CN112986572A - 自闭症的尿液蛋白标志物及其在早期诊断中的用途 - Google Patents

自闭症的尿液蛋白标志物及其在早期诊断中的用途 Download PDF

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Abstract

本公开涉及自闭症的尿液蛋白标志物及其在早期诊断中的用途。具体而言，本公开涉及检测尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断受试者自闭症的试剂中的用途。

Description

自闭症的尿液蛋白标志物及其在早期诊断中的用途
技术领域
本发明涉及临床医学；具体而言涉及人自闭症相关的尿液蛋白标志物。具体而言，本发明涉及利用质谱分析蛋白组学技术获得的人自闭症诊断相关的尿液蛋白标志物及其用途。
背景技术
生物标志物是与生理或生理病理相关的可检测的变化。尿液是理想的疾病生物标志物来源。除了尿液可以无创地大量获取之外，更重要的是尿液不受内稳态机制的调控，因此尿液可以富集机体产生的各种变化，而这些变化就是潜在的疾病标志物。在尿液中能更早更及时地发现疾病生物标志物，尿液在疾病的早期诊断上具有重大的临床应用前景。(参见Gao Y.Urine--an untapped goldmine for biomarker discovery.Sci China.LifeSci,2013,56(12):1145)。
尿液蛋白质组技术是利用蛋白质组学技术来研究尿液中所有蛋白质的方法。质谱技术飞速发展使尿液蛋白的鉴定深度和定量水平不断提高，极大地促进了尿蛋白质组学的研究和应用(Zhao,M等人A comprehensive analysis and annotation of human normalurinary proteome.Sci Rep.2017Jun 8；7(1):3024)。
自闭症是一种神经发育障碍，临床表现为语言和沟通障碍，社交互动和反应能力以及兴趣或行为受到限制和重复，这给自闭症儿童的家庭带来沉重负担。近年来，自闭症的患病率一直在稳定增长，目前已接近总人口的1％。自闭症的诊断主要是基于神经心理测试、患者的病史以及对行为异常的观察，这些诊断措施被认为是主观的，并可能产生许多假阳性。目前没有关于自闭症早期诊断的生物标志物的临床应用，所以寻找客观的进行自闭症早期诊断的生物标志物是至关重要的(参见Shen,L等人iTRAQ-Based ProteomicAnalysis Reveals Protein Profile in Plasma from Children withAutism.PROTEOMICS-Clinical Applications,2018.12(3)。
发明内容
鉴于本领域的上述需求，根据本公开的一些实施方式，提供了检测尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断受试者自闭症的试剂中的用途，其中所述尿液中蛋白质选自以下一种或多种：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体。
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者患有自闭症：氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体。
在具体的实施方式中，健康对照是指未患有自闭症的个体。
适用于本公开的鉴定试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。在具体的实施方式中，抗体是单克隆抗体。本公开对单克隆抗体的物种来源没有限制，任何能够结合上述蛋白的抗体均可以使用。
在具体的实施方式中，抗原结合片段包括但不限于：Fab、Fab'、(Fab')2、Fv、ScFv、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、双-scFv、mimi抗体。任何保留了抗原结合活性的抗体片段均适用于本公开。
在具体的实施方式中，根据本公开的蛋白标记物能够用于诊断自闭症。
在具体的实施方式中，表达水平选自核酸水平和蛋白质水平，尤其是蛋白质水平。
在具体的实施方式中，表达水平是在尿液样本中测定的。
根据另一些实施方式，还提供了一种用于诊断自闭症的试剂盒或芯片，其包含检测尿液中蛋白质含量的试剂，所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：
荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1和网状蛋白-4受体。
进一步地，所述试剂盒或芯片还包含检测一种或多种选自以下的尿液中蛋白质的含量的试剂：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4和MAPK激活蛋白PM28。
在一些实施方式中，试剂盒中包含上述蛋白的鉴定试剂。在另一些实施方式中，芯片上固定有上述蛋白的鉴定试剂。在一些实施方式中，所述鉴定试剂是抗体或其抗原结合片段。
根据一些实施方式，提供了一种用于诊断受试者中自闭症的方法，包括步骤：
1)获得受试者的尿液样本，
2)任选地，从尿液样本中分离蛋白，
3)确定所述受试者的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白、Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体及其组合。
在具体的实施方式中，使用质谱方法、ELISA方法、或Western方法确定表达水平。
当采用质谱方法确定蛋白及其表达水平时，在获得尿液样本的步骤之后，还可以包括消化步骤。在具体的实施方式中，用蛋白酶消化尿液样本中的蛋白。
根据一些实施方式，提供了一种用于早期诊断受试者中自闭症的方法，包括步骤：
1)获得受试者和健康对照的尿液样本，
2)确定受试者和健康对照的尿液样本中选自以下的蛋白的表达水平：氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白、Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体及其组合，
3)将受试者中所述蛋白的表达水平和健康对照中所述蛋白的表达水平进行比较，和
4)确定所述受试者是否具有自闭症。
在具体的实施方式中，和健康对照中的蛋白水平相比较，选自以下的蛋白的表达水平降低指示所述受试者患有自闭症：氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白、Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体及其组合。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明。本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。如无特别说明，所使用的实验材料均可从商业公司获取。
实施例
18名自闭症儿童样本来自北京阳光天使自闭症特训中心，年龄为3-7岁，同时获得年龄相仿的6名正常儿童尿液进行分析。
1.实验目的
获取自闭症儿童与正常儿童的尿液样品，通过自闭症儿童与正常儿童尿液蛋白组的比较，对临床上早期诊断自闭症有重要的指导意义。
2.材料与试剂
1)仪器：
Thermo-Orbitrap Lumos三合一质谱仪购自Thermo公司；
2)主要试剂：
色谱级乙腈、甲酸和甲醇为Fisher公司生产；碘乙酰铵(IAA)、碳酸氢铵、二硫苏糖醇(DTT)从Sigma公司购买；质谱级胰酶从Promega公司购买。
3.实验方法
(1)样本收集流程：收集自闭症儿童和正常儿童的尿液。
(2)提取尿液蛋白：取自闭症儿童和正常儿童的尿液，在12000g下离心40分钟，取上清，将尿液与无水乙醇按体积比1:3进行混合，-20℃过夜沉淀尿液蛋白。在4℃下以12000g离心30分钟，弃上清，沉淀自然风干后用裂解液复溶。
(3)蛋白组样品制备：对尿蛋白进行膜上酶切，具体参见Wisniewski JR,ZougmanA,Nagaraj N,Mann M Universal sample preparation method for proteomeanalysis.Nature methods 2009；6:359-62。通过BCA法测量多肽浓度。
(4)高pH反相色谱预分离多肽：所用试剂盒为Price高pH反向肽段分离试剂盒，购于Thermo公司。根据制造商的说明书进行多肽分离。
(5)高效液相串联质谱数据采集：用Orbitrap Fusion Lumos三合一质谱仪进行串联质谱分析。将多肽样本用0.1％甲酸稀释成0.5μg/μl。多肽样本通过Thermo液相系统EASY-nLC 1200上样系统进行分离。洗脱时间120分钟，色谱柱流速为0.25μl/分钟。洗脱梯度为流动B相的洗脱梯度4-28％。
数据依赖型质谱数据采集(DDA)：喷雾电压2.4kV,离子传输管温度320℃，一级全扫描：250-1550m/z，分辨率60000，二级扫描：200-2000m/z，分辨率30000，循环时间为3s，最高速模式，碎裂方式为HCD，碎裂能量30％。数据非依赖型质谱数据采集(DIA)：MS1参数设置：分辨率60000，母离子m/z扫描范围350-1550，AGC自动增益控制1e6；MS2参数设置：子离子扫描范围200-2000m/z，分辨率30000，碎裂方式为HCD，碎裂能量30％。
(6)质谱数据分析：DDA建库：数据依赖型质谱结果用Proteome Discoverer软件(版本2.1)进行搜库；参数：人SwissProt数据库(2018/04)，胰酶酶切；允许有2个漏切的位点，母离子质量容差10ppm，碎片离子质量容差0.02Da,固定修饰为半胱氨酸的氨酰甲基化修饰，蛋白FDR设置为1％。将搜库结果pdResult文件与10个DDA raw文件导入SpectronautX软件进行建库。DIA数据处理：Spectronaut X软件分析参数选择BGS Factory Setting(Default)，加载，背景库选择SwissPort_Humo_iRT；Report界面，导出所有二级碎片离子峰面积，进行蛋白组数据定量分析。
(7)统计分析
将自闭症儿童和正常儿童尿蛋白组数据进行统计分析，筛选出于与对照组相比二级碎片离子峰面积变化倍数在2倍以上，p值小于0.01的蛋白作为差异蛋白。
4.实验结果
将自闭症儿童与正常儿童尿蛋白进比较，经过统计学分析及变化倍数筛选，差异蛋白共120个，如表1所示。
表1.自闭症患者与正常儿童相比差异尿液蛋白质标志物
Figure BDA0002316567620000131
Figure BDA0002316567620000141
Figure BDA0002316567620000151
表1的结果表明，上述120种蛋白在自闭症患儿尿液中的含量低于正常儿童，分别为正常儿童尿液中蛋白含量的0.67-0.14。
5.随机分组法进一步验证结果
根据筛选条件在对照组和实验组中，筛选到120个差异蛋白，如表1所示。为了验证这120个不是随机产生的，进行随机分组。
随机分组，是把对照组和实验组的样本打乱，随机分为两组，每组中含有对照组和实验组的样本，然后根据原来的筛选条件筛选差异蛋白，结果发现，随机分组后比较组1和组2中尿蛋白的含量，发现没有差异蛋白，或者只有几个差异蛋白。如下表2进行随机分组：
表2
Figure BDA0002316567620000161
其中，C表示来自对照组的样品；Z表示来自自闭症患儿的样品。
由此可见，120种尿蛋白的量的差异是自闭症患儿所特异的，可用于作为自闭症的诊断标记物。

Claims (8)

1.检测尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断受试者自闭症的试剂中的用途，其中所述尿液中蛋白质选自以下一种或多种：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4、MAPK激活蛋白PM28、荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1、网状蛋白-4受体。
2.检测尿液中蛋白质含量的试剂在制备用于诊断受试者中自闭症的试剂中的用途，其中所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：
荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1和网状蛋白-4受体。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述尿液中蛋白质进一步包含一种或多种选自以下的蛋白质：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4和MAPK激活蛋白PM28。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的用途，其中所述检测尿液中蛋白质含量的试剂是质谱鉴定试剂、抗体或其抗原结合片段。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述检测尿液中蛋白质含量的试剂是单克隆抗体。
6.根据权利要求1-3任一项所述的用途，其中所述受试者是人。
7.一种用于诊断自闭症的试剂盒或芯片，其包含检测尿液中蛋白质含量的试剂，所述尿液中蛋白质为以下蛋白质的组合：
荷电多囊体蛋白1b、Ras相关蛋白R-Ras2、巯基氧化酶1、跨膜蛋白SMO、荷电多囊体蛋白2a、胶原α-3(IV)链、Ras相关蛋白Rab-34、肿瘤易感基因101蛋白、荷电多囊体蛋白2b、空泡分选相关蛋白4B、Ras相关蛋白Rab-5A、荷电多囊体蛋白4c、空泡分选相关蛋白37D、同线蛋白1、B、T淋巴细胞衰减因子、程序性细胞死亡6相互作用蛋白、胃蛋白酶A-3、信号调节蛋白β-2、钙黏着蛋白相关家族成员5、白介素-1受体拮抗蛋白、CD2相关蛋白、肺表面活性物质相关蛋白D、BRO1结构域蛋白BROX、真核翻译起始因子5A-1、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(I)/G(S)/(G)(T)亚基β5-2、组织蛋白酶L1、胰岛素生长因子样家族成员1、DCC相互作用蛋白13-β、蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶、羧肽酶X1、低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶、内质网膜蛋白复合物亚基10、α-淀粉酶2B、包含免疫球蛋白结构域的跨膜蛋白2、钾转运ATP酶α链2、髓鞘调节因子、环指蛋白150、NCT蛋白、水通道蛋白-1、甘聚糖-3、突触体相关蛋白23、蛋白保护剂3、核连蛋白-2、丝氨酸羧肽酶CPVL、含硫氧还蛋白域的蛋白15、胰岛素样生长因子结合蛋白1、胆碱转运体样蛋白4、β-甘露糖苷酶、共脂肪酶、C11orf52蛋白、β-2-糖蛋白1、GTP酶KRas、钙磷蛋白、胆碱转运体样蛋白2、间-α-胰蛋白酶抑制剂重链H5、泛素结合酶E2变体3、CD9抗原、FMR1相互作用蛋白1、抑制素βC链、脂肪酸结合蛋白、血小板源性生长因子受体α、水通道蛋白-2、S100钙结合蛋白A13、细胞分裂周期蛋白42同系物、垂体分泌蛋白I、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α、多囊体亚基12A、肝细胞癌相关蛋白10/11、溶质载体家族12成员1、转导蛋白β链1、Ras相关蛋白Rap-1b、Flotillin-1蛋白、尿溶蛋白-2、Ras相关的C3肉毒素底物1、骨髓基质抗原2、G蛋白偶联受体家族C组5成员C、Ras相关蛋白Rap-1A、FAM234A蛋白、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-2、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G(i)亚基α-1、硫酸乙酰肝素6-O-磺基转移酶2、酪氨酸蛋白激酶、富含半胱氨酸和跨膜结构域的蛋白1、Pleckstrin同源域B族成员2、清道夫受体富含半胱氨酸的1型蛋白M160、受体型酪氨酸蛋白磷酸酶F、低密度脂蛋白受体、硒蛋白F、泛素羧基末端水解酶、糖皮质激素诱导蛋白5、胶原α-2(XI)链、碳酸酐酶4、Ras相关蛋白Rab-5B、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白亚基α-13、细胞色素b还原酶1、葡萄糖苷酶2β亚基、CD160抗原、包含THAP结构域的蛋白4、分泌磷蛋白24、金属蛋白酶抑制剂2、血管生成素、半乳凝素-1、Klotho蛋白、包含MAM域的糖基磷脂酰肌醇锚蛋白1和网状蛋白-4受体。
8.根据权利要求7所述的用于诊断自闭症的试剂盒或芯片，其还包含检测一种或多种选自以下的尿液中蛋白质的含量的试剂：
氯离子胞内通道蛋白1、胶原蛋白α-3(V)链、Ras相关蛋白Rab-11B、Toll-相互作用蛋白、空泡分选相关蛋白4A、原钙粘蛋白19、血栓调节蛋白、含MIT结构域蛋白1、膜联蛋白A5、磷脂酶B样2、ATP依赖性转位酶ABCB1、红细胞带7整合膜蛋白、溶酶体膜蛋白2、卷曲蛋白-4和MAPK激活蛋白PM28。
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