda de modo mais geral, as modalidades poderiam ser executadas em software, ou em hardware, ou qualquer combinação deles, incluindo, porém não limitado ao software que corre em um processador de uso geral, microcódigo, PLAs, ou ASICs.

[00281] Também se considera que as modalidades possam ser efetuadas como sinais de computador incorporados em uma onda veículo, bem como sinais (por exemplo, elétricos e ópticos) propagados através de um meio de transmissão. Desse modo, os diversos tipos de informação discutidos acima poderiam ser formatados em uma estrutura, tal como uma estrutura de dados, e transmitidos como um sinal elétrico através de um meio de transmissão ou armazenados em um meio legível por computador.

[00282] Observa-se também que muitas das estruturas, materiais, e atos citados neste documento podem ser citados como meios para efetuar uma função ou etapa para efetuar uma função. Portanto, deve ser entendido que tal linguagem é designada para cobrir todas as tais estruturas, materiais, ou atos divulgados dentro deste relatório descritivo e seus equivalentes, incluindo a matéria incorporada por referência.

[00283] O processo de identificação do biomarcador, a utilização dos biomarcadores divulgados neste documento, e os diversos métodos para determinar os valores de biomarcadores são descritos em detalhe acima com relação ao NSCLC. Entretanto, a aplicação do processo, o uso de biomarcadores identificados, e os métodos para determinar os valores de biomarcadores são totalmente aplicáveis a outros tipos específicos de câncer, ao câncer em geral, a qualquer outra doença ou condição médica, ou à identificação de indivíduos que possam ser beneficiados ou não por um tratamento médico de apoio. Exceto quando se referindo a resultados específicos relacionados ao NSCLC, conforme está claro a partir do contexto, as referências aqui contidas ao NSCLC podem ser entendidas incluírem outros tipos de câncer, o câncer em geral, ou qualquer outra doença ou condição médica.

EXEMPLOS

[00284] Os exemplos a seguir são proporcionados para propósitos ilustrativos somente e não são pretendidos para limitar o escopo do pedido conforme definido pelas reivindicações em anexo. Todos os exemplos descritos neste documento foram realizados usando práticas padrões, que são bem conhecidas e de rotina para aqueles de habilidade na técnica. As práticas de biologia molecular de rotina descritas nos exemplos a seguir podem ser realizadas conforme descrito em manuais de laboratórios padrões, tais como Sambrook e col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Exemplo 1. Análise Multiplexada dos Aptâmeros das Amostras

[00285] Este exemplo descreve o ensaio de aptâmero multiplex usado para analisar as amostras e os controles, para a identificação dos biomarcadores apresentados na Tabela 1 (ver a Figura 9) e a identificação dos biomarcadores de câncer apresentados na Tabela 19. Para os estudos de NSCLC, mesotelioma, e carcinoma de células renais, a análise multiplexada utilizou 1.034 aptâmeros, cada um único para um alvo específico.

[00286] Neste método, as pontas das pipetas foram trocadas para cada adição de solução.

[00287] Também, salvo indicação em contrário, a maior parte das transferências das soluções e das adições de lavagem usou o topo de 96 poços de um Beckman Biomek FxP. As etapas dos métodos pipetadas manualmente usaram um P200 Pipetteman de doze canais (Rainin Instruments, LLC, Oakland, CA), salvo indicação em contrário. Um tampão personalizado, referido como SB17, foi preparado localmente, compreendendo 40 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA em pH 7,5. Um tampão personalizado, referido como SB18, foi preparado localmente, compreendendo 40 mM de HEPES, 100 de mM NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 em pH 7,5. Todas as etapas foram efetuadas na temperatura ambiente, salvo indicação em contrário.

Preparação da Solução de Estoque de Aptâmeros

[00288] As soluções de aptâmeros de estoque personalizadas, para 5%, 0,316% e 0,01% de soro, foram preparadas em concentração de 2x em 1x SB17, 0,05% de Tween-20.

[00289] Estas soluções são armazenadas a -20°C até o uso. No dia do ensaio, cada mistura de aptâmeros foi descongelada a 37°C por 10 minutos, colocada em um banho-maria fervente por 10 minutos e deixada esfriar até 25°C por 20 minutos, com mistura vigorosa entre cada etapa de aquecimento. Após aquecer-esfriar, 55 µL de cada mistura de 2x aptâmeros foi manualmente pipetada para uma placa Hybaid de 96 poços e a chapa da placa vedada. O resultado final foi três placas Hybaid com chapa vedada, de 96 poços, com misturas de 5%, 0,316% ou 0,01% de aptâmeros. A concentração individual do aptâmero era 2x o final ou 1 nM.

Preparação da Amostra de Ensaio

[00290] As alíquotas congeladas de 100% de soro ou plasma, armazenadas a -80°C, foram colocadas em banho-maria a 25°C por 10 minutos. As amostras descongeladas foram colocadas sobre gelo, redemoinhadas suavemente (ajustar em 4) por 8 segundos e então repostas sobre gelo.

[00291] Uma solução a 10% de amostra (2x o final) foi preparada transferindo-se 8 µL de amostra, usando uma pipeta de abrangência de 8 canais de 50 µL, para placas Hybaid de 96 poços, cada poço contendo 72 µL do diluente da amostra apropriado a 4°C (1x SB17 para o soro ou 0,8x SB18 para o plasma, mais 0,06% de Tween-20,11,1 μΜ de bloco Z_2, 0,44 mM de MgCl2, 2,2 mM de AEBSF, 1,1 mM de EGTA, 55,6 μΜ de EDTA). Esta placa foi armazenada sobre gelo até as etapas de diluição das amostras seguintes serem iniciadas no robô BiomekFxP.

[00292] Para começar o equilíbrio da amostra e dos aptâmeros, a placa com 10% de amostra foi brevemente centrifugada e colocada sobre o Beckman FX, em que ela foi misturada pipetando-se para cima e para baixo com a pipeta de 96 poços. Uma placa de 0,632% de amostra (2x o final) foi então preparada diluindo-se 6 µL da amostra a 10% em 89 µL de 1xSB17, 0,05% de Tween-20 com 2 mM de AEBSF. A seguir, a diluição de 6 µL da amostra a 0,632% resultante em 184 µL de 1xSB17, 0,05% de Tween-20 fez uma placa de amostra a 0,02% (2x o final). As diluições foram feitas no Beckman Biomek FxP. Após cada transferência, as soluções foram misturadas pipetando-se para cima e para baixo. As 3 placas de diluição da amostra foram então transferidas para as suas soluções de aptâmeros respectivas adicionando-se 55 µL da amostra a 55 µL da mistura de aptâmeros 2x apropriada. As soluções de amostra e aptâmeros foram misturadas no robô pipetando-se para cima e para baixo.

Ligação de Equilíbrio da Amostra

[00293] As placas de amostra/aptâmeros foram vedadas com folha metálica e colocadas em uma incubadora a 37°C por 3,5 horas, antes de prosseguirem para a etapa de Captura 1.

Preparação da placa de glóbulos de Captura 2

[00294] Uma alíquota de 11 mL de glóbulos de Estreptavidina C1 MyOne (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) (10 mg/mL) foi lavada 2 vezes com volumes iguais de 20 mM de NaOH (incubação por 5 minutos para cada lavagem), 3 vezes com volumes iguais de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 e suspensa novamente em 11 mL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20. Usando uma pipeta de múltiplos canais de extensão 12, 50 µL desta solução foram manualmente pipetados para cada poço de uma placa Hybaid de 96 poços. A placa foi então coberta com folha metálica e armazenadas a 4°C para uso no ensaio.

Preparação da placa de glóbulos de Captura 1

[00295] Três placas Millipore HV de 0,45 µm (membrana Durapore, Cat. no. MAHVN4550) foram equilibradas com 100 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 por pelo menos 10 minutos. O tampão de equilíbrio foi então filtrado através da placa e 133,3 µL de uma pasta semifluida de glóbulos de estreptavidina-agarose a 7,5% (em 1x SB17, 0,05% de Tween-20) foram adicionados a cada poço. Para manter os glóbulos de estreptavidina-agarose suspensos enquanto os transferia para a placa de filtro, a solução de glóbulos foi manualmente misturada com uma pipeta de 12 canais, de 200 µL, pelo menos 6 vezes entre as ocorrências de pipetagem. Após os glóbulos serem distribuídos através das 3 placas de filtro, um vácuo foi aplicado para remover o sobrenadante do glóbulo. Finalmente, os glóbulos foram lavados nas placas de filtro com 200 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 e então suspensos novamente em 200 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20. Os fundos das placas de filtro foram raspados e as placas armazenadas para uso no ensaio.

Carregamento do Cytomat

[00296] O cytomat foi carregado com todas as pontas, placas, todos os reagentes em cubas (exceto o reagente de NHS-biotina que foi preparado fresco exatamente antes da adição às placas), 3 placas de filtro de Captura 1 preparadas e 1 placa MyOne preparada.

Captura 1

[00297] Após um tempo de equilíbrio de 3,5 horas, as placas de amostra/aptâmeros foram removidas da incubadora, centrifugadas por cerca de 1 minuto, tiveram a cobertura removida, e foram colocadas sobre o deck do Beckman Biomek FxP. O programa do Beckman Biomek FxP foi iniciado. Todas as etapas subsequentes na Captura 1 foram efetuadas pelo robô do Beckman Biomek FxP, salvo observação em contrário. Dentro do programa, o vácuo foi aplicado às placas de filtro de Captura 1 para remover o sobrenadante do glóbulo. Cem microfiltros de cada uma das reações de ligação de equilíbrio a 5%, 0,316% e 0,01% foram adicionados às suas placas de filtração de Captura 1 respectivas e cada placa foi misturada usando um agitador orbital sobre o deck a 800 rpm por 10 minutos.

[00298] A solução não ligada foi removida por meio de filtração a vácuo. Os glóbulos de Captura 1 foram lavados com 190 μL de 100 μΜ de biotina em 1x SB17, 0,05% de Tween-20, seguidos por 5x 190 μL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 distribuindo-se a solução e imediatamente causando um vácuo para filtrar a solução através da placa.

Marcação

[00299] Uma alíquota de 100 mM de NHS-PEO4-biotina em DMSO anidro foi descongelada a 37°C por 6 minutos e então diluída 1:100 com tampão de marcação (SB17 em pH 7,25, 0,05% de Tween-20). Com o prompt de um robô, o reagente de NHS-PEO4-biotina diluído foi manualmente adicionado a uma cuba sobre deck e o programa do robô foi manualmente reiniciado para distribuir 100 µL do NHS-PEO4-biotina para cada poço de cada placa de filtro de Captura 1. Esta solução foi deixada incubar com os glóbulos de Captura 1 agitando-se a 800 rpm por 5 minutos sobre os agitadores orbitais.

Estimulação Cinética e Fotoclivagem

[00300] A reação de marcação foi removida por filtração a vácuo e finalizada pela adição de 150 µL de 20 mM de glicina em 1x SB17, 0,05% de Tween-20 às placas de Captura 1. A solução de marca de NHS/glicina foi removida por meio de filtração a vácuo. A seguir, 1500 µL de 20 mM de glicina (1x SB17, 0,05% de Tween-20) foram adicionados a cada placa e incubados por 1 minuto sobre agitadores orbitais a 800 rpm, antes da remoção por filtração a vácuo.

[00301] Os poços das placas de Captura 1 foram subsequentemente lavados três vezes por adição de 190 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween20, seguida por filtração a vácuo e então por adição de 190 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20, com agitação por 1 minuto, a 800 rpm, seguida por filtração a vácuo. Após a última lavagem, as placas foram colocadas sobre o topo de uma placa de poços profundos de 1 mL e removidas do deck. As placas de Captura 1 foram centrifugadas a 1000 rpm por 1 minuto para remover tanto quanto possível de volume insignificante dos glóbulos de agarose, antes da eluição.

[00302] As placas foram colocadas de volta ao Beckman Biomek FxP e 85 µL de 10 mM de DxSO4 em 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foram adicionados a cada poço das placas de filtro.

[00303] As placas de filtro foram removidas do deck, colocadas sobre um Termoagitador Variomag (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) sob as fontes de luz BlackRay (Ted Pella, Inc., Redding, CA), e irradiadas por 5 minutos enquanto se agitava a 800 rpm. Após a incubação por 5 minutos, as placas foram giradas 180 graus e irradiadas com agitação por 5 minutos mais.

[00304] As soluções fotoclivadas foram sequencialmente eluídas a partir de cada placa de Captura 1 para uma placa de poços profundos comum, colocando-se primeiramente a placa de filtro de Captura 1 a 5% sobre o topo de uma placa de poços profundos de 1 mL e centrifugandose a 1000 rpm por 1 minuto. As placas de Captura 1 a 0,316% e 0,01% foram então sequencialmente centrifugadas para a mesma placa de poços profundos.

Captura dos glóbulos de Captura 2

[00305] O bloco do poço profundo de 1 mL contendo os eluatos combinados da Captura 1 foi colocado sobre o deck do Beckman Biomek FxP para a Captura 2.

[00306] O robô transferiu todo o eluato fotoclivado da placa de poços profundos de 1 mL para a placa Hybaid contendo os glóbulos magnéticos MyOne de Captura 2 previamente preparados (após a remoção do tampão MyOne por meio da separação magnética).

[00307] A solução foi incubada enquanto se agitava a 1350 prm por 5 minutos, a 25°C, sobre um Termoagitador Variomag (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA).

[00308] O robô transferiu a placa para a estação do separador magnético sobre deck. A placa foi incubada sobre o magneto por 90 segundos, antes da remoção e do descarte do sobrenadante.

Lavagens com glicerol a 30%, a 37°C

[00309] A placa de Captura 2 foi movida para o agitador térmico sobre o deck e 75 µL de 1x SB 17, 0,05% de Tween-20 foram transferidos para cada poço. A placa foi misturada por 1 minuto a 1350 rpm e 37°C para suspender novamente e aquecer os glóbulos. Para cada poço da placa de Captura 2, 75 µL de glicerol a 60%, a 37°C, foram transferidos e a placa continuou a mistura por outro minuto a 1350 rpm e 37°C. O robô transferiu a placa para o separador magnético a 37°C, em que ela foi incubada sobre o magneto por 2 minutos, e então o robô removeu e descartou o sobrenadante. Estas lavagens foram repetidas duas vezes mais.

[00310] Após a remoção da terceira lavagem com glicerol a 30% dos glóbulos de Captura 2, 150 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foram adicionados a cada poço e incubados a 37°C, agitando-se a 1350 rpm por 1 minuto, antes da remoção por separação magnética sobre o magneto a 37°C.

[00311] Os glóbulos de Captura 2 foram lavados uma vez final usando 150 µL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20, com incubação por 1 minuto enquanto se agitava a 1350 rpm, a 25°C, antes da separação magnética.

Eluição e Neutralização dos Glóbulos de Captura 2

[00312] Os aptâmeros foram eluídos dos glóbulos de Captura 2 por adição de 105 µL de 100 mM de CAPSO com 1 M de NaCl, 0,05% de Tween-20 a cada poço. Os glóbulos foram incubado com esta solução, com agitação a 1300 rpm, por 5 minutos.

[00313] A placa de Captura 2 foi então colocada sobre o separador magnético por 90 segundos, antes de transferir 63 µL do eluato para uma nova placa de 96 poços contendo 7 µL de 500 mM de HCl, 500 mM de HEPES, 0,05% de Tween-20 em cada poço. Após a transferência, a solução foi misturada roboticamente pipetando-se 60 µL para cima e para baixo, cinco vezes.

Hibridização

[00314] O Beckman Biomek FxP transferiu 20 µL do eluato de Captura 2 neutralizado para uma placa Hybaid nova, e 6 µL de 10x Bloco Agilent, contendo um reforço de 10x de controles de hibridização, foram adicionados a cada poço. A seguir, 30 µL de 2x tampão de Hibridização Agilent foram manualmente pipetados para cada poço da placa contendo as amostras neutralizadas e o tampão de bloqueio e a solução foi misturada pipetando-se manualmente 25 µL para cima e para baixo, 15 vezes, lentamente, para evitar a formação extensa de bolhas. A placa foi girada a 1000 rpm por 1 minuto.

[00315] As lâminas da microdisposição Agilent personalizadas (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) foram projetadas para conter sondas complementares à região aleatória do aptâmero mais alguma região do primer. Para a maior parte dos aptâmeros, o comprimento ótimo da sequência complementar foi empiricamente determinado e variou entre 40-50 nucleotídeos. Para os aptâmeros posteriores, uma região complementar de 46 meros foi escolhida por padrão. As sondas foram ligadas à superfície da lâmina com um ligador poli-T para um comprimento de sonda total de 60 nucleotídeos.

[00316] Uma lâmina de vedação foi colocada em uma câmara de hibridização Agilent e 40 µL de cada uma das amostras contendo solução de hibridização e bloqueio foram manualmente pipetados para cada vedação. Uma pipeta de extensão variável com canal em S foi usada em um modo pretendido para minimizar a formação de bolhas. As lâminas do microdisposição Agilent personalizadas (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, C A), com seu Código de Barra de Número virado para cima, foram então lentamente abaixadas sobre as lâminas de vedação (ver o manual da Agilent quanto à descrição detalhada).

[00317] A superfície superior das câmaras de hibridização foi colocada sobre o sanduiche de lâmina/revestimento e lâmina de suporte de fixação sobre a estrutura inteira. Estas estruturas foram fixadas firmemente girando as roscas com firmeza.

[00318] Cada sanduiche de lâmina/lâmina de revestimento foi visualmente inspecionado para assegurar que a bolha da solução poderia mover-se livremente dentro da amostra. Se a bolha não se movesse livremente, a estrutura da câmara de hibridização era suavemente agitada para desprender as bolhas presas próximas à vedação.

[00319] As câmaras de hibridização montadas foram incubadas em um forno de hibridização Agilent por 19 horas, a 60°C, girando a 20 rpm.

Lavagem Pós-Hibridização

[00320] Aproximadamente 400 mL de Tampão de Lavagem Agilent 1 foram colocados em cada uma das duas placas de coloração de vidro separadas. Uma das placas de coloração foi colocada sobre uma placa de agitação magnética, e um porta-lâminas e uma barra de agitação foram colocados no tampão.

[00321] Uma placa de coloração para a Lavagem Agilent 2 foi preparada colocando-se uma barra de agitação em uma placa de coloração de vidro vazia.

[00322] Uma quarta placa de coloração de vidro foi reservada para a lavagem final com acetonitrila.

[00323] Cada uma das seis câmaras de hibridização foi desmontada. Um por um, o sanduiche de lâmina/revestimento foi removido de sua câmara de hibridização e afundado na placa de coloração contendo a Lavagem 1. O sanduiche de lâmina/revestimento foi arrancado separadamente usando um par de pinças, enquanto ainda se afundava a lâmina da microdisposição. A lâmina foi rapidamente transferida para o porta-lâminas na placa de coloração de Lavagem 1 sobre a placa de agitação magnética.

[00324] O porta-lâminas foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em um ajuste baixo e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[00325] Quando estava restando um minuto para a Lavagem 1, o Tampão de Lavagem 2, preaquecido para 37°C em uma incubadora, foi adicionado à segunda placa de coloração preparada. O porta-lâminas foi rapidamente transferido para o Tampão de Lavagem 2 e qualquer tampão em excesso sobre a parte inferior da prateleira foi removido raspando-o sobre a superfície superior da lâmina de coloração. O portalâminas foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em um ajuste baixo e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[00326] O porta-lâminas foi lentamente retirado da Lavagem 2, levando aproximadamente 15 segundos para remover as lâminas da solução.

[00327] Com um minuto restando na Lavagem 2, a acetonitrila (ACN) foi adicionada à quarta placa de coloração. O porta-lâminas foi transferido para a placa de coloração com acetonitrila. O porta-lâminas foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em um ajuste baixo e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[00328] O porta-lâminas foi lentamente retirado da placa de coloração com ACN e colocado sobre uma toalha absorvente. As bordas do fundo das lâminas foram rapidamente secadas e a lâmina foi colocada em uma caixa de lâminas limpa.

Imageamento da Microdisposição

[00329] As lâminas da microdisposição foram colocadas nos suportes de lâminas do scanner Agilent e carregadas para o Scanner de microdisposições Agilent de acordo com as instruções dos fabricantes.

[00330] As lâminas foram representadas por imagens no canal Cy3 em resolução de 5 µm no ajuste do PMT de 100% e a opção XRD ativada a 0,05. As imagens resultantes tiff foram processadas usando o software de extração de recurso Agilent, versão 10.5.

Exemplo 2. Identificação do Biomarcador

[00331] A identificação dos biomarcadores de NSCLC potenciais foi efetuada para a diagnose do NSCLC em indivíduos com nódulos pulmonares indeterminados, identificados com uma varredura por CT ou outro método de imageamento, o exame dos fumantes de alto risco quanto ao NSCLC, e diagnose de um indivíduo com NSCLC. Os critérios de inscrição para este estudo eram fumantes, idade de 18 ou mais, capazes de darem consentimento informado, e amostra de sangue e diagnose documentada de NSCLC ou resultados benignos. Para os casos, amostras de sangue coletadas antes do tratamento ou da cirurgia e subsequentemente diagnosticadas com NSCLC. Os critérios de exclusão incluíram diagnose ou tratamento anterior de câncer (excluindo o carcinoma de células escamosas da pele) dentro de 5 anos da extração de sangue. As amostras de soro foram coletadas de 3 locais diferentes e incluíram 46 amostras de NSCLC e 218 amostras do grupo de controle, conforme descrito na Tabela 17. O ensaio de afinidade do aptâmero multiplexado, como descrito no Exemplo 1, foi usado para medir e registrar o valor de RFU para 1.034 analitos em cada uma destas 264 amostras.

[00332] Cada uma das populações de caso e controle foi separadamente comparada gerando-se funções de distribuição cumulativa (cdfs) dependentes da classe para cada um dos 1.034 analitos. A distância de KS (estatística de Kolmogorov-Smirnov) entre os valores de dois conjuntos de amostras é uma medição não paramétrica do grau no qual a distribuição empírica dos valores de um grupo (Grupo A) difere da distribuição de valores do outro grupo (Grupo B). Para qualquer valor de um limite T, alguma proporção dos valores do Grupo A será menor do que T, e alguma proporção dos valores do Grupo B será menor do que T. A distância de KS mede a diferença máxima (sem sinal) entre a proporção dos valores dos dois grupos para qualquer escolha de T.

[00333] Este grupo de biomarcadores potenciais pode ser usado para construir classificadores que designam amostras para um grupo de controle ou de doença. Na realidade, muitos tais classificadores foram produzidos a partir destes grupos de biomarcadores e a frequência com a qual qualquer biomarcador foi usado em bons classificadores de pontuação determinada. Estes biomarcadores que ocorreram mais frequentemente entre os classificadores de pontuação top foram os mais úteis para criar um teste diagnóstico. Neste exemplo, os classificadores Bayesianos foram usados para explorar o espaço de classificação, porém muitas outras técnicas de aprendizado supervisionado podem ser empregadas para este propósito. A capacidade de pontuação de qualquer classificador individual foi medida pela área sob a curva característica de operação do receptor (AUC da ROC) do classificador na superfície Bayesiana, assumindo um predomínio da doença de 0,5. Este indicador de pontuação varia de zero a um, com um sendo um classificador sem erro. Os detalhes da construção de um classificador Bayesiano a partir das medições das populações de biomarcadores são descritos no Exemplo 3.

[00334] Usando os 59 analitos na Tabela 1, um total de 964 classificadores de 10 analitos foi encontrado com uma AUC de 0,94 para diagnosticar o NSCLC do grupo de controle. A partir deste grupo de classificadores, um total de 12 biomarcadores foi verificado estar presente em 30% ou mais dos classificadores de pontuação altos. A Tabela 13 proporciona uma lista destes biomarcadores potenciais e a Figura 10 é um gráfico da frequência para os biomarcadores identificados.

Exemplo 13. Classificação Naïve Bayesiana para o NSCLC

[00335] A partir da lista de biomarcadores identificados como úteis para a diferenciação entre o NSCLC e os controles, um painel de dez biomarcadores foi selecionado e um classificador naïve Bayes foi construído, ver as Tabelas 16 e 18. As funções de densidade de probabilidade (pdfs) dependentes da classe p(xi|c) e p(xi|d), em que xi é o log do valor de RFU medido para o biomarcador i, e c e d referemse às populações de controle e de doença, foram modeladas como funções do log das distribuições normais, caracterizadas por um µ médio e uma variância σ2. Os parâmetros para as pdfs dos dez biomarcadores são listados na Tabela 16 e um exemplo do dado bruto juntamente com a adaptação do modelo a uma pdf normal é mostrado na Figura 5. A suposição básica parece adaptar os dados muito bem, conforme evidenciado pela Figura 5.

[00336] A classificação naïve Bayes para tal modelo é dada pela equação a seguir, em que p(d) é o predomínio da doença na população,

apropriado para o teste e n = 10. Cada um dos termos no somatório é um log da razão das probabilidades para um marcador individual e o log da razão das probabilidades total de uma amostra x̄ estando livre da doença de interesse (isto é, neste caso, o NSCLC) versus tendo a doença é simplesmente o somatório destes termos individuais mais um termo que é responsável pelo predomínio da doença. Por simplicidade, é assumido p(d) = 0,5, de modo que

[00337] Dada uma medição da amostra desconhecida em log(RFU) para cada um dos dez biomarcadores de 6,9, 8,7, 7,9, 9,8, 8,4, 10,6, 7,3, 6,3, 7,3, 8,1, o cálculo da classificação é detalhado na Tabela 16. Os componentes individuais compreendendo o log da razão das probabilidades para a doença versus a classe de controle são tabelados e podem ser computados a partir dos parâmetros na Tabela 16 e dos valores de x̄ . O somatório dos logs das razões das probabilidades individuais é -11,584, ou uma probabilidade de estar livre da doença versus tendo a doença de 107.386, em que a probabilidade e11,584 = 107.386. Os primeiros 3 valores de biomarcadores têm probabilidades mais consistentes com o grupo de doença (log da probabilidade > 0), porém os 7 biomarcadores restantes são todos consistentemente verificados favorecerem o grupo de controle. Multiplicando-se as probabilidades conjuntamente dá os mesmos resultados que aquele mostrado acima; uma probabilidade de 107.386 que a amostra desconhecida esteja livre da doença. Na realidade, esta amostra veio da população de controle no grupo de treinamento.

Exemplo 4. Algoritmo Guloso para a Seleção de Painéis de Biomarcadores para os Classificadores.

[00338] Este exemplo descreve a seleção de biomarcadores da Tabela 1 para formar painéis que possam ser usados como classificadores em quaisquer dos métodos descritos neste documento. Os subgrupos dos biomarcadores na Tabela 1 foram selecionados para construir classificadores com bom desempenho. Este método foi também usado para determinar quais marcadores potenciais foram incluídos como biomarcadores no Exemplo 2.

[00339] A medição do desempenho do classificador usado aqui é a AUC; um desempenho de 0,5 é a expectativa de linha de base para um classificador aleatório (cara ou coroa), um classificador pior do que o aleatório pontuaria entre 0,0 e 0,5, um classificador com desempenho melhor do que o aleatório pontuaria entre 0,5 e 1,0. Um classificador perfeito, sem nenhum erro, teria uma sensibilidade de 1,0 e uma especificidade de 1,0. Podem-se aplicar os métodos descritos no Exemplo 4 a outras medições comuns do desempenho, tais como a medição F, a soma de sensibilidade e especificidade, ou o produto de sensibilidade e especificidade. Especificamente, poder-se-ia querer tratar a sensibilidade e a especificidade com importância diferente, de modo a selecionar os classificadores que desempenham com maior especificidade à custa de alguma sensibilidade, ou selecionar os classificadores que desempenham com maior sensibilidade à custa de alguma especificidade. Visto que o método descrito aqui somente envolve uma medição do "desempenho", pode ser usado qualquer esquema de importância que resulte em uma única medição do desempenho. As diferentes aplicações terão diferentes benefícios para os resultados de positivos verdadeiros e negativos verdadeiros, e também os custos diferentes associados com os resultados de falso positivo a partir de resultados de falsos negativos. Por exemplo, o exame de fumantes assintomáticos e a diagnose diferencial de nódulos benignos encontrados em CT não terão, em geral, a mesma decisão ótima entre especificidade e sensibilidade. As diferentes demandas dos dois testes em geral requererão atribuir uma diferente importância para a classificação errônea de positivo e negativo, refletida na medição do desempenho. A alteração da medição do desempenho em geral alterará o subgrupo exato de marcadores selecionados da Tabela 1 para um dado conjunto de dados.

[00340] Para a abordagem Bayesiana para a diferenciação das amostras de NSCLC das amostras de controle descritas no Exemplo 3, o classificador foi completamente parametrizado pelas distribuições de biomarcadores nas amostras de treinamento doentes e benignas, e a lista de biomarcadores foi escolhida a partir da Tabela 1; isto quer dizer, o subgrupo de marcadores escolhidos para a inclusão determinou um classificador em um modo um para um, dado um conjunto de dados de treinamento.

[00341] O método guloso empregado aqui foi usado para pesquisar o subgrupo ótimo de marcadores a partir da Tabela 1. Para números pequenos de marcadores ou classificadores com relativamente pouco marcadores, todo subgrupo possível de marcadores era enumerado e avaliado em termos do desempenho do classificador construído com aquele grupo particular de marcadores (ver o Exemplo 4, Parte 2). (Esta abordagem é bastante conhecida no campo da estatística como "seleção do melhor subgrupo"; ver, por exemplo, Hastie e col).. Entretanto, para os classificadores descritos neste documento, o número de combinações de marcadores múltiplos pode ser muito grande, e não foi possível avaliar cada grupo possível de 10 marcadores, visto que existem 30.045.015 combinações possíveis que podem ser geradas a partir de uma lista de somente 30 analitos totais. Por causa da impraticabilidade da pesquisa através de cada subgrupo de marcadores, o único subgrupo ótimo pode não ser encontrado; entretanto, por utilização desta abordagem, muitos subgrupos excelentes foram encontrados, e, em muitos casos, quaisquer destes subgrupos podem representar um ótimo.

[00342] Em vez de avaliar cada grupo possível de marcadores, pode ser seguida uma abordagem em etapas, avançada, "gulosa" (ver, por exemplo, Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10): e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002). Usando este método, um classificador é iniciado com o melhor marcador individual (com base na distância de KS para os marcadores individuais) e é desenvolvido em cada etapa testando-se, um por um, cada membro de uma lista de marcadores que não seja, no momento, um membro do grupo de marcadores no classificador. O um marcador que pontua melhor em combinação com o classificador existente é adicionado ao classificador. Isto é repetido até nenhum aperfeiçoamento mais no desempenho ser atingido. Infelizmente, esta abordagem pode deixar passar combinações valiosas de marcadores para as quais alguns dos marcadores individuais não são todos escolhidos antes do processo parar.

[00343] O procedimento guloso usado aqui foi um aprimoramento da abordagem em etapas, avançada, precedente, em que, para ampliar a pesquisa, em vez de manter somente um único classificador candidato (subgrupo de marcadores) em cada etapa, uma lista de classificadores candidatos foi mantida. A lista foi alimentada com cada subgrupo de marcadores individual (usando cada marcador na tabela sozinho). A lista foi expandida em etapas derivando-se novos classificadores (subgrupos de marcadores) a partir dos atualmente na lista e adicionando-os à lista. Cada subgrupo de marcadores atualmente na lista foi ampliado adicionando-se qualquer marcador da Tabela 1 já não parte daquele classificador, e que não, em sua adição ao subgrupo, duplicaria um subgrupo existente (estes são chamados "marcadores permissíveis"). Cada subgrupo de marcadores existente foi ampliado por cada marcador permissível da lista. Claramente, tal processo geraria no final cada subgrupo possível, e a lista careceria de espaço. Portanto, todos os classificadores gerados foram mantidos somente enquanto a lista era menos do que algum tamanho predeterminado (frequentemente o suficiente para manter todos os três subgrupos de marcadores). Assim que a lista atingiu o limite de tamanho predeterminado, ela tornou-se elitista: ou seja, somente os classificadores que mostrassem certo nível de desempenho eram mantidos na lista, e os outros cairiam do fim da lista e eram perdidos. Isto foi obtido mantendo-se a lista classificada em ordem de desempenho do classificador; novos classificadores que fossem pelo menos tão bons quanto o pior classificador atualmente na lista foram inseridos, forçando a expulsão daquele com desempenho inferior, na parte final, atual. Um detalhe de execução adicional é que a lista foi completamente substituída em cada etapa de geração; portanto, cada classificador na lista teve o mesmo número de marcadores, e em cada etapa o número de marcadores por classificador aumentou em um.

[00344] Visto que este método produziu uma lista de classificadores candidatos usando diferentes combinações de marcadores, pode-se perguntar se os classificadores podem ser combinados em ordem para evitar erros que poderiam ser feitos pelo menor classificador individual, ou por grupos de minoria dos melhores classificadores. Tais métodos de "ensemble" e "comité de especialistas" são bastante conhecidos nos campos de aprendizado estatístico e de máquina e incluem, por exemplo, "Média, "Votação", "Stacking", "Bagging" e "Boosting" (ver, por exemplo, Hastie e col).. Estas combinações de classificadores simples proporcionam um método para reduzir a variância na classificação devida a ruído, em qualquer grupo particular de marcadores, por inclusão de diversos classificadores diferentes e, portanto, informação a partir de um grupo maior dos marcadores a partir da tabela de biomarcadores, efetivamente calculando-se a média entre os classificadores. Um exemplo da utilidade desta abordagem é que ela pode impedir que valores discrepantes em um único marcador afetem adversamente a classificação de uma única amostra. A exigência de medir um número maior de sinais pode ser não prática nos ensaios de anticorpo de "um marcador por vez", porém não tem nenhum inconveniente para um ensaio de aptâmero totalmente multiplexado. Técnicas tais como estas beneficiam-se de uma tabela mais extensa de biomarcadores e usam as fontes múltiplas de informação referente aos processos da doença para proporcionar uma classificação mais sólida.

[00345] Os biomarcadores selecionados na Tabela 1 originaram classificadores que desempenham melhor do que os classificadores construídos com "não marcadores" (isto é, proteínas tendo sinais que não atendem os critérios para a inclusão na Tabela 1 (conforme descrito no Exemplo 2)).

[00346] Para os classificadores contendo somente um, dois, e três marcadores, todos os classificadores possíveis obtidos usando os biomarcadores na Tabela 1 foram enumerados e examinados quanto à distribuição do desempenho, comparados aos classificadores construídos de uma tabela similar de sinais de não marcadores aleatoriamente selecionados.

[00347] Na Figura 11, a AUC foi usada como a medição do desempenho; um desempenho de 0,5 é a expectativa de linha de base para um classificador aleatório (cara ou coroa). O histograma de desempenho do classificador foi comparado com o histograma de desempenho de uma enumeração exaustiva similar de classificadores construídos a partir de uma tabela de "não marcadores" de 59 sinais de não marcadores; os 59 sinais foram aleatoriamente escolhidos a partir de aptâmeros que não demonstraram sinalização diferencial entre as populações de controle e de doença.

[00348] A Figura 11 mostra os histogramas do desempenho de todos os classificadores de um, dois, e três marcadores possíveis, construídos a partir dos parâmetros de biomarcadores na Tabela 14 para biomarcadores que podem diferenciar entre o grupo de controle e o NSCLS e compara estes classificadores com todos os classificadores de um, dois, e três marcadores possíveis, construídos usando os sinais de RFU de aptâmeros "não marcadores". A Figura 11A mostra os histogramas do desempenho do classificador de um único marcador, a Figura 11B mostra o histograma de desempenho do classificador de dois marcadores, e a Figura 11C mostra o histograma do desempenho do classificador de três marcadores.

[00349] Na Figura 11, as linhas sólidas representam os histogramas do desempenho do classificador de todos os classificadores de um, dois, e três marcadores, usando os dados de biomarcadores para fumantes e nódulos pulmonares benignos e NSCLC na Tabela 14. As linhas pontilhadas são os histogramas do desempenho do classificador de todos os classificadores de um, dois, e três marcadores usando os dados para os controles e o NSCLC, porém usando o grupo de sinais de não marcadores aleatórios.

[00350] Os classificadores construídos a partir dos marcadores listados na Tabela 1 formam um histograma distinto, bem separado dos classificadores construídos com os sinais dos "não marcadores" para todas as comparações de um marcador, dois marcadores, e três marcadores. O desempenho e a pontuação de AUC dos classificadores construídos a partir dos biomarcadores na Tabela 1 também aumentam mais rápido com o número de marcadores do que fazem os classificadores construídos a partir dos não marcadores, a separação aumenta entre os classificadores de marcadores e não marcadores à medida que o número de marcadores por classificador aumenta. Todos os classificadores construídos usando os biomarcadores listados na Tabela 14 desempenham distintamente melhor do que os classificadores construídos usando os "não marcadores".

[00351] As distribuições do desempenho do classificador mostram que existem muitos classificadores de múltiplos marcadores possíveis que podem ser derivados do grupo de analitos na Tabela 1. Embora alguns biomarcadores sejam melhores do que outros sozinhos, conforme evidenciado pela distribuição das pontuações de classificadores e as AUCs para os analitos individuais, era desejável determinar se tais biomarcadores são requeridos para construir classificadores de alto desempenho. Para fazer esta determinação, o comportamento do desempenho do classificador foi examinado omitindo algum exemplar dos melhores biomarcadores. A Figura 12 compara o desempenho dos classificadores construídos com a lista completa de biomarcadores na Tabela 1 com o desempenho dos classificadores construídos com subgrupos de biomarcadores da Tabela 1 que excluiu os marcadores proeminentes.

[00352] A Figura 12 demonstra que os classificadores construídos sem os melhores marcadores desempenham bem, indicando que o desempenho dos classificadores não era devido a algum grupo de núcleo pequeno de marcadores e que as alterações nos processos básicos associados com a doença são refletidas nas atividades de muitas proteínas. Muitos subgrupos dos biomarcadores na Tabela 1 desempenharam próximos a otimamente, mesmo após a remoção dos 15 superiores dos 59 marcadores da Tabela 1. Após remover os 15 marcadores proeminentes (classificados pela distância de KS) da Tabela 1, o desempenho do classificador aumentou com o número de marcadores selecionados a partir da tabela para atingir uma AUC de quase 0,93, próxima ao desempenho da pontuação de classificador ótima de 0,948 selecionada da lista completa de biomarcadores.

[00353] Finalmente, a Figura 13 mostra como o desempenho da ROC de classificadores típicos construídos a partir da lista de parâmetros na Tabela 14 de acordo com o Exemplo 3. Um classificador de cinco analitos foi construído com MMP7, CLIC1, STX1A, CHRDL1, e PA2G4. A Figura 13A mostra o desempenho do modelo, assumindo a independência destes marcadores, como no Exemplo 3, e a Figura 13B mostra as curvas ROC empíricas geradas a partir do conjunto de dados de estudo usado para definir os parâmetros na Tabela 14. Pode ser visto que o desempenho para um dado número de marcadores selecionado estava qualitativamente em concordância, e que a concordância quantitativa era em geral bastante boa, conforme evidenciado pelas AUCs, embora o cálculo do modelo tenda a superestimar o desempenho do classificador. Isto está consistente com a noção que a informação contribuída por qualquer biomarcador particular referente aos processos da doença é redundante com a informação contribuída por outros biomarcadores proporcionados na Tabela 1, embora o cálculo do modelo assuma a independência completa. A Figura 13, desse modo, demonstra que a Tabela 1, em combinação com os métodos descritos no Exemplo 3, capacita a construção e a avaliação de um grande número de classificadores úteis para a diferenciação do NSCLC do grupo de controle.

Exemplo 5. Painel de Biomarcadores Clínicos

[00354] Um classificador floresta aleatória foi construído a partir de um painel de biomarcadores selecionados, que podem ser os mais apropriados para uso em um teste diagnóstico clínico. Diferente dos modelos selecionados pelo algoritmo avançado guloso naïve Bayes, o classificador floresta aleatória não assume que as medições dos biomarcadores são aleatoriamente distribuídas. Portanto, este modelo pode utilizar biomarcadores da Tabela 1 que não são efetivos no classificador naïve Bayes.

[00355] O painel foi selecionado usando um procedimento de eliminação backward que utilizou a medição da importância de gini proporcionada pelo classificador floresta aleatória. A importância de gini é uma medição da eficácia de um biomarcador em classificar corretamente as amostras no grupo de treinamento.

[00356] A medição da importância do biomarcador pode ser usada para eliminar os marcadores que sejam menos vitais para o desempenho do classificador. O procedimento da eliminação backward foi iniciado construindo-se um classificador floresta aleatória que incluiu todos os 59 na Tabela 1. O biomarcador menos importante foi então eliminado e um novo modelo foi construído com os biomarcadores restantes. Este procedimento continuou até permanecerem somente os biomarcadores individuais.

[00357] O painel final que foi selecionado proporcionou o melhor equilíbrio entre a maior AUC e o menor número de marcadores no modelo. O painel de 8 biomarcadores que satisfez estes critérios é composto dos seguintes analitos, MMP12, MMP7, KLK3-SERPINA3, CRP, C9, CNDP1, CA6, e EGFR. Um gráfico da curva ROC para este painel de biomarcadores é mostrado na Figura 14. A sensibilidade deste modelo é 0,70, com uma especificidade correspondente de 0,89.

Exemplo 6. Biomarcadores para a Diagnose de Câncer

[00358] A identificação de biomarcadores potenciais para a diagnose geral de câncer foi efetuada. Ambas as amostras de casos e controles foram avaliadas a partir de 3 tipos diferentes de câncer (câncer de pulmão, mesotelioma, e carcinoma de células renais). Por todos os lugares, os critérios de inclusão foram pelo menos 18 anos de idade com consentimento informado assinado. Tanto os casos quanto os controles foram excluídos para malignidade conhecida que não o câncer em questão.

[00359] Câncer de Pulmão. As amostras dos casos e dos controles foram obtidas conforme descrito no Exemplo 2. Um total de 46 casos e 218 controles foi usado neste Exemplo.

[00360] Mesotelioma Pleural. As amostras dos casos e dos controles foram obtidas de um biodepósito do centro de câncer acadêmico para identificar os marcadores potenciais para a diagnose diferencial de mesotelioma pleural de doença do pulmão benigna, incluindo os resultados de radiologias suspeitos que foram posteriormente diagnosticados como não malignos. Um total de 124 casos de mesotelioma e 138 controles expostos ao amianto foi usado neste Exemplo.

[00361] Carcinoma de Células Renais. As amostras dos casos e dos controles foram obtidas de um biodepósito do centro de câncer acadêmico de pacientes com carcinoma de células renais (RCC) e massas benignas (BEN). As amostras pré-cirúrgicas (TP1) foram obtidas para todos os pacientes. A análise primária comparou os dados de resultado (como registrados no campo de banco de dados SEER CA Status 1) para os pacientes com RCC com "Evidência de Doença" (EVD) vs. "Nenhuma Evidência de Doença" (NED), documentados através de acompanhamento clínico. Um total de 38 casos de EVD e 104 controles de NED foi usado neste Exemplo.

[00362] Uma lista final dos biomarcadores de câncer foi identificada combinando-se os grupos de biomarcadores considerados para cada um dos 3 estudos diferentes de câncer. Os classificadores Bayesianos que usaram os grupos de biomarcadores de tamanho crescente foram sucessivamente construídos usando um algoritmo guloso (conforme descrito em maior detalhe na Seção 6.2 deste Exemplo). Os grupos (ou painéis) de biomarcadores que foram úteis para diagnosticar o câncer em geral entre os diferentes locais e tipos de câncer foram compilados como uma função do tamanho do grupo (ou painel) e analisados quanto ao seu desempenho. Esta análise resultou na lista de 23 biomarcadores de câncer mostrados na Tabela 19, cada um dos quais estava presente em pelo menos um destes grupos de marcadores sucessivos, que variaram no tamanho de três a dez marcadores. Como um exemplo ilustrativo, nós descrevemos a geração de um painel específico composto de dez biomarcadores de câncer, que é mostrado na Tabela 32.

6.1 Classificação Naïve Bayesiana para Câncer

[00363] A partir da lista de biomarcadores da Tabela 1, um painel de dez biomarcadores de câncer potenciais foi selecionado usando um algoritmo guloso para a seleção de biomarcadores, conforme resumido na Seção 6.2 deste Exemplo. Um classificador naïve Bayes distinto foi construído para cada um dos 3. As funções de densidade de probabilidade (pdfs) dependentes da classe, p(xi|c) e p(xi|d) , em que xi é o log do valor de RFU medido para o biomarcador i, e c e d referemse às populações de controle e de doença, foram modeladas como funções do log das distribuições normais, caracterizadas por um µ médio e variância σ2. Os parâmetros para as pdfs dos 3 modelos compostos dos dez biomarcadores potenciais são listados na Tabela 31.

[00364] A classificação naïve Bayes para tal modelo é dada pela seguinte equação, em que p(d) é o predomínio da doença na população,

apropriado para o teste e n = 10. Cada um dos termos no somatório é um log da razão das probabilidades para um marcador individual e o log da razão das probabilidades total de uma amostra x̄ estando livre da doença de interesse (isto é, neste caso, cada doença particular a partir dos 3 tipos diferentes de câncer) versus tendo a doença é simplesmente o somatório destes termos individuais mais um termo que é responsável pelo predomínio da doença. Por simplicidade, é assumido- p(d) = 0,5, de modo que

[00365] Dada uma medição da amostra desconhecida em log(RFU) para cada um dos dez biomarcadores de 9,5, 8,8, 7,8, 8,3, 9,4, 7,0, 7,9, 6,3, 7,7, 10,6, o cálculo da classificação é detalhado na Tabela 32. Os componentes individuais compreendendo o log da razão das probabilidades para a doença versus a classe de controle são tabelados e podem ser computados a partir dos parâmetros na Tabela 31 e dos valores de x̄ . O somatório dos logs das razões das probabilidades individuais é -3,326, ou uma probabilidade de estar livre da doença versus tendo a doença de 28, em que a probabilidade e 3,326 = 28. Os primeiros 4 valores de biomarcadores têm probabilidades mais consistentes com o grupo de doença (log da probabilidade > 0), porém os 6 biomarcadores restantes são todos consistentemente verificados favorecerem o grupo de controle. Multiplicando-se as probabilidades conjuntamente dá os mesmos resultados que aquele mostrado acima; uma probabilidade de 28 que a amostra desconhecida esteja livre da doença. Na realidade, esta amostra veio da população de controle no grupo de treinamento de carcinoma de células renais.

6.1 Classificação Naïve Bayesiana para Câncer

[00366] A partir da lista de biomarcadores da Tabela 1, um painel de dez biomarcadores de câncer potenciais foi selecionado usando um algoritmo guloso para a seleção de biomarcadores, conforme resumido na Seção 6.2 deste Exemplo. Um classificador naïve Bayes distinto foi construído para cada um dos 3 tipos diferentes de câncer. As funções de densidade de probabilidade (pdfs) dependentes da classe, p(xi|c) e p(xi|d) , em que xi é o log do valor de RFU medido para o biomarcador i, e c e d referem-se às populações de controle e de doença, foram modeladas como funções do log das distribuições normais, caracterizadas por um µ médio e variância σ2. Os parâmetros para as pdfs dos 3 modelos compostos dos dez biomarcadores potenciais são listados na Tabela 31.

[00367] A classificação naïve Bayes para tal modelo é dada pela seguinte equação, em que p(d) é o predomínio da doença na população,

apropriado para o teste e n = 10. Cada um dos termos no somatório é um log da razão das probabilidades para um marcador individual e o log da razão das probabilidades total de uma amostra x̄ estando livre da doença de interesse (isto é, neste caso, cada doença particular a partir dos 3 tipos diferentes de câncer) versus tendo a doença é simplesmente o somatório destes termos individuais mais um termo que é responsável pelo predomínio da doença. Por simplicidade, é assumido p(d) = 0,5, de modo que

[00368] Dada uma medição da amostra desconhecida em log(RFU) para cada um dos dez biomarcadores de 9,5, 8,8, 7,8, 8,3, 9,4, 7,0, 7,9, 6,3, 7,7, 10,6, o cálculo da classificação é detalhado na Tabela 32. Os componentes individuais compreendendo o log da razão das probabilidades para a doença versus a classe de controle são tabelados e podem ser computados a partir dos parâmetros na Tabela 31 e dos valores de x̄ . O somatório dos logs das razões das probabilidades individuais é -3,326, ou uma probabilidade de estar livre da doença versus tendo a doença de 28, em que a probabilidade e3,326 = 28. Somente 4 dos valores de biomarcadores têm probabilidades mais consistentes com o grupo de doença (log da probabilidade > 0), porém os 6 biomarcadores restantes são todos consistentemente verificados favorecerem o grupo de controle. Multiplicando-se as probabilidades conjuntamente dá os mesmos resultados que aquele mostrado acima; uma probabilidade de 28 que a amostra desconhecida esteja livre da doença. Na realidade, esta amostra veio da população de controle no grupo de treinamento de NSCLC.

6.2 Algoritmo Guloso para a Seleção de Painéis de Biomarcadores de Câncer para os Classificadores Parte 1

[00369] Os subgrupos dos biomarcadores na Tabela 1 foram selecionados para construir classificadores potenciais que pudessem ser usados para determinar quais dos marcadores poderiam ser usados como biomarcadores de câncer gerais para detectar o câncer.

[00370] Dado um grupo de marcadores, um modelo distinto foi treinado para cada um dos 3 estudos de câncer, de modo que uma medição global do desempenho foi requerida para selecionar um grupo de biomarcadoes que fosse capaz de classificar simultaneamente muitos tipos diferentes de câncer. A medição do desempenho do classificador usada aqui foi a média da área sob a curva ROC através de todos os classificadores naïve Bayes. A curva ROC é um gráfico da taxa de positivo verdadeiro (sensibilidade) versus a taxa de falso positivo (especificidade 1) de um único classificador. A área sob a curva ROC (AUC) varia de 0 a 1,0, em que uma AUC de 1,0 corresponde à classificação perfeita e uma AUC de 0,5 corresponde ao classificador aleatório (cara ou coroa). Podem-se aplicar outras medições comuns de desempenho, tais como a medição F ou a soma ou o produto de sensibilidade e especificidade. Especificamente, poderia querer tratar a sensibilidade e a especificidade com importância diferente, de modo a selecionar os classificadores que desempenham com maior especificidade à custa de alguma sensibilidade, ou selecionar os classificadores que desempenham com maior sensibilidade à custa da especificidade. É escolhido usar a AUC porque ela inclui todas as combinações de sensibilidade e especificidade em uma única medição. As diferentes aplicações terão diferentes benefícios para os resultados de positivos verdadeiros e negativos verdadeiros, e terão custos diferentes associados com os resultados de falso positivo a partir de resultados de falsos negativos. A alteração da medição do desempenho pode alterar o subgrupo exato de marcadores selecionados para um dado conjunto de dados.

[00371] Para a abordagem Bayesiana para a diferenciação das amostras de câncer das amostras de controle descritas na Seção 6.1 deste Exemplo, o classificador foi completamente parametrizado pelas distribuições de biomarcadores em cada um dos 3 estudos de câncer, e a lista de biomarcadores foi escolhida a partir da Tabela 19. Isto quer dizer, o subgrupo de marcadores escolhidos para a inclusão determinou um classificador em um modo um para um, dado um conjunto de dados de treinamento.

[00372] O método guloso empregado aqui foi usado para pesquisar o subgrupo ótimo de marcadores a partir da Tabela 1. Para números pequenos de marcadores ou classificadores com relativamente pouco marcadores, todo subgrupo possível de marcadores era enumerado e avaliado em termos do desempenho do classificador construído com aquele grupo particular de marcadores (ver o Exemplo 4). (Esta abordagem é bastante conhecida no campo da estatística como "seleção do melhor subgrupo"; ver, por exemplo, Hastie e col).. Entretanto, para os classificadores descritos neste documento, o número de combinações de marcadores múltiplos pode ser muito grande, e não foi possível avaliar cada grupo possível de 10 marcadores, visto que existem 30.045.015 combinações possíveis que podem ser geradas a partir de uma lista de somente 30 analitos totais. Por causa da impraticabilidade da pesquisa através de cada subgrupo de marcadores, o único subgrupo ótimo pode não ser encontrado; entretanto, por utilização desta abordagem, muitos subgrupos excelentes foram encontrados, e, em muitos casos, quaisquer destes subgrupos podem representar um ótimo.

[00373] Em vez de avaliar cada grupo possível de marcadores, pode ser seguida uma abordagem em etapas, avançada, "gulosa" (ver, por exemplo, Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10): e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002). Usando este método, um classificador é iniciado com o melhor marcador individual (com base na distância de KS para os marcadores individuais) e é desenvolvido em cada etapa testando-se, um por um, cada membro de uma lista de marcadores que não seja, no momento, um membro do grupo de marcadores no classificador. O um marcador que pontua melhor em combinação com o classificador existente é adicionado ao classificador. Isto é repetido até nenhum aperfeiçoamento mais no desempenho ser atingido. Infelizmente, esta abordagem pode deixar passar combinações valiosas de marcadores para as quais alguns dos marcadores individuais não são todos escolhidos antes do processo parar.

[00374] O procedimento guloso usado aqui foi um aprimoramento da abordagem em etapas, avançada, precedente, em que, para ampliar a pesquisa, em vez de manter somente um único subgrupo de marcadores em cada etapa, uma lista de grupos de marcadores candidatos foi mantida. A lista foi alimentada com uma lista de marcadores individuais. A lista foi expandida em etapas derivando-se novos subgrupos de marcadores a partir dos atualmente na lista e adicionando-os à lista. Cada subgrupo de marcadores atualmente na lista foi ampliado adicionando-se qualquer marcador da Tabela 1 já não parte daquele classificador, e que não, em sua adição ao subgrupo, duplicaria um subgrupo existente (estes são chamados "marcadores permissíveis"). Cada momento, um novo grupo de marcadores era definido, um grupo de classificadores compostos de um para cada estudo de câncer era treinado usando estes marcadores, e o desempenho global era medido por meio da AUC através de todos os 3 estudos. Para evitar o sobreajuste potencial, a AUC para cada modelo de estudo do câncer foi calculada por meio de um procedimento de validação cruzada de dez vezes. Cada subgrupo de marcadores existente foi ampliado por cada marcador permissível da lista. Claramente, tal processo geraria no final cada subgrupo possível, e a lista careceria de espaço. Portanto, todos os grupos de marcadores gerados foram mantidos somente enquanto a lista era menos do que algum tamanho predeterminado. Assim que a lista atingiu o limite de tamanho predeterminado, ela tornou-se elitista: ou seja, somente os grupos classificadores que mostrassem certo nível de desempenho eram mantidos na lista, e os outros cairiam do fim da lista e eram perdidos. Isto foi obtido mantendo-se a lista classificada em ordem de desempenho do grupo de classificadores; novos grupos de marcadores cujos classificadores fossem globalmente pelo menos tão bons quanto o pior grupo de classificadores atualmente na lista foram inseridos, forçando a expulsão dos grupos de classificadores com desempenho inferior, na parte final, atuais. Um detalhe de execução adicional é que a lista foi completamente substituída em cada etapa de geração; portanto, cada grupo de marcadores na lista teve o mesmo número de marcadores, e em cada etapa o número de marcadores por classificador aumentou em um.

[00375] Em uma modalidade, o grupo (ou painel) de biomarcadores, úteis para construir classificadores para diagnosticar o câncer geral a partir de sem câncer, é baseado na AUC média para a combinação particular de biomarcadores usados no esquema de classificação. Foram identificadas muitas combinações de biomarcadores derivados dos marcadores na Tabela 19 que são capazes de classificar efetivamente diferentes amostras de câncer dos controles. Os painéis representativos são apresentados nas Tabelas 22-29, que apresentam uma série de 100 painéis diferentes de 3-10 biomarcadores, que têm a AUC de validação cruzada (CV) média indicada para cada painel. O número total de ocorrências de cada marcador em cada um destes painéis é indicado na parte inferior de cada tabela.

[00376] Os biomarcadores selecionados na Tabela 19 originaram classificadores que desempenham melhor do que os classificadores construídos com "não marcadores". Na Figura 15, mostra-se o desempenho de nossos classificadores de dez biomarcadores comparado ao desempenho de outros classificadores possíveis.

[00377] A Figura 15A mostra a distribuição das AUCs médias para os classificadores construídos a partir de grupos amostrados aleatoriamente de dez "não marcadores", retirados do grupo inteiro de 23 presentes em todos os 3 estudos, excluindo os dez marcadores na Tabela 19. O desempenho dos dez biomarcadores de câncer potenciais é mostrado como uma linha tracejada vertical. Este gráfico claramente mostra que o desempenho dos dez biomarcadores potenciais está bem além da distribuição de outras combinações de marcadores.

[00378] A Figura 15B mostra uma distribuição similar à Figura 15A, entretanto, os grupos amostrados aleatoriamente estavam restritos aos 49 biomarcadores da Tabela 1 que não foram selecionados pelo procedimento de seleção de biomarcador gulosa para classificadores de dez analitos. Este gráfico demonstra que os dez marcadores escolhidos pelo algoritmo guloso representam um subgrupo de biomarcadores que generalizam para outros tipos de câncer muito melhor do que os classificadores construídos com os 49 biomarcadores restantes.

[00379] Finalmente, a Figura 16 mostra a curva ROC do classificador para cada um dos classificadores dos 3 estudos de câncer. As modalidades e os exemplos precedentes são pretendidos somente como exemplos. Nenhuma modalidade, exemplo, ou elemento particular de uma modalidade particular ou exemplo é para ser interpretado como um elemento ou característica crítica, requerida, ou essencial de quaisquer das reivindicações. Ademais, nenhum elemento descrito neste documento é requerido para a prática das reivindicações em anexo, a não ser que expressamente descrito como "essencial" ou "crítico". Diversas alterações, modificações, substituições, e outras variações podem ser feitas nas modalidades divulgadas, sem sair do escopo do presente pedido, o qual é definido pelas reivindicações em anexo. O relatório descritivo, incluindo as figuras e os exemplos, é para ser considerado em um modo ilustrativo, em vez de em um restritivo, e pretende-se que todas as tais modificações e substituições sejam incluídas no escopo do pedido. Consequentemente, o escopo do pedido deve ser determinado pelas reivindicações em anexo e seus equivalentes legais, em vez de pelos exemplos dados acima. Por exemplo, as etapas descritas em quaisquer das reivindicações de método ou processo podem ser efetuadas em qualquer ordem possível e não estão limitadas a uma ordem apresentada em quaisquer das modalidades, dos exemplos, ou das reivindicações. Além disso, em quaisquer dos métodos antes mencionados, um ou mais biomarcadores da Tabela 1 ou da Tabela 19 podem ser especificamente excluídos como um biomarcador individual ou como um biomarcador de qualquer painel.
Tabela 1: Biomarcadores de Câncer

Tabela 2: Painéis de 1 Biomarcador

Tabela 3: Painéis de 2 Biomarcadores

Tabela 4: Painéis de 3 Biomarcadores

Tabela 5: Painéis de 4 Biomarcadores

Tabela 6: Painéis de 5 Biomarcadores

Tabela 7: Painéis de 6 Biomarcadores

Tabela 8: Painéis de 7 Biomarcadores

Tabela 9: Painéis de 8 Biomarcadores

Tabela 10: Painéis de 9 Biomarcadores

Tabela 11: Painéis de 10 Biomarcadores

Tabela 12: Contagens de marcadores nos painéis de biomarcadores

Tabela 13: Analitos em classificadores de dez marcadores

Tabela 14: Parâmetros derivados do grupo de treinamento para o classificador naïve Bayes.

Tabela 15: AUC para combinações ilustrativas de biomarcadores

Tabela 16: Cálculos derivados do grupo de treinamento para o classificador naïve Bayes.

Tabela 17: Características clínicas do grupo de treinamento

Tabela 18: Proteínas classificadoras de dez biomarcadores

Tabela 19: Biomarcadores de câncer geral

Tabela 20: Painéis de 1 Biomarcador

Tabela 21: Painéis de 2 Biomarcadores

Tabela 22: Painéis de 3 Biomarcadores

Tabela 23: Painéis de 4 Biomarcadores

Tabela 24: Painéis de 5 Biomarcadores

Tabela 25: Painéis de 6 Biomarcadores

Tabela 26: Painéis de 7 Biomarcadores

Tabela 27: Painéis de 8 Biomarcadores

Tabela 28: Painéis de 9 Biomarcadores

Tabela 29: Painéis de 10 Biomarcadores

Tabela 30: Contagens de marcadores nos painéis de biomarcadores

Tabela 31: Parâmetros derivados do conjunto de dados de câncer ajustados para os classificadores naïve Bayes

Tabela 32: Cálculos derivados do grupo de treinamento para o classificador naïve Bayes.

Claims (18)

1. Método in vitro para diagnosticar se um indivíduo tem ou não câncer, caracterizado pelo fato de que compreende:
   detectar, em uma amostra de sangue total, plasma ou soro de um indivíduo, um valor de biomarcador que corresponda a CA6, em que o referido indivíduo é classificado como tendo ou não tendo câncer com base no referido valor do biomarcador, baseado no método de classificação de naïve Bayes para um painel NSCLC.
2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a detecção dos valores do biomarcador que correspondem a pelo menos N biomarcadores selecionados do grupo de biomarcadores:
   KLK3-SERPINA3,
   BMPER,
   C9,
   AKR7A2,
   IGFBP2,
   FN1,
   CRP,
   CNTN1,
   BDNF,
   ITIH4,
   AHSG,
   EGFR,
   FGA-FGB-FGG,
   STX1A,
   CKB-CKM,
   CA6
   IGFBP4,
   BMP1,
   KIT,
   SERPINA1,
   GHR,
   NME2,
   e em que N = 2 a 23.
3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a detecção dos valores do biomarcador compreende efetuar um ensaio in vitro, em que o referido ensaio in vitro compreende preferencialmente pelo menos um reagente de captura correspondendo a cada um dos referidos biomarcadores, e adicionalmente compreendendo selecionar o referido pelo menos um reagente de captura a partir do grupo que consiste em aptâmeros e anticorpos, em que o referido pelo menos um reagente de captura é um aptâmero.
4. Método, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado a partir do grupo que consiste em um imunoensaio ou um ensaio baseado em aptâmeros.
5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que cada valor de biomarcador é avaliado com base em um valor predeterminado ou uma faixa predeterminada de valores, baseado no método de classificação de naïve Bayes para um painel NSCLC.
6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.
7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizado pelo fato de que N = 2 a 15, N = 3 a 15, N = 3 a 10, N = 4 a 20, N = 4 a 15, N = 4 a 10, N = 5 a 20, N = 5 a 15 ou N = 5 a 10.
8. Método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende:
   obter em um computador informação de biomarcador para um indivíduo, em que a informação de biomarcador compreende um valor de biomarcador que corresponde a CA6, em que o referido biomarcador foi detectado em amostra de sangue total, plasma e soro;
   efetuar com o computador uma classificação do valor do biomarcador; e
   indicar uma probabilidade que o dito indivíduo tem câncer com base na classificação.
9. Método implementado por computador, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que as informações do biomarcador compreendem ainda valores de biomarcadores que correspondem a um de pelo menos N biomarcadores selecionados do grupo que consiste em:
   KLK3-SERPINA3,
   BMPER,
   C9,
   AKR7A2,
   IGFBP2,
   FN1,
   CRP,
   CNTN1,
   BDNF,
   ITIH4,
   AHSG,
   EGFR,
   FGA-FGB-FGG,
   STX1A,
   CKB-CKM,
   CA6
   IGFBP4,
   BMP1,
   KIT,
   SERPINA1,
   GHR,
   NME2,
   em que N = 3 a 12.
10. Produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer, caracterizado pelo fato de que compreende:
    um meio legível por computador que incorpora o código do programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código do programa compreendendo:
    código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores que correspondem a CA6, em que o referido biomarcador foi detectado em amostra de sangue total, plasma ou soro; e
    código que executa um método de classificação que indica um status de câncer do indivíduo em função do referido valor de biomarcador.
11. Produto de programa de computador, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que os dados compreendem ainda valores de biomarcadores que correspondem a pelo menos um biomarcador e em que N = 3 a 12.
12. Produto de programa de computador, de acordo com a reivindicação 10 ou 11, caracterizado pelo fato de que o referido método de classificação utiliza uma função de densidade de probabilidade ou em que o referido método de classificação usa duas ou mais classes.
13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é classificado como tendo ou não tendo câncer com base nos referidos valores de biomarcadores e pelo menos um item de informações biomédicas adicionais correspondentes ao referido indivíduo.
14. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é um câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC).
15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o método compreende ainda detectar valores de biomarcadores que correspondem a pelo menos um dos pelo menos N biomarcadores selecionados do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 1, e em que N = 2 a 59.
16. Método, de acordo com a reivindicação13, caracterizado pelo fato de que o referido pelo menos um item de informação biomédica adicional é independentemente selecionado a partir do grupo que consiste em:

    • (a) informação correspondendo aos descritores físicos do dito indivíduo,
    • (b) informação correspondendo aos descritores radiológicos de uma anormalidade pulmonar no dito indivíduo,
    • (c) informação correspondendo à presença ou ausência de um nódulo pulmonar no dito indivíduo,
    • (d) informação correspondendo aos descritores físicos de um nódulo pulmonar no dito indivíduo,
    • (e) informação correspondendo a uma alteração na altura e/ou no peso do dito indivíduo,
    • (f) informação correspondendo à afiliação étnica do dito indivíduo,
    • (g) informação correspondendo ao sexo do dito indivíduo,
    • (h) informação correspondendo à história de fumar do dito indivíduo,
    • (i) informação correspondendo à exposição ambiental ao tabaco no dito indivíduo,
    • (j) informação correspondendo à história de uso de álcool no dito indivíduo,
    • (k) informação correspondendo à história ocupacional do dito indivíduo,
    • (l) informação correspondendo à história na família de câncer de pulmão ou outro câncer no dito indivíduo,
    • (m) informação correspondendo à presença ou ausência no dito indivíduo de pelo menos um marcador genético que se correlacione com um risco maior de câncer de pulmão ou câncer no dito indivíduo ou em um membro da família do dito indivíduo,
    • (n) informação correspondendo aos sintomas clínicos do dito indivíduo,
    • (o) informação correspondendo a outros testes de laboratório,
    • (p) informação correspondendo aos valores da expressão gênica do dito indivíduo, e
    • (q) informação correspondendo à dita exposição dos indivíduos a carcinógenos conhecidos.
17. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 13 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende a detecção valores de biomarcadores para os biomarcadores:

    • a. CA6;
    • b. CA6, YWHAG;
    • c. MMP7, CA6 e YWHAG ;
    • d. C9, CA6 e YWHAG;
    • e. CA6, STX1A e YWHAG;
    • f. KLK3-SERPINA3 e CA6;
    • g. C9 e CA6;
    • h. CA6 e CRP;
    • i. CA6 e BMPER;
    • j. CA6 e AKR7A2;
    • k. KLK3-SERPINA3, CA6 e AKR7A2;
    • l. KLK3-SERPINA3, CA6 e NME2;
    • m. KLK3-SERPINA3, BDNF e CA6;
    • n. KLK3-SERPINA3, C9, CA6 e AKR7A2;
    • o. KLK3-SERPINA3, BMPER, KIT, AKR7A2, CNTN1, C9 e CA6;
    • p. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, CNTN1 e C9;
    • q. KLK3-SERPINA3, BMPER, KIT, AKR7A2, GHR, CRP, CNTN1 e CA6;
    • r. KLK3-SERPINA3, BMPER, KIT, AKR7A2, GHR, ITIH4, CNTN1 e CA6;
    • s. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, ITIH4 e CNTN1;
    • t. KLK3-SERPINA3, BMPER, KIT, AKR7A2, GHR, CRP, IGFBP4, ITIH4 e CA6;
    • u. KLK3-SERPINA3, C9, KIT, CA6, GHR, BMPER, IGFBP4, AKR7A2 e CNTN1;
    • v. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, CNTN1, CRP e C9;
    • w. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP e CNTN1;
    • x. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, AKR7A2, GHR, CRP, IGFBP4, ITIH4 e CNTN1;
    • y. KLK3-SERPINA3, BMPER, KIT, AKR7A2, GHR, CRP, CNTN1, ITIH4 e CA6;
    • z. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, ITIH4 e C9;
    • aa. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, CNTN1, ITIH4 e C9;
    • bb. KLK3-SERPINA3, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP, GNTN1, ITIH4 e CA6;
    • cc. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, CNTN1, CRP e BMP1;
    • dd. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, IGFBP2, AKR7A2, GHR, CRP e CNTN1;
    • ee. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP, CNTN1 e ITIH4;
    • ff. KLK3-SERPINA3, C9, KIT, CA6, GHR, BMPER, IGFBP4, AKR7A2, CNTN1 e ITIH4;
    • gg. KLK3-SERPINA3, BMP1, KIT, CA6, GHR, BMPER, IGFBP4, AKR7A2, CNTN1 e ITIH4;
    • hh. KLK3-SERPINA3, BMP1, KIT, CA6, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP, CNTN1 e ITIH4;
    • ii. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, IGFBP2, AKR7A2, GHR, CRP, CNTN1 e ITIH4;
    • jj. KLK3-SERPINA3, C9, KIT, CA6, GHR, BMPER, IGRBP4, AKR7A2, CNTN1 e CRP;
    • kk. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, AHSG, GHR, BMPER, CNTN1, AKR7A2, C9 e CRP;
    • ll. KLK3-SERPINA3, C9, KIT, CA6, GHR, AHSG, IGFBP4, BMPER, CNTN1 e AKR7A2;
    • mm. KLK3-SERPINA3, BMP1, KIT, CA6, GHR, BMPER, IGFBP4, AKR7A2, CNTN1 e CRP;
    • nn. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, IGFBP4, AKR7A2, CNTN1, CRP, BMP1 e ITIH4;
    • oo. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP, BMP1 e ITIH4;
    • pp. KLK3-SERPINA3, C9, KIT, CA6, IGFBP2, BMPER, GHR, AKR7A2, CNTN1 e CRP;
    • qq. KLK3-SERPINA3, CA6, GHR, BMPER, IGFBP4, AKR7A2, CNTN1, CRP, BMP1 e ITIH4;
    • rr. KLK3-SERPINA3, CNTN1, KIT, CA6, IGFBP2, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4 e CRP;
    • ss. KLK3-SERPINA3, CA6, KIT, BMPER, GHR, AKR7A2, IGFBP4, CRP, C9 e ITIH4;
18. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o câncer é câncer de pulmão, mesotelioma pleural ou carcinoma de células renais.

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