BE1021759B1

BE1021759B1 - Marqueurs pour la consolidation alteree des fractures osseuses

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Publication number: BE1021759B1
Application number: BE2012/0389A
Authority: BE
Inventors: Valérie Gangji; Jean-Philippe Hauzeur; Seny Dominique De; Myrielle Mathieu; Aude Ingels; Sabrina Rigutto; Delphine SPRUYT; Enrico Bastianelli; Valentina Albarani; Xavier Pesesse; Michel Malaise
Original assignee: Universite Libre De Bruxelles; Bone Therapeutics Sa; Universite De Liege; Centre Hospitalier Universitaire De Liege
Priority date: 2011-06-10
Filing date: 2012-06-11
Publication date: 2016-01-15
Also published as: CA2838480A1; PT2718714E; AU2012266241A1; PL2718714T3; EP2718714B1; AU2012266241B2; EP2718714A1; WO2012168482A1; US20140100137A1; JP2014519610A; ES2548268T3; DK2718714T3; HK1194140A1

Abstract

La présente application décrit particulièrement interleukine-8 (IL-8) comme nouveau biomarqueur pour la prédiction, le diagnostic, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses; et les méthodes, utilisations et kits associés.

Description

MARQUEURS POUR LA CONSOLIDATION ALTÉRÉE DES FRACTURES OSSEUSES DOMAINE DE L’INVENTION L’invention se rapporte à des biomarqueurs et des paramètres utiles pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de maladies et états chez des sujets, particulièrement la consolidation altérée des fractures osseuses, tel que mais sans se limiter aux fractures avec absence de consolidation, fractures avec consolidation vicieuse ou fractures à consolidation retardée; et aux procédés, utilisations, kits et dispositifs associés.

CONTEXTE DE L’INVENTION

Il existe un besoin continu d’autres manières et manières préférablement améliorées d’obtenir une prédiction, un diagnostic, un pronostic et/ou une surveillance précis des maladies et états chez les sujets afin d’informer et de guider les choix de traitement.

La consolidation altérée des fractures englobe toutes anomalies et défauts de cicatrisation de la fracture osseuse tels que consolidation des fractures osseuses inadéquate, retardée ou absente, incluant mais sans limitations, consolidations vicieuses, retards de consolidation et absence de consolidation. Les fractures avec absence de consolidation, également connues comme absences de consolidation (NU), incluant notamment des fractures avec absences de consolidation serrées et instables (pseudarthrose) se caractérisent par un défaut des processus de réparation de la fracture, sans espoir de consolidation spontanée. Le taux rapporté des fractures avec absence de consolidation varie entre 2% et 10% de toutes les fractures, selon les auteurs (Gaston et al. J. Bone Joint Surg. Br., 2007, vol. 89(12), 1553-1560; Tzioupis and Giannoudis. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S3-S9). Les fractures avec absence de consolidation peuvent être classées comme hypertrophiques ou oligotrophiques si des sites de fragments osseux sont vasculaires. Les fractures avec absence de consolidation hypertrophiques s’expliquent habituellement par une instabilité du site de la fracture. Les fractures avec absence de consolidation oligotrophiques se produisent typiquement après un déplacement important des sites de la fracture et présentent une réponse de consolidation inadéquate tel qu’indiqué par l’absence de cal. Pour les fractures avec absence de consolidation telles qu’atrophiques, les fragments osseux sont avasculaires, adynamiques et incapables de réaction biologique (Frolke et al. Injury, 2007, vol. 38 Suppl 2, S19-S22).

Les consolidations vicieuses se caractérisent par une consolidation imparfaite de l’os précédemment fragmenté. Une consolidation retardée peut être définie comme une fracture pour laquelle la consolidation ne s'est pas produite au moment voulu et dont le résultat reste incertain.

Dans le processus de consolidation normal, une fracture osseuse engage une suite d'inflammation, de réparation et. de remodelage qui peut restaurer l'os à son état d’origine. Chez les humains, la phase inflammatoire dure environ de 5 à 7 jours et commence par le développement d’un hématome suivi par l’invasion des cellules inflammatoires. Ces cellules, en association avec les cellules locales, secrétent des cytokines, des chimiokynes et des facteurs de croissance pour encourager le recrutement des cellules progénitrices ostéogéniques et des cellules progénitrices endothéliales, essentielles à l’instauration du processus de réparation (Einhom. Clin. Orthop. Relat. Res., 1998, vol. 355 Suppl: S7-21). Le recrutement des cellules progénitrices se divise en quatre phases: mobilisation, migration, invasion et prise greffe des cellules sur le site de la fracture. L’altération notamment d’un des processus ci-dessus ou plus peut entraîner une consolidation altérée des fractures osseuses.

Le diagnostic est actuellement radiologique et il est effectué après 3 à 4 mois sans consolidation pour les consolidations retardées et après 6 à 9 mois sans consolidation pour les fractures avec absence de consolidation incluant pseudarthrose, selon le site et le type de fracture (Frolke et al. Supra). Des tests de dépistage cliniquement utiles, reposant sur des biomarqueurs, pour une consolidation des fractures osseuses altérée sont, à notre connaissance, non disponibles. En fait, Futilisation de molécules biologiques comme biomarqueurs pour une consolidation des fractures osseuses altérée n’a jamais fait l’objet de recherches chez les patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU). Dans des études pathophysiologiques, des auteurs ont démontré in situ que les niveaux de TGF-β, PDGF, FGF, et BMP 2/4 étaient les mêmes chez les sujets NU et sains 1 semaine après le traumatisme, mais qu'ils diminuaient 8 semaines plus tard chez les patients NU (Brownlow et al. Injury, 2001, vol. 32(7), 519-524). D’autres ont démontré que les niveaux sériques des TGF-β, PDGF-AB et FGF étaient plus bas à 2 et 4 semaines après le traumatisme chez les patients NU. Les TGF-β 1 et PDGF-AB étaient encore bas chez les patients NU à 12 semaines après le traumatisme (Weiss et al. Arch. Orthop. Trauma Surg., 2009, vol. 129, 989-997; Zimmermann et al. Bone, 2005, vol. 36(5), 779-785).

Puisque la connaissance, l’indication ou l’avertissement du fait qu’une fracture chez un sujet montre ou ait une possibilité accrue de montrer une consolidation altérée, de manière à ce que la progression aille vers une absence de consolidation, peut aider à pratiquer des interventions thérapeutiques sur le sujet, la mise à disposition d’autres méthodes et moyens, de méthodes et moyens alternatifs et préférablement améliorés pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses continue d’être de la plus grande importance.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION

Ayant mené des expériences et des tests extensifs, les inventeurs ont identifié des molécules biologiques dont les niveaux sont étroitement prédictifs et/ou indicatifs de la consolidation altérée des fractures osseuses et qui constituent ainsi des biomarqueurs utiles et prometteurs pour la consolidation altérée des fractures. Les phrases synonymes « consolidation altérée des fractures osseuses » ou « consolidation altérée des fractures » telles qu’utilisées ici englobent toutes anomalies, anormalités et défauts de consolidation des fractures osseuses, tels que consolidation des fractures inadéquate, retardée ou absente. Les phrases veulent comprendre spécifiquement et indiquer préférablement des consolidations vicieuses, consolidations retardées et absences de consolidation, indiquer encore plus préférablement des absences de consolidation, incluant notamment des absences de consolidation serrées et instables (pseudarthrose).

Conformément à l’invention, d'autres méthodes et moyens et méthodes et moyens nettement améliorés pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures sont réalisés par la mise à disposition d’un ou de plusieurs facteur-1 dérivé stromal (SDF-1 ou CXCL12), facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-BB), interleukine-8 (IL-8 ou CXCL8) et interleukine-6 (IL-6) comme biomarqueur(s) pour la consolidation altérée des fractures osseuses.

Donc, la présente invention concerne l’utilisation d’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 comme biomarqueur, plus particulièrement comme biomarqueur pour la consolidation altérée des fractures, encore plus particulièrement comme biomarqueur pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures. Préférablement, la présente invention concerne l’utilisation d’IL-8 comme biomarqueur, plus particulièrement comme biomarqueur pour la consolidation altérée des fractures, encore plus particulièrement comme biomarqueur pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures. Également, la présente invention concerne l’utilisation d’un ou plusieurs SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures. Préférablement, la présente invention concerne l’utilisation d’IL-8 pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures.

Dans des modes de réalisation préférés des utilisations présentes, la consolidation altérée des fractures osseuses peut être sélectionnée parmi le groupe consistant en fracture à consolidation vicieuse, fracture à consolidation retardée, et fracture avec absence de consolidation.

La présente invention concerne également une méthode pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, comprenant la mesure du niveau de l’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 dans un échantillon provenant dudit sujet. Préférablement, la présente invention concerne une méthode pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, comprenant la mesure du niveau d’IL-8 dans un échantillon provenant dudit sujet. Pour mesurer le niveau d’un ou plusieurs biomarqueurs, les méthodes présentes et particulièrement la phase d’examen de telles méthodes dans lesquelles les données sont collectées à partir du et/ou au sujet du sujet, comprennent typiquement la mesure ou la détermination du niveau (c'est-à-dire la quantité, le volume) dudit un ou plusieurs biomarqueur(s) dans un échantillon provenant du sujet.

Une méthode pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures chez un sujet telle qu’enseignée ici dans des modes de réalisation préférés peut comprendre les étapes de: (i) mesure de la quantité de l’un ou plusieurs de SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart pour un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic spécifique de consolidation altérée des fractures chez le sujet. Préférablement, une méthode telle qu’enseignée ici pour le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic de la consolidation altérée des fractures chez un sujet peut comprendre les étapes de: (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart pour un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic spécifique de consolidation altérée des fractures chez le sujet. La méthode peut également être exécutée pour un sujet à deux ou plusieurs points temporels successifs et les résultats respectifs aux dits points temporels successifs peuvent être comparés, selon laquelle la présence ou l’absence d’un changement entre le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic de consolidation altérée des fractures aux dits points temporels successifs est déterminée. Quand elle est ainsi appliquée, la méthode peut contrôler un changement dans le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic de consolidation altérée des fractures chez le sujet dans le temps.

Par exemple, un écart de la quantité de l’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6, préférablement de la quantité d’IL-8, dans un échantillon provenant d’un sujet, comparé à une valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures peut indiquer respectivement que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet. Dans un autre exemple, l’absence d’un tel écart à partir de la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures peut indiquer respectivement que le sujet ne présente pas de consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet. Dans encore un autre exemple, l’absence d’un tel écart à partir de la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures ou représentant un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures peut indiquer respectivement que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet. Une valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures peut par exemple représenter un état sain, c’est-à-dire un état sans fracture, ou peut représenter un état avec une fracture qui n’est pas une consolidation altérée des fractures. Une valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic d’une consolidation altérée des fractures peut par exemple représenter un état malade, c’est-à-dire un état avec consolidation altérée des fractures.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1, une quantité réduite de PDGF-BB, une quantité élevée d’IL-8 et/ou une quantité élevée d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le sérum ou le plasma provenant du sujet, comparée à la (aux) valeur(s) de référence respective(s) représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures, plus préférablement représentant un état sain ou une fracture se consolidant normalement, ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation des fractures chez le sujet.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1 et/ou une quantité réduite d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le surnageant des cellules ostéoblastiques cultivées ou des cellules souches mésenchymateuses obtenues chez le sujet, comparée à la (aux) valeur(s) de référence respective(s) représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures, plus préférablement représentant un état sain ou une fracture se consolidant normalement, ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation des fractures chez le sujet.

Une méthode pour surveiller la consolidation altérée des fractures ou pour surveiller la probabilité de développement de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, telle qu’enseignée ici peut dans des modes de réalisation préférés comprendre les étapes de : (i) mesure de la quantité de l’un ou plusieurs de SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 dans un échantillon provenant du sujet à deux ou plusieurs points temporels successifs; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart vers une modification dans la consolidation altérée des fractures ou vers une modification dans la probabilité de développer une consolidation altérée des fractures chez le sujet entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs. Préférablement, une méthode telle qu’enseignée ici pour surveiller la consolidation altérée des fractures osseuses ou pour surveiller le risque de développement de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet peut comprendre les étapes de (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet à deux ou plusieurs points temporels successifs; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart vers une modification dans la consolidation altérée des fractures osseuses ou vers une modification dans la probabilité de développer une consolidation altérée des fractures osseuses chez le sujet entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1, une quantité réduite de PDGF-BB, une quantité élevée d’IL-8 et/ou une quantité élevée d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le sérum ou le plasma provenant du sujet, dans un dernier des dits deux ou plusieurs points temporels successifs comparée à la quantité respective dans un premier des dits deux ou plusieurs points temporels successifs, peut indiquer que le risque de développement d’une consolidation altérée des fractures chez le sujet a augmenté.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1 et/ou une quantité élevée d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le surnageant des cellules ostéoblastiques cultivées ou des cellules souches mésenchymateuses obtenues chez le sujet, dans un dernier des dits deux ou plusieurs points temporels successifs comparée à la quantité respective dans un premier des dits deux ou plusieurs points temporels successifs, peut indiquer que le risque de développement d’une consolidation altérée des fractures chez le sujet a augmenté.

La présente invention est une méthode pour déterminer si un sujet est ou n’est pas (tel que par exemple, est toujours, ou n’est plus) dans le besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique (préventif) pour la consolidation altérée des fractures comprenant la mesure du niveau de l’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 dans un échantillon provenant dudit sujet. Dans des modes de réalisation préférés, la méthode peut comprendre les étapes de: (i) mesure de la quantité de l’un ou plusieurs de SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) déduction à partir de ladite découverte de présence ou d’absence d’un besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures. Préférablement, une méthode pour déterminer si un sujet est ou n’est pas dans le besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures osseuses peut comprendre la mesure du niveau d’IL-8 dans un échantillon provenant dudit sujet, peut comprendre préférablement les étapes de: (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) déduction à partir de ladite découverte de présence ou d’absence d’un besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures osseuses. Un traitement peut être particulièrement indiqué où la méthode autorise une conclusion indiquant que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre un risque de présenter une consolidation altérée des fractures ou qu'il a un mauvais diagnostic de consolidation altérée des fractures.

Dans ce contexte, la présente invention décrit en outre une méthode pour déterminer le résultat d’un traitement thérapeutique ou prophylactique de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, comprenant la mesure du niveau de l’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et IL-6, préférablement le niveau d’IL-8, dans un échantillon provenant dudit sujet.

Dans des modes de réalisation préférés des méthodes présentes, la consolidation altérée des fractures osseuses peut être sélectionnée parmi le groupe consistant en fracture à consolidation vicieuse, fracture à consolidation retardée, et fracture avec absence de consolidation.

Les traitements de la consolidation altérée des fractures incluent, notamment, des traitements non invasifs comme par exemple la stimulation électrique, les ultrasons ou dispositifs orthopédiques spécialisés, et des mesures invasives comme par exemple, l’enlèvement chirurgical du tissu mort, l’insertion de dispositif orthopédique interne (par exemple tige, plaque ou vis), l’insertion de greffe osseuse, l’injection d’une protéine morphogénétique osseuse (BMP) ou de plusieurs ou l’amputation afin d’éviter une blessure plus importante.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1, une quantité réduite de PDGF-BB, une quantité élevée d’IL-8 et/ou une quantité élevée d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le sérum ou le plasma provenant du sujet, comparée à la (aux) valeur(s) de référence respective(s) représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures, plus préférablement représentant un état sain, ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures.

Préférablement mais sans limitation, les inventeurs ont réalisé qu’une quantité réduite de SDF-1 et/ou une quantité réduite d’IL-6 dans un échantillon provenant du sujet, particulièrement dans le surnageant des cellules ostéoblastiques cultivées ou des cellules souches mésenchymateuses obtenues chez le sujet, comparée à la (aux) valeur(s) de référence respective(s) représentant la prédiction ou le diagnostic d’aucune consolidation altérée des fractures, plus préférablement représentant un état sain, ou représentant un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures. L’un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6 peut révéler ses diagnostic, prédiction, pronostic et/ou surveillance de la valeur pour la consolidation altérée des fractures osseuses, pré-fracture et/ou postfracture. Dans des modes de réalisation non limitatifs, un ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6 peut être particulièrement évalué chez les sujets entre le moment de la fracture et environ 40 mois post fracture, tel qu’à environ 1, 2, 3 et/ou 4 semaines post-fracture, et/ou à environ 1 à 4 mois, environ 5 à 8 mois, environ 9 à 12 mois, environ 13 à 16 mois, environ 17 à 20 mois, environ 21 à 24 mois, environ 25 à 28 mois, environ 29 à 32 mois, environ 33 à 36 mois et/ou environ 37 à 40 mois post-fracture. L’un/l’une quelconque des biomarqueurs, utilisations et méthodes présents peut être préférablement combiné avec ou peut compléter, ou peut être planifié au même moment que, une ou plusieurs mesures de diagnostic pour la consolidation altérée des fractures, tel que sans limitation, des techniques d’imagerie et radiologiques conventionnelles incluant rayons-X, tomographie par émission de positrons (TEP), tomodensitométrie (TDM), imagerie par résonnance magnétique (IRM), imagerie par ultrasons. L’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisations et méthodes décrits ici peut être particulièrement utile chez les sujets connus ou attendus comme courant le risque de développer une consolidation altérée des fractures osseuses, par exemple, ayant un ou plusieurs facteurs de risque pour la consolidation altérée des fractures osseuses. Sans limitation les facteurs de risque associés à la consolidation altérée des fractures osseuses incluent le style de vie et les facteurs de santé qui peuvent interférer avec la consolidation osseuse, tels que notamment la consommation de tabac, l’abus d’alcool, le mauvais état nutritionnel, le mauvais état de santé général, les déficiences de l’état physique et le diabète; les facteurs qui peuvent contribuer à la perte de la résistance osseuse, tels que notamment l'utilisation de médicaments anti-inflammatoires non-stéroïdiens (NSAID), l’utilisation de médicaments immunodépresseurs, d’autres médicaments tels que les anticonvulsifs et le remplacement de l’hormone thyroïdienne, la thyroxine; le type et le site de fracture tel qu’une fracture dans un site faiblement vasculaire, l’instabilité sur le site de la fracture, un traumatisme à forte énergie et un mauvais état des parties molles autour de l’os; une ascendance telle que des personnes avec ascendance d’Europe ou d’Asie qui courent un risque accru d’ostéoporose; l’âge tel que les personnes qui courent un risque accru de mauvaise consolidation osseuse; les femmes qui font l’objet d’une ménopause précoce, d’une ménarche tardive ou de la perte de leurs ovaires et celles qui courent un risque accru de faiblesse osseuse; etc.

Dans des modes de réalisation, l’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut être complété ou associé à la détermination de la présence ou de l'absence et/ou du niveau de l'un ou plusieurs facteurs de risque pour la consolidation altérée des fractures osseuses chez le sujet. L’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut préférablement permettre une sensibilité et/ou une spécificité (préférablement, sensibilité et spécificité) d’au moins 50%, d’au moins 60%, d’au moins 70% ou d’au moins 80%, par exemple > 85% ou > 90% ou >95%, par exemple entre environ 80% et 100% ou entre environ 85% et 95%. L’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut être appliqué aux sujets qui n’ont pas encore fait l’objet d’un diagnostic de la consolidation altérée des fractures osseuses (par exemple, dépistage préventif), ou qui ont été sujets à une fracture, ou qui ont fait l’objet d’un diagnostic de consolidation altérée des fractures osseuses, ou que l’on suppose présenter une consolidation altérée des fractures osseuses (par exemple présentation de l’un ou plusieurs signes et/ou symptômes caractéristiques), ou qui courent un risque de développer une consolidation altérée des fractures osseuses (par exemple, prédisposition génétique; présence d’un ou plusieurs facteurs de risque développemental, environnemental ou comportemental). L’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut être utilisé pour détecter diverses étapes de progression ou de sévérité de la consolidation altérée des fractures osseuses; pour détecter la réponse de la consolidation des fractures aux traitements prophylactiques ou thérapeutiques ou d’autres interventions; pour aider le médecin à prendre une décision lors de l’aggravation, du statuquo, de la récupération partielle ou de la récupération totale du sujet de la consolidation altérée des fractures osseuses, entraînant soit un autre traitement ou une autre observation soit l'autorisation de sortie du sujet d'un centre de soins médicaux. De même, l’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut être utilisé pour le dépistage de la population tel que par exemple, le dépistage d’une population générale ou d’une population stratifiée sur la base d’un ou de plusieurs critères, par exemple, l’âge, l’ascendance, l’emploi, la présence ou l’absence de facteurs de risque pour la consolidation altérée des fractures, etc. L’un/l’une quelconque ou plusieurs des biomarqueurs, utilisation et méthodes présents peut également tirer profit du fait d’être en outre complété ou associé avec l’évaluation d’un ou plusieurs autres biomarqueurs, signes, symptômes et/ou paramètres cliniques pertinents pour la consolidation altérée des fractures osseuses. Au moyen d’exemples et sans limitation, les biomarqueurs potentiellement utiles dans l’évaluation de la consolidation altérée des fractures, et dont la quantité peut être mesurée avantageusement dans les utilisations et méthodes présentes, incluent l'un quelconque ou plusieurs des béta-facteurs de croissance transformants (TGF-β), d’autres isoformes de facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) (autres isoformes), facteurs de croissance de fibroblaste (FGF) et protéines morphogénétiques osseuses (BMP), dont les niveaux ont été rapportés comme diminués chez les patients présentant une consolidation altérée des fractures (Brownlow et al. 2001; Weiss S et al. 2009; Zimmermann et al. 2005; ail supra).

Donc certains modes de réalisation concernent les utilisations et méthodes tels que définis ici, comprenant en outre la mesure du niveau de l'un quelconque ou plusieurs des TGF-β, PDGF, FGF et BMP dans un échantillon provenant du sujet.

De même, certains modes de réalisation concernent les utilisations et méthodes tels que définis ici, comprenant en outre la mesure du niveau de l'un quelconque ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-6, TGF-β, PDGF, FGF et BMP dans un échantillon provenant du sujet.

La quantité respective de l’un quelconque ou plusieurs des biomarqueurs présente peut être évaluée séparément et individuellement, c’est-à-dire chaque quantité comparée à sa valeur de référence correspondante. Autrement, les quantités de deux quelconques ou plusieurs des biomarqueurs présents peuvent être utilisées pour établir un profil de biomarqueur, qui peut être comparé de manière appropriée à une valeur de référence multi paramètres correspondante. D’une autre manière, les quantités de deux quelconque ou plusieurs biomarqueurs peuvent être chacune modulée par un facteur de pondération approprié et ajoutée pour atteindre une valeur unique qui peut ensuite être comparée de manière appropriée à une valeur de référence correspondante obtenue en conséquence. On pourra apprécier le fait que de tels facteurs de pondération peuvent dépendre de la méthodologie utilisée pour quantifier les biomarqueurs, et pour chaque réglage expérimental spécifique peuvent être déterminés et compris dans un modèle approprié au diagnostic, à la prédiction et /ou au pronostic de la consolidation altérée des fractures.

Des valeurs de référence telles qu’utilisées ici peuvent être établies selon les procédures connues précédemment utilisées pour les biomarqueurs. Des valeurs de référence peuvent être établies soit dans (ic’est-à-dire constituant une étape de) soit externe à {c’est-à-dire ne constituant pas une étape de) les utilisations et méthodes enseignées ici. En conséquence, l’une quelconque des utilisations et méthodes enseignées ici peut comprendre une étape d’établissement d’une valeur de référence requise.

Donc, la présente invention concerne également une méthode pour l’établissement d’une valeur de référence pour l’un quelconque ou plusieurs biomarqueurs telle qu’enseignée ici, ladite valeur représentant : (a) une prédiction ou un diagnostic d’absence de consolidation altérée des fractures ou un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, ou (b) une prédiction ou un diagnostic de consolidation altérée des fractures ou un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures, comprenant: (i) la mesure de la quantité d’un quelconque ou de plusieurs biomarqueurs dans un échantillon provenant de: (i a) un ou plusieurs sujets ne présentant pas de consolidation altérée des fractures ou ne courant pas le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou ayant un bon pronostic de consolidation altérée des fractures, ou (i b) un ou plusieurs sujets présentant une consolidation altérée des fractures ou courant le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou ayant un mauvais pronostic de consolidation altérée des fractures, et (ii a) l’établissement à partir de la quantité de l'un quelconque ou plusieurs biomarqueurs telle que mesurée dans (i a), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de l’absence de consolidation altérée des fractures ou représentant le bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures, ou (ii b) l’établissement à partir de la quantité de l'un quelconque ou plusieurs biomarqueurs telle que mesurée dans (i b), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de consolidation altérée des fractures ou représentant le mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures.

Préférablement, la présente invention est également une méthode pour l’établissement d’une valeur de référence pour IL-8, ladite valeur représentant: (a) une prédiction ou un diagnostic d’absence de consolidation altérée des fractures ou un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, ou (b) une prédiction ou un diagnostic de consolidation altérée des fractures ou un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, comprenant: (i) la mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant de: (i a) un ou plusieurs sujets ne présentant pas de consolidation altérée des fractures osseuses ou ne courant pas le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures osseuses ou ayant un bon pronostic de consolidation altérée des fractures osseuses, ou (i b) un ou plusieurs sujets présentant une consolidation altérée des fractures osseuses ou courant le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures osseuses ou ayant un mauvais pronostic de consolidation altérée des fractures osseuses, et (ii a) l’établissement à partir de la quantité d’IL-8 telle que mesurée dans (i a), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de l’absence de consolidation altérée des fractures osseuses ou représentant le bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, ou (ii b) l’établissement à partir de la quantité d’IL-8 telle que mesurée dans (i b), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de consolidation altérée des fractures osseuses ou représentant le mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses.

Dans des modes de réalisation préférés, les utilisations et méthodes présentes peuvent mesurer la quantité systémique de l’un ou plusieurs biomarqueurs tel qu’enseigné ici. Préférablement, les utilisations et méthodes présentes peuvent comprendre la mesure de la quantité systémique d’IL-8. La quantité systémique de l’un quelconque ou plusieurs biomarqueurs, préférablement IL-8 peut être évaluée de manière appropriée dans des échantillons qui comprennent, consistent essentiellement en ou consistent en du sang total ou un composant infime de celui-ci, tel que préférablement du plasma ou du sérum.

Dans d’autres modes de réalisation, les utilisations et méthodes présentes peuvent mesurer la quantité locale de l’un ou plusieurs biomarqueurs tel qu’enseigné ici sur le site de la fracture à consolidation altérée. Préférablement, les utilisations et méthodes présentes peuvent mesurer la quantité locale d’IL-8 sur le site de la fracture à consolidation altérée. La quantité locale d’un ou plusieurs biomarqueurs, préférablement IL-8, peut être déterminée de manière appropriée dans des échantillons qui comprennent, consistent essentiellement en tissu prélevé du site de la fracture à consolidation altérée, tel qu’un tissu obtenu par biopsie ou d’autres techniques de récupération de tissu.

Dans d’autres modes de réalisation, les utilisations et méthodes présentes peuvent mesurer la quantité locale de moelle osseuse de l’un ou plusieurs biomarqueurs tel qu’enseigné ici sur un site différent de récolte de moelle osseuse. Préférablement, les utilisations et méthodes présentes peuvent mesurer la quantité de moelle osseuse d'IL-8 sur différents sites de récolte de moelle osseuse. La moelle osseuse peut être obtenue à partir de l’os présentant la fracture à consolidation altérée chez le sujet, ou à partir d’un site distant de ladite fracture à consolidation altérée.

Dans encore d’autres modes de réalisation, les utilisations et méthode suivantes peuvent mesurer la quantité de l'un ou plusieurs biomarqueurs tel qu'enseigné ici dans les cellules ou dans le surnageant des cellules obtenues chez le sujet et cultivées ensuite in vitro. Préférablement, les utilisations et méthode suivantes peuvent mesurer la quantité d’IL-8 dans les cellules ou dans le surnageant des cellules obtenues chez le sujet et cultivés ensuite in vitro. Préférablement, les cellules peuvent être des cellules de tissu osseux ou progénitrices, plus préférablement des cellules ostéoblastes (OB) ou des cellules souches mésenchymateuses (MSC). Préférablement, les biomarqueurs peuvent être mesurés dans des cultures de cellules primaires et/ou autres cultures (par exemple secondaires, tertiaires, etc.). Les cellules peuvent être obtenues à partir du site de la fracture à consolidation altérée chez le sujet, ou à partir d’un site distant de ladite fracture à consolidation altérée.

La présente invention décrit en outre en un kit, particulièrement un kit pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, le kit comprenant (i) un moyen de mesure de la quantité de l’un quelconque ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6, particulièrement dans un échantillon provenant du sujet, et (ii) optionnellement et préférablement une ou plusieurs valeurs de référence ou moyens pour établir ladite une ou plusieurs valeurs de référence, dans lequel ladite une ou plusieurs valeurs de référence représente un diagnostic, une prédiction et /ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures.

Le moyen servant à mesurer la quantité d’un biomarqueur peut comprendre un ou plusieurs agents de liaison capables de lier spécifiquement audit biomarqueur. Des agents de liaison exemplaires peuvent inclure des preuves d’hybridation (oligonucléotides), amorces d’amplification, anticorps, aptamères, photoaptamères, protéines, peptides, peptidomimétiques ou petites molécules. Les agents de liaison peuvent être avantageusement immobilisés sur une phase solide ou un support solide.

La présente invention décrit ainsi également en un kit, particulièrement un kit pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures chez un sujet, le kit comprenant (i) un ou plusieurs agents de liaison capables de lier spécifiquement à l’un quelconque ou plusieurs des SDF-1, PDGF-BB , IL-8 et/ou IL-6 , particulièrement dans un échantillon provenant du sujet, (ii) préférablement, une quantité ou concentration connue dudit un ou plusieurs SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6, tel que pour une utilisation comme contrôles, standards et/ou calibreurs, (iii) optionnellement et préférablement, une ou plusieurs valeurs de référence ou moyen d’établissement de l’une ou plusieurs valeurs de référence, dans lequel ladite une ou plusieurs valeurs de référence représente un diagnostic, une prédiction et /ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures. Les dits composants sous (i) et/ou (ii) peuvent être marqués de manière appropriée tel qu’enseigné dans une autre partie de ces spécifications.

Dans des modes de réalisation préférés, les kits peuvent être configurés comme des dispositifs portatifs, tel que, par exemple, des dispositifs individuels, pour une utilisation au domicile ou dans des installations cliniques.

Il peut être apprécié que les moyens ou outils de collecte d’un échantillon à partir d’un sujet, tel que, par exemple, un tube de collecte de sang conventionnel comprenant un agent anti-coagulation, puissent être fournis séparément du kit ou compris dans les kits décrits ici.

La présente invention décrit en outre en l’utilisation d’un kit tel que décrit ici pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures.

Préférablement, la présente invention consiste en l’utilisation d’un kit pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet, le kit comprenant (i) un moyen de mesure de la quantité d’IL-8, particulièrement dans un échantillon provenant du sujet, et (ii) optionnellement et préférablement une ou plusieurs valeurs de référence ou moyens pour établir ladite une ou plusieurs valeurs de référence, dans lequel ladite une ou plusieurs valeurs de référence représente un diagnostic, une prédiction et /ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures osseuses. La présente invention consiste en outre en l’utilisation telle qu’enseignée ici, dans laquelle le moyen de collecte d’un échantillon à partir d’un sujet est fourni séparément du kit ou est compris dans le kit.

La présente invention décrit également en des réactifs et outils utiles pour mesurer l’un quelconque ou plus des biomarqueurs tel qu’enseigné ici. La présente invention décrit donc une puce ou biopuce d’acide nucléique ou une puce ou biopuce de protéine, polypeptide ou peptide comprenant l’un quelconque, préférablement deux, préférablement trois, plus préférablement les quatre SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6. La présente invention décrit également une puce ou biopuce d’agent de liaison comprenant un ou plusieurs agents de liaison capables de lier spécifiquement à l’un quelconque, préférablement deux, préférablement trois, plus préférablement les quatre SDF-1, PDGF-BB, IL-8 et/ou IL-6, comprenant préférablement une quantité ou une concentration connue dudit un ou plusieurs agents de liaison.

La présente invention décrit en outre en l’utilisation d’une puce ou biopuce tel que décrit ici pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures.

Préférablement, la présente invention décrit l’utilisation d’une puce ou biopuce d’acide nucléique ou une puce ou biopuce de protéine, polypeptide ou peptide pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses, ladite puce ou biopuce comprenant un acide nucléique encodant IL-8 ou comprenant IL-8. Préférablement, la présente invention décrit également l’utilisation d’une puce ou biopuce d’agent de liaison pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses, ladite puce ou biopuce comprenant un ou plusieurs agents de liaison capable de lier spécifiquement à IL-8, comprenant préférablement une quantité ou concentration connue dudit un ou plusieurs agents de liaison.

Les aspects ci-dessus et autres aspects et modes de réalisation préférés de l’invention sont décrits dans les sections suivantes et dans les revendications jointes. Le sujet des revendications jointes est ici intégré spécifiquement dans ces spécifications.

BRÈVE DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure 1 illustre les niveaux plasmatiques de SDF-1 dans une expérience comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU) avec des contrôles sains (HV), (A) tous les échantillons (HV, n = 49; NU, n = 15), (B) échantillons où le plasma est collecté dans des tubes à héparine (HV, n = 26; NU, n = 11), (C) échantillons où le plasma est collecté dans des tubes EDTA (HV, n = 40; NU, n = 5).

La Figure 2 illustre des niveaux sériques de PDGF-BB dans une expérience comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, n = 9) avec contrôles sains (HV, n = 20).

La Figure 3 illustre des niveaux sériques d’IL-8 dans une expérience comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, n = 4) avec contrôles sains (HV, n = 18).

La Figure 4 illustre des niveaux sériques d’IL-6 dans une expérience comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, η = 13) avec contrôles sains (HV, n = 29).

La Figure 5A illustre des niveaux sériques de SDF-1 dans le surnageant de la culture cellulaire ostéoblastique (OB) comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, n = 6) avec contrôles sains (HV, n = 9).

La Figure 5B illustre des niveaux de SDF-1 dans le surnageant de la culture cellulaire mésenchymale (MSC) comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, n = 6) avec contrôles sains (HV, n = 9).

La Figure 6 illustre des niveaux d’IL-6 dans le surnageant de la culture cellulaire ostéoblastique (OB) comparant un groupe de patients présentant des fractures avec absence de consolidation (NU, n = 6) avec contrôles sains (HV, n = 10).

DESCRIPTION DÉTAILLÉE DE L’INVENTION

Tel qu’utilisé ici, les formes singulières « un », « un » et « le » incluent à la fois des référents singuliers et pluriels sauf si le contexte le spécifie clairement autrement.

Les termes « comprenant », « comprend » et « compris » tels qu’utilisés ici sont synonymes avec « incluant », « inclut » ou « contenant », « contient », et sont inclusifs ou ouverts et n’excluent pas d’étapes de membres, éléments ou méthodes additionnelles et non-exposées. Le terme englobe également « consistant en » et « consistant essentiellement en ».

La récitation des plages numériques par point de virage inclut tous les numéros et fractions subsumés dans les plages respectives, de même que les points de virage exposés.

Le terme « environ » tel qu'utilisé ici quand on se réfère à une valeur mesurable telle qu'un paramètre, un montant, une durée temporelle et similaires, implique d'englober des variations de ou à partir de la valeur spécifiée, dans des variations particulières de +/-10% ou moins, préférablement +1-5% ou moins, plus préférablement +/-1% ou moins et encore plus préférablement +/-0.1% ou moins de et à partir de la valeur spécifiée, dans la mesure où de telles variations sont appropriées pour réaliser l'invention décrite. Il faut comprendre que la valeur à laquelle se réfère le modificateur « environ » est elle-même également spécifiquement et préférablement décrite.

Tandis que le terme « un ou plus », tel qu'un ou plusieurs membres d’un groupe de membres est clair en lui-même, au moyen d’une autre exemplification, le terme englobe notamment une référence à l’un quelconque des dits membres, ou à l’un des deux ou plusieurs des dits membres, tel que, par exemple l’un des >3, >4, >5, >6 ou >7 des dits membres et jusqu’à tous les dits membres.

Tous les documents cités dans les spécifications présentes sont ici intégrés par référence dans leur globalité.

Sauf indication contraire, tous les termes utilisés dans la description de l’invention, incluant des termes techniques et scientifiques ont la signification la plus couramment comprise par l’une des règles de l'art ordinaires à laquelle appartient l'invention. Au moyen d’autres conseils, les définitions de terme peuvent être inclues pour mieux apprécier l’enseignement de la présente invention.

Les inventeurs ont identifié un facteur-1 dérivé stromal (SDF-1), facteur de croissance dérivé des plaquettes BB (PDGF-BB), interleukine-8 (IL-8 ou CXCL8) et interleukine-6 (IL-6) comme biomarqueur(s) nouveau(x) et utile(s) pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses. En particulier, les inventeurs ont identifié IL-8 comme biomarqueur nouveau et utile pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses.

Le terme «biomarqueur» est vaste dans l’art et peut indiquer largement une molécule biologique et/ou une partie détectable de celle-ci dont l’évaluation qualitative et/ou quantitative chez un sujet est, seule ou associée à d’autres données, prédictive et/ou informative (par exemple prédiction, diagnostic et/ou pronostic) par rapport à un ou plusieurs aspects du phénotype et/ou génotype du sujet tel que, par exemple, par rapport à l’état du sujet en ce qui concerne une maladie ou un état donné. Particulièrement, les biomarqueurs sont prévus ici d’être de base ARN (particulièrement de base ARN-m) ou préférablement peuvent être de base protéine-, polypeptide- ou peptide-.

Les termes « fracture avec absence de consolidation », « non-consolidation de fracture », « absence de consolidation » ou « NU » concernent de manière interchangeable une fracture qui, due à divers facteurs échoue dans sa consolidation sur une période de temps normale. NU inclut notamment des absences de consolidation serrées et instables ou pseudarthrose. Les termes « fracture à consolidation vicieuse », « consolidation vicieuse de fracture » ou « consolidation vicieuse » concernent de manière interchangeable la consolidation imparfaite de l’os précédemment fragmenté. Les termes « fracture à consolidation retardée » ou « consolidation retardée » se rapportent de manière interchangeable à une fracture dans laquelle la consolidation ne s’est pas produite en temps voulu et où le résultat reste incertain. Les fractures avec absence de consolidation, à consolidation vicieuse ou à consolidation retardée sont englobées ici sous le terme « consolidation altérée des fractures osseuses » ou « consolidation altérée des fractures ». La consolidation altérée des fractures nécessite donc une certaine forme d’intervention pour stimuler la consolidation.

La période de temps à laquelle s'achève en pratique la consolidation altérée des fractures varie selon la fracture spécifique, mais il est généralement convenu qu’une fracture non consolidée dans les 6 mois après blessure ne se consolidera pas sans intervention. Il a également été suggéré de conclure que la consolidation altérée des fractures se produira si une fracture ne montre pas de signe de progression vers la consolidation dans les 3 mois après la blessure ou simplement si une fracture ne s’est pas consolidée dans les délais dans lesquels un chirurgien spécialisé dans les fractures aurait prévu sa consolidation.

La référence dans ces spécifications à des maladies ou des états englobe toutes ces maladies ou états telles que décrits ici dans la mesure où ils sont cohérents avec le contexte d'une récitation particulière, englobe plus spécifiquement la consolidation altérée des fractures.

Les termes « prévoyant » ou « prédiction », « diagnostiquant » ou « diagnostic » et « pronostiquant » ou « pronostic » sont des lieux courants et sont bien compris dans la pratique médicale et clinique. Il convient de comprendre que la phrase « une méthode pour le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic » d'une maladie ou état donnés peut également être interchangée avec des phrases telle que « une méthode pour diagnostiquer, prévoir et/ou pronostiquer » ladite maladie ou état ou « une méthode pour réaliser (ou déterminer ou établir) le diagnostic, la prédiction et/ou le pronostic » de ladite maladie ou état ou similaire.

Au moyen d’une autre explication est sans limitation, « prédire » ou « prédiction » se réfère généralement à une déclaration, indication ou annonce d’une maladie ou état chez un sujet n’ayant pas (encore) ladite maladie ou état. Par exemple, une prédiction d’une maladie ou d’un état chez un sujet peut indiquer une probabilité, une chance ou un risque que le sujet développe ladite maladie ou état, par exemple dans une certaine période de temps ou à un certain âge. Ladite probabilité, chance ou ledit risque peuvent être notamment indiqués comme une valeur, plage ou statistiques absolus ou peuvent être indiqués par rapport à un contrôle approprié du sujet ou de la population du sujet (tel que, par exemple, par rapport à un sujet ou une population de sujets général(e), normal(e) ou sain(e). La probabilité, la chance ou le risque qu’un sujet développe une maladie ou un état peut donc être avantageusement indiqué comme accru ou diminué, ou comme multiplié ou divisé par rapport à un sujet ou une population de sujets de contrôle approprié. Tel qu’utilisé ici, le terme « prédiction » des états ou maladies tel qu’enseigné ici chez un sujet peut également signifier que le sujet a une prédiction «positive » de celles-ci, c'est-à-dire que le sujet courre un risque d'avoir celles-ci (par exemple, le risque est significativement accru vis-à-vis d’un sujet ou d’une population de sujets de contrôle. Le terme « prédiction de pas de » maladies ou états tel qu’enseigné ici tel que décrit ici chez un sujet peut particulièrement signifier que le sujet a une prédiction « négative » de celles-ci, c’est-à-dire que le risque que le sujet ait celles-ci n’est pas significativement accru vis-à-vis d’un sujet ou d’une population de sujet de contrôle.

Les termes « diagnostiquer » ou « diagnostic » se réfèrent généralement au processus ou acte de reconnaissance, décision ou conclusion d’une maladie ou état chez un sujet sur la base des symptômes ou signes et/ou à partir des résultats des diverses procédures de diagnostic (tel que, par exemple, à partir de la connaissance de la présence, de l'absence et/ou de la quantité d'une ou plusieurs caractéristiques des biomarqueurs de la maladie ou état diagnostiquées. Tel qu’utilisé ici « diagnostic des » maladies ou états tel qu'enseigné ici chez un sujet peut particulièrement signifier que le sujet présente ceux-ci et donc a fait l'objet du diagnostic de présenter ceux-ci. « Diagnostic de pas » de maladies ou états tel qu'enseigné ici chez un sujet peut particulièrement signifier que le sujet ne présente pas ceux-ci et donc a fait l'objet du diagnostic de ne pas présenter ceux-ci. Un sujet peut faire l’objet d’un diagnostic de ne pas présenter ceux-ci malgré la présence d’un ou plusieurs symptômes conventionnels ou signes évocateurs de ceux-ci.

Les termes « pronostiquer » ou « pronostic » se réfèrent généralement à une anticipation sur la progression d’une maladie ou d’un état et la perspective (par exemple, la probabilité, la durée et/ou l’étendue) de la récupération. Un bon pronostic des maladies ou états enseignés ici peut généralement englober une anticipation d'une récupération satisfaisante partielle ou complète à partir des maladies ou états, préférablement dans une période de temps acceptable. Un bon pronostic de ceux-ci peut plus couramment englober une anticipation de non aggravation ou autre aggravation de ceux-ci, préférablement dans une période de temps donnée. Un mauvais pronostic des maladies ou états tel qu'enseigné ici peut généralement englober une anticipation d'une récupération sous-standard et/ou une récupération lente peu satisfaisante, ou substantiellement pas de récupération ou même une aggravation de celles-ci.

Donc la prédiction ou le pronostic d’une maladie ou état peut notamment autoriser la prédiction ou établir un pronostic de l’occurrence de la maladie ou de l’état, ou prédire ou établir un pronostic de la progression, de l’aggravation, de l’atténuation ou de la récurrence de la maladie ou de l’état ou la réponse à un traitement ou à d’autres facteurs externes ou internes, situations ou causes de stress, etc.

En outre, la surveillance d’une maladie ou état peut notamment permettre de prédire l’occurrence de la maladie ou de l’état, ou de surveiller la progression, l’aggravation, l’atténuation ou la récurrence de la maladie ou de l’état, ou la réponse au traitement ou à d’autres facteurs externes ou internes, situations ou causes de stress, etc. De manière avantageuse, la surveillance peut s’appliquer au cours d'un traitement médical d'un sujet, préférablement un traitement médical ayant pour but l’atténuation de la maladie ou de l’état ainsi surveillé. Une telle surveillance peut être comprise, par exemple, dans la prise de décision pour la sortie d’hôpital d’un patient, pour les besoins de modification d’un traitement ou le besoin d’une autre hospitalisation. Tel que prévu ici, une référence pour surveiller une maladie ou un état inclut également de manière spécifique la surveillance de la probabilité, du risque ou de la chance d'un sujet de développer la maladie ou l’état, c'est-à-dire, la surveillance du(des) changement(s) de ladite probabilité, dudit risque ou de ladite chance avec le temps.

Le terme « sujet » ou « patient » tel qu’utilisé ici typiquement et préférablement indique des humains, mais peut également englober la référence à des animaux non-humains, préférablement des animaux à sang chaud, plus préférablement des vertébrés, encore plus préférablement des mammifères, tels que, par exemple, des primates non-humains, des rongeurs, des canins, des félins, des équins, des ovins, des porcins et autres. Sont particulièrement visés des sujets connus comme ou suspectés d’avoir souffert d’une fracture osseuse, plus particulièrement chez lesquels la fracture osseuse n’a pas été consolidée (tel qu’établi, par exemple, par recherche radiologique). Des sujets pertinents peuvent inclure ceux présentant à un docteur des symptômes et signes indicateurs d’une fracture osseuse non consolidée ou d’une consolidation altérée des fractures osseuses.

Les termes « échantillon » ou « échantillon biologique » tels qu’utilisés ici incluent tout spécimen biologique obtenu à partir d’un sujet. Des spécimens biologiques exemplaires incluent, sans limitation, le sang total, le plasma, le sérum, les érythrocytes, les leucocytes (par exemple cellules sanguines mononucléaires périphériques), moelle osseuse totale, cellules souches et sériques dérivées de la moelle osseuse, salive, urine, selles (c’est-à-dire fèces), larmes, sueur, sébum, aspirat de mamelons, lavage de canal, exsudais de tumeur, liquide synovial, liquide céphalorachidien, lymphe, liquide de cytoponction, liquide amniotique, tout autre liquide corporel, rognures d’ongles, lysat cellulaire, produits de sécrétion cellulaire, liquide inflammatoire, sécrétions vaginales, biopsies, biopsies osseuses, tissus osseux homogénats de tissus, etc. Des échantillons préférés peuvent inclure ceux comportant un ou plusieurs biomarqueurs tels qu’enseignés ici en quantités détectables. Des échantillons plus préférés, particulièrement pour la détermination des niveaux systémiques des biomarqueurs, incluent le sang total ou un composant infime de celui-ci, tel que particulièrement préférablement le plasma ou le sérum. Dans certains modes de réalisation, un échantillon peut comprendre ou peut être représenté par du surnageant de cellules ou cellule, lesdites cellules (préférablement MSC ou OB) ayant été obtenues à partir du sujet et cultivés subséquemment in vitro. Préférablement, les cellules peuvent être évaluées au cours de la culture primaire et/ou secondaire. Préférablement un échantillon est facilement disponible par des méthodes minimalement invasives, permettant d’enlever ou d’isoler ledit échantillon du sujet.

Une molécule ou substance à analyser tel qu’un métabolite, acide nucléique, ARN, ADN ou ADNc, protéine, polypeptide ou peptide est « mesurée » dans un échantillon quand la présence ou l’absence et/ou la quantité de ladite molécule ou substance à analyser dudit groupe de molécules ou de substances à analyser est détectée ou déterminée dans l’échantillon, préférablement substantiellement pour l’exclusion d’autres molécules et substances à analyser. Par exemple, un biomarqueur peut être mesuré en mesurant l’ARNm encodant celui-ci ou en mesurant la protéine ou polypeptide encodée ou un peptide de celui-ci.

Les termes « quantité », « volume » et « niveau » sont synonymes et généralement bien compris dans l’art. Par rapport aux molécules ou substances à analyser, les termes peuvent particulièrement se référer à une quantification absolue de la molécule ou de la substance à analyser dans un échantillon, ou à une quantification relative de la molécule ou de la substance à analyser dans l’échantillon, c ’est-à-dire relative à une autre valeur telle qu’une valeur de référence telle qu’enseignée ici, ou à une plage de valeurs indiquant une expression de base d’un biomarqueur. Ces valeurs ou plages peuvent être obtenues à partir d’un patient unique ou à partir d’un groupe de patients.

Une quantité absolue d’une molécule ou d’une substance à analyser dans un échantillon peut être avantageusement exprimée en poids ou en volume molaire, ou plus couramment en concentration, par exemple poids par volume ou poids moléculaire par volume.

Une quantité relative d’une molécule ou d’une substance à analyser dans un échantillon peut être avantageusement exprimée comme une augmentation ou une diminution ou comme une multiplication ou une diminution liée à ladite autre valeur, telle que relative à une valeur de référence telle qu'enseignée ici. La réalisation d’une comparaison relative entre la première variable et la seconde variable (par exemple, première et seconde quantité) peut mais ne nécessite pas de déterminer les valeurs absolues des dites première et seconde variables. Par exemple, une méthode de mesure peut produire des mesures quantifiables (telles que, par exemple, des intensités de signal) pour lesdites première et seconde variable, dans laquelle lesdites mesures sont une fonction de la valeur desdites variables et dans laquelle lesdites mesures peuvent être directement comparées pour produire une valeur relative pour la première variable face à la seconde variable, sans la nécessité actuelle de d'abord convertir les mesures en valeurs absolues des variables respectives.

Tel qu’utilisé ici, la référence à l’un quelconque des biomarqueurs, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide correspond au biomarqueur, à l’acide nucléique, à la protéine, au polypeptide ou au peptide couramment connus sous les désignations respectives dans l’art. Les termes englobent de tels biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides de tout organisme où ils ont été trouvés, et particulièrement d’animaux, préférablement des animaux à sang chaud, plus préférablement des vertébrés, encore plus préférablement des mammifères, incluant des mammifères humains et non-humains, encore plus préférablement des humains. Les termes englobent particulièrement de tels biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides avec une séquence native, c’est-à-dire ceux dont la séquence primaire est la même que celle des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides trouvés dans ou provenant de la nature. Une personne expérimentée comprend que les séquences natives peuvent différer entre différentes espèces du fait de la divergence génétique entre de telles espèces. En outre, des séquences natives peuvent différer entre ou parmi des individus différents de mêmes espèces du fait de la diversité génétique normale (variation) au sein d'espèces données. De même, des séquences natives peuvent différer entre ou même au sein de différents individus de mêmes espèces du fait des modifications post-transcriptionnelles ou post-translationnelles. Ces variantes ou isoformes de biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides sont décrites ici. En conséquence, toutes les séquences des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides trouvées dans ou provenant de la nature sont considérés comme « natives ». Les termes englobent les biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides quand ils font partie d’un organisme, organe, tissu ou cellule vivants, quand ils font partie d’un échantillon biologique, de même que, quand ils sont au moins partiellement isolés de telles sources. Les termes englobent également les biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides quand ils sont produits par des moyens recombinés ou synthétiques.

Des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides exemplaires humains tels qu’enseignés ici peuvent être annotés avec les numéros d’accession NCBI Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) donnés ci-dessous. Une personne expérimentée peut également être consciente que dans certains cas, lesdites séquences puissent être des précurseurs (par exemple préprotéines) des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides tels qu’enseignés ici et puissent inclure des parties qui sont traitées loin des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides matures. Une personne expérimentée peut en outre être consciente que bien que seulement un ou plusieurs isoformes puisse être énuméré ci-dessous, tous les isoformes sont recherchés. Sauf spécification contraire, les entrées ci-dessous sont présentées sous la forme: Nom (Code; numéro d’accession Genbank pour une ou plusieurs séquences ARNm représentatives (par exemple, isoformes), suivi par une période et la version de la séquence Genbank; numéro d’accession Genbank pour une séquence d’acide aminé représentative correspondante (par exemple isoformes), suivi par une période et la version de la séquence Genbank):

Facteur-1 dérivé stromal et isoformes α, β, γ, φ et ε (SDF-1 ou CXCL12; NM_199168.3, NM 000609.5, NM_001033886.2, NM_001178134.1; NP_954637.1, NP_000600.1, NP_001029058.1, NP_001171605.1)

Facteur de croissance BB dérivé des plaquettes, c’est-à-dire un homodimère de polypeptides béta PDGFB (PDGFB; NM_002608.2, NM_033016.2; NP_002599.1, NP_148937.1)

Interleukine-8 (IL-8, CXCL8, GCP-1, LECT, LUCT, LYNAP, MDNCF, MONAP, NAF, NAP-1 ou NAP1; NM 000584.2; NP_000575.1)

Interleukine-6 (IL-6, HSF, HGF, CDF, BSF2 ou IFNB2; NM 000600.3, NP_000591.1)

Préférablement, quand l’échantillon est du sang total ou un composant fractionnel de celui-ci tel que plasma ou sérum, tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide peut être une forme circulante (c’est-à-dire forme non-cellulaire ou liée à la membrane).

Sauf apparence contraire dans le contexte, la référence ici à tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide de ceux-ci peut généralement également englober des formes modifiées desdits biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides tel que des modifications d’influence post-expression incluant, par exemple, la phosphorylation, la glycosylation, la lipidation, la méthylation, la cystéinylation, la sulfonation, la glutathionylation, l’acétylation, l’oxydation de méthionine en méthionine sulfoxyde ou méthionine sulfone, et autres.

Dans un mode de réalisation, tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide peut être humain, c’est-à-dire que leur séquence primaire peut être la même qu’une séquence primaire correspondante de ou présente dans un biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide humain se produisant naturellement. Donc le qualificatif « humain » dans cette connexion se rapporte à la séquence primaire des biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide respectifs, plutôt qu’à leur origine ou source. Par exemple, de tels biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides peuvent être présents dans ou isolés d’échantillons de sujets humains ou peuvent être obtenus par d’autres moyens (par exemple, par expression recombinée, translation acellulaire ou synthèse peptidique non-biologique).

Préférablement, les biomarqueurs tels que décrits ici sont de base protéine, polypeptide ou peptide.

La référence ici à tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide peut également englober des fragments de ceux-ci. Donc, la référence ici pour mesurer (ou mesurer la quantité de) tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide peut englober la mesure des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides et/ou la mesure d’un ou plusieurs fragments de ceux-ci. Par exemple, tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide et/ou un ou plusieurs fragments de ceux-ci peut être mesuré collectivement, de manière à ce que la quantité mesurée corresponde aux volumes ajoutés des espèces mesurées collectivement. Dans un autre exemple, tout biomarqueur, acide nucléique, protéine, polypeptide ou peptide et/ou un ou plusieurs fragments de ceux-ci peut être mesuré chacun individuellement.

Le terme « fragment » d’un acide nucléique se réfère généralement à des formes supprimées ou tronquées en 5’- et/ou 3’- terminal dudit acide nucléique. Le terme « fragment » d’une protéine, d’un polypeptide ou d’un peptide se réfère généralement aux formes supprimées ou tronquées en N- et/ou C- terminal desdits protéine, polypeptide ou peptide. Sans limitation, un fragment d’un acide nucléique, d’une protéine, d’un polypeptide ou d’un peptide peut représenter au moins environ 5%, ou au moins environ 10%, par exemple, > 20%, > 30% ou > 40%, tel que préférablement > 50%, par exemple, > 60%, > 70% ou > 80%, ou plus préférablement > 90% ou > 95% de la séquence nucléotidique dudit aide nucléique ou de la séquence d’acide aminé de ladite protéine, dudit polypeptide ou peptide.

Dans certains modes de réalisation, les biomarqueurs ou autres réactifs décrits ici peuvent comprendre un traceur détectable. Le terme « traceur » se réfère à tout atome, molécule, groupe caractéristique ou biomolécule qui peut être utilisé pour fournir une mesure ou une propriété détectable et préférablement quantifiable, et qui peut être lié à ou faire partie d’une entité d’intérêt, tel qu’un peptide ou un polypeptide ou un agent de liaison spécifique. Les traceurs peuvent être convenablement détectables par des moyens de spectrométrie de masse, spectroscopiques, optiques, colorimétriques, magnétiques, photochimiques, biochimiques, immunochimiques ou chimiques. Les traceurs incluent sans limitation des colorants; radio-traceurs telles que 'P, P, S, I, I; réactifs denses aux électrons; enzymes (par exemple, peroxydase de raifort ou phosphatase alcaline tel que couramment utilisés dans des immunoessais); groupes caractéristiques de liaison tels que biotine, maltose; haptènes tels que digoxigénine, his-tag, myc-tag; groupes caractéristiques luminogènes, phosphorescents ou fluorogènes; mass tags; et colorants fluorescents seuls ou en combinaison avec des groupes caractéristiques qui peuvent supprimer ou déplacer les spectres d’émission par transfert d’énergie de fluorescence par résonance (FRET). Des exemples d’associations qui peuvent être utilisées dans le traceur:disposition partenaire de liaison peuvent inclure, par exemple biotineistreptavidin, his-tag:ion métal (par exemple Ni2+), maltoseiprotéine de liaison du maltose. Également envisagée ici est l’utilisation de tous biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptide telle qu’enseignée ici, comprenant optionnellement un traceur détectable, comme contrôles (positif), standards ou calibreurs dans des essais de détection qualitatifs ou quantitatifs (méthodes de mesure) desdits biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides, et particulièrement dans ces méthodes pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance des maladies ou états tel qu’enseigné ici chez des sujets. Les biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides peuvent être délivrés sous toute forme, notamment comme précipités, séchés sous vide, lyophilisats, en solution liquides ou congelés ou en covalence ou de manière non-covalente immobilisés en phase solide, tel que par exemple, sur une matrice chromatographique solide ou sur du verre ou du plastique ou toute autre surface appropriée (par exemple, comme partie des puces et biopuces de peptide). Les biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides peuvent être facilement préparés, par exemple, isolés de sources naturelles ou préparés de manière recombinée ou synthétiquement.

La présente invention décrit en outre des agents de liaison capables de lier spécifiquement aux biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides tel qu’enseigné ici. Les agents de liaison tel que prévu dans toutes ces spécifications peuvent inclure notamment des preuves d’hybridation, amorces d’amplification, anticorps, aptamère, photoaptamère, protéine, peptide, peptidomimétiques ou une petite molécule. Les agents de liaison peuvent être marqués convenablement.

Le terme « lier spécifiquement » tel qu'utilisé dans ces spécifications signifie qu’un agent (mentionné ici également comme « agent de liaison-spécifique ») se lie à une ou plusieurs molécules ou substances à analyser souhaitées à l’exclusion d’autres molécules qui sont aléatoires ou non liées, et optionnellement substantiellement à l’exclusion d’autres molécules qui sont liées structurellement. Le terme «lier spécifiquement » ne requiert pas nécessairement qu’un agent se lie exclusivement à sa(ses) cible(s) prévues. Par exemple, un agent peut être considéré comme se liant spécifiquement à la(aux) cible(s) d’intérêt si son affinité pour de telle(s) cible(s) prévues sous les états de liaison est d’au moins 2 fois plus grande, préférablement au moins environ 5 fois plus grande, plus préférablement au moins environ 10 fois plus grande, encore plus préférablement au moins environ 25 fois plus grande, toujours plus préférablement au moins environ 50 fois plus grande et même encore plus préférablement au moins environ 100 fois ou plus plus grande, que son affinité pour une molécule non-cible. Pour des preuves d’hybridation, la liaison spécifique peut être évaluée sous des états d’hybridation de haute rigueur tel qu’il est connu dans l’art. Pour des amorces d’amplification, la liaison spécifique peut être mise en évidence par une amplification sélective de la cible voulue.

Préférablement, l’agent peut se lier à sa(ses) cible(s) avec constante d’affinité (KA) d’une telle liaison KA > lxlO6 M’1, plus préférablement KA > lxlO7 M'1, encore plus préférablement KA > lxlO8 M'1, même plus préférablement KA > lxlO9 M'1, et toujours plus préférablement KA > lxlO10 M1 or KA > lxlO11 M"1, où KA = [SBA_T]/[SBA][T], SBA indique l’agent de liaison spécifique, T indique la cible voulue. La détermination de KA peut être réalisée par des méthodes connues dans l’art, telle que par exemple, Γutilisation de la dialyse à l’équilibre et de l’analyse du diagramme de Scatchard.

Tel qu'utilisé ici, le terme « anticorps » est utilisé dans son sens large et se réfère généralement à tout agent de liaison immunologique. Le terme englobe spécifiquement des anticorps monoclonaux intacts, des anticorps polyclonaux, des anticorps multivalents (par exemple, 2-, 3- ou plus-valent) et/ou des anticorps multispécifiques (par exemple, anticorps bi- ou plus spécifiques) formés à partir d'au moins deux anticorps intacts et des fragments d’anticorps dans la mesure où ils montrent l’activité biologique voulue (particulièrement, la capacité à se lier spécifiquement à un antigène d’intérêt), de même que des composites multivalents et/ou multispécifiques de ces fragments. Le terme « anticorps » n’est pas uniquement inclusif des anticorps générés par des méthodes comprenant une immunisation, mais inclut également tout polypeptide, par exemple un polypeptide exprimé de manière recombinée, qui est fait pour englober au moins une région déterminante de la complémentarité (CDR) capable de se lier spécifiquement à un épitope ou à antigène d’intérêt. Le terme s’applique donc à ces molécules sans tenir compte si elles sont produites in vitro ou un vivo.

Un anticorps peut être un parmi les catégories IgA, IgD, IgE, IgG et IgM et préférablement un anticorps de catégorie IgG. Un anticorps peut être un anticorps polyclonal, par exemple, un antisérum ou des immunoglobulines purifiées à partir de celui-ci (par exemple, d’affinité purifié). Un anticorps peut être un anticorps monoclonal ou un mélange d’anticorps monoclonaux. Des anticorps monoclonaux peuvent cibler un antigène particulier ou un épitope particulier dans un antigène avec une sélectivité et une reproductibilité plus grandes. Au moyen d’exemple et sans limitation, des anticorps monoclonaux peuvent être faits par la méthode d’hybridome d’abord décrite par Kohler et al. 1975 (Nature 256: 495), ou peuvent être faits par des méthodes d’ADN (par exemple, comme dans US 4,816,567). Des anticorps monoclonaux peuvent également être isolés des pharmacothèques d’anticorps phagiques en utilisant des techniques telles que décrites par Clackson et al. 1991 (Nature 352: 624-628) et Marks et al. 1991 (J Mol Biol 222: 581-597), par exemple. D’autres agents de liaison peuvent être des fragments d’anticorps. Des « fragments d'anticorps » comprennent une partie d'un anticorps intact, comprenant la liaison antigène ou la région variable de celui-ci. Des exemples de fragments d’anticorps incluent les fragments Fab, Fab', F(ab')2, Fv et scFv; diabodies; anticorps linéaires; molécules d’anticorps monocaténaires; et anticorps multivalents et/ou multispécifiques formés à partir de fragment(s) d’anticorps, par exemple, dibodies, tribodies, et multibodies. Les désignations ci-dessus Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv etc. sont considérées comme ayant leur signification établie par l’art.

Le terme anticorps inclut des anticorps provenant de ou comprenant une ou plusieurs portions dérivées de toute espèce animale, préférablement des espèces vertébrées, incluant par exemple des oiseaux et des mammifères. Sans limitation, les anticorps peuvent être du poulet, de la dinde, de l'oie, du canard, de la pintade, de la caille ou du faisan. Également sans limitation, les anticorps peuvent être humains, murins (par exemple souris, rat, etc.), singe, lapin, chèvre, mouton, cochon d’Inde, chameau (par exemple Camelus bactrianus et Camelus dromaderius), lama (par exemple, Lama paccos, Lama glama ou Lama vicugna) ou cheval.

Une personne expérimentée comprendra qu’un anticorps peut inclure une ou plusieurs délétions, ajouts et/ou substitutions d’acide aminé (par exemple substitutions conservatrices), dans la mesure où de telles altérations préservent sa liaison de l’antigène respectif. Un anticorps peut également inclure une ou plusieurs modifications natives ou artificielles de ses résidus d’acide aminé constituants (par exemple glycosylation, etc.)

Des méthodes de production d’anticorps polyclonaux et monoclonaux de même que des fragments de ceux-ci sont bien connus dans l’art, tout comme le sont des méthodes pour produire des anticorps recombinés ou des fragments de ceux-ci (voir par exemple Harlow and Lane, “Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1988; Harlow and Lane, “Using Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbour Laboratory, New York, 1999, ISBN 0879695447; “Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques”, by Zola, ed., CRC Press 1987, ISBN 0849364760; “Monoclonal Antibodies: A Practical Approach”, by Dean & Shepherd, eds., Oxford University Press 2000, ISBN 0199637229; Methods in Molecular Biology, vol. 248: “Antibody Engineering: Methods and Protocols”, Lo, ed., Humana Press 2004, ISBN 1588290921).

Le terme « aptamère » se réfère à un oligo-ADN, oligo-ARN ou oligo ADN/ARN simple brin ou double brin ou tout analogue de ceux-ci, qui peut spécifiquement se lier à une molécule cible tel qu’un peptide. De manière avantageuse, les aptamères peuvent afficher une spécificité et une affinité élevées (par exemple KA dans l’ordre lxlO9 M'1) pour leurs cibles. La production d’aptamère est décrite notamment dans US 5,270,163; Ellington & Szostak 1990 (Nature 346: 818-822); Tuerk & Gold 1990 (Science 249: 505-510); ou “The Aptamer Handbook: Functional Oligonucleotides and Their Applications”, by Klussmann, ed., Wiley-VCH 2006, ISBN 3527310592, intégré ici par référence. Le terme « photoaptamère » se réfère à un aptamère qui contient un ou plusieurs groupes fonctionnels photoréactifs qui peuvent se lier de manière covalente ou se lier transversalement avec une molécule cible. Le terme « peptidomimétique » se réfère à un agent non-peptidique qui est un analogue topologique d’un peptide correspondant. Des méthodes de désignation rationnelle des peptidomimétiques des peptides sont connues dans l’art. Par exemple, la conception rationnelle des trois peptidomimétiques sur la base du peptide 8-mer sulfaté CCK26-33, et de deux peptidomimétiques sur la base du peptide 11-mer Substance P, et liée aux principes de conception des peptidomimétiques, est décrite dans Horwell 1995 (Trends Biotechnol 13: 132-134).

Le terme « petite molécule » se réfère aux composés, préférablement des composés organiques, avec une dimension comparable à ces molécules organiques généralement utilisées dans des produits pharmaceutiques. Le terme exclut des macromolécules biologiques (par exemple, protéines, acides nucléiques, etc.). Des petites molécules organiques préférées vont en dimension jusqu’à environ 5000 Da, par exemple jusqu’à environ 4000, préférablement jusqu’à 3000 Da, plus préférablement jusqu’à 2000 Da, encore plus préférablement jusqu’à environ 1000 Da, par exemple, jusqu’à environ 900, 800, 700, 600 ou jusqu’à environ 500 Da.

Toutes les méthodes de séparation, de détection et de quantification existantes, disponibles ou conventionnelles peuvent être utilisées ici pour mesurer la présence ou l’absence (par exemple, mesure présente face à absente; ou volume détectable face à volume non détectable) et/ou la quantité (par exemple, mesure étant une quantité absolue ou relative, telle que, par exemple, concentration absolue ou relative) des biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides de ceux-ci dans des échantillons (toutes molécules ou substances à analyser d’intérêt à mesurer ainsi dans des échantillons, incluant un quelconque ou plusieurs biomarqueurs, acides nucléiques, protéines, polypeptides ou peptides tel qu’enseigné ici, peuvent être ici mentionnées collectivement comme biomarqueurs).

Par exemple, de telles méthodes peuvent inclure des méthodes d’essais biochimiques, méthodes d’immunoessais, méthodes d’analyse de spectrométrie de masse ou méthodes de chromatographie, ou des combinaisons de celles-ci.

Le terme « immunoessai » se réfère généralement aux méthodes connues telles que celles pour détecter une ou plusieurs molécules ou substances à analyser d'intérêt dans un échantillon, où la spécificité d'un immunoessai pour la(les) molécule(s) ou la(les) substance(s) à analyser d’intérêt est conférée par une liaison spécifique entre un agent de liaison spécifique, couramment un anticorps et la(les) molécule(s) ou la(les) substance(s) à analyser d’intérêt. Des technologies d’immunoessai incluent sans limitation ELIS A direct (essai par immunoadsorbant lié à l’enzyme), ELISA indirect, ELISA en sandwich, ELISA par compétition, ELISA multiplexe, radioimmunoessai (RIA), technologies ELISPOT, et autres techniques semblables connues dans l’art. Les principes de ces méthodes d’immunoessais sont connues dans l’art, par exemple John R. Crowther, "The ELISA Guidebook", lst ed., Humana Press 2000, ISBN 0896037282.

Au moyen d’une autre explication et sans limitation, ELISA direct utilise un anticorps primaire marqué pour se lier à et ainsi quantifier l’antigène cible dans un échantillon immobilisé sur un milieu solide tel qu’une plaque Microwell. ELISA indirect utilise un anticorps primaire non marqué qui se lie à l’antigène cible et un anticorps marqué secondaire qui reconnaît et permet de quantifier l’anticorps primaire lié à l’antigène. Dans ELISA en sandwich, l’antigène cible est capturé à partir d’un échantillon en utilisant un anticorps « capture » qui se lie à un site antigène dans l’antigène, et suite à l’élimination des substances à analyser non liées, l’antigène ainsi capturé est détecté en utilisant un anticorps de « détection » qui se lie à un autre site antigène dans ledit antigène, où l’anticorps de détection peut être directement marqué ou indirectement détectable tel que ci-dessus. ELISA par compétition utilise un « compétiteur » marqué qui peut soit être l’anticorps primaire soit l'antigène cible. Dans un exemple, l’anticorps primaire non marqué est incubé avec un échantillon, cette réaction est permise pour atteindre un équilibre, puis l’antigène cible marqué est ajouté. Ce dernier sera lié à l’anticorps primaire partout où ses sites de liaisons ne seront pas encore occupés par un antigène cible non marqué provenant de l’échantillon. Ainsi, le volume détecté d’antigène lié marqué est inversement en corrélation avec le volume d’antigène non marqué dans l’échantillon. ELISA multiplexe permet la détection simultanée de deux ou plusieurs substances à analyser dans un compartiment unique (par exemple plaque Microwell) habituellement dans une pluralité d’adresses d’échantillons (voir, par exemple, Nielsen & Geierstanger 2004. J Immunol Methods 290: 10720 and Ling et al. 2007. Expert Rev Mol Diagn 7: 87-98 pour d’autres conseils). Tel que considéré, le marquage dans les technologies ELISA se fait habituellement par conjugaison d’enzyme (tel que, par exemple, peroxydase de raifort) et le point de virage est typiquement colorimétrique, chimiluminescent ou fluorescent, magnétique, piézoélectrique, pyroélectrique et autres.

Le radioimmunoessai (RIA) est une technique compétitive et implique le mélange de quantités connues d’antigène cible marqué radioactivement (par exemple, marqué l25I- ou 131I) avec anticorps audit antigène, puis l’ajout d’antigène non marqué ou « froid » à partir d’un échantillon et la mesure du volume de l’antigène marqué déplacé (voir, par exemple "An Introduction to Radioimmunoassay and Related Techniques", by Chard T, ed., Elsevier Science 1995, ISBN 0444821198 pour des conseils). Généralement, toute technique de spectrométrie de masse (MS) qui peut obtenir des informations précises sur la masse des peptides, et préférablement également sur une fragmentation et/ou une séquence d’acide aminé (partielle) des peptides sélectionnés (par exemple dans la spectrométrie de masse en tandem, MS/MS; ou dans la fragmentation après la source, TOF MS spectrométrie de masse à temps de vol), est utile ici. Des techniques et systèmes appropriés MS et MS/MS sont bien connus en soi (voir, par exemple, Methods in Molecular Biology, vol. 146: “Mass Spectrometry of Proteins and Peptides”, by Chapman, ed., Humana Press 2000, ISBN 089603609x; Biemann 1990. Methods Enzymol 193: 455-79; or Methods in Enzymology, vol. 402: “Biological Mass Spectrometry”, by Burlingame, ed., Academie Press 2005, ISBN 9780121828073) et peuvent être utilisés ici. La fragmentation d’ion peptide en dispositions MS (MS/MS) en tandem peut être obtenue en utilisant des manières établies dans l’art, tel que,par exemple, la dissociation induite par collision (CID). La détection et la quantification des biomarqueurs par spectrométrie de masse peut impliquer une surveillance multiple de réaction (MRM), tel que décrite parmi d’autres par Kuhn et al. 2004 (Proteomics 4: 1175-86). Les méthodes d’analyse de peptide MS peuvent être avantageusement associées avec des méthodes de séparation ou de fractionnement de protéine ou de peptide en aval, tel que par exemple les méthodes chromatographiques.

La chromatographie peut également être utilisée pour mesurer les biomarqueurs. Tel qu’utilisé ici, le terme « chromatographie » englobe des méthodes pour séparer les substances chimiques, mentionnées comme tel et largement disponible dans l’art. Dans une approche préférée, la chromatographie se réfère à un processus dans lequel un mélange de substances chimiques (substances à analyser) porté par un courant mobile de liquide ou de gaz (« phase mobile ») est séparé en composants comme résultat de la distribution différentielle des substance à analyser, puisqu’elles s’écoulent autour ou sur un liquide stationnaire ou une phase solide (« phase stationnaire »), entre ladite phase mobile et ladite phase stationnaire. La phase stationnaire peut être habituellement un solide finement divisé, une feuille de matériau filtrant ou une fine pellicule de liquide sur la surface d’un solide, ou similaire. La chromatographie est également largement applicable pour la séparation des composés chimiques d’origine biologique, tel que, par exemple, acides aminés, protéines, fragments de protéines ou peptides, etc.

La chromatographie telle qu’utilisée ici peut être préférablement colonnaire {c’est-à-dire où la phase stationnaire est déposée ou emballée dans une colonne), préférablement la chromatographie liquide et encore plus préférablement l’HPLC. Tandis que les spécificités de la chromatographie sont bien connues dans l’art, pour d’autres conseils, voir par exemple Meyer M., 1998, ISBN: 047198373X, and "Practical HPLC Methodology and Applications", Bidlingmeyer, B. A., John Wiley & Sons Inc., 1993. Des types exemplaires de chromatographie incluent, sans limitation, une chromatographie liquide haute performance (HPLC), une HPLC à phase normale (NP-HPLC), une HPLC à phase inversée (RP-HPLC), une chromatographie à échange d’ions (IEC), telle qu’une chromatographie à échange de cation ou d’anion, une chromatographie à interaction hydrophile (HILIC), une chromatographie à interaction hydrophobe (HIC), une chromatographie d’exclusion diffusion (SEC) incluant une chromatographie à filtration sur gel ou une chromatographie sur gel perméable, chromatofocusing, chromatographie d’affinité telle qu’immunoaffinité, chromatographie d’affinité rftétallique immobilisée et autres. D’autres méthodes de séparation, identification ou quantification de peptides ou polypeptides peuvent être utilisées, optionnellement en conjonction avec l’une des méthodes d’analyse décrites ci-dessus, pour la mesure des biomarqueurs de la présente invention. De telles méthodes incluent, sans limitation, le fractionnement d’extraction chimique, la focalisation isoélectrique (IEF) incluant la focalisation isoélectrique capillaire (CIEF), l’isotachophorèse capillaire (CITP), l’électrochromatographie capillaire (CEC), et autres, l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide unidimensionnelle (PAGE), l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide bidimensionnelle (2D-PAGE), l’électrophorèse sur gel capillaire (CGE), l’électrophorèse sur zone (CZE), la chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC), l’électrophorèse en continue en milieu liquide (FFE), etc.

Le niveau des biomarqueurs au niveau de l’ARN peut être détecté en utilisant les outils de mesure de l’ARN standard quantitatifs connus dans l’art. Des exemples sans limitation incluent l’analyse basée sur l’hybridation, l’analyse de l’expression de biopuce, l’expression de gène numérique (DGE), l’hybridation ARN in situ (RISH), le buvardage de Northern et autres; PCR, RT-PCR, RT-qPCR, point de virage PCR, PCR numérique ou autres; la détection oligonucléotidique supportée, le pyroséquençage, le séquençage cyclique de polony par synthèse, le séquençage bidirectionnel simultané, le séquençage à simple molécule, le séquençage en temps réel à simple molécule, le séquençage vrai à simple molécule, le séquençage par nanopore assisté par hybridation, et le séquençage par synthèse.

Les divers aspects et modes de réalisation enseignés ici peuvent en outre dépendre de la comparaison de la quantité de biomarqueurs mesurés en échantillons à partir des patients avec des valeurs de référence, où lesdites valeurs de référence représentent des prédictions, diagnostics et/ou pronostics connus de maladies et états telles qu’enseignées ici.

Par exemple, les valeurs de référence distinctes peuvent représenter la prédiction d’un risque (par exemple un risque élevé d’anormalité) d’avoir une maladie ou état donnés tel qu’enseigné ici face à la prédiction d’aucun risque ou de risque normal d’avoir ladite maladie ou ledit état. Dans un autre exemple, des valeurs de référence distinctes peuvent représenter des prédictions de degrés différents de risque d’avoir une telle maladie ou un tel état.

Dans un autre exemple, des valeurs de référence distinctes peuvent représenter le diagnostic d’une maladie ou état donnés tel qu'enseigné ici face au diagnostic d’aucune maladie ou état de cette sorte (tel que, par exemple, le diagnostic de santé ou de récupération de ladite maladie ou dudit état, etc.). Dans un autre exemple, des valeurs de référence distinctes peuvent représenter le diagnostic d’une telle maladie ou d’un tel état de gravité variable.

Dans encore un autre exemple, des valeurs de référence distinctes peuvent représenter un bon pronostic pour une maladie ou état donné tel qu’enseigné ici face à un mauvais pronostic pour ladite maladie ou ledit état. Dans un autre exemple, des valeurs de référence distinctes peuvent représenter des pronostics favorables ou défavorables de façon variable, pour une telle maladie ou un tel état.

Une telle comparaison peut généralement inclure tout moyen de déterminer la présence ou l’absence d’au moins une différence et optionnellement de la taille de cette différence entre des valeurs comparées. Une comparaison peut inclure une inspection visuelle, une comparaison arithmétique ou statistique des mesures. De telles comparaisons statistiques incluent, mais sans se limiter à, l’application d’une règle.

Des valeurs de référence peuvent être établies selon les procédures connues précédemment utilisées pour d’autres biomarqueurs et paramètres. Par exemple, une valeur de référence peut être établie chez un individu ou une population d’individus caractérisés par un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic particulier de ladite maladie ou dudit état (c ’est-à-dire, pour qui ledit diagnostic, la dite prédiction et/ou ledit pronostic de la maladie ou de l’état reste vrai). Une telle population peut comprendre sans limitation > 2, > 10, > 100, ou même plusieurs centaines ou plus d’individus.

Un « écart » d'une première valeur à partir d'une seconde valeur peut généralement englober toute direction (par exemple, augmentation: première valeur > seconde valeur; ou diminution: première valeur< seconde valeur) et toute étendue de l’altération.

Par exemple, un écart peut englober une diminution dans une première valeur, sans limitation, d’au moins environ 10% (environ 0.9-fois ou moins), ou d’au moins environ 20% (environ 0.8-fois ou moins), ou d’au moins environ 30% (environ 0.7-fois ou moins), ou d’au moins environ 40% (environ 0.6-fois ou moins), ou d’au moins environ 50% (environ 0.5-fois ou moins), ou d’au moins environ 60% (environ 0.4-fois ou moins), ou d’au moins environ 70% (environ 0.3-fois ou moins), ou d’au moins environ 80% (environ 0.2-fois ou moins), ou d’au moins environ 90% (environ 0.1-fois ou moins), relative à une seconde valeur avec laquelle une comparaison est réalisée.

Par exemple, un écart peut englober une augmentation d’une première valeur, sans limitation, d’au moins environ 10% (environ 1.1-fois ou plus), ou d’au moins environ 20% (environ 1.2-fois ou plus), ou d’au moins environ 30% (environ 1.3-fois ou plus), ou d’au moins environ 40% (environ 1.4-fois ou plus), ou d’au moins environ 50% (environ 1.5-fois ou plus), ou d’au moins environ 60% (environ 1.6-fois ou plus), ou d’au moins environ 70% (environ 1.7-fois ou plus), ou d’au moins environ 80% (environ 1.8-fois ou plus), ou d’au moins environ 90% (environ 1.9-fois ou plus), ou d’au moins environ 100% (environ 2-fois ou plus), ou d’au moins environ 150% (environ 2.5-fois ou plus), ou d’au moins environ 200% (environ 3- fois ou plus), ou d’au moins environ 500% (environ 6-fois ou plus, ou d’au moins environ 700% (environ 8-fois ou plus), ou autre relative à une seconde valeur avec laquelle une comparaison est réalisée.

Préférablement, un écart peut se référer à une altération observée statistiquement significative. Par exemple, un écart peut se référer à une altération observée qui tombe hors des marges d’erreur des valeurs de référence chez une population donnée (tel qu’exprimé, par exemple, par un écart standard ou une erreur standard, ou par un multiple prédéterminé de celui-ci, par exemple, ±lxSD ou ±2xSD, ou ±lxSE ou ±2xSE). L’écart peut également se référer à une valeur tombant hors d’une plage de référence définie par des valeurs chez une population donnée (par exemple, hors d’une plage qui comprend >40%, > 50%, >60%, >70%, >75% ou >80% ou >85% ou >90% ou >95% ou même >100% de valeurs chez lesdites populations).

Dans un autre mode de réalisation, un écart peut être conclu si une altération observée se trouve au delà d’un seuil ou d’une coupure donnée. Un tel seuil ou une telle coupure peuvent être sélectionnés tel que généralement connu dans l’art pour apporter une sensibilité et/ou une spécificité choisies des méthodes de diagnostic, prédiction et/ou pronostic, par exemple, la sensibilité et/ou la spécificité d’au moins 50%, ou au moins 60%, ou au moins 70%, ou au moins 80%, ou au moins 85%, ou au moins 90%, ou au moins 95%.

Il est donc évident qu’ont été fournis conformément à l'invention, les biomarqueurs, utilisations et méthode qui apportent des avantages substantiels dans le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures. Tandis que l’invention a été décrite en conjonction avec des modes de réalisation spécifiques de celle-ci, il est évident que de nombreuses alternatives, modifications et variations seront évidentes pour les personnes expérimentées dans l'art à la lumière de la description suscitée. En conséquence, il est prévu d’englober toutes ces alternatives, modifications et variations comme suit dans l’esprit et la portée étendue des revendications jointes.

Les aspects et modes de réalisation de l’invention sont en outre supportés par les exemples non-limitatifs suivants.

EXEMPLE

Exemple 1: mesure des niveaux de biomarqueurs dans le sérum/plasma

Deux groupes de sujets sont saisis dans l’étude: (1) volontaires sains (HV), (2) patients avec consolidation altérée des fractures, en particulier avec fractures avec absence de consolidation (NU). La population de patients a été distribuée comme suit:

L’âge moyen dans les deux groupes variait entre trente et quarante ans. Les patients avec fracture avec absence de consolidation étaient plus âgés (P = 0.012) et étaient principalement des hommes. Cependant, les résultats sont restés inchangés indépendamment du sexe et de l’âge. Les sites osseux se trouvaient dans les os longs (radius, humérus, fibula, tibia et cubitus) sauf 2 fractures du métatarse et 2 fractures du calcanéum. Le délai entre la fracture et l’échantillon récolté variait d’environ 25 mois avec un écart standard de 15 mois.

Pour identifier les marqueurs biologiques systémiques des fractures avec absence de consolidation, les sérums ont été collectés dans des tubes secs et le plasma a été collecté dans des tubes héparine ou EDTA, centrifugés, aliquotés et congelés à -20°C jusqu’à utilisation. Ils ont été utilisés pour déterminer le niveau des facteurs de croissance et des protéines en utilisant les dosages immunoadsorbants reliés à l’enzyme (ELISA).

Le facteur 1 dérivé stromal a été mesuré dans le plasma (SDF-1/CXCL12, Duoset, R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). Les biomarqueurs suivants ont été mesurés dans le sérum: Facteur de croissance BB dérivé des plaquettes (PDGF-BB, Quantikine™ R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni), interleukine-8 (IL8/CXCL8, Quantikine™, R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni) et interleukine 6 (IL-6, Quantikine™, R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni).

Toutes les valeurs continues sont exprimées comme moyennes ± erreur standard de la moyenne (SEM), toutes les valeurs P rapportées sont unilatérales, et la signification statistique est évaluée sur le niveau 10%. La normalité de la distribution était testée avec un test de Kolmogorov-Smimov. Quand le test de Kolmogorov-Smimov a échoué, les différences entre les groupes ont été analysées par un test de Mann-Whitney.

Par comparaison aux HV, chez les patients NU, le niveau plasmatique de SDF-1 a diminué (Fig. IA). La diminution a été plus prononcée dans le plasma collecté dans des tubes héparine par comparaison au plasma collecté dans des tubes EDTA (Fig. IB et IC). Donc, l’héparine peut être un agent de collecte de sang préféré, spécifiquement, un agent anti-coagulation, pour la collecte des échantillons de sang ou de plasma pour la mesure du SDF-1. Sur la base de la lecture de cet exemple particulier, et au moyen de l’illustration uniquement et sans aucune limitation à l’invention tel que décrite largement ici, une quantité de SDF-1 dans le plasma d’un sujet humain collecté en utilisant l'héparine, dont la quantité est inférieure à environ 200 pg/ml, préférablement moins qu’environ 150 pg/ml, plus préférablement moins qu’environ 100 pg/ml, tel qu’entre environ 20 et environ 150 pg/ml ou entre environ 50 et environ 100 pg/ml peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre un risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures; et une quantité de SDF-1 dans le plasma d’un sujet humain collecté en utilisant de l’héparine, dont la quantité est plus qu’environ 200 pg/ml peut indiquer que le sujet ne présente pas de consolidation altérée des fractures ou qu’il ne courre pas de risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet n’a pas besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures.

Le niveau sérique de PDGF-BB a diminué chez les patients NU par comparaison aux contrôles sains (HV) (Fig. 2). Sur la base de la lecture de cet exemple particulier et au moyen de l’illustration uniquement et sans aucune limitation à l’invention tel que décrite largement ici, une quantité de PDGF-BB dans le sérum d’un sujet humain qui est moins qu’environ 2.50 ng/ml, préférablement moins qu’environ 2.25 ng/ml, plus préférablement est d’environ 2.00 ng/ml ou moins, tel qu’entre environ 1.5 et environ 2.5 ng/ml ou entre environ 1.75 et environ 2.25 ng/ml peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre un risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures; et une quantité de PDGF-BB dans le sérum d’un sujet humain qui est plus qu’environ 2.50 ng/ml, préférablement plus qu’environ 2.70 ng/ml, tel qu’entre environ 2.50 et environ 3.00 ng/ml peut indiquer que le sujet ne présente pas de consolidation altérée des fractures ou qu’il ne courre pas de risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet n’a pas besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures.

Par comparaison avec des volontaires sains (HV), le niveau sérique de l’IL-8 a augmenté chez les patients NU (Fig. 3). Sur la base de la lecture de cet exemple particulier et au moyen de l’illustration uniquement et sans aucune limitation à l’invention tel que décrite largement ici, une quantité d’IL-8 dans le sérum d’un sujet humain qui est plus qu’environ 15 pg/ml, préférablement plus qu’environ 20 pg/ml, plus préférablement plus qu’environ 25 pg/ml, encore plus préférablement plus qu’environ 30 pg/ml, tel qu’entre environ 15 et environ 45 pg/ml ou entre environ 20 et environ 40 pg/ml ou entre environ 30 et environ 35 pg/ml peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre un risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures; et une quantité d’IL-8 dans le sérum d’un sujet humain qui est moins qu’environ 15 pg/ml, préférablement moins qu’environ 12.5 pg/ml, tel qu’entre environ 5 et environ 15 pg/ml ou entre environ 7.5 et environ 12.5 pg/ml ou est d’environ 10 pg/ml peut indiquer que le sujet ne présente pas de consolidation altérée des fractures ou qu’il ne courre pas de risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet n’a pas besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures.

Par comparaison avec des volontaires sains (HV), le niveau sérique de l’IL-6 a eu tendance à augmenter chez les patients NU (Fig.4A et 4B). Sur la base de la lecture de cet exemple particulier et au moyen de l’illustration uniquement et sans aucune limitation à l’invention tel que décrite largement ici, une quantité d’IL-6 dans le sérum d’un sujet humain qui est plus qu’environ 1.0 pg/ml, préférablement plus qu’environ 1.2 pg/ml, plus préférablement plus qu’environ 1.5 pg/ml, encore plus préférablement plus qu’environ 2 pg/ml, tel qu’entre environ 1.3 et environ 2.5 pg/ml ou entre environ 1.5 et environ 2.5 pg/ml peut indiquer que le sujet présente une consolidation altérée des fractures ou qu’il courre un risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet a besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures; et une quantité d’IL-6 dans le sérum d’un sujet humain qui est moins qu’environ 1.0 pg/ml peut indiquer que le sujet ne présente pas de consolidation altérée des fractures ou qu’il ne courre pas de risque d’avoir une consolidation altérée des fractures ou peut indiquer un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures chez le sujet, et peut indiquer que le sujet n’a pas besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures.

Exemple 2: culture de cellules provenant de sujets

Tel qu’il est remarqué, la quantité de biomarqueurs peut également être mesurée dans les cellules ou dans le surnageant des cellules obtenues à partir de sujets et cultivées in vitro, préférablement à partir de cellules ostéoblastiques (OB) ou de cellules souches mésenchymateuses (MSC). Ce qui suit apporte les protocoles appropriés pour l’isolation, la différentiation et la culture des cellules souches.

Vingt à soixante ml de moelle osseuse héparinisée (BM) ont été obtenus à partir de la crête iliaque distante du site de la fracture. BM a été mélangé à du soluté physiologique tamponné par les phosphates (PBS:BM proportion (v:v): 2) et mis en couche sur une solution Ficoll de gradients de densité. Après la centrifugation, des cellules mononucléaires ont été cultivées à partir de l’interface et lavées deux fois dans le PBS. Les cellules étaient mises en culture en flacons de 1.43 xlO6 cellules/25 cm2 dans deux différents milieux; (1) un milieu mésenchymal composé de DNEM, 10% de sérum fœtal bovin, 1% de L-glutamine, 1% de pénicilline et 1% de streptomycine; (2) un milieu ostéogénique. Les cellules ont été conservées dans une atmosphère humidifiée à 37°C contenant 5% de CO2. Les changements de milieu étaient réalisés tous les 2 à 3 jours. Quand elles étaient confluentes, les cellules de la première culture étaient détachées et remises en culture pour la culture secondaire. Les surnageants de ces 2 passages de culture ont été collectés et congelés jusqu’à utilisation.

Les protocoles de réactifs ELISA utilisés pour les échantillons de sang ont été appliqués au surnageant de cellule avec une adaptation courante.

Exemple 3: activité autocrine/paracrine des cellules ostéoblastiques et des cellules souches mésenchymateuses

Pour étudier l’activité autocrine/paracrine des cellules ostéoprogénitrices dans la consolidation altérée des fractures, le niveau des facteurs de croissance secrété dans la culture de la cellule ostéoblastique surnageante (OB) ou de la cellule mésenchymale (MSC) a été évalué par ELISA. Les facteurs de croissance suivants ont été mesurés; facteur 1 dérivé stromal (SDF-1/CXCL12, Duoset, R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni), et interleukine-6 (IL-6, Duoset, R&D Systems, Abingdon, Royaume-Uni). Les valeurs ont été exprimées en pg/ml de surnageant.

Par comparaison à des volontaires sains (HV), SDF-1 était moins secrété dans le surnageant de la culture OB et MSC des patients avec absence de consolidation des fractures (NU) à la fin de la culture cellulaire primaire (Fig 5A et 5B).

En outre, IL-6 était moins secrété dans le surnageant de la culture OB des patients NU à la fin des cultures cellulaire primaire et secondaire par comparaison avec HV (Fig 6).

Claims

Revendications

1. Utilisation d’interleukine-8 (IL-8) comme biomarqueur pour la consolidation altérée des fractures osseuses.
2. Utilisation d’IL-8 pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses.
3. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 ou 2, dans laquelle la consolidation altérée des fractures osseuses est sélectionnée parmi le groupe consistant en fracture à consolidation vicieuse, fracture à consolidation retardée, et fracture avec absence de consolidation.
4. Méthode pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet comprenant la mesure du niveau d’IL-8 dans un échantillon provenant dudit sujet.
5. Méthode pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet selon la revendication 4 comprenant les étapes de: (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart pour un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic spécifique de consolidation altérée des fractures chez le sujet.
6. Méthode pour surveiller la consolidation altérée des fractures osseuses ou pour surveiller le risque de développement de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet selon la revendication 4 comprenant les étapes de: (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet à deux ou plusieurs points temporels successifs; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs; (iv) attribution de ladite découverte d’écart ou d’aucun écart à une modification dans la consolidation altérée des fractures osseuses ou à une modification dans la probabilité de développer une consolidation altérée des fractures osseuses chez le sujet entre les dits deux ou plusieurs points temporels successifs.
7. Méthode pour déterminer si un sujet est ou n’est pas dans le besoin d’un traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures osseuses comprenant la mesure du niveau d’IL-8 dans un échantillon provenant dudit sujet, comprenant préférablement les étapes de: (i) mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant du sujet; (ii) comparaison de la quantité telle que mesurée dans (i) avec une valeur de référence représentant un diagnostic, une prédiction et/ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures osseuses; (iii) découverte d’un écart ou d’aucun écart de la quantité telle que mesurée dans (i) à partir de la valeur de référence; et (iv) déduction à partir de ladite découverte de présence ou d’absence d’un besoin de traitement thérapeutique ou prophylactique pour la consolidation altérée des fractures osseuses.
8. Méthode selon l’une quelconque des revendications 4 à 7, dans laquelle la consolidation altérée des fractures osseuses est sélectionnée parmi le groupe consistant en fracture à consolidation vicieuse, fracture à consolidation retardée, et fracture avec absence de consolidation.
9. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou méthode selon l’une quelconque des revendications 4 à 8, comprenant en outre la mesure du niveau de l’un quelconque ou plus des SDF-1, PDGF-BB, EL-6, TGF-|S, PDGF, FGF et BMP dans un échantillon provenant du sujet.
10. Méthode pour établir une valeur de référence pour IL-8, ladite valeur de référence représentant: (a) une prédiction ou un diagnostic d’absence de consolidation altérée des fractures osseuses ou un bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, ou (b) une prédiction ou un diagnostic de consolidation altérée des fractures osseuses ou un mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, comprenant: (i) la mesure de la quantité d’IL-8 dans un échantillon provenant de: (i a) un ou plusieurs sujets ne présentant pas de consolidation altérée des fractures osseuses ou ne courant pas le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures osseuses ou ayant un bon pronostic de consolidation altérée des fractures osseuses, ou (i b) un ou plusieurs sujets présentant une consolidation altérée des fractures osseuses ou courant le risque d’avoir une consolidation altérée des fractures osseuses ou ayant un mauvais pronostic de consolidation altérée des fractures osseuses, et (ii a) l’établissement à partir de la quantité d’IL-8 telle que mesurée dans (i a), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de l’absence de consolidation altérée des fractures osseuses ou représentant le bon pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses, ou (ii b) l’établissement à partir de la quantité d’IL-8 telle que mesurée dans (i b), la valeur de référence représentant la prédiction ou le diagnostic de consolidation altérée des fractures osseuses ou représentant le mauvais pronostic pour la consolidation altérée des fractures osseuses.
11. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou 9 ou méthode selon l’une quelconque des revendications 4 à 10, comprenant la mesure de la quantité systémique d’IL-8, préférablement dans laquelle l’échantillon comprend, consiste essentiellement en ou consiste en du sang total ou un composant fractionnel de celui-ci, plus préférablement du plasma ou sérum.
12. Utilisation selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou 9 ou méthode selon l’une quelconque des revendications 4 à 10, comprenant la mesure de la quantité d’IL-8 dans les cellules ou dans le surnageant des cellules obtenues à partir du sujet et cultivées subséquemment in vitro.
13. Utilisation ou méthode selon la revendication 12, dans laquelle les cellules sont des ostéoblastes (OB) ou des cellules souches mésenchymateuses (MSC).
14. Utilisation d’un kit pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses chez un sujet, le kit comprenant (i) un ou plusieurs agents de liaison capables de lier spécifiquement à IL-8, particulièrement dans un échantillon provenant du sujet, et (ii) optionnellement et préférablement une ou plusieurs valeurs de référence ou moyens pour établir ladite une ou plusieurs valeurs de référence, dans lequel ladite une ou plusieurs valeurs de référence représentent un diagnostic, une prédiction et /ou un pronostic connu de consolidation altérée des fractures osseuses.
15. Utilisation selon la revendication 14, dans laquelle le moyen de collecte d’un échantillon à partir d’un sujet est fourni séparément du kit ou est compris dans le kit.
16. Utilisation d’une puce ou biopuce d’acide nucléique ou une puce ou biopuce de protéine, polypeptide ou peptide pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses, ladite puce ou biopuce comprenant un acide nucléique encodant IL-8 ou comprenant IL-8.
17. Utilisation d’une puce ou biopuce d’agent de liaison pour le diagnostic, la prédiction, le pronostic et/ou la surveillance de la consolidation altérée des fractures osseuses, ladite puce ou biopuce comprenant un ou plusieurs agents de liaison capables de se lier spécifiquement à IL-8, comprenant préférablement une quantité ou concentration connue dudit un ou plusieurs agents de liaison.