KR101921945B1 - 폐암 바이오마커 및 그것의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 비소세포 폐암 및 일반적인 암의 검출 및 진단을 위한 바이오마커, 방법, 기구, 시약, 시스템 및 키트에 관한 것이다. 일 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암 또는 일반적인 암을 진단하기 위하여 단독 또는 다양한 조합으로 사용될 수 있다. 다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제공되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 폐암이거나 폐암일 가능성이 있는 것으로 분류된다. 다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제공되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 암이거나 암일 가능성이 있는 것으로 분류된다.

Description

폐암 바이오마커 및 그것의 용도{LUNG CANCER BIOMARKERS AND USES THEREOF}

본 발명은 일반적으로 개인에서의 바이오마커의 검출 및 암의 진단에 관한 것이며, 더욱 상세하게는 개인에서의 암, 특히 폐암을 진단하기 위한 바이오마커, 방법, 기구, 시약, 시스템 및 키트에 관한 것이다.

하기 명세서는 본 발명과 관련된 정보의 요약을 제공하며, 본원에 제공된 어떠한 정보 또는 인용된 문헌들도 본 발명에 대한 종래 기술로 인정되지 않는다. 많은 사람들이 어떤 다른 형태의 암보다 폐암으로 더 사망한다. 이것은 남자나 여자 모두에게 있어서 사실이다. 폐암은 유방암(breast cancer), 전립선암(prostate cancer) 및 대장암(colon cancer)을 모두 합친 것보다 더 많은 사망률을 차지하고 있다. 폐암은 2010년 미국에서 157,300건으로 추정된 사망률 또는 모든 암 사망률의 28%를 차지하였다. 2010년, 116,750명의 남성과 105,770명의 여성들이 폐암으로 진단받았을 것이며, 86,220명의 남성과 71,080명의 여성들이 폐암으로 사망할 것으로 추정하였다(Jemal, CA Cancer J Clin 2010; 60:277). 미국의 남성들 중에서, 폐암은 백인, 흑인, 아시아인/태평양 섬 지역민, 미국 인디언/알래스카 원주민 및 히스패닉 남성들 사이에서 두 번째로 가장 흔한 암이다. 미국의 여성들 중에서, 폐암은 백인, 흑인 및 미국 인디언/알래스카 원주민 여성들 사이에서 두 번째로 가장 흔한 암이며, 아시아인/태평양 섬 지역민 및 히스패닉 여성들 사이에서 세 번째로 가장 흔한 암이다. 담배를 끊지 않은 사람들에 대한 폐암으로 인한 사망 가능성은 15%이며, 50-59세에 담배를 끊은 사람들에 대해서도 여전히 5% 이상이다. 미국에서만 폐암의 연간 보건의료 비용은 950억 달러이다.

흡연에 의해 야기되는 폐암의 91%는 모든 폐암 중 약 87%에 해당하는 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)이다. 혼합세포 폐암(mixed-cell lung cancer)도 발생하지만, 여전히 모든 폐암 중 나머지 15%는 소세포 폐암(small cell lung cancer)이다. 소세포 폐암은 극히 드물며 급속하게 죽음을 초래하기 때문에, 조기 발견의 기회가 적다.

비소세포 폐암에는 편평세포 암종(squamous cell carcinoma), 대세포 암종(large cell carcinoma) 및 선암종(adenocarcinoma) 등의 3가지 주요 형태가 있다. 선암종은 폐암의 가장 흔한 형태이며(30%-65%), 흡연자와 비흡연자 모두에게서 가장 빈번하게 발견되는 폐암이다. 편평세포 암종은 모든 폐암 중 25-35%를 차지하며, 일반적으로 기관지 근위부(proximal bronchus)에서 발견된다. 초기 비소세포 폐암은 국소화되는(localized) 경향이 있으며, 만약 조기에 검출된다면 상기 폐암은 종종 바람직한 결과 및 개선된 생존율을 가지는 수술에 의해 치료될 수 있다. 다른 치료 옵션은 방사선 치료, 약물 치료 및 이 방법들의 조합을 포함한다.

비소세포 폐암은 종양의 크기 및 림프절(lymph nodes)을 포함하는 다른 조직에서의 그것의 존재에 의해 병기가 나뉜다. 무증상 병기(occult stage)에서, 암 세포는 객담 샘플(sputum samples) 또는 세척 샘플(lavage samples)에서 발견되며, 폐에서는 어떠한 종양도 발견할 수 없다. 0기(stage 0)에서는, 폐의 가장 안쪽의 내벽(innermost lining)에서만 암 세포가 보이며, 종양은 내벽까지 자라지 않는다. IA기(stage IA)에서, 암은 국소적으로 침윤성(invasive)인 것으로 여겨지며, 폐 조직 깊은 곳으로 자라지만 종양은 가로로 3cm 이하이다. 이 병기에서, 종양은 기관지 또는 림프절에서는 발견되지 않는다. IB기(stage IB)에서, 종양은 가로로 3cm 보다 크거나 기관지 또는 흉막(pleura) 안으로 자라지만, 림프절 안으로 자라지는 않는다. IIA기(stage IIA)에서, 종양은 7cm 이하이며, 림프절 안으로 자란다. IIB기(stage IIB)에서, 종양은 림프절에서 발견되며 가로로 5cm 보다 크거나 기관지 또는 흉막 안으로 자라고; 또는 암은 림프절에는 없으나 흉벽(chest wall), 횡격막(diaphragm), 흉막(pleura), 기관지(bronchus) 또는 심장 주변의 조직에서 발견되거나, 독립된 종양결절(tumor nodules)이 동일한 폐의 엽(lobe)에 존재한다. IIIA기(stage IIIA)에서, 암세포는 폐와 기관지 주변의 림프절 및 폐 사이에 있으나 종양이 위치하고 있는 흉부 쪽에서 발견된다. IIIB기(stage IIIB)에서, 암세포는 종양으로부터 흉곽의 맞은편과 목에 위치한다. 폐 주변의 다른 기관들 또한 암세포를 가질 수 있으며, 다중 종양(multiple tumor)들이 폐의 하나의 엽(lobe)에서 발견될 수 있다. IV기(stage IV)에서, 종양은 동일한 폐 또는 양쪽 폐의 많은 엽들에서 발견되며, 암세포는 신체의 다른 부분에서도 발견된다.

폐암에 대한 현재의 진단 방법은 암성 세포(cancerous cell)에 대한 객담 검사, 흉부 X-레이, 기도의 광섬유 평가와 생검(biopsy) 및 저선량 나선 컴퓨터 단층촬영(low dose spiral computed tomography(CT))을 포함한다. 객담 세포검사(sputum cytology)는 매우 낮은 민감도를 가진다. 흉부 X-레이 또한 비교적 둔감하며, 눈으로 볼 수 있게 1cm 보다 큰 크기의 병변을 필요로 한다. 기관지경 검사(bronchoscopy)는 종양이 기관지경이 접근하기 쉬운 기도 내에서 눈에 보일 필요가 있다. 가장 널리 알려져 있는 진단 방법은 저선량 흉부 CT지만, X-레이와 마찬가지로 CT의 사용은 그 자체가 암을 유발할 수 있는 전리 방사선(ionizing radiation)을 수반한다. CT는 또한 현저한 제한을 가진다: 스캔(scan)은 해석하는데 매우 높은 수준의 기술 능력을 필요로 하며, 발견된 많은 이상들은 사실 폐암이 아니며, CT 소견을 받는데 상당한 건강관리 비용을 야기한다. 가장 흔한 우발적 소견(incidental finding)은 양성 폐 결절(benign lung nodule)이다.

폐 결절(lung nodule)은 폐 내에 위치하고 있는 비교적 동그란 병변 또는 비정상적인 조직의 부위이며, 크기가 다양할 수 있다. 폐 결절은 양성(benigh) 또는 암성(cancerous)일 수 있으나, 대부분은 양성이다. 결절이 4mm 미만이면 유병율(prevalence)은 단지 1.5%이고, 결절이 4-8mm이면 유병율은 대략 6%이고, 결절이 20mm 이상이면 발생률은 대략 20%이다. 작은 그리고 중간 크기의 결절에 대하여 환자는 1년간 3개월 내에 반복 촬영을 받을 것을 권유받는다. 많은 커다란 결절들에 대하여, 환자는 이것들의 대부분이 양성이라 할지라도 (외과적이며 합병증을 야기할 수 있는) 생검(biopsy)을 받는다.

따라서, 수행되는 외과적 처치의 빈도를 감소시키고 외과적 합병증의 위험을 최소화하기 위하여 CT를 대체하거나 보완할 수 있는 진단 방법이 필요하다. 게다가, 폐 결절이 없거나 발생한 적이 없을 때에도, 환자의 결과를 개선하기 위하여 초기에 폐암을 검출하기 위한 방법이 필요하다. 단지 16%의 폐암 케이스만이 국소적(localized)이며 초기 단계의 암인 것으로 진단되며, 84%의 말기 단계에서 진단된 케이스들의 5년 생존율은 단지 13%인 것에 비하여, 이 경우의 5년 생존율은 46%이다. 이는 많은 증상이 다른 폐 질병에 공통되며 종종 폐암의 말기에서만 나타나기도 하므로, 진단을 위해 증상에 의지하는 것은 유용하지 않다는 것을 보여준다. 이러한 증상들은 지속적인 기침(persistent cough), 혈담(bloody sputum), 흉통(chest pain) 및 되풀이하여 발생하는 기관지염(bronchitis) 또는 폐렴(pneumonia)을 포함한다.

암의 조기 진단 방법이 존재할 경우, 이득은 일반적으로 의학계에 주어진다. 진단 프로토콜(screening protocol)이 널리 사용되는 암은 폐암에 대한 16% 대비 유방암(88%) 및 대장암(65%)과 같이 가장 높은 5년 생존율을 가진다. 그러나, 진단을 통하여 암이 I기로 진단되면, 폐암 환자의 88%는 10년 혹은 그보다 더 길게 생존한다. 이는 초기 비소세포 폐암을 확실하게 검출할 수 있는 진단 방법에 대한 명확한 필요성을 보여준다.

특정 질병 상태에 대한 바이오마커의 선별은 첫째로 대조 집단과 비교하여 특정의 의학적 적용을 위하여 질병 집단에서 주목할만하며 통계학적으로 현저한 차이를 가지는 마커의 확인을 포함한다. 바이오마커는 질병의 발병 또는 진행에서와 유사하며, 병변에 대응하여 원위 조직(distal tissues)으로부터 또는 폐 조직으로부터 혈류로 쉽게 분산되는, 분비되거나 방출된 분자를 포함할 수 있다. 그것들은 또한 종양에 대한 반응으로 세포에 의해 만들어진 단백질을 포함할 수 있다. 확인된 바이오마커 또는 일련의 바이오마커는 일반적으로 임상적으로 입증되거나 그것이 선별된 원래의 의도된 용도를 위한 확실한 지표임을 보여준다. 바이오마커는 소분자(small molecules), 펩티드(peptides), 단백질(proteins) 및 핵산(nucleic acid)을 포함할 수 있다. 바이오마커의 확인에 영향을 미치는 몇몇의 주요 문제들은 이용가능한 데이터의 오버피팅(over-fitting) 및 데이터에서의 편향(bias)을 포함한다.

다양한 방법들이 바이오마커를 확인하고 질병을 진단하기 위한 시도에 사용되어 왔다. 단백질-기반 마커(protein-based markers)에 대하여, 이것들은 2차원 전기영동(two-dimensional electrophoresis), 질량 분석(mass spectrometry) 및 면역학적 검정(immunoassay)을 포함한다. 핵산 마커(nucleic acid marker)에 대하여, 이것들은 mRNA 발현 프로파일(mRNA expression profiles), 마이크로RNA 프로파일(microRNA profiles), FISH, 유전자 발현의 연속적 분석(serial analysis of gene expression, SAGE) 및 대규모 유전자 발현 어레이(large scale gene expression array)를 포함한다.

2차원 전기영동의 유용성은 낮은 검출 민감도; 단백질 용해도(protein solubility), 전하(charge) 및 소수성(hydrophobicity)에 대한 문제점; 겔 재생력(gel reproducibility); 및 단일 스팟(single spot)을 나타내는 다중 단백질(multiple proteins)의 가능성에 의해 제한된다. 사용되는 포맷에 의존하는 질량 분석법에 대하여, 제한사항은 샘플 처리 및 분리, 존재비가 낮은(low abundance) 단백질에 대한 민감도, 신호에 대한 잡음의 고려사항 및 검출된 단백질의 즉시 확인할 수 없음에 중점을 두고 있다. 바이오마커 발굴에 대한 면역학적 검정법 접근에서의 제한사항은 다수의 분석물을 측정하기 위한 항체-기반 다중 분석의 불가능에 중점을 두고 있다. 어떤 것은 고성능 항체의 어레이를 간단하게 찍을 수 있고, 샌드위치 검정을 사용하지 않고 그 항체들에 결합한 분석물을 측정할 수 있다. (이것은 생물 또는 세포에서 모든 DNA 또는 RNA 서열을 혼성화(hybridization)에 의해 측정하기 위하여 핵산 서열의 모든 게놈을 사용하는 것과 형식적으로 일치할 것이다. 혼성화는 확인을 위한 엄격한 테스트이기 때문에 상기 혼성화 실험은 도움이 된다. 그 매트릭스와 함께 단백질은 극도로 상이한 존재비(abundances)를 가지기 때문에, 오히려 매우 우수한 항체는 혈액 또는 오히려 세포 추출물의 맥락에서 작동하기 위한 그것들의 결합 파트너를 선택하는 데 충분히 엄격하지 않다.) 따라서, 그것은 바이오마커 발굴에 대한 면역학적 검정법에 기초한 접근법과는 상이한 접근법을 사용하여야만 한다 - 그것은 많은 분석물을 측정하는데 충분한 엄격함을 가짐과 동시에 분석물이 정말로 바이오마커인가를 결정하기 위한 다중 ELISA 검정법(즉, 샌드위치 검정법)을 사용할 필요가 있을 것이다. 샌드위치 면역학적 검정(sandwiches immunoassays)은 높은 함량에 대해서는 평가할 수 없으므로, 엄격한 샌드위치 면역검정법을 사용하는 바이오마커 발굴은 표준 어레이 포맷을 사용할 수 없다. 마지막으로, 항체 시약(antibody reagents)은 실질적인 로트(lot)의 변경(variability) 및 시약 불안정(instability)에 영향을 받기 쉽다. 단백질 바이오마커 발견에 대한 즉석 플랫폼(instant platform)은 이 문제를 극복한다.

이 방법들 중 다수는 분석 이전에 어떤 형태의 샘플 분리(sample fractionation)를 요하거나 그것에 의존한다. 따라서, 일련의 잘 확립된 샘플 집단에서 통계적으로 유의한 바이오마커를 확인/발굴하도록 설계된 충분히 효력이 있는 연구를 수행하기 위하여 요구되는 샘플의 조제는 매우 어렵고, 비용이 들며 시간이 소요된다. 분리하는 동안, 다양한 변경들이 다양한 샘플들에 도입될 수 있다. 예를 들어, 잠재적인 마커는 처리에 대하여 불안정할 수 있고, 상기 마커의 농도가 변경될 수 있고, 부적절한 응집(aggregation) 또는 분해(disaggregation)가 발생할 수 있으며, 우발적인 샘플 오염이 발생할 수 있으므로, 분명하지 않고 미세한 변화는 질병 초기에 예견된다.

이 기술들을 사용하는 바이오마커 발굴 및 검출 방법이 진단적 바이오마커의 확인에 심각한 한계를 가진다는 것이 일반적으로 받아들여지고 있다. 이 한계들은 존재비가 낮은(low-abundance) 바이오마커의 검출 불가능, 전체 동적 범위(entire dynamic range)의 프로테옴(proteome)을 지속적으로 포함하는 것의 불가능, 샘플 처리 및 분리에서의 비재현성(irreproducibility) 및 방법의 전체적인 비재현성 및 견고성(robustness)의 결여를 포함한다. 게다가, 이러한 연구들은 데이터에 편견이 개입되어 있으며, 표적 질병 집단 내에서 바이오마커를 확인하고 입증하는 데 요구되는 분포(distribution) 및 랜덤화(randomization)의 관점에서, 적절한 대조군을 포함하는 샘플 집단의 복잡성을 충분하게 처리할 수 없다.

비록 신규하고 효과적인 바이오마커의 발굴을 목표로 한 노력들이 수십 년 동안 계속되고 있지만, 이 노력들은 대체적으로 성공하지 못하였다. 다양한 질병들에 대한 바이오마커들은 전형적으로 학술 실험실에서, 주로 어떤 질병 과정에 대한 기초 연구를 하는 동안에 우연한 발견을 통하여 확인되어 왔다. 이러한 발견과 적은 양의 임상 데이터들에 기초하여, 신규한 바이오마커의 확인을 시사하는 논문들이 공개되었다. 그러나, 테스트된 적은 수의 임상 샘플들은 단지 효과적인 바이오마커가 실제 발굴되었는지에 대한 설득력이 없는 통계적인 증거만을 제공하기 때문에, 이들 제안된 바이오마커들 중 대부분은 실제로 또는 유용한 바이오마커로서 확인되지 않았다. 즉, 초기의 확인은 통계학의 기본적인 요소에 대하여 엄격하지 않았다. 각각 1994년에서 2003년도에 있어서, 과학 문헌의 검색은 바이오마커에 대한 수천의 참조문헌들이 공개되어 있음을 보여준다. 그러나, 같은 시기 동안 FDA는 기껏해야 1년에 3개의 신규한 단백질 바이오마커만을 진단용으로 승인했을 뿐이며, 몇 년간 어떠한 신규한 단백질 바이오마커도 승인되지 않았다.

실패한 바이오마커 발굴에 대한 노력의 역사에 기초하여, 질병에 대한 바이오마커는 희귀하며 발굴하기 어렵다는 일반적인 이해를 더 촉진하는 수학적 이론들이 제안되었다. 2D 겔 또는 질량 분석법에 기초한 바이오마커 연구는 이러한 개념들을 지지한다. 매우 적은 수의 유용한 바이오마커들이 이러한 접근법을 통하여 확인되었다. 그러나, 2D 겔 및 질량 분석법은 대략 1nM 농도 및 그보다 높은 농도로 혈액에 존재하는 단백질을 측정하며, 이 단백질의 앙상블은 아마도 질병과 함께 변하지 않을 것이라는 것이 주로 간과되었다. 즉석 바이오마커 발굴 플랫폼(instant biomarker discovery platform) 외에, 더욱 낮은 농도에서 단백질 발현 수준을 정확하게 측정할 수 있는 프로테오믹 바이오마커 발굴 플랫폼은 존재하지 않는다.

복잡한 인간 생물학에 대한 생화학적 경로들은 대부분 알려져 있다. 많은 생화학적 경로들은 결국 병리학 내에서 국소적으로 작용하는 분비된 단백질들, 예를 들어 병리학에서 다른 세포들의 복제를 자극하도록 분비되는 성장 인자에 의해 개시되며, 다른 인자들은 면역계 등을 피해 분비된다. 많은 이러한 분비된 단백질들이 측분비 방식(paracrine fashion)으로 작용하는 반면, 몇몇은 신체에서 말초적으로(distally)으로 작용한다. 생화학적 경로에 대한 기초적인 이해를 가진 당업자들은 많은 병인-특이적(pathology-specific) 단백질들이 2D 겔 및 질량 분석법의 검출 한계 이하(심지어는 그보다 더 낮은)의 농도로 혈액에 존재한다는 것을 이해할 것이다. 이 상대적으로 풍부한 수의 질병 바이오마커의 확인에 선행되어야만 하는 것은 2D 겔 또는 질량 분석법에 의해 검출가능한 정도 이하의 농도에서 단백질을 분석할 수 있는 프로테오믹 플랫폼이다.

따라서, (a) 폐암에 대한 위험성이 매우 높은 흡연자를 선별(screening); (b) 악성 폐 결절과 양성 폐 결절의 구별(differentiation); (c) 폐암 바이오마커의 검출; 및 (d) 폐암의 진단이 가능한 바이오마커, 방법, 기구, 시약, 시스템 및 키트에 대한 요구가 존재한다.

요약

본 발명은 암, 더욱 상세하게는 비소세포 폐암(NSCLC)의 검출 및 진단을 위한 바이오마커, 방법, 시약, 기구, 시스템 및 키트를 포함한다. 본 발명의 바이오마커는 실시예 1에 상세히 설명되어 있는 다중 압타머-기반 검정법(multiplex aptamer-based assay)을 사용하여 확인되었다. 본원에 기재되어 있는 상기 압타머-기반 바이오마커 확인 방법을 사용함으로써, 본 발명은 놀랍게도 비소세포 폐암의 검출 및 진단에 유용한 상당수의 비소세포 폐암 바이오마커를 기재한다. 이 바이오마커를 확인하는데 있어서, 수백 명의 개개인의 샘플로부터 얻어진 1000개 이상의 단백질을 측정하였으며, 그것들 중 몇몇은 극히 낮은 1000조분의 1몰 범위(femtomolar range)의 농도로 측정되었다. 이는 2D 겔 및/또는 질량 분석법으로 처리되는 바이오마커 발견 실험보다 약 4차수(four orders of magnitude) 정도 낮은 것이다.

기재된 비소세포 폐암 바이오마커 중 어떤 것은 비소세포 폐암을 검출하고 진단하는데 단독으로 유용하긴 하지만, 바이오마커의 패널로서 유용한 비소세포 폐암 바이오마커의 다중 서브셋(multiple subsets)의 분류를 위한 방법을 본원에 설명하였다. 일단 개개인의 바이오마커 또는 바이오마커의 서브셋이 확인되면, 개인에서의 비소세포 폐암의 검출 또는 진단은 생물학적 샘플에서 선별된 바이오마커 또는 바이오마커들의 레벨 차이를 측정할 수 있는 임의의 검정 플랫폼(assay platform) 또는 포맷(format)을 사용하여 달성될 수 있다.

그러나, 그것은 본원에 기재된 압타머-기반 바이오마커 확인 방법에 의해서만 가능하며, 여기에서 1000개가 넘는 별개의 잠재적인 바이오마커 값들은 본원에 기재된 비소세포 폐암 바이오마커를 확인할 수 있는, 이전에 비소세포 폐암으로 진단되거나 비소세포 폐암이 아닌 것으로 진단된 다수의 개인들로부터 개별적으로 확인된다. 이 발견적 접근은 인체 병리학에 대한 해석을 필요로 하지 않는 환자 중심의 시스템(patient-relevant system)에 대해 더욱 많은 문의를 제기하므로, 조건 배지(conditioned media) 또는 용해된 세포(lysed cells)로부터의 바이오마커의 발견과는 극명히 대조된다.

따라서, 본 발명의 일 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암(NSCLC)을 진단하기 위하여 단독 또는 다양한 조합으로 사용하거나, CT 스캔 또는 다른 영상화 방법으로 확인된 쉽게 규정할 수 없는 폐결절(pulmonary nodule)을 가진 개인에게서 발견된 것과 같은 양성 상태(benign conditions)와 비소세포 폐암의 감별 진단(differential diagnosis), 비소세포 폐암에 대한 위험이 높은 흡연자의 선별 및 비소세포 폐암에 걸린 개인의 진단을 가능하게 하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커를 제공한다. 상기 언급한 바와 같이 표 1에 제공된 바이오마커를 포함하는 예시적 구현은 실시예 1에서 일반적으로 설명되며 실시예 2 및 5에서 더욱 특별히 설명되는 다중 압타머-기반 검정법을 사용하여 확인된다. 표 1에 제공된 마커들은 고위험 집단에서 비소세포 폐암을 진단하고, 쉽게 규정할 수 없는 폐결절을 가진 개인에게서 비소세포 폐암과 양성 폐질환을 감별하는데 유용하다.

기재된 비소세포 폐암 바이오마커 중 어떤 것은 비소세포 폐암을 검출하고 진단하는데 단독으로 유용하다 할지라도, 두 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 비소세포 폐암 바이오마커의 다중 서브셋의 분류를 위한 방법을 본원에 기술하였다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현들은 N의 바이오마커를 포함하는 조합을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 두 개의 바이오마커이다. 다른 구현에서, N은 2-59의 바이오마커로부터 임의의 수로 선택된다.

여전히 다른 구현에서, N은 2-5, 2-10, 2-15,2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55 또는 2-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55 또는 3-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 4-5, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55 또는 4-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55 또는 5-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6-55 또는 6-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7-55 또는 7-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55 또는 8-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 9-10, 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55 또는 9-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55 또는 10-59로부터 임의의 수로 선택된다. N은 유사한 범위를 포함하나 더 고차의 범위를 포함하도록 선택될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 비소세포 폐암인 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인이 비소세포 폐암일 가능성은 상기 바이오마커 값에 기초하여 결정된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 바이오마커 값에 기초하여 비소세포 폐암인 것으로 분류되며, 여기에서 N = 2-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인이 비소세포 폐암일 가능성은 상기 바이오마커 값에 기초하여 결정되며, 여기에서 N = 2-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인이 비소세포 폐암이 아님을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 비소세포 폐암이 아닌 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 상기 개인이 폐암에 걸리지 않았음을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 폐암이 아닌 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 18에 기재되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 상기 개인이 폐암에 걸리지 않았음을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 바이오마커 값에 기초하여 비소세포 폐암이 아닌 것으로 분류되며, 여기에서 N = 2-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 N의 바이오마커 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인이 비소세포 폐암인지를 나타내며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 2-11에 제시되어 있는 패널 세트의 군으로부터 선택된 바이오마커 또는 바이오마커의 패널에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인이 비소세포 폐암인지를 나타낸다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 N의 바이오마커 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 비소세포 폐암의 부재(absence)를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인에서의 비소세포 폐암의 부재를 나타내며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 N의 바이오마커 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 비소세포 폐암의 부재를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인에서의 비소세포 폐암의 부재를 나타내며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 2-11에 제공된 패널의 군으로부터 선택된 바이오마커의 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 비소세포 폐암의 부재를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인에서의 비소세포 폐암의 부재를 나타낸다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 미리 결정된 역치(threshold)로부터 벗어난 분류 스코어에 기초하여 비소세포 폐암인 것으로 분류되며, 여기에서 N = 2-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 비소세포 폐암의 부재를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 미리 결정된 역치로부터 벗어난 분류 스코어에 기초하여 비소세포 폐암이 아닌 것으로 분류되며, 여기에서 N = 2-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는(computer-implemented) 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하고, 여기에서 N은 상기에 정의된 것과 같이 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택되며; 각각의 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 수많은 분류에 기초하여 개인의 비소세포 폐암일 가능성을 보여주는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암인지 아닌지로 개인을 분류하기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 각각의 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 수많은 분류에 기초하여 개인이 비소세포 폐암인지 아닌지를 보여주는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서(processor)에 의해 실행가능한 프로그램 코드(program code)를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체(computer readable medium)를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플로부터 얻은 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며, 여기에서 N은 상기에 정의된 것과 같으며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 비소세포 폐암일 가능성을 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인의 비소세포 폐암 상태(status)를 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플로부터 얻은 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하고; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 비소세포 폐암 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하고; 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 및 상기 분류에 기초하여 상기 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 보여주는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암인지 아닌지로 개인을 분류하기 위한 컴퓨터로 구현되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터로부터 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 및 상기 분류에 기초하여 상기 개인이 비소세포 폐암인지 아닌지를 보여주는 것을 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻은 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 상기 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 본 발명은 개인의 비소세포 폐암 상태를 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며; 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 비소세포 폐암 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

기재된 바이오마커 중 어떤 것은 일반적인 암을 검출하고 진단하는 데 단독으로 유용하긴 하지만, 일반적으로 암을 검출하고 진단하기 위한 바이오마커의 패널로서 유용한 바이오마커의 다중 서브셋(multiple subsets)의 분류를 위한 방법을 본원에 기술하였다. 일단 개개인의 바이오마커 또는 바이오마커의 서브셋이 확인되면, 개인에서의 암의 검출 또는 진단은 생물학적 샘플에서 선별된 바이오마커 또는 바이오마커들의 레벨 차이를 측정할 수 있는 임의의 검정 플랫폼(assay platform) 또는 포맷(format)을 사용하여 달성될 수 있다.

그러나, 그것은 본원에 기재된 압타머-기반 바이오마커 확인 방법을 사용하는 것에 의해서만 가능하며, 여기에서 1000개가 넘는 별개의 잠재적인 바이오마커 값들은 본원에 기재된 암 바이오마커를 확인할 수 있는, 이전에 암으로 진단되거나 암이 아닌 것으로 진단된 다수의 개인들로부터 개별적으로 확인된다. 이 발견적 접근은 인체 병리학에 대한 해석을 필요로 하지 않는 환자 중심의 시스템(patient-relevant system)에 대해 더욱 많은 문의를 제기하므로, 조건 배지(conditioned media) 또는 용해된 세포(lysed cells)로부터의 바이오마커의 발견과는 극명히 대조된다.

따라서, 본 발명의 일 양상에서, 본 발명은 암을 진단하기 위하여 단독 또는 다양한 조합으로 사용하기 위한 하나 또는 그 이상의 바이오마커를 제공한다. 예시적 구현은 실시예 1에서 일반적으로 설명되며 실시예 6에서 더욱 특별히 설명되는 다중 압타머-기반 검정법을 사용하여 확인되는 표 19에 제공된 바이오마커를 포함한다. 표 19에 제공된 마커들은 암이 아닌 개인들과 암에 걸린 개인을 감별하는데 유용하다.

기재된 암 바이오마커 중 어떤 것은 암을 검출하고 진단하는 데 단독으로 유용하긴 하지만, 세 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 암 바이오마커의 다중 서브셋(multiple subsets)의 분류를 위한 방법을 본원에 기술하였다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현들은 N의 바이오마커를 포함하는 조합을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 세 개의 바이오마커이다. 다른 구현에서, N은 3-23의 바이오마커로부터 임의의 수로 선택된다.

여전히 다른 구현에서, N은 2-5, 2-10, 2-15, 2-20 또는 2-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 3-5, 3-10, 3-15, 3-20 또는 3-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 4-5, 4-10, 4-15, 4-20 또는 4-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 5-10, 5-15, 5-20 또는 5-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 6-10, 6-15, 6-20 또는 6-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 7-10, 7-15, 7-20 또는 7-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 8-10, 8-15, 8-20 또는 8-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 9-10, 9-15, 9-20 또는 9-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 10-15, 10-20 또는 10-23으로부터의 임의의 수로 선택된다. N은 유사한 범위를 포함하나 더 고차의 범위를 포함하도록 선택될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 암인 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인이 암일 가능성은 상기 바이오마커 값에 기초하여 결정된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 바이오마커 값에 기초하여 암인 것으로 분류되며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인이 암일 가능성은 상기 바이오마커 값에 기초하여 결정되며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 대응하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 상기 개인이 암이 아님을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 암이 아닌 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 상기 개인이 암이 아님을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여 암이 아닌 것으로 분류된다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 상기 개인이 암이 아님을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 상기 바이오마커 값에 기초하여 암이 아닌 것으로 분류되며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 N의 바이오마커의 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커는 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인이 암을 가짐을 보여주며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 20-29에 제시된 패널의 군으로부터 선택된 바이오마커의 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인이 암을 가짐을 보여준다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 N의 바이오마커 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 암의 부재(absence)를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커는 표 19에 제시되어 있는 바이오마커 군으로부터 선택되며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인에서의 암의 부재를 나타내며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 20-29에 제공된 패널의 군으로부터 선택된 바이오마커의 패널 상의 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 암의 부재를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 바이오마커 값의 분류는 상기 개인에서의 암의 부재를 나타낸다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 개인에게서 암을 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 미리 결정된 역치(threshold)로부터 벗어난 분류 스코어에 기초하여 암인 것으로 분류되며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 개인에게서 암의 부재를 진단하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 개인은 미리 결정된 역치(threshold)로부터 벗어난 분류 스코어에 기초하여 암이 아닌 것으로 분류되며, 여기에서 N = 3-10이다.

다른 양상에서, 본 발명은 암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며, 여기에서 N은 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택되며; 상기 각각의 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 실행하는 것; 그리고 수많은 분류에 기초하여 상기 개인이 암일 가능성을 나타내는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 암인지 아닌지로 개인을 분류하기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 19에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 상기 각각의 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 그리고 수많은 분류에 기초하여 상기 개인이 암인지 아닌지를 나타내는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며, 여기에서 N은 상기에 정의된 것과 같으며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 암일 가능성을 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 개인의 암 상태를 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 암 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 19에 제시되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 그리고 상기 분류에 기초하여 상기 개인이 암일 가능성을 나타내는 것을 포함한다.

다른 양상에서, 본 발명은 암인지 아닌지로 개인을 분류하기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법을 제공한다. 상기 방법은 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터로 검색하는 것, 여기에서 상기 바이오마커 정보는 표 19에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택되는 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 상기 바이오마커 값의 분류를 컴퓨터로 수행하는 것; 그리고 상기 분류에 기초하여 개인이 암인지 아닌지를 나타내는 것을 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 본 발명은 암일 가능성을 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 19에 기재되어 있는 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 암일 가능성을 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 본 발명은 개인의 암 상태를 보여주기 위한 컴퓨터 프로그램 제품을 제공한다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하고 있는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하며, 상기 프로그램 코드는 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드, 여기에서 상기 데이터는 표 19에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서의 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 그리고 바이오마커 값의 함수로서 개인의 암 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

본 발명은 폐암의 검출 및 진단을 위한 바이오마커를 확인하기 위한 기술을 제공하며, 이 기술을 이용하여 확인된 바이오마커는 폐암을 진단하는 데 유용하다.

도 1a는 생물학적 샘플에서 비소세포 폐암을 검출하기 위한 예시적 방법에 대한 흐름도이다.
도 1b는 나이브 베이즈(naive bayes) 분류 방법을 사용하는 생물학적 샘플에서 비소세포 폐암을 검출하기 위한 예시적 방법에 대한 흐름도이다.
도 2는 비소세포 폐암을 검출하는 테스트를 위한 나이브 베이즈 분류기(naive bayes classifier)를 사용하여 단일 바이오마커인 MMP7에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이다.
도 3은 비소세포 폐암을 검출하는 테스트를 위한 나이브 베이즈 분류기를 사용하여 2에서 10까지의 바이오마커로부터의 바이오마커 패널에 대한 ROC 곡선을 나타낸 것이다.
도 4는 비소세포 폐암 패널을 위한 나이브 베이즈 분류기를 사용하여 1에서 10까지 증가된 바이오마커의 수로서 분류 스코어(classification score)(AUC)에서의 증가를 나타낸 것이다.
도 5는 나이브 베이즈 분류기를 트레이닝하는데 사용되는 정규 누적분포함수(normal cdf)(파선)에 대한 그것들의 커브핏(curve fits)에 따라 흡연자 및 양성 결절 대조군의 조합(실선) 및 비소세포 폐암 질병군(점선)에 대한 로그 변환 RFU(log-transformed RFU)에서의 누적분포함수(cumulative distribution function)로서 MMP7에 대하여 측정된 바이오마커 분포를 나타낸 것이다.
도 6은 본원에 기재된 다양한 컴퓨터에 의해 실행되는 방법과 함께 사용하기 위한 예시적인 컴퓨터 시스템을 나타낸 것이다.
도 7은 일 구현에 따라서 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 나타내는 방법에 대한 흐름도이다.
도 8은 일 구현에 따라서 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 나타내는 방법에 대한 흐름도이다.
도 9는 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커를 검출하는데 사용될 수 있는 예시적인 압타머 검정법을 나타낸 것이다.
도 10은 잠재적 바이오마커의 집합된 세트로부터 NSCLC와 양성 결절을 감별하기 위한 분류기를 확립하는데 사용되는 바이오마커에 대한 빈도 막대그래프를 나타낸 것이다.
도 11a는 표 1에 제시된 바이오마커 세트(검정색) 및 랜덤 마커 세트(회색)을 사용하여 모든 가능한 단일 단백질 나이브 베이즈 분류기 스코어(AUC)를 요약한 한 쌍의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 11b는 표 1에 제시된 바이오마커 세트(검정색) 및 랜덤 마커 세트(회색)을 사용하여 모든 가능한 두 개의 단백질 단백질 나이브 베이즈 분류기 스코어(AUC)를 요약한 한 쌍의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 11c는 표 1에 제시된 바이오마커 세트(검정색) 및 랜덤 마커 세트(회색)을 사용하여 모든 가능한 세 개의 단백질 단백질 나이브 베이즈 분류기 스코어(AUC)를 요약한 한 쌍의 막대 그래프를 나타낸 것이다.
도 12는 풀 패널(full panel)로부터 선택된 2에서 10까지의 마커 및 분류기를 생성하는 동안 최적의 5, 10 및 15 마커를 적하함으로써 얻어진 스코어 사용하여 나이브 베이즈 분류기에 대한 AUC를 나타낸 것이다.
도 13a는 2에서 5까지의 패널에 대한 표 14에 있는 데이터로부터 만들어진 ROC 곡선 세트를 나타낸 것이다.
도 13b는 도 12a에서와 같이 2에서 5까지의 마커로부터의 패널에 대한 트레이닝 데이터로부터 계산된 ROC 곡선 세트를 나타낸 것이다.
도 14는 실시예 5에 기술된 임상적 바이오마커 패널로부터 계산된 ROC 곡선을 나타낸 것이다.
도 15a 및 15b는 실시예 6에 기술된 그리디 선별 과정(greedy selection procedure)에 의해 선별된 10개의 암 바이오마커(표 19)와 1,000개의 랜덤하게 샘플링된 10개의 "비 마커(non marker)" 바이오마커 세트간의 성능 비교를 나타낸 것이다. 표 19에 있는 10개의 암 바이오마커에 대한 평균 AUC는 수직의 점선으로 나타내었다. 도 15a에서, 10개의 "비 마커"의 세트는 실시예 6에 기술된 그리디 과정에 의해 선별되지 않도록 랜덤하게 선별된다. 도 15b에서, 15a에서와 같이 동일한 과정이 사용되지만, 샘플링은 실시예 6에 기술된 그리디 과정에 의해 선별되지 않은 표 1에 남아있는 49개의 비소세포 폐암 바이오마커로 한정된다.
도 16은 표 31에 제시된 3개의 나이브 베이즈 분류기에 대한 수신자 조작 특성(receiver operating characteristic, ROC) 곡선을 나타낸 것이다. 각 연구에 대한 곡선 아래 면적(area under the curve, AUC) 또한 범례 옆에 나타내었다.

참조는 본 발명의 대표적인 구현을 상세하게 해줄 것이다. 본 발명은 열거된 구현들과 함께 기술될 수 있음과 동시에, 본 발명을 그 구현들로 제한하고자 하는 것이 아님을 이해할 것이다. 이에 반하여, 본 발명은 청구항에 의해 정의된 것과 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변경 및 동등물을 포함한다.

당업자들은 본원에 기술된 것들과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질들이 본 발명의 실시에 사용될 수 있고 본 발명의 실시 범위 내에 있음을 알 것이다. 본 발명은 기술된 방법 및 물질들을 결코 한정하지 않는다.

달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자들에게 일반적으로 통용되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 기구 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다 할지라도, 바람직한 방법, 기구 및 물질을 지금 기술한다.

본 발명에 인용된 모든 문헌, 공개된 특허 문서 및 특허 명세서들은 그 명세서가 속하는 기술분야의 수준을 나타낸다. 본원에 인용된 모든 문헌, 공개된 특허 문서 및 특허 명세서들은 비록 각각의 문헌, 공개된 특허 문서 또는 특허 명세서가 참조에 의해 통합되는 것으로 명확하고 개별적으로 나타내었을 지라도 이와 마찬가지로 참조에 의해 통합되어 있다.

첨부된 청구항을 포함하는 이 명세서에서 사용된 것으로서, 단수형태 "하나("a", "an" 및 "the")"는 달리 그 내용을 명확하게 지시하지 않는 한 복수의 참조(plural reference)를 포함하며, "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 그 이상(one or more)"과 상호교환적으로 사용된다. 따라서, 참고로 "압타머(an aptamer)"는 압타머의 혼합물을 포함하고, 참고로 "프로브(a probe)"는 프로브의 혼합물 등을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "약(about)"은 수치가 관련되어 있는 항목의 기본 기능이 변경되지 않는 한, 대수롭지 않은 수치의 변경 또는 변화를 나타낸다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "포함하다("comprises", "comprising", "includes", "including", "contains", "containing")" 및 그것의 임의의 변화들은 공정, 방법, 제법 한정 제품(product-by-process) 또는 물질의 조성물(composition of matter)이 단지 그 성분만을 포함하지는 않지만 특별히 열거되지 않은 다른 성분 또는 이와 같은 공정, 방법, 제법 한정 제품 또는 물질의 조성물에 본래 포함될 수 있는 한, 비배타적인 포함(nonexclusive inclusion)을 포함한다.

본 발명은 비소세포 폐암 및 더욱 일반적으로는 암의 검출 및 진단을 위한 바이오마커, 방법, 기구, 시약, 시스템 및 키트를 포함한다.

일 양상에서, 비소세포 폐암을 진단하고, CT 스캔 또는 다른 영상화 방법으로 확인된 정확히 규정할 수 없는 폐 결절을 가진 개인에게서 발견된 비-악성 상태(non-malignant conditions)로부터 비소세포 폐암의 감별진단, 비소세포 폐암에 대한 위험이 높은 흡연자의 선별 및 비소세포 폐암을 가진 개인을 진단할 수 있게 하고, 비소세포 폐암의 재발을 관리하거나 다른 임상적 징후를 처리하기 위하여, 단독 또는 다양한 조합으로 사용하기 위한 하나 또는 그 이상의 바이오마커가 제공된다. 하기에 상세히 기술된 바와 같이, 예시적 구현들은 실시예 1, 더욱 특별하게는 실시예 2에 일반적으로 기술된 다중 압타머-기반 검정법을 사용하여 확인된 표 1에 제공된 바이오마커를 포함한다.

표 1은 비소세포 폐암 케이스들로부터의 수많은 개인 혈액 샘플 및 흡연자들 및 양성 폐 결절을 가지는 것으로 진단된 개인으로부터의 수많은 동등한 개인 혈액 샘플을 분석하여 얻어진 발견을 제시한다. 상기 흡연자 및 양성 폐 결절 대조군은 비소세포 폐암 진단 테스트가 가장 큰 이점을 낼 수 있는 집단과 매치되도록 설계된다. 이들 케이스 및 대조군들은 이러한 테스트들이 적용될 수 있는 조건 하에서 현실 세계의 범위를 모방할 수 있는 다중 임상 부문으로부터 얻어진다. 잠재적인 바이오마커는 질병 및 대조군 혈액을 풀링(pooling)하기 보다는 각각의 샘플에서 측정되며; 이는 질병의 존재 여부와 관련된 표현형(이 경우에는 비소세포 폐암)이 다른 개인 및 그룹에 대한 보다 나은 이해를 가능하게 한다. 1000개 이상의 단백질 측정이 각각의 샘플 상에서 이루어지고 각 질병 및 대조군 집단으로부터의 몇백의 샘플들이 개별적으로 측정되었기 때문에, 표 1은 굉장히 큰 규모의 데이터 세트의 분석으로부터 얻어진다. 상기 측정값은 본원의 "바이오마커의 분류 및 질병 스코어의 계산" 에 기술된 방법을 사용하여 분석되었다. 표 1은 흡연자와 양성 폐 결절로부터 얻어진 "대조군" 샘플로부터 비소세포 폐암을 가진 개인으로부터 얻어진 샘플을 구별하는데 유용한 것으로 밝혀진 59개의 바이오마커를 열거한 것이다.

기술된 비소세포 폐암 바이오마커 중 어떤 것은 비소세포 폐암을 검출하고 진단하는데 단독으로 유용할 수 있으나, 각각의 분류(grouping) 또는 서브셋(subset) 선별이 "바이오마커 패널(biomarker panel)" 및 패널로서 본원에서 상호교환적으로 칭해지는 세 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 유용한 경우, 비소세포 폐암 바이오마커의 다중 서브셋의 분류를 위한 방법 또한 본원에 기술된다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현들은 N의 바이오마커를 포함하는 조합들을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 두 개의 바이오마커이다. 다른 구현에서, N은 2-59의 바이오마커들로부터 선택된다.

여전히 다른 구현에서, N은 2-5, 2-10, 2-15,2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55 또는 2-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 3-5, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55 또는 3-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 4-5, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55 또는 4-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55 또는 5-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6-55 또는 6-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7-55 또는 7-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55 또는 8-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 9-10, 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55 또는 9-59로부터 임의의 수로 선택된다. 다른 구현에서, N은 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55 또는 10-59로부터 임의의 수로 선택된다. N은 유사한 범위를 포함하나 더 고차의 범위를 포함하도록 선택될 수 있음을 알 수 있을 것이다.

일 구현에서, 바이오마커 서브셋 또는 패널에 유용한 바이오마커의 수는 특정 조합의 바이오마커 값에 대한 민감도 및 특이도 값에 기초한다. 상기 용어 "민감도(sensitivity)" 및 "특이도(specificity)"는 본원에서 그들의 생물학적 샘플에서 검출된 하나 또는 그 이상의 바이오마커 값에 기초하여, 비소세포 폐암이거나 비소세포 폐암이 아닌 것으로 개인을 정확하게 분류하는 능력에 대하여 사용된다. "민감도"는 비소세포 폐암을 가지는 개인을 정확하게 분류하는 것에 대한 바이오마커의 성능(performance)을 나타낸다. "특이도"는 비소세포 폐암이 아닌 개인을 정확하게 분류하는 것에 대한 바이오마커의 성능을 나타낸다. 예를 들어, 대조군 샘플 및 비소세포 폐암 샘플의 세트를 테스트하기 위하여 사용된 마커의 패널에 대한 85%의 특이도와 90%의 민감도는 85%의 대조군 샘플이 패널에 의해 대조군 샘플로서 정확하게 분류되었고, 90%의 비소세포 폐암 샘플이 패널에 의해 비소세포 폐암 샘플로서 정확하게 분류되었음을 나타낸다. 이상적인 또는 바람직한 최소값은 실시예 3에 기술된 것과 같이 결정될 수 있다. 대표적인 패널은 각 패널에 대하여 바람직한 레벨의 특이도 및 민감도를 가지는 3-10 바이오마커의 일련의 100개의 서로 다른 패널을 제시하고 있는 표 4-11에 제시되어 있다. 이들 패널 각각에서 각 마커의 발생의 총 수를 표 12에 나타내었다.

일 양상에서, 비소세포 폐암은 개인으로부터의 생물학적 샘플 상에서 검정을 수행하고, 바이오마커 MMP7, CLIC1 또는 STX1A 및 표 1의 바이오마커 리스트로부터 선택된 적어도 N의 추가적인 바이오마커 중 적어도 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에게서 검출되거나 진단되며, 여기에서 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9와 동일하다. 다른 양상에서, 비소세포 폐암은 개인으로부터의 생물학적 샘플 상에서 검정을 수행하고, 바이오마커 MMP7, CLIC1 또는 STX1A 및 표 1의 바이오마커 리스트로부터 선택된 적어도 N의 추가적인 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에게서 검출되거나 진단되며, 여기에서 N은 1, 2, 3, 4, 5, 6 또는 7과 동일하다. 다른 양상에서, 비소세포 폐암은 개인으로부터의 생물학적 샘플 상에서 검정을 수행하고, 바이오마커 MMP7 및 표 1의 바이오마커 리스트로부터 선택된 적어도 N의 추가적인 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에게서 검출되거나 진단되며, 여기에서 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9와 동일하다. 다른 양상에서, 비소세포 폐암은 개인으로부터의 생물학적 샘플 상에서 검정을 수행하고, 바이오마커 CLIC1 및 표 1의 바이오마커 리스트로부터 선택된 적어도 N의 추가적인 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에서 검출되거나 진단되며, 여기에서 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9와 동일하다. 다른 양상에서, 비소세포 폐암은 개인으로부터의 생물학적 샘플 상에서 검정을 수행하고, 바이오마커 STX1A 및 표 1의 바이오마커 리스트로부터 선택된 적어도 N의 추가적인 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에게서 검출되거나 진단되고, 여기에서 N은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 9와 동일하다.

본원에서 확인된 비소세포 폐암 바이오마커는 비소세포 폐암을 효과적으로 검출하거나 진단하는 데 사용될 수 있는 바이오마커의 서브셋 또는 패널에 대한 상대적으로 많은 수의 선택을 나타낸다. 바람직한 수의 이러한 바이오마커의 선택은 선택된 바이오마커의 특정 조합에 의존한다. 비소세포 폐암을 검출하거나 진단하기 위한 바이오마커의 패널은 또한 표 1에서 발견되지 않은 바이오마커를 포함할 수 있고, 표 1에서 발견되지 않은 추가적인 바이오마커의 포함은 표 1로부터 선택된 특정 서브셋 또는 패널에서 바이오마커의 수를 감소시킬 수 있다는 것에 대하여 유념할 필요가 있다. 서브셋 또는 패널에서 사용된 표 1로부터의 바이오마커의 수 또한 주어진 검정에 대하여 수용가능한 민감도 및 특이도 값을 확립하기 위하여 추가적인 생물의학 정보가 바이오마커 값과 함께 사용된다면 감소될 수 있다.

바이오마커의 서브셋 또는 패널에 사용되는 바이오마커의 수에 영향을 줄 수 있는 다른 인자는 비소세포 폐암에 대하여 진단될 개인으로부터의 생물학적 샘플을 얻기 위하여 사용된 과정이다. 신중하게 제어된 샘플 획득 환경에서, 바람직한 민감도 및 특이도 값을 만족시키는 데 필요한 바이오마커의 수는 샘플의 수집, 취급 및 저장에 더욱 변화를 줄 수 있는 환경에서보다 낮아질 것이다. 표 1에 제시된 바이오마커 리스트를 개발하는 데 있어서, 분류기 트레이닝을 위한 데이터를 수집하기 위하여 다중 샘플 수집 부위가 사용되었다. 이것은 샘플의 수집, 취급 및 저장에 있어서 변화에 덜 민감하지만, 또한 서브셋 또는 패널에서의 바이오마커의 수가 트레이닝 데이터가 매우 유사한 환경 하에서 모두 얻어진 경우에서보다 클 것을 요구할 수 있는 더욱 견고한 바이오마커를 제공한다.

본 발명의 일 양상은 도 1a 및 1b를 참고하여 일반적으로 기재될 것이다. 생물학적 샘플은 관심 있는 개인(들)로부터 얻어진다. 상기 생물학적 샘플은 그 후 관심 있는 하나 또는 그 이상의(N) 바이오마커의 존재를 검출하고, 상기 N의 바이오마커(도 1b에 마커 RFU로서 언급됨) 각각에 대한 바이오마커 값을 결정하기 위하여 분석된다. 일단 바이오마커가 검출되고 바이오마커 값이 정해지면, 각각의 마커는 본원에 상세히 기재된 것과 같이 점수가 매겨지거나 분류된다. 상기 마커 스코어는 샘플을 얻은 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 나타내는 전체 진단 스코어를 제공하기 위하여 합해진다.

본원에 사용된 것으로서, "폐(lung)"는 "폐(pulmonary)"로서 상호교환적으로 언급될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "흡연자(smoker)"는 담배 연기 흡입의 병력(history)을 가지는 개인을 말한다.

"생물학적 샘플(biological sample)", "샘플(sample)" 및 "시료(test sample)"는 개인으로부터 얻어지거나 만약 그렇지 않으면 개인으로부터 유래된 임의의 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 말하는 것으로 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 이것은 (전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복막 세척액(peritoneal washing), 낭종액(cystic fluid), 뇌척수막 액(meningeal fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 세포액(cytologic fluid), 복수(ascites), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 기관지 찰과물(bronchial brushing), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 조직 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함한다. 이것은 또한 모든 절차 중 실험적으로 분리된 단편(fractions)을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청 또는 적혈구 세포 또는 백혈구 세포(white blood cells; leukocytes)와 같은 특정 형태의 혈액 세포를 포함하는 단편으로 단편화될 수 있다. 만일 원한다면, 샘플은 조직 및 체액 샘플의 조합과 같은 개인으로부터의 샘플 조합일 수 있다. 상기 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 또한 예를 들어, 대변 샘플, 조직 샘플 또는 조직 생검으로부터의 샘플과 같은 균질화된 고체 물질을 포함하는 물질을 포함한다. 상기 용어 "생물학적 샘플"은 또한 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 얻기 위한 임의의 적절한 방법이 사용될 수 있고; 대표적인 방법은 예를 들어, 채혈(phlebotomy), 면봉법(swab)(예를 들어, 구강상피세포 면봉법(buccal swab)) 및 세침 흡인 조직검사(fine needle aspirate biopsy procedure)를 포함한다. 세침 흡인에 적합한 대표적인 조직은 림프절, 폐, 폐 세척액, BAL(기관지폐포 세척액, bronchoalveolar lavage), 흉막(pleura), 갑상선(thyroid), 유방(breast), 췌장(pancreas) 및 간(liver)을 포함한다. 샘플들은 또한 예를 들어, 미세절개(micro dissection)(예를 들어, 레이저 포획 미세절개(laser capture microdissection; LCM) 또는 레이저 미세 절개(laser micro dissection; LMD)), 방광 세척(bladder wash), 도말(smear)(예를 들어, PAP 도말) 또는 유즙도관 세척법(ductal lavage)에 의해 수집될 수 있다. 개인으로부터 얻어지거나 유래된 "생물학적 샘플"은 개인으로부터 얻어진 후 임의의 적절한 방법으로 처리된 임의의 이러한 샘플을 포함한다.

게다가, 생물학적 샘플은 다수의 개인들로부터 생물학적 샘플을 취하고 그것들을 합치거나(pooling) 각 개인의 생물학적 샘플의 앨리컷을 합침(pooling)으로써 얻어질 수 있다. 상기 합쳐진 샘플은 개인으로부터의 샘플로서 처리될 수 있고, 만약 합쳐진 샘플에서 암이 존재하는 것으로 밝혀지면, 그 후 각 개인의 생물학적 샘플은 상기 개인이 비소세포 폐암을 가짐을 결정하기 위하여 재조사될 수 있다.

설명을 위한 목적으로, 문구 "개인으로부터의 생물학적 샘플로부터 얻은 데이터(data attributed to a biological sample form an individual)"는 개인의 생물학적 샘플로부터 유래되거나 그것을 이용하여 생성된 어떤 형태의 데이터를 의미하기 위한 것이다. 상기 데이터는 하나의 측정 시스템에서의 단위를 다른 측정 시스템으로의 단위로 전환시키는 것에 의한 것과 같이, 생성된 후 어느 정도 재구성(reformatted), 정정(revised) 또는 수학적으로 변경(mathematically altered)될 수 있으나, 상기 데이터는 상기 생물학적 샘플로부터 유래되거나 그것을 사용하여 생성된 것으로 이해된다.

"표적(target)", "표적 분자(target molecule)" 및 "분석물(analyte)"은 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 관심 있는 임의의 분자를 칭하기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. "관심 분자(molecule of interest)"는 예를 들어, 단백질의 경우에 아미노산 서열에서의 경미한 변화, 이황화 결합 형성(disulfide bond formation), 글리코실화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경시키지 않는 표지 성분(labeling component)과의 결합과 같은 임의의 다른 조작(manipulation) 또는 변경(modification)과 같은 특정 분자의 임의의 경미한 변화(minor variation)를 포함한다. "표적 분자", "표적" 또는 "분석물"은 하나의 형태 또는 종류의 분자 또는 다중-분자 구조의 복제 세트이다. "표적 분자들", "표적들" 및 "분석물들"은 하나 이상의 이러한 분자들의 세트를 말한다. 대표적인 표적 분자는 단백질(proteins), 폴리펩티드(polypeptides), 핵산(nucleic acids), 탄수화물(carbohydrates), 지질(lipids), 다당류(polysaccharides), 당단백(glycoproteins), 호르몬(hormones), 수용체(receptors), 항원(antigens), 항체(antibodies), 애피바디(affibodies), 자기항체(autoantibodies), 항체 모방체(antibody mimics), 바이러스(viruses), 병원체(pathogens), 독성 물질(toxic substances), 기질(substrates), 대사물질(metabolites), 전이상태 유사체(transition state analogs), 보조인자(cofoactors), 억제제(inhibitors), 약물(drugs), 염료(dyes), 영양분(nutrients), 성장 인자(growth factors), 세포(cells), 조직(tissues) 및 임의의 앞서 말한 것들의 임의의 단편 또는 부분을 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 칭하기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 폴리머는 선형(linear) 또는 분지형(branched)일 수 있고, 변경된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산(non-amino acid)에 의해 중단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 개입(intervention)에 의하여; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 결합과 같은 임의의 다른 조작 또는 변경에 의하여 변경된 아미노산 폴리머를 포함한다. 예를 들어, (예를 들어, 비천연형(unnatural) 아미노산 등을 포함하는) 하나 또는 그 이상의 아미노산의 유사체뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변경들을 포함하는 폴리펩티드 또한 상기 정의 내에 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연결된 사슬일 수 있다. 단백질 전구체(preprotein) 또는 완전한 성숙 단백질(intact mature protein); 성숙 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 폴리펩티드; 단백질의 단편; 스플라이스 변이체(splice variant); 단백질의 재조합 형태; 아미노산 변경, 결실 또는 치환을 가지는 단백질 변이체; 소화물(digests); 및 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 전사 후 변경(post-translational modification) 또한 상기 정의 내에 포함된다.

본원에 사용된 것으로서, "마커(marker)" 및 "바이오마커(biomarker)"는 개인에서 정상 또는 비정상적 진행의 표지(sign) 또는 개인에서 질병 또는 다른 상태의 표지이거나 그것을 나타내는 표적 분자를 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 더욱 상세하게는, "마커" 또는 "바이오마커"는 정상 또는 비정상이든지 간에, 만약 비정상이라면 만성인지 급성인지, 특정 생리학적 상태 또는 진행의 존재와 관련된 해부, 생리, 생화학 또는 분자학적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 검정법 및 의료적 영상화를 포함하는 다양한 방법에 의하여 검출가능하고 측정가능하다. 바이오마커가 단백질인 경우, 그것은 또한 생물학적 샘플에서 대응하는 단백질 바이오마커의 양 또는 존재 또는 부재의 대리지표(surrogate measure) 만큼에 해당하는 발현 또는 바이오마커 또는 상기 바이오마커의 발현을 조절하는 단백질을 암호화하는 유전자의 메틸화 상태를 사용할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "바이오마커 값(biomarker value)","값(value)", "바이오마커 레벨(biomarker level)" 및 "레벨(level)"은 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 만들어진 측정값을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용되며, 생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 것에 대한 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가(titer), 레벨(level), 발현 레벨, 측정된 레벨의 비율 등을 나타낸다. "값" 또는 "레벨"의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는 데 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 성분에 의존한다.

바이오마커가 개인에서의 비정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태의 표지이거나 그것을 나타내는 경우, 그 바이오마커는 일반적으로 개인에서의 정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태의 부재의 표지이거나 그것을 나타내는 바이오마커의 발현 레벨 또는 값과 비교하여 과발현(over-expressed) 또는 발현 감소(under expressed) 중 하나로서 설명된다. "상향 조절(up-regulation)", "상향 조절된(up-regulated)", "과발현(over-expression)", "과발현된(over-expressed)" 및 그것들의 임의의 변화들은 건강하거나 정상적인 개인으로부터의 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출된 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더욱 큰 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 특정 질병의 서로 다른 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더욱 큰 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 칭할 수 있다.

"하향 조절(down-regulation),"하향 조절된(down-regulated)", "발현 감소(under-expression)", "발현 감소된(under-expressed)" 및 그것들의 임의의 변화들은 건강하거나 정상적인 개인으로부터의 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출된 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 적은 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 특정 질병의 서로 다른 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 적은 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 칭할 수 있다.

게다가, 과발현되거나 발현 감소된 바이오마커는 또한 개인에서 정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태의 부재의 표지이거나 그것을 나타내는 바이오마커의 "정상적인" 발현 레벨 또는 값과 비교하여, "차별적으로 발현(differentially expressed)"되거나 "차별적인 레벨(differential level)" 또는 "차별적인 값(differential value)"을 가지는 것으로 칭해질 수 있다. 따라서, 바이오마커의 "차별적인 발현" 또한 바이오마커의 "정상적인" 발현 레벨로부터 변화로서 말해질 수 있다.

상기 용어 "차별적인 유전자 발현(differential gene expression)" 및 "차별적인 발현(differential expression)"은 정상 또는 대조 대상에서 그것의 발현에 관하여, 특정 질병으로 고통받는 피험자에게서 높거나 낮은 레벨로 발현이 활성화된 유전자(또는 그것의 대응하는 단백질 발현 산물)를 칭하기 위하여 상호교환적으로 사용된다. 상기 용어는 또한 동일한 질병의 서로 다른 단계에서 높거나 낮은 레벨로 발현이 활성화된 유전자(또는 대응하는 단백질 발현 산물)를 포함한다. 그것은 또한 차별적으로 발현된 유전자가 핵산 레벨 또는 단백질 레벨에서 활성화되거나 억제될 수 있거나, 서로 다른 폴리펩티드 산물을 만들어내는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)에 영향을 받을 수 있다. 이러한 차이점들은 폴리펩티드의 mRNA 레벨, 표면 발현(surface expression), 분비 또는 다른 분할(partitioning)을 포함하는 다양한 변화에 의해 명백해질 것이다. 차별적인 유전자 발현은 두 개 또는 그 이상의 유전자 또는 그것들의 유전자 산물 간의 발현의 비교; 또는 두 개 또는 그 이상의 유전자 또는 그것들의 유전자 산물 간의 발현 비율의 비교; 또는 오히려 정상 피험자와 질병으로 고통받는 피험자 사이 또는 동일한 질병의 다양한 단계 사이에서 상이한, 동일 유전자의 두 개의 다르게 처리된 산물의 비교를 포함할 수 있다. 차별적인 발현은 예를 들어, 정상 및 병든 세포, 또는 서로 다른 질병 사건 또는 질병 단계를 겪은 세포들 사이에서의 유전자 또는 그것의 발현 산물에서 일시적(temporal) 또는 세포적(cellular) 발현 패턴에서의 정량적(quantitative)뿐만 아니라 정성적(qualitative) 차이 모두를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, "개인(individual)"은 피시험자(test subject) 또는 환자를 말한다. 상기 개인은 포유동물 또는 비포유동물일 수 있다. 다양한 구현에서, 상기 개인은 포유동물이다. 포유류 개인은 인간 또는 비인간일 수 있다. 다양한 구현에서, 상기 개인은 인간이다. 건강하거나 정상인 개인은 (예를 들어, 폐질병, 폐 관련 질병 또는 다른 폐질환을 포함하는) 관심 질병 또는 상태를 기존의 진단 방법에 의해 검출할 수 없는 개인이다.

"진단하다(diagnose)", "진단하는 것(diagnosing)", "진단(diagnosis)" 및 그것들의 변화형은 개인에게 관련된 하나 또는 그 이상의 징후, 증상, 데이터 또는 다른 정보에 기초하여, 개인의 건강 상태 또는 상황의 발견, 판단 또는 인지를 말한다. 개인의 건강 상태는 건강한(healthy)/정상(normal)(즉, 질병 또는 질환이 없음의 진단)으로 진단되거나, 건강이 나쁜(ill)/비정상(abnormal)(즉, 질병 또는 질환의 존재 또는 특성의 판단의 진단)으로 진단될 수 있다. 상기 용어 "진단하다", "진단하는 것", "진단" 등은 특정 질병 또는 질환에 관하여 질병의 초기 발견; 질병의 특성 또는 분류; 질병의 진행(progress), 차도(remission) 또는 재발(recurrence)의 발견; 개인에 대한 처치 또는 치료의 시행 후 질병 반응의 발견을 포함한다. 비소세포 폐암의 진단은 암이 아닌 개인들로부터 암을 가지는 개인을 구별하는 것을 포함한다. 그것은 또한 비소세포 폐암으로부터 흡연자와 양성 폐 결절을 구별하는 것을 포함한다.

"예후예측하다(prognose)", "예후예측하는 것(prognosing)", "예후예측(prognosis)" 및 그것들의 변화형은 질병 또는 질환을 가지는 개인에서 질병 또는 질환의 진행 과정의 예측(예를 들어, 환자 생존율을 예측하는 것)을 말하며, 이러한 용어는 개인에 대한 처치 또는 치료의 시행 후 질병 반응의 평가를 포함한다.

"평가하다(evaluate)", "평가하는 것(evaluating)', "평가(evaluation)" 및 그것들의 변화형은 "진단하다(diagnose)" 및 "예후예측하다(prognose)" 모두를 포함하며, 또한 질병을 가지지 않은 개인에서의 질병 또는 질환의 진행 과정에 대한 판단 또는 예측뿐만 아니라, 질병이 분명히 치료된 개인에서의 질병 및 질환이 재발할 가능성에 관한 판단 또는 예측을 포함한다. 상기 용어 "평가하다"는 또한 예를 들어, 개인이 치료제에 대하여 순조롭게 반응할 것인지 아니면 치료제에 대하여 반응하지 않을 것인지(또는, 예를 들어, 독성을 경험하거나 다른 바람직하지 않은 부작용을 경험할 것인지)를 예측하는 것, 개인에게 투여하기 위한 치료제를 선택하는 것 또는 개인에 대하여 시행된 치료에 대한 개인의 반응을 관찰하거나 발견하는 것과 같은 치료에 대한 개인의 반응을 평가하는 것을 포함한다. 따라서, 비소세포 폐암을 "평가하는 것"은 예를 들어, 임의의 하기의 것: 개인에게서 비소세포 폐암의 진행 과정을 예측하는 것; 비소세포 폐암이 분명히 치료된 환자에게서 비소세포 폐암의 재발을 예측하는 것; 또는 비소세포 폐암 치료에 대한 개인의 반응을 판단하거나 예측하는 것 또는 개인의 생물학적 샘플로부터 유래된 바이오마커 값의 측정에 기초하여 개인에게 시행하기 위한 비소세포 폐암 치료를 선택하는 것을 포함할 수 있다.

임의의 하기의 예들은 비소세포 폐암을 "진단하는 것" 또는 "평가하는 것" 중 하나: 비소세포 폐암의 존재 여부를 초기에 검출하는 것; 비소세포 폐암의 특정 단계, 형태 또는 서브-타입, 또는 다른 분류 또는 특성을 판단하는 것; 의심스런 폐 결절 또는 덩어리가 양성 또는 악성 비소세포 폐암인지를 판단하는 것; 또는 비소세포 폐암의 진행(예를 들어, 종양의 성장 또는 전이 속도를 관찰하는 것), 차도 또는 재발을 발견/관찰하는 것으로서 칭해질 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "추가적인 생물의학 정보(additional biomedical information)"는 본원에 기재된 임의의 바이오마커를 사용하는 것을 제외한, 암의 위험 또는 더욱 특별하게는 비소세포 폐암의 위험에 관련된 하나 또는 그 이상의 개인의 평가를 말한다. "추가적인 생물의학 정보"는 임의의 하기의 것들: 개인의 외형적 기술서(physical description), CT 영상에 의해 발견된 폐 결절의 외형적 기술서, 개인의 키 및/또는 체중, 개인의 성별, 개인의 민족성, 흡연력, 직업 경력, 공지된 발암물질에 대한 노출(예를 들어, 임의의 석면(asbestos), 라돈 가스(radon gas), 화학물질(chemicals), 화재에 의한 연기, 및 생산회사(industrial)/공장(factory) 또는 자동차(auto)/선박(marine)/항공기(aircraft) 배출물과 같은 정체되거나 움직이는 근원으로부터의 방출을 포함할 수 있는 공기 오염물질(air pollution)), 간접 흡연에 대한 노출, 비소세포 폐암(또는 다른 암)의 가족력, 폐 결절의 존재, 결절의 크기, 결절의 위치, 결절의 형태(예를 들어, CT 영상을 통하여 발견된 것, 간 유리 음영(ground glass opacity; GGO), 고형(solid), 비고형(non-solid)), 결절의 경계면 특성(edge characteristic)(예를 들어, 평활(smooth), 분엽상(lobulated), 명료(sharp and clear), 침상(spiculated), 침윤(infiltrating)) 등을 포함한다. 흡연력은 주로 담배를 피운 년 수 곱하기 하루에 피운 평균 담배갑의 수를 말하는 "갑년(pack years)"의 관점으로 정량화된다. 예를 들면, 평균적으로 35년간 하루 1갑의 담배를 피운 사람은 35갑년의 흡연력을 가지는 것으로 칭해진다. 추가적인 생물의학 정보는 예를 들어, 일상적인 질문사항 또는 건강력 질문사항 등의 사용에 의해 개인들 그 자신으로부터 또는 의료 종사자 등으로부터 당업계에 공지된 일반적인 기술을 사용하여 개인들로부터 얻어질 수 있다. 대안적으로, 추가적인 생물의학 정보는 CT 영상(예를 들어, 저선량 CT 영상) 및 X-레이를 포함하는 일반적인 영상 기술로부터 얻어질 수 있다. 임의의 생물학적 정보의 평가와 함께 바이오마커의 레벨을 테스트하는 것은 바이오마커를 단독으로 테스트하거나 임의의 특정 항목의 추가적인 생물의학 정보를 단독으로 평가하는 것(예를 들어, CT 영상 단독)과 비교하여, 예를 들어, 비소세포 폐암(또는 다른 비소세포 폐암 관련 용도)을 검출하는 것에 대한 민감도, 특이도 및/또는 AUC를 향상시킬 수 있다.

상기 용어 "곡선 아래 영역(area under the curve)" 또는 "AUC"는 당업계에 모두 잘 알려져 있는 수용자 반응 특성(receiver operating characteristic curve; ROC) 곡선의 곡선 아래 영역을 말한다. AUC 측정은 완전한 데이터 범위에 걸친 분류기의 정확성을 비교하는데 유용하다. 더욱 큰 AUC를 가지는 분류기는 두 개의 관심군(예를 들어, 비소세포 폐암 샘플 및 정상 또는 대조 샘플) 사이에서 미지의 것을 정확하게 분류하기 위한 더 큰 능력을 가진다. ROC 곡선은 두 개의 집단(예를 들어, 비소세포 폐암인 경우 및 비소세포 폐암이 아닌 대조군) 사이에서의 감별에서 특정한 특성(feature)(예를 들어, 본원에 기재된 임의의 바이오마커 및/또는 추가적인 생물의학 정보의 임의의 항목)의 성능(performance)을 그래프로 그리는데(plotting) 유용하다. 전형적으로, 전체 집단(예를 들어, 케이스 및 대조군)에 걸친 상기 특성 데이터는 단일 특성(single feature) 값에 기초하여 높은 차순으로(in ascending order) 정리된다. 그 후, 그 특성에 대한 각각의 값에 대하여, 데이터에 대한 진양성율(true positive rate) 및 위양성율(false positive rate)이 계산된다. 상기 진양성율은 그 특성에 대한 값 이상의 케이스의 숫자를 계산한 후 총 케이스의 수로 나눔으로써 측정된다. 상기 위양성율은 그 특성에 대한 값 이상의 대조군의 숫자를 계산한 후 총 대조군의 수로 나눔으로써 측정된다. 비록 이 정의는 그 특성이 대조군과 비교하여 높아진 경우에서의 시나리오를 말하지만, 이 정의는 또한 그 특성이 대조군과 비교하여 낮은 경우에서의 시나리오에도 적용된다(이러한 시나리오에서, 그 특성에 대한 값보다 낮은 샘플이 계산될 수 있다). ROC 곡선은 단일 특성뿐만 아니라 다른 단일 산출(single output)에 대하여 생성될 수 있고, 예를 들어 두 개 또는 그 이상의 특성의 조합이 단일 합계 값(single sum value)을 제공하기 위하여 수학적(예를 들어, 더하고, 빼고, 곱하는 등)으로 조합될 수 있으며, 이 단일 합계 값은 ROC 곡선으로 그려질 수 있다. 부가적으로, 그 조합이 단일 산출값을 파생하는 다중 특성의 임의의 조합이 ROC 곡선으로 그려질 수 있다. 이 특성의 조합들은 테스트를 포함할 수 있다. 상기 ROC 곡선은 테스트의 위양성율(1-특이도)에 대한 테스트의 진양성율(민감도)의 플롯이다.

본원에 사용된 것으로서, 바이오마커 값에 대한 "검출(detecting)" 또는 "측정(determining)"은 바이오마커 값에 대응하는 시그널을 발견하고 기록하는데 필요한 기구 및 그 시그널을 생성하는데 필요한 물질(들) 모두의 사용을 포함한다. 다양한 구현에서, 상기 바이오마커 값은 형광(fluorescence), 화학발광(chemiluminescence), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면 탄성파(surface acoustic waves), 질량 분석법(mass spectrometry), 적외선 분광법(infrared spectroscopy), 라만 분광법(raman spectroscopy), 원자 현미경(atomic force microscopy), 주사 터널링 현미경(scanning tunneling microscopy), 전기화학 검출법(electrochemical detection methods), 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 양자점(quantum dots) 등을 포함하는 임의의 적절한 방법을 사용하여 검출된다.

"고체 지지체(solid support)"는 본원에서 분자가 공유결합 또는 비공유결합 중 하나를 통하여 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 가지는 임의의 기질을 말하는 것이다. "고체 지지체"는 예를 들어, 막(membrane); 칩(chip)(예를 들어, 단백질 칩); 슬라이드(slide)(예를 들어, 유리 슬라이드 또는 커버슬립(coverslip)); 컬럼(column); 속이 빈 형태(hollow), 고체(solid), 반고체(semi-solid), 예를 들어 비드(bead)와 같은 세공(pore) 또는 공동(cravity)을 가지는 입자; 겔(gel); 광섬유 물질(fiber optic material)을 포함하는 섬유(fiber); 매트릭스(matrix); 및 샘플 용기(receptacle)를 포함할 수 있는 다양한 물리적 형태를 가질 수 있다. 대표적인 샘플 용기는 샘플 웰(sample wells), 튜브(tubes), 모세관(capillaries), 바이알(vials) 및 샘플을 고정할 수 있는 임의의 다른 관(vessel), 홈(groove) 또는 굴곡(indentation)을 포함한다. 샘플 용기는 미세역가 플레이트(microtiter plate), 슬라이드, 미세유동 장치(microfluidics device) 등과 같은 다중-샘플 플랫폼 상에 포함될 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 물질, 유기 또는 무기 물질로 이루어질 수 있다. 시약을 포획하는 고체 지지체 조성물은 일반적으로 부착 방법(예를 들어, 공유 부착(covalent attachment)에 따라 부착된다. 다른 대표적 용기는 그 안에서 검정 및 관련 조작이 일어날 수 있는 미세액적(microdroplet) 및 미세유체(microfluid)가 조절되거나 벌크 오일(bulk oil)/수성 유제(aqueous emulsion)를 포함한다. 적절한 고체 지지체는 예를 들어, 플라스틱(plastics), 레진(resins), 다당류(polysaccharide), 실리카(silica) 또는 실리카-기재의 물질(silica-based materials), 기능화된 유리(functionalized glass), 개질된 실리콘(modified silicon), 탄소(carbon), 금속(metals), 무기 유리(inorganic glasses), 막(membranes), 나일론(nylon), (예를 들어, 실크, 울 및 코튼과 같은) 천연 섬유(natural fibers), 폴리머(polymers) 등을 포함한다. 상기 물질은 예를 들어, 포획 시약의 부착을 위해 사용되는 카르복시(carboxy), 아미노(amino) 또는 하이드록실(hydroxyl)기와 같은 반응성 기를 포함할 수 있는 고체 지지체로 구성된다. 고분자성 고체 지지체는 예를 들어, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트(polyethylene glycol tetraphthalate), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 부틸 고무(butyl rubber), 스티렌부타디엔 고무(styrenebutadiene rubber), 천연 고무(natural rubber), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), (폴리)테트라플루오로에틸렌((poly)tetrafluoroethylene), (폴리)비닐리덴플루오라이드((poly)vinylidenefluoride), 폴리카보네이트(polycarbonate) 및 폴리메틸펜텐(polymethylpentene)을 포함할 수 있다. 사용될 수 있는 적절한 고체 지지체 입자는 예를 들어, 루미넥스^®-타입 인코딩된 입자(Luminex^®-type encoded particles), 자성 입자(magnetic particles) 및 유리 입자(glass particles)와 같은 인코딩된 입자(encoded particles)를 포함한다.

바이오마커의 예시적 사용

다양한 예시적 구현에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 분석 방법을 포함하는 임의의 수의 분석 방법에 의해, 혈청 또는 혈장에서와 같은 개인의 순환기에 존재하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커에 대응하는 하나 또는 그 이상의 바이오마커 값을 검출함으로써 개인에서 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법을 제공한다. 이 바이오마커들은 예를 들어, 비소세포 폐암이 아닌 개인과 비교하여 비소세포 폐암인 개인에서 차별적으로 발현된다. 개인에게서 바이오마커의 차별적 발현의 검출은 예를 들어, 폐암의 조기 진단을 가능하게 하기 위하여, (예를 들어, 컴퓨터 단층(CT) 스캔 상에서 발견된 결절과 같은) 양성 및 악성 폐 결절을 구별하기 위하여, 비소세포 폐암의 재발 또는 다른 임상적 징후를 관찰하기 위하여 사용될 수 있다.

비소세포 폐암의 다양한 임상적 징후에 사용될 수 있는 본원에 기술된 임의의 바이오마커는 임의의 하기의 것들: (예를 들어, 고위험 개인 또는 집단에서) 비소세포 폐암을 검출하는 것; 비소세포 폐암(NSCLC) 및 소세포 폐암(SCLC) 및/또는 선암(adenocarcinoma) 및 편평세포암(squamous cell carcinoma)을 감별함으로써(또는 그렇지 않다면 조직 병리를 용이하게 함으로써) 비소세포 폐암을 특성화(예를 들어, 비소세포 폐암의 형태, 아형태 또는 단계를 결정)하는 것; 폐 결절이 양성 결절인지 악성 폐 종양인지를 판단하는 것; 비소세포 폐암의 예후를 판단하는 것; 비소세포 폐암의 진행 또는 차도를 관찰하는 것; 비소세포 폐암의 재발을 관찰하는 것; 전이를 관찰하는 것; 치료 선별; 치료제 또는 다른 치료에 대한 반응을 관찰하는 것; 컴퓨터 단층촬영 검진에 대한 개인의 평가(stratification)(예를 들어, 그 개인이 비소세포 폐암에 대한 큰 위험이 있는지 확인하고, 그것에 의해 흉부-CT 검진으로부터 가장 이익을 얻을 수 있으므로 CT의 양성 예측치가 증가한다); (CT 테스트 또는 바이오마커 테스트 단독에 비하여 증가된 진단 성능을 가지는 검정법을 제공하기 위하여) 흡연력 등과 같은 추가적인 생물의학 정보 또는 결절 크기, 형태 등과 함께 바이오마커 테스트를 결합하는 것; 악성 또는 양성으로서 폐 결절의 진단을 용이하게 하는 것; 일단 폐암 결절이 CT 상에서 발견되도록 임상적 결정을 용이하게 하는 것(예를 들어, 만일 바이오마커에 기초한 테스트가 결절 크기에 상관없이 음성인 것과 같이 결절의 위험이 낮다고 간주되는 경우에는 CT 스캔을 반복 지시하고, 또는 만일 바이오마커에 기초한 테스트가 결절의 크기에 상관없이 양성인 것과 같이 결절의 위험이 중간 내지 높다고 간주되는 경우에는 생검을 고려하는 것); 및 임상 추적(clinical follow up)에 관련된 결정(예를 들어, CT 상에서 비분류된 결절을 발견한 후 CT 스캔, 세침생검 또는 개흉을 반복하여 실행할 것인지 아닌지)을 용이하게 하는 것을 포함한다. 바이오마커 테스트는 고위험 개인의 CT 또는 흉부 X-레이 검진 단독 이상으로 양성 예측치(positive predictive value; PPV)를 향상시킬 수 있다. CT 검진과 함께 그것의 유용성에 더하여, 본원에 기재된 상기 바이오마커는 또한 흉부 X-레이, 기관지 내시경 검사(bronchoscopy) 또는 형광 기관지 내시경 검사(fluorescent bronchoscopy), MRI 또는 PET 스캔과 같은 비소세포 폐암에 사용되는 임의의 다른 영상 기법(imaging modalities)과 함께 사용될 수 있다. 게다가, 상기 기재된 바이오마커는 또한 비소세포 폐암의 징후가 영상 기법 또는 다른 임상적 응용(clinical correlates)에 의해 검출되기 전 또는 증상이 나타나기 전 이것의 사용을 확신하는 데 유용할 수 있다. 그것은 CT 스캔 또는 다른 영상 기법으로 확인된 정확히 규정할 수 없는 폐 결절을 가지는 개인을 구별하는 것, 비소세포 폐암에 대한 고위험 흡연자의 선별, 및 비소세포 폐암인 개인을 진단하는 것을 더 포함한다.

비소세포 폐암을 진단하기 위하여 본원에 기재된 임의의 바이오마커가 사용될 수 있는 방법의 예로서, 비소세포 폐암에 걸렸는지 알려지지 않은 개인에게서 상기 기재된 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현은 개인이 비소세포 폐암에 걸렸는지를 보여줄 수 있고, 그것에 의하여 아마 비소세포 폐암이 다른 방법에 의해 검출되기 전 또는 증상이 나타나기 전, 치료가 가장 효과적인 질병의 초기 단계에서 비소세포 폐암을 검출할 수 있게 한다. 비소세포 폐암의 진행 동안 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 과발현은 예를 들어, 비소세포 폐암 종양이 성장 및/또는 전이(따라서 나쁜 예후를 보임)되는 것과 같은 비소세포 폐암 진행의 징후일 수 있는데 반하여, 하나 또는 그 이상의 바이오마커가 차별적으로 발현되는 정도(degree)의 감소(즉, 뒤이은 바이오마커 테스트에서, 개인에서의 발현 레벨이 "정상(normal)" 발현 레벨 쪽으로 향하거나 접근하는 것)는 예를 들어, 비소세포 폐암의 종양이 줄어드는 것(따라서 좋거나 더 나은 예후를 보임)과 같은 비소세포 폐암의 차도의 징후를 나타낼 수 있다. 유사하게는, 비소세포 폐암의 치료과정 동안 하나 또는 그 이상의 바이오마커가 차별적으로 발현되는 정도의 증가(즉, 뒤이은 바이오마커 테스트에서, 개인에서의 발현 레벨이 "정상" 발현 레벨로부터 멀리 벗어나는 것)는 비소세포 폐암이 진행하고 있음을 나타낼 수 있으므로 그 치료는 효과적이지 않음을 나타내는 반면, 비소세포 폐암의 치료과정 동안 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 차별적 발현의 감소는 비소세포 폐암의 차도의 징후일 수 있으므로 그 치료는 성공적임을 나타낸다. 부가적으로, 개인의 비소세포 폐암이 분명히 치료된 후 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현에 있어서의 증가 또는 감소는 비소세포 폐암 재발의 징후일 수 있다. 이와 같은 상황에서, 예를 들어, 상기 개인은 만일 비소세포 폐암의 재발이 나중에까지 검출되지 않을 경우보다 초기 단계에서 치료(만일 개인이 지속적인 치료를 받는다면, 투약량 및/또는 빈도를 증가시키기 위한 것과 같은 변경된 최적의 치료 계획)를 다시 시작할 수 있다. 게다가, 개인에게서 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 레벨은 특정 치료제에 대한 개인의 반응의 전조일 수 있다. 비소세포 폐암의 재발 또는 진행에 대한 관찰에서, 바이오마커 발현 레벨에서의 변화는 비소세포 폐암 활성을 검출 또는 치료에 있어서 변화의 필요성을 결정하기 위한 것과 같은, 영상화를 반복할 필요성(예를 들어, CT 스캐닝의 반복)을 나타낼 수 있다.

본원에 기재된 임의의 바이오마커의 검출은 치료의 성공을 평가하거나 치료 후 비소세포 폐암의 차도, 재발 및/또는 (전이를 포함하는) 진행을 관찰하기 위한 것과 같은, 비소세포 폐암 치료 후 또는 비소세포 폐암 치료와 함께 특히 매우 유용할 수 있다. 비소세포 폐암 치료는 예를 들어, 개인에 대한 치료제의 투여, 수술의 시행(예를 들어, 적어도 한 부분의 비소세포 폐암 종양의 수술적 절제 또는 비소세포 폐암 및 주변 조직의 제거), 방사선 치료의 수행 또는 당업계에서 사용되는 임의의 다른 형태의 비소세포 폐암 치료 및 이 치료들의 임의의 조합을 포함한다. 폐암 치료는 예를 들어, 개인에 대한 치료제의 투여, 수술의 시행(예를 들어, 적어도 한 부분의 폐 종양의 수술적 절제), 방사선 치료의 수행 또는 당업계에서 사용되는 임의의 다른 형태의 비소세포 폐암 치료 및 이 치료들의 임의의 조합을 포함한다. 예를 들어, siRNA 분자는 유전자 발현을 억제하는 합성 이중 가닥 RNA 분자(synthetic double stranded RNA molecules)이며, 표적화된 폐암 치료제로서의 역할을 할 수 있다. 예를 들어, 임의의 바이오마커는 치료 후 적어도 한 번 검출될 수 있거나, 치료 후 여러 번 검출(예를 들어, 주기적 간격으로(periodic interval))될 수 있거나, 치료 전과 후 모두에서 검출될 수 있다. 시간에 대한 개인에서의 임의의 바이오마커의 차별적인 발현 레벨은 비소세포 폐암의 진행, 차도 또는 재발의 징후일 수 있으며, 그것들의 예는 임의의 하기의 것: 치료 전 바이오마커의 발현 레벨에 비해 치료 후 바이오마커의 발현 레벨에서의 증가 또는 감소; 치료 후 초기 시점에서의 바이오마커 발현 레벨에 비해 치료 후 후기 시점에서 바이오마커 발현 레벨에서의 증가 또는 감소; 및 바이오마커의 정상 레벨에 비해 치료 후 단일 시점에서의 바이오마커의 차별적인 발현 레벨을 포함한다.

특정 예로서, 본원에 기재된 임의의 바이오마커의 바이오마커 레벨은 수술전(pre-surgery) 및 수술 후(post-surgery)(예를 들어, 수술 후 2-16주) 혈청 또는 혈장 샘플에서 검출될 수 있다. 수술 전 샘플에 비해 수술 후 바이오마커 발현 레벨의 증가는 비소세포 폐암의 진행을 나타낼 수 있는 반면(예를 들어, 실패한 수술), 수술 전 샘플에 비해 수술 후 샘플에서의 바이오마커 발현 레벨의 감소는 비소세포 폐암의 퇴행(regression)을 나타낼 수 있다(예를 들어, 상기 수술은 폐 종양을 성공적으로 제거하였음). 바이오마커 레벨의 유사한 분석들이 방사선 치료 또는 치료제의 투여 또는 암백신(cancer vaccine) 전후와 같은 다른 형태의 치료 전후에 수행될 수 있다.

독립형(stand-alone) 진단 테스트로서 바이오마커 레벨을 테스트하는 것 외에, 바이오마커 레벨은 또한 질병 민감성(susceptibility)의 증가된 위험의 징후인 SNPs 또는 다른 유전적 병변(genetic lesions) 또는 변형(variability)의 측정과 함께 테스트 될 수 있다(Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622(2009)를 참조).

독립형 진단 테스트로서 바이오마커 레벨을 테스트하는 것 외에, 바이오마커 레벨은 또한 CT 검진과 같은 방사선적 검진(radiologic screening)과 함께 테스트 될 수 있다. 예를 들어, 상기 바이오마커는 비소세포 폐암에 대한 위험(예를 들어, 흡연자)에서 많은 무증상 집단을 선별하기 위한 것과 같은, CT 검진을 수행하기 위한 의학 및 경제적 정당화를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 바이오마커 레벨의 "CT 전(pre-CT)" 테스트는 그것들의 바이오마커 레벨에 기초하여 비소세포 폐암에 대한 고위험 대상자 및 CT 검진에 대하여 우선 순위가 매겨져야만 하는 대상자를 확인하기 위한 것과 같이, CT 검진에 대하여 고위험 대상자를 계층화하는데 사용될 수 있다. 만일 CT 테스트가 실행된다면, 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 바이오마커 레벨(예를 들어, 혈청 또는 혈장 샘플의 압타머 검정법에 의해 검출되는 것)이 측정될 수 있고, 진단 스코어는 CT 또는 바이오마커 단독 테스트에 대한 양성 예측치(PPV)를 증가시키기 위하여 추가적인 생물의학 정보(예를 들어, CT 테스트에 의해 검출되는 종양 파라미터)와 함께 평가될 수 있다. 바이오마커 레벨을 검출하기 위한 "CT 후(post-CT)" 압타머 패널은 CT(또는 다른 영상화 기법)에 의해 발견된 폐 결절이 악성 또는 양성일 가능성을 판단하는데 사용될 수 있다.

본원에 기재된 임의의 바이오마커의 검출은 CT 후 테스트에 유용할 수 있다. 예를 들면, 바이오마커 테스트는 CT 단독에 대한 상당한 수의 위양성 테스트(false positive test)를 제거하거나 감소시킬 수 있다. 게다가, 바이오마커 테스트는 환자의 치료를 용이하게 할 수 있다. 예로서, 만일 폐 결절이 5mm보다 작은 경우, 바이오마커 테스트는 조기에 환자에게 생검에 대하여 "추이만을 관찰(watch and wait)"하자고 할 수 있고; 만일 폐 결절이 5-9mm 크기인 경우, 바이오마커 테스트는 위양성 스캔 상에서 생검 또는 개흉을 하지 않을 수 있고; 만일 폐 결절이 10mm보다 큰 경우, 바이오마커 테스트는 양성 결절을 가지는 이 환자들의 소집단에 대한 수술을 하지 않을 수 있다. 결절 생검에 관련된 현저한 질병 발생율 및 결절의 위치에 따른 결절 조직을 얻는데 있어서의 어려움 때문에, 바이오마커 테스트에 기초한 어떤 환자들에서의 생검 필요성을 제거하는 것은 유익할 것이다. 유사하게는, 결절이 실제로 양성인 환자들과 같은 어떤 환자들에서의 수술 필요성을 제거하는 것은 불필요한 위험과 수술에 따른 비용이 발생하는 것을 막을 수 있을 것이다.

고위험 개인에서 방사선적 검진과 함께 바이오마커 레벨을 테스트하는 것 외에도(예를 들어, 영상 스캔 상에서 발견된 폐 결절 또는 덩어리의 크기 또는 다른 특성과 함께 바이오마커 레벨을 평가하는 것), 바이오마커에 관련된 정보는 또한 다른 형태의 데이터, 특히 비소세포 폐암에 대한 개인의 위험을 나타내는 데이터(예를 들어, 환자의 병력(clinical history), 작업상 피폭(occupational exposure history), 증상, 암의 가족력, 흡연자인지의 여부와 같은 위험 인자 및/또는 다른 바이오마커의 상태 등)과 함께 평가될 수 있다. 이 다양한 데이터들은 컴퓨터 또는 다른 장치/기구에 통합될 수 있는 컴퓨터 프로그램/소프트웨어와 같은 자동화된 방법에 의해 평가될 수 있다.

기재된 바이오마커들 중 어떤 것이라도 영상 테스트에 또한 사용될 수 있다. 예를 들면, 영상 제제(imaging agent)는 비소세포 폐암 진단을 보조하기 위하여, 질병의 진행/차도 또는 전이를 관찰하기 위하여, 질병의 재발을 관찰하기 위하여, 또는 다른 용도들 중에서 치료에 대한 반응을 관찰하기 위하여 사용될 수 있는 상기 기재된 임의의 바이오마커와 결합될 수 있다.

바이오마커 및 바이오마커 값의 검출 및 측정

본원에 기재된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은 임의의 다양한 공지의 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다. 일 구현에서, 바이오마커 값은 포획 시약을 사용하여 검출된다. 본원에 사용된 것으로서, "포획제(capture agent)" 또는 "포획 시약(capture reagent)"은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 말한다. 다양한 구현에서, 상기 포획 시약은 용액 내에서 바이오마커에 노출될 수 있고, 또는 포획 시약이 고체 지지체 상에 고정화되어 있는 동안 바이오마커에 노출될 수 있다. 다른 구현에서, 상기 포획 시약은 고체 지지체 상의 제2의 특징부(feature)와 반응하는 특징부를 포함한다. 이 구현들에서, 상기 포획 시약은 용액 내에서 바이오마커에 노출될 수 있고, 그 후 포획 시약 상의 특징부는 고체 지지체 상의 바이오마커를 고정화시키기 위하여 고체 지지체 상의 제2의 특징부와 함께 사용될 수 있다. 상기 포획 시약은 수행될 분석의 형태에 기초하여 선택된다. 포획 시약은 압타머(aptamer), 항체(antibodies), 항원(antigens), 애드넥틴(adnectins), 안키린(ankyrins), 다른 항체 모조물(antibody mimetics) 및 다른 단백질 스캐폴드(protein scaffolds), 자가항체(autoantibodies), 키메라(chimeras), 소분자(small molecules), F(ab')₂ 단편, 단일 사슬 항체 단편(single chain anbibody fragment), Fv 단편(Fv fragment), 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment), 핵산(nucleic acid), 렉틴(lectin), 리간드 결합 수용체(ligand-binding receptor), 애피바디(affybodies), 나노바디(nanobodies), 각인된 고분자(imprinted polymer), 아비머(avimers), 펩티드 모조물(peptidomimetics), 호르몬 수용체(hormone receptor), 시토카인 수용체(cytokine receptor), 및 합성 수용체(synthetic receptors) 및 이것들의 변경 및 단편을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다.

어떤 구현에서, 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체(complex)를 사용하여 검출된다.

다른 구현에서, 상기 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체로부터 유래되며, 예를 들어 바이오마커/포획 시약 상호작용 후의 반응 결과와 같이 간접적으로 검출되지만, 상기 바이오마커/포획 시약 복합체의 형성에 의존한다.

어떤 구현에서, 상기 바이오마커 값은 생물학적 샘플에서 바이오마커로부터 직접적으로 검출된다.

일 구현에서, 상기 바이오마커는 생물학적 샘플에서 두 개 또는 그 이상의 바이오마커의 연속적 검출을 가능하게 하는 다중화된 포맷(multiplexd format)을 사용하여 검출된다. 다중화된 포맷의 일 구현에서, 포획 시약은 고체 지지체 상의 이산 위치(discrete location)에서 직접 또는 간접적으로, 공유결합 또는 비공유결합적으로 고정화된다. 다른 구현에서, 다중화된 포맷은 각각의 고체 지지체가 예를 들어, 양자점(quantum dot)과 같은 그 고체 지지체와 결합된 독특한 포획 시약을 가지는 이산 고체 지지체를 사용한다. 다른 구현에서, 개개의 기구는 생물학적 샘플에서 검출될 각각의 다중 바이오마커 중 하나의 검출을 위하여 사용된다. 개개의 기구는 생물학적 샘플에서 각 바이오마커를 동시에 처리할 수 있도록 구성될 수 있다. 예를 들면, 미세역가 플레이트(microtiter plate)는 플레이트 내의 각 웰이 생물학적 샘플에서 검출될 다중의 바이오마커 중 하나를 특별하게 분석하는데 사용되는 것처럼 사용될 수 있다.

하나 또는 그 이상의 앞서 말한 구현들에서, 형광 태그(fluorescent tag)는 바이오마커 값을 검출할 수 있도록 바이오마커/포획 복합체의 성분을 표지하는데 사용될 수 있다. 다양한 구현에서, 상기 형광 태그는 공지의 기술을 사용하여 포획 시약이 본원에 기재된 임의의 바이오마커에 대하여 특이적이도록 구성될 수 있고, 형광 표지는 그 후 대응하는 바이오마커 값을 검출하기 위하여 사용될 수 있다. 적절한 형광 표지(fluorescent label)는 희토류 킬레이트(rare earth chelates), 플루오르세인(fluorescein) 및 그것의 유도체, 로다민(rhodamine) 및 그것의 유도체, 단실(dansyl), 알로피코시아닌(allophycocyanin), PBXL-3, Qdot 605, 리사민(Lissamine), 피코에리트린(phycoerythrin), 텍사스 레드(Texas Red) 및 다른 이와 같은 화합물들을 포함한다.

일 구현에서, 상기 형광 표지는 형광 염료 분자(fluorescent dye molecule)이다. 어떤 구현에서, 상기 형광 염료 분자는 인돌륨 고리의 3-탄소 상의 치환기가 화학적 반응기(chemically reactive group) 또는 복합 물질(conjugated substance)을 포함하는, 적어도 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템(indolium ring system)을 포함한다. 어떤 구현에서, 상기 염료 분자는 예를 들어, 알렉사플루오르 488(AlexaFluor 488), 알렉사플루오르 532(AlexaFluor 532), 알렉사플루오르 647(AlexaFluor 647), 알렉사플루오르 680(AlexaFluor 680) 또는 알렉사플루오르 700(AlexaFluor 700)과 같은 알렉사플루오르 분자를 포함한다. 다른 구현에서, 상기 염료 분자는 예를 들어, 두 개의 상이한 알렉사플루오르 분자와 같은 제1형 및 제2형의 염료 분자를 포함한다. 다른 구현에서, 상기 염료 분자는 제1형 및 제2형 염료 분자를 포함하고, 두 개의 염료 분자는 서로 다른 방출 스펙트럼(emission spectra)를 가진다.

형광 발광(fluorescence)은 넓은 범위의 검정 포맷에 적합한 다양한 수단(instrumentation)을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 분량 형광계(spectrofluorimeter)는 미세역가 플레이트, 현미경 슬라이드, 프린팅된 어레이(printed arrary), 큐벳(cuvettes) 등을 분석하도록 설계된다(Principles of Fluorescence Spectroscopy by J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004; Bioluminescence ＆ Chemiluminescence: Progress ＆ Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002.를 참조).

하나 또는 그 이상의 앞서 말한 구현에서, 화학발광 태그는 바이오마커 값의 검출이 가능하도록 바이오마커/포획 복합체의 성분을 표지하는데 선택적으로 사용될 수 있다. 적절한 화학발광 물질은 임의의 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride), 로다민 6G, Ru(bipy)3²⁺, TMAE(tetrakis(dimethylamino)ethylene), 피로갈롤(1,2,3-트리히드록시벤젠)(Pyrogallol(1,2,3-trihydroxibenzene)), 루시레닌(Lucigenin), 퍼록시옥살레이트(peroxyosalates), 아릴 옥살레이트(Aryl oxalates), 아크리디늄 에스테르(Acridinium esters), 디오세테인(dioxetanes) 및 그 이외의 것들을 포함한다.

또 다른 구현에서, 상기 검출 방법은 상기 바이오마커 값에 대응하는 검출가능한 시그널을 생성하는 효소/기질 화합물을 포함한다. 일반적으로, 상기 효소는 분광광도법(spectrophotometry), 형광발광(fluorescence) 및 화학발광(chemiluminescence)을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성(chromogenic) 기질의 화학적 변경을 촉진한다. 적절한 효소는 예를 들어, 루시퍼라아제(luciferases), 루시페린(luciferin), 말레이트 디하이드로게나아제(malate dehydrogenase), 우레아제(urease), 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRPO), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다아제(beta-galactosidase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 라이소자임(lysozyme), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 갈락토스 옥시다아제(galactose oxidase) 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유리카아제(uricase), 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 락토퍼록시다아제(lactoperoxidase), 마이크로퍼록시다아제(microperoxidase) 등을 포함한다.

또 다른 구현에서, 상기 검출 방법은 측정가능한 시그널을 생성하는 형광발광, 화학발광, 방사성 핵종(radionuclide) 또는 효소/기질 화합물의 조합일 수 있다. 멀티모달 시그널링(multimodal signaling)은 바이오마커 검정 포맷에서 유일하고 유리한 특성을 가질 수 있다.

더욱 상세하게는, 본원에 기재된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은 하기에 기재된 것과 같은 싱글플렉스 소마머 검정법(singleplex SOMAmer assays), 다중화된 소마머 검정법(multiplexed SOMAmer assays), 싱글플렉스 또는 다중화된 면역검정법(immunoassays), mRNA 발현 프로파일링(mRNA expression profiling), miRNA 발현 프로파일링(miRNA expression profiling), 질량 분광 분석법(mass spectrometric analysis), 조직(histological)/세포학적(cytological) 방법 등을 포함하는 공지의 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다.

압타머 기반 검정법을 사용하는 바이오마커 값의 측정

생물학적 샘플 및 다른 샘플에서 생리학적으로 중요한 분자의 검출 및 정량을 위한 검정법은 과학적 연구 및 보건 분야에서 중요한 수단이다. 이와 같은 검정법의 하나의 종류는 고체 지지체 상에 고정화된 하나 또는 그 이상의 압타머를 포함하는 마이크로어레이의 사용을 포함한다. 상기 압타머는 각각 매우 특이적인 방식 및 매우 높은 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있다("Nucleic Acid Ligand"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,475,096 및 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"이라는 제목의 U.S. Patent No. 6,242,246, U.S. Patent No. 6,458,543 및 U.S. Patent No. 6,503,715을 참조). 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉하면, 압타머는 샘플에 존재하는 그것들 각각의 표적 분자에 결합하여 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 측정할 수 있게 한다.

본원에 사용된 것으로서, "압타머(aptamer)"는 표적 분자에 대한 특정 결합 친화력을 가지는 핵산을 말한다. 친화 상호작용(affinity interaction)은 그러나 이 상황에서는 정도(degree)의 문제이며, 그것의 표적에 대한 압타머의 "특정 결합 친화력(specific binding affinity)"은 압타머는 시료에서의 다른 성분에 결합하는 것보다 일반적으로 더 높은 정도의 친화력으로 그것의 표적에 결합함을 의미한다는 것을 알 수 있다. "압타머"는 특정 뉴클레오티드 서열을 가지는 하나의 형태 또는 종류의 핵산 분자의 복제 세트를 말한다. 서로 다른 압타머는 동일하거나 서로 다른 수의 뉴클레오티드 중 하나를 가질 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변경된 핵산일 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이중 가닥 영역을 포함하는 것일 수 있고, 매우 질서정연한(higher ordered) 구조를 포함할 수 있다. 광반응성(photoreactive) 또는 화학적 반응성 기능기(chemically reactive functional group)가 그것의 대응하는 표적에 공유적으로 결합될 수 있도록 압타머에 포함되어 있는 한, 압타머는 또한 광압타머(photoaptamer)일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 압타머 방법은 동일한 표적 분자와 특이적으로 결합하는 두 개 또는 그 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 하기에 더 기재된 바와 같이, 압타머는 태그를 포함할 수 있다. 만약 압타머가 태그를 포함한다면, 모든 압타머의 복제는 동일한 태그를 가질 필요가 없다. 더욱이, 만약 서로 다른 압타머가 각각 태그를 포함한다면, 이 서로 다른 압타머들은 서로 동일한 태그 또는 서로 다른 태그 중 하나를 가질 수 있다.

압타머는 SELEX를 포함하는 임의의 공지의 방법을 사용하여 확인될 수 있다. 일단 확인되면, 압타머는 화학 합성 방법 및 효소 합성 방법을 포함하는 임의의 공지의 방법에 따라 제조되거나 합성될 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "소마머(SOMAmer)" 또는 느린 오프-레이트의 변경된 압타머(Slow Off-Rate Modified Aptamer)는 향상된 오프-레이트 특성을 가지는 압타머를 말한다. 소마머는 "향상된 오프-레이트를 가지는 압타머를 만들기 위한 방법(Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates)"이라는 제목의 미국 공개특허번호 제2009/0004667호에 기재된 향상된 SELEX 방법을 사용하여 만들 수 있다.

상기 용어 "SELEX" 및 "SELEX 공정(SELEX process)"은 (1) 바람직한 방식, 예를 들어 단백질에 고친화력을 가지는 결합으로 표적 분자와 상호작용하는 압타머의 선별과 (2) 그 선택된 핵산의 증폭(amplification)의 조합을 일반적으로 칭하기 위하여 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 상기 SELEX 공정은 특정 표적 또는 바이오마커에 대하여 고친화력을 가지는 압타머를 확인하는데 사용될 수 있다.

SELEX는 일반적으로 핵산의 후보물질 혼합물을 제조하고, 친화 복합체(affinity complex)를 형성하기 위하여 원하는 표적 분자에 후보물질 혼합물을 결합시키고, 결합되지 않은 후보물질 핵산으로부터 친화 복합체를 분리하고, 친화 복합체로부터 핵산을 분리 및 단리시키고, 핵산을 정제하고, 특정 압타머 서열을 증폭하는 것을 포함한다. 상기 공정은 선별된 압타머의 친화력을 더 개선하기 위한 다중 라운드(multiple rounds)를 포함할 수 있다. 상기 공정은 공정에서의 하나 또는 그 이상의 지점에서 증폭 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, "Nucleic Acid ligands"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,475,096를 참조). 상기 SELEX 공정은 그것의 표적에 공유적으로 결합하는 압타머 뿐만 아니라 그것의 표적에 비공유적으로 결합하는 압타머를 생성하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,705,337을 참조).

상기 SELEX 공정은 예를 들어, 생체 내(in vivo) 안정성을 향상시키거나 운반 특성을 향상시키는 것과 같은, 압타머 상에 향상된 특성을 부여하는 변경된 뉴클레오티드를 포함하는 고친화성 압타머를 확인하는데 사용될 수 있다. 이러한 변경의 예는 리보오스(ribose) 및/또는 포스페이트(phosphate) 및/또는 염기 위치(base position)에서의 화학적 치환을 포함한다. SELEX 공정에서 확인된 압타머는 피리딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변경된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있는 미국특허번호 제5,660,985호("High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides")에 기재되어 있다. 상기를 참고하여, 미국특허번호 제5,580,737호는 2'-아미노(2'-NH₂), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe)로 변경된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고특이성 압타머를 기술하고 있다. 또한, SELEX 및 광SELEX에서 확장된 물리 및 화학적 특성을 가지는 핵산 라이브러리 및 그것들의 용도를 기술하고 있는 미국특허공개번호 제20090098549호("SELEX 및 PHOTOSELEX")를 참고하라.

SELEX는 또한 바람직한 오프-레이트(off-rate) 특성을 가지는 압타머를 확인하는데 사용될 수 있다. 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생성하기 위한 향상된 SELEX 방법을 기술하고 있는 미국특허출원공개번호 제2009/0004667호("Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates")를 참고하라. 그것들 각각의 표적 분자들로부터 더욱 느린 해리(dissociation) 속도를 가지는 압타머 및 광압타머를 생성하기 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 표적 분자와 후보물질 혼합물을 접촉시키고; 핵산-표적 복합체의 형성이 일어나도록 하고; 느린 오프-레이트 증폭(enrichment) 공정을 수행하는 것을 포함하며, 여기에서 빠른 해리 속도를 가지는 핵산-표적 복합체는 해리되어 재생성되지 않을 것인 반면, 느린 해리 속도를 가지는 복합체는 온전하게 유지될 것이다. 부가적으로, 상기 방법은 향상된 오프-레이트 성능을 가지는 압타머를 생성하기 위하여 후보물질 핵산 혼합물의 생성에서 변경된 뉴클레오티드의 사용을 포함한다.

이 검정법의 변화는 압타머가 그것의 표적 분자에 공유적으로 결합 또는 "광가교(photocrosslink)" 결합할 수 있게 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머를 사용한다(예를 들어, U.S. Patent No. 6,544,776, "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"을 참고하라). 이들 광반응성(photoreactive) 압타머는 또한 광압타머로(photoaptamer)도 불린다(예를 들어, 각각 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: PHotoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"라는 제목의 U.S. Patent NO. 5,763,177, U.S. Patent No. 6,001,577 및 U.S. Patent No. 6.291,184; "Photoselection of Nucleic Acid Ligands"라는 제목의 U.S. Patent No. 6,458,539를 참고하라). 상기 마이크로어레이가 샘플과 접촉한 후, 광압타머는 그것들의 표적 분자에 결합할 수 있는 기회를 가지며, 상기 광압타머는 광활성화되고, 고체 지지체는 임의의 비특이적으로 결합된 분자를 제거하기 위하여 세척된다. 광압타머 상의 광활성화된 작용기에 의해 생성된 공유 결합 때문에 광압타머에 결합된 표적 분자는 일반적으로 제거되지 않으므로, 가혹한 세척 조건이 사용될 수 있다. 이 방법으로, 상기 검정법은 시료에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 검출할 수 있게 한다.

이들 검정 포맷 모두에서, 상기 압타머는 샘플과 접촉하기 이전에 고체 지지체 상에 고정화된다. 그러나, 어떤 환경하에서, 샘플과 접촉하기 전 압타머의 고정화는 최적의 검정을 제공하지 않을 수도 있다. 예를 들면, 압타머의 전-고정화(pre-immobilization)는 아마도 긴 반응시간에 따른 고체 지지체 표면상의 표적 분자와 압타머의 비효율적인 혼합을 야기할 수 있으므로, 그것의 표적 분자에 대한 압타머의 효율적인 결합을 위하여 긴 배양기간을 요한다. 게다가, 광압타머가 검정법에 사용되고 고체 지지체로서 사용된 물질에 의존하는 경우, 상기 고체 지지체는 광압타머와 그것의 표적 분자 간의 공유 결합의 형성을 이루기 위하여 사용되는 빛을 산란시키거나 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 더욱이, 사용된 방법에 따라, 고체 지지체의 표면은 또한 임의의 표지 시약에 노출되고 그것에 의해 영향을 받을 수 있기 때문에, 그것의 압타머에 결합된 표적 분자의 검출은 부정밀도(imprecision)에 영향을 받기 쉽다. 마지막으로, 고체 지지체 상의 압타머의 고정화는 일반적으로 샘플에 대한 압타머의 노출 이전에 압타머-제조 단계(즉, 고정화)를 포함하며, 이 제조 단계는 상기 압타머의 활성 또는 기능성에 영향을 미칠 수 있다.

용액에서 압타머가 그것의 표적을 포획할 수 있게 한 후, 검출 전 압타머-표적 혼합물의 특정 성분을 제거하기 위하여 설계된 분리 단계를 사용하는 압타머 검정법 또한 기술되어 있다("Multiplexed Analyses of Test Samples"라는 제목의 U.S. Patent Application Publication 2009/0042206을 참조). 상기 기술된 압타머 검정 방법은 핵산(즉, 압타머)을 검출하고 정량화하는 것에 의하여 시료에서의 비-핵산 표적(예를 들어, 단백질 표적)의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 상기 기술된 방법은 비-핵산 표적을 검출하고 정량화하기 위한 핵산 대리물(surrogate)(즉, 압타머)을 생성하므로, 단백질 표적을 포함하는 넓은 범위의 바람직한 표적에 적용될, 증폭을 포함하는 다양한 핵산 기술을 가능하게 한다.

압타머는 압타머 바이오마커 복합체(또는 광압타머 바이오마커 공유결합 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하고, 검출 및/또는 정량화를 위한 압타머의 단리가 가능하도록 구성될 수 있다. 일 구현에서, 이 구조체는 압타머 서열 내에 절단가능하거나(cleavable) 방출가능한(releasable) 구성요소를 포함할 수 있다. 다른 구현에서, 부가적인 기능성, 예를 들어 표지되거나 검출가능한 성분, 스페이서(spacer) 성분 또는 특정 결합 태그 또는 고정화 구성요소가 압타머 내로 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 압타머는 절단가능한 부분(moiety), 표지(label), 표지를 분리하는 스페이서 성분 및 방출가능한 부분을 통하여 압타머에 연결된 태그를 포함할 수 있다. 일 구현에서, 절단가능한 구성요소는 광절단가능한 링커(photocleavable linker)이다. 상기 광절단가능한 링커는 비오틴 부분(biotin moiety) 및 스페이서 부분(spacer section)에 부착될 수 있고, 아민의 유도체화를 위한 NHS기를 포함할 수 있으며, 압타머에 비오틴기를 도입하는데 사용될 수 있고, 그것에 의하여 검정 방법 이후 압타머의 방출을 가능하게 한다.

용액에서 모든 검정 성분을 처리하는 균질 검정법(homogenous assays)은 시그널의 검출 이전에 샘플 및 시약의 분리를 요하지 않는다. 이 방법은 빠르며 사용이 용이하다. 이 방법은 그것의 특정 표적과 반응하는 분자 포획 또는 결합 시약에 기초한 시그널을 생성한다. 비소세포 폐암에 대하여, 상기 분자 포획 시약은 압타머 또는 항체 등일 수 있고, 상기 특정 표적은 표 1의 비소세포 폐암 바이오마커 일 수 있다.

일 구현에서, 시그널 생성을 위한 방법은 플루오로포어-표지된(fluorophore-labeled) 포획 시약과 그것의 특정 바이오마커 표적의 상호작용에 기인하는 이방성(anisotropy) 시그널 변화를 이용한다. 상기 표지된 포획제가 그것의 표적과 반응할 때, 증가된 분자량은 이방성 값이 더욱 느리게 변하도록 복합체에 부착된 플로오로포어의 회전운동(rotational motion)을 야기한다. 이방성 변화를 관찰하는 것에 의하여, 결합 반응(binding events)은 용액에서 바이오마커를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 다른 방법은 형광편광 검정법(fluorescence polarization assay), 분자 비콘 방법(molecular beacon methods), 시분할 형광 퀀칭(time resolved fluorescene quenching), 화학발광(chemiluminescence), 형광공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer) 등을 포함한다.

생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있는 대표적인 용액에 기초한 압타머 검정법(solution-based aptamer assay)은 하기: (a) 제1의 태그를 포함하고 바이오마커에 대한 특이적 친화력을 가지는 압타머와 생물학적 샘플을 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하는 것, 여기에서 바이오마커가 샘플에 존재하는 경우 압타머 친화 복합체(aptamer affinity complex)가 형성되며; (b) 제1의 포획 구성요소를 포함하는 제1의 고체 지지체에 상기 혼합물을 노출시켜 제1의 태그가 상기 제1의 고체 지지체에 결합하도록 하는 것; (c) 상기 제1의 고체 지지체에 결합되지 않은 혼합물의 임의의 성분을 제거하는 것; (d) 상기 압타머 친화 복합체의 바이오마커 성분에 제2의 태그를 부착하는 것; (e) 상기 제1의 고체 지지체로부터 상기 압타머 친화 복합체를 분리시키는 것; (f) 제2의 포획 구성요소를 포함하는 제2의 고체 지지체에 분리된 압타머 친화 복합체를 노출시켜 제2의 태그가 제2의 포획 구성요소에 결합하도록 하는 것; (g) 상기 압타머 친화 복합체로부터 비착물화된(non-complexed) 압타머를 분할함으로써 혼합물로부터 임의의 비착물화된 압타머를 제거하는 것; (h) 상기 고체 지지체로부터 압타머를 용출하는 것; 및 (i) 상기 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출함으로써 바이오마커를 검출하는 것을 포함한다.

임의의 당업계에 공지된 방법들이 상기 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출함으로써 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있다. 친화 복합체의 압타머 성분을 검출하기 위하여 다수의 서로 다른 검출 방법, 예를 들어 혼성화 검정(hybridization assays), 질량 분석(mass spectroscopy) 또는 QPCR과 같은 검출 방법이 사용될 수 있다. 어떤 구현에서, 핵산 염기서열 분석 방법(nucleic acid sequencing methods)이 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출하여 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있다. 간단하게는, 시료는 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 압타머의 서열(들)을 확인하고 정량하기 위하여 임의의 종류의 핵산 염기서열 분석 방법의 대상이 될 수 있다. 어떤 구현에서, 상기 서열은 전체 압타머 분자 또는 상기 분자를 고유하게 확인하는데 사용될 수 있는 분자의 임의의 부분을 포함한다. 다른 구현에서, 염기서열을 확인하는 것은 압타머에 첨가된 특이적 서열이며; 이와 같은 서열은 종종 "태그(tags)", 바코드(barcodes)" 또는 "집코드(zipcodes)"로 칭해진다. 어떤 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 압타머 서열을 증폭하거나 RNA 및 임의의 부위에 화학적 변경을 포함하는 DNA를 포함하는 임의의 종류의 핵산을 염기서열 분석에 적절한 임의의 다른 종류의 핵산으로 전환시키기 위한 효소적 단계(enzymatic steps)를 포함한다.

어떤 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 하나 또는 그 이상의 클로닝 단계(cloning steps)를 포함한다. 다른 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 클로닝을 사용하지 않는 직접 염기서열 분석 방법(direct sequencing method)을 포함한다.

어떤 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 시료에서 하나 또는 그 이상의 압타머를 표적으로 하는 특정 프라이머(specific primer)를 사용하는 직접 접근법(direct approach)을 포함한다. 다른 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 시료에 있는 모든 압타머를 표적으로 하는 동시다발적 접근법(shotgun approach)을 포함한다.

어떤 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 염기서열 분석을 위해 표적화된 분자를 증폭하기 위한 효소적 단계를 포함한다. 다른 구현에서, 상기 염기서열 분석 방법은 단일 분자의 서열을 직접적으로 분석한다. 생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있는 예시적인 핵산 염기서열 분석에 기반한 방법은 하기: (a) 효소적 단계를 사용하여 화학적으로 변경된 뉴클레오티드를 포함하는 압타머의 혼합물을 변경되지 않은 핵산으로 전환하는 것; (b) 그 결과 생성된 변경되지 않은 핵산을 예를 들어, 454 염기서열 분석 시스템(454 Sequencing System)(454 Life Sciences/Roche), 일루미나 염기서열 분석 시스템(Illumina Sequencing System)(Illumina), ABI SOLiD 염기서열 분석 시스템(Applied Biosystems), 헬리스코프 단일 분자 시퀀서(HeliScope Single Molecule Sequencer)(Helicos Biosciences), 또는 퍼시픽 바이오사이언스 리얼 타임 단일 분자 염기서열 분석 시스템(Pacific Biosciences Real Time Single Molecule Sequencing System)(Pacific BioSciences) 또는 폴로네이터 지 염기서열 분석 시스템(Polonator G Sequencing System)(Dover Systems)과 같은 대량 병렬적 염기서열 분석 플랫폼(massively parallel sequencing platform)을 사용하여 동시다발적으로 염기서열 분석하는 것, 및 (c) 특정 서열(specific sequence)과 서열 계수(sequence count)에 의해 혼합물에 존재하는 압타머를 확인하고 정량하는 것을 포함한다.

면역검정법을 이용한 바이오마커 값의 측정

면역검정 방법(immunoassay)은 그것의 대응하는 표적 또는 분석물에 대한 항체의 반응에 기초하고 있으며, 특정 검정 포맷에 의존하여 샘플에서 분석물을 검출할 수 있다. 면역-반응성(immuno-reactivity)에 기초한 검정 방법의 특이도 및 민감도를 향상시키기 위하여, 단일클론항체(monoclonal antibodies)가 그것의 특이적인 에피토프 인식(epitope recognition) 때문에 종종 사용된다. 다중클론항체(polyclonal antibodies) 또한 단일클론항체에 비해 표적에 대하여 증가된 친화력 때문에 다양한 면역검정법에서 성공적으로 사용되고 있다. 면역검정법은 넓은 범위의 생물학적 샘플 매트릭스(biological sample matrices)와 함께 사용하도록 설계되어 왔다. 면역검정법의 포맷은 정성적(qualitative), 반정량적(semi-quantitative) 및 정량적(quantitative) 결과를 제공하도록 설계되어 왔다.

정량적 결과는 공지된 농도의 검출될 특정 분석물을 사용하여 생성된 표준 곡선의 사용을 통하여 생성된다. 미지의 샘플로부터 얻은 반응 또는 시그널은 표준 곡선 위에 그려지고, 미지의 샘플에서 표적에 대응하는 양 또는 값이 확립된다.

수많은 면역검정 포맷들이 설계되어 왔다. ELISA 또는 EIA는 분석물을 정량적으로 검출할 수 있다. 이 방법은 분석물 또는 항체 중 어느 하나에 대한 표지의 부착에 의존하며, 상기 표지 성분은 직접 또는 간접적으로 효소를 포함한다. ELISA 테스트는 분석물의 직접, 간접, 경쟁적(competitive) 또는 샌드위치(sandwich) 검출을 위한 포맷을 갖출 수 있다. 다른 방법들은 예를 들어, 방사성동위원소(radioisotope)(I¹²⁵) 또는 형광발광(fluorescence)과 같은 표지에 의존한다. 부가적인 기술들은 예를 들어, 응집(agglutination), 비탁법(nephelometry), 혼탁법(turbidimetry), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역세포화학법(immunocytochemistry), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 유세포 분석법(flow cytometry), 루미넥스 검정법(Luminex assay) 및 그 외의 것들을 포함한다(ImmunoAssay : A Practical Guide, edited by Brain Law, published by Taylor ＆ Francis, Ltd., 2005 edition을 참조).

예시적인 검정 포맷은 효소-결합 면역흡착검정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사성면역검정법(radioimmunoassay), 형광(fluorescent), 화학발광(chemiluminescence) 및 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 또는 시분할 형광 공명 에너지 전이(time resolved-FRET; TR-FRET) 면역검정법을 포함한다. 바이오마커를 검출하기 위한 방법의 예는 바이오마커 면역침강법에 이어서 겔 전기영동법(gel electrophoresis), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), 평면 전기크로마토그래피(planar electrochromatography) 등과 같은, 크기 및 펩티드 레벨을 구별할 수 있게 하는 정량적 방법을 포함한다.

물질이 생성하는 검출가능한 표지 또는 시그널을 검출 및/또는 정량하기 위한 방법은 표지의 특성에 의존한다. 적절한 효소에 의해 촉매화된 반응 산물은(여기에서 검출가능한 표지가 효소인 경우, 상기를 참조) 제한 없이 형광성, 발광성 또는 방사성일 수 있거나, 그것들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 이와 같은 검출가능한 표지를 검출하는데 적합한 검출기의 예는 제한 없이 X-레이 필름(x-ray film), 방사능 계측기(radioactivity counters), 섬광 계측기(scintillation counters), 분광 광도계(spectrophotometers), 비색계(colorimeters), 형광계(fluorometers), 발광계(luminometer) 및 농도측정계(densitometers)를 포함한다.

검출을 위한 임의의 방법은 임의의 적절한 제조, 처리 및 반응의 분석을 가능하게 하는 임의의 포맷으로 수행될 수 있다. 이것은 예를 들어, 다중-웰 검정 플레이트(multi-well assay plates)(예를 들어, 96 웰 또는 384 웰)일 수 있거나, 임의의 적절한 어레이 또는 마이크로어레이를 사용하는 것일 수 있다. 다양한 시약을 위한 저장 용액(stock solution)은 수동으로(manually) 또는 기계적으로(robotically) 만들어질 수 있고, 그 후의 모든 피펫팅(pipetting), 희석(diluting), 혼합(mixing), 분배(distribution), 세척(washing), 배양(incubating), 샘플 판독(readout), 데이터 수집(data collection) 및 분석(analysis)이 상용의 분석 소프트웨어, 로봇 공학 및 검출가능한 표지를 검출할 수 있는 검출 기계를 사용하여 기계적으로 완료될 수 있다.

유전자 발현 프로파일링을 사용하는 바이오마커 값의 측정

생물학적 샘플에서 mRNA를 측정하는 것은 생물학적 샘플에서 대응하는 단백질 레벨의 검출을 위한 대리물(surrogate)로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 바이오마커 또는 바이오마커 패널 또한 적절한 RNA를 검출함으로써 검출될 수 있다.

mRNA 발현 레벨은 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction; RT-PCR)(qPCR에 따른 RT-PCR)에 의해 측정될 수 있다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 만드는데 사용된다. 상기 cDNA는 DNA 증폭 과정의 진행으로서 형광을 만들어내기 위하여 qPCR에서 사용될 수 있다. 평균 곡선과 비교하여, qPCR은 세포당 mRNA 복제의 수와 같은 절대 측정(absolute measurement)을 만들어낼 수 있다. 모세관 전기이동과 조합된 노던 블롯(Northern blots), 마이크로어레이(microarrarys), 침입자 검정법(invader assay) 및 RT-PCR 모두 샘플에서 mRNA의 발현 레벨을 측정하는데 사용되고 있다(Gene Expression Profiling: Method and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004를 참조).

miRNA 분자는 비암호화(non-coding)이지만 유전자 발현을 조절하는 소형 RNA이다. mRNA 발현 레벨의 측정에 적합한 임의의 방법들도 대응하는 miRNA에 대하여 사용될 수 있다. 최근 많은 연구소들이 질병에 대한 바이오마커로서 miRNAs의 사용을 연구하고 있다. 많은 질병들이 광범위한 전자 조절(transcriptional regulation)을 수반하며, miRNA가 바이오마커로서의 역할을 한다는 것을 알 수 있다는 것은 놀랍지 않다. miRNA 농도와 질병 간의 연관성은 종종 단백질 레벨과 질병 간의 연관성보다 덜 명확하나, 그럼에도 불구하고, miRNA 바이오마커의 값은 실질적일 수 있다. 물론, 병에 걸려있는 동안 상이하게 발현된 임의의 RNA와 마찬가지로, 시험관 내(in vitro) 진단 산물의 개발에 직면하는 문제들은 miRNA가 병든 세포에서 견뎌내고, 분석을 위하여 쉽게 추출되거나, miRNA가 측정될 수 있을 만큼 충분히 길게 잔존해야만 하는 경우 혈액 또는 다른 매트릭스 내로 방출될 필요성을 포함할 것이다. 비록 많은 잠재적인 바이오마커들이 병에 걸려있는 동안 주변분비 방식(paracrine fashion)으로 병리 및 기능 부위에 의도적으로 분비될지라도, 단백질 바이오마커도 유사한 필요성을 가진다. 많은 잠재적인 단백질 바이오마커들이 이 단백질들이 합성되는 세포 바깥에서 기능하도록 설계된다.

생체 내 분자 영상화 기술을 사용하는 바이오마커의 검출

임의의 상기 기재된 바이오마커들(표 1을 참조) 또한 분자 영상화 테스트에 사용될 수 있다. 예를 들면, 영상 제제(imaging agent)는 비소세포 폐암 진단의 보조를 위하여, 질병의 진행/차도 또는 전이를 관찰하기 위하여, 질병의 재발을 관찰하기 위하여, 또는 다른 용도들 중에서 치료에 대한 반응을 관찰하기 위하여 사용될 수 있는 임의의 상기 기재된 바이오마커와 결합될 수 있다.

생체 내 영상화 기술은 개인의 신체에서 특정 질병의 상태를 판단하기 위한 비침윤적(non-invasive) 방법을 제공한다. 예를 들면, 신체의 전 부분(entire portion) 또는 온몸(entire body)은 3차원 영상으로 검사될 수 있으며, 그것에 의해 신체에서 형태와 구조에 관한 매우 유익한 정보가 얻어진다. 이러한 기술은 개인의 암의 상태, 특히 비소세포 폐암 상태에 관한 정보를 제공하기 위하여, 본원에 기재된 바이오마커의 검출과 조합될 수 있다.

기술에 있어서의 다양한 진보 덕분에 생체 내 분자 영상화 기술의 사용이 확장되고 있다. 이러한 진보는 신체 내에서 강력한 시그널을 제공할 수 있는 방사성표지 및/또는 형광성 표지와 같은 새로운 조영제(contrast agent)의 개발; 및 유용한 정보를 제공하기 위하여 현저한 민감도와 정확성을 가지는, 신체 외부로부터 이러한 시그널을 검출하고 분석할 수 있는 강력한 새로운 영상화 기술의 개발을 포함한다. 상기 조영제는 적절한 영상화 시스템에서 가시화될 수 있고, 그것에 의해 조영제가 위치된 신체의 부분(들)의 영상이 제공된다. 상기 조영제는 압타머 또는 항체와 같은 포획 시약, 예를 들어, 펩티드 또는 단백질 또는 (예를 들어, 유전자 발현의 검출을 위한) 올리고뉴클레오티드, 또는 하나 또는 그 이상의 거대분자(macromolecules) 및/또는 다른 미립자 형태(particulate forms)를 가지는 임의의 이러한 것들을 포함하는 복합체와 결합될 수 있다.

상기 조영제는 또한 영상화에 유용한 방사성 원소(radioactive atom)의 특징을 가질 수 있다. 적절한 방사성 원소는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 테크네튬-99m(technetium-99m) 또는 이오딘-123(iodine-123)을 포함한다. 다른 손쉽게 검출가능한 부분들은 예를 들어, 이오딘-123, 이오딘-131(iodine-131), 인듐-111(indium-111), 플루오린-19(fluorine-19), 탄소-13(carbon-13), 질소-15(nitrogen-15), 산소-17(oxygen-17), 가돌리늄(gadolinium), 망간(manganese) 또는 철(iron)과 같은 자기 공명 영상(magnetic resonance imaging; MRI)을 위한 스핀 표지(spin label)를 포함한다. 이러한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자들에 의해 쉽게 선택될 수 있다.

표준 영상화 기술은 자기 공명 영상, 전산화 단층 촬영(computed tomography scanning), 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography; PET), 단일광자 방출 단층촬영(single photon emission computed tomography; SPECT) 등을 포함하지만 이로 한정되는 것은 아니다. 진단적 생체 내 영상화를 위한, 사용가능한 검출 기구의 유형은 표적(단백질, mRNA 등)으로 사용되는 주어진 방사성 핵종(radionuclide) 및 특정 바이오마커와 같은, 주어진 조영제를 선택하는데 있어서의 주요 인자이다. 전형적으로, 선택된 상기 방사성 핵종은 기구의 주어진 형태에 의해 검출가능한 붕괴(decay) 유형을 가진다. 또한, 생체 내 진단을 위한 방사성 핵종을 선택할 때, 그것의 반감기는 표적 조직에 의한 최대 흡수(uptake) 시간에 검출될 수 있을 만큼 충분히 길어야 하지만, 숙주에 유해한 방사능이 최소화될 만큼 충분히 짧아야 한다.

대표적인 영상화 기술은 방사성 핵종이 개인에게 종합적(synthetically) 또는 국부적(locally)으로 투여되는 영상화 기술인 PET 및 SPECT를 포함하나, 이로 제한되는 것은 아니다. 그 후 방사성 핵종의 흡수는 시간에 따라 측정되며, 표적화된 조직 및 바이오마커에 대한 정보를 얻기 위하여 사용된다. 사용된 특정 동위 원소의 고에너지(감마-레이) 방출 및 그것들을 검출하는데 사용되는 기구의 민감성과 정교성(sophistication) 때문에, 방사성 핵종의 2차원 분포는 신체 외부에서 추론될 수 있다.

PET에서 일반적으로 사용되는 양전자-방출 방사성 핵종(positron-emitting nuclides)은 예를 들어, 탄소-11(carbon-11), 질소-13(nitrogen-13), 산소-15(oxigen-15) 및 플루오린-18(fluorine-18)을 포함한다. 전자 포획(electron capture) 및/또는 감마선-방출에 의해 붕괴되는 동위 원소는 SPECT에 사용되며, 예를 들어 이오딘-123 및 테크네튬-99m을 포함한다. 테크네튬-99m을 사용하여 아미노산을 표지하기 위한 예시적인 방법은 테크네튬-99m-화학주성 펩티드 결합체(technetium-99m-chemotactic peptide conjugate)를 형성하기 위하여 두 기능을 가지도록 변경된(bifunctionally modified) 화학주성 펩티드의 금속 결합기와 차례로 반응하는 불안정한 테크네튬-99m-전구 복합체(technetium-99m-precursor complex)를 형성하기 위하여, 킬레이팅 전구체의 존재하에서 과테크네튬산 이온(pertechnetate ion)의 환원이다.

항체들은 이러한 생체 내 영상화 진단 방법을 위하여 자주 사용된다. 생체 내 진단을 위한 항체의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 표 1에서의 임의의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 표지된 항체들은 개인의 질병 상태를 진단하거나 평가하기 위한 목적으로 사용된 특정 바이오마커에 따라 검출가능한, 어떤 유형의 암(예를 들어, 비소세포 폐암)을 가지는 것으로 의심되는 개인에게 주입될 수 있다. 사용된 표지는 이전에 기재된 것과 같이 사용될 영상화 기법에 따라 선택될 것이다. 표지의 위치는 암의 범위를 측정가능하게 한다. 기관 또는 조직 내에서의 표지의 양 또한 그 기관 또는 조직에서의 암의 존재 여부를 측정할 수 있게 한다.

유사하게는, 압타머는 이러한 생체 내 영상화 진단 방법을 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 표 1에 기재된 특정 바이오마커를 확인하는데 사용되는 압타머는(그리고, 따라서 그 특정 바이오마커에 특이적으로 결합한다) 적절하게 표지될 수 있으며, 개인의 비소세포 폐암 상태를 진단하거나 판단하기 위한 목적으로 특정 바이오마커에 따라 검출가능한 비소세포 폐암을 가지는 것으로 의심되는 개인에게 주입된다. 사용된 표지는 이전에 기재된 것과 같이 사용될 영상화 기법에 따라 선택될 것이다. 표지의 위치는 암의 범위를 측정가능하게 한다. 기관 또는 조직 내에서의 표지의 양 또한 그 기관 또는 조직에서의 암의 존재 여부를 측정할 수 있게 한다. 압타머-유도 영상 제제(aptamer-directed imaging agents)는 다른 영상 제제와 비교하여 조직 침입(penetration), 조직 분포(distribution), 동역학(kenetics), 제거(elimination), 효능(potency) 및 민감성에 관련된 독특하고 유리한 특성을 가질 수 있다.

이러한 기술들은 또한 예를 들어, 역배열(antisense) 올리고뉴클레오티드를 사용하는 영상화를 통한 유전자 발현의 검출을 위하여, 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 선택적으로 수행될 수 있다. 이 방법들은 예를 들어, 표지로서 형광성 분자 또는 방사성 핵종을 사용하여, 인시츄 혼성화(in situ hybridization)에 사용된다. 유전자 발현의 검출을 위한 다른 방법들은 예를 들어, 지시 유전자(reporter gene) 활성의 검출을 포함한다.

다른 일반적인 유형의 영상화 기술은 피험자 내부의 형광 시그널이 피험자 외부에 있는 광학 기구(optical device)에 의해 검출되는 광학 영상화(optical imaging)이다. 이 시그널은 실제의 형광 및/또는 생물발광(bioluminescence)에 기인할 수 있다. 광학 검출 기구의 민감도에 있어서의 향상은 생체 내 진단 검정을 위한 광학 영상화의 유용성을 증가시킨다.

예를 들어, 새로운 암 치료를 위한 시도에서 임상적인 효과를 더욱 빠르게 측정하고/하거나 윤리적으로 의심스러운 것으로 간주 될 수 있는, 다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 질병에 대하여 플라시보(placebo)를 사용하는 장기 치료를 피하기 위한 임상실험을 포함하여, 생체 내 분자 바이오마커 영상화의 사용이 증가하고 있다.

다른 기술의 리뷰를 위하여, 엔. 블로우 등을 참조하라(N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009).

조직/세포학적 방법을 사용하는 바이오마커 값의 측정

비소세포 폐암의 평가를 위하여, 다양한 조직 샘플들이 조직 또는 세포학적 방법에 사용될 수 있다. 샘플의 선별은 초기 종양의 위치 및 전이 부위에 의존한다. 예를 들면, 말단기관지(endo-bronchial) 및 경기관지(trans-bronchial) 생검, 세침 흡인(fine needle aspirates), 절단침(cutting needles) 및 중심부 생검(core biopsy)이 조직학에 사용될 수 있다. 기관지 세척액 및 브러싱(brushing), 늑막 흡인(pleural aspiration) 및 객담(sputum)은 세포학에 사용될 수 있다. 세포학적 분석은 여전히 비소세포 폐암의 진단에 사용되고 있는 반면, 조직학적 방법은 암 검출에 대한 더 나은 민감도를 제공하는 것으로 알려져 있다. 비소세포 폐암에 걸린 개인에게서 상승 조절되는 것으로 나타난 본원에서 확인된 임의의 바이오마커(표 1을 참조)는 질병의 표지자(indicator)로서 조직학적 견본을 염색하는데 사용될 수 있다.

일 구현에서, 대응하는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)이 폐 조직 세포 샘플의 세포학적 평가에 사용되며, 하나 또는 그 이상의 하기의 것: 세포 샘플을 수집(collecting), 세포 샘플을 고정(fixing), 탈수(dehydrating), 수세(clearing), 현미경 슬라이드 상에 세포 샘플을 고정화(immobilizing), 세포 샘플의 투과성을 증진(permeabilizing), 분석물 복구(analyte retrieval)를 위한 처리(treating), 염색(staining), 탈색(destaining), 세척(washing), 차단(blocking) 및 버퍼 용액에서 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)과 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 일 구현에서, 상기 세포 샘플은 세포 블록(block)으로부터 만들어진다.

다른 구현에서, 대응하는 바이오마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)이 폐 조직 샘플의 조직학적 평가에 사용되며, 하나 또는 그 이상의 하기의 것: 조직 견본의 수집, 조직 샘플의 고정, 탈수, 수세, 현미경 슬라이드 상에 조직 샘플을 고정화, 조직 샘플의 투과성을 증진, 분석물 복구를 위한 처리, 염색, 탈색, 세척, 차단, 재수화(rehydrating) 및 버퍼 용액에서 포획 시약(들)과 반응시키는 것을 포함할 수 있다. 일 구현에서, 고정 및 탈수는 동결(freezing)로 대체된다.

다른 구현에서, 대응하는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 또는 그 이상의 압타머(들)은 조직 또는 세포 샘플과 반응시키며, 핵산 증폭 방법에서 핵산 표적으로 제공될 수 있다. 적합한 핵산 증폭 방법은 예를 들어, PCR, q-베타 레플리카아제(q-beta replicase), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 사슬 교체(strand displacement), 리가아제 연쇄 반응법(ligase chain reaction), 및 회전환 증폭을 돕는 제한(restriction) 및 원형화(circularization)를 포함한다.

일 구현에서, 조직 또는 세포학적 평가에 사용하기 위한 대응하는 바이오마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)은 임의의 하기의 것: 차단 물질(blocking materials), 경쟁자(competitors), 세제(detergents), 안정화제(stabilizers), 운반 핵산(carrier nucleic acid), 다가음이온성 물질(polyanionic materials) 등을 포함할 수 있는 버퍼 용액에 혼합된다.

"세포학 프로토콜(cytology protocol)"은 일반적으로 샘플 수집, 샘플 고정, 샘플 고정화 및 염색을 포함한다. "세포 제조(cell preparation)"는 제조된 세포의 염색을 위한 하나 또는 그 이상의 느린 오프-레이트의 압타머의 사용을 포함하는, 샘플 수집 후의 여러 공정을 포함할 수 있다.

샘플 수집은 처리되지 않은 운반 용기에 샘플을 직접 넣는 것, 어떤 유형의 배지가 담겨있는 운반 용기에 샘플을 넣는 것 또는 임의의 처리(treatment) 또는 고정(fixation) 없이 슬라이드 상에 직접적으로 샘플을 놓는 것(고정화)을 포함할 수 있다.

샘플 고정화(immobilization)는 폴리리신(polylysine), 젤라틴(gelatin) 또는 실란(silane)으로 처리된 유리 슬라이드에 수집된 견본의 일부분을 붙임으로써 이용될 수 있다. 슬라이드는 슬라이드 전역에 얇고 평평한 세포층을 도말(smearing)함으로써 제조될 수 있다. 보관은 일반적으로 기계적 변형(mechanical distortion) 및 건조에 의한 인공물(drying artifact)을 최소화시킨다. 액상 견본은 세포 블록(cell block) 방법으로 처리될 수 있다. 또는, 대안적으로, 액상 견본은 상온에서 약 10분간 고정 용액(fixative solution)과 1:1로 혼합될 수 있다.

세포 블록은 잔여 삼출액(residual effusion), 객담(sputum), 요침사(urine sediment), 위장액(gastrointestinal fluid), 폐액(pulmonary fluid), 세포 긁어낸 것(cell scraping) 또는 세침 흡인으로부터 제조될 수 있다. 세포는 원심분리 또는 막 여과에 의해 농축되거나 패키징된다. 세포 블록 제조를 위한 많은 방법들이 개발되어 있다. 대표적인 방법은 침전물 고정(fixed sediment), 세균성 아가(bacterial agar), 또는 막 여과 방법을 포함한다. 침전물 고정 방법에서, 세포 침전물은 보우인(Bouins), 피크르산(picric acid), 또는 완충된 포르말린(buffered formalin)과 같은 고정액과 혼합된 후, 상기 혼합물은 고정화된 세포를 펠릿화하기 위하여 원심분리된다. 될 수 있는 한 완전하게 세포 펠릿을 건조하여 상층액을 제거한다. 펠릿을 수집하고 렌즈 페이퍼(lens paper)로 싼 후 조직 카세트(tissue cassette)에 넣는다. 상기 조직 카세트를 추가 고정액과 함께 병에 넣고, 조직 샘플과 같이 처리한다. 아가법(agar method)은 매우 유사하지만, 펠릿이 제거되고 페이퍼 타월 위에서 건조된 후 반으로 자른다. 자른 쪽을 유리 슬라이드 상의 한 방울의 용해된 아가에 올려놓은 후, 상기 펠릿을 아가 내에서 확실하게 버블이 형성되지 않도록 아가로 덮는다. 상기 아가를 굳힌 후 임의의 여분의 아가를 걷어낸다. 이것을 조직 카세트에 넣으면 조직 처리는 완료된다. 대안적으로, 상기 펠릿은 65℃에서 2% 아가 용액에 직접적으로 현탁될 수 있고, 샘플은 원심분리된다. 상기 아가 세포 펠릿을 4℃에서 1시간 동안 응고시킨다. 상기 고체 아가는 원심분리 튜브로부터 제거될 수 있고, 반으로 분할될 수 있다. 상기 아가를 여과 페이퍼로 감싼 후 조직 카세트에 넣는다. 이 시점 이전의 처리는 상기에 기재된 것과 같다. 원심분리는 막 여과와 함께 임의의 이러한 방법으로 대체될 수 있다. 임의의 이러한 방법은 "세포 블록 샘플(cell block sample)"을 만드는데 사용될 수 있다.

세포 블록은 로위크릴 수지(Lowicryl resins), LR 화이트(LR White), LR 골드(LR Gold), 유니크릴(Unicryl) 및 모노스텝(MonoStep)을 포함하는 특성화된 수지를 사용하여 제조될 수 있다. 이 수지들은 저점도를 가지며, 낮은 온도에서 자외선을 사용하여 중합될 수 있다. 포매 처리(embedding process)는 탈수하는 동안 샘플을 점진적으로 냉각시키고, 수지에 샘플을 옮기고, 마지막으로 적절한 UV 파장에서 낮은 온도에서 블록을 중합시키는 것에 의존한다.

세포 블록 절편(cell block sections)은 세포형태학 검사(cytomorphological examination)를 위하여 헤마톡실린-에오신으로 염색될 수 있고, 동시에 부가적인 절편은 특정 마커에 대한 검사를 위하여 사용된다.

상기 처리가 조직학적인지 세포학적인지에 관계없이, 상기 샘플은 샘플 분해를 예방하기 위하여 부가적인 처리 전에 고정화될 수 있다. 이 처리는 "고정(fixation)"이라 불리며, 상호교환적으로 사용될 수 있는 넓은 범위의 물질 및 방법들을 설명한다. 샘플 고정 프로토콜 및 시약은 검출될 표적과 분석될 특정 세포/조직에 기초하여 경험적으로 잘 선택된다. 샘플 고정은 에탄올(ethanol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 메탄올(methanol), 포르말린(formalin) 또는 이소프로판올(isopropanol)과 같은 시약에 의존한다. 상기 샘플은 가능한 한 슬라이드에 수집 및 첨가된 후 바로 고정되어야 한다. 그러나, 선별된 고정액은 그것들의 뒤이은 검출을 더욱 어렵게 만드는 다양한 분자 표적들 안으로 구조적 변화를 도입할 수 있다. 고정 및 고정화 처리 및 그것들의 순서는 세포의 외형을 변경시킬 수 있고, 이러한 변화는 세포검사 기사에 의해 예상되고 인식되어야만 한다. 고정액은 어떤 세포 형태의 수축(shrinkage)을 야기할 수 있고, 세포질이 과립 모양(granular) 또는 그물 모양(reticular)을 나타내도록 할 수 있다. 많은 고정액이 세포 성분과 가교 결합함으로써 작용한다. 이것은 특정 에피토프를 손상시키거나 변경시킬 수 있고, 새로운 에피토프를 생성할 수 있으며, 분자 회합(molecular associations)을 야기할 수 있고, 막 투과성을 감소시킬 수 있다. 포르말린 고정은 가장 일반적인 세포/조직학적 방법 중 하나이다. 포르말린은 단백질 주변 또는 단백질 내에서 메틸 브릿지(methyl bridge)를 형성한다. 침전(precipitation) 또는 응고(coagulation) 또한 고정하는데 사용되며, 에탄올은 이러한 유형의 고정에 자주 사용된다. 가교결합(crosslinking) 및 침전의 조합 또한 고정에 사용될 수 있다. 강력한 고정 처리는 형태학적 정보를 보전하는 최선의 방법인 반면, 약한 고정 처리는 분자 표적의 보존에 최선의 방법이다.

대표적인 고정액은 50% 순수 에탄올, 2mM 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1.85% 포름알데히드이다. 이 성분배합(formulation) 상의 변화는 에탄올(50% 내지 95%), 메탄올(20% - 50%), 및 포르말린(포름알데히드) 단독을 포함한다. 다른 일반적인 고정액은 2% PEG 1500, 50% 에탄올 및 3% 메탄올이다. 슬라이드는 상온에서 약 10 내지 15분간 고정액에 놓은 후, 제거하여 건조한다. 일단 슬라이드가 고정되면, PBS와 같은 완충 용액으로 헹궈질 수 있다.

넓은 범위의 염료들이 세포의(cellular), 아세포의(sub-cellular) 및 조직의 특징 또는 형태학적 구조를 차별적으로 강조하고 대조하거나 "염색(stain)"하는데 사용될 수 있다. 헤마톡실린(hematoxylin)은 핵을 파란색 또는 검은색으로 염색하는데 사용된다. 오렌지 G-6(Orange G-6) 및 에오신 아주르(eosin azure) 모두 세포의 세포질을 염색한다. 오렌지 G는 케라틴(keratin) 및 글리코겐(glycogen) 함유 세포를 노란색으로 염색한다. 에오신 Y는 핵소체(nucleoli), 섬모(cilia), 적혈구(red blood cells) 및 표재성 상피 편평세포(superficial epithelial squamous cells)를 염색하는데 사용된다. 로마노프스키 염색(romanowsky stains)은 자연 건조된(air dried) 슬라이드에 사용되며, 다형성을 증가시키고 세포질 내(intracytoplasmic) 물질로부터 세포 밖 물질을 구별하는데 유용하다.

염색 과정은 염색에 대한 세포의 투과성을 증가시키기 위한 처리를 포함할 수 있다. 세제(detergent)를 사용한 세포의 처리는 투과성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 세포 및 조직의 투과성을 증가시키기 위하여, 고정된 샘플은 용매(solvents), 사포닌(saponins) 또는 비이온성 세제(non-ionic detergents)로 더 처리될 수 있다. 효소적 분해(enzymatic digestion) 또한 조직 샘플에서 특정 표적의 접근성을 향상시킬 수 있다.

염색 후, 상기 샘플은 알코올 농도가 증가하는 연속적인 알코올 헹굼을 사용하여 탈수된다. 마지막 세척은 자일렌(xylene) 또는 슬라이드에 사용되는 커버 슬립에 근접한 굴절률(refractive index)을 가지는 시트러스 테르펜(citrus terpene)과 같은 자일렌 대용물을 사용하여 완료된다. 이 마지막 단계는 수세(clearing)로서 칭해진다. 일단 샘플이 탈수되고 수세되면, 봉입제(mounting medium)를 사용한다. 상기 봉입제는 유리에 근접한 굴절률을 가지는 것으로 선택되며, 슬라이드에 커버 슬립을 붙일 수 있다. 그것은 또한 세포의 부가적인 건조, 수축 또는 쇠퇴(fading)를 억제할 것이다.

사용된 염색 또는 처리에 관계없이, 폐 세포 견본의 최종 평가는 형태의 외관 검사(visual inspection) 및 마커의 존재 여부의 측정을 가능하게 하는 어떤 형태의 현미경에 의해 이루어진다. 예시적인 현미경 방법은 명시야(brightfield), 위상차(phase contrast), 형광(fluorescence) 및 차등간섭 대조(differential interference contrast)를 포함한다.

만일 검사 후 샘플 상에서의 제2의 테스트가 요구된다면, 커버 슬립을 제거할 수 있으며, 슬라이드는 탈색시킨다. 탈색(destaining)은 본래 추가되는 염료 없이 원래의 염색 방법에 대하여 역순으로 슬라이드를 염색하는데 사용된 원용매 시스템(original solvent system)을 사용하는 것을 포함한다. 탈색은 또한 세포가 무색이 될 때까지 산성 알코올에 슬라이드를 담금으로써 완료될 수 있다. 일단 무색의 슬라이드를 수조(water bath)에서 잘 헹구고, 제2의 염색 처리를 적용한다.

또한, 특정 분자의 식별은 항체 또는 핵산 프로브 또는 압타머와 같은 특정 분자 시약의 사용을 통한 세포 형태학적 분석과 함께 가능할 것이다. 이것은 진단 세포학의 정확도를 향상시킨다. 미세절개(micro-dissection)는 특히 비정상적 크로모좀(abnormal chromosomes), 유전자 발현(gene expression) 또는 변이(mutations)에 대한 추가적인 평가를 위한 세포의 서브셋을 단리하는데 사용될 수 있다.

조직학적 평가를 위한 조직 샘플의 제조는 고정(fixation), 탈수(dehydration), 침투(infiltration), 포배(embedding) 및 절편화(sectioning)를 포함한다. 조직학에서 사용되는 고정 시약은 세포학에서 사용되는 것들과 매우 유사하거나 동일하고, 개개의 단백질과 같은 분자들의 노출에서 형태학적 특징을 보존하는 것에 대한 동일한 문제점을 가진다. 만일 조직 샘플이 고정되지 않고 탈수되었으나 대신에 동결된 후 동결되어 있는 동안 절편화 되었다면, 시간이 절약될 수 있다. 이것은 더욱 온화한 처리 방법이며, 더 많은 개개의 마커들을 보존할 수 있다. 그러나, 동결은 얼음 결정의 도입으로 인하여 세포 내(subcellular) 정보가 상실되기 때문에 조직 샘플의 장기간 저장에 적합하지 않다. 동결된 조직 샘플 내의 얼음은 또한 매우 얇은 슬라이스를 생성하는 절편화 공정을 방해한다. 포르말린 고정뿐만 아니라, 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)도 고정에 사용되며 인지질(막)을 염색한다.

조직의 탈수(dehydration)는 알코올의 농도를 증가시키면서 연속적으로 세척하여 달성된다. 수세(clearing)는 알코올 및 포배 물질(embedding material)과 함께 섞일 수 있는 물질을 사용하고, 알코올:수세 촉진제(clearing agent)(자일렌 또는 자일렌 대용품) 50:50에서 출발하는 단계적 공정을 포함한다. 침투(infiltration)는 조직을 먼저 50:50의 포배 시약:수세 촉진제에서 그리고 100% 포배 시약에서, 액체 형태의 포배 시약(웜왁스(warm wax), 니트로셀룰로오스 용액(nitrocellulose solution))과 함께 배양하는 것을 포함한다. 포배(embedding)는 몰드(mold) 또는 카세트(cassette)에 조직을 위치시키고, 왁스(wax), 아가(agar) 또는 젤라틴(gelain)과 같은 용해된 포배 시약을 채움으로써 완성된다. 상기 포배 시약을 굳힌다. 굳어진 조직 샘플은 그 후 염색 및 뒤이은 실험을 위하여 얇은 절편으로 절단될 수 있다.

염색 이전에, 조직 절편은 왁스가 제거되고 재탈수된다. 자일렌은 절편의 왁스를 제거하는데 사용되며, 한번 또는 그 이상의 자일렌 교체가 사용될 수 있고, 조직은 농도를 감소시킨 알코올에서 연속적으로 세척함으로써 재탈수된다. 왁스를 제거하기 전에, 조직 절편은 약 20분간 약 80℃에서 유리 슬라이드에 열 고정화될 수 있다.

레이저 포획 미세절개(laser capture micro-dissection)는 조직 절편으로부터 추가 분석을 위한 세포의 서브셋의 단리를 가능하게 한다.

세포학에서와 같이, 현미경적 특징의 가시화를 강화시키기 위하여, 조직 절편 또는 슬라이스는 다양한 염색제로 염색될 수 있다. 다양한 종류의 사용 염색제들이 특이적 특징들을 강화시키거나 확인하기 위하여 사용될 수 있다.

세포/조직학적 샘플과 분자 시약의 상호작용을 더 증가시키기 위하여, "분석물 복구(analyte retrieval)"를 위한 많은 기술이 개발되어 왔다. 먼저 이와 같은 기술은 고정된 샘플의 고온 가열을 사용한다. 이 방법은 또한 열-유도 에피토프 복구(heat-induced epitope retrieval) 또는 HIER로 칭한다. 스팀 가열(sream heating), 전자레인지 가열(microwaving), 고압살균(autoclaving), 항온수조(water bath) 및 가압 증자(pressure cooking) 또는 이 가열 방법들의 조합을 포함하는, 다양한 가열 기술들이 사용되어 왔다. 분석물 복구 용액은 예를 들어, 물, 시트레이트(citrate) 및 일반 식염수 완충액(saline buffers)을 포함한다. 분석물 복구를 위한 성공 비결은 고온에서의 시간이지만, 장기간 동안에서의 더 낮은 온도 또한 성공적으로 사용된다. 분석물 복구를 위한 또 다른 성공 비결은 가열 용액의 pH이다. 낮은 pH는 최적의 면역염색(immunostaining)을 제공하는 것으로 알려져 있으나, 또한 종종 음성 대조군으로서 제2의 조직 절편의 사용을 필요로 하는 백그라운드(background)를 발생시킨다. (백그라운드를 증가시키는 일 없이 면역염색을 증가시키는) 가장 견고한 이점은 일반적으로 완충 조성물에 상관없이 높은 pH 용액을 사용하여 얻어진다. 특정 표적을 위한 상기 분석물 복구 공정은 공정 최적화에 대하여 가변적이므로, 열, 시간, pH 및 완충 조성물을 사용하여 표적에 대하여 경험적으로 최적화된다. 마이크로파 분석물 복구 방법을 사용하는 것은 항체 시약을 사용하여 서로 다른 표적의 연속적인 염색을 가능하게 한다. 그러나, 염색 단계 사이에서 항체와 효소 복합체를 완성하는데 요구되는 시간은 또한 세포막 분석물을 붕괴시키는 것으로 나타났다. 마이크로파 가열 방법은 인시츄 혼성화(in situ hybridization) 방법에서도 이용된다.

분석물 복구 공정을 시작하기 위하여, 먼저 절편의 왁스를 제거하고 탈수시킨다. 그 후, 슬라이드를 디쉬 혹은 병 내 pH 6.0의 10mM 소디움 시트레이트 버퍼에 담근다. 전형적인 방법은 1100W의 마이크로파를 사용하며, 2분간 100% 전력으로 슬라이드를 전자레인지에 가열한 후, 용액 내에서 슬라이드의 커버가 여전히 덮여있는지 확실히 하기 위하여 확인한 후, 18분간 20% 전력을 사용하여 슬라이드를 전자레인지에 가열하였다. 그 후, 슬라이드를 뚜껑이 없는 용기에서 냉각시킨 후, 증류수로 헹구었다. HIER은 면역화학적 시약에 대한 표적의 반응성을 향상시키기 위하여 효소적 분해와 함께 사용될 수 있다.

이러한 효소적 분해 프로토콜은 프로테이나아제 K(proteinase K)를 사용한다. 20μg/ml 농도의 프로테이나아제 K를 50mM 트리스염, 1mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100, pH 8.0의 버퍼에 제조한다. 상기 공정은 먼저 각 5분씩, 자일렌을 2번 교체하여 절편의 왁스를 제거하는 것을 포함한다. 그 후, 샘플을 각각 3분간 100% 에탄올 2번, 각각 1분간 95% 및 80% 에탄올로 수화시키고, 증류수로 헹군다. 절편을 프로테이나아제 K 작용액(working solution)으로 덮고, 습한 챔버에서 37℃에서 10-20분 배양한다(최적 배양 시간은 조직 형태 및 고정의 정도에 따라 달라질 수 있다). 상기 절편을 10분간 상온에서 냉각시킨 후, 2분간 2번 PBS 트윈 20(PBS Tween 20)으로 헹군다. 만일 원한다면, 내생적 화합물 및 효소로부터의 잠재적인 간섭을 제거하기 위하여 절편을 차단할 수 있다. 그 후, 상기 절편을 상온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체 희석 버퍼에 적절하게 희석하여 1차 항체와 함께 배양한다. 상기 절편을 2분간 2번 PBS 트윈 20으로 헹군다. 만일 특별한 적용이 필요하다면, 부가적인 차단을 수행한 후 2분간 3번 PBS 트윈 20으로 추가적으로 헹구어준 후, 마지막으로 면역염색 프로토콜을 완료한다.

상온에서의 1% SDS를 사용한 간단한 처리 또한 면역조직학적 염색을 향상시키는 것으로 증명되었다. 분석물 복구 방법은 슬라이드가 덮인 절편뿐만 아니라 유동(free floating) 절편에도 적용될 수 있다. 또 다른 처리 옵션은 pH 6.0의 시트르산과 0.1 Nonidet P40을 포함하는 용기에 슬라이드를 담그고 95℃로 가열하는 것이다. 상기 슬라이드는 그 후 PBS와 같은 완충 용액을 세척한다.

조직의 면역학적 염색에 대하여, 그것은 혈청 또는 탈지분유(non-fat dry milk)와 같은 단백질 용액에 절편을 담금으로써 조직 단백질과 항체의 비특정 결합을 차단시키는 데 유용할 수 있다.

차단 반응(blocking reaction)은 내생적 비오틴(endogenous nucleases)의 레벨을 감소시키고; 내생적인 전하 효과(endogenous charge effects)를 제거하고; 내생적 뉴클레아제(endogenous nucleases)를 불활성화시키고/거나 퍼록시다아제(peroxidase) 및 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 내생적 효소를 불활성화시킬 필요성을 포함할 수 있다. 내생적 뉴클레아제는 프로테이나아제 K를 이용한 분해에 의하여, 열 처리에 의하여, EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트제를 사용하는 것에 의하여, 운반체 DNA 또는 RNA의 도입에 의하여, 우레아(urea), 티오우레아(thiourea), 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 리튬 퍼클로레이트(lithium perchlorate) 등 또는 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)와 같은 카오트로프(chaotrope)로 처리함으로써 불활성화될 수 있다. 알칼라인 포스파타아제는 상온에서 5분간 0.1N HCl로 처리하거나 1mM 레바미솔(levamisole)로 처리함으로써 불활성화될 수 있다. 퍼록시다아제 활성은 0.03% 하이드로겐 퍼록사이드(hydrogen peroxide)로 처리함으로써 제거될 수 있다. 내생적 비오틴은 슬라이드 또는 절편을 상온에서 적어도 15분간 아비딘(avidin) 용액(스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin)을 대신 사용할 수 있음)에 담금으로써 차단될 수 있다. 그 후, 상기 슬라이드 또는 절편을 버퍼로 적어도 10분간 세척한다. 이것은 적어도 3번 반복될 수 있다. 그 후, 상기 슬라이드 또는 절편을 10분간 비오틴 용액에 담근다. 이것은 매번 새로운 비오틴 용액을 사용하여 적어도 3번 반복될 수 있다. 버퍼 세척 방법을 반복한다. 차단 프로토콜은 세포 또는 조직 구조 또는 관심 표적(들) 중 어느 하나라도 손상되는 것을 예방하기 위하여 최소화되어야 하지만, 하나 또는 그 이상의 이 프로토콜은 하나 또는 그 이상의 느린 오프-레이트 압타머와 함께 반응하기 이전에 "차단(block)" 슬라이드 또는 절편과 조합될 수 있다(Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, authored by Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998을 참조).

질량 분석 방법을 사용하는 바이오마커 값의 측정

다양한 구성의 질량 분석기가 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있다. 여러 유형의 질량 분석기가 사용가능하거나, 다양한 구성을 가지도록 생산될 수 있다. 일반적으로, 질량 분석기는 하기의 주요 성분: 샘플 입구(inlet), 이온 공급원(ion source), 질량 분석기(mass analyzer), 검출기(detector), 진공 시스템(vacuum system) 및 기구-제어 시스템(instrument-control system) 및 데이터 시스템(data system)을 가진다. 샘플 입구, 이온 공급원 및 질량 분석기에서의 차이는 일반적으로 기구의 형태 및 그것의 특성을 정의한다. 예를 들면, 상기 입구는 모세관 컬럼 리퀴드 크로마토그래피 공급원(capillary-column liquid chromatography source)이거나 매트릭스 보조 레이저 탈착(matrix-assisted laser desorption)에 사용되는 것과 같은 다이렉트 프로브(direct probe) 또는 스테이지(stage)일 수 있다. 통상적인 이온 공급원은 예를 들어, 나노분무(nanospray) 및 미세분무(microspray)를 포함하는 전기분무(electrospray) 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착이다. 통상적인 질량 분석기는 사중극 질량 필터(quadrupole mass filter); 이온 트랩 질량 분석기(ion trap mass analyzer) 및 비행 시간 질량 분석기(time-of-flight mass analyzer)를 포함한다. 부가적인 질량 분석 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R(1998); Kinter and Sherman, New York (2000)을 참조).

단백질 바이오마커 및 바이오마커 값은 임의의 하기: 전자분무 이온화 질량 분석법(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS), 표면 강화 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS), 실리콘상에서의 탈착/이온화(desorption/ionization on silicon, DIOS), 2차 이온 질량분석(secondary ion mass spectroscopy, SIMS), 사중극 비행 시간(quadrupole time-of-flight; Q-TOF), 울트라플렉스(ultraflex) III TOF/TOF라 불리는 탠덤 비행 시간(tandem time-of-flight)(TOF/TOF) 기술, 대기압 화학 이온화 질량 분석법(atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry; APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)^N, 대기압 광이온화 질량 분석법(atmospheric pressure photoionization mass spectrometry; APPI-MS), APPI-MS/MS 및 APPI-(MS)^N, 사중극 질량 분석법(quadrupole mass spectrometry), 푸리에 변환 질량 분석법(Fourier transform mass spectrometry; FTMS), 정량적 질량 분석법(quantitiative mass spectrometry) 및 이온 트랩 질량 분석법(ion trap mass spectrometry)에 의하여 검출되고 측정될 수 있다.

샘플 제조 전략은 단백질 바이오마커의 질량 분석적 특성화 및 바이오마커 값의 검출 이전에 샘플을 표지하고 양을 늘리는데 사용된다. 표지 방법은 상대적이고 절대적인 정량을 위한 등압 태그(isobaric tag)(isobaric tag for relative and absolute quantitation; iTRAQ) 및 세포 배양에서의 아미노산을 사용한 안정한 동위 원소 표지(stable isotope labeling with amino acid in cell culture; SILAC)를 포함하지만 이로 제한되지는 않는다. 질량 분석적 분석 이전에 후보 바이오마커 단백질에 대하여 선택적으로 부유한(enrich) 샘플에 사용되는 포획 시약은 소마머, 항체, 핵산 프로브, 키메라, 소분자, F(ab')₂ 단편, 단일 사슬 항체 단편(single chain anbibody fragment), Fv 단편(Fv fragment), 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment), 핵산(nucleic acid), 렉틴(lectin), 리간드 결합 수용체(ligand-binding receptor), 애피바디(affybodies), 나노바디(nanobodies), 안키린(ankyrins), 도메인 항체(domain antibodies), 대안적 항체 스캐폴드(alternative antibody scaffolds)(예를 들어, 디아바디(diabodies) 등), 각인된 고분자(imprinted polymer), 아비머(avimers), 펩티드 모조물(peptidomimetics), 펩토이드(peptoids), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 트레오스 핵산(threose nucleic acid), 호르몬 수용체(hormone receptor), 시토카인 수용체(cytokine receptor), 및 합성 수용체(synthetic receptors) 및 이것들의 변경 및 단편을 포함하나 이로 한정되는 것은 아니다.

근접 결합 검정법을 사용한 바이오마커 값의 검출

근접 결합 검정법(proximity ligation assay)은 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있다. 간단하게는, 시료는 올리고뉴클레오티드로 연장된 한 쌍의 각 구성원을 가지는 한 쌍의 항체 또는 한 쌍의 압타머일 수 있는 한 쌍의 친화 프로브(affinity probe)와 접촉된다. 한 쌍의 친화 프로브에 대한 표적은 하나의 단백질 상의 두 개의 구별되는 결정인자(determinate)일 수 있거나, 동질다합성(homomultimeric) 또는 이종다합성(heteromultimeric) 복합체로서 존재할 수 있는 각 두 개의 서로 다른 단백질 상의 하나의 결정인자일 수 있다. 프로브가 표적 결정인자에 결합할 때, 올리고뉴클레오티드 연장물(oligonucleotide extension)의 유리 말단(free end)은 서로 혼성화되기에 충분할 만큼 인접(close proximity)하게 이동한다. 올리고뉴클레오티드 연장물의 혼성화는 그것들이 충분히 근접하게 위치되었을 때 올리고뉴클레오티드 연장물이 서로 가교를 형성하게 해주는 공통의 연결 올리고뉴클레오티드(common connector oligonucleotide)에 의해 용이해진다. 일단 프로브의 올리고뉴클레오티드 연장물이 혼성화되면, 연장물의 말단은 효소적 DNA 라이게이션에 의해 서로 결합된다.

각각의 올리고뉴클레오티드 연장물은 PCR 증폭을 위한 프라이머 부위를 포함한다. 일단 상기 올리고뉴클레오티드 연장물이 서로 결합되면, 상기 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭을 통하여 표적 단백질의 정체(identity) 및 양(amount)에 관한 정보뿐만 아니라 표적 결정인자가 두 개의 서로 다른 단백질 상에 있을 경우 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 나타내는 연속적인 DNA 서열을 형성한다. 근접 결합(proximity ligation)은 실시간 단백질 농도 및 실시간 PCR의 사용을 통한 상호작용 정보를 위한 높은 민감하고 특이적인 검정법을 제공할 수 있다. 관심 결정요소와 결합하지 않는 프로브는 대응하는 올리고뉴클레오티드 연장물에 근접하게 이동하지 않고, 어떠한 결합 또는 PCR 증폭도 진행될 수 없으며, 그 결과 어떠한 시그널도 생성되지 않는다.

상기 방법이 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제공된 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 바이오마커에 각각 대응하는 적어도 N의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는 경우, 앞서 언급한 검정법은 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법에 유용한 바이오마커 값을 검출할 수 있게 하며, 여기에서 하기에 상세히 설명되는 것과 같은 바이오마커 값을 사용하는 분류는 상기 개인이 비소세포 폐암인지의 여부를 나타낸다. 기재된 비소세포 폐암 바이오마커 중 어떠한 것은 비소세포 폐암을 검출하고 진단하는데 단독으로 유용하긴 하지만, 세 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 비소세포 폐암 바이오마커의 다중 서브셋의 분류를 위한 방법을 본원에 설명하였다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현들은 N의 바이오마커를 포함하는 조합들을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 세 개의 바이오마커이다. 다른 구현에서, N은 2-59의 바이오마커로부터 임의의 수로 선택된다. N은 임의의 상기 기재된 범위로부터 임의의 수로 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 유사한 범위를 포함하나 더 고차의 범위를 포함하도록 선택될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본원에 기재된 임의의 방법에 따라서, 바이오마커 값은 개별적으로 검출되고 분류될 수 있거나 예를 들어, 다중 검정 포맷에서와 같이 집합적으로 검출되고 분류될 수 있다.

다른 양상에서, 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택되는 바이오마커에 각각 대응하는 적어도 N의 바이오마커 값을 검출하는 것을 포함하는, 비소세포 폐암의 부재를 검출하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 하기에 상세히 설명되는 것과 같은 바이오마커 값을 사용하는 분류는 상기 개인에서의 비소세포 폐암의 부재를 나타낸다. 기재된 비소세포 폐암 바이오마커 중 어떠한 것은 비소세포 폐암의 부재를 검출하고 진단하는데 단독으로 유용하긴 하지만, 세 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 비소세포 폐암 바이오마커의 다중 서브셋의 분류를 위한 방법을 본원에 설명하였다. 따라서, 본 발명의 다양한 구현들은 N의 바이오마커를 포함하는 조합들을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 세 개의 바이오마커이다. 다른 구현에서, N은 2-59의 바이오마커로부터 임의의 수로 선택될 수 있다. N은 임의의 상기 기재된 범위로부터 임의의 수로 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 유사한 범위를 포함하나 더 고차의 범위를 포함하도록 선택될 수 있음을 알 수 있을 것이다. 본원에 기재된 임의의 방법에 따라서, 바이오마커 값은 개별적으로 검출되고 분류될 수 있거나 예를 들어, 다중 검정 포맷에서와 같이 집합적으로 검출되고 분류될 수 있다.

바이오마커의 분류 및 질병 스코어의 계산

주어진 진단 테스트에 대한 바이오마커의 "사인(signatre)"은 일련의 마커를 포함하며, 각각의 마커는 관심 집단에서 서로 다른 레벨을 가진다. 이 문맥에서, 서로 다른 레벨은 두 개 또는 그 이상의 군에서의 개인에 대한 마커 레벨의 상이한 평균, 또는 두 개 또는 그 이상의 군에서의 상이한 변화, 또는 두 가지 모두의 조합을 칭할 수 있다. 진단 테스트의 가장 단순한 형태를 위하여, 이 마커들은 두 개의 군 중 하나, 질병에 걸리거나 질병에 걸리지 않은 것 중 하나로 개인으로부터의 미지의 샘플을 선정하는데 사용될 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 군 중 하나로의 샘플의 지정은 분류로서 알려져 있고, 이 지정을 달성하는데 사용되는 방법은 분류기(classifier) 또는 분류 방법(classification method)으로 알려져 있다. 분류화 방법은 또한 스코어링 방법(scoring method)으로서 칭해질 수 있다. 일련의 마커 값으로부터 진단 분류기(diagnostic classifier)를 구성하는데 사용될 수 있는 많은 분류 방법이 있다. 일반적으로, 분류 방법은 데이터 세트가 두 개의(또는 그 이상, 다중 분류 상태에 대하여) 다른 군 내에서 하나를 구별하기 위하여 개인으로부터 얻어진 샘플을 사용하여 수집되는 경우, 지도학습 기술(supervised learning techniques)을 이용하여 가장 쉽게 수행된다. 각 샘플이 속하는 분류(군 또는 집단)는 각 샘플에 대하여 미리 알려져 있으므로, 분류 방법은 바람직한 분류 반응을 주도록 트레이닝될 수 있다. 그것은 또한 진단 분류기를 생산하기 위한 비지도 학습 기술(unsupervised learning techniques)을 사용할 수 있다.

진단 분류기를 개발하기 위한 통상적인 접근법은 의사결정 트리(decision tree); 배깅(bagging) + 부스팅f(boosting) + 포레스트(forests); 학습에 기초한 추론의 규칙; 파즌 윈도우(Parzen Window); 선형 모델(linear models); 기호 논리학(logistic); 신경 회로망(neural network) 방법; 비지도 클러스터링(unsupervised clustering); K-평균(K-means); 계층적 상승/하강(hierarchical ascending/descending); 반지도 학습(semi-supervised learning); 프로토타입 방법(prototype methods); 최대 근접(nearest neighbor); 핵밀도 추정(kernel density estimation); 지지 벡터 기계(support vector machines); 은닉 마코프 모델(hiddefn Markov models); 볼쯔만 학습(Boltzmann Learning)을 포함하며, 분류기는 서로 단순하게 또는 개개의 목적 함수(objective function)를 최소화하는 방법으로 조합될 수 있다(리뷰를 위하여, 예를 들어 각각 그 자체가 참조로서 통합되어 있는, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley ＆ Sons, 2nd edition, 2001를 참조; 또한, TheElements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science + Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조).

지도 학습 기술을 사용하여 분류기를 생성하기 위하여, 트레이닝 데이터(training data)라 불리는 일련의 샘플을 획득하였다. 진단 테스트의 맥락에서, 트레이닝 데이터는 나중에 선정될 미지의 샘플에 대한 다른 군(분류)으로부터의 샘플을 포함한다. 예를 들면, 대조 집단에서의 개인 및 특정 질병 집단에서의 개인으로부터 수집된 샘플은 질병을 가지거나 질병을 가지지 않는 것 중 하나로서 미지의 샘플(또는, 더욱 상세하게는, 샘플이 얻어진 개인)을 분류할 수 있는 분류기를 개발하기 위한 트레이닝 데이터를 구성할 수 있다. 트레이닝 데이터로부터 분류기를 개발하는 것은 분류기를 트레이닝하는 것으로 알려져 있다. 분류기 트레이닝에 대한 특이적 세부사항은 지도 학습 기술의 특성에 의존한다. 설명을 목적으로, 트레이닝 나이브 베이지안 분류기(nave Bayesian classifier)의 예가 하기에 설명될 것이다(예를 들어, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley ＆ Sons, 2nd edition, 2001를 참조; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science + Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조).

전형적으로 트레이닝 세트에 있는 샘플보다 더욱 많은 잠재적 바이오마커 값이 있기 때문에, 오버-피팅(over-fitting)을 피하는데 주의하여야 한다. 오버-피팅은 통계학적 모델이 기초(underlying) 통계학적 모델(statistical model) 대신에 랜덤 에러(random error) 또는 노이즈(noise)를 표시할 때 발생한다. 오버-피팅은 예를 들어, 분류기를 개발하는데 사용된 마커의 수를 제한하는 것, 마커 반응이 다른 하나와는 관계없다고 가정하는 것, 사용된 기초 통계학적 모델의 복잡성(complexity)을 제한하는 것, 그리고 기초 통계학적 모델이 데이터에 따른 것임을 확실하게 하는 것을 포함하는 다양한 방법으로 피할 수 있다.

일련의 바이오마커를 사용하는 진단 테스트 개발의 실례가 되는 예는 나이브 베이즈 분류기, 바이오마커의 엄격한 단독 처리와 함께 베이즈 원리(theorem)에 기초한 단순 확률 분류기(simple probabilistic classifier)의 적용을 포함한다. 각각의 바이오마커는 각 분류에서 측정된 RFU 값 또는 로그 RFU 값(상대적 형광 단위; relative fluorescence units)에 대한 클래스-의존성 확률 밀도 함수(probability density function; pdf)에 의해 표시된다. 하나의 분류에서 일련의 마커에 대한 조인트 pdf(joint pdfs)는 각 바이오마커에 대한 개개의 분류-의존성 pdf의 산물로 추정된다. 이와 관련하여 나이브 베이즈 분류기를 트레이닝하는 것은 분류 의존성 pdf를 특성화하기 위한 파라미터를 선정하는 것("파라미터화(parameterization)")에 해당한다. 분류 의존성 pdf에 대한 임의의 기초 모델이 사용될 수 있으나, 상기 모델은 일반적으로 트레이닝 세트에서 발견된 데이터로 확인되어야만 한다.

특히, 질병 분류에서 바이오마커

에 대한 값

측정의 분류-의존성 확률은

로 쓰여지며,

값을 가지는

마커를 찾을 종합적인 나이브 베이즈 확률은

로 쓰여지며, 여기에서 각각의

들은 RFU 또는 로그 RFU에서 측정된 바이오마커 레벨이다. 미지의 것에 대한 분류 지정은 동일한 측정값에 대하여 질병을 가지지 않을 가능성(대조군)

와 비교하여 측정된

를 가지는 질병에 걸릴 가능성

을 계산함으로써 용이해진다. 이 가능성의 비율은 베이즈 원리의 적용, 즉

에 의해 분류 의존성 pdf로부터 계산될 수 있고, 여기에서

는 테스트에 적절한 집단에서의 질병의 유병율(prevalence)이다. 이 비율의 양쪽 대수(logarithm)를 취하고, 상기로부터의 나이브 베이즈 분류-의존성 확률을 대신 사용하여

를 얻는다. 이 형태는 로그 우도 비율(log likelihood ratio)로 알려져 있고, 간단하게는 질병을 가지는 것에 대한 특정 질병을 가지지 않을 로그 우도(log likelihood)를 말하며, 우선

개의 개개의 바이오마커 개개의 로그 우도 비율(log likelihood ratio)의 합으로 이루어진다. 그것의 가장 단순한 형태에서, 미지의 샘플(또는 더욱 상세하게는, 샘플이 얻어진 개인)은 상기 비율이 0보다 큰 경우에는 질병을 가지지 않는 것으로 분류되며, 상기 비율이 0보다 작은 경우에는 질병을 가지는 것으로 분류된다.

일 예시적 구현에서, 분류-의존성 바이오마커 pdfs

및

는 측정된 RFU 값

에서 정규(normal) 또는 로그-정규(log-normal) 분포로 가정되며, 즉

및

를 사용한

에 대하여 유사한 식을 가지는

이다. 상기 모델의 파라미터화는 트레이닝 데이터로부터 각 분류-의존성 pdf에 대한 두 개의 파라미터, 평균(mean)

및 분산(variance)

의 추정이 필요하다. 이것은 예를 들어, 최대 우도 추정(maximum likelihood estimates), 최소 제곱(least-square) 및 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함하는 다수의 방법으로 달성될 수 있다.

및

에 대한 정규 분포를 상기에 정의된 로그-우도 비율로 대신하여 하기의 식:

을 얻는다. 일단 일련의

및

이 트레이닝 데이터 및 특정화된 집단에서의 질병 유병율로부터 각 클래스에서 각각의 pdf에 대하여 정의되면, 상기 베이즈 분류기는 완전히 결정되고, 측정된 값

를 사용하여 미지의 샘플을 분류하는데 사용될 수 있다.

나이브 베이즈 분류기의 성능은 분류기를 구성하고 트레이닝하는데 사용된 바이오마커의 수와 특성에 의존한다. 단일 바이오마커는 하기의 실시예 3에 정의된 것과 같은, 그것의 KS-거리(Kolmogorov-Smirnov)에 따라 작동될 것이다. 만일 분류기 성과 지표(classifier performance metric)가 수용자 반응 특성 곡선 아래 면적(AUC)으로 정의된다면, 완벽한 분류기는 1의 스코어를 가질 것이며, 랜덤 분류기는 평균적으로 0.5의 스코어를 가질 것이다. 사이즈

과

의 두 세트의 A 및 B 사이의 KS-거리의 정의는 두 개의 경험적 누적분포함수(empirical cumulative distribution function, cdf) 간의 가장 큰 차이인 값

이다.

관측

의 세트 A에 대한 경험적 누적분포함수는

로서 정의되며, 여기에서

는

인 경우 1과 동일하고, 그렇지 않으면 0과 동일한 표시함수(indicator function)이다. 정의에 의하면, 1의 KS-거리가 경험적 분포가 중복되지 않음을 나타내는 경우, 이 값은 0과 1 사이의 경계에 있다.

우수한 KS 거리(예를 들어, > 0.3)를 가지는 뒤이은 마커의 첨가는 뒤이어서 첨가된 마커가 제1의 마커에 대하여 독립적인 경우, 일반적으로 분류 성능을 향상시킨다. 분류기 스코어로서 수용자 반응 특성 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하는 것은 그리디 알고리즘(greedy algorithm)의 변화를 가지는 많은 고득점(high-scoring) 분류기를 생성하기 쉽다. (그리디 알고리즘은 전체 최적화(global optimum)를 발견할 가능성을 가지는 각 단계에서 국부적인 최적 선택을 만들어줄 메타휴리스틱(metaheuristic)을 해결하는 문제를 수행하는 임의의 알고리즘이다.)

본원에서 사용된 알고리즘 접근법은 실시예 4에 상세히 기재되어 있다. 간단하게는, 모든 단일 분석물 분류기는 잠재적인 바이오마커의 표로부터 생성되고 리스트에 첨가된다. 다음으로, 각각의 저장된 단일 분석물 분류기에 대한 제2의 분석물의 모든 가능한 첨가가 그 후 수행되며, 새로운 리스트 상에 미리 결정된 수의 가장 최상의 득점 페어(pair), 말하자면, 예를 들어 1000을 저장한다. 모든 가능한 세 개의 마커 분류기는 이 새로운 리스트 중의 가장 최상의 두 개의 마커 분류기를 사용하여 조사되고, 다시 한번 이것들 중 가장 최상의 1000을 저장한다. 이 과정은 상기 스코어가 안정 상태(plateau)에 달하거나 부가적인 마커가 첨가됨으로써 나빠지기 시작할 때까지 계속된다. 수렴(convergence) 후 남아있는 고득점 분류기들은 발명의 용도를 위한 바람직한 성능에 대하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 일 진단적 적용에서, 높은 민감도와 적당한 특이도를 가지는 분류기는 적당한 민감도와 높은 특이도를 가지는 것보다 더욱 이상적일 수 있다. 다른 진단적 적용에서, 높은 특이도와 적당한 민감도를 가지는 분류기가 더 이상적일 수 있다. 이상적 레벨의 성능은 일반적으로 특유의 진단적 적용에 각각 허용될 수 있는 위양성과 위음성의 수 사이에서 만들어져야만 하는 트레이드-오프(trade-off)에 기초하여 선택된다. 이러한 트레이드-오프는 에러, 일반적으로 위양성 또는 위음성 중 하나의 의학적 결과(medical consequence)에 의존한다.

다양한 다른 기술들이 당업계에 알려져 있으며, 나이브 베이즈 분류기를 사용하는 바이오마커의 리스트로부터 많은 잠재적 분류기들을 생성하는데 사용될 수 있다. 일 구현에서, 유전 알고리즘(genetic algorithms)이라고 일컫는 것이 상기에 정의된 것과 같은 적절한 스코어를 사용하여 서로 다른 마커를 조합하는데 사용될 수 있다. 유전 알고리즘은 특히 매우 크고 다양한 집단의 잠재적 분류기들을 조사하는데 매우 적합하다. 다른 구현에서, 소위 개미 집단 최적화(ant colony optimization)가 일련의 분류기를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 다른 진화적인 방법뿐만 아니라 모의 어닐링(simulated annealing) 및 다른 확률적 탐색법(stochastic search methods)을 포함하는 당업계에 공지된 다른 방법들도 사용될 수 있다. 메타휴리스틱 방법, 예를 들어 하모니 탐색법(harmony search) 또한 사용될 수 있다.

예시적 구현은 비소세포 폐암을 검출하기 위한 진단 테스트를 생성하는데 다양한 조합으로 표 1에 열거된 임의의 수의 비소세포 폐암 바이오마커를 사용한다(이러한 바이오마커가 어떻게 확인되었는지에 대한 상세한 설명에 대한 실시예 2 및 6을 참조). 일 구현에서, 비소세포 폐암을 진단하기 위한 방법은 표 1에 열거된 임의의 수의 비소세포 폐암 바이오마커와 함께 나이브 베이즈 분류 방법을 사용한다. 실례가 되는 실시예(실시예 3)에서, 흡연자 및 양성 폐 결절의 집단으로부터 비소세포 폐암을 검출하기 위한 가장 간단한 테스트는 단일 바이오마커, 예를 들어, 0.59의 KS-거리를 가지는 비소세포 폐암에서 차별적으로 발현되는 MMP7을 사용하여 구성될 수 있다. 표 16과 상기에 기재된 로그 우도에 대한 식에 MMP7에 대한 파라미터

,

,

및

를 사용하여, 0.803의 곡선 아래 면적을 가지는 진단 테스트가 만들어질 수 있고, 표 15를 참고하라. 이 테스트에 대한 ROC 곡선을 도 2에 나타내었다.

예를 들어, 0.53의 KS-거리를 가지는 바이오마커 CLIC1의 첨가는 분류기의 성능을 0.883의 AUC로 현저하게 향상시킨다. 두 개의 바이오마커로 구성된 분류기에 대한 스코어는 KS-거리의 단순 합계가 아니며, KS-거리는 바이오마커와 결합될 때의 부가물이 아니라, 강력한 마커로서 동일한 레벨의 성능을 달성하기 위하여 더 많은 약한 마커들을 포획한다는 것에 주목해야 한다. 제3의 마커, 예를 들어, STX1A를 첨가하는 것은 분류기의 성능을 0.901의 AUC로 상승시킨다. 예를 들어, CHRDL1, PA2G4, SERPINA1, BDNF, GHR, TGFBI 및 NME2와 같은 부가적인 바이오마커를 첨가하는 것은 표 15에 요약된 일련의 비소세포 폐암 테스트를 생성하며, 이를 도 3에 일련의 ROC 곡선으로 나타내었다. 분류기 구성에 사용된 분석물 수의 함수와 같은 분류기 스코어를 도 4에 나타내었다. 이 예시적인 10개의 마커 분류기의 AUC는 0.948이다.

표 1에 열거된 마커들은 비소세포 폐암을 진단하기 위한 분류기를 만들어내기 위하여 많은 방법으로 조합될 수 있다. 어떤 구현에서, 바이오마커의 패널은 선택된 특이적 진단 성능 기준(criterion)에 따른 서로 다른 수의 분석물로 구성된다. 예를 들면, 어떤 조합의 바이오마커는 다른 조합들보다 더욱 민감한(또는 더욱 특이적인) 테스트를 생성할 수 있다.

일단 패널이 표 1로부터의 일련의 특정 바이오마커를 포함하는 것으로 정의되면, 분류기는 일련의 트레이닝 데이터로 구성되며, 진단 테스트의 정의가 완료된다. 일 구현에서, 미지의 샘플을 분류하는데 사용된 방법을 도 1a에 약술하였다. 다른 구현에서, 미지의 샘플을 분류하는데 사용된 방법을 도 1b에 약술하였다. 분류를 위해 사용된 적절한 정량적 바이오마커 레벨을 생성하게 하기 위하여, 생물학적 샘플을 적절하게 희석한 후 하나 또는 그 이상의 검정법을 수행하였다. 측정된 바이오마커 레벨은 분류 및 클래스 지정의 신뢰를 반영하는 샘플에 대한 최적 스코어를 산출하는 분류 방법에 대한 정보(input)로서 사용된다.

표 1은 비소세포 폐암을 진단하는데 유용한 59개의 바이오마커를 확인한 것이다. 이것은 바이오마커를 발견하고자 노력하는 동안 일반적으로 발견되는 것에 비해 기대 이상으로 놀랍게도 많은 수이며, 수백의 개의 개개의 샘플에서 측정된 1000개 이상의 단백질, 어떤 경우에는 낮은 1000조분의 1몰(femtomolar) 범위의 농도를 포함하는 상기 설명된 연구의 규모에 기인할 수 있다. 아마도, 다수의 발견된 바이오마커들은 종양 생물학 및 종양의 존재에 대한 신체의 반응 모두에 관련된 다양한 생화학적 경로를 반영하며; 각각의 경로 및 과정은 많은 단백질을 포함한다. 그 결과는 어떠한 소그룹 단백질의 단일 단백질이라도 이러한 복잡한 과정에 대한 유일한 정보가 아니며, 오히려 다중 단백질이 예를 들어, 세포사멸(apoptosis) 또는 세포 외 매트릭스 회복(extracellular matrix repair)과 같은 관련 과정에 포함된다는 것을 보여준다.

상기에 설명된 연구 동안 확인된 주어진 다수의 바이오마커 중 어떤 것은 다양한 진단 방법에 사용될 수 있는 다수의 고성능 분류기를 얻을 수 있을 것으로 기대되었다. 이러한 생각을 테스트하기 위하여, 수천 개의 분류기를 표 1의 바이오마커를 사용하여 평가하였다. 실시예 4에 기재된 것과 같이, 표 1에 존재하는 많은 서브셋의 바이오마커들이 유용한 분류기를 생성하는데 조합될 수 있다. 실시예를 통하여, 명세서는 비소세포 폐암의 검출을 위하여 1, 2 및 3개의 바이오마커를 포함하는 분류기를 제공한다. 실시예 4에 기재된 것과 같이, 표 1에 있는 바이오마커를 사용하여 구성된 모든 분류기들은 "비-마커(non-marker)"를 사용하여 구성된 분류기 보다 더 명백하게 작동한다.

분류기를 구성하기 위하여 더 작은 서브셋을 만드는, 표 1에 있는 어떤 마커를 랜덤하게 배제함으로써 얻어진 분류기의 성능 또한 테스트하였다. 실시예 4에 기재된 것과 같이, 표 1에 있는 마커의 랜덤 서브셋으로 구성된 분류기는 표 1에 있는 전 리스트의 마커를 사용하여 구성된 최적의 분류기와 유사하게 작동하였다.

10개의 마커 집합으로부터 "최상의(best)" 개개의 마커를 배제함으로써 얻어진 10개의 마커 분류기의 성능 또한 테스트하였다. 실시예 4에 기재된 것과 같이, 표 1의 "최상의" 마커를 제외하고 구성된 분류기 또한 잘 작동하였다. 표 1에 열거된 바이오마커의 많은 서브셋은 심지어 표 1에 열거된 상위 15개의 마커들을 제거한 후에도 최적에 가깝게 작동하였다. 이것은 임의의 특정 분류기의 성능 특성이 어떤 중심 그룹의 바이오마커 때문일 가능성은 없으며, 질병의 과정은 많은 단백질의 발현 레벨을 변경하는 다양한 생화학적 경로에 강한 영향을 줄 가능성이 있음을 의미한다.

실시예 4로부터 얻은 결과는 어떤 가능성 있는 결론을 암시한다: 첫째로, 다수의 바이오마커의 확인은 그것의 집합체(aggregation)가 유사하게 높은 성능을 제공하는 많은 분류기가 될 수 있게 한다. 두 번째로, 분류기는 특정 바이오마커가 근본적인 질병, 질환 또는 사건 프로세스의 복잡성에 의심할 여지 없이 널리 퍼진 불필요한 중복(redundancies)을 반영하는 방식으로 다른 바이오마커를 대신할 수 있도록 구성될 수 있다. 다시 말해서, 표 1에서 확인된 임의의 개개의 바이오마커에 의해 제공된 질병, 질환 또는 사건에 대한 정보는 표 1에 있는 어떤 특정 바이오마커 또는 소그룹의 바이오마커도 임의의 분류기에 포함되어서는 안된다는 것일지도 모른다.

예시적 구현은 미지의 샘플을 분류하기 위하여 표 16의 데이터로부터 구성된 나이브 베이즈 분류기를 사용한다. 그 방법을 도 1a 및 1b에 약술하였다. 일 구현에서, 생물학적 샘플을 선택적으로 희석하고, 다중화된 압타머 검정법을 수행하였다. 상기 검정으로부터의 데이터는 실시예 3에 약술한 것과 같이 표준화되고 조정되며, 그 결과 얻어진 바이오마커 레벨은 베이즈 분류 도식(scheme)에 정보(input)로서 사용된다. 로그-우도 비율은 개별적으로 각각 측정된 바이오마커에 대하여 계산된 후, 진단 스코어라고도 불리는 최종 분류 스코어(final classification score)를 생성하기 위하여 합계된다. 그 결과 얻어진 지정(assignment)뿐만 아니라 총 분류 스코어 또한 기록될 수 있다. 선택적으로, 각각의 바이오마커 레벨에 대하여 계산된 개개의 로그-우도 위험 인자(log-likelihood risk factors) 또한 기록될 수 있다. 분류 스코어 계산에 대한 상세한 내용은 실시예 3에 기재하였다.

키트

표 1의 바이오마커(뿐만 아니라 추가적인 생물의학 정보)의 임의의 조합은 예를 들어, 본원에 기재된 방법을 수행하는데 사용하기 위한 것과 같은 적절한 키트를 사용하여 검출될 수 있다. 게다가, 임의의 키트는 형광성 부분(moiety) 등과 같은 본원에 기재된 것과 같은 하나 또는 그 이상의 검출가능한 표지를 포함할 수 있다.

일 구현에서, 키트는 (a) 생물학적 샘플에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커를 검출하기 위한 (예를 들어, 적어도 하나의 압타머 또는 항체와 같은) 하나 또는 그 이상의 포획 시약과, 여기에서 상기 바이오마커는 표 1에 제시되어 있는 임의의 바이오마커를 포함하며, 선택적으로 (b) 본원에 더 기재된 것과 같이, 생물학적 샘플이 얻어진 개인을 비소세포 폐암이거나 비소세포 폐암이 아닌 것 중 하나로 분류하거나, 개인이 비소세포 폐암일 가능성을 측정하기 위한 하나 또는 그 이상의 소프트웨어 또는 컴퓨터 프로그램 제품을 포함한다. 대안적으로, 하나 또는 그 이상의 컴퓨터 프로그램 제품보다는, 인간에 의해 상기 단계를 수동으로 실행하기 위한 하나 또는 그 이상의 설명서(instruction)가 제공될 수 있다.

대응하는 포획 시약 및 시그널 생성 물질과 고체 지지체의 조합은 본원에서 "검출 장치(detection device)" 또는 "키트(kit)"로 칭한다. 상기 키트는 또한 장치 및 시약을 사용하고, 샘플을 다루고, 데이터를 분석하기 위한 설명서를 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 생물학적 샘플의 분석 결과를 분석하고 기록하기 위하여 컴퓨터 시스템 또는 소프트웨어와 함께 사용될 수 있다.

상기 키트는 또한 생물학적 샘플을 처리하기 위한 하나 또는 그 이상의 시약(예를 들어, 가용화 버퍼(solubilization buffers), 세제(detergents), 세척제(washes) 또는 버퍼(buffers))을 포함할 수 있다. 본원에 기재된 임의의 상기 키트는 또한 예를 들어, 버퍼, 차단제(blocking agents), 질량 분석 매트릭스 물질(mass spectrometry matrix materials), 항체 포획 시약(antibody capture agents), 양성 대조군 샘플(positive control samples), 음성 대조군 샘플(negative control samples), 소프트웨어 및 프로토콜, 안내서 및 참고 데이터와 같은 정보를 포함할 수 있다.

일 양상에서, 본 발명은 비소세포 폐암 상태의 분석을 위한 키트를 제공한다. 상기 키트는 표 1로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 바이오마커에 대한 PCR 프라이머(primers)를 포함한다. 상기 키트는 비소세포 폐암에 대한 바이오마커의 사용 및 상관 관계(correlation)에 대한 설명서를 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 또한 표 1로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 바이오마커의 상보체(complement), 시약, 및/또는 샘플 DNA를 증폭 또는 단리하기 위한 효소를 포함하는 DNA 어레이를 포함할 수 있다. 상기 키트는 실시간 PCR(real-time PCR)을 위한 시약, 예를 들어 TaqMan 프로브(probe) 및/또는 프라이머 및 효소를 포함할 수 있다.

예를 들면, 키트는 (a) 최소한 시료에서 하나 또는 그 이상의 바이오마커를 정량하기 위한 포획 시약을 포함하는 시약과, 여기에서 상기 바이오마커는 표 1에 제시되어 있는 바이오마커 또는 본원에 기재된 다른 바이오마커 또는 바이오마커 패널을 포함하고, 선택적으로 (b) 하나 또는 그 이상의 미리 측정된 컷오프와 시료에서 정량된 각각의 바이오마커의 양을 비교하고, 상기 비교에 기초하여 정량화된 각 바이오마커에 대한 스코어를 지정하고, 총 스코어를 얻기 위하여 정량화된 각 바이오마커에 대한 지정된 스코어를 조합하고, 미리 측정된 스코어와 총 스코어를 비교하고, 개인이 비소세포 폐암인지 아닌지의 여부를 결정하기 위하여 상기 비교를 사용하기 위한, 하나 또는 그 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램을 포함할 수 있다. 대안적으로, 하나 또는 그 이상의 알고리즘 또는 컴퓨터 프로그램 이외에, 인간에 의해 상기 단계를 수동으로 실행하기 위한 하나 또는 그 이상의 설명서가 제공될 수 있다.

컴퓨터 방법 및 소프트웨어

일단 바이오마커 또는 바이오마커 패널이 선택되면, 개인을 진단하기 위한 방법은 하기의: 1) 생물학적 샘플을 수집하거나 그렇지 않다면 얻고; 2) 상기 생물학적 샘플에서 바이오마커 또는 바이오마커 패널을 검출하고 측정하기 위한 분석 방법을 수행하고; 3) 바이오마커 값을 수집하는데 사용된 방법에 필요한 임의의 데이터 표준화(normalization or standardization)를 수행하고; 4) 마커 스코어를 계산하고; 5) 총 진단 스코어를 얻기 위하여 마커 스코어를 합하고; 6) 개인의 진단 스코어를 기록하는 것을 포함할 수 있다. 이 접근법에서, 상기 진단 스코어는 질병의 존재 여부를 표시하는 미리 설정된 역치(pre-set threshold value)와 비교되는 모든 마커 계산결과의 합으로부터 측정된 단일 숫자일 수 있다. 또는, 상기 진단 스코어는 바이오마커 값을 각각 나타내는 일련의 바(bar)일 수 있고, 반응 패턴은 질병의 존재 여부의 측정을 위하여 미리 설정된 패턴(pre-set pattern)과 비교될 수 있다.

적어도 본원에 기재된 방법의 어떤 구현은 컴퓨터의 사용으로 실행될 수 있다. 컴퓨터 시스템(100)의 예는 도 6에 나타내었다. 도 6을 참고하면, 시스템(100)은 프로세서(processor)(101), 입력 장치(input device)(102), 출력 장치(output device)(103), 저장 장치(storage device)(104), 컴퓨터-판독가능한 저장매체 판독기(computer-readable storage meadia reader)(105a), 통신 시스템(communication system)(106), 처리 가속장치(processing acceleration)(예를 들어, DSP 또는 특정 목적의 프로세서)(107) 및 메모리(109)를 포함하는, 버스(bus)(108)를 통하여 전기적으로 연결된 하드웨어 구성요소로 구성됨을 보여준다. 컴퓨터 판독가능한 저장매체 판독기(105a)는 컴퓨터-판독가능한 저장매체(105b), 일시적으로 원격(remote), 국소(local), 고정(fixed) 및/또는 이동가능한(removable) 저장 장치 플러스 저장매체, 메모리 등을 광범위하게 나타내는 조합과 더 연결될 수 있고/있거나 저장 장치(104), 메모리(109) 및/또는 임의의 다른 그와 같이 접근가능한 시스템(100) 리소스(resource)를 포함할 수 있는 컴퓨터 판독가능한 정보를 더 영구적으로 포함한다. 시스템(100)은 또한 작동 시스템(operating system)(192) 및 프로그램, 데이터 등과 같은 다른 코드(code)(193)를 포함하는 소프트웨어 구성요소(일반적으로 작동 메모리(working memory)(191) 내에 위치하는 것으로 보임)를 포함한다.

도 6에 관하여, 시스템(100)은 광범위한 유연성(flexibility) 및 적용성(configurability)을 가진다. 따라서, 예를 들어, 단일 구성(architecture)은 일반적으로 바람직한 프로토콜, 프로토콜의 변형, 확장(extension) 등에 따라 추가로 구성될 수 있는 하나 또는 그 이상의 서버(servers)를 실행하는데 사용될 수 있다. 그러나, 구현은 더욱 특이적인 적용 요구에 따라 적절히 사용될 수 있다는 것을 당업자들은 확인할 수 있을 것이다. 예를 들면, 하나 또는 그 이상의 시스템 구성요소는 시스템(100) 성분 내에서((예를 들어, 통신 시스템(106) 내에) 서브-구성요소로서 수행될 수 있다. 맞춤형 하드웨어(customized hardware) 또한 사용될 수 있고/있거나, 특정 구성요소가 하드웨어, 소프트웨어 또는 둘 다에서 실행될 수 있다. 게다가, 네트워크 입력/출력 장치(비도시)와 같은 다른 컴퓨팅 장치에 연결되어 있다 할지라도 사용될 수 있으며, 유선(wired), 무선(wireless), 모뎀(modem) 및/또는 다른 연결 또는 다른 컴퓨팅 장치(computing device) 또한 사용될 수 있음을 알 수 있다.

일 양상에서, 상기 시스템은 비소세포 폐암 특유의 바이오마커의 특징을 포함하는 데이터베이스를 포함할 수 있다. 바이오마커 데이터(또는 바이오마커 정보)는 컴퓨터로 실행된 방법의 일부분으로서 사용하기 위하여 컴퓨터에 정보(input)로서 사용될 수 있다. 상기 바이오마커 데이터는 본원에 기재된 것과 같은 데이터를 포함할 수 있다.

일 양상에서, 상기 시스템은 하나 또는 그 이상의 프로세서에 정보 데이터(input data)를 제공하기 위한 하나 또는 그 이상의 장치를 더 포함한다.

상기 시스템은 있는 그대로의 데이터(naked data) 구성요소의 데이터 세트를 저장하기 위한 메모리를 더 포함한다.

다른 양상에서, 상기 정보 데이터를 제공하기 위한 장치는 예를 들어, 질량 분석기(mass spectrometer) 또는 유전자 칩 판독기(gene chip reader)와 같은 데이터 구성요소의 특성을 검출하기 위한 검출기를 포함한다.

상기 시스템은 부가적으로 데이터베이스 관리 시스템을 포함할 수 있다. 사용자 요구(requests) 또는 질의(queries)는 데이터베이스의 트레이닝 세트로부터 관련 정보를 추출하기 위하여 질의를 처리하는 데이터베이스 관리 시스템에 의해 해석되는 적절한 언어로 구성될 수 있다.

상기 시스템은 네트워크 서버와 하나 또는 그 이상의 클라이언트가 연결된 네트워크에 연결가능할 수 있다. 상기 네트워크는 당업계에 공지되어 있는 것과 같은 근거리 통신망(local area network; LAN) 또는 광역 통신망(wide area network; WAN)일 수 있다. 바람직하게는, 상기 서버는 사용자 요구를 처리하기 위한 데이터베이스 데이터에 접근하기 위한 컴퓨터 프로그램 제품(예를 들어, 소프트웨어)을 구동하는데 필요한 하드웨어를 포함한다.

상기 시스템은 데이터 관리 시스템으로부터의 지시를 수행하기 위한 작동 시스템(operating system)(예를 들어, UNIX 또는 Linux)를 포함할 수 있다. 하나의 양상에서, 상기 작동 시스템은 인터넷과 같은 글로벌 커뮤니케이션 네트워크(global communication network) 상에서 작동할 수 있고, 그러한 네트워크에 연결하기 위하여 글로벌 커뮤니케이션 네트워크 서버를 이용한다.

상기 시스템은 당업계에 공지된 그래픽 사용자 인터페이스(graphical user interface)에서 일상적으로 발견되는 것과 같은 버튼(buttons), 풀 다운 메뉴(pull down menus), 스크롤 바(scroll bars), 텍스트를 입력하기 위한 공간(fields for entering text) 등과 같은 인터페이스 구성요소를 포함하는 그래픽 디스플레이 인터페이스를 포함하는 하나 또는 그 이상의 장치를 포함할 수 있다. 사용자 인터페이스상에 입력된 요구는 하나 또는 그 이상의 시스템 데이터베이스에 관련 정보를 검색하기 위하여 포맷(formatting)을 위한 시스템에서 적용 프로그램으로 전달될 수 있다. 사용자에 의해 입력된 요구 또는 질의는 임의의 적절한 데이터베이스 언어로 구성될 수 있다.

상기 그래픽 사용자 인터페이스는 작동 시스템의 일부분으로서 그래픽 사용자 인터페이스 코드에 의해 생성될 수 있고, 입력 데이터로 사용될 수 있고/있거나 입력된 데이터를 표시할 수 있다. 처리된 데이터의 결과는 인터페이스에 표시되고, 시스템과 연결된 프린터 상에 인쇄되고, 메모리 장치에 저장되고/되거나 네트워크로 전달될 수 있거나, 컴퓨터 판독가능한 매체의 형태로 제공될 수 있다.

상기 시스템은 상기 시스템에 데이터 구성요소에 관한 데이터(예를 들어, 발현 값)를 제공하기 위한 입력 장치와 연결될 수 있다. 하나의 양상에서, 상기 입력 장치는 예를 들어, 질량 분석기, 유전자 칩 또는 어레이 판독기 등을 포함하는 유전자 발현 프로파일링 시스템을 포함할 수 있다.

다양한 구현에 따른 비소세포 폐암 바이오마커 정보를 분석하기 위한 방법 및 기구는 예를 들어, 컴퓨터 시스템상에서 작동하는 컴퓨터 프로그램을 사용하여 임의의 적절한 방법으로 실행될 수 있다. 프로세서 및 원격으로 접근가능한 애플리케이션 서버(remotely-accessible application server), 네트워크 서버(network server), 개인 컴퓨터(personal computer) 또는 워크스테이션(workstation)과 같은 랜덤 접근 메모리(random access memory)를 포함하는 기존의 컴퓨터 시스템이 사용될 수 있다. 부가적인 컴퓨터 시스템 구성은 대용량 기억장치(mass storage) 및 사용자 인터페이스, 예를 들어 기존의 모니터, 키보드 및 추적 장치(tracking device)와 같은 메모리 장치 또는 정보 저장 시스템을 포함할 수 있다. 상기 컴퓨터 시스템은 자립형(stand-alone) 시스템 또는 서버 및 하나 또는 그 이상의 데이터베이스를 포함하는 컴퓨터 네트워크의 일부분일 수 있다.

비소세포 폐암 바이오마커 분석 시스템은 데이터 집합, 처리, 분석, 기록 및/또는 진단과 같은 데이터 분석을 완료하기 위한 기능 및 연산(operation)을 제공할 수 있다. 예를 들면, 일 구현에서, 상기 컴퓨터 시스템은 비소세포 폐암 바이오마커에 관련되는 정보를 수용하고, 저장하고, 검색하고, 분석하고 기록할 수 있는 컴퓨터 프로그램을 실행할 수 있다. 상기 컴퓨터 프로그램은 원 데이터(raw data)를 처리하고 추가 자료를 모으기 위한 프로세싱 모듈(processing module) 및 비소세포 폐암 상태 및/또는 진단을 생성하기 위하여 원 데이터 및 추가 데이터를 분석하기 위한 분석 모듈(analysis module)과 같은 다양한 기능 또는 연산을 수행하는 다중 모듈(multiple modules)을 포함할 수 있다. 비소세포 폐암 상태를 진단하는 것은 질병에 관련된 개인의 상태에 관한 추가적인 생물의학 정보를 포함하는 임의의 다른 정보를 모으거나 수집하고, 추가 테스트가 바람직한지의 여부를 확인하거나, 또는 그렇지 않으면 개인의 건강 상태를 고려하는 것을 포함할 수 있다.

도 7을 참고하면, 기재된 구현의 원리에 따라 컴퓨터를 사용하는 방법의 예를 볼 수 있다. 도 7에서, 흐름도(3000)을 도시하였다. 블록(3004)에서, 바이오마커 정보는 개인에 대하여 검색될 수 있다. 상기 바이오마커 정보는 예를 들어, 개인의 생물학적 샘플의 테스트가 완료된 후 컴퓨터 데이터베이스로부터 검색될 수 있다. 상기 바이오마커 정보는 표 1에 제공된 바이오마커로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함할 수 있으며, 여기에서 N = 2-59이다. 블록(3008)에서, 컴퓨터는 각각의 바이오마커 값을 분류하는데 사용될 수 있다. 그리고, 블록(3012)에서, 측정은 대다수의 분류에 기초하여 개인이 비소세포 폐암일 가능성으로 이루어질 수 있다. 표시는 사람에게 보여 질 수 있는 그런 디스플레이 또는 다른 지시 장치(indicating device)에 출력될 수 있다.

도 8을 참고하면, 다른 구현에 따라 컴퓨터를 사용하는 대안적인 방법은 흐름도(3200)를 통하여 설명될 수 있다. 블록(3204)에서, 컴퓨터는 개인에 대한 바이오마커 정보를 검색하기 위하여 사용될 수 있다. 상기 바이오마커 정보는 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함한다. 블록(3208)에서, 바이오마커 값의 분류는 컴퓨터를 사용하여 수행될 수 있다. 그리고, 블록(3212)에서, 표시는 분류에 기초하여 개인이 비소세포 폐암일 가능성으로 이루어질 수 있다. 상기 표시는 사람에게 보여 질 수 있는 그런 디스플레이 또는 다른 지시 장치에 출력될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 그것은 컴퓨터의 스크린 또는 다른 출력 장치상에 나타내질 수 있다.

본원에 기재된 어떤 구현은 컴퓨터 프로그램 제품을 포함하기 위한 수단을 제공할 수 있다. 컴퓨터 프로그램 제품은 적용 프로그램으로 하여금 데이터베이스와 함께 컴퓨터를 실행시키기 위하여 매체에 통합된 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 가지는 컴퓨터 판독가능 매체를 포함할 수 있다.

본원에 사용된 것으로서, "컴퓨터 프로그램 제품(computer program product)"은 임의의 특성의 물리적 매체(예를 들어, 서류(written), 전자(electronic), 자기(magnetic), 광학(optical) 또는 그 외) 상에 포함되며, 컴퓨터 또는 다른 자동화된 데이터 프로세싱 시스템과 함께 사용될 수 있는, 본래의 또는 프로그래밍 언어 명령문(statements)의 형태로 조직화된 일련의 명령어(instruction)를 말한다. 이러한 프로그래밍 언어 명령문은 컴퓨터 또는 데이터 프로세싱 시스템에 의해 실행될 때, 컴퓨터 또는 데이터 프로세싱 시스템이 명령문의 특정 내용에 따라 작동하도록 한다. 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨터 판독가능한 매체에 통합되어 있는 원시 코드(source code)와 목적 코드(object code) 및/또는 테스트 또는 데이터 라이브러리에 프로그램을 제한 없이 포함한다. 게다가, 컴퓨터 시스템 또는 데이터 프로세싱 설비 장치를 미리 선별된 방법으로 작동하도록 할 수 있는 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 본래의 원시 코드(original source code), 어셈블리 코드(assembly code), 목적 코드(object code), 기계어(machine language), 앞서 말한 것 및 임의의 및 모든 동등물의 암호화되거나 압축된 형태를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 다수의 형태로 제공될 수 있다.

일 양상에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 비소세포 폐암일 가능성을 나타내기 위하여 제공된다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하고, 상기 프로그램 코드는: 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드와, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서 적어도 N의 바이오마커 중 하나에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하고, 여기에서 N = 2-59이고; 바이오마커 값의 함수로서 상기 개인의 비소세포 폐암의 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

여전히 다른 양상에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 비소세포 폐암일 가능성을 나타내기 위하여 제공된다. 상기 컴퓨터 프로그램 제품은 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드를 포함하는 컴퓨터 판독가능한 매체를 포함하고, 상기 프로그램 코드는: 개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드와, 여기에서 상기 데이터는 표 1에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택된 생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 포함하며; 바이오마커 값의 함수로서 개인의 비소세포 폐암의 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드를 포함한다.

다양한 구현이 방법 또는 기구로서 기재되는 동안, 구현은 컴퓨터와 연결된 코드, 예를 들어 컴퓨터상의 코드 레지던트(code resident) 컴퓨터에 의해 접근가능한 코드를 통하여 실행될 수 있다. 예를 들면, 소프트웨어 및 데이터베이스는 상기에 논의된 많은 방법을 실행하는데 사용될 수 있다. 따라서, 하드웨어에 의해 달성되는 구현 이외에도, 이 구현은 이 명세서에 기재된 기능을 가능하게 하는 것으로 구현된 컴퓨터 판독가능한 프로그램 코드를 가지는 매체를 사용가능한 컴퓨터로 이루어지는 하나의 제품의 사용을 통하여 달성될 수 있다는 것에도 유의해야 한다. 따라서, 구현은 또한 그것들의 프로그램 코드 매체(means)로 이 특허에 의해 보호되는 것으로 간주하는 것이 바람직하다. 게다가, 상기 구현은 제한 없이 RAM, ROM, 자기 매체(magnetic media), 광학 매체(optical media) 또는 광자기 매체(magneto-optical media)를 포함하는 실질적으로 어떤 종류의 컴퓨터-판독가능한 메모리에 저장된 코드로서 구현될 수 있다. 심지어 더욱 일반적으로는, 상기 구현은 범용 프로세서(general purpose processor) 상에서 구동하는 소프트웨어, 마이크로코드(microcode), PLAs 또는 ASICs를 포함하지만 이로 제한되지는 않는 소프트웨어 또는 하드웨어 또는 그것들의 임의의 조합에서 실행될 수 있다.

구현은 반송파(carrier wave)로 구현된 컴퓨터 시그널뿐만 아니라 전송매체(transmission medium)를 통하여 전달된(예를 들어, 전기적 또는 광학적) 시그널로서 달성될 수 있다는 것 또한 예상된다. 따라서, 상기에 논의된 다양한 형태의 정보는 데이터 구조와 같은 구조로 구성될 수 있으며, 전송 매체를 통하거나 컴퓨터 판독가능한 매체 상에 저장된 전기적 시그널로서 전송된다.

또한, 본원에 열거된 많은 구조, 물질 및 작용들은 기능을 수행하기 위한 수단 또는 기능을 수행하기 위한 단계로서 재인용될 수 있다는 것도 주목해야 한다. 따라서, 이와 같은 언어는 이 명세서 내에 기재된 그러한 구조, 물질 또는 작용 및 참조로서 통합되어 있는 물질을 포함하는 그것들의 동등물을 모두 포함할 권리가 있는 것으로 인지되어야 한다.

본원에 기재된 바이오마커 확인 공정, 바이오마커의 이용 및 바이오마커 값을 측정하기 위한 다양한 방법들이 비소세포 폐암에 대하여 상기에 상세히 기재되었다. 그러나, 공정의 적용, 확인된 바이오마커의 사용 및 바이오마커 값을 측정하기 위한 방법은 다른 특정 형태의 암에, 일반적으로 암에, 임의의 다른 질병 또는 의학적 상태에, 또는 부수적인 의학적 치료에 의해 혜택을 받거나 받지 않을 수 있는 개인의 확인에 충분히 적용가능하다. 비소세포 폐암에 관련된 특정 결과에 대하여 언급할 때를 제외하고는, 문맥상으로도 명확한 바와 같이, 본원에서 비소세포 폐암에 대한 언급은 다른 형태의 암, 일반적으로 암 또는 임의의 다른 질병 또는 의학적 상태를 포함하는 것으로 이해될 수 있다.

실시예

하기의 예들은 설명을 위한 목적으로 제공되며, 첨부된 청구항에 의해 정의된 것과 같은 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것이 아니다. 본원에 기재된 모든 예들은 당업계에 잘 알려져 있고 일반적인 표준 기술을 사용하여 수행되었다. 하기의 실시예에 기재된 일반적인 분자 생물학 기술들은 샘브룩 등과 같은 표준 실험실 메뉴얼에 기재된 것과 같이 수행될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,(2001)).

실시예 1: 샘플의 다중 압타머 분석

이 실시예는 표 1에 제시된 바이오마커의 확인 및 표 19에 제시된 암 바이오마커의 확인을 위한 샘플 및 대조군을 분석하는데 사용된 다중 압타머 검정법(multiplex aptamer assay)을 기술한다(도 9를 참조). 비소세포 폐암, 중피종(mesothelioma) 및 신장암(renal cell carcinoma)의 연구를 위하여, 상기 다중 분석은 각각 특정 표적에 유일한 1,034개의 압타머를 사용하였다.

이 방법에서, 각각의 용액을 첨가하기 위하여 피펫의 팁을 바꾸었다.

또한, 달리 지시하지 않는 한, 대부분의 용액을 옮겨 세척제를 첨가하고, 베크만 바이오멕 FxP(Beckman Biomek FxP)의 96웰 헤드를 사용하였다. 방법 단계는 달리 지시하지 않는 한, 12개 채널 P200 피펫만(twelve channel P200 Pipetteman)(Rainin Instruments, LLC, Oakland, CA)을 사용하여 손으로 피펫팅하였다. pH 7.5에서 40mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM KCl, 5mM MgCl₂, 1mM EDTA를 포함하는 SB17로 불리는 맞춤 버퍼(custom buffer)를 실험실에서(in-house) 제조하였다. 모든 단계는 달리 지시하지 않는 한 상온에서 수행하였다.

1. 압타머 스톡 용액의 제조

5%, 0.316% 및 0.01% 혈청에 대한 맞춤 스톡 압타머 용액을 1 x SB17, 0.05% 트윈-20에 2x 농도로 제조하였다.

이들 용액을 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다. 분석하는 날, 각 압타머 믹스(mix)를 10분간 37℃에서 녹이고, 10분간 끓는 물 수조에 놓아둔 후, 각 가열 단계 사이에서 격렬하게 혼합시키면서 20분간 25℃로 냉각시켰다. 가열-냉각 후, 55μl의 각 2x 압타머 믹스를 96-웰 혼성화 플레이트 안으로 손으로 피펫팅하여 넣고, 플레이트를 호일로 밀봉하였다. 최종 결과물을 5%, 0.316% 또는 0.01% 압타머 믹스를 이용한 3, 96-웰, 호일 밀봉된 혼성화 플레이트에서 얻었다. 개개의 압타머 농도는 2x 최종 또는 1nM였다.

2. 검정 샘플 제조

-80℃에서 보관된 100% 혈청의 동결 엘리컷을 25℃의 항온수조에 10분간 넣어두었다. 녹인 샘플을 얼음에 넣고, 8초간 부드럽게 볼텍싱(4로 설정)한 후 얼음에 다시 넣었다.

96-웰 혼성화 플레이트 안으로 50μL 8-채널의 스패닝 피펫터(8-channel spanning pipettor)를 사용하여 8μL의 샘플을 옮김으로써 10% 샘플 용액(2x 최종)을 제조하였으며, 각 웰은 4℃에서 72μL의 적절한 샘플 희석액을 포함한다(혈청에 대하여 1x SB17, 0.06% Tween-20, 11.1μM Z-block_2, 0.44mM MgCl₂, 2.2mM AEBSF, 1.1mM EGTA, 55.6μM EDTA). 이 플레이트를 다음 샘플 희석 단계가 바이오멕 FxP 로봇상에서 시작될 때까지 얼음에 보관하였다.

샘플과 압타머의 평형을 개시하기 위하여, 10% 샘플 플레이트를 가볍게 원심분리한 후, 바이오멕 FxP(Biomek FxP)에 올려두고 96-웰 피펫터를 사용하여 아래 위로 피펫팅하여 혼합하였다. 그 후, 2mM AEBSF와 함께 89μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20 내로 6μL의 10% 샘플을 이동시킴으로써 0.632% 샘플 플레이트(2x 최종)를 제조하였다. 다음으로, 184μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20 내로 6μL의 상기 제조된 0.632% 샘플을 희석하여 0.02% 샘플 플레이트(2x 최종)를 만들었다. 희석은 베크만 바이오멕 FxP 상에서 완료하였다. 각각 옮긴 후, 용액을 아래 위로 피펫팅하여 혼합하였다. 그 후, 3개의 샘플 희석 플레이트를 55μL의 적절한 2x 압타머 혼합물에 55μL의 샘플을 첨가함으로써 각자의 압타머 용액으로 옮겼다. 상기 샘플 및 압타머 용액을 아래 위 피펫팅에 의해 로봇 상에서 혼합하였다.

3. 샘플 평형 결합

상기 샘플/압타머 플레이트를 실리콘 캡으로 밀봉하고, 캐치 1(Catch 1) 단계로 나아가기 전에 3.5 시간 동안 37℃ 배양기에 놓아두었다.

4. 캐치 2(Catch 2) 비드 플레이트의 제조

마이원 스트렙타비딘 C1 비드(MyOne Streptavidin C1 beads; Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)의 11mL 엘리컷을 동일한 양의 20mM NaOH로 2번 세척하고(각 세척에 대하여 5분 배양), 동일한 양의 1xSB17, 0.05% 트윈-20으로 3번 세척하고, 11mL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20에 재현탁하였다. 12-스팬 멀티채널 피펫터(12-channel pipettor)를 사용하여, 50μL의 이 용액을 96-웰 혼성화 플레이트의 각 웰 안으로 수동으로 피펫팅하여 넣었다. 그 후, 상기 플레이트를 호일로 감싸고 검정에 사용하기 위하여 4℃에 보관하였다.

5. 캐치 1 비드 플레이트의 제조

세 개의 0.45μm 밀리포어 HV 플레이트(Millipore HV plates; Durapore membrane, Cat# MAHVN4550)를 적어도 10분간 100μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20으로 평형화시켰다. 그 후, 평형 버퍼(equilibration buffer)를 플레이트를 통하여 여과시키고, (1xSB17, 0.05% 트윈-20에 용해시킨) 133.3μL의 7.5% 스트렙타비딘-아가로오스 비드 슬러리(slurry)를 각 웰 안으로 첨가하였다. 필터 플레이트 안으로 그것들을 옮기는 동안 현탁된 스트렙타비딘-아가로오스 비드를 유지하기 위하여, 상기 비드 용액을 피펫팅 사이에서 적어도 6번, 200μL의 12-채널 피펫터를 사용하여 수동으로 혼합하였다. 비드를 3개의 필터 플레이트에 분포시킨 후, 비드 상층액을 제거하기 위하여 진공을 사용하였다. 마지막으로, 상기 비드를 200μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20을 사용하여 필터 플레이트에서 세척한 후, 200μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20으로 재현탁하였다. 필터 플레이트의 바닥을 닦아내고, 그 플레이트를 검정에 사용하기 위하여 보관하였다.

6. 사이토멧(Cytomat)의 로딩

사이토멧을 통에서 모든 팁, 플레이트, 모든 시약과 함께 로딩하고(플레이트에 첨가되기 전에 바로 새롭게 제조되는 NHS-비오틴 시약은 제외), 3개를 캐치 1 필터 플레이트에 제조하였고, 하나를 마이원 플레이트에 제조하였다.

7. 캐치 1

3.5분의 평형화 시간 후, 샘플/압타머 플레이트를 배양기로부터 제거하여 약 1분간 원심분리하고, 캡 매트 커버를 제거하여 베크만 바이오멕 FxP의 데크(deck)에 놓아두었다. 베크만 바이오멕 FxP 프로그램를 시작하였다. 캐치 1에서 다음에 오는 모든 단계들은 달리 지시하지 않는 한, 베크만 바이오멕 FxP 로봇에 의해 수행하였다. 프로그램 내에서, 비드 상층액을 제거하기 위하여 캐치 1 필터 플레이트에 진공을 적용하였다. 각각 100μl의 5%, 0316% 및 0.01% 평형 결합 반응액을 그것들 각각의 캐치 1 여과 플레이트에 첨가하고, 각 플레이트를 10분간 800rpm에서 온-데크 오르비탈 쉐이커(on-deck orbital shaker)를 사용하여 혼합하였다.

결합되지 않은 용액을 진공 여과를 통하여 제거하였다. 캐치 1 비드를 1xSB17, 0.05% 트윈-20에 용해시킨 190μL의 100μM 비오틴으로 세척한 후, 용액을 분배시켜 190μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20 5개를 얻고, 플레이트를 통하여 용액을 여과하기 위하여 즉시 진공을 뽑아주었다.

8. 태깅(Tagging)

무수 DMSO에 용해시킨 100mM의 NHS-PE0₄-비오틴 엘리컷을 6분간 37℃에서 녹인 후, 태깅 버퍼(tagging buffer)(pH = 7.25에서 SB17, 0.05% 트윈-20)를 사용하여 1:100으로 희석하였다. 로봇 프롬프트 상에서, 희석된 NHS-PEO₄-비오틴 시약을 온 데크 통에 수동으로 첨가하고, 각 캐치 1 필터 플레이트의 각 웰 안으로 100μL의 NHS-PE0₄-비오틴을 분배하기 위하여 로봇 프로그램을 수동으로 재개시하였다. 이 용액을 오르비탈 쉐이커 상에서 5분간 800rpm으로 흔들어주면서 캐치 1 비드와 함께 배양하였다.

9. 동적 유발(kinetic challenge) 및 광절단(photo-cleavage)

태깅 반응은 진공 여과에 의해 제거되며, 상기 반응은 캐치 1 플레이트에 1xSB17, 0.05% 트윈-20에 용해시킨 150μL의 20mM 글리세린을 첨가함으로써 중단되었다. NHS-태그/글리신 용액을 진공 여과를 통해 제거하였다. 다음으로, 1500μL의 20mM 글리세린(1xSB17, 0.05% 트윈-20)을 각 플레이트에 첨가하고, 진공 여과에 의해 제거하기 전에 800rpm으로 오르비탈 쉐이커 상에서 1분간 배양하였다.

캐치 1 플레이트의 웰을 그 후 190μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20을 첨가하여 세 번 세척하고 진공 여과를 한 후, 800rpm에서 1분간 흔들어주면서 190μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20을 첨가하여 진공 여과를 하였다. 마지막 세척 후, 플레이트를 1mL 딥-웰 플레이트 상단에 올려두고, 데크로부터 제거하였다. 가능한 한 용출 전 아가로오스 비드로부터 될 수 있는 한 많은 외부량(extraneous volume)을 제거하기 위하여, 캐치 1 플레이트를 1분간 1000rpm에서 원심분리하였다.

플레이트를 다시 베크만 바이오멕 FxP에 올려놓고, 1xSB17, 0.05% 트윈-20에 용해시킨 85μL의 10mM DxSO₄를 필터 플레이트의 각 웰에 첨가하였다.

이 필터 플레이트를 데크로부터 제거하고, 블랙레이 광원(BlackRay light sources)(Ted Pella, Inc., Redding, CA) 하에서 베리오맥 써모쉐이커(variomag thermoshaker; Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) 위에 올려두고, 상기 플레이트를 180도로 회전시키고 5분 이상 동안 흔들면서 방사선을 조사하여 5분 배양한 후, 800rpm으로 흔들면서 5분간 방사선을 조사하였다.

처음으로 1mL의 딥-웰 플레이트의 상단에 5% 캐치 1 필터 플레이트를 올려놓고 1분간 1000rpm에서 원심분리함으로써 통상의 딥-웰 플레이트 내로 광절단된 용액을 각 캐치 1 플레이트로부터 연속적으로 용출하였다. 0.316% 및 0.01% 캐치 1 플레이트를 그 후 연속적으로 동일한 딥 웰 플레이트로 원심분리하였다.

10. 캐치 2 비드 포획

캐치 1의 화합된 용출액을 포함하는 1mL의 딥 웰 블록을 캐치 2를 위한 베크만 바이오멕 FxP의 데크에 놓아두었다.

로봇은 1mL 딥-웰 플레이트로부터 얻은 모든 광-절단된 용출액을 미리 제조된 캐치 2 마이원 자성 비드(magnetic beads)를 포함하는 혼성화 플레이트 위로 옮겨놓았다(자성 분리를 통하여 마이원 버퍼를 제거한 후).

상기 용액을 베리오맥 써모쉐이커(Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) 상에서 25℃, 5분간 1350rpm으로 흔들면서 배양하였다.

로봇이 플레이트를 온-데크 마그네틱 세퍼레이터 스테이션(on deck magnetic seperator station)으로 옮겼다. 상기 플레이트를 상층액을 제거하여 버리기 전에 90초간 자석 위에서 배양하였다.

11. 37℃ 30% 글리세롤 세척

캐치 2 플레이트를 온-데크 써멀 쉐이커로 이동시키고, 75μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20을 각 웰로 옮겼다. 재현탁하기 위하여 플레이트를 1분간 1350rpm, 37℃에서 혼합하고, 비드를 승온시켰다. 37℃에서 캐치 2 플레이트의 각 웰에 75μL의 60% 글리세롤을 넣고, 상기 플레이트를 1350rpm 및 3℃에서 1분 더 혼합을 계속하였다. 로봇이 플레이트를 37℃ 마그네틱 세퍼레이터로 옮기고, 거기에서 2분간 자석 위에서 배양한 한 후, 로봇이 상층액을 제거하고 버린다. 이 세척을 두 번 이상 반복하였다.

캐치 2 비드로부터 세 번째 30% 글리세롤 세척액을 제거한 후, 37℃ 자석 위에서 마그네틱 분리에 의한 제거 전에, 150μL의 1xSB17, 0.05% 트윈-20을 각 웰에 첨가하여 37℃에서 배양하고, 1분간 1350rpm으로 흔들어 주었다.

캐치 2 비드를 마그네틱의 분리 전, 25℃에서 1350rpm으로 흔들어주면서 1분간의 배양과 함께 150μL의 1xSB19, 0.05% 트윈-20을 사용하여 마지막으로 세척하였다.

12. 캐치 2 비드 용출 및 중성화

각 웰에 1M NaCl, 0.05% 트윈-20과 함께 105μL의 100mM CAPSO를 첨가함으로써 캐치 2 비드로부터 압타머가 용출되었다. 상기 비드를 5분간 1300rpm에서 흔들어주면서 이 용액과 함께 배양하였다.

그 후, 63μL의 용출액을 각 웰에 7μL의 500mM HCl, 500mM HEPES, 0.05% 트윈-20을 포함하는 새로운 96-웰 플레이트로 옮기기 전에, 상기 캐치 2 플레이트를 90초간 마그네틱 세퍼레이터 위에 올려놓았다. 옮긴 후, 상기 용액을 로봇으로 60μL을 다섯 번 아래 위로 피펫팅함으로써 혼합하였다.

13. 혼성화

베크만 바이오멕 FxP는 20μL의 중성화된 캐치 2 용출액을 새로운 혼성화 플레이트로 옮기고, 10x 스파이크(spike)의 혼성화 대조군을 포함하는 6μL의 10x 애질런트 블록(Agilent Block)을 각 웰에 첨가하였다. 다음으로, 30μL의 2x 애질런트 혼성화 버퍼를 중성화된 샘플과 차단 버퍼를 포함하는 플레이트의 각 웰로 수동으로 피펫팅하고, 상기 용액을 대규모의 거품 형성을 피하기 위하여 수동으로 천천히 25μL를 15번 아래 위로 피펫팅하여 혼합하였다. 상기 플레이트를 1분간 1000rpm에서 회전시켰다.

맞춤형 애질런트 마이크로어레이 슬라이드(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)는 몇몇의 프라이머 영역이 더해진 압타머 랜덤 영역에 상보적인 프로브를 포함하도록 설계하였다. 다수의 압타머에 대하여, 상보적 서열의 최적 길이는 경험적으로 결정되며, 40-50 사이이다. 압타머 뒤에 46-mer의 상보적 영역이 자동적으로 선택되었다. 상기 프로브는 60 뉴클레오티드 길이의 총 프로브를 위해 폴리-T 링커(poly-T linker)로 슬라이드 표면에 연결되었다.

가스켓 슬라이드(gasket slide)를 애질런트 혼성화 챔버 위에 놓고, 혼성화 및 차단 용액을 포함하는 각 40μL의 샘플을 수동으로 각 가스켓 내로 피펫팅하였다. 거품 형성을 최소화하기 위하여 8-채널로 변경가능한 피펫터를 어느 정도 사용하였다. 바코드가 위로 오게 한 맞춤형 애질런트 슬라이드(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA)를 그 후 가스켓 슬라이드 위로 천천히 내렸다(상세한 설명을 위하여 애질런트 매뉴얼을 참고).

혼성화 챔버의 상단을 슬라이드/백킹 샌드위치(backing sandwich) 상에 놓고, 전체 어셈블리에 걸쳐서 클램핑 브라켓(clamping brackets)을 움직였다. 이 어셈블리를 스크류를 확실하게 돌려 단단히 죄었다.

샘플 내에서 용액 거품이 자유롭게 움직일 수 있는지를 확인하기 위하여, 각 슬라이드/백킹 슬라이드 샌드위치를 육안으로 면밀하게 살폈다. 만일 거품이 자유롭게 움직이지 않는다면, 가스켓 주변에 머무르고 있는 거품을 떼기 위하여 혼성화 챔버 어셈블리를 가볍게 쳐주었다.

상기 조립된 혼성화 챔버를 20rpm으로 회전시키면서 60℃에서 19시간 동안 애질런트 혼성화에서 배양하였다.

14. 혼성화 후 세척

대략 400mL의 애질런트 세척 버퍼 1을 각각 2개의 별도의 유리 염색 디쉬에 넣었다. 염색 디쉬 중 하나를 마그네틱 교반 플레이트(magnetic stir plate)에 놓고, 슬라이드 렉과 교반 막대를 버퍼 안으로 넣었다.

애질런트 세척액 2를 위한 염색 디쉬를 빈 유리 염색 디쉬 내로 교반 막대를 넣어 제조하였다.

마지막 아세토니트릴 세척을 위하여 4번째 유리 염색 디쉬를 챙겨두었다.

각 6개의 혼성화 챔버를 해체하였다. 차례차례, 슬라이드/백킹 샌드위치를 그것의 혼성화 챔버로부터 제거하고, 세척액 1을 포함하는 염색 디쉬 안으로 넣었다. 마이크로어레이 슬라이드가 계속 잠겨있는 동안, 상기 슬라이드/백킹 샌드위치를 집게를 사용하여 한쪽으로 들어올렸다. 슬라이드를 재빨리 마그네틱 교반 플레이트 상의 세척 1 염색 디쉬에 있는 슬라이드 랙으로 옮겼다.

상기 슬라이드 랙을 천천히 헹구고 5번 담그었다. 마그네틱 교반 막대를 낮은 조절로 돌리고, 슬라이드를 5분간 배양하였다.

세척액 1에 대하여 1분이 남아있을 때, 배양기에서 37℃로 미리 데워진 세척 버퍼 2를 두 번째로 제조된 염색 디쉬에 첨가하였다. 상기 슬라이드 랙을 재빨리 세척 버퍼 2로 옮기고, 랙의 바닥에 있는 임의의 과잉 버퍼를 염색 디쉬의 상단에서 폐기하여 제거하였다. 상기 슬라이드 랙을 천천히 헹구고 5번 담그었다. 마그네틱 교반 막대를 낮은 조절점으로 돌리고, 슬라이드를 5분간 배양하였다. 상기 슬라이드 랙을 세척제 2에서 천천히 꺼내 용액에서 슬라이드를 제거하기 위하여 대략 15초간 잡고 있었다.

세척액 2에서 남아있는 1분을 사용하여, 아세토니트릴(ACN)을 4번째 염색 디쉬에 첨가하였다. 상기 슬라이드 랙을 아세토니트릴 염색 디쉬로 옮겼다. 상기 슬라이드 랙을 천천히 헹구고 5번 담그었다. 마그네틱 교반 막대를 낮은 조절로 돌리고, 슬라이드를 5분간 배양하였다.

상기 슬라이드 랙을 천천히 ACN 염색 디쉬에서 꺼내 흡수 타올 위에 올려놓았다. 슬라이드의 하단을 재빨리 건조시키고, 슬라이드를 깨끗한 슬라이드 박스에 올려놓았다.

15. 마이크로어레이 영상화

마이크로어레이 슬라이드를 애질런트 스캐너 슬라이드 홀더 내에 놓고, 제조사의 설명서에 따라 애질런트 마이크로어레이 스캐너로 로딩하였다.

상기 슬라이드를 100% PMT 셋팅, 5μm 해상도에서 Cy3-채널과 0.05에서 가능한 XRD 옵션에서 영상화하였다. 그 결과 만들어진 tiff 영상을 애질런트 특성 추출 소프트웨어 버전 10.5(Agilent feature extraction software version 10.5)를 사용하여 처리하였다.

실시예 2: 바이오마커 확인

CT 스캔 또는 다른 영상화 방법으로 확인된 정확히 규정할 수 없는 폐 결절을 가지는 개인에서의 비소세포 폐암의 진단, 비소세포 폐암에 대한 고위험 흡연자의 선별 및 비소세포 폐암을 가지는 개인을 진단하기 위한 잠재적인 비소세포 폐암 바이오마커의 확인을 수행하였다. 이 연구를 위한 등록 기준(enrollment criteria)은 사전 동의(informed consent) 및 혈액 샘플 및 비소세포 폐암 또는 양성 판독물을 제공 가능한 18세 또는 그 이상의 흡연자이다. 사례를 위한 혈액 샘플을 치료 또는 수술 전 및 비소세포 폐암으로 진단된 후에 수집하였다. 배제 기준(exclusion criteria)은 채혈(blood draw) 5년 내의 (피부의 편평세포 암종(squamous cell carcinoma)을 제외한) 이전의 암의 진단 또는 치료를 포함한다. 혈청 샘플을 세 의 서로 다른 부위로부터 수집하였으며, 이것은 표 17에 기술된 바와 같이 46개의 비소세포 폐암 샘플 및 218개의 대조군 샘플을 포함한다. 각각의 이 264개의 샘플에서 1,034개의 분석물의 RFU 값을 측정하고 기록하기 위하여, 실시예 1에 기재된 것과 같은 다중 압타머 친화 검정법을 사용하였다.

각 사례 및 대조군 집단을 각각의 1,034개의 분석물에 대한 분류 의존적(class-dependent) 누적분포함수 cumulative distribution function, cdfs)를 생성함으로써 개별적으로 비교하였다. 두 세트의 샘플로부터 얻어진 값 사이의 KS-거리(Kolmogorov-Smirnov statistic)는 하나의 세트(Set A)로부터의 경험적인 분포 값이 다른 세트(Set B)로부터의 분포값과 어느 정도까지 차이가 있는지의 비모수적 측정(non parametric measurement)이다. 임의의 역치 T의 값에 대하여, 세트 A로부터의 어떤 비율의 값은 T 보다 작을 것이며, 세트 B로부터의 어떤 비율의 값은 T 보다 작을 것이다. KS-거리는 임의의 선택의 T에 대한 두 세트로부터의 값의 비율 사이의 최대(부호 없음) 차이를 측정한다.

이 잠재적 바이오마커의 세트는 대조군 또는 질병 그룹 중 하나로 샘플을 지정하는 분류기를 확립하는데 사용될 수 있다. 사실, 많은 이와 같은 분류기는 이들 바이오마커의 세트 및 측정된 우수한 득점의 분류기에서의 임의의 바이오마커의 잦은 사용으로부터 생성된다. 상위 득점 분류기들 중 하나에서 가장 빈번하게 생기는 이 바이오마커는 진단 테스트를 만드는데 가장 유용하다. 이 실시예에서, 베이지안 분류는 분류 공간을 조사하는데 사용되었으나, 많은 다른 지도 학습 기술이 이 목적을 위하여 사용될 수 있다. 임의의 개개의 분류기의 득점 조절(scoring fitness)은 0.5의 질병 유병율(disease prevalence)을 평가하는 베이지안 표면에서 분류기의 수신자 조작 특성 곡선(receiver operating characteristic curve) 아래의 영역(ROC의 AUC)을 사용하여 측정된다. 이 득점 지표는 오류 없는(error-free) 분류기가 되는 것을 포함하여 0에서 2로 달라진다. 바이오마커 집단 측정으로부터 베이지안 분류기를 구성하는 것에 대한 상세한 설명은 실시예 3에 기재하였다.

실시예 3: 비소세포 폐암을 위한 나이브 베이지안 분류

비소세포 폐암 및 대조군을 구별하는데 유용한 것으로 확인된 바이오마커의 리스트로부터 10개의 바이오마커 패널을 선택하고, 나이브 베이즈 분류기를 구성하였다(표 16 및 18을 참고). 클래스-의존성 확률 밀도 함수(class-dependent probability density functions; pdfs),

및

는 평균

및 분산

에 의해 특성화된 로그-정규 분포 함수(normal distribution function)로서 모델링되었으며, 여기에서

는 바이오마커

에 대하여 측정된 RFU값의 로그(log)이고,

및

는 대조군과 질병 집단을 말한다. 10개의 바이오마커의 pdfs에 대한 파라미터는 표 1에 열거하였으며, 정규 pdf에 적합한 모델 핏에 따른 원 데이터(raw data)의 예는 도 5에 나타내었다. 기초 가정은 도 5에 의해 명시된 것과 같이 데이터에 꽤 적합한 것으로 보인다.

이와 같은 모델에 대한 나이브 베이즈 분류는 하기의 식:

으로 주어지며, 여기에서

는 테스트에 적합한 집단에서의 질병의 유병율(prevalence)이고, 여기에서 n=10이다. 합계에서 각각의 항은 개개의 마커에 대한 로그-우도 비율이고, 질병을 가지는 것에 대한 관심 질병(즉, 이 경우에는 비소세포 폐암)을 가지지 않는 샘플

의 총 로그-우도 비율은 이들 개개의 항목 플러스 질병의 유병율을 차지하는 항목의 단순한 합계이다. 간단하게 하기 위하여,

로 가정하였으므로

이다.

미지의 샘플 측정값을 6.9, 8.7, 7.9, 9.8, 8.4, 10.6, 7.3, 6.3, 7.3, 8.1의 각 10개의 바이오마커에 대한 로그(RFU)로 볼 때, 분류의 계산을 표 16에 기술하였다. 대조군 대 질병 클래스에 대한 로그 우도 비율을 포함하는 개개의 성분을 표로 만들었으며, 이것은 표 16 있는 파라미터 및

의 값으로부터 계산될 수 있다. 개개의 로그 우도 비율의 합계는 -11.584 또는 질병을 가지지 않을 가능성 대 질병을 가질 가능성은 107,386이고, 여기에서 우도(likelihood) e ^11.584 = 107,386이다. 처음 3개의 바이오마커 값은 질병군과 더 일치할 가능성(로그 우도 > 0)을 가지지만, 나머지 7개의 바이오마커는 모두 일관적으로 대조군을 뒷받침하는 것으로 밝혀졌다. 우도를 함께 멀티플레잉하는 것은 상기에 나타낸 것과 같은 동일한 결과; 미지의 샘플이 질병을 가지지 않을 107,386의 가능성을 준다.

실시예 4: 분류기를 위한 바이오마커 패널을 선별하기 위한 그리디 알고리즘

이 실시예는 본원에 기재된 임의의 방법에서 분류기로서 사용될 수 있는 패널을 만들기 위한 표 1로부터의 바이오마커 선별을 기술한다. 표 1에 있는 바이오마커의 서브셋이 우수한 성능을 가지는 분류기를 구성하기 위하여 선택되었다. 이 방법은 또한 잠재적 마커가 실시예 2에서 바이오마커로서 포함되는지를 결정하는데 사용된다.

본원에서 사용된 분류기 성능의 측정은 곡선 아래의 영역(AUC)이고; 0.5의 성능은 랜덤(동전 뒤집기(coin toss)) 분류기에 대한 일반적인 예상(baseline expectation)이며, 랜덤보다 나쁜 성능을 가지는 분류기는 0.0 및 0.5 사이의 스코어일 것이고, 랜덤보다 훨씬 나은 스코어를 가지는 분류기는 0.5 및 1.0 사이의 스코어일 것이다. 오류를 가지지 않는 완벽한 분류기는 1.0의 민감도 및 1.0의 특이도를 가질 것이다. 어느 것은 F-측정값(F-measure), 민감도와 특이도의 합계 또는 민감도와 특이도의 결과와 같은 성능의 다른 일반적인 측정값에 대하여 실시예 4에 기술된 방법을 사용할 수 있다. 보다 상세하게는, 어느 것은 약간의 민감도를 희생하여 높은 특이도로 수행하는 그런 분류기를 선택하거나 약간의 특이도를 희생하여 높은 민감도로 수행하는 그런 분류기를 선택하기 위하여, 서로 다른 영향력을 가지는 민감도와 특이도로 처리하는 것이 좋을 것이다. 본원에 기재된 방법은 단지 "성능(performance)"의 측정만을 포함하기 때문에, 단일 성능 측정값을 내는 임의의 가중치 계산 방법(weighting scheme)이 사용될 수 있다. 서로 다른 적용은 진양성 및 진음성 결과물에 대한 서로 다른 이점을 가질 것이며, 또한 위음성 결과물로부터 위양성 결과물과 관련된 서로 다른 비용을 가질 것이다. 예를 들면, 무증상 흡연자를 선별하는 것과 CT 상에서 발견된 양성 결절의 감별 진단은 일반적으로 특이도와 민감도 사이에 동일한 광학적 트레이드-오프(optical trade-off)를 가지지 않을 것이다. 두 테스트의 차별적 요구는 일반적으로 성능 측정값에 반영되는 양성 및 음성 오분류(misclassification)에 다른 가중을 주는 셋팅을 필요로 할 것이다. 성능 측정값을 바꾸는 것은 일반적으로 주어진 일련의 데이터에 대한 표 1로부터 선택된 마커의 정밀한 서브셋을 변화시킬 것이다.

실시예 3에 기술된 대조군 샘플로부터 비소세포 폐암 샘플의 구별에 대한 베이지안 접근법을 위하여, 분류기는 질병과 양성 트레이닝 샘플에서의 바이오마커 분포에 의해 완벽하게 파라미터화되며, 바이오마커의 리스트는 표 1로부터 선택되고; 즉, 포함을 위하여 선택된 마커의 서브셋은 주어진 일련의 트레이닝 데이터를 일대일(one-to-one) 방식으로 분류기를 결정하였다.

본원에서 사용된 그리디 방법은 표 1로부터 최적의 마커의 서브셋을 검색하는데 사용되었다. 적은 수의 마커 또는 상대적으로 소수의 마커를 가지는 분류기에 대하여, 마커의 모든 가능한 서브셋을 열거하고, 특정한 일련의 마커로 구성된 분류기의 성능에 관하여 평가하였다(실시예 4, Part 2를 참조하라). (이 접근법은 통계학 분야에서 "최상의 서브셋 선택(best subset selection)"으로 잘 알려져 있다; Hastie, et al.,을 참조). 그러나, 본원에 기술된 분류기에 대하여, 다중 마커의 다수의 조합들은 매우 클 수 있고, 거기에는 단지 30개의 총 분석물의 리스트로부터 생성될 수 있는 30,045,015의 가능한 조합이 있기 때문에, 10개의 마커의 모든 가능한 세트를 평가하는 것은 가능하지 않다. 마커의 모든 서브셋을 통한 검색의 실행 불가능성 때문에, 단일 광학 서브셋은 발견되지 않을지도 모르지만, 이 접근법을 사용함으로써 많은 우수한 서브셋들이 발견되었고, 많은 경우에 있어서 임의의 이 서브셋들은 광학 서브셋을 나타낼 수 있다.

마커의 모든 가능한 세트를 평가하는 대신에, "그리디(greedy)" 전진 단계적 접근법(forward stepwise approach)이 수행될 수 있다(Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10); e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002를 참고). 이 방법을 사용하여, 분류기는 (개개의 마커에 대한 KS-거리에 기초하여) 최상의 단일 마커를 사용하여 시작되고, 현재 분류기에 있는 마커 세트의 일원이 아닌 마커 리스트의 각 일원을 차례로 시험해 보는 것에 의해 각 단계에서 발달된다. 현재 있는 분류기와 결합하여 최상의 스코어를 기록하는 마커를 분류기에 첨가하였다. 이것을 성능의 향상이 더 이상 이뤄지지 않을 때까지 반복하였다. 불행하게도, 이 접근법은 어떤 개개의 마커가 진행 중지 전에 모두 선택되는 것은 아닌 마커의 귀중한 조합을 놓칠 수 있다.

본원에서 사용된 그리디 방법은 각 단계에서 단일 후보 분류기(마커 서브셋)만을 보유하기보다는 검색을 넓힌다는 점에서, 선행하는 전진 단계적 접근법의 고심작이며, 후보 분류기의 리스트는 보존하였다. 상기 리스트는 (독자적으로 표에 있는 모든 마커를 사용하여) 모든 단일 마커 서브셋과 함께 도입되었다. 이 리스트는 현재 리스트 상에 있는 것들로부터 새로운 분류기(마커 서브셋)를 얻고, 그것들을 리스트에 첨가함으로써 단계를 확대하였다. 현재 리스트 상에 있는 각 마커 서브셋은 아직 그 분류기의 성분이 아니고 서브셋에 대한 그것의 첨가에 따라 존재하는 서브셋을 2배로 하지 않을 표 1로부터의 임의의 마커를 추가하여 확장된다(이것들은 "허용가능 마커(permissible markers)"라 부른다). 모든 현재 있는 마커 서브셋은 리스트로부터의 모든 허용가능 마커에 의해 확장된다. 명백하게는, 이와 같은 과정은 결국 모든 가능한 서브셋을 생성하고, 리스트는 공간을 다 써버리게 될 것이다. 따라서, 생성된 모든 분류기는 리스트가 얼마간의 미리 결정된 (종종 모든 세 개의 마커 서브셋을 수용하기에 충분한) 크기보다 작은 동안만 유지된다. 일단 리스트가 미리 결정된 크기의 한계에 도달하면, 그것은 엘리트(elitist)가 된다; 즉, 단지 어느 정도 레벨의 성능을 보이는 분류기만이 리스트에 보존되고, 다른 것들은 리스트로부터 제외되어 삭제된다. 이것은 분류기 성능 순으로 저장된 리스트를 보존함으로써 달성되고; 현재의 최저 수준미달의 배제에 초점을 맞추어, 적어도 현재 리스트 상의 가장 나쁜 분류기만큼 우수한 새로운 분류기는 삽입된다. 또 다른 실행의 상세한 내용은 리스트가 각 세대의 단계상에서 완벽하게 대체되므로, 리스트 상의 모든 분류기는 동일한 수의 마커 및 각 단계에서 하나에 의해 발생된 분류기 당 마커의 수를 가진다.

이 방법은 마커의 서로 다른 조합을 사용하여 후보 분류기의 리스트를 생성하기 때문에, 만일 분류기가 최상의 단일 분류기 또는 최상의 분류기의 소수의 그룹에 의해 만들어질 수 있는 오류를 피하도록 조합될 수 있는지 의문이 들 수 있다. 이러한 "앙상블(ensemble)" 및 "자문 위원회(committee of experts)" 방법은 통계학 및 기계학습 분야에서 잘 알려져 있으며, 예를 들어, "평균(Averaging)", "투표(Voting)", "스태킹(Stacking)", "배깅(Bagging)" 및 "부팅(Boosting)"을 포함한다(예를 들어, Hastie, et al.,를 참조). 이들 단순 분류기의 조합은 여러 개의 다른 분류기를 포함시킴으로써 마커의 임의의 특정 세트에서의 노이즈로 인한 분류에서의 변화를 감소시키기 위한 방법을 제공하므로, 바이오마커 표로부터의 더욱 많은 마커의 세트로부터의 정보를 분류기 사이에서 효과적으로 평균내었다. 이 접근법의 유용성의 예는 그것이 단일 샘플의 분류에 불리한 영향을 주는 것으로부터 단일 마커에서의 이상치(outliers)를 보호할 수 있다는 것이다. 다수의 시그널을 측정하기 위한 필요 조건은 기존의 "한번에 하나의 마커(one marker at a time)" 항체 검정으로 비실용적일 수 있으나, 충분히 다중화된 압타머 검정법에 대해서는 불리한 점을 가지지 않는다. 이와 같은 기술은 더 광범위한 바이오마커의 표와 더욱 견고한 분류를 제공하기 위하여 질병의 과정을 고려하는 다중 출처의 정보 사용으로부터 이익을 얻는다.

표 1에서 선택된 바이오마커는 "비-마커(non-marker)"(즉, (실시예 2에 기술된 것과 같은) 표 1에 포함시키기 위한 기준을 충족하지 않는 시그널을 가지는 단백질)를 사용하여 확립된 분류기보다 잘 수행하는 분류기를 발생시킨다.

단지 하나, 두 개 또는 세 개의 마커만을 포함하는 분류기를 위한 표 1에 있는 바이오마커를 사용하여 얻어진 모든 가능한 분류기를 열거하였고, 랜덤하게 선택된 비-마커 시그널의 유사한 표로부터 확립된 분류기와 비교하여 성능의 분포에 대하여 조사하였다.

도 11에서, AUC는 성능의 측정값으로서 사용되었으며, 0.5의 성능은 랜덤(동전 뒤집기) 분류기에 대한 일반적인 예상(baseline expectation)이다. 분류기 성능의 막대그래프는 59개의 비-마커 시그널의 "비-마커" 표로부터 확립된 분류기의 유사한 소모적 열거(exhaustive enumeration)에서의 성능의 막대그래프와 비교되고; 59개의 시그널은 대조군과 질병 집단 사이의 서로 다른 신호전달을 나타내지 않는 압타머로부터 랜덤하게 선택되었다.

도 11은 대조군과 비소세포 폐암을 구별할 수 있는 바이오마커를 위하여 표 14에서 바이오마커 파라미터로부터 확립된 모든 가능한 하나, 두 개 또는 세 개의 마커 분류기의 성능의 막대그래프를 나타내며, 59개의 "비-마커" 압타머 RFU 시그널을 사용하여 확립된 모든 가능한 하나, 두 개 또는 세 개의 마커 분류기와 이 분류기를 비교한다. 도 11a는 단일 마커 분류기 성능의 막대그래프를 나타낸 것이고, 도 11b는 두 개의 마커 분류기 성능의 막대그래프를 나타낸 것이며, 도 11c는 세 개의 마커 분류기 성능의 막대그래프를 나타낸 것이다.

도 11에서, 실선(solid line)은 표 14에 있는 흡연자 및 양성 결절 및 비소세포 폐암에 대한 바이오마커 데이터를 사용하는 모든 하나, 두 개 및 세 개의 마커 분류기의 분류기 성능의 막대그래프를 나타낸다. 점선(dotted line)은 대조군 및 비소세포 폐암에 대한 데이터를 사용하지만, 랜덤 비-마커 시그널의 세트를 사용하는 모든 하나, 두 개 및 세 개 마커 분류기의 분류기 성능의 막대그래프이다.

표 1에 열거된 마커로부터 확립된 분류기는 모든 하나-마커, 두 개-마커 및 세 개-마커 비교를 위한 "비-마커"로부터의 시그널을 사용하여 확립된 분류기로부터 잘 분리된 별개의 막대그래프를 형성한다. 표 1에 있는 바이오마커로부터 확립된 분류기의 성능 및 AUC 스코어는 또한 비-마커로부터 확립된 분류기로 할 수 있는 것보다 마커의 수를 빠르게 증가시키고, 분리는 분류기 증가 당 마커의 수로서 마커와 비-마커 분류기 사이에서 증가한다. 표 14에 열거된 바이오마커를 사용하여 확립된 모든 분류기는 "비-마커"를 사용하여 확립된 분류기보다 더 명백하게 실행한다.

분류기 성능의 분포는 표 1에 있는 분석물 세트로부터 유래될 수 있는 많은 가능한 다중 마커 분류기가 있음을 나타낸다. 비록 몇몇의 바이오마커는 그 자체가 다른것들 보다 우수하지만, 분류기 스코어의 분포 및 단일 분석물에 대한 AUC에 의해 증명된 바와 같이, 이와 같은 바이오마커들이 고성능 분류기를 구성하는데 필요한지를 결정하는데 바람직하다. 이를 확인하기 위하여, 몇 개의 우수한 바이오마커를 배제시킴으로써 분류기 성능의 거동을 시험하였다. 도 12는 상위에 랭킹된 마커가 배제된 표 1로부터의 바이오마커 서브셋을 사용하여 확립된 분류기의 성능과 표 1에 있는 바이오마커의 전체 리스트를 사용하여 확립된 분류기의 성능을 비교한 것이다.

도 12는 마커의 어떤 작은 중심 그룹에 의한 것이 아닌 분류기의 성능 및 많은 단백질의 활성에 반영되어 있는 질병에 연관된 기초 과정에 있는 변화를 의미하는, 최상의 마커 없이 구성된 분류기가 잘 작동함을 나타낸다. 표 1에 있는 바이오마커의 많은 서브셋들은 표 1로부터의 59개의 마커 중 상위 15개를 제거한 후에도 최적에 가깝게 작동하였다. 표 1로부터 15개의 상위에 랭킹된 마커(KS-거리에 의해 랭킹됨)를 제거한 후에도, 분류기 성능은 바이오마커 전체 리스트로부터 선택된 0.948의 최적의 분류기 스코어의 성능에 가깝게 거의 0.93의 AUC에 도달하도록 표로부터 선택된 마커의 수에 따라 증가하였다.

마지막으로, 도 13은 실시예 3에 따라서 표 14에 있는 파라미터의 리스트로부터 구성된 전형적인 분류기의 ROC 성능이 어떠한지를 나타낸다. 5개의 분석물 분류기는 MMP7, CLIC1, STX1A, CHRDL1 및 PA2G4로 구성된다. 도 13a는 실시예 3에 있는 것과 같은 마커의 독립을 가정하는 것으로부터의 모델 성능을 나타내고, 도 13b는 표 14에 있는 파라미터를 정의하는데 사용된 연구 데이터 세트로부터 생성된 경험적 ROC 곡선을 나타낸다. 주어진 수의 선택된 마커에 대한 성능은 정량적으로 일치하였으며, 그 정량적인 일치는 마커 수가 증가하는 만큼 감소된다는 것을 알 수 있다. 이것은 질병의 과정을 고려하여 임의의 특정 바이오마커에 의해 얻어진 정보는 표 1에 제공된 다른 바이오마커에 의하여 얻어진 정보와 중복된다는 견해와 일치한다. 도 13은 따라서 실시예 3에 기재된 방법과 함께 조합된 표 1은 대조군으로부터 비소세포 폐암을 구별하는데 유용한 매우 많은 분류기의 제작 및 평가를 가능하게 한다.

실시예 5: 임상적 바이오마커 패널

랜덤 포레스트 분류기는 임상적 진단 테스트에 사용하기에 가장 적절할 수 있는 것으로 선택된 바이오마커의 패널로부터 확립된다. 나이브 베이즈 그리디 전향 알고리즘에 의해 선택된 모델과는 달리, 랜덤 포레스트 분류기는 바이오마커 측정값이 랜덤하게 분포된다고 추정하지 않는다. 따라서, 이 모델은 나이브 베이즈 분류기에 효과적이지 않은 표 1로부터의 바이오마커를 사용할 수 있다.

상기 패널은 랜덤 포레스트 분류기에 의해 제공되는 지니 중요도 척도(gini importance measure)가 이용된 후진 제거 과정(backward elimination procedure)을 사용하여 선택된다. 상기 지니 중요도는 트레이닝 세트에서 샘플을 정확하게 분류하는데 있어서 바이오마커의 유효성의 척도이다.

이 바이오마커 중요도의 척도는 분류기의 성능에 대하여 덜 필수적인 마커들을 제거하는데 사용될 수 있다. 후진 제거 과정은 표 1에 있는 59개 모두가 포함되된 랜덤 포레스트 분류기를 확립함으로써 개시된다. 가장 덜 중요한 바이오마커는 그 후 제거되고, 남아있는 바이오마커들을 사용하여 새로운 모델이 확립된다.

선택된 마지막 패널은 모델에서 가장 우수한 AUC와 가장 적은 수의 마커 사이에 최상의 밸런스를 제공한다. 이들 기준을 만족하는 8개의 패널은 하기의 분석물: MMP12, MMP7, KLK3-SERPINA3, CRP, C9, CNDP1, CA6 및 EGFR로 구성되어 있다. 이 바이오마커 패널에 대한 ROC 곡선의 그래프는 도 14에 나타내었다. 이 모델의 민감도는 0.70이며, 대응 특이도는 0.89이다.

실시예 6: 암의 진단을 위한 바이오마커

암의 일반적인 진단을 위한 잠재적 바이오마커의 확인을 수행하였다. 사례 및 대조군 샘플 모두 3가지 서로 다른 암의 형태(폐암, 중피종 및 신장암)로 평가되었다. 현장을 통틀어, 포함 기준은 사전 동의에 서명한 적어도 18세 이상이었다. 사례 및 대조군 모두 문제의 암 외에 알려진 악성 종양은 배제되었다.

폐암

사례 및 대조군 샘플을 실시예 2에 기술된 것과 같이 얻었다. 총 46개의 사례 및 218개의 대조군이 이 실시예에서 사용되었다.

흉막 중피종

나중에 비-악성으로 진단된 의심스러운 방사선학적 소견을 포함하는 양성 폐 질환으로부터 흉막 중피종의 감별 진단을 위한 잠재적인 마커를 확인하기 위하여, 학술 암 센터 검체은행(academic cancer center biorepository)으로부터 사례 및 대조군 샘플을 얻었다. 총 124개의 중피종 사례 및 138개의 석면에 노출된 대조군이 이 실시예에서 사용되었다.

신장암

학술 암 센터 검체 은행에서 신장암(renal cell carcinoma, RCC) 및 양성 종괴(benign masses, BEN) 환자로부터 사례 및 대조군 샘플을 얻었다. 수술 전 샘플(pre-surgical samples, TP1)을 모든 피험자들로부터 얻었다. 임상적 추적 조사(clinical follow-up)를 통하여 문서로 기록된 “질병의 증거(Evidence of Disease, EVD)”대“질병의 증거 없음(No Evidence of Disease, NED)”과 함께 RCC 환자에 대한 (SEER 데이터베이스 필드 CA 스테이터스 1에 기록된 것과 같은) 결과 데이터(outcome data)를 1차 분석과 비교하였다. 총 38개의 EVD 사례 및 104개의 NED 대조군이 이 실시예에서 사용되었다.

각각 3개의 서로 다른 암 연구로부터 고려된 바이오마커 세트를 조합함으로써 암 바이오마커의 최종 리스트를 확인하였다. 규모가 증가된 바이오마커 세트가 사용된 베이지안 분류기는 (이 실시예의 섹션 6.2에 더욱 상세하게 기술되는 것과 같은) 그리디 알고리즘을 사용하여 성공적으로 구성되었다. 서로 다른 부위 및 형태의 암 사이에서 일반적으로 암을 진단하는데 유용한 바이오마커의 세트 (또는 패널)는 세트 (또는 패널) 크기의 함수로 취합되고, 그것들의 성능에 대하여 분석되었다. 이 분석은 표 19에 나타낸 23개의 암 바이오마커의 리스트를 도출하였고, 그것들 각각은 3개부터 10개의 마커까지의 크기 범위인 적어도 하나의 이들 연속적인 마커 세트로 존재한다. 실례로서, 표 32에 나타낸 10개의 암 바이오마커로 구성된 특정 패널의 생성을 기술한다.

6.1 암을 위한 나이브 베이지안 분류기

표 1의 바이오마커 리스트로부터, 이 실시예의 섹션 6.2에 개요를 설명한 바와 같이, 바이오마커 선별을 위한 그리디 알고리즘을 이용하여 10개의 암 바이오마커의 패널을 선택하였다.

각각 3개의 서로 다른 암 형태에 대한 별개의 나이브 베이즈 분류기를 구성하였다. 클래스-의존성 확률 밀도 함수(pdfs),

및

는 평균

및 분산에 의해 특성화된 로그-정규 분포 함수(normal distribution function)로서 모델링되었으며, 여기에서

는 바이오마커

에 대하여 측정된 RFU값의 로그(log)이고,

및

는 대조군과 질병 집단을 말한다. 10개의 바이오마커로 구성된 3개의 모델의 pdfs에 대한 파라미터를 표 31에 열거하였다.

이와 같은 모델에 대한 나이브 베이즈 분류는 하기의 식:

으로 주어지며, 여기에서

는 테스트에 적합한 집단에서의 질병의 유병율(prevalence)이고, 여기에서 n=10이다. 합계에서 각각의 항은 개개의 마커에 대한 로그-우도 비율이고, 질병을 가지는 것에 대한 관심 질병(즉, 이 경우에는 각각 3개의 서로 다른 암 형태로부터의 특정 질병)을 가지지 않는 샘플

의 총 로그-우도 비율은 이들 개개의 항목 플러스 질병의 유병율을 차지하는 항목의 단순한 합계이다. 간단하게 하기 위하여,

로 가정하였으므로

이다.

미지의 샘플 측정값을 9.5, 8.8, 7.8, 8.3, 9.4, 7.0, 7.9, 6.3, 7.7, 10.6의 각 10개의 바이오마커에 대한 로그(RFU)로 볼 때, 분류의 계산을 표 16에 기술하였다. 대조군 대 질병 클래스에 대한 로그 우도 비율을 포함하는 개개의 성분을 표로 만들었으며, 이것은 표 31 있는 파라미터 및

의 값으로부터 계산될 수 있다. 개개의 로그 우도 비율의 합계는 -3.326 또는 질병을 가지지 않을 가능성 대 질병을 가질 가능성은 28이고, 여기에서 우도(likelihood) e ^3.326 = 28이다. 단지 4개의 바이오마커 값만이 질병군과 더 일치할 가능성(로그 우도 > 0)을 가지지만, 나머지 6개의 바이오마커는 모두 일관적으로 대조군을 뒷받침하는 것으로 밝혀졌다. 우도를 함께 멀티플레잉하는 것은 상기에 나타낸 것과 같은 동일한 결과; 미지의 샘플이 질병을 가지지 않을 28의 가능성을 준다. 사실, 이 샘플은 비소세포 폐암 트레이닝 세트의 대조군 집단으로부터 유래된 것이다.

6.2 분류기를 위한 암 바이오마커 패널을 선별하기 위한 그리디 알고리즘

Part 1

표 1에 있는 바이오마커의 서브셋은 암을 검출하기 위한 일반적인 암 바이오마커로서 사용될 수 있는 마커를 측정하는데 사용될 수 있는 잠재적 분류기를 구성하기 위하여 선별되었다.

마커의 세트를 고려하여, 각각 3개의 암 연구에 대하여 별개의 모델을 트레이닝하였고, 수많은 서로 다른 형태의 암을 동시에 분류할 수 있는 바이오마커의 세트를 선별하기 위한 글로벌 척도(global measure)가 요구된다. 본원에서 사용된 분류기 성능의 척도는 모든 나이브 베이즈 분류기를 통틀어 ROC 곡선 아래 면적의 평균이다. ROC 곡선은 단일 분류기 진양성률(true positive rate)(민감도) 대 위양성률(false positive rate)(1-특이도)의 그래프이다. ROC 곡선 아래 면적은 0 내지 1.0의 범위이며, AUC가 1.0인 경우 완벽한 분류에 해당하고, 0.5의 AUC는 랜덤(동전 뒤집기) 분류기에 해당한다. 어느 것은 F-측정값(F-measure) 또는 민감도와 특이도의 합계 또는 민감도와 특이도의 결과와 같은 성능의 다른 일반적인 측정값을 적용할 수 있다. 보다 상세하게는, 어느 것은 약간의 민감도를 희생하여 높은 특이도로 수행하는 그런 분류기를 선택하거나 약간의 특이도를 희생하여 높은 민감도로 수행하는 그런 분류기를 선택하기 위하여, 서로 다른 영향력을 가지는 민감도와 특이도로 처리하는 것이 좋을 것이다. AUC는 단일 측정값으로 민감도와 특이도의 모든 조합을 포함하기 때문에 AUC를 사용하는 것을 택하였다. 서로 다른 적용은 진양성 및 진음성 결과물에 대한 서로 다른 이점을 가질 것이며, 또한 위음성 결과물로부터 위양성 결과물과 관련된 서로 다른 비용을 가질 것이다. 성능 측정값을 바꾸는 것은 주어진 일련의 데이터에 대하여 선택된 마커의 정밀한 서브셋을 변화시킬 것이다.

이 실시예의 섹션 6.2에 기술된 대조군 샘플로부터 암 샘플의 구별을 위한 베이지안 접근법을 위하여, 분류기는 각각 3개의 암 연구에서 바이오마커의 분포에 의해 완벽하게 파라미터화되며, 바이오마커의 리스트는 표 19로부터 선택된다. 다시 말해서, 포함을 위하여 선택된 마커의 서브셋은 주어진 일련의 트레이닝 데이터를 일대일(one-to-one) 방식으로 분류기를 결정하였다.

본원에서 사용된 그리디 방법은 표 1로부터 최적의 마커의 서브셋을 검색하는데 사용되었다. 적은 수의 마커 또는 상대적으로 소수의 마커를 가지는 분류기에 대하여, 마커의 모든 가능한 서브셋을 열거하고, 특정한 마커의 세트로 구성된 분류기의 성능에 관하여 평가하였다(실시예 4를 참조). (이 접근법은 통계학 분야에서 "최상의 서브셋 선택(best subset selection)"으로 잘 알려져 있다; Hastie, et al.,을 참조). 그러나, 본원에 기재된 분류기에 대하여, 다중 마커의 다수의 조합들은 매우 클 수 있고, 단지 30개의 총 분석물의 리스트로부터 생성될 수 있는 30,045,015개의 가능한 조합이 있기 때문에, 10개의 마커의 모든 가능한 세트를 평가하는 것은 가능하지 않다. 마커의 모든 서브셋을 통한 검색의 실행 불가능성 때문에, 단일 광학 서브셋은 발견되지 않을지도 모르지만, 이 접근법을 사용함으로써 많은 우수한 서브셋들이 발견되었고, 많은 경우에 있어서 임의의 이 서브셋들은 광학 서브셋을 나타낼 수 있다.

마커의 모든 가능한 세트를 평가하는 대신에, "그리디(greedy)" 전진 단계적 접근법(forward stepwise approach)이 수행될 수 있다(Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10); e1002. doi:10.1371/journal.pone.0001002를 참고). 이 방법을 사용하여, 분류기는 (개개의 마커에 대한 KS-거리에 기초하여) 최상의 단일 마커를 사용하여 시작되고, 현재 분류기에 있는 마커 세트의 일원이 아닌 마커 리스트의 각 일원을 차례로 시험해 보는 것에 의해 각 단계에서 발달된다. 현재 있는 분류기와 결합하여 최상의 스코어를 기록하는 마커를 분류기에 첨가하였다. 이것을 성능의 향상이 더 이상 이뤄지지 않을 때까지 반복하였다. 불행하게도, 이 접근법은 어떤 개개의 마커가 진행 중지 전에 모두 선택되는 것은 아닌 마커의 귀중한 조합을 놓칠 수 있다.

본원에서 사용된 그리디 방법은 각 단계에서 단일 마커 서브셋만을 보유하기보다는 검색을 넓힌다는 점에서, 선행하는 전진 단계적 접근법의 고심작이며, 후보 마커 세트의 리스트는 보존하였다. 상기 리스트는 단일 마커의 리스트와 함께 도입되었다. 이 리스트는 현재 리스트 상에 있는 것들로부터 새로운 마커 서브셋을 얻고, 그것들을 리스트에 첨가함으로써 단계를 확대하였다. 현재 리스트 상에 있는 각 마커 서브셋은 이미 그 분류기의 일부분이 아니고 서브셋에 대한 그것의 첨가에 따라 존재하는 서브셋을 중복하지 않을 표 1로부터의 임의의 마커를 추가하여 확장된다(이것들은 "허용가능 마커(permissible markers)"라 부른다). 매번 새로운 마커의 세트가 정의되고, 각 암 연구에 대한 것으로 구성된 분류기의 세트는 이들 마커를 사용하여 트레이닝 되며, 글로벌 성능을 3개의 연구 전체를 통틀어 평균 AUC를 통하여 측정하였다. 잠재적 오버 피팅을 피하기 위하여, 각 암 연구 모델에 대한 AUC를 10배의 교차 검증(cross validation) 과정을 통하여 계산하였다. 모든 현재 있는 마커 서브셋은 리스트로부터의 모든 허용가능 마커에 의해 확장된다. 명백하게는, 이와 같은 과정은 결국 모든 가능한 서브셋을 생성할 것이며, 리스트는 공간을 다 써버리게 될 것이다. 따라서, 생성된 모든 마커 세트는 리스트가 얼마간의 미리 결정된 크기보다 작은 동안만 유지된다. 일단 리스트가 미리 결정된 크기의 한계에 도달하면, 그것은 엘리트(elitist)가 된다; 즉, 단지 어느 정도 레벨의 성능을 보이는 분류기만이 리스트에 보존되고, 다른 것들은 리스트로부터 제외되어 삭제된다. 이것은 분류기 세트 성능 순으로 저장된 리스트를 보존함으로써 달성되고; 현재의 최저 수준미달의 배제에 초점을 맞추어, 분류기가 적어도 현재 리스트 상의 가장 나쁜 분류기만큼 글로벌하게 우수한 새로운 마커 세트가 삽입된다. 또 다른 실행의 상세한 내용은 리스트가 각 세대의 단계상에서 완벽하게 대체되므로, 리스트 상의 모든 마커 세트는 동일한 수의 마커 및 각 단계에서 하나에 의해 발생된 분류기 당 마커의 수를 가진다.

일 구현에서, 비-암으로부터 일반적인 암을 진단하기 위한 분류기를 구성하는데 유용한 바이오마커의 세트(또는 패널)은 분류 체계(classification scheme)에 사용된 바이오마커의 특정 조합에 대한 평균 AUC에 기초한다. 대조군으로부터 서로 다른 암 샘플을 효과적으로 분류할 수 있는 표 19에 있는 마커들로부터 유래된 바이오마커의 수많은 조합들을 확인하였다. 대표적인 패널들을 표 22-29에 제시하였으며, 이는 일련의 3-10 바이오마커의 100개의 서로 다른 패널을 제시하며, 각 패널에 대한 도시 평균(indicated mean) 교차 검증(cross validation, CV) AUC를 가진다. 이들 각 패널에서 각 마커의 발생의 총 수는 각 표의 하단에 나타내었다. 표 19에서 선택된 바이오마커들은 "비-마커(non-marker)"를 사용하여 확립된 분류기 보다 더 잘 성능하는 분류기를 만든다. 도 15에 다른 가능한 분류기의 성능과 비교하여 본 발명의 10개의 바이오마커 분류기의 성능을 나타내었다.

도 15a는 표 19에 있는 10개의 마커를 배제하고, 모든 3개의 연구들에 존재하는 23개의 전체 세트로부터 획득한 랜덤하게 샘플링된 10개의 “비-마커” 세트로부터 확립된 분류기에 대한 평균 AUC의 분포를 나타낸 것이다. 10개의 잠재적인 암 바이오마커의 성능은 수직의 점선으로 나타내었다. 이 그래프는 10개의 잠재적인 바이오마커의 성능이 다른 마커 조합의 분포를 훨씬 넘어선다는 것을 명백하게 보여준다.

도 15b는 도 15a와 유사한 분포를 나타내지만, 랜덤하게 샘플링된 세트는 10개의 분석물 분류기에 대한 그리디 바이오마커 선별 과정에 의해 선택되지 않은 표 1로부터의 49개의 바이오마커로 제한된다. 이 그래프는 그리디 알고리즘에 의해 선택된 10개의 마커가 나머지 49개의 바이오마커를 사용하여 확립된 분류기보다 훨씬 나은 다른 형태의 암으로 보편화하는 바이오마커의 서브셋을 나타냄을 보여준다.

마지막으로, 도 16은 각각의 3개의 암 연구 분류기에 대한 분류기 ROC 곡선을 나타낸다. 앞서 말한 구현 및 실시예들은 단지 예일 뿐이다. 어떠한 특정 구현, 실시예, 또는 특정 구현 또는 실시예의 구성요소도 임의의 청구항의 중요하고, 필수적이거나 필수 구성요소 또는 특징으로 구성되지 않는다. 게다가, 본원에 기재된 어떠한 구성요소들도 "필수적인(exxential)" 또는 "중요한(critical)"과 같이 특별히 기재되지 않는 한 첨부된 청구항의 실행에 필수적이지 않다. 첨부된 청구항에 의해 정의된 본 발명의 범위로부터 벗어나는 일 없이 기재된 구현에 대하여 다양한 변형, 변경, 치환 및 다른 변화가 일어날 수 있다. 도면 및 실시예를 포함하는 명세서는 제한이라기보다는 실례적인 수단으로 간주되며, 모든 그러한 변경 및 치환은 본 발명의 범위 내에 포함된다. 따라서, 본 발명의 범위는 상기에 주어진 실시예에 의해서가 아니라, 첨부된 청구항 및 그것의 법적 동등물에 의해 결정되어야 한다. 예를 들면, 임의의 방법(method or process)에 열거된 단계는 임의의 실행가능한 순서로 실행될 수 있으며, 임의의 구현, 실시예 또는 청구항에 있는 순서로 제한되지 않는다. 게다가, 임의의 앞서 언급한 방법에서, 표 1 또는 표 19의 하나 또는 그 이상의 바이오마커는 특히 개개의 바이오마커 또는 임의의 패널로부터의 바이오마커 중 하나로서 배제될 수 있다.

< 암 바이오마커 >

< 1개 바이오마커의 패널 >

< 2개 바이오마커의 패널 >

< 3개 바이오마커의 패널 >

< 4개 바이오마커의 패널 >

< 5개 바이오마커의 패널 >

< 6개 바이오마커의 패널 >

< 7개 바이오마커의 패널 >

< 8개의 바이오마커의 패널 >

< 9개 바이오마커의 패널 >

< 10개 바이오마커의 패널 >

< 바이오마커 패널에서 마커의 수 >

< 10개의 마커 분류기에서의 분석물 >

< 나이브 베이즈 분류기를 위한 트레이닝 세트로부터 얻어진 파라미터 >

< 바이오마커의 예시적 조합에 대한 AUC >

< 나이브 베이즈 분류기를 위한 트레이닝 세트로부터 얻어진 계산 >

< 트레이닝 세트의 임상학적 특성 >

< 10개의 바이오마커 분류기 단백질 >

< 일반적인 암의 바이오마커 >

< 1개 바이오마커의 패널 >

< 2개 바이오마커의 패널 >

< 3개 바이오마커의 패널 >

< 4개 바이오마커의 패널 >

< 5개 바이오마커의 패널 >

< 6개 바이오마커의 패널 >

< 7개 바이오마커의 패널 >

< 8개 바이오마커의 패널 >

< 9개 바이오마커의 패널 >

< 10개 바이오마커의 패널 >

< 바이오마커 패널에서 마커의 수 >

< 나이브 베이즈 분류기를 위한 암 데이터 세트로부터 얻어진 파라미터 >

< 나이브 베이즈 분류기를 위한 트레이닝 세트로부터 얻어진 계산 >

Claims (66)

1. 생물학적 샘플에서 하기 표 1로부터 선택된 N의 단백질 바이오마커 값을 측정하는 것을 포함하며, 상기 적어도 하나의 단백질 바이오마커는 카보닉 안하이드라아제 VI (carbonic anhydrase VI, CA6) 및 코르딘 유사 1(chordin-like 1, CHRLD1)로부터 선택되고, 상기 N의 바이오마커 값은 개인이 폐암을 가지고 있는지 아닌지에 대한 지표를 제공하고, 그리고 상기 N은 적어도 2인, 개인이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인지 여부를 진단하는데 사용되는 정보를 제공하는 시험관 내 방법:
   [표 1]
   

   
2. 생물학적 샘플에서 제1항의 표 1로부터 선택된 N의 단백질 바이오마커 값을 측정하는 것을 포함하며, 상기 적어도 하나의 단백질 바이오마커는 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase VI, CA6) 및 코르딘 유사 1(chordin-like 1, CHRLD1)로부터 선택되고, 상기 N의 바이오마커 값에 의해 개인이 폐암을 가지고 있는지 아닌지에 대한 지표를 제공하고, 그리고 상기 N은 적어도 2인, 개인이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)인지 아닌지의 가능성에 대한 지표를 제공하는 시험관 내 방법.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 각각의 바이오마커 값은 미리 결정된 값(predetermined level) 또는 미리 결정된 범위의 값에 기초하여 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전체 혈액(blood), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개인은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개인은 흡연자인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 개인은 폐 결절(pulmonary nodule)을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 N의 단백질 바이오마커 값은 0.80 또는 그보다 큰 AUC 값을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 개인에 대한 바이오마커 정보를 컴퓨터상에서 검색하는 단계로, 상기 바이오마커 정보는 제1항의 표 1로부터 선택된 N의 단백질 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하고, 상기 적어도 하나의 단백질 바이오마커는 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase VI, CA6) 및 코르딘 유사 1(chordin-like 1, CHRLD1)로부터 선택되고;
    컴퓨터를 사용하여 상기 각각의 바이오마커 값을 분류하는 단계; 및
    다수의 분류에 기초하여 상기 개인이 폐암일 가능성을 나타내는 단계;
    를 포함하고, 상기 N은 적어도 2인 것을 특징으로 하는, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)일 가능성을 나타내기 위한 컴퓨터에 의해 실행되는(computer-implemented) 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 개인이 폐암일 가능성을 나타내는 단계는 컴퓨터 디스플레이 상에 가능성을 나타내는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
13. 컴퓨팅 장치 또는 시스템의 프로세서에 의해 실행가능한 프로그램 코드을 포함하고, 상기 프로그램 코드는:
    개인으로부터의 생물학적 샘플에서 얻어진 데이터를 검색하는 코드로, 상기 데이터는 제1항의 표 1로부터 선택된 N의 단백질 바이오마커에 각각 대응하는 바이오마커 값을 포함하고, 상기 적어도 하나의 단백질 바이오마커는 카보닉 안하이드라아제(carbonic anhydrase VI, CA6) 및 코르딘 유사 1(chordin-like 1, CHRLD1)로부터 선택되고, 상기 바이오마커는 생물학적 샘플에서 검출되고; 그리고
    상기 바이오마커 값의 함수로써 개인의 폐암 상태를 나타내는 분류 방법을 실행하는 코드;
    를 포함하고, 상기 N은 적어도 2인 것을 특징으로 하는, 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)일 가능성을 나타내기 위한 컴퓨터 판독 가능한 매체.
14. 제13항에 있어서, 상기 분류 방법은 확률 밀도 함수를 사용하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
15. 제13항에 있어서, 상기 분류 방법은 두 개 또는 그 이상의 클래스를 사용하는 것을 특징으로 하는 컴퓨터 판독 가능한 매체.
16. 생물학적 샘플에서 제1항의 표 1로부터 선택된 N의 단백질 바이오마커 값을 측정하는 것을 포함하며, 상기 적어도 하나의 단백질 바이오마커는 카보닉 안하이드라아제 VI (carbonic anhydrase VI, CA6) 및 코르딘 유사 1(chordin-like 1, CHRLD1)로부터 선택되고, 상기 N의 바이오마커 값에 의해 개인이 폐암을 가지고 있는지 아닌지에 대한 지표를 제공하고, 그리고 상기 N은 적어도 2인, 개인이 비소세포 폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC)에 대한 무증상 고위험 개인을 진단하는데 사용되는 정보를 제공하는 시험관 내 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 각각의 바이오마커 값은 미리 결정된 값(predetermined level) 또는 미리 결정된 범위의 값에 기초하여 평가되는 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 전체 혈액(blood), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 생물학적 샘플은 혈청인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제16항에 있어서, 상기 개인은 인간인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제16항에 있어서, 상기 N은 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12인 것을 특징으로 하는 방법.
22. 제16항에 있어서, 상기 개인은 흡연자인 것을 특징으로 하는 방법.
23. 제16항에 있어서, 상기 개인은 폐 결절(pulmonary nodule)을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제1항, 제2항 및 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 바이오마커 값과 상기 개인에 해당하는 추가적인 생물의학 정보 중 적어도 하나의 항목에 기초하여, 상기 개인이 비소세포 폐암인지 진단하거나, 상기 개인이 비소세포 폐암일 가능성이 결정되는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제24항에 있어서,
    상기 추가적인 생물의학 정보 중 적어도 하나의 항목은
    (a) 상기 개인의 외형적 기술서(physical description)에 해당하는 정보,
    (b) 상기 개인에서의 폐의 이상의 방사선학적 기술서에 해당하는 정보,
    (c) 상기 개인에서의 폐 결절의 존재 여부에 해당하는 정보
    (d) 상기 개인에서의 폐 결절의 외형적 기술서에 해당하는 정보,
    (e) 상기 개인의 키 및/또는 체중 변화에 해당하는 정보,
    (f) 상기 개인의 민족성에 해당하는 정보,
    (g) 상기 개인의 성별에 해당하는 정보,
    (h) 상기 개인의 흡연력에 해당하는 정보,
    (i) 상기 개인에서의 환경적 흡연에 대한 노출 해당하는 정보,
    (j) 상기 개인에서의 음주력에 해당하는 정보,
    (k) 상기 개인의 직업 경력에 해당하는 정보,
    (l) 상기 개인에서의 폐암 또는 다른 암의 가족력에 해당하는 정보,
    (m) 상기 개인 또는 상기 개인의 가족 구성원에서의 폐암 또는 암의 높은 위험과 관련되는 적어도 하나의 유전적 마커의 상기 개인에서의 존재 여부에 해당하는 정보,
    (n) 상기 개인의 임상적 증상에 해당하는 정보,
    (o) 다른 실험실 테스트에 해당하는 정보,
    (p) 상기 개인의 유전자 발현값에 해당하는 정보, 및
    (q) 상기 개인의 공지된 발암물질에 대한 노출에 해당하는 정보
    로 이루어지는 군으로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
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