KR102078310B1 - 비소세포성 폐암 진단용 단백질 바이오마커 패널 및 이를 이용한 비소세포성 폐암 진단 방법 - Google Patents

비소세포성 폐암 진단용 단백질 바이오마커 패널 및 이를 이용한 비소세포성 폐암 진단 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 바이오마커를 포함하는 바이오마커 패널과 사람으로부터 폐암을 진단하기 위한 방법에 관한 것이다. 폐암을 진단하기 위한 방법들이 제공되며, 상기 방법은 표 2에 제공된 바이오마커들에서 선택된 적어도 하나의 바이오마커에 해당하는 적어도 하나의 바이오마커 값을 샘플에서 검출하는 단계를 구비하고, 상기 적어도 하나의 바이오마커 값에 기초하여, 상기 사람은 비소세포성 폐암을 가지고 있는 아시아인으로 분류되거나, 폐암을 가질 가능성을 결정한다.

Description

비소세포성 폐암 진단용 단백질 바이오마커 패널 및 이를 이용한 비소세포성 폐암 진단 방법
본 발명은 비소세포성 폐암 진단용 단백질 바이오마커 패널 및 이를 이용한 비소세포성 폐암 진단 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 줄기 세포 성장 인자 수용체(KIT)을 포함하는 바이오마커 단백질 중 N개의 단백질을 가지는, 사람으로부터 비소세포성 폐암을 진단하기 위한 단백질 바이오마커 패널에 관한 것이다.
하기 설명에서는 본 출원과 관련된 정보의 요약을 제공하며, 제공된 정보나 참조 문헌들이 본 출원의 종래 기술로 인정되지 않는다.
폐암은 한국 및 전 세계에서 여전히 암 관련 사망의 주요 원인이다 (Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, et al. (2015) Global cancer statistics, 2012, CA Cancer J Clin.). 2011년 한국에서, 21,753건을 초과하여 폐암이 신규 발병하였고 15,000 명을 초과하여 폐암으로 인해 사망하였다고 추정된다 (Jung KW, Won YJ, Kong HJ, Oh CM, Lee DH, et al. (2014) Cancer statistics in Korea: incidence, mortality, survival, and prevalence). 선진국에서는 폐암 발병률과 사망률이 감소하고 있지만, 흡연율이 지속적으로 증가하는 개발 도상국, 특히 아시아 국가들에서는 폐암 발병률과 사망률이 가파르게 증가하고 있다 (Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet-Tieulent J, et al. (2015) Global cancer statistics, 2012, CA Cancer J Clin.).
조기 폐암을 가진 대부분의 사람들은 증상이 나타나지 않기 때문에, 60%를 넘는 환자들은 치료 가능성이 없는 진행 단계에서 진단된다 (Jemal A, Center MM, DeSantis C, Ward EM (2010) Global patterns of cancer incidence and mortality rates and trends. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 19: 1893-1907; Jett JR (1993) Current Treatment of Unresectable Lung-Cancer. Mayo Clinic Proceedings 68: 603-611.). 폐암이 진행된 환자의 5년 생존율은 10% 미만이지만, 1기 환자의 5년 생존율은 70%를 초과할 수 있다 (Hoffman PC, Mauer AM, Vokes EE (2000) Lung cancer. Lancet 355: 479-485.). 따라서, 사망률 및 이환율 감소에 중요한 폐암의 조기 진단이라는 연구 목적이 폐암 검진법의 개발로 전환되었다.
전미 폐 검진 임상연구(National Lung Screening Trial (NLST)) (Aberle DR, Adams AM, Berg CD, Black WC, Clapp JD, et al. (2011) Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med 365: 395-409)에서는 저선량 CT(LDCT) 검진으로는 폐암 관련 사망률이 20% 감소함을 보이긴 하였으나, LDCT 검진의 24.2%는 양성이고 이들 결절의 96.4%는 오진으로 판단된다 (Aberle DR, Adams AM, Berg CD, Black WC, Clapp JD, et al. (2011), Reduced lung-cancer mortality with low-dose computed tomographic screening. N Engl J Med 365: 395-409.; Aberle DR, Abtin F, Brown K (2013) Computed Tomography Screening for Lung Cancer: Has It Finally Arrived? Implications of the National Lung Screening Trial. Journal of Clinical Oncology 31: 1002-1008.). 공격성 종양의 발견 외에, NLST에서 LDCT로 발견한 모든 폐암 중 18% 보다 많은 폐암이 무통증으로 보이며, LDCT에 의한 폐암 진단의 위험성을 기술할 때, 과도한 진단도 고려되어야 한다 (Patz EF, Jr., Pinsky P, Gatsonis C, Sicks JD, Kramer BS, et al. (2014) Overdiagnosis in low-dose computed tomography screening for lung cancer. JAMA Intern Med 174: 269-274).
따라서, 혈청처럼 비침습 방식으로 수집한 생물학적 표본에서 측정한, 민감도와 특이도를 가지는 폐암 바이오마커는 고위험 대상, 특히 CT를 통해 비결정성 폐결절이 발견된 환자들에 대해 임상적 결정을 내리는데 도움이 될 수 있다. 비소세포성 폐암(NSCLC)의 개별 혈청 바이오마커, 주로 사이토케라틴 19 단편 21.1 (Cyfra 21-1), 암배아 항원, 그리고 조직 펩타이드 항원에 대하여 공개된 데이터에 따르면, 이들 바이오마커는 특히 초기 병기의 질병에 제한된 민감도와 특이도를 보인다 (Pastor A, Menendez R, Cremades MJ, Pastor V, Llopis R, et al. (1997) Diagnostic value of SCC, CEA and CYFRA 21.1 in lung cancer: a Bayesian analysis. European Respiratory Journal 10: 603-609.; Buccheri G, Torchio P, Ferrigno D (2003) Clinical equivalence of two cytokeratin markers in non-small cell lung cancer - A study of tissue polypeptide antigen and cytokeratin 19 fragments. Chest 124: 622-632.; Lai RS, Hsu HK, Lu JY, Ger LP, Lai NS (1996) CYFRA 21-1 enzyme-linked immunosorbent assay. Evaluation as a tumor marker in non-small cell lung cancer. Chest 109: 995-1000.).
분자 진단법의 발전과 유전체학에 대한 이해로 인해, 현재의 검진 기준을 보완할 잠재력이 있는 몇 가지 폐암 바이오마커가 발견되었다 (Hasan N, Kumar R, Kavuru MS (2014) Lung cancer screening beyond low-dose computed tomography: the role of novel biomarkers. Lung 192: 639-648.; Bigbee WL, Gopalakrishnan V, Weissfeld JL, Wilson DO, Dacic S, et al. (2012) A multiplexed serum biomarker immunoassay panel discriminates clinical lung cancer patients from high-risk individuals found to be cancer-free by CT screening. J Thorac Oncol 7: 698-708.; Daly S, Rinewalt D, Fhied C, Basu S, Mahon B, et al. (2013) Development and validation of a plasma biomarker panel for discerning clinical significance of indeterminate pulmonary nodules. J Thorac Oncol 8: 31-36.; Gold L, Ayers D, Bertino J, Bock C, Bock A, et al. (2010) Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One 5: e15004.; Ostroff RM, Bigbee WL, Franklin W, Gold L, Mehan M, et al. (2010) Unlocking biomarker discovery: large scale application of aptamer proteomic technology for early detection of lung cancer. PLoS One 5: e15003.; Pecot CV, Li M, Zhang XJ, Rajanbabu R, Calitri C, et al. (2012) Added value of a serum proteomic signature in the diagnostic evaluation of lung nodules. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 21: 786-792.). Ostroff외 다수는 폐암 조기 진단을 위한 단백질 바이오마커 패널을 발견하였음을 보고한 바 있다 (Gold L, Ayers D, Bertino J, Bock C, Bock A, et al. (2010) Aptamer-based multiplexed proteomic technology for biomarker discovery. PLoS One 5: e15004.; Ostroff RM, Bigbee WL, Franklin W, Gold L, Mehan M, et al. (2010) Unlocking biomarker discovery: large scale application of aptamer proteomic technology for early detection of lung cancer. PLoS One 5: e15003.).
그러나, 폐암의 역학과 분자 생물학은 민족적 또는 지역적 배경에 따라 다르고, 단백질 바이오마커의 개발이나 CT 영상화 모델에의 통합도 이루어지지 않았다.
압타머(aptamer)는 새로운 생체 분자로서, 대단위 올리고(oligo) 라이브러리 풀로부터 선별된다. 일련의 SELEX 동작을 통해, 특이 리간드(ligand) 대상 압타머들을 확장하고 최종적으로 선정한다. 압타머는 화학적으로 합성 가능하고 다양한 목적을 위해 변형이 잘 되는 단일 가닥 핵산이다. 또한, 압타머는 중합 효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 방법에 의해 증폭하여 분석할 수 있고, 고용량 DNA 어레이 기술에 적용할 수도 있다.
압타머 기반 고용량 정량적 검정법은 질병 상태를 진단하기 위해 다변량 단백체 특징을 가려내기 위한 훌륭한 플랫폼으로 보고되고 증명되었다. 단일 플랫폼에서 천 개가 넘는 단백질을 동시에 측정할 수 있고, 이로써 질병 특이 단백체 특징을 찾아내기 위해 인체 샘플을 분석할 수 있는 기회를 갖게 된다.
본 발명은 사람에게서 비소세포성 폐암을 진단하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 비소세포성 폐암을 발견하기 위한 단백질 바이오마커 패널을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 목적은 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 목적들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기 기술적 과제를 해결하기 위하여, 본 발명의 일 실시예는 폐암, 특히 비소세포성 폐암을 진단하기 위한 단백질 바이오마커 패널을 제공한다. 본 발명의 일 실시예에서, 바이오마커들은 실시예들에서 상세히 설명하는 다중 압타머 기반 검정법을 이용하여 식별되었다. 본원에서 설명하는 상기 다중 압타머 기반 검정법을 이용함으로써, 본원은 비소세포성 폐암의 검출 및 진단에 유용한 비소세포성 폐암 바이오마커 리스트를 설명한다. 이들 바이오마커를 식별하기 위해, 과거에 비소세포성 폐암의 존부 여부를 진단받은 아시아인의 표본으로부터 소규모 셋의 후보 바이오마커 단백질들을 측정하였다. 각 바이오마커를 분석하고 환자군과 대조군을 구분해내는 성능을 서로 비교하여 표 2에 기재된 바와 같이 보다 나은 성능을 가진 소규모 셋의 바이오마커들을 선택하였다. 나이브 베이지안 정리(naive Bayesian theorem)에 따라, 실시예들에 상세히 설명한 바와 같이, 다변량 분류기를 생성하고 분석하였다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 일 실시예에 따른 사람에게서 폐암을 진단하기 위한 방법은
표 2에 기재된 바이오마커 단백질들 중 N개를 포함하는 바이오마커 패널을 제공하고, 상기 N은 적어도 2인 정수인 단계, 및 상기 패널의 N개의 바이오마커 단백질들과 각각 대응되는 바이오마커 값을 부여하기 위해, 사람으로부터 얻은 생물학적 샘플에서 상기 바이오마커 단백질들을 검출하는 단계를 포함하고, 상기 폐암은 상기 바이오마커 값들에 기초하여 진단됨을 특징으로 한다.
상기 바이오마커 값들을 검출하는 단계는 생체내 검정을 실시하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 생체내 검정은 상기 바이오마커 단백질 각각에 대응되는 하나의 포획 시약을 포함할 수 있고, 상기 방법은 압타머, 항체 및 핵산 프로브로 이루어지는 군에서 적어도 하나의 포획 시약을 선택하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 적어도 하나의 포획 시약은 압타머일 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈장 및 혈청으로 이루어지는 군에서 선택될 수 있다.
상기 생물학적 샘플은 혈청일 수 있다.
상기 사람은 아시아인일 수 있다.
상기 사람은 흡연자일 수 있다.
상기 사람은 악성 폐 결절을 가질 수 있다.
상기 N은 3, 4, 5, 6, 7 혹은 그 이상일 수 있다.
상기 바이오마커 값들은, 보체 성분 C9, 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase) 6 (CA6), C-반응성 단백질(CRP), 표피 성장 인자 수용체 1(EGFR1), 매트릭스 메탈로 프로티나아제 7(MMP7), 알파1-안티프로티아제(SERPINA3) 및 줄기 세포 성장 인자 수용체(KIT)의 측정값들일 수 있다.
상기 바이오마커 값들은, 실시간 PCR, 마이크로어레이 및 루미넥스 마이크로비드 검정법(Luminex microbead assay)으로 이루어지는 군으로부터 측정될 수 있다.
상기 폐암은 통계적인 방법으로 진단될 수 있다.
상기 통계적인 방법은 선형 판별 분석, 로지스틱 회귀 분석, 나이브 베이지안 분류, 지지 벡터 머신 및 랜덤 포레스트(random forest)로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다.
또한 본 발명의 목적을 달성하기 위한, 사람으로부터 비소세포성 폐암을 진단하기 위한 단백질 바이오마커 패널에 있어서, 상기 패널은 KIT를 포함하는 표2에 기재된 바이오마커 단백질들 중 N개의 바이오마커 단백질을 포함하고, N은 적어도 2임을 특징으로 한다.
상기 N은 3, 4, 5, 6, 7 혹은 그 이상일 수 있다.
상기 패널은 보체 성분 C9, 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase) 6 (CA6), C-반응성 단백질(CRP), 표피 성장 인자 수용체 1(EGFR1), 매트릭스 메탈로 프로티나아제 7(MMP7), 알파1-안티프로티아제(SERPINA3) 및 줄기 세포 성장 인자 수용체(KIT)의 측정값들을 가질 수 있다.
상기 사람은 아시아인일 수 있다.
상기 사람은 흡연자일 수 있다.
상기 사람은 악성 폐 결절을 가질 수 있다.
상기 단백질 바이오마커 패널은 비소세포성 폐암을 발견하기 위한 단백질 바이오마커 패널을 제공할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 것으로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 효과들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
도 1은 알고리즘 교육 및 확인을 위한 연구 흐름도이다.
도 2는 압타머 기반 다중 검정법을 도시한다.
도 3은 정규 누적 분포 함수(CDF)에 적합한 모델과 함께 미가공 데이터의 예를 도시한다.
도 4a 내지 4n은 환자-대조군간의 후보 마커를 비교한 도면이다.
도 5a 내지 5c는 7-마커 나이브 베이즈 분류기(na
Figure 112018024855063-pct00001
ive Bayes classifier)에 대한 ROC 곡선을 도시한다.
도 6a 내지 6g는 6-마커 나이브 베이즈 분류기에 대한 ROC 곡선을 도시한다.도 7a 및 7b는 7-마커 나이브 베이즈 분류기와 Cyfra 21-1의 성능을 비교한 도면이다.
대표적인 실시예를 참조하여 본 발명을 구체적으로 기술한다. 본 발명을 열거되는 실시예와 관련하여 설명하지만, 본 발명은 상기 실시예에 한정되지 않음을 이해할 것이다. 이에 반하여, 본 발명은 청구항에 의해 정의된 것과 같은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있는 모든 대안, 변경 및 동등물을 포함한다.
당업자들은 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법과 물질들은 본 발명의 범위 내에 포함될 수 있고 또한 포함됨을 알 수 있을 것이다. 본 발명은 기재된 방법들과 물질들에 결코 한정되지 않는다.
달리 정의하지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술분야에서 당업자들에게 일반적으로 통용되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본원에 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법, 장치 및 물질이 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있다 할지라도, 바람직한 방법, 장치 및 물질을 이제 기술한다.
본원에 인용된 모든 문헌, 공개 특허 문서 및 특허 출원들은 본원이 속하는 기술분야의 수준을 나타낸다. 본원에 인용된 모든 문헌, 공개 특허 문서 및 특허 출원들은 각각의 문헌, 공개 특허 문서 또는 특허 출원이 구체적이고 명확하게 참조에 의해 통합되는 것으로 나타난 정도와 동일한 정도로 참조에 의해 통합되어 있다.
첨부된 청구항을 포함하여 본원에서 사용되는, 단수 형태 "하나 ("a", an" 및 "the")"는 문맥상 달리 명확하게 지시되지 않는 한, 복수 표현을 포함하며, "적어도 하나(at least one)" 및 "하나 또는 그 이상(one or more)"과 혼용된다. 따라서, "압타머(an aptamer)"는 압타머의 혼합물을 포함하고, "프로브(a probe)"는 프로브의 혼합물을 포함한다.
본원에 사용된 용어 "약(about)"은 수치가 관련되어 있는 항목의 기본 기능이 변경되지 않는 정도의 미미한 수치의 변경 또는 변화를 나타낸다.
본원에 사용된 용어 "포함하다("comprises", "comprising", "includes", "including", "contains", "containing")" 및 이 용어의 변화형은, 어떤 요소나 요소 리스트를 포함하는 공정, 방법, 방법 한정 물건(product-by-process), 또는 물질의 조성이 단지 이들 요소 뿐만 아니라, 명확히 열거하지 않거나 그러한 공정, 방법, 방법 한정 물건, 또는 물질의 조성에 고유한 다른 요소들을 포함할 수 있는 비배타적인 포함(nonexclusive inclusion)을 망라한다.
일 실시예에서, 바이오마커 서브셋이나 바이오마커 패널에 유용한 바이오마커의 수는 특정 바이오마커 값 조합을 위한 민감도 및 특이도 값에 근거한다. 여기에서 “민감도” 및 “특이도”라는 용어는 생물학적 샘플에서 검출된 하나 혹은 그 이상의 바이오마커 값에 근거하여, 개인이 비소세포성 폐암을 가지고 있는지 아닌지를 정확히 알아내는 능력과 관련하여 사용된다. “민감도”는 비소세포성 폐암을 가지는 사람을 정확히 식별하는 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다. “특이도”는 비소세포성 폐암을 가지지 않는 사람을 정확히 식별하는 바이오마커(들)의 성능을 나타낸다.
본원은 바이오마커, 방법, 장치, 시약, 시스템 및 비소세포성 폐암과 암의 발견 및 진단을 위한 키트를 보다 일반적으로 포함한다.
여기에 사용되는 “폐(lung)”이라는 용어는 “허파(pulmonary)”라는 용어와 혼용될 수 있다.
여기에 사용되는 “흡연자”라는 용어는 담배 연기 흡입의 이력이 있는 개인을 이른다.
"생물학적 샘플(biological sample)", "샘플(sample)" 및 "시료(test sample)"는 개인으로부터 획득하거나 그 외 달리 도출된 물질, 생물학적 체액, 조직 또는 세포를 말하는 것으로, 본원에서 혼용된다. 이는 (전혈(whole blood), 백혈구(leukocytes), 말초혈액 단핵 세포(peripheral blood mononuclear cells), 백혈구 연층(buffy coat), 혈장(plasma) 및 혈청(serum)을 포함하는) 혈액, 객담(sputum), 눈물(tears), 점액(mucus), 세비액(nasal washes), 비강 흡인물(nasal aspirate), 호흡(breath), 소변(urine), 정액(semen), 침(saliva), 복막 세척액(peritoneal washing), 낭종액(cystic fluid), 양수(amniotic fluid), 선액(glandular fluid), 림프액(lymph fluid), 세포액(cytologic fluid), 복수(ascites), 흉수(pleural fluid), 유두 흡인물(nipple aspirate), 기관지 흡인물(bronchial aspirate), 기관지 찰과물(bronchial brushing), 활액(synovial fluid), 관절 흡인물(joint aspirate), 조직 분비물(organ secretions), 세포(cell), 세포 추출물(cell extract) 및 뇌척수액(cerebrospinal fluid)을 포함한다. 이는 또한 상기 열거한 것들에서 실험적으로 분리된 단편(fractions)을 포함한다. 예를 들어, 혈액 샘플은 혈청, 혈장 또는 적혈구 세포 또는 백혈구 세포와 같은 특정 형태의 혈액 세포를 포함하는 단편으로 분리될 수 있다. 원하는 경우, 샘플은 조직 샘플과 및 체액 샘플의 조합처럼, 개인의 샘플 조합일 수 있다. 상기 용어 "생물학적 샘플(biological sample)"은 또한 예를 들어, 대변 샘플, 조직 샘플 또는 조직 생검으로 부터의 샘플과 같은 균질화된 고체 물질을 포함하는 물질을 포함한다. 상기 용어 "생물학적 샘플"은 또한 조직 배양 또는 세포 배양으로부터 유래된 물질을 포함한다. 생물학적 샘플을 얻기 위한 적절한 방법이 사용될 수 있고; 대표적인 방법은 예를 들어, 채혈, 면봉법(예를 들어, 구강상피세포 면봉법) 및 세침 흡인 조직검사를 포함한다. 세침 흡인을 할만한 대표적인 조직은 림프절, 폐, 폐 세척액, BAL(기관지폐포 세척액, bronchoalveolar lavage), 갑상선, 유방 및 간(liver)을 포함한다. 샘플들은 또한 예를 들어, 미세절개(예를 들어, 레이저 포획 미세절개(laser capture microdissection; LCM) 또는 레이저 미세 절개(laser micro dissection; LMD)), 방광 세척, 도말(예를 들어, PAP 도말) 또는 유즙도관 세척법에 의해 수집될 수 있다. 개인으로부터 얻어지거나 유래되는 "생물학적 샘플"은 개인으로부터 얻은 후 적절한 방법으로 처리된 샘플을 포함한다.
또한, 생물학적 샘플은 다수의 사람으로부터 생물학적인 샘플들을 얻어서 그 샘플들을 풀(pool)로 만들거나 각 개인의 생물학적 샘플의 부분 표본을 풀로 만들어서 도출할 수 있음을 알아야 한다. 풀로 만든 샘플은 한 개인으로부터 나온 샘플로서 처리될 수 있고, 상기 풀로 만든 샘플에서 암의 존재가 확정되면 어느 개인(들)이 비소세포성 폐암을 가지고 있는지 결정하기 위해 개별적인 생물학적 샘플을 다시 테스트할 수 있다.
본 명세서의 목적을 위해, "개인의 생물학적 샘플에 기인한 데이터"라는 문구는 상기 데이터가 개인의 생물학적인 샘플에서 유래된 어떤 형식의 데이터이거나 생물학적인 샘플을 이용하여 생성한 데이터임을 의미한다. 상기 데이터는 생성 후, 어느 한 측정 방식의 단위에서 다른 측정 방식의 단위로 변환하는 것처럼, 어느 정도 리포맷, 수정, 또는 수학적으로 변경된 것일 수 있다. 그러나 상기 데이터는 생물학적 샘플로부터 유래되거나 생물학적 샘플을 이용하여 생성된 것으로 이해된다.
"표적(target)", "표적 분자(target molecule)" 및 "분석물(analyte)"은 생물학적 샘플에 존재할 수 있는 임의의 관심 분자를 지칭하기 위하여 본원에서 혼용된다. "관심 분자(molecule of interest)"는, 예를 들어, 단백질의 경우에 아미노산 서열에서의 경미한 변화, 이황화 결합 형성(disulfide bond formation), 글리코실화(glycosylation), 지질화(lipidation), 아세틸화(acetylation), 인산화(phosphorylation), 또는 분자의 본질을 실질적으로 변경시키지 않는 표지 성분(labeling component)과의 결합과 같은 기타 다른 조작(manipulation) 또는 변경(modification) 등의 특정 분자의 경미한 변화(minor variation)를 포함한다. "표적 분자", "표적" 또는 "분석물"은 하나의 형태 또는 종류의 분자 또는 다중-분자 구조의 복제 세트이다. "표적 분자들", "표적들" 및 "분석물들"은 하나 이상의 이러한 분자들의 세트를 말한다. 표적 분자의 예에는 단백질(proteins), 폴리펩티드(polypeptides), 핵산(nucleic acids), 탄수화물(carbohydrates), 지질(lipids), 다당류(polysaccharides), 당단백(glycoproteins), 호르몬(hormones), 수용체(receptors), 항원(antigens), 항체(antibodies), 애피바디(affibodies), 자기항체(autoantibodies), 항체 모방체(antibody mimics), 바이러스(viruses), 병원체(pathogens), 독성 물질(toxic substances), 기질(substrates), 대사물질(metabolites), 전이상태 유사체(transition state analogs), 보조인자(cofactors), 억제제(inhibitors), 약물(drugs), 염료(dyes), 영양분(nutrients), 성장 인자(growth factors), 세포(cells), 조직(tissues) 및 상기 열거한 것들의 단편 또는 부분을 포함한다.
본원에 사용된 "폴리펩티드(polypeptide)", "펩티드(peptide)" 및 "단백질(protein)은 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 지칭하기 위하여 본원에서 혼용된다. 상기 폴리머는 선형 또는 분기형일 수 있고, 변경된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비아미노산(non-amino acid)에 의해 절단될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 또는 인위적으로; 예를 들어, 이황화 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 표지 성분과의 결합과 같이, 기타 다른 조작 또는 변경에 의하여 변경된 아미노산 폴리머를 포함한다. 상기 용어의 정의에는 또한, 예를 들어, (예를 들어, 비천연 아미노산 등을 포함하는) 하나 또는 그 이상의 아미노산의 유사체뿐만 아니라 당업계에 공지된 다른 변경들을 포함하는 폴리펩티드가 포함된다. 폴리펩티드는 단일 사슬 또는 연결된 사슬일 수 있다. 단백질 전구체(preprotein) 또는 완전한 성숙 단백질(intact mature protein); 성숙 단백질로부터 유래된 펩티드 또는 폴리펩티드; 단백질의 단편; 스플라이스 변이체(splice variant); 단백질의 재조합 형태; 아미노산 변경, 결실 또는 치환을 가지는 단백질 변이체; 소화물(digests); 및 글리코실화, 아세틸화, 인산화 등과 같은 전사 후 변경(post-translational modification) 또한 상기 정의 내에 포함된다.
본원에 사용된 "마커(marker)" 및 "바이오마커(biomarker)"는 개인에서 정상 또는 비정상적 진행의 표시 또는 개인에서 질병 또는 다른 상태의 표시이거나 그것을 나타내는 표적 분자를 지칭하기 위하여 혼용된다. 더욱 상세하게는, "마커" 또는 "바이오마커"는 정상 또는 비정상, 그리고 비정상이라면 만성 또는 급성의 특정 생리학적 상태 또는 진행의 존재와 관련된 해부적, 생리학적, 생화학적 또는 분자학적 파라미터이다. 바이오마커는 실험실 검정법 및 의료적 영상화를 포함하는 다양한 방법에 의하여 검출 및 측정 가능하다. 바이오마커가 단백질인 경우, 바이오마커나 상기 바이오마커의 발현을 제어하는 단백질을 암호화하는 유전자의 생물학적 샘플 또는 메틸화 상태에서, 해당 유전자의 발현을 해당 단백질 바이오마커의 양 또는 존재 여부에 대한 대리 지표(surrogate measure)로서 사용 가능하다.
본원에 사용된 "바이오마커 값(biomarker value)", "값(value)", "바이오마커 레벨(biomarker level)" 및 "레벨(level)"은 생물학적 샘플에서 바이오마커를 검출하기 위한 임의의 분석 방법을 사용하여 측정되고 또한 상기 생물학적 샘플에서 바이오마커의, 바이오마커를 위한, 또는 바이오마커에 대응하는 존재, 부재, 절대적인 양 또는 농도, 상대적인 양 또는 농도, 역가(titer), 레벨(level), 발현 레벨, 측정된 레벨의 비율 등을 나타내는 측정값을 지칭하기 위하여 혼용된다. "값" 또는 "레벨"의 정확한 특성은 바이오마커를 검출하는 데 사용된 특정 분석 방법의 특정 설계 및 성분에 의존한다.
바이오마커가 개인에서의 비정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태를 나타내거나 그것의 표시이면, 그 바이오마커는 일반적으로 개인에서의 정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태의 부재를 나타내거나 그것의 표시인 바이오마커의 발현 레벨 또는 값과 비교하여, 과대 발현(over-expressed) 또는 과소 발현 (under expressed) 중 하나로 표현된다. "상향 조절(up-regulation)", "상향 조절된(up-regulated)", "과대 발현(over-expression)", "과대 발현된(over-expressed)" 및 이 표현들의 변화형은, 건강한 또는 정상적인 개인의 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더 큰 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 지칭하기 위하여 혼용된다. 상기 용어들은 또한 특정 질병의 서로 다른 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더 큰 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 지칭할 수 있다
"하향 조절(down-regulation), "하향 조절된(down-regulated)", "과소 발현 (under-expression)", "과소 발현된(under-expressed)" 및 이 표현들의 변화형은, 건강한 또는 정상적인 개인의 유사한 생물학적 샘플에서 전형적으로 검출되는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더 작은 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 지칭하기 위하여 혼용된다. 상기 용어들은 또한 특정 질병의 서로 다른 단계에서 검출될 수 있는 바이오마커의 값 또는 레벨(또는 값 또는 레벨의 범위)보다 더 작은 생물학적 샘플에서의 바이오마커 값 또는 레벨을 지칭할 수 있다.
또한, 과대 발현되거나 과소 발현된 바이오마커는 개인에서 정상적인 진행 또는 질병 또는 다른 상태의 부재의 표시이거나 그것을 나타내는 바이오마커의 "정상적인" 발현 레벨 또는 값과 비교하여, "차별적으로 발현(differentially expressed)"되거나 "차별적인 레벨(differential level)" 또는 "차별적인 값(differential value)"을 가지는 것으로 말할 수 있다. 따라서, 바이오마커의 "차별적인 발현"은 바이오마커의 "정상적인" 발현 레벨의 변화로도 표현될 수 있다.
"차별적인 유전자 발현(differential gene expression)" 및 "차별적인 발현(differential expression)"이라는 용어는 정상 대상이나 대조 대상에서의 발현에 비해, 특정 질병을 가지는 대상에게서 더 높거나 낮은 레벨로 발현이 활성화되는 유전자(또는 이에 대응하는 단백질 발현 산물)를 지칭하기 위하여 혼용된다. 상기 용어는 또한 동일한 질병의 서로 다른 단계에서 높은 레벨이나 낮은 레벨로 발현이 활성화되는 유전자(또는 이에 대응하는 단백질 발현 산물)를 포함한다. 상기 용어는 또한 차별적으로 발현된 유전자가 핵산 레벨 또는 단백질 레벨에서 활성화되거나 억제될 수 있거나, 서로 다른 폴리펩티드 산물을 만들어내는 선택적 스플라이싱(alternative splicing)이 될 수 있다. 이러한 차이점들은 폴리펩티드의 mRNA 레벨, 표면 발현, 분비 또는 분할(partitioning) 등의 다양한 변화를 통해 명확해질 수 있다. 차별적인 유전자 발현은 두 개 또는 그 이상의 유전자 또는 그것들의 유전자 산물 간의 발현의 비교; 또는 두 개 또는 그 이상의 유전자 또는 그것들의 유전자 산물 간의 발현 비율의 비교; 또는 오히려 정상 피험자와 질병이 있는 피험자 사이 또는 동일한 질병의 다양한 단계 사이에서 상이한, 동일 유전자의 다르게 처리된 두 개의 산물의 비교를 포함할 수 있다. 차별적인 발현은 예를 들어, 정상 및 병든 세포, 또는 서로 다른 질병 사건 또는 질병 단계를 겪은 세포들 사이에서의 유전자 또는 그것의 발현 산물에서 시간에 따른 또는 세포적 발현 패턴에서의 정량적 차이와 정성적 차이 모두를 포함한다.
"진단하다(diagnose)", "진단하는 것(diagnosing)", "진단(diagnosis)" 및 이 용어들의 변화형은 개인에게 관련된 하나 또는 그 이상의 징후, 증상, 데이터 또는 그 외 정보에 기초하여, 개인의 건강 상태 또는 상황의 발견, 판단 또는 인지를 말한다. 개인의 건강 상태는 건강한/정상(즉, 질병 또는 질환 부재)으로 진단되거나, 건강이 나쁜/비정상(즉, 질병 또는 질환의 존재 또는 특성의 평가)으로 진단될 수 있다. 상기 용어 "진단하다", "진단하는 것", "진단" 등은 특정 질병 또는 질환과 관련하여, 질병의 조기 발견; 질병의 특성 또는 분류; 질병의 진행, 치유, 또는 재발의 발견; 개인의 처치 또는 치료 후 질병에 대한 반응의 발견을 포함한다. 비소세포성 폐암의 진단은 암이 없는 개인과 암이 있는 개인의 구별을 포함한다. 또한 이는 비소세포성 폐암과 흡연자와 양성 폐 결절의 구별을 포함한다.
"예후를 예측하다(prognose)", "예후를 예측하는 것(prognosing)", "예후 예측(prognosis)" 및 이 용어들의 변화형은 질병 또는 질환이 있는 개인에서 질병 또는 질환의 진행 예측(예를 들어, 환자 생존율을 예측하는 것)을 말하며, 이러한 용어는 개인에 대한 처치 또는 치료 후 질병 반응의 평가를 포함한다.
"평가하다(evaluate)", "평가하는 것(evaluating)', "평가(evaluation)" 및 이 용어들의 변화형은 "진단하다(diagnose)" 및 "예후를 예측하다(prognose)" 모두를 포함하며, 또한 질병이 없는 개인에게서 질병 또는 질환의 진행에 대한 판단 또는 예측뿐만 아니라, 질병이 분명히 치료된 개인에서의 질병 및 질환이 재발할 가능성에 관한 판단 또는 예측을 포함한다. 상기 용어 "평가하다"는 또한 예를 들어, 개인이 치료제에 대하여 순조롭게 반응할 것인지 아니면 치료제에 대하여 반응하지 않을 것인지(또는, 예를 들어, 독성을 경험하거나 다른 바람직하지 않은 부작용을 경험할 것인지)를 예측하는 것, 개인에게 투여할 치료제를 선택하는 것 또는 개인에 대하여 시행된 치료에 대한 개인의 반응을 관찰하거나 발견하는 것과 같이, 치료에 대한 개인의 반응 평가를 포함한다. 따라서, 비소세포성 폐암을 "평가하는 것"은 예를 들어, 개인에게서 비소세포성 폐암의 진행 과정을 예측하는 것; 비소세포성 폐암이 분명히 치료된 환자에게서 비소세포상 폐암의 재발을 예측하는 것; 또는 비소세포성 폐암 치료에 대한 개인의 반응을 판단하거나 예측하는 것 또는 개인의 생물학적 샘플로부터 도출된 바이오마커 값의 측정에 기초하여 개인을 위한 비소세포성 폐암 치료법을 선택하는 것을 포함할 수 있다.
하기의 예들은 비소세포성 폐암의 "진단" 또는 "평가": 비소세포성 폐암의 존부를 조기 검출; 비소세포성 폐암의 특정 단계, 유형 또는 하위 유형, 또는 그 외의 분류 또는 특성을 판단; 의심스런 폐 결절 또는 종양이 양성 또는 악성 비소세포성 폐암인지 판단; 또는 비소세포성 폐암의 진행(예를 들어, 종양의 성장 또는 전이 속도 관찰), 차도 또는 재발의 발견/관찰로 지칭될 수 있다.
본원에 사용된 "추가적인 생체의학 정보(additional biomedical information)"는 본원에 기재된 바이오마커의 사용을 제외하고, 암 위험도 또는 보다 구체적으로 비소세포성 폐암 위험도에 관련된 하나 또는 그 이상의 개인의 평가물을 말한다. "추가적인 생체의학 정보"는 개인의 외형, CT 영상에서 발견된 폐 결절의 외형, 개인의 키 및/또는 체중, 개인의 성별, 개인의 민족성, 흡연력, 직업 경력, 공지된 발암물질에 대한 노출(예를 들어, 석면, 라돈 가스, 화학 물질, 화재에 의한 연기, 및 산업/공장 또는 자동차/선박/항공기 배출물과 같이, 정체되거나 움직이는 소스로부터의 방출물을 포함할 수 있는 공기 오염), 간접 흡연에 대한 노출, 비소세포성 폐암(또는 다른 암)의 가족력, 폐 결절의 존재, 결절의 크기, 결절의 위치, 결절의 형태(예를 들어, CT 영상에서 발견된 결절, 간 유리 음영(ground glass opacity; GGO), 고형, 비고형, 결절의 경계면 특성(예를 들어, 평활(smooth), 분엽상(lobulated), 명료(sharp and clear), 침상(spiculated), 침윤(infiltrating)) 등을 포함한다. 흡연력은 주로 담배를 피운 년 수 곱하기 하루에 피운 평균 담배갑의 수를 말하는 "갑년(pack years)"의 관점으로 정량화된다. 예를 들면, 평균적으로 35년간 하루 1갑의 담배를 피운 사람은 35갑년의 흡연력을 가지는 것으로 표현된다. 추가적인 생체의학 정보는, 공지의 일반 기술을 이용하여 개인으로부터 획득할 수 있다. 예를 들면, 일상 문진 또는 건강력 문진 등을 통해, 개인과 또는 의료 종사자부터 추가적인 생체의학 정보를 얻을 수 있다. 대안으로, 추가적인 생체의학 정보는 CT 영상(예를 들어, 저선량 CT 영상) 및 X-레이를 포함하는 일반적인 영상 기술로부터 얻을 수 있다. 추가적인 생체의학적 정보의 평가와 바이오마커 레벨의 테스트를 결합하면, 예를 들어 바이오마커 테스트를 단독 실시하거나 추가적인 생체의학 정보 중 어느 특정 항목을 단독 평가하는 것(예를 들어, CT 영상 단독)에 비하여, 비소세포성 폐암(또는 다른 비소세포성 폐암 관련 용도) 검출에 대한 민감도, 특이도 및/또는 AUC를 향상시킬 수 있다.
"곡선 아래 영역(area under the curve)" 또는 "AUC"는 당업계에 모두 잘 알려져 있는 수용자 반응 특성(receiver operating characteristic curve; ROC) 곡선의 아래 영역을 말한다. AUC 측정은 전체 데이터 범위에 걸쳐 분류기의 정확성을 비교하는데 유용하다. 보다 큰 AUC를 가지는 분류기는 두 개의 관심군(예를 들어, 비소세포성 폐암 샘플 및 정상 또는 대조 샘플) 간에 미지의 것을 정확하게 분류하는 능력이 더 크다. ROC 곡선은, 두 개의 집단(예를 들어, 비소세포성 폐암을 가진 군과 비소세포 폐암이 아닌 대조군) 을 구별함에 있어서, 특정한 특성(예를 들어, 본원에 기재된 바이오마커 및/또는 추가적인 생체의학 정보의 임의의 항목)의 성능을 그래프로 표현하는데 유용하다. 일반적으로, 전체 집단(예를 들어, 환자군 및 대조군)에 걸친 상기 특성 데이터는 단일 특성 값에 기초하여 오름 차순으로 정리된다. 그 후, 상기 특성에 대한 각각의 값에 대하여, 데이터에 대한 진양성율(true positive rate) 및 위양성율(false positive rate)이 계산된다. 상기 진양성율은 그 특성에 대한 값 이상의 케이스의 숫자를 계산한 후 총 케이스의 수로 나눔으로써 측정된다. 상기 위양성율은 그 특성에 대한 값 이상의 대조군의 숫자를 계산한 후 총 대조군의 수로 나눔으로써 측정된다. 비록 이 정의는 대조군에 비해 환자군에서 특성이 높아지는 시나리오를 말하지만, 이 정의는 또한 그 특성이 대조군과 비교하여 환자군에서 낮은 시나리오에도 적용된다(이 시나리오에서, 상기 특성에 대한 값보다 낮은 샘플의 수를 계산할 수 있다). ROC 곡선은 기타 다른 단일 산출뿐만 아니라 단일 특성에 대하여 생성될 수 있고, 단일 합계 값(single sum value)을 제공하기 위하여, 예를 들어 두 개 또는 그 이상의 특성을 (예를 들어, 더하고, 빼고, 곱하는 등) 수학적으로 조합할 수 있으며, 이 단일 합계 값은 ROC 곡선으로 나타낼 수 있다. 부가적으로, 단일 산출값이 도출되는 다중 특성의 조합을 ROC 곡선으로 그릴 수 있다. 이들 특성 조합은 테스트를 구성할 수 있다. 상기 ROC 곡선은 테스트의 위양성율(1-특이도)에 대한 테스트의 진양성율(민감도)을 나타내는 그래프이다.
본원에 사용된, 바이오마커 값에 대한 "검출(detecting)" 또는 "측정(determining)"은 바이오마커 값에 대응하는 신호를 발견하고 기록하는데 필요한 기구 및 그 신호를 생성하는데 필요한 물질(들) 모두의 사용을 포함한다. 다양한 실시예에서, 상기 바이오마커 값은 형광(fluorescence), 화학발광(chemiluminescence), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance), 표면 탄성파(surface acoustic waves), 질량 분석법(mass spectrometry), 적외선 분광법(infrared spectroscopy), 라만 분광법(raman spectroscopy), 원자 현미경(atomic force microscopy), 주사 터널링 현미경(scanning tunneling microscopy), 전기화학 검출법(electrochemical detection methods), 핵 자기 공명(nuclear magnetic resonance), 양자점(quantum dots) 등을 포함하는 방법들 중 임의의 적절한 방법을 이용하여 검출된다.
본원에서 "고체 지지체(solid support)"는 분자가 공유결합 또는 비공유결합 중 하나를 통하여 직접 또는 간접적으로 부착될 수 있는 표면을 가지는 임의의 기질을 말한다. "고체 지지체"는, 예를 들어, 막(membrane); 칩(chip)(예를 들어, 단백질 칩); 슬라이드(slide)(예를 들어, 유리 슬라이드 또는 커버 슬립); 컬럼; 속이 빈 형태, 고체, 반고체, 예를 들어 비드(bead)와 같은 세공(pore) 또는 공동(cavity)을 가지는 입자; 겔; 광섬유 물질을 포함하는 섬유; 매트릭스; 및 샘플 용기(receptacle)를 포함할 수 있는 다양한 물리적 형태를 가질 수 있다. 샘플 용기의 예로는 샘플 웰, 튜브, 모세관, 바이알 및 샘플을 고정할 수 있는 임의의 다른 관, 홈, 또는 굴곡이 포함된다. 샘플 용기는 마이크로타이터 플레이트(microtiter plate), 슬라이드, 미세유동 장치 등과 같은 다중-샘플 플랫폼 상에 위치할 수 있다. 지지체는 천연 또는 합성 물질, 유기 또는 무기 물질로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 시약을 포획하는 고체 지지체의 조성은 부착 방법(예를 들어, 공유 부착(covalent attachment))에 의존한다. 상기 용기의 다른 예로는, 내부에서 검정 및 관련 조작이 일어날 수 있는 미세액적(microdroplet) 및 미세유체(microfluid)가 조절되거나 벌크 형태의 오일/수성 유제가 포함된다. 적절한 고체 지지체는, 예를 들어, 플라스틱, 레진, 다당류, 실리카 또는 실리카 기반 물질, 기능성 유리, 개질 실리콘, 탄소, 금속, 무기 유리, 막, 나일론, (예를 들어, 실크, 울 및 코튼과 같은) 천연 섬유, 폴리머 등을 포함한다. 상기 물질은, 예를 들어, 포획 시약을 부착하기 위해 사용하는 카르복시(carboxy), 아미노(amino) 또는 하이드록실(hydroxyl)기와 같은 반응성 기를 포함할 수 있는 고체 지지체로 구성된다. 고분자성 고체 지지체는, 예를 들어, 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌 글리콜 테트라프탈레이트(polyethylene glycol tetraphthalate), 폴리비닐 아세테이트(polyvinyl acetate), 폴리비닐 클로라이드(polyvinyl chloride), 폴리비닐 피롤리돈(polyvinyl pyrrolidone), 폴리아크릴로니트릴(polyacrylonitrile), 폴리메틸 메타크릴레이트(polymethyl methacrylate), 폴리테트라플루오로에틸렌(polytetrafluoroethylene), 부틸 고무(butyl rubber), 스티렌부타디엔 고무(styrenebutadiene rubber), 천연 고무(natural rubber), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리프로필렌(polypropylene), (폴리)테트라플루오로에틸렌((poly)tetrafluoroethylene), (폴리)비닐리덴플루오라이드((poly)vinylidenefluoride), 폴리카보네이트(polycarbonate) 및 폴리메틸펜텐(polymethylpentene)을 포함할 수 있다. 사용가능한 적절한 고체 지지체 입자는 예를 들어, 루미넥스®-타입 인코딩된 입자(Luminex®-type encoded particles), 자성 입자(magnetic particles) 및 유리 입자(glass particles)와 같은 인코딩된 입자(encoded particles)를 포함한다.
바이오마커의 예시적 용도
다양한 예시적 실시예에서, 본원에서 기술하는 분석 방법들 중 하나를 포함하는 임의의 개수의 분석 방법에 의해, 혈청이나 혈장과 같이, 개인의 순환계에 존재하는 하나 혹은 그 이상의 바이오마커에 해당하는 하나 혹은 그 이상의 바이오마커 값을 검출하여 사람(개인)에게서 비소세포성 폐암을 진단하기 위한 방법들을 제공한다. 이들 바이오마커는, 이를테면, 비소세포성 폐암이 없는 사람에 비해 비소세포성 폐암이 있는 사람에게서 차별적으로 발현된다. 개인에게서 바이오마커의 차별적 발현의 발견은, 예를 들면, 비소세포성 폐암의 조기 진단, 양성 폐결절과 악성 폐결절간의 구분 (예를 들면 CT 영상 관찰되는 결절), 비소세포성 폐암 재발의 관찰, 또는 그 외 임상적 징후 관찰을 위해 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바이오마커는 다양한 임상적 비소세포성 폐암 징후에 사용될 수 있으며 다음을 포함한다: (고위험 개인이나 집단에서) 비소세포성 폐암 발견; 이를테면, 비소세포성 폐암과 소세포성 폐암의 구별 및/또는 선암과 편평상피암간의 구별을 통해 (또는 조직 병리를 용이하게 하여), 비소세포성 폐암의 특성 규정 (예를 들면, 비소세포성 폐암 유형, 하위 유형, 또는 병기 결정); 폐 결절이 양성 결절인지 악성 폐암인지 결정; 비소세포성 폐암의 예후 결정; 비소세포성 폐암의 진행 또는 차도 관찰; 비소세포성 폐암 재발 관찰; 전이 관찰; 치료법 선정; 치료제나 다른 치료법에 대한 반응 관찰; CT 검진을 위한 환자 분류 (예를 들면, 비소세포성 폐암 위험도가 높아 나선형 CT 검진이 가장 큰 도움이 될 사람들을 식별하여 CT의 양성 예측도를 증가시킴); 흡연 이력 등과 결절 사이즈 결합과 같이, 바이오마커 테스트와 추가적인 생체의학 정보의 결합 (예를 들면, CT 테스트나 바이오마커 테스트를 단독 실시 하는 경우에 비해, 진단 성능이 향상된 분석 시험 제공); 폐 결절의 악성 혹은 양성으로의 진단을 용이하게 함; 일단 CT에서 폐 결절이 관찰되면 임상적 의사 결정을 용이하게 함 (예를 들면, 결절 크기와 상관없이 바이오마커에 따른 테스트가 음성인 경우처럼, 결절의 위험도가 낮다고 판단되면, CT 검진을 반복하도록 오더를 내리거나, 결절의 크기와 상관없이 바이오마커에 따른 테스트가 양성인 경우처럼, 결절의 위험도가 높다고 판단되면, 생검을 고려하는 것); 및 (예를 들면, CT상에서 비석회화 결절이 관찰된 후, CT 검진, 결절 절제, 또는 흉부절개술을 반복 실시할 지와 같이) 임상적인 팔로우-업에 대한 의사 결정을 용이하게 하는 것. 바이오마커 테스트는 고위험 개인에 대한 CT 또는 흉부 X레이만 실시할 경우 보다 양성 예측도를 개선할 수 있다. 본원에서 설명하는 바이오마커는 CT 검진과 함께 사용될 경우에 유용성을 가질 뿐만 아니라, 흉부 X레이, 기관지 내시경, 형광 기관지 내시경, MRI 또는 PET 검진과 같이, 그 외 비소세포성 폐암을 위해 이용되는 영상 방식과 연계해서 사용될 수 있다. 또한, 비소세포성 폐암의 징후를 영상 방식이나 그 외 다른 임상적 관련 요인에 의해 발견하기 전, 또는 증상이 나타나기 전에, 이러한 용도 중 특정 용도를 위해 상기 설명한 바이오마커가 유용하게 사용될 수 있다. 여기에는 CT 검진이나 다른 영상 방식에 의해 관찰된 비결정성 폐 결절을 가진 개인의 구별하고, 비소세포성 폐암에 대한 고위험 흡연자 식별 및 비소세포성 폐암에 걸린 개인의 진단을 더 포함한다.
비소세포성 폐암 진단에 본원에 설명한 바이오마커를 사용할 수 있는 방식의 일 예로서, 비소세포성 폐암이 있는지 모르는 개인에게서 상기 기술한 바이오마커 하나 혹은 그 이상의 차별적 발현은 그 개인이 비소세포성 폐암을 가지고 있음을 나타낼 수 있고, 이로써, 치료가 가장 효과적인 초기에, 아마도 다른 수단에 의해 비소세포성 폐암을 발견하거나 비소세포성 폐암의 증상이 나타나기 전에 비소세포성 폐암을 발견할 수 있다. 비소세포성 폐암 진행 중, 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 과다 발현은 비소세포성 폐암이 진행중임, 예를 들면 비소세포성 폐암의 종양의 성장 및/또는 전이(따라서 예후가 좋지 않음)를 나타낼 수 있고, 다른 한편으로 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 정도의 감소는(즉, 후속 바이오마커 테스트에서, 환자 개인이 "정상" 발현 레벨을 향하거나 근접하는 경우는) 비소세포성 폐암에 대한 차도가 있음, 예를 들면 비소세포성 폐암의 종양의 크기가 줄어들고 있음(따라서 예후가 좋거나 더 좋아짐)을 나타낼 수 있다. 마찬가지로, 비소세포성 폐암 치료 과정에서, 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 정도의 증가(즉, 후속 바이오마커 테스트에서, 환자 개인이 "정상" 발현 레벨에서 멀어지는 경우)는 비소세포성 폐암이 진행되어 치료가 효과적이지 않음을 나타낼 수 있고, 반면 비소세포성 폐암 치료 과정에서, 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 정도의 감소는 비소세포성 폐암에 대한 차도가 있어 치료가 성공적임을 나타낼 수 있다. 또한, 비소세포성 폐암을 분명히 치료된 후, 개인에게서 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 차별적인 발현 정도가 증가 또는 감소하는 것은 비소세포성 폐암의 재발을 나타낼 수 있다. 이와 같은 상황에서, 상기 개인은 비소세포성 폐암의 재발이 더 늦게까지 발견되지 않는 경우에 비해, 보다 이른 병기에 치료를 재개할 수 있다(또는 환자가 치료를 지속하고 있는 경우, 약의 용량 및/또는 빈도를 증가시키는 등, 치료법을 수정할 수 있다). 더욱이, 개인에 따라 달리 나타나는 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 발현 레벨을 통해, 특정 치료제에 대한 상기 개인의 반응을 예견할 수 있다. 비소세포성 폐암 재발이나 진행을 관찰함에 있어서, 바이오마커의 발현 레벨의 변화는, 이를테면 비소세포성 폐암 활성도 결정 또는 치료법의 변화 필요성 결정을 위하여, 영상 검진(예를 들면 CT 검진)의 반복이 필요함을 나타낼 수 있다.
본원에서 기술하는 바이오마커의 검출은, 치료법의 성공 평가나 치료 이후 비소세포성 폐암의 소멸, 재발 및/또는 진행(전이 포함)을 관찰과 같이, 비소세포성 폐암 치료 이후 또는 비소세포성 폐암 치료 과정과 연계하여, 특히 더 유용하다. 비소세포성 폐암 치료법은, 예를 들면, 개인에게 치료제 처방, 수술 (예를 들면, 최소한 비소세포성 폐암 종양의 일부를 외과적으로 절개하거나 비소세포성 폐암과 주변 조직을 절제하는 것), 방사선 치료, 또는 이 분야에서 사용되는 다른 종류의 비소세포성 폐암 치료법, 그리고 이들 치료법들의 조합을 포함한다. 폐암의 치료법에는, 예를 들면, 환자 개인에게 치료제 처방, 수술 (예를 들면, 폐 종양의 최소한 일부를 외과적으로 절개), 방사선 치료, 또는 이 분야에서 사용되는 다른 종류의 비소세포성 폐암 치료법, 그리고 이들 치료법들의 조합을 포함한다. 예를 들면, siRNA 분자는 유전자 발현을 막는 합성 이중 가닥의 RNA 분자이고, 폐암 표적 치료법으로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 상기 바이오마커중 임의의 바이오마커는 치료 후 적어도 한번 검출될 수 있거나, 치료 후 여러 번(예를 들면, 주기적으로) 검출될 수 있거나, 치료전과 치료 후 모두 검출될 수 있다. 개인에게서 상기 바이오마커중 임의의 바이오마커의 시간에 따른 발현 레벨의 변화는 치료 후 비소세포성 폐암의 진행, 차도 또는 재발의 징후일 수 있다. 상기 비소세포성 폐암의 진행, 차도 또는 재발의 예에는 바이오마커의 발현 레벨이 치료 전에 비해 치료 후에 증가 또는 감소; 바이오마커의 발현 레벨이 치료 후 이른 시점에 비해 치료 후 보다 더 늦은 시점에 증가 또는 감소; 및 바이오마커의 발현 레벨이 치료 후 어느 일 시점에서 정상 레벨과 다른 경우를 포함한다.
구체적인 예로서, 본원에 기술된 바이오마커 중 임의의 바이오마커에 대한 바이오마커 레벨은 수술 전과 수술 후(예를 들면 수술 후 2 내지 16주 경과) 혈청이나 혈장 샘플에서 측정할 수 있다. 수술 전 샘플에 비해 수술 후 샘플에서 바이오마커 발현 레벨(들)이 증가하면 이는 비소세포성 폐암의 진행(예를 들면, 비성공적인 수술)의 징후일 수 있고, 수술 전 샘플에 비해 수술 후 샘플에서 바이오마커 발현 레벨(들)이 감소하면 이는 비소세포성 폐암의 차도 (예를 들면, 수술로 폐 종양이 성공적으로 제거) 징후일 수 있다. 방사선 치료, 치료제 투여, 또는 암 백신 투여 전후와 같이, 그 외 다른 치료법 실시 전후에도, 바이오마커 레벨을 유사한 방식으로 분석할 수 있다.
바이오마커 레벨의 테스트를 단일 진단 테스트로 실시하는 것 외에, 질병에 대한 위험도의 증가를 나타내는 SNP 또는 다른 유전적 병변이나 변동성의 측정과 연관하여 바이오마커 레벨을 테스트할 수 있다 (예를 들면, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009) 참조).
바이오마커 레벨의 테스트를 단일 진단 테스트로 실시하는 것 외에, CT 검진과 같은 방사선 검진과 함께 바이오마커 레벨 테스트를 실시할 수 있다. 예를 들면, 비소세포성 폐암에 대해 위험성이 있는 무증상 집단(예를 들면, 흡연자)의 검진처럼, CT 검진에 대한 의료적, 경제적 타당성을 제공할 수 있다. 예를 들어, "CT-전" 바이오마커 레벨 테스트는, 바이오마커 레벨에 근거하여 비소세포성 폐암에 대해 위험도가 높아 CT 검진을 우선적으로 실시해야 하는 자들을 식별하는 것처럼, 고위험 개인을 CT 검진이 요구되는 자로 분류하는데 이용될 수 있다. CT 테스트를 실시하는 경우, (예를 들면, 혈청이나 혈장 샘플에 대한 압타머 분석에 의해) 하나 혹은 그 이상의 바이오마커의 바이오마커 레벨을 측정할 수 있고, CT나 바이오마커 테스트를 단독 실시할 경우 보다 양성 예측도를 개선하기 위해, 진단 스코어를 추가적인 생체의학 정보(예를 들면, CT 테스트에 의해 결정된 종양 매개 변수)와 연계하여 평가할 수 있다. 바이오마커 레벨을 측정하기 위한 "CT-후" 압타머 패널은 CT(또는 다른 영상 방식)에서 관찰되는 폐 결절이 양성이거나 음성일 가능성을 결정하는데 이용될 수 있다.
본원에서 기술된 바이오마커 중 임의의 바이오마커의 검출은 CT-후 테스트에 유용할 수 있다. 예를 들면, 바이오마커 테스트는 CT를 단독으로 실시하는 경우에 비해 상당 수의 거짓 양성 테스트를 제거하거나 감소시킬 수 있다. 또한, 바이오마커 테스트를 통해 환자를 용이하게 치료할 수 있다. 예를 들어, 폐 결절의 크기가 5mm보다 작으면, 바이오마커 테스트의 결과로 조기에 환자를 "지켜보고 기다리는(watch and wait)" 상태에서 조직 검사를 하는 단계로 진행할 수 있다. 만약 폐 결절이 5 내지 9mm이면, 바이오마커 테스트를 통해, 거짓된 양성 검진에 따른 조직 검사나 흉부 절개를 하지 않을 수 있다. 그리고 폐 결절이 10mm 보다 크면, 바이오마커 테스트를 통해, 양성 결절을 가진 환자 개체군에게 수술을 하지 않을 수 있다. 결절 조직 검사와 관련된 중요한 병적 상태가 존재하고, 결절의 위치에 따라 결절 조직을 획득하는데 어려움이 있기 때문에, 바이오마커 테스트에 근거하여 어떤 환자에서는 조직 검사를 할 필요성을 제거하는 것이 이로울 수 있다. 마찬가지로, 실제로 결절인 양성인 경우처럼, 어떤 환자는 수술할 필요성이 없어지게 됨으로써, 수술과 관련된 불필요한 위험과 비용을 회피할 수 있다.
고위험군에서 방사선 검진과 연계하여 바이오마커 레벨을 테스트하는 것(영상 검진에서 관찰되는 폐 결절이나 종양의 크기, 또는 그 외 특성과 연관하여 바이오마커 레벨을 분석하는 것) 외에, 바이오마커에 대한 정보는 다른 유형의 데이터, 특히 비소세포성 폐암에 대한 개인의 위험도를 나타내는 데이터 (예를 들면, 환자의 임상적 이력, 직업상의 노출 이력, 증상, 암에 대한 가족력, 흡연 여부와 같은 위험 인자, 및/또는 다른 바이오마커의 상태 등)과 연계하여 평가할 수 있다. 이들 다양한 데이터는 컴퓨터나 그 외 장치에서 실행될 수 있는 컴퓨터 프로그램/소프트웨어와 같이, 자동화된 방법에 의해 분석될 수 있다.
기재된 바이오마커는 영상 테스트에도 사용될 수 있다. 예를 들면, 여타 용도들 중, 비소세포성 폐암 진단, 진행/차도 또는 전이의 관찰, 재발 관찰, 또는 치료법에 대한 반응 관찰을 위해, 영상제제(imaging agent)를 바이오마커와 결합하여, 비소세포성 폐암 진단의 보조 역할을 할 수 있다.
바이오마커 및 바이오마커 값의 검출 및 측정
본원에 기술된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은 공지의 다양한 분석 방법을 사용하여 검출할 수 있다. 일 실시예에서, 바이오마커 값은 포획 시약을 사용하여 검출한다. 본원에서 사용되는 "포획제(capture agent)"또는 "포획 시약(capture reagent)"은 바이오마커에 특이적으로 결합할 수 있는 분자를 말한다. 다양한 실시예에서, 상기 포획 시약은 용액에서 바이오마커에 노출되거나, 고체 지지체상에서 고정되어 바이오마커에 노출될 수 있다. 다른 실시예에서, 상기 포획 시약은 고체 지지체상의 이차 특성과 반응하는 특성을 포함한다. 이들 실시예에서, 상기 포획 시약은 용액에서 바이오마커에 노출되고, 그 후 고체 지지체상에서 바이오마커를 고정하기 위해, 포획 시약의 특성을 고체 지지체상의 특성과 함께 사용할 수 있다. 포획 시약은 실시되는 분석법 유형에 따라 선정된다. 포획 시약은 압타머, 항체, 항원, 애드넥틴(adnectins), 안키린(ankyrins), 그 외 항체 유사체들과 단백질 스캐폴드, 자가항체, 키메라, 작은 분자, F(ab')2 단편, Fv 단편, 단일 사슬 Fv 단편, 단일 사슬 항체 단편, 핵산, 렉틴, 리간드 결합 수용체, 어피바디(affybody), 나노 바디, 각인 고분자, 아비머(avimer), 펩티도모방체, 호르몬 수용체, 사이토킨 수용체, 합성 수용체 및 이들의 변형체와 단편을 포함하지만, 이들에 한정되지 않는다.
어떤 실시예에서, 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체를 사용하여 검출한다.
다른 실시예에서, 상기 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체로부터 도출되고, 예를 들면 바이오마커/포획 시약 상호 작용에 뒤따르는 반응의 결과로 검출되는 경우와 같이, 간접적으로 검출되지만, 바이오마커 값은 바이오마커/포획 시약 복합체의 형성에 의존한다.
어떤 실시예에서, 상기 바이오마커 값은 생물학적인 샘플의 바이오마커로부터 직접적으로 검출된다.
일 실시예에서, 바이오마커는 생물학적인 샘플에서 둘 혹은 그 이상의 바이오마커의 동시 검출을 허용하는 다중화 포맷을 이용하여 검출된다. 상기 다중화 포맷의 일 실시예에서, 포획 시약들은 고체 지지체상의 이산 위치에서 직접 또는 간접적으로, 공유 결합 또는 비공유 결합으로 고정된다. 다른 실시예에서, 다중화 포맷은 서로 다른 고체 지지체를 사용하고, 각각의 고체 지지체는 이를테면 양자점과 같이, 상기 고체 지지체와 관련된 고유 포획 시약을 가진다. 다른 실시예에서, 생물학적인 샘플에서 검출될 다중 바이오마커들 각각의 검출을 위해 개별적인 장치가 사용된다. 개별 장치들은 생물학적인 샘플의 각 바이오마커가 동시에 처리 가능하도록 구성된다. 예를 들면, 마이크로타이터 플레이트를 사용하여 상기 플레이트의 각 웰(well)을 생물학적인 샘플에서 검출될 다중 바이오마커들 중 하나를 고유하게 분석하는데 이용할 수 있다.
상기 실시예들 중 하나 혹은 그 이상에서, 바이오마커 값의 검출이 가능하도록 바이오마커/포획 복합체의 성분을 표시하기 위해 형광 택을 사용할 수 있다. 다양한 실시예에서, 상기 형광 택을 공지의 기술을 이용하여 본원에 기술된 바이오마커들 중 임의의 바이오마커에 고유한 포획 시약에 결합할 수 있고, 이후 상기 형광 택을 해당 바이오마커 값을 검출하기 위해 사용할 수 있다. 적절한 형광 표지에는 희토류 킬레이트, 플루오레신과 이의 파생물, 로다민과 이의 파생물, 단실, 알로피코시아닌, PBXL-3, Qdot 605, 리사민, 피코에리트린, 텍사스 레드 및 기타 이러한 화합물을 포함한다.
일 실시예에서, 상기 형광 표지는 형광 염료 분자(fluorescent dye molecule)이다. 어떤 실시예에서, 상기 형광 염료 분자는 인돌륨 고리의 3-탄소 상의 치환기가 화학적 반응기(chemically reactive group) 또는 복합 물질(conjugated substance)을 포함하는, 적어도 하나의 치환된 인돌륨 고리 시스템(indolium ring system)을 포함한다. 어떤 실시예에서, 상기 염료 분자는 예를 들어, 알렉사플루오르 488(AlexaFluor 488), 알렉사플루오르 532(AlexaFluor 532), 알렉사플루오르 647(AlexaFluor 647), 알렉사플루오르 680(AlexaFluor 680) 또는 알렉사 플루오르 700(AlexaFluor 700)과 같은 알렉사플루오르 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 염료 분자는 예를 들어, 두 개의 상이한 알렉사플루오르 분자와 같은 제1형 및 제2형의 염료 분자를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 염료 분자는 제1형 및 제2형 염료 분자를 포함하고, 두 개의 염료 분자는 서로 다른 방출 스펙트럼을 가진다.
형광 발광은 광범위한 검정 포맷에 적합한 다양한 수단을 사용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, 분광 형광계는 마이크로타이터 플레이트, 현미경 슬라이드, 프린팅된 어레이, 큐벳 등을 분석하도록 설계된다 (Principles of Fluorescence Spectroscopy by J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004. Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; Philip E. Stanley and Larry J. Kricka editors, World Scientific Publishing Company, January 2002를 참조).
하나 또는 그 이상의 상기 실시예에서, 화학발광 태그는 바이오마커 값의 검출이 가능하도록 바이오마커/포획 복합체의 성분을 표지하는데 선택적으로 사용될 수 있다. 적절한 화학발광 물질은 옥살릴 클로라이드(oxalyl chloride), 로다민 6G, Ru(bipy)32, TMAE(tetrakis(dimethylamino)ethylene), 피로갈롤(1,2,3-트리히드록시벤젠)(Pyrogallol(1,2,3-trihydroxibenzene)), 루시레닌(Lucigenin), 퍼록시옥살레이트(peroxyosalates), 아릴 옥살레이트(Aryl oxalates), 아크리디늄 에스테르(Acridinium esters), 디오세테인(dioxetanes) 및 그 외 물질을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 검출 방법은 바이오마커 값에 대응하는 검출 가능한 신호를 발생하는 효소/기질 화합물을 포함한다. 일반적으로, 상기 효소는 분광광도법(spectrophotometry), 형광발광(fluorescence) 및 화학발광(chemiluminescence)을 포함하는 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화를 촉진한다. 적절한 효소는, 예를 들어, 루시퍼라아제(luciferases), 루시페린(luciferin), 말레이트디하이드로게나아제(malate dehydrogenase), 우레아제(urease), 서양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase; HRPO), 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase), 베타-갈락토시다아제(betagalactosidase), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 라이소자임(lysozyme), 글루코스 옥시다아제(glucose oxidase), 갈락토스 옥시다아제(galactose oxidase) 및 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나아제(glucose-6-phosphate dehydrogenase), 유리카아제(uricase), 크산틴 옥시다아제(xanthine oxidase), 락토퍼록시다아제(lactoperoxidase), 마이크로퍼록시다아제(microperoxidase) 등을 포함한다.
또 다른 실시예에서, 상기 검출 방법은 측정 가능한 신호를 발생하는 형광발광, 화학발광, 방사성 핵종(radionuclide) 또는 효소/기질 화합물의 조합일 수 있다. 다중 모드 시그널링은 바이오마커 검정 포맷에서 고유한, 장점을 가질 수 있다.
보다 상세하게, 본원에 기재된 바이오마커에 대한 바이오마커 값은 하기에 기재된 것과 같은 싱글플렉스 압타머 검정법(singleplex aptamer assays), 다중화 압타머 검정법(multiplexed aptamer assays), 싱글플렉스 또는 다중화 면역검정법(immunoassays), mRNA 발현 프로파일링(mRNA expression profiling), miRNA 발현 프로파일링(miRNA expression profiling), 질량 분광 분석법(mass spectrometric analysis), 조직적(histological)/세포학적(cytological) 방법 등을 포함하는 공지의 분석 방법을 사용하여 검출될 수 있다.
압타머 기반 검정법을 사용하여 바이오마커 값 결정
생물학적 샘플 및 그 외 샘플에서 생리학적으로 중요한 분자의 검출 및 정량을 위한 검정법은 과학적 연구 및 보건 분야에서 중요한 수단이다. 이와 같은 검정법 중 하나는 고체 지지체 상에 고정된 하나 또는 그 이상의 압타머를 포함하는 마이크로어레이의 사용을 포함한다. 상기 압타머 각각은 매우 특이적인 방식 및 매우 높은 친화력으로 표적 분자에 결합할 수 있다("Nucleic Acid Ligand"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,475,096 및 "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"이라는 제목의 U.S. Patent No. 6,242,246, U.S. Patent No. 6,458,543 및 U.S. Patent No. 6,503,715을 참조). 일단 마이크로어레이가 샘플과 접촉하면, 압타머들은 샘플에 존재하는 표적 분자에 각각 결합하여 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값의 측정을 가능하게 한다.
본원에 사용된 "압타머(aptamer)"는 표적 분자에 대한 특정 결합 친화력을 가지는 핵산을 말한다. 친화 상호작용(affinity interaction)은 정도(degree)의 문제이지만, 이 상황에서, 표적에 대한 압타머의 "특정 결합 친화력(specific binding affinity)"은, 상기 압타머가 시료에서 다른 성분에 결합하는 것보다 일반적으로 더 높은 정도의 친화력으로 그것의 표적에 결합함을 의미한다는 것을 알 수 있다. "압타머"는 특정 뉴클레오티드 서열을 가지는 일 형태 또는 일종의 핵산 분자의 복제 세트를 말한다. 압타머는, 임의의 개수의 화학적으로 변형된 뉴클레오티드를 포함하여, 적정 개수의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. "압타머"는 하나 이상의 그러한 분자 세트를 말한다. 서로 다른 압타머는 동일 또는 서로 다른 개수의 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 압타머는 DNA 또는 RNA 또는 화학적으로 변경된 핵산일 수 있고, 단일 가닥, 이중 가닥 또는 이중 가닥 영역을 포함할 수 있고, 매우 질서정연한 구조를 포함할 수 있다. 압타머는 광압타머일 수도 있으며, 이 경우 광반응성 또는 화학적 반응성 기능기가 대응하는 표적에 공유적으로 결합될 수 있도록 압타머에 포함되어 있다. 본원에 기재된 임의의 압타머 방법은 동일한 표적 분자와 특이적으로 결합하는 두 개 또는 그 이상의 압타머의 사용을 포함할 수 있다. 하기에 더 기재된 바와 같이, 압타머는 태그를 포함할 수 있다. 만약 압타머가 태그를 포함한다면, 모든 압타머의 복제는 동일한 태그를 가질 필요가 없다. 더욱이, 만약 서로 다른 압타머가 각각 태그를 포함한다면, 이 서로 다른 압타머들은 서로 동일한 태그 또는 서로 다른 태그를 가질 수 있다.
압타머는 SELEX 공정을 포함하는 임의의 공지의 방법을 사용하여 식별될 수 있다. 일단 식별되면, 압타머는 화학 합성 방법 및 효소 합성 방법을 포함하는 임의의 공지의 방법에 따라 제조되거나 합성될 수 있다.
본원에 사용된 "소마머(SOMAmer)" 또는 느린 오프-레이트의 변경된 압타머(Slow Off-Rate Modified Aptamer)는 향상된 오프-레이트 특성을 가지는 압타머를 말한다. 소마머는 "향상된 오프-레이트를 가지는 압타머를 만들기 위한 방법(Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates)"이라는 제목의 미국 공개특허번호 제2009/0004667호에 기재된 향상된 SELEX 방법을 사용하여 만들 수 있다.
상기 용어 "SELEX" 및 "SELEX 공정(SELEX process)"은 (1) 바람직한 방식, 예를 들어, 단백질에 고친화력으로 결합하는 방식으로, 표적 분자와 상호작용하는 압타머의 선별과 (2) 그 선택된 핵산의 증폭의 조합을 통칭하기 위래, 본원에서 혼용된다. 상기 SELEX 공정은 특정 표적 또는 바이오마커에 대하여 고친화력을 가지는 압타머를 식별하기 위해 사용될 수 있다.
SELEX는 일반적으로 핵산의 후보물질 혼합물을 제조하는 단계, 친화 복합체(affinity complex)를 형성하기 위하여 원하는 표적 분자에 후보물질 혼합물을 결합시키는 단계, 결합되지 않은 후보물질 핵산으로부터 친화 복합체를 분리하는 단계, 친화 복합체로부터 핵산을 분리 및 단리시키는 단계, 핵산을 정제하는 단계, 특정 압타머 서열을 증폭하는 단계를 포함한다. 선별된 압타머의 친화력을 보다 더 개선하기 위해, 상기 공정을 여러 번 실시할 수 있다. 상기 공정은 하나 또는 그 이상의 공정 지점에서 증폭 단계를 포함할 수 있다(예를 들어, "Nucleic Acid ligands"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,475,096를 참조). 상기 SELEX 공정은 표적에 공유적으로 결합하는 압타머 뿐만 아니라 표적에 비공유적으로 결합하는 압타머를 생성하기 위하여 사용될 수 있다(예를 들어, "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX"라는 제목의 U.S. Patent No. 5,705,337을 참조).
상기 SELEX 공정은, 예를 들어, 생체 내(in vivo) 안정성을 향상시키거나 운반 특성을 향상시키기 위해, 압타머에 향상된 특성을 부여하는 변경된 뉴클레오티드를 포함하는 고친화성 압타머를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 이러한 변경의 예는, 리보오스(ribose) 및/또는 포스페이트(phosphate) 및/또는 염기 위치에서의 화학적 치환을 포함한다. SELEX 공정에서 식별된 압타머는 피리딘의 5'- 및 2'-위치에서 화학적으로 변경된 뉴클레오티드 유도체를 포함하는 올리고뉴클레오티드를 기술하고 있는 미국 특허 제5,660,985호 ("High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides")에 기재되어 있다. 상기를 참고하여, 미국 특허 제5,580,737호는 2'-아미노(2'-NH2), 2'-플루오로(2'-F) 및/또는 2'-O-메틸(2'-OMe)로 변경된 하나 또는 그 이상의 뉴클레오티드를 포함하는 고특이성 압타머를 기술하고 있다. 또한 SELEX 및 광SELEX에서 확장된 물리 및 화학적 특성을 가지는 핵산 라이브러리 및 그것들의 용도를 기술하고 있는 미국특허공개번호 제2009/0098549호("SELEX 및 PHOTOSELEX")를 참고할 수 있다.
또한 SELEX는 바람직한 오프-레이트 특성을 가지는 압타머를 식별하기 위해 사용될 수 있다. 표적 분자에 결합할 수 있는 압타머를 생성하기 위한 향상된 SELEX 방법을 기술하고 있는 미국 특허 출원 공개번호 제 2009/0004667호("Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates")를 참고할 수 있다. 각 표적 분자로부터 더욱 느린 해리 속도를 가지는 압타머 및 광압타머를 생성하기 위한 방법이 기재되어 있다. 상기 방법은 표적 분자와 후보 물질 혼합물을 접촉시키는 단계; 핵산-표적 복합체를 형성하는 단계; 느린 오프-레이트 증폭 공정을 수행하는 단계를 포함하며, 여기서 빠른 해리 속도를 가지는 핵산-표적 복합체는 해리되어 재생성되지 않을 것이지만, 느린 해리 속도를 가지는 복합체는 온전하게 유지될 것이다. 부가적으로, 상기 방법은, 향상된 오프-레이트 성능을 가지는 압타머를 생성하기 위하여, 후보물질 핵산 혼합물의 생성시 변경된 뉴클레오티드의 사용을 포함한다.
이 검정법의 변형하여, 압타머가 표적 분자에 공유결합 또는 "광가교(photocrosslink)" 결합을 할 수 있도록 하는 광반응성 작용기를 포함하는 압타머를 사용한다 (예를 들어, U.S. Patent No. 6,544,776, "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip"을 참고). 이 광반응성 압타머는 광압타머로도 불린다(예를 들어, 각각 "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: PHotoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX"라는 제목의 U.S. Patent NO. 5,763,177, U.S. Patent No. 6,001,577 및 U.S. Patent No. 6.291,184; "Photoselection of Nucleic Acid Ligands"라는 제목의 U.S. Patent No. 6,458,539를 참조). 상기 마이크로어레이가 샘플과 접촉한 후, 광압타머는 표적 분자에 결합할 수 있는 기회를 가지며, 상기 광압타머는 광활성화되고, 고체 지지체는 비특이 결합된 분자를 제거하기 위하여 세척된다. 광압타머 상의 광활성화된 작용기에 의해 생성된 공유 결합 때문에 광압타머에 결합된 표적 분자는 일반적으로 제거되지 않으므로, 엄격한 세척 조건이 사용될 수 있다. 이 방법에서, 상기 검정법은 시료에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값을 검출가능하게 한다.
이러한 검정 포맷들 모두에서, 상기 압타머는 샘플과 접촉하기 이전에 고체 지지체 상에 고정된다. 그러나, 특정 환경에서는 샘플과 접촉하기 전에 압타머가 고정되면 최적의 검정이 이루어지지 않을 수 있다. 예를 들면, 압타머의 전-고정화(pre-immobilization)는 아마도 긴 반응시간에 따른 고체 지지체 표면상의 표적 분자와 압타머의 비효율적인 혼합을 야기할 수 있으므로, 표적 분자에 압타머가 효율적으로 결합하도록 배양기간을 길게 할 필요가 있다. 게다가, 광압타머가 검정법에 사용되고 고체 지지체로 사용된 물질에 의존하는 경우, 상기 고체 지지체는, 광압타머와 표적 분자 간의 공유 결합을 위해 사용되는 빛을 산란시키거나 흡수하는 경향이 있을 수 있다. 더욱이, 사용 방법에 따라, 고체 지지체의 표면은 표지 시약에 노출되어 영향을 받을 수 있기 때문에, 압타머에 결합된 표적 분자의 검출 정밀성이 떨어질 우려가 있다. 마지막으로, 일반적으로 고체 지지체 상의 압타머의 고정화는, 샘플에 압타머를 노출하기 이전에 압타머를 제조하는 단계(즉, 고정화)를 포함하며, 이 제조 단계는 압타머의 활성도나 기능성에 영향을 미칠 수 있다.
압타머가 용액에서 표적을 포획할 수 있도록 한 후, 검출 이전에 압타머-표적 혼합물의 특정 성분을 제거하도록 고안된 분리 단계를 사용하는 압타머 검정법 또한 기술되어 있다 ("Multiplexed Analyses of Test Samples"라는 제목의 U.S. Patent Application Publication 2009/0042206을 참조). 상기 압타머 검정 방법은 핵산(즉, 압타머)의 검출 및 정량화를 통해, 샘플에서 비-핵산 표적(예를 들어, 단백질 표적)의 검출 및 정량화를 가능하게 한다. 상기 방법은 비-핵산 표적을 검출하고 정량화하기 위한 핵산 대리물(surrogate)(즉, 압타머)을 생성하여, 증폭 단계를 포함하는 다양한 핵산 기술이 단백질 표적을 포함하는 바람직한 광범위 표적에 적용될 수 있도록 한다.
압타머는 압타머 바이오마커 복합체(또는 광압타머 바이오마커 공유결합 복합체)로부터 검정 성분의 분리를 용이하게 하고, 검출 및/또는 정량화를 위한 압타머의 단리가 가능하도록 구성될 수 있다. 일 실시예에서, 이 구조체는 압타머 서열 내에 절단 가능하거나 방출 가능한 요소를 포함할 수 있다. 다른 실시예에서, 부가적인 기능, 예를 들어 표지되거나 검출가능한 성분, 스페이서 성분 또는 특정 결합 태그 또는 고정화 요소가 압타머에 도입될 수 있다. 예를 들면, 상기 압타머는 절단가능한 부분(moiety), 표지, 표지를 분리하는 스페이서 성분 및 방출가능한 부분을 통하여 압타머에 연결된 태그를 포함할 수 있다. 일 실시예에서, 절단가능한 구성요소는 광절단가능한 링커이다. 상기 광절단가능한 링커는 비오틴 부분(biotin moiety) 및 스페이서 부분에 부착될 수 있고, 아민의 유도체화를 위한 NHS기를 포함할 수 있으며, 압타머에 비오틴기를 도입하는데 사용될 수 있음으로써, 이후 검정 방법에 따라 압타머의 방출이 가능해진다.
용액에서 모든 검정 성분을 처리하는 균질 검정법(homogenous assays)은 신호 검출 이전에 샘플 및 시약의 분리를 요하지 않는다. 이 방법은 속도가 빠르고 사용이 용이하다. 이 방법은 특정 표적과 반응하는 분자 포획 또는 결합 시약에 기초하여 신호를 생성한다.
일 실시예에서, 신호 생성 방법은 플루오로포어-표지된(fluorophore-labeled) 포획 시약과 특정 바이오마커 표적의 상호작용에 기인하는 이방성 신호의 변화를 이용한다. 상기 표지된 포획제가 표적과 반응할 때, 증가된 분자량으로 인해 복합체에 부착된 플로오로포어의 회전운동이 값이 더욱 느려진다. 이방성 변화를 관찰함으로써, 결합 반응은 용액에서 바이오마커를 정량적으로 측정하는데 사용될 수 있다. 그 외 방법에는 형광편광 검정법(fluorescence polarization assay), 분자 비콘 방법(molecular beacon methods), 시분할 형광 퀀칭(time resolved fluorescene quenching), 화학발광(chemiluminescence), 형광공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer) 등이 포함된다.
생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값의 검출을 위해 사용할 수 있는 예시적인 용액 기반 압타머 검정법은 (a) 제1 태그를 포함하고 바이오마커에 대해 특이 친화력을 가지는 압타머와 생물학적 샘플을 접촉시킴으로써 혼합물을 제조하는 단계, 여기에서 바이오마커가 샘플에 존재하는 경우 압타머 친화 복합체가 형성되며; (b) 제1 포획 구성요소를 포함하는 제1 고체 지지체에 상기 혼합물을 노출시켜 제1 태그를 상기 제1 고체 지지체에 결합시키는 단계; (c) 상기 제1 고체 지지체에 결합되지 않은 혼합물의 임의의 성분을 제거하는 단계; (d) 상기 압타머 친화 복합체의 바이오마커 성분에 제2 태그를 부착하는 단계; (e) 상기 제1 고체 지지체로부터 상기 압타머 친화 복합체를 분리하는 단계; (f) 상기 분리된 압타머 친화 복합체를 제2 포획 구성요소를 포함하는 제2 고체 지지체에 노출시켜 제2 태그를 제2 포획 구성요소에 결합시키는 단계; (g) 상기 압타머 친화 복합체로부터 비착물화된(non-complexed) 압타머를 분할함으로써 혼합물로부터 임의의 비착물화된 압타머를 제거하는 단계; (h) 상기 고체 지지체로부터 압타머를 용출하는 단계; 및 (i) 상기 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출함으로써 바이오마커를 검출하는 단계를 포함한다.
상기 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출하여 바이오마커 값을 검출하기 위해, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다. 친화 복합체의 압타머 성분을 검출하기 위하여 다수의 서로 다른 검출 방법, 예를 들어 혼성화 검정(hybridization assays), 질량 분석(mass spectroscopy) 또는 QPCR과 같은 검출 방법이 사용될 수 있다. 어떤 실시예에서, 핵산 염기서열 분석 방법을 압타머 친화 복합체의 압타머 성분을 검출하여 바이오마커 값을 검출하는데 사용할 수 있다. 간단하게 말해서, 시료는 시료에 존재하는 하나 또는 그 이상의 압타머의 서열(들)을 확인하고 정량하기 위하여 임의의 종류의 핵산 염기서열 분석 방법의 대상이 될 수 있다. 어떤 실시예에서, 상기 서열은 전체 압타머 분자 또는 상기 분자를 고유하게 식별하기 위해 사용될 수 있는 분자의 부분을 포함한다. 다른 실시예에서, 식별성 염기서열은 압타머에 첨가된 특이적 서열이며; 이와 같은 서열은 종종 "태그(tags)", 바코드(barcodes)" 또는 "집코드(zipcodes)"로 지칭된다. 어떤 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은, 압타머 서열을 증폭하거나, 화학적으로 변형된 RNA 및 DNA를 포함하는 핵산을 염기서열 분석에 적절한 다른 종류의 핵산으로 변환시키기 위한 효소적 단계들을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은 하나 또는 그 이상의 복제 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은 복제 단계가 없는 직접 염기서열 분석 방법을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은, 시료에서 하나 또는 그 이상의 압타머를 표적으로 하는 특정 프라이머를 사용하는 직접 접근법을 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은 시료에 있는 모든 압타머를 표적으로 하는 동시다발적 접근법을 포함한다.
어떤 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은 염기서열 분석을 위해 표적화된 분자를 증폭하기 위한 효소적 단계를 포함한다. 다른 실시예에서, 상기 염기서열 분석 방법은 단일 분자의 서열을 직접적으로 분석한다. 생물학적 샘플에서 바이오마커에 대응하는 바이오마커 값의 검출을 위해 사용가능한 예시적인 핵산 염기서열 분석에 기반한 방법은 (a) 효소적 단계를 사용하여 화학적으로 변경된 뉴클레오티드를 포함하는 압타머의 혼합물을 변경되지 않은 핵산으로 전환하는 단계; (b) 그 결과 생성된 변경되지 않은 핵산을, 예를 들어, 454 염기서열 분석 시스템(454 Sequencing System)(454 Life Sciences/Roche), 일루미나 염기서열 분석 시스템(Illumina Sequencing System)(Illumina), ABI SOLiD 염기서열 분석 시스템(Applied Biosystems), 헬리스코프 단일 분자 시퀀서(HeliScope Single Molecule Sequencer)(Helicos Biosciences), 또는 퍼시픽 바이오사이언스 리얼 타임 단일 분자 염기서열 분석 시스템(Pacific Biosciences Real Time Single Molecule Sequencing System)(Pacific BioSciences) 또는 폴로네이터 지 염기서열 분석 시스템(Polonator G Sequencing System)(Dover Systems)과 같은 대량 병렬적 염기서열 분석 플랫폼(massively parallel sequencing platform)을 사용하여 동시다발적으로 염기서열 분석하는 단계; 및 (c) 특정 서열과 서열 계수(sequence count)에 의해 혼합물에 존재하는 압타머를 식별하고 정량화하는 단계를 포함한다.
면역검정법을 이용한 바이오마커 값의 측정
면역검정 방법은 대응하는 표적 또는 분석물에 대한 항체의 반응에 기초하고 있으며, 특정 검정 포맷에 의존하여 샘플에서 분석물을 검출할 수 있다. 면역-반응성에 기초하여 검정 방법의 특이도 및 민감도를 향상시키기 위하여, 단일클론항체가 가지는 특이적 에피토프 인식 때문에 단일클론항체 종종 사용된다. 다중클론항체는 단일클론항체에 비해 표적에 대하여 증가된 친화력을 가지기 때문에, 다중클론항체 역시 다양한 면역검정법에서 성공적으로 사용되고 있다. 면역검정법은 광범위한 생물학적 샘플 매트릭스와 함께 사용하도록 설계되었다. 면역검정법의 포맷은 정성적, 반정량적, 그리고 정량적 결과를 제공하도록 설계되었다.
정량적 결과는 공지의 농도를 가진, 검출될 특정 분석물을 사용하여 생성된 표준 곡선을 통하여 생성된다. 미지의 샘플로부터 얻은 반응 또는 신호를 표준 곡선으로 나타내고, 미지의 샘플에서 표적에 대응하는 양 또는 값이 확립된다.
수많은 면역검정 포맷들이 설계되어 왔다. ELISA 또는 EIA는 분석물을 정량적으로 검출할 수 있다. 이 방법은 분석물 또는 항체 중 어느 하나에 대한 표지의 부착에 의존하며, 상기 표지 성분은 직접 또는 간접적으로 효소를 포함한다. ELISA 테스트는 분석물의 직접, 간접, 경쟁적 또는 샌드위치 검출을 위한 포맷을 갖출 수 있다. 다른 방법들은, 예를 들어, 방사성동위원소(radioisotope)(I125) 또는 형광발광과 같은 표지에 의존한다. 부가적인 기술들은, 예를 들어, 응집(agglutination), 비탁법(nephelometry), 혼탁법(turbidimetry), 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침강법(immunoprecipitation), 면역세포화학법(immunocytochemistry), 면역조직화학법(immunohistochemistry), 유세포 분석법(flow cytometry), 루미넥스 검정법(Luminex assay) 및 그 외의 것들을 포함한다 (ImmunoAssay : A Practical Guide, edited by Brain Law, published by Taylor ＆ Francis, Ltd., 2005 edition을 참조).
예시적인 검정 포맷은 효소-결합 면역흡착검정법(enzyme linked immunosorbent assay; ELISA), 방사성면역검정법(radioimmunoassay), 형광(fluorescent), 화학발광(chemiluminescence) 및 형광 공명 에너지 전이(fluorescence resonance energy transfer; FRET) 또는 시분할 형광 공명 에너지 전이(time resolved-FRET; TR-FRET) 면역검정법을 포함한다. 바이오마커 검출 방법의 예는 바이오마커 면역침강법에 이어서 겔 전기영동법(gel electrophoresis), 모세관 전기이동(capillary electrophoresis), 평면 전기크로마토그래피(planar electrochromatography) 등과 같은, 크기 및 펩티드 레벨을 구별을 가능케 하는 정량적 방법을 포함한다.
검출가능한 표지 또는 신호 발생 물질을 검출 및/또는 정량화하는 방법은 표지의 특성에 의존한다. 적절한 효소에 의해 촉매화된 반응 산물은(여기에서 검출가능한 표지가 효소인 경우, 상기를 참조) 제한 없이 형광성, 발광성 또는 방사성일 수 있거나, 그것들은 가시광선 또는 자외선을 흡수할 수 있다. 이와 같은 검출가능한 표지를 검출하는데 적합한 검출기의 예는 제한 없이 X-레이 필름, 방사능 계측기, 섬광 계측기, 분광 광도계, 비색계, 형광계, 발광계 및 농도측정계를 포함한다.
검출 방법은 제조, 처리 및 반응에 대해 적절한 분석을 가능하게 하는 포맷으로 수행될 수 있다. 이는, 예를 들어, 다중-웰 검정 플레이트(예를 들어, 96 웰 또는 384 웰)이나, 적절한 어레이 또는 마이크로어레이를 사용하는 것일 수 있다. 다양한 시약을 위한 저장 용액은 수동으로 또는 기계적으로 만들 수 있고, 그 후의 모든 피펫팅, 희석, 혼합, 분배, 세척, 배양, 샘플 판독, 데이터 수집 및 분석이 상용 분석 소프트웨어, 로봇 공학 및 검출가능한 표지를 검출할 수 있는 검출 기계를 사용하여 기계적으로 완료될 수 있다.
유전자 발현 프로파일링을 이용한 바이오마커 값의 측정
생물학적 샘플에서 mRNA 측정은 상기 생물학적 샘플에서 대응하는 단백질 레벨의 검출을 위한 대리물로서 사용될 수 있다. 따라서, 본원에 기재된 임의의 바이오마커 또는 바이오마커 패널 또한 적절한 RNA 검출을 통해 검출될 수 있다.
mRNA 발현 레벨은 역전사 중합효소연쇄반응(reverse transcription quantitative polymerase chain reaction; RT-PCR)(qPCR에 따른 RT-PCR)에 의해 측정된다. RT-PCR은 mRNA로부터 cDNA를 만드는데 사용된다. 상기 cDNA는 DNA 증폭 과정이 진행됨에 따라, 형광을 만들어내기 위하여 qPCR에서 사용될 수 있다. 표준 곡선과 비교하여, qPCR은 세포당 mRNA 복제의 수와 같은 절대 측정치를 생성할 수 있다. 모세관 전기이동과 조합된 노던 블롯(Northern blots), 마이크로어레이, 침입자 검정법(invader assay) 및 RT-PCR 모두 샘플에서 mRNA의 발현 레벨을 측정하는데 이용되고 있다(Gene Expression Profiling: Method and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004를 참조).
miRNA 분자는 비암호화이지만 유전자 발현을 조절하는 소형 RNA이다. mRNA 발현 레벨의 측정에 적합한 방법들도 대응하는 miRNA에 대하여 사용될 수 있다. 최근 많은 연구소들이 질병에 대한 바이오마커로서 miRNAs의 사용을 연구하고 있다. 수많은 질병들이 광범위한 전사 조절(transcriptional regulation)을 수반하며, miRNA가 바이오마커로서의 역할을 할 수 있음은 놀라운 일이 아니다. miRNA 농도와 질병 간의 연관성은 종종 단백질 레벨과 질병 간의 연관성보다 명확하지 않지만, miRNA 바이오마커의 값은 실질적일 수 있다. 물론, 병에 걸려있는 동안 상이하게 발현되는 RNA의 경우처럼, 시험관 내(in vitro) 진단 제품의 개발시 직면하는 문제들에는, miRNA가 병든 세포에서 살아남아 분석용으로 용이하게 추출되거나, miRNA가 측정될 수 있을 만큼 충분히 오래 살아남아야 하는 혈액 또는 다른 매트릭스 내로 방출되어야 하는 요건을 포함할 것이다. 비록 많은 잠재적인 바이오마커들이 병에 걸려있는 동안 주변분비 방식(paracrine fashion)으로 병리 및 기능 부위에 의도적으로 분비될지라도, 단백질 바이오마커 역시 유사한 요건을 가진다. 수많은 잠재적 단백질 바이오마커가 단백질이 합성되는 세포 바깥에서 기능하도록 설계된다
생체 내 분자 영상 기술을 이용한 바이오마커 검출
상기 기재된 바이오마커들은 분자 영상 테스트에도 사용될 수 있다. 예를 들면, 영상 제제는 비소세포성 폐암 진단의 보조를 위하여, 질병의 진행/차도 또는 전이, 질병의 재발, 또는 다른 용도들 중에서 치료에 대한 반응을 관찰하기 위하여 사용될 수 있는 상기 기재된 바이오마커와 결합될 수 있다.
생체 내 영상화 기술은 개인의 신체에서 특정 질병의 상태를 판단하기 위한 비침윤적 방법을 제공한다. 예를 들면, 신체의 전 부분 또는 온 몸을 3차원 영상으로 검사할 수 있으며, 이로서 신체 형태와 구조에 관한 매우 유익한 정보를 얻는다. 이러한 기술은 개인의 암의 상태, 특히 비소세포성 폐암 상태에 관한 정보를 제공하기 위하여, 본원에 기재된 바이오마커의 검출과 조합될 수 있다.
다양한 기술 발전으로 인해, 생체내 분자 영상 기술의 사용이 확장되고 있다. 이러한 기술 발전에는, 신체 내에서 강력한 신호를 제공할 수 있는 방사성표지 및/또는 형광성 표지와 같은 새로운 조영제(contrast agent)의 개발; 및 유용한 정보를 제공하기 위하여 탁월한 민감도와 정확성을 가지는, 신체 외부로부터 이러한 신호를 검출하고 분석할 수 있는 강력한 새로운 영상 기술의 개발이 포함된다. 상기 조영제는 적절한 영상 시스템에서 가시화될 수 있고, 조영제가 위치한 신체의 부분(들)의 영상이 제공된다. 상기 조영제는, 압타머 또는 항체와 같은 포획 시약, 예를 들어, 펩티드 또는 단백질 또는 (예를 들어, 유전자 발현의 검출을 위한) 올리고뉴클레오티드, 또는 하나 또는 그 이상의 거대분자(macromolecules) 및/또는 다른 미립자 형태(particulate forms)를 가지는 것들을 포함하는 복합체와 결합될 수 있다.
또한, 상기 조영제는 영상화에 유용한 방사성 원소의 특징을 가질 수 있다. 적절한 방사성 원소는 신티그래프(scintigraphic) 연구를 위한 테크네튬-99m(technetium-99m) 또는 이오딘-123(iodine-123)을 포함한다. 기타 용이하게 검출가능한 부분들은, 예를 들어, 이오딘-123, 이오딘-131(iodine-131), 인듐-111(indium-111), 플루오린-19(fluorine-19), 탄소-13(carbon-13), 질소-15(nitrogen-15), 산소-17(oxygen-17), 가돌리늄(gadolinium), 망간(manganese) 또는 철(iron)과 같은 자기 공명 영상(MRI)을 위한 스핀 표지(spin label)를 포함한다. 이러한 표지는 당업계에 잘 알려져 있으며, 당업자들에 의해 쉽게 선택될 수 있다.
표준 영상 기술은 자기 공명 영상, 전산화 단층 촬영(computed tomography scanning), 양전자 방출 단층촬영(positron emission tomography; PET), 단일광자 방출 단층촬영(single photon emission computed tomography; SPECT) 등을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 진단적 생체 내 영상화를 위한, 사용가능한 검출 기구의 유형은 표적(단백질, mRNA 등)으로 사용되는 주어진 방사성 핵종(radionuclide) 및 특정 바이오마커와 같은, 주어진 조영제를 선택하는데 있어서의 주요 인자이다. 일반적으로, 선택된 상기 방사성 핵종은 기구의 주어진 형태에 의해 검출가능한 붕괴(decay) 유형을 가진다. 또한, 생체 내 진단을 위한 방사성 핵종을 선택할 때, 반감기는 표적 조직에 의해 최대 흡수(uptake) 시간에 검출될 수 있을 만큼 충분히 길어야 하지만, 숙주에 유해한 방사능이 최소화될 만큼 충분히 짧아야 한다.
영상 기술의 예는 방사성 핵종이 개인에게 종합적(synthetically) 또는 국부적(locally)으로 투여되는 영상 기술인 PET 및 SPECT를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이후 방사성 핵종의 흡수는 시간에 따라 측정되며, 표적화된 조직 및 바이오마커에 대한 정보를 얻기 위하여 사용된다. 사용된 특정 동위 원소의 고에너지(감마-레이) 방출 및 이를 검출하는데 사용되는 기구의 민감성과 정교성(sophistication) 때문에, 방사성 핵종의 2차원 분포는 신체 외부에서 추론될 수 있다.
PET에서 일반적으로 사용되는 양전자-방출 방사성 핵종(positron-emitting nuclides)은, 예를 들어, 탄소-11(carbon-11), 질소-13(nitrogen-13), 산소-15(oxigen-15) 및 플루오린-18(fluorine-18)을 포함한다. 전자 포획(electron capture) 및/또는 감마선-방출에 의해 붕괴되는 동위 원소는 SPECT에 사용되며, 예를 들어, 이오딘-123 및 테크네튬-99m을 포함한다. 테크네튬-99m을 사용하여 아미노산을 표지하기 위한 예시적인 방법은, 테크네튬-99m-화학주성 펩티드 결합체(technetium-99m-chemotactic peptide conjugate)를 형성하기 위하여 두 기능을 가지도록 변경된(bifunctionally modified) 화학주성 펩티드의 금속 결합기와 차례로 반응하는 불안정한 테크네튬-99m-전구 복합체(technetium-99m-precursor complex)를 형성하기 위하여, 킬레이팅 전구체의 존재하에서 과테크네튬산 이온(pertechnetate ion)의 환원이다.
이러한 생체 내 영상 진단 방법을 위해, 항체를 자주 사용한다. 생체 내 진단을 위한 항체의 제조 및 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 표 2에 나타난 임의의 바이오마커에 특이적으로 결합하는 표지된 항체들은, 개인의 질병 상태를 진단하거나 평가하기 위한 목적으로 사용된 특정 바이오마커에 따라 검출가능한, 어떤 유형의 암(예를 들어, 비소세포성 폐암)을 가지는 것으로 의심되는 개인에게 주입될 수 있다. 사용된 표지는, 이전에 언급한 바와 같이, 사용될 영상화 기법에 따라 선택될 것이다. 표지의 위치로 인해 암의 범위를 측정할 수 있다. 또한, 기관 또는 조직 내의 표지의 양을 통해 그 기관 또는 조직에서의 암의 존재 여부를 결정할 수 있다.
마찬가지로, 압타머는 이러한 생체 내 영상 진단 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 표 2에 기재된, 특정 바이오마커의 식별을 위해 사용되는 압타머는(따라서 상기 특정 바이오마커에 특이적으로 결합한다) 적절하게 표지될 수 있으며, 개인의 비소세포성 폐암 상태를 진단하거나 판단하기 위해, 특정 바이오마커에 따라 검출가능한 비소세포성 폐암을 가지는 것으로 의심되는 개인에게 주입된다. 사용된 표지는, 이전에 언급한 바와 같이, 사용될 영상화 기법에 따라 선택될 것이다. 표지의 위치를 통해 암의 범위를 측정할 수 있다. 또한 기관 또는 조직 내에서의 표지의 양을 통해 그 기관 또는 조직에서의 암의 존재 여부를 결정할 수 있다. 압타머-유도 영상 제제(aptamer-directed imaging agents)는 다른 영상 제제와 비교하여 조직 침입(penetration), 조직 분포(distribution), 동역학(kinetics), 제거(elimination), 효능(potency) 및 민감성에 관련된 고유의, 유리한 특성을 가질 수 있다.
이러한 기술들은 또한, 예를 들어, 역배열(antisense) 올리고뉴클레오티드를 사용하는 영상화를 통한 유전자 발현의 검출을 위하여, 표지된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 선택적으로 수행될 수 있다. 이 방법들은, 예를 들어, 표지로서 형광성 분자 또는 방사성 핵종을 사용하여, 인시츄 혼성화(in situ hybridization)에 이용된다. 유전자 발현의 검출을 위한 다른 방법들은 예를 들어, 지시 유전자(reporter gene) 활성의 검출을 포함한다.
그 외 다른 일반적인 영상화 기술은, 피험자 내부의 형광 신호가 피험자 외부에 있는 광학 기구에 의해 검출되는 광학 영상화이다. 이 신호는 실제 형광 및/또는 생물발광(bioluminescence)에 기인할 수 있다. 광학 검출 기구의 민감도 향상으로 인해, 생체 내 진단 검정을 위한 광학 영상화의 유용성이 증가되었다.
예를 들어, 새로운 암 치료를 위한 시도시 임상적인 효과를 더 빨리 측정하는 임상 실험 및/또는 다발성 경화증(multiple sclerosis)처럼 플라시보를 사용하는 장기 치료가 윤리적으로 문제시될 수 있는 질병에서 플라시보를 사용한 장기 치료를 피하기 위한 임상실험 등에서, 생체 내 분자 바이오마커 영상화의 사용이 증가하고 있다.
그 외 다른 기술의 리뷰를 위하여, N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009를 참조할 수 있다.
조직학적/세포학적 방법을 이용한 바이오마커 값의 측정
비소세포성 폐암을 평가하기 위해, 다양한 조직 샘플들이 조직학적 또는 세포학적 방법에 사용될 수 있다. 샘플은 주요 종양의 위치 및 전이 부위에 따라 선별한다. 예를 들면, 말단기관지(endo-bronchial) 및 경기관지(trans-bronchial) 생검, 세침 흡인(fine needle aspirates), 절단침(cutting needles) 및 중심부 생검(core biopsy)이 조직학에 사용될 수 있다. 기관지 세척액 및 브러싱(brushing), 늑막 흡인(pleural aspiration) 및 객담(sputum)은 세포학에 사용될 수 있다. 세포학적 분석은 여전히 비소세포성 폐암의 진단에 사용되고 있는 반면, 조직학적 방법은 암 검출에 더 높은 민감도를 제공하는 것으로 알려져 있다. 비소세포성 폐암에 걸린 개인에게서 상승 조절되는 것으로 나타난, 본원에서 확인된 임의의 바이오마커는 질병의 표지자(indicator)로서 조직학적 견본을 염색하는데 사용될 수 있다.
일 실시예에서, 대응하는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)이 폐 조직 세포 샘플의 세포학적 평가에 사용되며, 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 세포 샘플 수집, 세포 샘플을 고정(fixing), 탈수(dehydrating), 수세(clearing), 현미경 슬라이드 상에 세포 샘플을 고정화(immobilizing), 세포 샘플의 투과성을 증진(permeabilizing), 분석물 복구(analyte retrieval)를 위한 처리(treating), 염색(staining), 탈색(destaining), 세척(washing), 차단(blocking) 및 버퍼 용액에서 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)과 반응시키는 것. 일 실시예에서, 상기 세포 샘플은 세포 블록(block)으로부터 생성된다.
다른 실시예에서, 대응하는 바이오마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)이 폐 조직 샘플의 조직학적 평가에 사용되며, 다음 중 하나 또는 그 이상을 포함할 수 있다: 조직 샘플의 수집, 조직 샘플의 고정, 탈수, 수세, 현미경 슬라이드 상에 조직 샘플을 고정화, 조직 샘플의 투과성을 증진, 분석물 복구를 위한 처리, 염색, 탈색, 세척, 차단, 재수화(rehydrating) 및 버퍼 용액에서 포획 시약(들)과의 반응. 일 실시예에서, 고정 및 탈수는 동결(freezing)로 대체된다.
다른 실시예에서, 대응하는 바이오마커(들)에 특이적인 하나 또는 그 이상의 압타머(들)은 조직 또는 세포 샘플과 반응시키며, 핵산 증폭 방법에서 핵산 표적으로 제공될 수 있다. 적합한 핵산 증폭 방법은 예를 들어, PCR, q-베타 레플리카아제(q-beta replicase), 회전환 증폭(rolling circle amplification), 사슬 교체(strand displacement), 헬리카제 의존 증폭법(helicase dependent amplification), 루프 매개 등온 증폭법(loop mediated isothermal amplification), 리가아제 연쇄 반응법(ligase chain reaction), 및 회전환 증폭을 돕는 제한(restriction) 및 원형화(circularization)를 포함한다.
일 실시예에서, 조직학적 또는 세포학적 평가에 사용하기 위해, 대응하는 바이오마커에 특이적인 하나 또는 그 이상의 포획 시약(들)은 임의의 하기의 것: 차단 물질(blocking materials), 경쟁자(competitors), 세제(detergents), 안정화제(stabilizers), 운반 핵산(carrier nucleic acid), 다가음이온성 물질(polyanionic materials) 등을 포함할 수 있는 버퍼 용액에 혼합된다.
"세포학 프로토콜(cytology protocol)"은 일반적으로 샘플 수집, 샘플 고정, 샘플 고정화 및 염색을 포함한다. "세포 제조(cell preparation)"는 제조된 세포의 염색을 위한 하나 또는 그 이상의 느린 오프-레이트의 압타머의 사용을 포함하는, 샘플 수집 후의 여러 공정 단계를 포함할 수 있다.
샘플 수집은 처리되지 않은 운반 용기에 샘플을 직접 넣는 것, 어떤 유형의 배지가 담겨있는 운반 용기에 샘플을 넣는 것 또는 임의의 처리 또는 고정없이 슬라이드 상에 직접적으로 샘플을 놓는 것(고정화)을 포함할 수 있다.
샘플 고정화(immobilization)는 폴리리신(polylysine), 젤라틴(gelatin) 또는 실란(silane)으로 처리된 유리 슬라이드에 수집된 견본의 일부분을 붙임으로써 개선될 수 있다. 슬라이드는 슬라이드 전역에 얇고 평평한 세포층을 도말(smearing)함으로써 제조될 수 있다. 일반적으로, 기계적 변형(mechanical distortion) 및 건조 인공물(drying artifact)을 최소화하기 위해 주의를 기울인다. 액상 견본은 세포 블록 방법으로 처리될 수 있다. 또는, 대안적으로, 액상 견본은 상온에서 약 10분간 고정 용액과 1:1로 혼합될 수 있다.
세포 블록은 잔여 삼출액(residual effusion), 객담(sputum), 요침사(urine sediment), 위장액(gastrointestinal fluid), 폐액(pulmonary fluid), 세포 긁기(cell scraping) 또는 세침 흡인을 통해 생성될 수 있다. 세포는 원심분리 또는 막 여과에 의해 농축되거나 패키징된다. 세포 블록 제조를 위한 많은 방법들이 개발되어 있다. 대표적인 방법은 침전물 고정(fixed sediment), 세균성 아가(bacterial agar), 또는 막 여과 방법을 포함한다. 침전물 고정 방법에서, 세포 침전물은 보우인(Bouins), 피크르산(picric acid), 또는 완충된 포르말린(buffered formalin)과 같은 고정액과 혼합된 후, 상기 혼합물은 고정화된 세포를 펠릿화하기 위하여 원심분리된다. 가능한한 완전히 세포 펠릿을 건조하여 상층액을 제거한다. 펠릿을 수집하고 렌즈 페이퍼(lens paper)로 싼 후 조직 카세트(tissue cassette)에 넣는다. 상기 조직 카세트를 추가 고정액과 함께 병에 넣고, 조직 샘플과 같이 처리한다. 아가법(agar method)은 매우 유사하지만, 펠릿이 제거되고 페이퍼 타월 위에서 건조된 후 반으로 자른다. 자른 쪽을 유리 슬라이드 상의 한 방울의 용해된 아가에 올려놓은 후, 상기 펠릿을 아가 내에서 확실하게 버블이 형성되지 않도록 아가로 덮는다. 상기 아가를 굳힌 후 임의의 여분의 아가를 걷어낸다. 이것을 조직 카세트에 넣으면 조직 처리는 완료된다. 대안적으로, 상기 펠릿은 65℃에서 2% 아가 용액에 직접적으로 현탁될 수 있고, 샘플은 원심분리된다. 상기 아가 세포 펠릿을 4℃에서 1시간 동안 응고시킨다. 상기 고체 아가는 원심분리 튜브로부터 제거될 수 있고, 반으로 분할될 수 있다. 상기 아가를 여과 페이퍼로 감싼 후 조직 카세트에 넣는다. 이 시점 이전의 처리는 상기에 기재된 것과 같다. 원심분리는 막 여과와 함께 임의의 이러한 방법으로 대체될 수 있다. 임의의 이러한 방법은 "세포 블록 샘플(cell block sample)"을 만드는데 사용될 수 있다.
세포 블록은 로위크릴 수지(Lowicryl resins), LR 화이트(LR White), LR 골드(LR Gold), 유니크릴(Unicryl) 및 모노스텝(MonoStep)을 포함하는 특성화된 수지를 사용하여 제조될 수 있다. 이 수지들은 저점도를 가지며, 낮은 온도에서 자외선을 사용하여 중합될 수 있다. 포매 처리(embedding process)는 탈수하는 동안 샘플을 점진적으로 냉각시키고, 수지에 샘플을 옮기고, 마지막으로 적절한 UV 파장에서 낮은 온도에서 블록을 중합시키는 것에 의존한다.
세포 블록 단편(cell block sections)은 세포형태학 검사(cytomorphological examination)를 위하여 헤마톡실린-에오신으로 염색될 수 있고, 동시에 부가적인 단편은 특정 마커에 대한 검사를 위하여 사용된다.
상기 공정이 조직학적 공정인지 세포학적 공전인지와 관계없이, 상기 샘플은 샘플 분해를 예방하기 위하여 부가적인 처리 이전에 고정화될 수 있다. 이 처리는 "고정(fixation)"이라 불리며, 혼용될 수 있는 광범위한 물질 및 방법들을 설명한다. 샘플 고정 프로토콜 및 시약은 검출될 표적과 분석될 특정 세포/조직에 기초하여 경험적으로 선택한다. 샘플 고정은 에탄올(ethanol), 폴리에틸렌 글리콜(polyethylene glycol), 메탄올(methanol), 포르말린(formalin) 또는 이소프로판올(isopropanol)과 같은 시약에 의존한다. 상기 샘플은 가능한 한 슬라이드에 수집 및 첨가된 후 바로 고정되어야 한다. 그러나, 선별된 고정액은 후속 검출을 더욱 어렵게 만드는 다양한 분자 표적들에 구조적 변화를 일으킬 수 있다. 고정 및 고정화 처리 및 이들의 순서는 세포의 외형을 변경시킬 수 있고, 이러한 변화를 세포검사 기사가 예상하고 인식해야 한다. 고정액은 특정 세포 유형을 수축시킬 수 있고, 세포질이 과립 모양(granular) 또는 그물 모양(reticular)을 나타내도록 할 수 있다. 수많은 고정액이 세포 성분과 가교 결합함으로써 기능한다. 이것은 특정 에피토프를 손상시키거나 변경시킬 수 있고, 새로운 에피토프를 생성할 수 있으며, 분자 회합(molecular associations)을 야기할 수 있고, 막 투과성을 감소시킬 수 있다. 포르말린 고정은 가장 일반적인 세포학적/조직학적 방법 중 하나이다. 포르말린은 단백질 주변 또는 단백질 내에서 메틸 브릿지(methyl bridge)를 형성한다. 침전(precipitation) 또는 응고(coagulation) 역시 고정을 위해 사용되며, 에탄올은 이러한 유형의 고정에 자주 이용된다. 가교결합(crosslinking) 및 침전의 조합 또한 고정을 위해 사용될 수 있다. 강력한 고정 처리는 형태학적 정보를 보전하는 최선의 방법인 반면, 약한 고정 처리는 분자 표적의 보존에 최선의 방법이다.
대표적인 고정액은 50% 순수 에탄올, 2mM 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 1.85% 포름알데히드이다. 이 성분배합(formulation) 상의 변화는 에탄올(50% 내지 95%), 메탄올(20% - 50%), 및 포르말린(포름알데히드) 단독을 포함한다. 다른 일반적인 고정액은 2% PEG 1500, 50% 에탄올 및 3% 메탄올이다. 슬라이드는 상온에서 약 10 내지 15분간 고정액에 둔 후, 제거하여 건조한다. 일단 슬라이드가 고정되면, PBS와 같은 완충 용액으로 헹굴 수 있다.
광범위한 염료들이 세포, 아세포 및 조직의 특징 또는 형태학적 구조를 차별적으로 강조하고 대조하거나 "염색(stain)"하는데 사용될 수 있다. 헤마톡실린(hematoxylin)은 핵을 파란색 또는 검은색으로 염색하는데 사용된다. 오렌지 G-6(Orange G-6) 및 에오신 아주르(eosin azure) 모두 세포의 세포질을 염색한다. 오렌지 G는 케라틴(keratin) 및 글리코겐(glycogen) 함유 세포를 노란색으로 염색한다. 에오신 Y는 핵소체(nucleoli), 섬모(cilia), 적혈구(red blood cells) 및 표재성 상피 편평세포(superficial epithelial squamous cells)를 염색하는데 사용된다. 로마노프스키 염색(romanowsky stains)은 자연 건조된(air dried) 슬라이드에 사용되며, 다형성을 증가시키고 세포질 내(intracytoplasmic) 물질로부터 세포 밖 물질을 구별하는데 유용하다.
염색 과정은 염색에 대한 세포의 투과성을 증가시키기 위한 처리를 포함할 수 있다. 세제(detergent)를 사용한 세포의 처리는 투과성을 증가시키는데 사용될 수 있다. 세포 및 조직의 투과성을 증가시키기 위하여, 고정된 샘플은 용매(solvents), 사포닌(saponins) 또는 비이온성 세제(non-ionic detergents)로 더 처리될 수 있다. 효소적 분해(enzymatic digestion) 또한 조직 샘플에서 특정 표적의 접근성을 향상시킬 수 있다.
염색 후, 상기 샘플은 알코올 농도가 증가하는 연속적인 알코올 헹굼을 통해 탈수된다. 마지막 세척은 자일렌(xylene) 또는 슬라이드에 사용되는 커버 슬립에 근접한 굴절률을 가지는 시트러스 테르펜(citrus terpene)과 같은 자일렌 대용물을 사용하여 완료된다. 이 마지막 단계는 수세(clearing)로 지칭된다. 일단 샘플이 탈수되고 수세되면, 봉입제(mounting medium)를 사용한다. 상기 봉입제는 유리에 근접한 굴절률을 가지는 것으로 선택되며, 슬라이드에 커버 슬립을 붙일 수 있다. 이는 또한 세포의 부가적인 건조, 수축 또는 쇠퇴(fading)를 억제할 것이다.
사용된 염색 또는 처리에 관계없이, 폐 세포 견본의 최종 평가는 형태의 외관 검사(visual inspection) 및 마커의 존재 여부의 결정을 가능하게 하는 어떤 유형의 현미경에 관찰에 의해 이루어진다. 예시적인 현미경 방법은 명시야(brightfield), 위상차(phase contrast), 형광(fluorescence) 및 차등간섭 대조(differential interference contrast)를 포함한다.
검사 후 샘플 상에 제2의 테스트가 요구되면, 커버 슬립을 제거할 수 있으며, 슬라이드는 탈색시킨다. 탈색(destaining)은 본래 추가되는 염료 없이 원래의 염색 과정의 역순으로 슬라이드를 염색하는데 사용된 원용매 시스템(original solvent system)을 사용하는 것을 포함한다. 탈색은 또한 세포가 무색이 될 때까지 산성 알코올에 슬라이드를 담금으로써 완료될 수 있다. 일단 무색의 슬라이드를 수조에서 잘 헹구고, 제2의 염색 처리를 적용한다.
또한, 특정 분자의 식별은 항체 또는 핵산 프로브 또는 압타머와 같은 특정 분자 시약의 사용을 통한 세포 형태학적 분석과 함께 실시할 수 있다. 이는 진단 세포학의 정확도를 향상시킨다. 미세절개(micro-dissection)는 특히 비정상적 크로모좀(abnormal chromosomes), 유전자 발현(gene expression) 또는 변이(mutations)에 대한 추가적인 평가를 위한 세포의 서브셋을 단리하는데 사용될 수 있다.
조직학적 평가를 위한 조직 샘플의 제조는 고정(fixation), 탈수(dehydration), 침투(infiltration), 포매(embedding) 및 단편화(sectioning)를 포함한다. 조직학에서 사용되는 고정 시약은 세포학에서 사용되는 것과 매우 유사하거나 동일하고, 개개의 단백질과 같은 분자 특징을 희생하여 형태학적 특징을 보존하는 동일한 문제점을 가진다. 만일 조직 샘플이 고정되지 않고 탈수되었으나 대신에 동결된 후 동결되어 있는 동안 단편화 되었다면, 시간이 절약될 수 있다. 이는 좀 더 온건한 처리 방법이며, 더 많은 개개의 마커들을 보존할 수 있다. 그러나, 동결은 얼음 결정의 도입으로 인하여 아세포 정보가 상실되기 때문에 조직 샘플의 장기간 저장에 적합하지 않다. 동결된 조직 샘플 내의 얼음은 또한 매우 얇은 슬라이스를 생성하는 단편화 공정을 방해한다. 포르말린 고정뿐만 아니라, 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)도 고정에 사용되며 인지질(막)을 염색한다.
조직은 알코올의 농도를 증가시키면서 연속적으로 세척하여 탈수된다. 수세는 알코올 및 포매 물질과 섞일 수 있는 물질을 사용하고, 알코올:수세 촉진제(clearing agent)(자일렌 또는 자일렌 대용품)의 비율을 50:50에서 출발하는 단계적 공정을 포함한다. 침투(infiltration)는 조직을 먼저 50:50의 포매 시약:수세 촉진제에서 그리고 100% 포매 시약에서, 액체 형태의 포매 시약(웜왁스(warm wax), 니트로셀룰로오스 용액(nitrocellulose solution))과 함께 배양하는 것을 포함한다. 포매는 몰드 또는 카세트에 조직을 위치시키고, 왁스, 아가 또는 젤라틴과 같은 용해된 포매 시약을 채움으로써 완성된다. 상기 포매 시약을 굳힌다. 굳어진 조직 샘플은 그 후 염색 및 후속 실험을 위해 얇은 단편으로 절단될 수 있다.
염색 이전에, 조직 단편은 왁스가 제거되고 재탈수된다. 자일렌은 단편의 왁스를 제거하는데 사용되며, 한번 또는 그 이상의 자일렌이 교체될 수 있고, 조직은 농도를 감소시킨 알코올에서 연속적으로 세척함으로써 재탈수된다. 왁스를 제거하기 전에, 조직 단편은 약 20분간 약 80℃에서 유리 슬라이드에 열 고정화될 수 있다.
레이저 포획 미세절개(laser capture micro-dissection)는 조직 단편으로부터 추가 분석을 위한 세포의 서브셋의 단리를 가능하게 한다.
세포학에서와 처럼, 현미경적 특징의 가시화를 강화시키기 위하여, 조직 단편 또는 슬라이스는 다양한 염색제로 염색될 수 있다. 다양한 종류의 상용 염색제들이 특이적 특징들을 강화시키거나 식별하기 위하여 사용될 수 있다.
세포학적/조직학적 샘플과 분자 시약의 상호작용을 더 증진하기 위하여, "분석물 복구(analyte retrieval)"를 위한 많은 기술이 개발되었다. 먼저 이러한 최초 기술은 고정된 샘플을 고온으로 가열한다. 이 방법은 또한 열-유도 에피토프 복구(heat-induced epitope retrieval) 또는 HIER로 칭한다. 스팀 가열(steam heating), 전자레인지 가열(microwaving), 고압살균(autoclaving), 항온수조(water bath) 및 가압 증자(pressure cooking) 또는 이 가열 방법들의 조합을 포함하는, 다양한 가열 기술들이 사용되어 왔다. 분석물 복구 용액은, 예를 들어, 물, 시트레이트(citrate) 및 일반 식염수 완충액(saline buffers)을 포함한다. 분석물 복구의 핵심은 고온에서의 시간이지만, 장기간 동안에서의 더 낮은 온도 또한 성공적으로 사용된다. 분석물 복구를 위한 또 다른 핵심은 가열 용액의 pH이다. 낮은 pH는 최적의 면역 염색을 제공하는 것으로 알려져 있으나, 또한 종종 음성 대조군으로서 제2 조직 단편의 사용을 필요로 하는 백그라운드를 발생시킨다. (백그라운드를 증가시키는 일 없이 면역염색을 증가시키는) 가장 견고한 이점은 일반적으로 완충 조성물에 상관없이 높은 pH 용액을 사용하여 얻는다. 특정 표적을 위한 상기 분석물 복구 공정은, 공정 최적화를 위한 변수로서, 열, 시간, pH 및 완충 조성물을 사용하여 경험적으로 최적화된다. 마이크로파 분석물 복구 방법을 사용하면 항체 시약으로 서로 다른 표적의 연속적인 염색이 가능하다. 그러나, 염색 단계 사이에서 항체와 효소 복합체를 완성하는데 요구되는 시간은 또한 세포막 분석물을 저하시키는 것으로 나타났다. 마이크로파 가열 방법은 인시츄 혼성화(in situ hybridization) 방법에서도 개선된다.
분석물 복구 공정을 시작하기 위하여, 먼저 단편의 왁스를 제거하고 탈수시킨다. 그 후, 슬라이드를 접시나 병 안의 pH 6.0의 10mM 소디움 시트레이트 버퍼에 담근다. 대표적인 방법에서는, 1100W의 마이크로파를 사용하며, 2분간 100% 전력으로 슬라이드를 전자레인지에 가열한 후, 용액 내에서 슬라이드의 커버가 여전히 덮여있는지 확인한 후, 18분간 20% 전력을 사용하여 슬라이드를 전자레인지에 가열한다. 그 후, 슬라이드를 뚜껑이 없는 용기에서 냉각시킨 후, 증류수로 헹구었다. 면역화학적 시약에 대한 표적의 반응성을 향상시키기 위하여, HIER을 효소 분해와 함께 사용될 수 있다.
이러한 효소 분해 프로토콜은 프로테이나아제 K(proteinase K)를 사용한다. 20μg/ml 농도의 프로테이나아제 K를 50mM 트리스염, 1mM EDTA, 0.5% 트리톤 X-100, pH 8.0의 버퍼에 제조한다. 상기 공정은 먼저 각 5분씩, 자일렌을 2번 교체하여 단편의 왁스를 제거하는 것을 포함한다. 그 후, 샘플을 각각 3분간 100% 에탄올 2번, 각각 1분간 95% 및 80% 에탄올로 수화시키고, 증류수로 헹군다. 단편을 프로테이나아제 K 작용액(working solution)으로 덮고, 습한 챔버에서 37℃에서 10-20분 동안 배양한다(최적 배양 시간은 조직 형태 및 고정화 정도에 따라 달라질 수 있다). 상기 단편을 10분간 상온에서 냉각시킨 후, 2분간 2번 PBS 트윈 20(PBS Tween 20)으로 헹군다. 만일 원한다면, 내생적 화합물 및 효소로부터의 잠재적인 간섭을 제거하기 위하여 단편을 차단할 수 있다. 그 후, 상기 단편을 상온에서 1시간 또는 4℃에서 하룻밤 동안 1차 항체 희석 버퍼에 적절하게 희석하여 1차 항체와 함께 배양한다. 상기 단편을 2분간 2번 PBS 트윈 20으로 헹군다. 만일 특별한 적용이 필요하다면, 부가적인 차단을 수행한 후 2분간 3번 PBS 트윈 20으로 추가적으로 헹구어준 후, 마지막으로 면역염색 프로토콜을 완료한다.
상온에서의 1% SDS를 사용한 간단한 처리 또한 면역조직학적 염색을 향상시키는 것으로 증명되었다. 분석물 복구 방법은 슬라이드가 덮인 단편뿐만 아니라 자유 유동 단편에도 적용될 수 있다. 또 다른 처리 옵션은 pH 6.0의 시트르산과 0.1 Nonidet P40을 포함하는 용기에 슬라이드를 담그고 95℃로 가열하는 것이다. 그 후 PBS와 같은 완충 용액으로 상기 슬라이드를 세척한다.
조직의 면역학적 염색을 위해, 혈청 또는 탈지분유(non-fat dry milk)와 같은 단백질 용액에 단편을 담금으로써 조직 단백질과 항체의 비특이 결합을 막는 것이 유용할 수 있다.
차단 반응(blocking reaction)은 내생적 비오틴(endogenous biotin)의 레벨을 감소시키고; 내생적인 전하 효과(endogenous charge effects)를 제거하고; 내생적 뉴클레아제(endogenous nucleases)를 불활성화시키고/거나 퍼록시다아제(peroxidase) 및 알칼라인 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 같은 내생적 효소를 불활성화시킬 필요가 있을 수 있다. 내생적 뉴클레아제는, 프로테이나아제 K를 이용한 분해에 의하여, 열 처리에 의하여, EDTA 또는 EGTA와 같은 킬레이트제를 사용하여, 운반체 DNA 또는 RNA의 도입에 의하여, 우레아(urea), 티오우레아(thiourea), 구아니딘 하이드로클로라이드(guanidine hydrochloride), 구아니딘 티오시아네이트(guanidine thiocyanate), 리튬 퍼클로레이트(lithium perchlorate) 등 또는 디에틸 피로카보네이트(diethyl pyrocarbonate)와 같은 카오트로프(chaotrope)로 처리함으로써 불활성화될 수 있다. 알칼라인 포스파타아제는 상온에서 5분간 0.1N HCl로 처리하거나 1mM 레바미솔(levamisole)로 처리함으로써 불활성화될 수 있다. 퍼록시다아제 활성도는 0.03% 하이드로겐 퍼록사이드(hydrogen peroxide)로 처리함으로써 제거될 수 있다. 내생적 비오틴은 슬라이드 또는 단편을 상온에서 적어도 15분간 아비딘(avidin) 용액(스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘(neutravidin)을 대신 사용할 수 있음)에 담금으로써 차단될 수 있다. 그 후, 상기 슬라이드 또는 단편을 버퍼로 적어도 10분간 세척한다. 세척은 적어도 3번 반복될 수 있다. 그 후, 상기 슬라이드 또는 단편을 10분간 비오틴 용액에 담근다. 이는 매번 새로운 비오틴 용액을 사용하여 적어도 3번 반복될 수 있다. 버퍼 세척 방법을 반복한다. 차단 프로토콜은 세포 또는 조직 구조 또는 관심 표적(들)의 손상을 예방하기 위하여 최소한으로 사용되어야 하지만, 이들 프로토콜의 하나 또는 그 이상은, 하나 또는 그 이상의 느린 오프-레이트 압타머와 함께 반응하기 이전에, 슬라이드 또는 단편을 "차단"하기 위해 조합될 수 있다(Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, authored by Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998을 참조).
질량 분석 방법을 이용한 바이오마커 값의 측정
다양한 구성의 질량 분석기가 바이오마커 값을 검출하는데 사용될 수 있다. 여러 유형의 질량 분석기가 사용가능하거나, 다양한 구성을 가지도록 생산될 수 있다. 일반적으로, 질량 분석기는 다음과 같은 주요 구성요소를 가진다: 샘플 유입구(inlet), 이온 공급원(ion source), 질량 분석기(mass analyzer), 검출기(detector), 진공 시스템(vacuum system) 및 기구-제어 시스템(instrument-control system) 및 데이터 시스템(data system). 일반적으로, 샘플 유입구, 이온 공급원 및 질량 분석기의 차이가 기구의 형태와 특성을 정의한다. 예를 들면, 상기 유입구는 모세관 컬럼 리퀴드 크로마토그래피 공급원(capillary-column liquid chromatography source)이거나 매트릭스 보조 레이저 탈착(matrix-assisted laser desorption)에 사용되는 것과 같은 다이렉트 프로브(direct probe) 또는 스테이지(stage)일 수 있다. 통상적인 이온 공급원은 예를 들어, 나노분무(nanospray) 및 미세분무(microspray)를 포함하는 전기분무(electrospray) 또는 매트릭스 보조 레이저 탈착이다. 통상적인 질량 분석기는 사중극 질량 필터(quadrupole mass filter); 이온 트랩 질량 분석기(ion trap mass analyzer) 및 비행 시간 질량 분석기(time-of-flight mass analyzer)를 포함한다. 추가적인 질량 분석 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Burlingame et al., Anal. Chem. 70:647 R-716R(1998); Kinter and Sherman, New York (2000)을 참조).
단백질 바이오마커 및 바이오마커 값은 임의의 하기: 전자분무 이온화 질량 분석법(electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, 매트릭스 보조 레이저 탈착 이온화 비행 시간 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry, MALDI-TOF-MS), 표면 강화 레이저 탈착/이온화 비행 시간 질량 분석법(surface-enhanced laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS), 실리콘상에서의 탈착/이온화(desorption/ionization on silicon, DIOS), 2차 이온 질량분석(secondary ion mass spectroscopy, SIMS), 사중극 비행 시간(quadrupole time-of-flight; Q-TOF), 울트라플렉스(ultraflex) III TOF/TOF라 불리는 탠덤 비행 시간(tandem time-of-flight)(TOF/TOF) 기술, 대기압 화학 이온화 질량 분석법(atmospheric pressure chemical ionization mass spectrometry; APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, 대기압 광이온화 질량 분석법(atmospheric pressure photoionization mass spectrometry; APPI-MS), APPI-MS/MS 및 APPI-(MS)N, 사중극 질량 분석법(quadrupole mass spectrometry), 푸리에 변환 질량 분석법(Fourier transform mass spectrometry; FTMS), 정량적 질량 분석법(quantitative mass spectrometry) 및 이온 트랩 질량 분석법(ion trap mass spectrometry)에 의하여 검출되고 측정될 수 있다.
샘플 제조 전략은 단백질 바이오마커의 질량 분석적 특성화 및 바이오마커 값의 검출 이전에 샘플을 표지하고 양을 늘리는데 사용된다. 표지 방법은 상대적이고 절대적인 정량을 위한 등압 태그(isobaric tag)(isobaric tag for relative and absolute quantitation; iTRAQ) 및 세포 배양에서의 아미노산을 사용한 안정한 동위 원소 표지(stable isotope labeling with amino acid in cell culture; SILAC)를 포함하지만 이로 한정되지 않는다. 질량 분석적 분석 이전에, 후보 바이오마커 단백질을 위한 샘플을 선택적으로 강화하기 위해 사용되는 포획 시약은 압타머, 항체, 핵산 프로브, 키메라, 소분자, F(ab')2 단편, 단일 사슬 항체 단편(single chain antibody fragment), Fv 단편(Fv fragment), 단일 사슬 Fv 단편(single chain Fv fragment), 핵산(nucleic acid), 렉틴(lectin), 리간드 결합 수용체(ligand-binding receptor), 애피바디(affybodies), 나노바디(nanobodies), 안키린(ankyrins), 도메인 항체(domain antibodies), 대안적 항체 스캐폴드(alternative antibody scaffolds)(예를 들어, 디아바디(diabodies) 등), 각인된 고분자(imprinted polymer), 아비머(avimers), 펩티드 모조물(peptidomimetics), 펩토이드(peptoids), 펩티드 핵산(peptide nucleic acid), 트레오스 핵산(threose nucleic acid), 호르몬 수용체(hormone receptor), 시토카인 수용체(cytokine receptor), 및 합성 수용체(synthetic receptors) 및 이들의 변경 및 단편을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다.
근접 결합 검정법을 이용한 바이오마커 값의 측정
근접 결합 검정법(proximity ligation assay)은 바이오마커 값의 측정에 사용될 수 있다. 간단히 말하면, 시료는 한 쌍의 항체 또는 한 쌍의 압타머일 수 있는 한 쌍의 친화 프로브(affinity probe)와 접촉되며, 상기 쌍의 각 구성성분은 올리고뉴클레오티드로 연장된다. 한 쌍의 친화 프로브에 대한 표적은 하나의 단백질 상의 두 개의 구별되는 결정인자이거나, 동질다합성(homomultimeric) 또는 이종다합성(heteromultimeric) 복합체로서 존재할 수 있는 두 개의 서로 다른 단백질 각각의 하나의 결정인자일 수 있다. 프로브가 표적 결정인자에 결합할 때, 올리고뉴클레오티드 확장자(oligonucleotide extension)의 유리 말단(free end)은 서로 혼성화되기에 충분할 만큼 인접하게 이동한다. 올리고뉴클레오티드 확장자들이 충분히 근접하게 위치되었을 때 이들의 가교 역할을 하는 공통 연결 올리고뉴클레오티드(common connector oligonucleotide)에 의해, 올리고뉴클레오티드 확장자가 용이하게 혼성화된다. 일단 프로브의 올리고뉴클레오티드 확장자가 혼성화되면, 확장자의 말단은 효소 DNA 결합에 의해 서로 결합된다.
올리고뉴클레오티드 확장자 각각은 PCR 증폭을 위한 프라이머 부위를 포함한다. 일단 상기 올리고뉴클레오티드 확장자가 서로 결합되면, 상기 올리고뉴클레오티드는 PCR 증폭을 통하여 표적 단백질의 정체(identity) 및 양(amount)에 관한 정보뿐만 아니라 표적 결정인자가 두 개의 서로 다른 단백질 상에 있을 경우 단백질-단백질 상호작용에 대한 정보를 나타내는 연속적인 DNA 서열을 형성한다. 근접 결합은, 실시간 PCR을 통해 실시간 단백질 농도 및 상호작용 정보를 위한 높은 민감도 및 특이도를 가진 검정법을 제공할 수 있다. 관심 결정요소와 결합하지 않는 프로브는 대응하는 올리고뉴클레오티드 확장자를 근접 이동시키지 않고, 어떠한 결합이나 PCR 증폭도 진행될 수 없으며, 그 결과 어떠한 신호도 생성되지 않는다.
상기 검정법으로 인해, 비소세포성 폐암의 진단법에 유용하게 사용될 수 있는 바이오마커 값의 검출이 가능해지며, 상기 방법은, 개인의 생물학적 샘플에서 표 2에 제공된 바이오마커로 구성된 군으로부터 선택된 바이오마커에 각각 대응하는 적어도 N개의 바이오마커 값을 검출하는 단계를 포함하다. 하기에 설명하는 바와 같이, 바이오마커 값을 이용한 분류는 상기 개인이 비소세포성 폐암을 가지고 있는지 여부를 나타낸다. 기재된 비소세포성 폐암 바이오마커 중 특정 바이오마커는 단독으로 비소세포성 폐암을 검출하고 진단하는데 유용하긴 하지만, 각각 세 개 또는 그 이상의 바이오마커를 포함하는 패널로서 유용한, 다중 비소세포 폐암 바이오마커 서브셋을 정하는 방법을 본원에 설명한다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시예에서는 N개의 바이오마커를 포함하는 조합을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 세 개의 바이오마커이다. 다른 실시예에서, N은 2 내지 59개의 바이오마커 중 임의로 선택된다. N은 상기 기재된 범위에서 임의로 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 유사하지만 보다 더 고차 범위를 포함하도록 선택될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라서, 바이오마커 값은 개별적으로 검출되고 분류될 수 있으며, 또는, 예를 들어, 다중 검정 포맷에서처럼, 집합적으로 검출되고 분류될 수 있다.
다른 양상에 따르면, 비소세포성 폐암의 부재를 검출하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 개인의 생물학적 샘플에서 표 2에 제공된 바이오마커의 군으로부터 선택되는 바이오마커에 각각 대응하는 적어도 N개의 바이오마커 값을 검출하는 단계를 포함한다. 하기에 상세히 설명하는 바와 같이, 바이오마커 값을 이용한 분류는 상기 개인에게서 비소세포 폐암이 부재함을 나타낸다. 기재된 비소세포 폐암 바이오마커 중 특정 바이오마커는 비소세포성 폐암의 부재를 검출하고 진단하는데 단독으로 유용하긴 하지만, 세 개 또는 그 이상의 바이오마커의 패널로서 각각 유용한 비소세포성 폐암 바이오마커의 다중 서브셋의 분류를 위한 방법을 본원에 설명한다. 따라서, 본 발명의 다양한 실시예는 N개의 바이오마커를 포함하는 조합들을 제공하며, 여기에서 N은 적어도 세 개의 바이오마커이다. 다른 실시예에서, N은 2 내지 59개의 바이오마커 중 임의로 선택된다. N은 상기 기재된 범위에서 임의로 선택될 수 있을 뿐만 아니라, 유사하지만 보다 더 고차 범위를 포함하도록 선택될 수 있다. 본원에 기재된 방법에 따라서, 바이오마커 값은 개별적으로 검출되고 분류될 수 있으며, 또는, 예를 들어, 다중 검정 포맷에서처럼, 집합적으로 검출되고 분류될 수 있다.
바이오마커의 분류 및 질병 스코어의 계산
주어진 진단 테스트를 위한 바이오마커 "시그너쳐(signature)"는 일련의 마커를 포함하며, 각 마커는 관심 집단에서 상호 다른 레벨을 가진다. 여기서, 서로 다른 레벨이라 함은, 둘 또는 그 이상 군의 개인에 대한 상이한 마커 레벨 평균, 또는 둘 또는 그 이상의 군의 상이한 변화, 또는 이들 두 가지 모두의 조합을 지칭할 수 있다. 가장 단순한 형태의 진단 테스트를 위해, 두 개의 군 중 하나인 정상군 또는 질병군에 개인의 미지 샘플 할당시 이들 마커를 사용할 수 있다. 두 개 또는 그 이상의 군 중 하나에 샘플을 할당하는 것을 분류라 하고, 이러한 샘플 할당을 위해 사용되는 방법을 분류기(classifier) 또는 분류 방법(classification method)이라 한다. 분류 방법은 달리 스코어링 방법(scoring method)이라고도 한다. 많은 분류 방법이 일련의 바이오마커 값으로부터 진단 분류기(diagnostic classifier)를 구성하기 위해 이용될 수 있다. 일반적으로, 구별 하고자 하는 두 개의(또는 여러 분류 상태를 위해서는 그 이상의 데이터 세트) 서로 다른 군 내에서 개인으로부터 얻은 샘플을 사용하여 데이터 셋을 수집하는 지도학습 기술(supervised learning techniques)을 이용하면, 분류 방법이 가장 쉽게 수행된다. 각 샘플이 속하는 클래스(군 또는 집단)는 미리 알려져 있으므로, 상기 분류 방법은 원하는 분류 반응을 줄 수 있도록 트레이닝될 수 있다. 진단 분류기를 생산하기 위해 비지도 학습 기술(unsupervised learning techniques)을 사용하는 것 역시 가능하다.
진단 분류기 개발을 위한 통상적인 접근법들은 의사결정 트리(decision tree); 배깅(bagging) + 부스팅(boosting) + 포레스트(forests); 학습 기반 규칙 추론; 파즌 윈도우(Parzen Window); 선형 모델(linear models); 기호 논리학(logistic); 신경 회로망(neural network) 방법; 비지도 클러스터링(unsupervised clustering); K-평균(K-means); 계층적 상승/하강(hierarchical ascending/descending); 반지도 학습(semi-supervised learning); 프로토타입 방법(prototype methods); 최대 근접(nearest neighbor); 핵밀도 추정(kernel density estimation); 지지 벡터 기계(support vector machines); 은닉 마코프 모델(hidden Markov models); 볼쯔만 학습(Boltzmann Learning)을 포함하며, 분류기들은 단순 결합하거나, 특정 목적 함수(objective function)를 최소화하는 방식으로 결합될 수 있다. Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley ＆ Sons, 2nd edition, 2001 및 The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science + Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조할 수 있으면 이들 각각은 전체가 참조 통합된다.
지도 학습 기술을 사용하여 분류기를 생성하기 위하여, 트레이닝 데이터라 불리는 일련의 샘플을 획득한다. 진단 테스트에서, 트레이닝 데이터는, 나중에 미지의 샘플이 할당될 서로 구분되는 군(분류)으로부터의 샘플을 포함한다. 예를 들면, 대조군의 개인과 특정 질병군의 개인으로부터 수집된 샘플은, 미지의 샘플(또는, 더욱 상세하게는, 샘플이 얻어진 개인)을 질병의 존부로 분류할 수 있는 분류기 개발을 위해 사용되는 트레이닝 데이터를 구성할 수 있다. 트레이닝 데이터로부터 분류기를 개발하는 것을 분류기를 트레이닝한다라고 말한다. 분류기 트레이닝에 대한 특이적 세부사항은 지도 학습 기술의 특성에 달려있다. 설명을 위해, 트레이닝 나이브 베이지안 분류기(naive Bayesian classifier)의 예를 하기에 설명한다(예를 들어, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editors, John Wiley ＆ Sons, 2nd edition, 2001를 참조; 또한, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and prediction, T. Hastie, et al., editors, Springer Science + Business Media, LLC, 2nd edition, 2009를 참조).
통상, 트레이닝 세트의 샘플보다 더 많은 잠재적 바이오마커 값이 존재하므로, 오버-피팅(over-fitting)을 피하도록 주의를 기울여야 한다. 통계학적 모델이 저변의 관계 대신에 랜덤 에러나 노이즈를 기술할 경우, 오버-피팅이 발생한다. 오버-피팅은, 예를 들어, 분류기 개발에 사용되는 마커의 수를 제한, 마커 반응이 서로 독립적이라고 가정, 사용된 기초 통계학적 모델의 복잡성을 제한, 그리고 기초 통계학적 모델이 데이터에 따른 것임을 보장하는 등의 다양한 방법으로 피할 수 있다.
일련의 바이오마커를 이용한 진단 테스트 개발의 예는, 나이브 베이즈 분류기, 바이오마커를 엄격하게 독립적으로 처리하면서 베이즈 원리에 기초한 단순 확률 분류기의 적용을 포함한다. 각각의 바이오마커는 각 클래스에서 측정된 RFU 값 또는 로그 RFU 값(상대적 형광 단위)에 대한 클래스-의존성 확률 밀도 함수(probability density function; pdf)에 의해 기술된다. 하나의 클래스에서 일련의 마커에 대한 조인트 pdf(joint pdfs)는 각 바이오마커에 대한 개인 클래스-의존성 pdf의 산물로 가정한다. 이와 관련하여 나이브 베이즈 분류기를 트레이닝하는 것은 상기 클래스-의존성 pdf를 특성화하기 위한 파라미터를 선정하는 것("파라미터화(parameterization)")에 해당한다. 클래스-의존성 pdf에 대한 기초 모델이 사용될 수 있으나, 상기 모델은 일반적으로 트레이닝 세트에서 관찰된 데이터에 맞아야 한다.
구체적으로, 질병 클래스의 바이오마커 i에 대한 값 xi를 측정하는 클래스-의존성 확률은
Figure 112018024855063-pct00002
로 쓰여지고,
Figure 112018024855063-pct00003
값을 가지는 n개의 마커를 관찰할 수 있는 총 나이브 베이즈 확률은
Figure 112018024855063-pct00004
Figure 112018024855063-pct00005
로 쓰여지며, 여기에서 개인 xi는 RFU 또는 로그 RFU로 측정된 바이오마커 레벨이다. 미지에 대한 분류 지정은, 동일 측정값에 대하여 질병을 가지지 않을 가능성(대조군)
Figure 112018024855063-pct00006
Figure 112018024855063-pct00007
과 비교하여, 측정값
Figure 112018024855063-pct00008
Figure 112018024855063-pct00009
을 가지는 질병을 가질 가능성
Figure 112018024855063-pct00010
을 계산함으로써 용이해진다. 이 가능성들의 비율은 베이즈 원리를 적용하여 클래스-의존성 pdf로부터 계산될 수 있고, 여기에서 p(d)는 테스트에 적절한 집단에서의 질병의 유병율이다. 상기 비율의 양쪽 대수를 취하여 상기로부터의 나이브 베이즈 클래스-의존성 확률을 대입하면, 하기와 같다.
이 형태는 로그 우도 비율(log likelihood ratio)로 알려져 있고, 단순히 질병 존재와 질병 부재에 대한 로그 우도(log likelihood)를 말하며, 일차적으로 n개의 바이오마커 각각의 로그 우도 비율의 합으로 이루어진다. 이에 대한 가장 단순한 형태에서, 미지의 샘플(또는 더욱 상세하게는, 상기 샘플이 얻어진 개인)은 상기 비율이 0보다 큰 경우 질병이 없을 것으로 분류되며, 상기 비율이 0보다 작은 경우에는 질병을 가지는 것으로 분류된다.
일 예시적 실시예에서, 클래스-의존성 바이오마커 pdfs
Figure 112018024855063-pct00011
및
Figure 112018024855063-pct00012
는 측정된 RFU 값 xi, 즉 μd 및 σd를 사용한
Figure 112018024855063-pct00013
에 대하여 유사한 식을 가지는 RFU 값 에서 정규 또는 로그-정규 분포로 가정된다. 상기 모델의 파라미터화를 위해서는, 트레이닝 데이터로부터 각 클래스-의존성 pdf에 대한 두 개의 파라미터, 평균 μ 및 분산 σ2의 추정할 필요가 있다. 이것은 예를 들어, 최대 우도 추정, 최소 제곱 및 당업자에게 공지된 임의의 방법을 포함하는 다수의 방법으로 달성될 수 있다. μ 와 σ에 대한 정규 분포를 상기에 정의된 로그-우도 비율에 대입하면 하기와 같다.
일단 일련의 μ 와 σ2가 트레이닝 데이터와 집단의 질병 유병율로부터 각 클래스의 각 pdf에 대하여 정의되면, 상기 베이즈 분류기가 완전히 결정되어, 이를 측정 값 {tilde over (x)}를 사용하여 미지의 샘플을 분류하는데 이용할 수 있다.
나이브 베이즈 분류기의 성능은 분류기를 구성하고 트레이닝하는데 사용된 바이오마커의 수와 특성에 달려있다. 단일 바이오마커는 하기의 예 3에 정의된 바와 같이, 상기 바이오마커의 KS-거리(Kolmogorov-Smirnov)에 따라 작동할 것이다. 만일 분류기 성능 지표(classifier performance metric)가 수용자 반응 특성 곡선 아래 면적(AUC)으로 정의된다면, 완벽한 분류기는 1의 스코어를 가질 것이며, 랜덤 분류기는 평균적으로 0.5의 스코어를 가질 것이다. 사이즈 n과 m인 두 개의 세트 A와 B 사이의 KS-거리는
Figure 112018024855063-pct00014
의 값으로 정의되고, 이는 두 개의 경험적 누적분포함수(empirical cumulative distribution function, cdf) 간의 최대 차이값이다. n번의 관찰 세트 A에 대한 경험적 누적분포함수는 로서 정의되며, 여기에서 IXix는 Xi<x인 경우 1과 동일하고, 그렇지 않으면 0과 동일한 표시함수(indicator function)이다. 의미상, 이 값은 0과 1사이에 있으며, 여기서 KS-거리 1은 경험적 분포가 중복되지 않음을 나타낸다.
우수한 KS 거리(예를 들어, > 0.3)를 가지는 후속 마커를 첨가하는 경우, 상기 첨가된 마커가 제1 마커에 대하여 독립적이면, 일반적으로 분류 성능이 향상된다. 분류기 스코어로서 수용자 반응 특성 곡선 아래 면적(AUC)을 사용하면 탐욕 알고리즘(greedy algorithm)의 변화를 가지는 많은 고득점 분류기를 생성하기 쉽다. (탐욕 알고리즘은 전체 최적화(global optimum)를 발견할 가능성을 가지는 각 단계에서 국부적인 최적 선택을 할 메타휴리스틱(metaheuristic) 방법을 해결하는 문제를 수행하는 임의의 알고리즘이다.)
모든 단일 분석물 분류기는 잠재적인 바이오마커의 표로부터 생성되고 리스트에 첨가된다. 다음으로, 가능한한 모든 제2 분석물을 각각의 저장된 단일 분석물 분류기에 첨가하고, 새 리스트 상에 소정 개수의 최상 득점 페어(pair), 말하자면, 예를 들어 1000을 저장한다. 최상의 2-마커 분류기들에 대한 상기 새 리스트를 사용하여 모든 가능한 세 개의 마커 분류기를 조사하고, 다시 한번 이들 중 최상의 1000을 저장한다. 상기 스코어가 안정 상태(plateau)에 달하거나 부가적인 마커의 첨가로 인해 떨어지기 시작할 때까지 이 과정을 지속한다. 의도하는 용도에 대한 바람직한 성능을 위해, 수렴후 남아있는 고득점 분류기들을 평가할 수 있다. 예를 들면, 일 진단적 적용에서, 높은 민감도와 적당한 특이도를 가지는 분류기는 적당한 민감도와 높은 특이도를 가지는 것보다 바람직할 수 있다. 다른 진단적 적용에서, 높은 특이도와 적당한 민감도를 가지는 분류기가 더 바람직할 수 있다. 일반적으로, 이상적인 성능 레벨은, 특정 진단 적용시 허용될 수 있는 위양성 수와 위음성의 수 사이에 있어야 하는 트레이드-오프(trade-off)에 기초하여 선택된다. 이러한 트레이드-오프는 오진, 일반적으로 위양성 또는 위음성 중 하나의 의학적 결과에 의존한다.
기타 다양한 기술이 당업계에 알려져 있으며, 나이브 베이즈 분류기를 사용하는 바이오마커의 리스트로부터 많은 잠재적 분류기들을 생성하는데 이용될 수 있다. 일 실시예에서, 소위 유전 알고리즘(genetic algorithms)이 상기에 정의된 적정 스코어를 사용하여 서로 다른 마커를 조합하는데 이용될 수 있다. 유전 알고리즘은 특히, 매우 크고 다양한 집단의 잠재적 분류기들을 찾아내는데 상당히 적합하다. 다른 실시예에서, 소위 개미 집단 최적화(ant colony optimization)가 일련의 분류기를 생성하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 다른 진화적인 방법뿐만 아니라 모의 어닐링(simulated annealing) 및 다른 확률적 탐색법(stochastic search methods)을 포함하는 당업계에 공지된 다른 방법들도 사용될 수 있다. 메타휴리스틱 방법, 예를 들어 하모니 탐색법(harmony search) 또한 사용될 수 있다.
임상 샘플 획득
바이오마커를 선택하기 위해, 환자군 및 대조군을 도 1과 표 1에 기재된 연구 디자인에 따라 수집하였다. 환자군은 병기가 1기 내지 4기인 비소세포성 폐암을 가진 아시아인이다. 대조군은 건강한 일반인과 비악성 폐 결절을 가진 환자로 구성되었다. 각 샘플은 정맥 천자를 통해 추출하였고, 혈청은 일반적인 프로토콜에 따라 획득했다. 각각의 혈청은 영하 80°C 이하에서 동결하여 저장하였다.
후보 바이오마커 측정
후보 마커의 측정을 위해, 압타머-기반 다중 검정법을 도 2에 도시된 바와 같이 실시하였다. 광으로 절단가능한 링커를 통해, 비오틴 단편을 각 압타머에 연결한다. 간단히 말해서, 수정 압타머 혼합체를 희석 혈청과 혼합하였고, 3시간 동안 37°C에서 배양하여 평형 결합을 실시한다. 이후 상기 혼합액은 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 코딩된 플레이트에 이송되었고, 비오틴 태그를 통해 압타머-단백질 복합체를 압타머상에 포획하기 위해 30분 동안 배양하였다. 일련의 세척 단계를 실시하여 샘플에서 비결합 단백질을 제거하였다. 이후 비오틴을 포획된 단백질에 태깅하기 위해, 아민 반응성 비오틴 시약을 배양하였다. 그리고 나서, 자외선을 조사하여 압타머-단백질 복합체를 광 절단 반응을 통해 해제하였다. 상청액은 스트렙타아비딘(streptavidin)으로 코딩된 새 플레이트에 이송되었고, 비오틴 단편을 통해 복합체를 단백질상에 포획하기 위해 배양하였다. 일련의 세척 단계를 실시하여 비결합 압타머를 제거하였다. 이후 포획된 압타머를 용출 완충액으로 고 pH에 의해 해제하고 중성화하였다. 용출액은 검출 프로브와 루미넥스-비드 결합 포획 프로브와 탈수 반응을 겪는다. 루미넥스 비드 혼합체는 세척되어 루미넥스 200 기구를 사용하여 측정되고, 데이터는 루미넥스 3.1 소프트웨어를 사용하여 분석되었다.
바이오마커 값 조정(calibration)
검정 변화를 최소화하기 위해, 3 점 QC 샘플을 샘플과 함께 측정하였다. 3점은 검정법의 검출 범위에서 단백질 농도의 고레벨, 중레벨 및 저레벨을 나타낸다. QC 샘플은 혈청과 스파이크 단백질(spiked protein)으로 구성되고, 이전에 테스트한 명목값을 확인하였다. 각 검정시 QC 샘플을 테스트하여, QC 샘플에서 측정된 단백질 값을 명목 값과 비교하고 각 단백질에 대해 조정 인자를 생성하였다. 이후 검정 결과를 조정 인자를 이용하여 조정하였다.
비소세포성 폐암을 위한 바이오마커 선정
비소세포성 폐암을 위한 소규모의 바이오마커 셋을 선택하기 위해, 환자군과 대조군의 조정된 MFI 값을 비교하고, 누적 분포 그래프와 각 압타머에 대한 ROC 곡선을 도출했다 (도 4a 내지 4n). 각 마커는 곡선 아래 영역을 테스트하고 비교하였다.
나이브 베이지안 분류기 확립
다수의 변화량을 단일 스코어로 만들기 위해, 나이브 베이지안 분류기를 생성하였다. 비소세포성 폐암을 위한 바이오마커 리스트로부터, 7개의 마커를 선택하여 나이브 베이지안 분류기를 구성하였다. 단일 단백질 측정을 위한 나이브 베이지안 분류기를 하기에 설명한다. 단백질의 측정치가 x인 경우, 질병을 가질 확률은 P(d|x)이다. 그리고, 단백질의 측정치가 x인 경우, 질병을 가지지 않을 확률은 P(c|x)이다. P(d|x)> P(c|x)이면, 단백질 레벨 x는 질병으로 분류 될 수 있다. 베이즈 정리에 따라,
사후확률(posterior)=우도(likelihood) x 사전 확률(prior)/증거(evidence)
클래스-의존성 확률 밀도 함수, p(xi|c) 및 p(xi|d)는 평균 u와 편차 s2에 의해 규정되는 로그-노말 분포 함수로 모델링되며, 여기서 xi는 바이오마커 i에 대한 조정 MFI값의 로그치이다. 상기 7개의 바이오마커의 pdf를 위한 변수는 표 3에 기재되어 있고, 정규 pdf에 적합한 모델과 함께 비가공 데이터의 일예는 도 3에 도시된다. 이러한 모델을 위한 나이브 베이지안 분류는 다음 수식으로 나타나고, 여기서 p(d)는 집단의 질병 유병률이다.
우도 비율(likelihood ratio)=P(d|x)/P(c|x)=p(d)/(1-p(d)xPi(p(x|d)/ p(x|c))
로그 우도 비율은 질병 상태를 구분하기 위한 단일 스코어로 사용된다.
실시예들
하기 예들은 단지 예시적 목적을 위해 제공될 뿐이며, 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본원의 범위를 제한하지 않는다. 본원에 기재된 모든 예는 당업자에게 잘 알려진 표준 기술을 이용하여 실시되었다. 하기 예들에 설명한 일반적인 분자 생물학 기술은, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001)과 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기재된 대로 실시될 수 있다.
실시예 1
샘플 제조
샘플을 제조하기 위해, 전혈을 레드 탑 튜브(red top tube)에 보관하여야 한다. 전혈을 채취한 후, 혈액이 30분 동안 응고하도록 테스트 튜브를 상온에서 온전하게 배양한다. 이후, 냉장 원심 분리기에서 10분 동안 1,000 내지 2,000xg으로 원심분리하여 혈청과 혈전을 분리할 수 있다. 원심분리후, 상층부의 혈청을 즉시 청결한 튜브로 이동시켜야 한다. 샘플은 처리 과정에서 2 내지 8°C 온도로 유지되어야 한다. 혈청이 현장에서 분석되지 않으면, 상기 혈청을 즉시 소량 알리코트(aliquot)로 분주하여 영하 20°C 이하에서 저장해야 한다. 냉-해동 주기는 많은 혈청 성분에 치명적이므로 피하는 것이 중요하다. 용혈성, 황달성, 또는 고지혈성 샘플은 특정 테스트를 무효화할 수 있다.
실시예 2
다중 압타머 검정법에 의한 샘플 분석
본 실시예는 표 2에 기재된 비소세포성 폐암 바이오마커 식별을 위한 샘플을 분석하기 위해 사용되는 다중 압타머 검정법을 기술한다. 이들 방법에서는 용액을 첨가할 때마다 피펫 팁을 교체하였다.
또한, 달리 기재하지 않으면, 대부분의 용액 이동과 세척액 첨가는 BioTek EL 406 세척기와 디스펜서를 사용하였다. 달리 기재하지 않으면, 수작업으로 피펫하는 단계에서는 8-채널 P200 Pipetteman (Rainin Instruments, LLC, Oakland, Calif.)를 사용하였다. SB17로 불리는 맞춤 버퍼는 내부에서 제작하였고, 40mM HEPES, 101mM NaCl, 5mM KCL, 5mM MgCl2, 및 pH7.5의 1mM EDTA로 구성된다. 달리 언급하지 않으면, 모든 단계는 상온에서 실시되었다.
1. 압타머 스톡 용액(aptamer stock solution) 제조
2%, 0.1% 및 0.01% 혈청을 위한 맞춤 스톡 압타머 용액들을 1xSB17, 0.05% 트윈-20에서 2x 농도로 제조하였다.
이들 용액을 사용할 때까지 영하 20°C에서 보관하였다. 검정하는 날, 각 압타머 혼합액은 10분 동안 37°C에서 해동하여 10분 동안 끓는 수조에 두고 20분 동안 25°C로 식혀서, 각 단계 사이에 활발한 혼합이 일어났다. 가열-냉각 후, 각각의 2x 압타머 혼합액 55ul을 수작업으로 96-웰 PCR 플레이트에 피펫팅하고 플레이트를 호일로 밀봉하였다.
2. 검정 샘플 제조
영하 80°에서 보관된 동결 100% 혈청 알리코트를 5분 동안 25°C의 수조에 넣었다. 해동한 샘플을 얼음위에 두어 천천히 와류가 일도록 두고 이후 다시 얼음위에 두었다.
20ul 8-채널 피펫을 사용하여 3ul 샘플을 96-웰 PCR 플레이트들에 이동시킴으로써, 각 웰에는 4C에서 적정 샘플 희석액 72ul(1xSB17, 0.02% 트윈-20)을 담도록 하여 4% 샘플액(최종 2x)을 준비하였다. 여러 번 피펫팅하여 샘플들을 혼합한후, 4% 샘플 용액 4ul을 이동시켜 적정 샘플 희석액 76ul과 혼합하여 0.2% 샘플액(최종 2x)을 얻었다. 마지막으로, 0.2% 샘플액 6ul을 이동시켜 샘플 희석액 54ul와 혼합하여, 0.02% 샘플액(최종 2x)을 얻었다. 샘플 희석액을 준비한 후, 각 샘플 55ul을 평형 결합을 위해 새 PCR 플레이트로 이동시켰다.
3. 평형 결합
세 개의 가열-냉각 압타머 용액을 부피 55ul의 적정 샘플 희석액으로 이동시켰다. 샘플과 압타머 용액을 피펫팅하여 혼합하고 호일 커버를 덮었다. 이후 상기 플레이트를 3 시간 동안 37°C의 배양기에 두었다.
4. 캐치 1 (Catch 1)
평형 결합 단 계후, 압타머-샘플 혼합액 100ul을 스트렙타비딘으로 코팅된 새 플레이트로 옮기고 이 플레이트를 써모믹서(thermomixer)에 놓아두고, 30분 동안 (800rpm으로) 혼합하면서 37°C에서 배양했다. 빛을 피하기 위해, 상기 플레이트를 캐치 1 단계 내내 덮어두었다.
5. 자동화 단계 1: 세척, 태깅
캐치 1 단 계후, 상기 플레이트를 EL406 세척기와 디스펜서에 놓아 두었다. 상기 EL406 세척기와 디스펜서는 다음과 같은 단계를 실시하도록 프로그램화되었다: 흡수되지 않은 물질은 흡인을 통해 제거하고, 웰은 1mM 덱스트란 황산과 500uM 비오틴을 보충한 300ul의 완충액 PB1으로 4번 세척하였다. 이후 웰을 300ul의 완충액 PB1으로 3번 더 세척하였다.
완충액 PB1에서 새로 준비한 1mM NHS-PEG4-비오틴 용액 150uL을 웰에 첨가하여 5분 동안 흔들면서 배양하였다. 액체는 흡인되고 웰은 10mM 글리세린이 보충된 300ul의 완충액 PB1으로 8번 세척하였다. 1mM 덱스트란 황산을 보충한 100ul의 완충액 PB1을 첨가하였다.
6. 동적 유발(kinetic challenge), 광 절단 및 캐치 2
플레이트를 EL406 세척기와 디스펜서에서 꺼내서 20분 동안 5cm 거리를 둔 자외선 광원(LED 자외선 광원)하에 배치된 서모믹서에 올려 두었다. 상기 서모믹서는 800rpm 및 RT에 세팅되었다. 5분 동안 조사한 후, 샘플을 세척한 새 스트렙타비딘 코팅 플레이트에 수작업으로 옮겼다. 캐치 2 단계는 10분 동안 800rpm 및 상온의 서모믹서에서 실시되었다.
7. 자동화 단계 2: 세척, 용출
캐치 2 단계 후, 상기 플레이트를 EL406 세척기와 디스펜서에 놓아 두었다. 상기 EL406 세척기와 디스펜서는 다음과 같은 단계를 실시하도록 프로그램화되었다: 액체를 흡인하고, 25%의 플로필렌 글리콜을 보충한 300ul의 완충액 PB1으로 8번 세척하였다. 웰을 300ul의 완충액 PB1으로 5번 세척하고, 최종 세척액을 흡인하였다. 100ul의 CAPSO 용출 완충액을 첨가하고 압타머를 5분 동안 흔들면서 용출하였다.
8. 용출 및 중성화
이들 자동화 단계 이후에, 상기 플레이트를 플레이트 세척기의 덱으로부터 꺼내고, 90ul의 샘플 알리코트들을 수작업으로 10uL 중성화 완충액을 담고 있는 PCR 플레이트의 웰들에 옮겼다.
9. 루미넥스 독출
미소구체(microsphere)를 부유시키기 위해, 60초 동안 미소구체 스톡 용액에 와류를 일으키고 초음파 처리 하였다. 부유한 미소구체는 1.5xTMAC 혼성화 용액에서 매 반응당 2000개의 미소구체로 희석되고 와류 및 초음파 처리를 통해 혼합되었다. 매 반응당 33uL의 비드 혼합액을 96-웰 PCR 플레이트에 옮겼다. 1x TE 완충액에서 15nM 비오틴화된 검출 올리고뉴클레오타이드 스톡 7ul을 매 반응마다 첨가하고 혼합하였다. 중성화된 검정 샘플 10ul을 첨가하고, 상기 플레이트를 실리콘 캡 매트 실로 밀봉하였다. 상기 플레이트를 먼저 5분 동안 96C에서 배양하고 유전자 증폭기에서 하루 밤 동안 교반하지 않고 50C에서 배양했다. 필터 플레이트를 0.5% BSA가 보충된 0.005x TMAC 혼성화 용액으로 미리 적셔두었다. 상기 혼성화 반응으로부터 샘플 전체를 필터 플레이트에 옮겼다. 상기 혼성화 플레이트는 0.5% BSA가 보충된 0.005x TMAC 혼성화 용액 75ul로 헹구고, 잔존 물질은 필터 플레이트로 옮겼다. 샘플들을 느린 진공 하에서 필터링하였다. 상기 필터 플레이트는 0.5% BSA가 보충된 0.005x TMAC 혼성화 용액 75ul로 한번 세척하고, 필터 플레이트에 있는 미소구체는 샘플 완충액애서 한번 더 부유 처리되었다. 필터 플레이트는 차광하여 1000rpm으로 5분 동안 서모믹서에서 배양하였다. 이후 필터 플레이트를 0.5% BSA를 포함하는 0.005x TMAC 용액으로 세척하였다. 0.5% BSA를 포함하는 0.005x TMAC 용액에서 10ug/ml SAPE 075ul을 각 반응마다 첨가하고 1시간동안 1000rpm으로 25°C의 서모믹서에서 배양하였다. 필터 플레이트를 0.5% BSA를 포함하는 0.005x TMAC 용액으로 두 번 세척하고, 필터 플레이트에 있는 미소구체는 0.5% BSA를 포함하는 0.005x TMAC 혼성화 용액 75ul로 한번 더 부유 처리되었으며, XPonent 3.0 소프트웨어를 가동하는 루미넥스 200 기구상에서 분석하였다. 7500 내지 18000의 고 PMT 조정 및 더블릿 판별기 세팅하에서, 비드 유형당 적어도 100개의 미소구체를 계수하였다.
실시예 3
바이오마커 식별
검정 변화를 최소화하기 위해, 3 점 QC 샘플을 샘플과 함께 측정하였다. 3점은 검정법의 검출 범위에서 단백질 농도의 고레벨, 중레벨 및 저레벨을 나타낸다. QC 샘플은 혈청과 스파이크 단백질(spiked protein)으로 구성되고, 이전에 테스트한 명목값을 확인하였다. 각 검정시 QC 샘플을 테스트하여, QC 샘플에서 측정된 단백질 값을 명목 값과 비교하고 각 단백질에 대해 조정 인자를 생성하였다. 조정 인자를 명목 값/테스트 값으로 지칭할 수 있다. 이후 검정 결과를 조정 인자를 이용하여 조정하였다.
비소세포성 폐암을 위한 소규모의 바이오마커 셋을 선택하기 위해, 환자군과 대조군의 조정된 MFI 값을 비교하고, 각 압타머에 대한 ROC 곡선을 도출했다 (도 4a 내지 4n). 각 마커는 곡선 아래 영역을 테스트하고 비교하였다.
실시예 4
비소세포성 폐암을 위한 나이브 베이지안 분류기 트레이닝
다수의 변화량을 단일 스코어로 만들기 위해, 나이브 베이지안 분류기를 생성하였다. 비소세포성 폐암을 위한 바이오마커 리스트로부터, 7개의 마커를 선택하여 나이브 베이지안 분류기를 구성하였다. 단일 단백질 측정을 위한 나이브 베이지안 분류기를 하기에 설명한다. 단백질의 측정치가 x인 경우, 질병을 가질 확률은 P(d|x)이다. 그리고, 단백질의 측정치가 x인 경우, 질병을 가지지 않을 확률은 P(c|x)이다. P(d|x) > P(c|x)이면, 단백질 레벨 x는 질병으로 분류될 수 있다. 베이즈 정리에 따라,
사후확률(posterior)=우도(likelihood) x 사전 확률(prior)/증거(evidence)
클래스-의존성 확률 밀도 함수, p(xi|c) 및 p(xi|d)는 평균 u와 편차 s2에 의해 규정되는 로그-노말 분포 함수로 모델링되며, 여기서 xi는 바이오마커 i에 대한 조정 MFI값의 로그치이다. 상기 7개의 바이오마커의 pdf를 위한 변수는 표 3에 기재되어 있고, 정규 pdf에 적합한 모델과 함께 비가공 데이터의 일예는 도 5a 내지 5c에 도시된다. 이러한 모델을 위한 나이브 베이지안 분류는 다음 수식으로 나타나고, 여기서 p(d)는 집단의 질병 유병률이다. 질병의 우도 P(d|x)/P(c|x)는 하기와 같이 표현될 수 있다.
P(d|x)/P(c|x)=p(d)/(1-p(d) x Pi(p(x|d)/p(x|c))
로그 우도 비율(P(d|x)/P(c|x))은 질병 상태를 구분하기 위한 단일 스코어로 사용된다.
7-마커 분류기를 위한 변수는 표 4에 기재된 바와 같이 산출되었다. 그리고 트레이닝된 분류기는 도 5a 내지 5c 및 도 7에 도시된 바와 같이, 질병 구분 성능을 보여주었다.
실시예 5
진단 성능의 손실없이, 패널에 요구되는 바이오마커의 최소 개수를 최적화하기 위해, 탐욕 후진 제거 알고리즘(greedy backward elimination algorithm)을 사용했다. 간단히 말해서, 7개의 6-마커 분류기들을 구성하였으나 상기 7-마커 모델에 비해서 성능이 떨어졌다 (도 6a 내지 6g 및 표 6). 폐암 진단을 위한 패널을 단순화하기 위해, 최소 개수의 단백질을 가지고 최적 성능을 내도록 최종 7-마커 모델을 선택했다.
실시예 6
7-마커 분류기의 검증
분류기의 질병 구별 성능을 검증하기 위해, 테스트하지 않은 샘플들을 압타머 기반 다중 검정법으로 측정하였다. 7개의 마커들의 측정치를 7-마커 분류기에 적용하였고, 이들은 트레이닝 세트를 가진 유사한 ROC 곡선을 보여주었다 (도 5a 내지 5c 및 도 7, 표 5).
실시예 7
종래의 혈액 테스트와 성능 비교, Cyfra 21-1
7-마커 분류기의 성능을 비교하기 위해, 샘플 전부를 Cyfra 21-1 Elisa 키트를 사용하여 테스트했다. 효소-테스트 Cyfra 21-1(DRG Instruments GmbH, Germany)은 일반적인 샌드위치 프로토콜을 따라 효소 면역검정 기술에 기초한다. Cyfra 21-1의 농도는 표준 곡선으로부터 산출하였다. 검정법의 민감도는 0.15ng/mL이었다. Cyfra 21-1의 ROC 곡선을 그려서 7-마커 분류기의 ROC 곡선과 비교하였다 (도 7a 및 7b).
상기 분류기의 AUC는 모든 비소세포성 폐암 케이스에서 0.88, 초기 폐암 환자들 (1기 및 2기)에게서 0.83으로 관찰되었으며, 반면에 Cyfra 21-1는 모든 케이스에 대해 0.72의 AUC, 초기 폐암 환자에게서는 0.63의 AUC를 보였다 (도 7a 및 7b).
트레이닝 셋 검증 셋
환자군 대조군 환자군 대조군
대상 수 75 75 25 25
평균 연령 (세) 61.4 58.4 61.16 59.2
중간 연령 (세) 63 58 59 57
조직 병리
편평상피 세포 암 21 8
선암 53 17
대세포 암 1
병기
1기 21 9
2기 8 4
3기 14 2
4기 32 10
성별
남 46 50 19 18
여 29 25 6 7
흡연 이력
비흡연자 27 28 7 9
현재 흡연자 22 26 9 7
과거 흡연자 26 21 9 9
양성 결절 34 14
단백질 이름
EGFR1 표피 성장 인자 수용체 1(epidermal growth factor receptor 1)
MMP7 매트릭스 메탈로 프로티나제 7(matrix metallo-proteinase 7)
CA6 탄산 탈수 효소 6(carbonic anhydrase 6)
PTN 플레이오트로핀(pleiotrophin)
CRDL1 코르딘-유사 단백질 1 (chordin-like protein 1)
IGFBP2 인슐린 유사 성장 인자 결합 단백질 2 (insulin like growth factor binding protein 2)
MMP12 매트릭스 메탈로 프로티나제 12(matrix metallo-proteinase 12)
CNDP1 카르노신 디펩티다제(carnosine dipeptidase)
KIT 줄기 세포 성장 인자 수용체
SERPINF2 알파2-안티플라즈민(alpha2-antiplasmin)
CRP C-반응성 단백질(C-reactive protein)
C9 보체 성분 9(complement component 9)
SELL L-셀렉틴(L-selectin)
SERPINA3 알파-1-안티치모트립신(alpha-1-antichymotrypsin)
단백질 ROC 곡선상의 AUC 중요도 방향 설명
EGFR1 0.69 p<0.0001 하 수용체 티로신 키나제
MMP7 0.61 p=0.02447 상 세포외 기질의 붕괴, 셀 증식에 대한 긍정적인 규제, 콜라겐 분해대사, 피브로넥틴을 저하시킴
CA6 0.7 p<0.0001 하 이산화 탄소의 가역적 수화 반응, 일-탄소 대사(one-carbon metabolism), 질소 대사
KIT 0.56 p=0.1784 하 디코이 수용체(decoy receptor)
CRP 0.66 p<0.001 상 염증성 급성기 반응 물질, 면역 반응 물질
C9 0.73 p<0.0001 상 염증성 급성기 반응 물질, 세포 용해 MAC 복합체의 구멍 형성 소단위
SERPINA3 0.66 p<0.001 상 세린 프로티아제 억제제(seine protease inhibitor), 급성기 반응 및 조직 항상성 일부
대조군 비소세포성 폐암
분석물 균 (μc) 표준편차 (σc) 평균 (μd) 표준편차 (σd)
EGFR1 2.89 0.06 2.82 0.10
MMP7 2.60 0.16 2.74 0.31
CA6 2.26 0.16 2.04 0.22
KIT 1.81 0.10 1.77 0.10
CRP 2.86 0.38 3.34 0.68
C9 4.08 0.13 4.21 0.13
SERPINA3 2.84 0.11 2.96 0.17
양성 음성
환자군 전체 케이스 75 25 100 75.00% 민감도
트레이닝 58 17 75 77.30%
검증 17 8 25 68.00%
초기 (1기, 2기) 26 16 42 61.90%
트레이닝 20 9 29 69.00%
검증 6 7 13 46.20%
대조군 전체 대조군 27 73 100 73.00% 특이도
트레이닝 21 54 75 72.00%
검증 6 19 25 76.00%
양성 결절 4 44 91.70%
트레이닝 4 30 34 88.20%
검증 0 14 14 100%
마커 75% 민감도에서의 특이도
EGFR1, MMP7, CA6, KIT, CRP, C9, SERPINA3 91.70%
MMP7, CA6, KIT, CRP, C9, SERPINA3 79.20%
EGFR1, CA6, KIT, CRP, C9, SERPINA3 81.30%
EGFR1, MMP7, KIT, CRP, C9, SERPINA3 62.50%
EGFR1, MMP7, CA6, CRP, C9, SERPINA3 89.60%
EGFR1, MMP7, CA6, KIT, C9, SERPINA3 87.50%
EGFR1, MMP7, CA6, KIT, CRP, SERPINA3 89.60%
EGFR1, MMP7, CA6, KIT, CRP, C9 89.60%

Claims (28)

  1. 보체 성분 C9, 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase) 6 (CA6), C-반응성 단백질(CRP), 표피 성장 인자 수용체 1(EGFR1), 매트릭스 메탈로 프로티나아제 7(MMP7), 알파1-안티프로티아제(SERPINA3) 및 줄기 세포 성장 인자 수용체(KIT)의 바이오마커 단백질들을 포함하는 바이오마커 패널을 제공하고,
    상기 패널의 바이오마커 단백질들과 각각 대응되는 바이오마커 값을 부여하기 위해, 사람으로부터 얻은 생물학적 샘플에서 상기 바이오마커 단백질들을 검출하는 단계를 포함하는,
    상기 바이오마커 값들에 기초하여 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커 값들을 검출하는 단계는 시험관 내 검정을 실시하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 시험관 내 검정은 상기 바이오마커 단백질 각각에 대응되는 하나의 포획 시약을 포함하고, 압타머, 항체 및 핵산 프로브로 이루어지는 군에서 적어도 하나의 포획 시약을 선택하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 적어도 하나의 포획 시약은 압타머임을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 전혈, 혈장 및 혈청으로 이루어지는 군에서 선택됨을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 생물학적 샘플은 혈청임을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 사람은 아시아인임을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 사람은 흡연자임을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 사람은 악성 폐 결절을 가짐을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
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  16. 제1항에 있어서,
    상기 바이오마커 값들은, 실시간 PCR, 마이크로어레이 및 루미넥스 마이크로비드 검정법(Luminex microbead assay)으로 이루어지는 군으로부터 측정됨을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 비소세포성 폐암은 통계적인 방법으로 진단됨을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  18. 제1항에 있어서,
    통계적인 방법은 선형 판별 분석, 로지스틱 회귀 분석, 나이브 베이지안 분류, 지지 벡터 머신 및 랜덤 포레스트(random forest)로 이루어지는 군으로부터 선택됨을 특징으로 하는 비소세포성 폐암을 진단하기 위해 정보를 제공하는 방법.
  19. 사람으로부터 비소세포성 폐암을 진단하기 위한 단백질 바이오마커 패널에 있어서, 상기 패널은 보체 성분 C9, 탄산 탈수효소(carbonic anhydrase) 6 (CA6), C-반응성 단백질(CRP), 표피 성장 인자 수용체 1(EGFR1), 매트릭스 메탈로 프로티나아제 7(MMP7), 알파1-안티프로티아제(SERPINA3) 및 줄기 세포 성장 인자 수용체(KIT)의 바이오마커 단백질들을 포함하는 단백질 바이오마커 패널.
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  26. 제19항에 있어서,
    상기 사람은 아시아인임을 특징으로 하는 단백질 바이오마커 패널.
  27. 제19항에 있어서,
    상기 사람은 흡연자임을 특징으로 하는 단백질 바이오마커 패널.
  28. 제19항에 있어서,
    상기 사람은 악성 폐 결절을 가짐을 특징으로 하는 단백질 바이오마커 패널.
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