CN109270276A

CN109270276A - 卵巢癌的尿液蛋白标志物及其诊断用途

Info

Publication number: CN109270276A
Application number: CN201811331633.5A
Authority: CN
Inventors: 高友鹤; 李育秋; 张琳珮
Original assignee: Beijing Normal University
Current assignee: Beijing Normal University
Priority date: 2018-11-09
Filing date: 2018-11-09
Publication date: 2019-01-25

Abstract

本发明涉及卵巢癌的尿液蛋白标志物及其诊断用途。具体而言，本发明涉及利用大鼠卵巢内原位注射卵巢癌细胞和质谱分析获得的尿蛋白标志物，在人卵巢癌的诊断、病程监测中的用途，所述尿蛋白标志物选自胱硫醚γ‑裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A‑1、OX‑2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β‑氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α‑1‑酸糖蛋白等。本发明中获得的尿液差异蛋白为卵巢癌的早期诊断、病程监测提供一种更简单、快捷、无创的选择。

Description

卵巢癌的尿液蛋白标志物及其诊断用途

技术领域

本发明涉及临床医学；具体涉及人卵巢癌相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用上皮性卵巢癌原位大鼠疾病模型和质谱分析蛋白组学技术获得的人卵巢癌诊断和/或监测相关的尿液蛋白标志物及其用途。

背景技术

疾病生物标志物是与病理生理过程相关的可测量的变化，用于诊断疾病、监测病程、预测疾病预后和评估治疗效果等。

尿液作为机体经由泌尿系统及尿路排出体外的液体排泄物，不受稳态机制的调控，能够富集全身的变化，而且早期、敏感，尿液是理想的疾病标志物来源。因其变化早又敏感，可以反映各种疾病早期的变化。这些变化就是潜在的疾病标志物^[1]。尿液蛋白质组技术(urinary proteomics)作为一种快速发展的分析工具，可以在尿液里挖掘疾病相关的早期生物标志物，目前尿蛋白组分析深度可鉴定到6000多个蛋白^[2]。在疾病标志物的研究中具有重大的临床应用前景。

卵巢癌(ovarian cancer)是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，卵巢癌死亡率却占各类妇科肿瘤的首位。有研究统计，卵巢癌死亡率占女性癌症总死亡率的5％^[3]。由于卵巢的胚胎发育、组织解剖及内分泌功能较复杂，早期症状不典型，术前鉴别卵巢肿瘤的组织类型及良恶性相当困难，大约60-70％的卵巢癌患者确诊时已经处于III-IV期或诊断时伴有腹部转移。目前临床的诊断方法有B超检查、X线检查、CT及磁共振检查等，主要的筛查方法是经阴道超声检查，血清CA-125等。一直以来，虽然血液卵巢癌标志物、腹部超声和阴道超声检查皆因敏感性和特异性不高问题而备受困扰，手术、放疗、化疗、生物靶向治疗等治疗手段有所改善，但5年生存率只有40％左右，预后差^[4]。尽管近年来卵巢癌的诊断技术在不断发展，但仍然有很多病人未能以现有的诊断技术在卵巢癌的早期阶段进行诊断。为了减少卵巢癌的发病率和死亡率，需要考虑针对卵巢癌的新的筛查和早期诊断和过程检测的方法^[5]。

目前，已有报道利用动物模型模拟疾病进展，通过质谱鉴定尿液蛋白寻找早期疾病标志物，包括肾小球疾病^[6]、梗阻性肾病^[7]、肺纤维化^[8]、肝纤维化^[9]、多发性硬化^[10]、心肌炎^[11]、胰腺炎^[12]、以及皮下肿瘤^[13]和脑胶质瘤^[14]等疾病，这些研究通过尿液蛋白质组的方法寻找疾病早期的潜在生物标志物。

因此，在早期用非侵入性的方法寻找的生物标志物对于卵巢癌的早期诊断、病程监测和预后有重要意义。

发明内容

鉴于在本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方案，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断卵巢癌的试剂中的用途：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、及其任意组合。

在另一个实施方案中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于受试者的卵巢癌早期诊断的试剂中的用途：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、及其任意组合。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在卵巢癌的早期损伤：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、及其组合。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在卵巢癌的早期损伤：载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、及其组合。

在一个具体的实施方案中，卵巢癌的早期或早期损伤是指卵巢肿瘤仅局限于一侧卵巢，未发生其他器官侵袭，对应的是临床上的卵巢癌的I期，即，卵巢肿瘤仅局限于一侧卵巢或双侧卵巢，包膜完整，腹腔内器官无肿瘤细胞的侵袭。

在另一个实施方案中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断或监测受试者的卵巢癌肿瘤中期的试剂中的用途：芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2及其组任意合。

在一个具体的实施方案中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，根据受试者的尿液中蛋白标志物的表达水平的变化情况来判断受试者的卵巢癌的病程进展阶段，具体地，判断是否进展至卵巢癌肿瘤进展中期。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于卵巢癌肿瘤进展中期：芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、及其组合。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于卵巢癌肿瘤进展中期：单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、及其组合。

在一个具体的实施方案中，卵巢癌肿瘤进展中期是指卵巢肿瘤仅局限于一侧卵巢，手术对侧卵巢和大网膜发生侵袭，对应是临床上是卵巢癌的Ⅱ期，即卵巢癌肿瘤累及双侧卵巢，伴有部分腹膜转移。

在另一个实施方案中，提供了选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断或监测受试者的卵巢癌肿瘤晚期的试剂中的用途：cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15、及其任意组合。

在一个具体的实施方案中，对受试者进行取样，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，根据受试者的尿液中蛋白标志物的表达水平的变化情况来判断患者是否处于卵巢癌肿瘤晚期。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于卵巢癌肿瘤晚期阶段：cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M、及其组合。

在一个具体的实施方案中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于卵巢癌肿瘤晚期阶段：纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15、及其组合。

在一个具体的实施方案中，卵巢癌肿瘤晚期是指对应临床上卵巢癌的Ⅲ和Ⅳ期，即卵巢癌肿瘤累及双侧卵巢，并伴有腹腔内卵巢、大网膜、膈膜等器官严重侵袭。

在本说明书中，提及的卵巢癌的I期、Ⅱ期、Ⅲ和Ⅳ期参照国际妇产科联盟(International Federation of Gynecology and Obestetrics,FIGO)2013年《FIGO2013卵巢癌、输卵管、腹膜癌分期》。

在上述实施方案中，健康对照是指未患有卵巢癌的受试者。

适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方案中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。

在一个具体的实施方案中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')₂、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。

在本公开的实施方案中，所述卵巢癌按组织类型分类选自：上皮性卵巢癌和非上皮性卵巢癌。其中，上皮性卵巢癌包括但不限于：浆液性囊腺癌、粘液性囊腺癌、子宫内膜样癌、透明细胞癌、未分化癌、移行细胞肿瘤、混合上皮肿瘤和未分类上皮性肿瘤。非上皮性卵巢癌包括三种亚类：1、生殖细胞肿瘤，包括：无性细胞瘤、內胚窦瘤、胚胎癌、多胚瘤、绒毛膜癌、畸胎瘤和混合性生殖细胞肿瘤等；2、性索-间质肿瘤，包括：支持-间质细胞肿瘤、颗粒-间质细胞肿瘤、两性母细胞瘤和男性母细胞瘤；3、其它肿瘤，包括：脂肪细胞肿瘤、性腺母细胞瘤、非特异性软组织肿瘤、未分类肿瘤(参见WHO(2014年及其更新版本)卵巢肿瘤组织学分类标准)。

在本公开的实施方案中，所述卵巢癌按照分类属于原发性上皮性卵巢癌。

在一个具体的实施方案中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。

在一个具体的实施方案中，表达水平是在尿液样本中测定的。

根据另一个实施方案，还提供了一种用于诊断卵巢癌疾病的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、及其组合。

在一个实施方案中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一个实施方案中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一个实施方案中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。在另一个实施方案中，所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂。

在一个具体的实施方案中，提供了一种卵巢癌早期诊断的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、及其组合。

在另一个具体的实施方案中，提供了一种用于诊断或监测受试者卵巢癌肿瘤进展中期的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、及其组合。

在另一个具体的实施方案中，提供了一种用于诊断或监测受试者卵巢癌肿瘤晚期的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂或者由选自以下的蛋白的鉴定试剂组成：cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15、及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者中卵巢癌的方法，其包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，

3)确定所述受试者和健康对照的的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：

胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、及其组合。

4)确定所述受试者是否具有卵巢癌。

在一个具体的实施方案中，使用质谱方法、ELISA方法、Western方法确定表达水平，具体是蛋白表达水平。

当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在一个具体的实施方案中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。

根据一些实施方案，提供了一种用于早期诊断受试者中卵巢癌的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、载脂蛋白A-I、及其组合；

3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者是否具有卵巢癌的早期损伤。

其中，和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者存在卵巢癌的早期损伤：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT及其组合；和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者存在卵巢癌的早期损伤：载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断或监测受试者中卵巢癌肿瘤进展中期的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2及其组合，

3)将受试者所述蛋白的表达水平和健康对照所述蛋白的表达水平进行比较，

4)确定所述受试者的卵巢癌是否处于中期阶段。

其中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于卵巢癌中期阶段：芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区及其组合；相较于健康对照，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于卵巢癌中期阶段：单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2及其组合。

根据一些实施方案，提供了一种用于诊断受试者卵巢癌晚期的方法，包括步骤：

1)获得受试者和健康对照的尿液样本，

2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15及其组合，

4)确定所述受试者的是否处于肿瘤晚期状态。

其中，相较于健康对照，受试者中选自以下的蛋白的表达水平提高指示所述受试者处于肿瘤晚期状态：cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M及其组合；和健康对照中的蛋白的表达水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者处于肿瘤晚期状态：纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15、及其组合。

附图说明

图1：卵巢癌原位模型实验组大鼠和假手术对照组大鼠体重监测结果；●代表模型实验组；■代表假手术对照组。*表示p<0.05。

图2A-1至图2D-5分别代表卵巢癌造模手术侧卵巢、大网膜、手术对侧卵巢、膈膜肿瘤组织HE染色放大倍数为40×的病理结果。

图2A-1至图2A-5分别代表卵巢癌实验大鼠手术侧卵巢的对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

图2B-1至图2B-5分别代表卵巢癌实验大鼠大网膜组织的对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

图2C-1至图2C-5分别代表卵巢癌实验大鼠手术对侧卵巢对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

图2D-1至图2D-5分别代表卵巢癌实验大鼠膈膜对照组、造模第7天、第14天、第28天、第42天大鼠肿瘤组织HE染色结果。

具体实施方式

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。

实施例

实施例1.肿瘤动物模型的建立

1.Nutu-19大鼠卵巢癌细胞来源于同种Fischer344大鼠的卵巢上皮癌细胞系，组织学类型是临床最常见的上皮性卵巢癌浆液性乳头状囊腺癌，其肿瘤生长方式、疾病进展过程亦与临床卵巢癌相似，均是盆腔、腹腔播散生长，以大量腹水、消瘦、远方转移而致死，符合临床的上皮性卵巢癌的诊断标准。利用Nutu-19大鼠卵巢癌细胞原位注射大鼠一侧卵巢的动物模型来模拟人原发性上皮性卵巢癌疾病发展过程，研究卵巢癌发生过程中肿瘤进展情况和病理生理及形态学的变化，寻找上皮性卵巢癌的早期尿液蛋白标志物。

利用该动物模型模拟肿瘤的发病过程，观察肿瘤从正常、早期肿瘤、肿瘤进展及肿瘤晚期的整体变化，对临床上早期诊断卵巢癌、监测卵巢癌的病情进展重要的指导意义。

2.材料与试剂

1)仪器：

大鼠代谢笼：购自北京佳源兴业科技有限公司。Thermo orbitrap fusion lumos质谱仪：购自Thermo Fisher Scientific公司；Thermo EASY-Nlc1200高效液相色谱仪：购自Thermo Fisher Scientific公司；MillliQ RG超纯水系统：购自Millipore公司；C18反相分析柱(RP柱,0.1×150mm,3μm,)：购自Michrom Bioresources公司。

2)主要试剂：

去离子水来源于MillliQ RG超纯水系统；色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Merck公司购买；测序级胰酶从Sigma公司购买。

3)动物：

雌性Fischer344大鼠(体重110-120g)购自北京维通利华实验动物技术有限公司，在标准饲养环境中饲养。

3.实验方法

1)肿瘤细胞的传代：将冻存的Nutu-19卵巢癌细胞(购自上海美轩生物科技有限公司)快速37℃复苏后，进行体外贴壁培养，按照1：3传代比进行传代培养、经过2周扩大培养后收集卵巢癌细胞。

2)肿瘤的接种：模型组用无菌生理盐水将体外培养的肿瘤细胞4×10⁶个/ml，将5μl肿瘤细胞悬液通过微量注射器注射到大鼠左侧卵巢包膜内。对照组在大鼠同侧卵巢癌注射5μl生理盐水。

3)样本收集流程：在造模之前，将大鼠置于代谢笼中收集正常尿液，在造模之后分别于第7、14、28、42天将大鼠置于代谢笼中收集尿液样本。同时每次收尿前测量造模后模型组大鼠和正常大鼠的体重。

4)指标检测：

体重监测：每天测量造模后模型组大鼠和对照组大鼠的体重

组织病理学：在造模第7、14、28、42天，将实施例1中的部分大鼠安乐死并取大鼠手术侧卵巢、手术对侧卵巢、大网膜、膈膜等组织。将组织从每个动物中取出，并在4℃下在4％甲醛通过浸入固定。切片，后用H&E染色观察各组织发生的病理变化。

测试例

测试例1.组织病理学检查

在大鼠肿瘤造模42天，将实施例1中的大鼠安乐死并取大鼠皮下肿瘤组织用福尔马林固定，蜡块包埋后进行HE染色。

测试例2.蛋白质分析

1.尿蛋白提取与保存：各时段尿液于4℃2000g离心20分钟，取上清，置于新EP管内，继续12000g 4℃离心20分钟；取上清，-80℃保存。

2.乙醇沉淀尿液蛋白，用Bradford法测蛋白浓度后进行膜上酶切，参见Wisniewski JR,Zougman A,Nagaraj N,Mann M.Universal sample preparation methodfor proteome analysis.Nature methods 2009；6:359-62。BCA法测量多肽浓度。

3.LC-MS/MS串联质谱分析：

将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过Thermo液相系统EASY-nLC 1200上样系统分离。洗脱时间90分钟，色谱柱流速为0.3μl/min。洗脱梯度为5％至40％流动相B(流动相A为：0.1％甲酸；流动相B为：89.9％乙腈)。洗脱下的肽段使用ThermoOrbitrap Lumos质谱仪进行分析。采用阳离子模式，母离子和子离子的分辨率为120000。

4.数据库检索：

所有质谱结果用mascot软件进行数据库检索。所用数据库为Swissprot_rat。检索条件为：胰酶酶切；允许有2个漏切位点；半胱氨酸+57Da的固定修饰；质谱数据检索容许误差为：母离子0.05Da，子离子0.05Da。

5.蛋白相对定量：

所有质谱结果通过初级LC-MS/MS软件进行相对定量结果分析。软件操作根据文献中所示方法使用(参见Hauck SM,Dietter J,Kramer RL等人.Deciphering membrane-associated molecular processes in target tissue of autoimmune uveitis bylabel-free quantitative mass spectrometry.Molecular&cellular proteomics:MCP2010；9:2292-305)。

6.统计分析

将不同时间点的蛋白组数据进行统计分析，筛选出于造模前0天相比谱图数变化倍数在1.5倍以上或0.67倍以下，p值小于0.05的蛋白作为差异蛋白。

实验结果

1.体重变化

如图1所示，从第28天起模型实验组的体重稍低于假手术对照组，但实验组与对照组体重无明显的统计学差异，这说明了卵巢癌发病较隐匿，早期症状不明显，另一方面，在体重发生显著变化前，尿里就能看出疾病相关的变化。

2.病理检测结果

如图2A-1至图2D-5，HE染色结果显示：对照组，显示正常的组织结构(图2A-1、图2B-1、图2C-1及图2D-1)；Nutu-19卵巢癌细胞原位注射的大鼠模型实验组，造模后：

第7天，手术侧卵巢有癌细胞，其他器官未发现肿瘤的侵袭，第14天手术侧卵巢发现癌细胞，大网膜未发现肿瘤侵袭，说明处于卵巢癌早期；

第28天手术侧卵巢发现癌细胞大网膜有侵袭，在手术对侧卵巢和膈膜的开始有肿瘤侵袭，说明处于卵巢癌进展中期；

第42天手术侧卵巢发现癌细胞，大网膜、膈膜、手术对侧卵巢侵袭较严重，说明处于卵巢癌晚期。

病理显示肿瘤细胞排列混乱，大小形态不一，核大深染，异型性明显，可见核分裂像，胞质异常。组织类型是低分化浆液性乳头状囊腺癌上皮性卵巢癌。说明肿瘤模型造模成功(图2A-1至图2D-5)。

3.蛋白鉴定结果

对照组和Nutu-19卵巢癌原位模型实验组大鼠(n＝4)的尿液经过质谱鉴定5个时间点(0天、7天、14天、28天和42天)，分别进行2次技术重复。在FDR(假阳性筛查)小于1％的水平，基于两肽以上鉴定的蛋白为614个。

与0天蛋白定量的显示谱图数进行比对，筛选出其他时间点变化倍数在1.5倍以上或0.67倍以下，p值小于0.05的差异蛋白，同时使用Uniprot数据库将大鼠蛋白转化为相应的人同源蛋白。

与对照组的相比，卵巢癌原位大鼠模型7天组尿中的大鼠差异蛋白为4个、卵巢癌原位大鼠模型14天组尿中的大鼠差异蛋白为11个卵巢癌原位大鼠模型28天组尿中的大鼠差异蛋白为20个、卵巢癌原位大鼠模型42天组尿中的大鼠差异蛋白为28个。

将不同时间点的卵巢癌原位动物模型模型与对照组大鼠尿蛋白进行比较，经过ANOVA统计学分析以及变化倍数筛选，可靠的差异蛋白人同源的有48个，分别为：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白。

相较于对照，卵巢癌原位模型实验组中表达水平提高的尿蛋白共18个，分别为胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1。

相较于对照，卵巢癌原位模型实验组中表达水平降低的尿蛋白的30个，分别为载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白。

由于在建模后第7天，卵巢癌原位实验模型组和对照组大鼠病理检测，与对照组相比，除手术侧卵巢有癌细胞外，其他组织的未出现侵袭。第14天，卵巢癌原位实验模型组和对照组大鼠病理检测，除手术侧卵巢有癌细胞外，大网膜开始出现的细胞形态异常，推测有略微侵袭，病理显示处于卵巢癌早期，因此，在卵巢癌原位实验模型组早期(造模7天和14天)筛选出差异蛋白14个(具体参见表1)，这些蛋白可以作为卵巢癌早期诊断的生物标志物，转化为人同源蛋白后，具体为：胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT的表达水平提高；载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白的表达量降低。

表1.卵巢癌早期诊断的尿液蛋白标志物

由于在建模后第28天时，卵巢癌原位动物模型组相比对照组大鼠病理HE染色显示。大网膜进一步侵袭，手术对侧卵巢开始出现侵袭转移。因此，对第28天的卵巢癌原位动物模型组被鉴定到质谱差异蛋白进行汇总，可以用于指示卵巢癌的肿瘤进展中期(具体参见表2)。

表2.卵巢癌肿瘤中期的尿液蛋白标志物

由于在建模后第42天时，卵巢癌原位动物模型组相比对照组大鼠病理HE染色显示；手术对侧卵巢、大网膜侵袭进一步严重、膈膜开始出现侵袭移。因此，对第42天的卵巢癌原位动物模型组被鉴定到质谱差异蛋白进行汇总，可以用于指示卵巢癌的肿瘤进展晚期，这一阶段特异出现的差异蛋白作为肿瘤晚期的诊断标记物。

表3.卵巢癌肿瘤晚期的蛋白标志物

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Claims

1.选自以下的蛋白的鉴定试剂在制备用于诊断受试者中的卵巢癌的试剂中的用途：

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌的早期诊断，所述蛋白选自：

胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、及其组合。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌肿瘤进展中期的诊断或监测，所述蛋白选自：

芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、Rab GDP解离抑制剂β、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、单核细胞分化抗原CD14、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、及其组合。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述诊断是指受试者的卵巢癌肿瘤晚期的诊断或监测，所述蛋白选自：

cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、羧肽酶Q、Igγ-2A链C区、Igγ-1链C区、溶质载体家族22名成员7、酒精脱氢酶1、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、血管紧张素转换酶、载脂蛋白M、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、OX-2膜糖蛋白、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、酒精脱氢酶[NADP(+)]、β-烯醇酶、双糖链蛋白聚糖、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、富含亮氨酸重复蛋白15、及其组合。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，

优选地，所述抗体是单克隆抗体。

6.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述受试者是哺乳动物，优选是人。

7.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，通过所述鉴定试剂，在所述受试者的尿液样本中测定的所述蛋白的表达水平，

任选地，所述表达水平是核酸表达水平或蛋白表达水平。

8.根据权利要求1至4中任一项所述的用途，其中，所述卵巢癌是上皮性卵巢癌。

9.一种用于诊断受试者中卵巢癌的试剂盒或芯片，其包含选自以下的蛋白的鉴定试剂：

胱硫醚γ-裂解酶、Rab GDP解离抑制剂β、酯水解酶C11orf54同系物、中性和碱性氨基酸转运蛋白rBAT、载脂蛋白A-1、OX-2膜糖蛋白、带电多泡体蛋白质5、β-氨基己糖苷酶亚基β、单核细胞分化抗原CD14、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、钙粘蛋白1、胃亚蛋白酶、丝氨酸蛋白酶抑制剂A3M、α-1-酸糖蛋白、芳基硫酸酯酶B、血管紧张素转换酶、Igγ-1链C区、酒精脱氢酶1、血浆蛋白酶C1抑制剂、羧肽酶Q、载脂蛋白M、唾液酸O-乙酰酯酶、组织α-L-岩藻糖苷酶、Igγ-2A链C区、溶酶体硫酯酶PPT2、富含亮氨酸重复蛋白15、酒精脱氢酶[NADP(+)]、软骨寡聚基质蛋白、双糖链蛋白聚糖、血红蛋白家族2A成员2、胱抑素相关蛋白2、cAMP依赖性蛋白激酶II型-α调节亚基、溶质载体家族22名成员7、类视黄素诱导型丝氨酸羧肽酶、三叶草因子1、纤连蛋白、α-烯醇化酶、磷酸丙糖异构酶、穿膜肽酶A亚基、前纤维蛋白、L-乳酸脱氢酶B链、高尔基体蛋白1、核苷二磷酸激酶B、交联粘附分子C、磷脂酰肌醇-3、醛糖还原酶、β-烯醇酶、Xaa-Pro二肽酶、聚糖核心蛋白、及其组合；

所述鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段，优选所述抗体是单克隆抗体；

所述诊断选自：卵巢癌的早期诊断、诊断或监测卵巢癌肿瘤中期、诊断或监测卵巢癌肿瘤晚期。