BR112013003391B1 - Método para diagnosticar câncer pancreático em um indivíduo - Google Patents

Abstract

biomarcadores de câncer pancreático e usos dos mesmos. a presente revelação inclui biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e kits para a detecção e o diagnóstico de câncer em geral e câncer pancreático especificamente. em um aspecto, a revelação fornece biomarcadores que podem ser usados sozinhos ou em várias combinações para diagnosticar o câncer em geral ou o câncer pancreático especificamente. em outro aspecto, métodos são fornecidos para diagnosticar câncer pandreático em um indivíduo, onde os métodos incluem detecção, em uma amostra biológica de um indivíduom de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecido na tabela 1, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer pancreático, ou a probabilidade do indivíduo tendo câncer pancreático é determinada, baseada em pelo menos um valor de biomarcador. em um aspecto adicional, os métodos são fornecidos para diagnosticar o câncer em geral um indivíduo, onde os métodos incluem detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer geralmente, ou a probabilidade do indivíduo tendo câncer é determinada, baseada em pelo menos um valor de biomarcador.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “MÉTODO PARA DIAGNOSTICAR CÂNCER PANCREÁTICO EM UM INDIVÍDUO”.

PEDIDOS DE PATENTE RELACIONADOS [0001] Este pedido de patente reivindica o benefício do Pedido

Provisório de Patente U.S. No. Serial 61/373.687, depositado em 13 de agosto de 2010, Pedido Provisório de Patente U.S. No. Serial 61/418.689, depositado em primeiro de dezembro de 2010, Pedido Provisório de Patente U.S. No. Serial 61/482.347, depositado em 4 de maio de 2011, e Pedido Provisório de Patente U.S. No. Serial 61/482.480, depositado em 4 de maio de 2011, cada um dos quais é incorporado neste pedido por referência em sua totalidade.

CAMPO DA INVENÇÃO [0002] O presente pedido de patente refere-se geralmente à detecção de biomarcadores e o diagnóstico do câncer em um indivíduo e, mais especificamente, a um ou mais biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e kits para diagnóstico de câncer, mais particularmente câncer pancreático, em um indivíduo.

ANTECEDENTES [0003] A seguinte descrição fornece um resumo da informação relevante para o presente pedido de patente e não é uma admissão que qualquer informação fornecida ou publicações referenciadas neste pedido é técnica anterior ao presente pedido de patente.

[0004] O câncer pancreático é a quarta causa principal de morte relacionada ao câncer nos EUA. Embora a sobrevida de 5 anos seja somente de 5%, foi mostrado que esta aumenta com intervenção cirúrgica precoce: em 20% dos indivíduos elegíveis a uma resseção “curativa”, a sobrevida aumenta de 15 a 20%. No momento do diagnóstico, mais da metade dos pacientes tem doença distante e os outros 25% têm disseminação regional. Isto é porque a doença é

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2/284 notoriamente difícil de diagnosticar nos seus estágios precoces. Aproximadamente 20 por cento dos pacientes com a doença “operável” [estágio IIb ou menos] sofrem uma resseção “curativa” e a sobrevida aumenta de 5 anos de menos de 5% a 15-20%.

[0005] Os cânceres pancreáticos podem resultar tanto das porções exócrinas como das endócrinas do pâncreas. De tumores pancreáticos, 95% desenvolvem-se da porção exócrina do pâncreas, incluindo o epitélio ductal, células acinares, tecido conectivo e tecido linfático. Aproximadamente 75% de todos os carcinomas pancreáticos ocorrem dentro da cabeça ou pescoço do pâncreas, 15-20% ocorrem no corpo do pâncreas, e 5-10% ocorrem na cauda.

[0006] A recidiva pode ser local (no mesmo local ou próximo de onde começou) ou distante (disseminação a órgãos, tais como fígado, pulmões ou ossos). Quando câncer exócrino pancreático ocorre, é essencialmente tratado da mesma forma que câncer metastático, e provavelmente incluirá quimioterapia se o paciente puder tolerá-la. Tipicamente, câncer pancreático primeiro sofre metástase a linfonodos regionais, então ao fígado, e, menos comumente, aos pulmões. Também pode invadir diretamente órgãos viscerais circundantes, tais como duodeno, estômago, e cólon ou sofre metástase a qualquer superfície na cavidade abdominal através da disseminação peritoneal. Pode resultar em ascite, e isto tem um prognóstico ameaçador. Câncer pancreático pode disseminar-se à pele como metástases nodulosas dolorosas. Câncer pancreático raramente sofre metástase para os ossos.

[0007] Duas aplicações clínicas de um teste de câncer pancreático baseado em sangue são para diagnóstico pré-clínico na população assintomática de alto risco e diagnóstico diferencial na população sintomática. A utilidade clínica de ambas destas indicações é delineada abaixo.

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3/284 [0008] Rastreamento em uma população assintomática de alto risco: houve aproximadamente 43.140 novos casos de câncer pancreático nos EUA em 2010, e 36.800 mortes. Genética, história familiar, pancreatite crônica, fumo e alto consumo de álcool aumentam o risco de câncer pancreático, tal como o de fibrose cística. O aumento no risco foi relatado como:

• Fumo de cigarros: <25 por dia é risco de 2x,> 25 por dia é risco de 3x • Álcool: mais de 3 doses de bebida por dia fornece um aumento de risco de 1,6 vezes • História familiar: um parente de primeiro grau com a doença fornece um aumento de 5x • Adultos com fibrose cística: risco de 31x • Mutações genéticas de BRCA2: risco de 10x [0009] Na população assintomática mas em risco, a ausência de um paradigma de rastreamento eficaz de câncer é simplesmente detectado no momento da apresentação dos sintomas. Isto provavelmente será tarde. A existência de um teste de detecção precoce aumentaria a proporção de pacientes elegíveis para a cirurgia curativa. A taxa de cura atual de 20% nos 20% de indivíduos de detecção precoce é somente 4% da população total. Se a elegibilidade à cirurgia curativa aumentasse - pela detecção precoce na população assintomática - dos 20% atuais, então o total curável aumentaria, como seria o número de vidas salvas por ano. Uma vez que o câncer pancreático é uma doença de baixa prevalência, até nesta população de alto risco, alta especificidade é um atributo importante para um teste de rastreamento. Uma baixa taxa de falsos- positivos é essencial para reduzir o custo incorrido por procedimentos posteriores desnecessários e reduzir a ansiedade do paciente.

[00010] Diagnóstico diferencial no paciente sintomático. O

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4/284 câncer pancreático pode ser difícil de distinguir de condições benignas, tais como pancreatite ou distúrbios gastrointestinais. O diagnóstico diferencial de um câncer pancreático exócrino primário inclui pancreatite crônica, tumores endócrinos pancreáticos, pancreatite autoimune, linfoma, e uma variedade de outras condições raras. Sintomas comuns mas não específicos associados ao câncer pancreático incluem:

• Dor abdominal - particularmente irradiando às costas • Icterícia obstrutiva • Diabetes inexplicado súbito • Perda de peso • Anorexia, fadiga • Náusea, vômito • Pancreatite aguda ou crônica [00011] A tabela abaixo mostra os números de pacientes que se apresentam a salas de emergência e a hospitais com pelo menos dois destes sintomas relevantes; o primeiro sintoma é qualquer um dos sintomas listados, e o segundo sintoma é aquele listado na tabela. Os dados de sala de emergência eram de: (http://hcupnet.ahrq.gov/) enquanto os dados ambulatórios eram de CDC 2008 National Ambulatory Medical Care Survey 2006 (número 8).

Sintomas Relevantes por Idade
		Dept del Emergência A	'odos os Ambulatórios
	Porcentagem	64-84	45-84	64-84	45-84
Dor abdominal	10,6%	39.922	142.188	106.458	379.168
Icterícia	11,0%	1.405	3.429	3.746	9.145
Perda de peso	11,0%	5.465	9.860	14.574	26.294
Indisposição e Fadiga	4,1%	18.200	32.241	48.533	85.977
Pancreatite aguda	18,6%	9.807	31.080	26.152	82.879

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Pancreatite crônica	43,2%	1.061	7.966	2.829	21.242
Todos		75.86 0	226.765	202.293	604.705

[00012] A detecção sensível da doença resseccionável é essencial para a utilidade clínica desta indicação. A detecção imediata do câncer pancreático aumenta as possibilidades de diagnóstico de doença curável. O diagnóstico do câncer pancreático é tipicamente feito radiograficamente pela descoberta de uma massa dentro do pâncreas, que muitas vezes obstrui o tubo pancreático ou a árvore biliar. Entretanto, o imageamento pode ser invasivo e caro. Um teste sanguíneo que determina quais pacientes requerem acompanhamento, incluindo o imageamento diagnóstico, beneficiaria os pacientes e simplificaria o diagnóstico.

[00013] Seleção de biomarcadores para um estado de doença específico envolve primeiro a identificação de marcadores que têm uma diferença mensurável e estatisticamente significante em uma população de doença em comparação com uma população controle de uma aplicação médica específica. Os biomarcadores podem incluir moléculas secretadas ou dispersadas que paralelizam o desenvolvimento ou progressão da doença e prontamente se difundem na corrente sanguínea do tecido de câncer pancreático ou dos tecidos circundantes e células circulantes em resposta a um tumor. O biomarcador ou conjunto de biomarcadores identificados são geralmente clinicamente validados ou mostrados ser um indicador confiável para o uso desejado original para o qual foi selecionado. Biomarcadores podem incluir pequenas moléculas, peptídeos, proteínas e ácidos nucleicos. Algumas questões-chave que afetam a identificação de biomarcadores incluem sobreajustamento dos dados disponíveis e viés nos dados.

[00014] Uma variedade de métodos foi utilizada em uma tentativa de

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6/284 identificar biomarcadores e diagnosticar a doença. Para marcadores baseados em proteína, estes incluem eletroforese bidimensional, espectrometria de massa e métodos de imunoensaio. Para marcadores de ácidos nucleicos, estes incluem perfis de expressão de mRNA, perfis de microRNA, FISH, análise serial da expressão gênica (SAGE), e arranjos de expressão gênica em larga escala.

[00015] A utilidade da eletroforese bidimensional é limitada pela baixa sensibilidade de detecção; questões com solubilidade proteica, carga e hidrofobicidade; reprodutibilidade em gel; e a possibilidade de um ponto único que representa múltiplas proteínas. Para espectrometria de massa, dependendo do formato usado, as limitações giram em torno do processamento e separação da amostra, sensibilidade a proteínas de baixa abundância, considerações sinal-ruído, e incapacidade de identificar imediatamente a proteína detectada. As limitações em abordagens de imunoensaio para descoberta de biomarcadores são centradas na incapacidade de ensaios múltiplos baseados no anticorpo para medir um grande número de analitos. Poderia ser impresso simplesmente um arranjo de anticorpos de alta qualidade, sem sanduíches, e medir os analitos ligados àqueles anticorpos. (Isto seria o equivalente formal de usar um genoma inteiro de sequências de ácidos nucleicos para medir por hibridização de todas as sequências de DNA ou RNA em um organismo ou uma célula. O experimento de hibridização funciona porque a hibridização pode ser um teste estringente para identidade. Mesmo anticorpos muito bons não são bastante estringentes na seleção dos seus parceiros de ligação para trabalhar no contexto de sangue ou mesmo extratos celulares porque o conjunto proteico naquelas matrizes tem abundâncias extremamente diferentes). Dessa forma, deve ser usada uma abordagem diferente com abordagens baseadas em imunoensaios para descoberta de biomarcadores - seriam necessárias para usar ensaios ELISA

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7/284 multiplexados (isto é, sanduíches) para obter estringência suficiente para medir muitos analitos simultaneamente para decidir quais analitos são de fato biomarcadores. Imunoensaios sanduíche não escalam para alto conteúdo, e dessa forma a descoberta de biomarcadores usando imunoensaios sanduíche estringentes não é possível usando formatos de arranjo padrão. Por fim, os reagentes de anticorpo são sujeitos à variabilidade substancial do lote e instabilidade do reagente. A plataforma imediata para descoberta de biomarcadores proteicos supera este problema.

[00016] Muitos destes métodos dependem ou requerem algum tipo de fracionamento da amostra antes da análise. Dessa forma, a preparação da amostra necessária para executar um estudo suficientemente alimentado desenhado para identificar e descobrir biomarcadores estatisticamente relevantes em uma série de populações de amostra bem definida é extremamente difícil, cara e demorada. Durante o fracionamento, uma ampla faixa de variabilidade pode ser introduzida em várias amostras. Por exemplo, um marcador potencial pode ser instável para o processo, a concentração do marcador pode ser modificada, agregação ou desagregação inapropriada podem ocorrer, e contaminação inadvertida da amostra pode ocorrer e dessa forma encobrir modificações sutis esperadas na primeira doença.

[00017] É reconhecido amplamente que a descoberta de biomarcadores e métodos de detecção usando estas tecnologias têm limitações sérias para identificação de biomarcadores diagnósticos. Estas limitações incluem uma incapacidade de detectar biomarcadores de baixa abundância, uma incapacidade de cobrir constantemente a faixa dinâmica inteira do proteoma, irreprodutibilidade em processamento e fracionamento da amostra e, em geral, irreprodutibilidade e falta de robustez do método. Além disso, estes

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8/284 estudos introduziram vieses nos dados e não trataram apropriadamente a complexidade das populações da amostra, incluindo controles apropriados, quanto a distribuição e randomização necessária para identificar e validar biomarcadores dentro de uma população da doença alvo.

[00018] Embora os esforços apontados para a descoberta de biomarcadores novos e eficazes tenham continuado por várias décadas, os esforços foram basicamente malsucedidos. Biomarcadores de várias doenças tipicamente eram identificados em laboratórios acadêmicos, normalmente por uma descoberta acidental fazendo pesquisa básica em algum processo da doença. Baseado na descoberta e com pequenas quantidades de dados clínicos, os artigos que foram publicados sugeriam a identificação de um novo biomarcador. A maioria destes biomarcadores propostos, entretanto, não foi confirmada como biomarcadores verdadeiros ou úteis, principalmente porque o pequeno número de amostras clínicas testadas fornece somente prova estatística fraca que um biomarcador eficaz foi de fato encontrado. Isto é, a identificação inicial não foi rigorosa com respeito aos elementos básicos da estatística. Em cada um dos anos 1994 a 2003, uma pesquisa da literatura científica mostra que milhares de referências dirigidas a biomarcadores foram publicadas. Durante aquele mesmo período de tempo, entretanto, o FDA aprovou para o uso diagnóstico, no máximo, três novos biomarcadores proteicos por ano, e durante vários anos nenhum novo biomarcador proteico foi aprovado.

[00019] Baseado na história de esforços fracassados da descoberta de biomarcadores, teorias matemáticas foram propostas que ainda promovem a compreensão geral que os biomarcadores da doença são raros e difíceis de encontrar. Pesquisa de biomarcadores baseada em géis 2D ou espectrometria de massa suporta estas noções. Muito poucos biomarcadores úteis foram identificados por estas abordagens.

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Entretanto, é normalmente ignorado que gel 2D e espectrometria de massa medem proteínas que estão presentes no sangue em concentrações de aproximadamente 1 nM e maiores, e que este conjunto de proteínas pode ser muito bem o menos suscetível a se modificar com a doença. Exceto a plataforma de descoberta de biomarcador imediata, plataformas proteômicas de descoberta de biomarcadores que são capazes de medir exatamente os níveis de expressão proteica em concentrações muito mais baixas não existem. [00020] Muito é conhecido sobre vias bioquímicas pela biologia humana complexa. Muitas vias bioquímicas culminam ou são iniciadas por proteínas secretadas que trabalham localmente dentro da patologia, por exemplo, fatores de crescimento são secretados para estimular a replicação de outras células na patologia, e outros fatores são secretados para repelir o sistema imune, e similares. Embora muitas destas proteínas secretadas funcionem de uma maneira parácrina, alguns operam distalmente no corpo. Um versado na técnica com uma compreensão básica das vias bioquímicas entenderia que muitas proteínas específicas para a patologia deveriam existir no sangue em concentrações abaixo (mesmo muito abaixo) dos limites de detecção de géis 2D e espectrometria de massa. O que deve preceder a identificação deste número relativamente abundante de biomarcadores de doença é uma plataforma proteômica que pode analisar proteínas em concentrações abaixo das detectáveis por géis 2D ou espectrometria de massa.

[00021] Consequentemente, existe uma necessidade para biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e kits que permitem (a) a diferenciação do câncer pancreático de condições benignas; (b) o rastreamento de indivíduos assintomáticos de alto risco para câncer pancreático; (c) a detecção de biomarcadores de câncer pancreático; e (d) o diagnóstico de câncer pancreático.

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SUMÁRIO [00022] O presente pedido de patente inclui biomarcadores, métodos, reagentes, dispositivos, sistemas e kits para detecção e diagnóstico de câncer e mais particularmente, câncer pancreático. Os biomarcadores do presente pedido de patente foram identificados usando um ensaio baseado em múltiplos aptâmeros que é descrito detalhadamente no Exemplo 1. Usando o método de identificação de biomarcadores baseado no aptâmero descrito neste pedido, este pedido de patente descreve um surpreendentemente grande número de biomarcadores de câncer pancreático que são úteis para a detecção e diagnóstico do câncer pancreático bem como um grande número de biomarcadores de câncer que são úteis mais geralmente para a detecção e diagnóstico do câncer. Na identificação destes biomarcadores, mais de 800 proteínas de centenas de amostras individuais foram medidas, algumas das quais estavam em concentrações na faixa baixa de femtomolar. Isto é aproximadamente quatro ordens de magnitude menor que os experimentos de descoberta de biomarcadores feitos com géis 2D e/ou espectrometria de massa.

[00023] Embora alguns biomarcadores de câncer pancreático descritos sejam úteis sozinhos para detecção e diagnóstico de câncer pancreático, métodos são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer pancreático que são úteis como um painel de biomarcadores. Uma vez que um biomarcador individual ou subconjunto de biomarcadores foi identificado, a detecção ou diagnóstico do câncer pancreático em um indivíduo pode ser realizado usando qualquer plataforma ou formato de ensaio que é capaz de medir diferenças nos níveis do biomarcador ou biomarcadores selecionados em uma amostra biológica.

[00024] Entretanto, foi somente usando o método de identificação de biomarcadores baseado em aptâmeros descrito neste pedido, em que

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11/284 mais de 800 valores de biomarcadores potenciais separados foram individualmente rastreados de um grande número de indivíduos tendo sido anteriormente diagnosticados como tendo ou não tendo câncer pancreático que foi possível identificar os biomarcadores de câncer pancreático descritos neste pedido. Esta abordagem de descoberta está em contraste com a descoberta de biomarcadores de meios condicionados ou células lisadas como questiona um sistema de pacientes mais relevante que não requer tradução para a patologia humana.

[00025] Dessa forma, em um aspecto do pedido de patente imediata, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinho ou em várias combinações para diagnosticar câncer pancreático ou permitir diagnóstico diferencial do câncer pancreático das condições gastrointestinais (GI) benignas, tais como pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou visualização anormal depois descoberta ser benigna. Modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, que como observado acima, foram identificados usando um ensaio baseado em aptâmero múltiplo, como descrito geralmente no Exemplo 1 e mais especificamente no Exemplo 2. Os marcadores fornecidos na Tabela 1 são úteis em diagnosticar câncer pancreático em uma população assintomática de alto risco, e para distinguir pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou visualização anormal depois descoberta ser benigna do câncer pancreático.

[00026] Enquanto alguns biomarcadores de câncer pancreático descritos são úteis sozinho para detectar e diagnosticar câncer pancreático, métodos também são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer pancreático que são cada um útil como um painel de dois ou mais

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12/284 biomarcadores. Dessa forma, várias modalidades do pedido de patente imediato fornecem combinações que compreendem N biomarcadores, em que N é pelo menos dois biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-65 biomarcadores. [00027] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45,

2- 50, 2-55 ou 2-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45,

3- 50, 3-55 ou 3-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45,

4- 50, 4-55 ou 4-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45,

5- 50, 5-55 ou 5-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50,

6- 55 ou 6-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50,

7- 55 ou 7-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50,

8- 55 ou 8-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55 ou 9-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 1055 ou 10-65. Será apreciado que N pode ser selecionado para englobar faixas de ordem similar, mas mais altas.

[00028] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer pancreático

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13/284 baseado em pelo menos um valor de biomarcador.

[00029] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que a probabilidade do indivíduo tendo câncer pancreático é determinada baseada nos valores de biomarcadores.

[00030] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer pancreático baseado nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[00031] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que a probabilidade do indivíduo que tem câncer pancreático é determinada baseada nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[00032] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela

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1, Col. 2, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer pancreático baseado em pelo menos um valor de biomarcador.

[00033] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um correspondente a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer pancreático baseado nos valores de biomarcadores, e em que N = 2-10.

[00034] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer pancreático, e em que N = 3-10.

[00035] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer pancreático, e em que N = 3-10.

[00036] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores

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15/284 selecionados a partir do grupo de painéis apresentados nas Tabelas 211, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer pancreático.

[00037] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer pancreático no indivíduo, e em que N = 3-10.

[00038] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer pancreático no indivíduo, e em que N = 3-10.

[00039] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis fornecidos nas Tabelas 2-11, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer pancreático no indivíduo.

[00040] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores que correspondem a um de pelo menos N

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16/284 biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer pancreático baseado em um escore de classificação que se desvia de um limiar predeterminado, e em que N=2-10.

[00041] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer pancreático em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores que correspondem a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer pancreático baseado em um escore de classificação que se desvia de um limiar predeterminado, e em que N=2-

10.

[00042] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O método compreende: recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 1, Col. 2; execução com o computador de uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicação de uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático baseado em uma pluralidade de classificações.

[00043] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para classificar um indivíduo como tendo ou não câncer pancreático. O método compreende: recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N

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17/284 biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2; execução com o computador de uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicação se o indivíduo tem câncer pancreático baseado em uma pluralidade de classificações.

[00044] Em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2; e o código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático como uma função dos valores de biomarcadores.

[00045] Em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar um status de câncer pancreático de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer pancreático do indivíduo como uma função dos valores de

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18/284 biomarcadores.

[00046] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O método compreende recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 1, Col. 2; execução com o computador de uma classificação de valor de biomarcadores; e indicação de uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático baseado na classificação.

[00047] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para classificar um indivíduo como tendo ou não câncer pancreático. O método compreende recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2; execução com o computador de uma classificação de valor de biomarcadores; e indicando se o indivíduo tem câncer pancreático baseado na classificação.

[00048] Ainda em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra biológica selecionada a partir do grupo de

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19/284 biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2; e o código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático como uma função do valor de biomarcador.

[00049] Ainda em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar um status de câncer pancreático de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer pancreático do indivíduo como uma função do valor de biomarcador.

[00050] Embora alguns biomarcadores de câncer descritos sejam úteis sozinhos para detecção e diagnóstico de câncer, os métodos que são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer são úteis como um painel de biomarcadores. Uma vez que um biomarcador individual ou subconjunto de biomarcadores foi identificado, a detecção ou diagnóstico do câncer em um indivíduo pode ser realizado usando qualquer plataforma ou formato de ensaio que é capaz de medir diferenças nos níveis do biomarcador ou biomarcadores selecionados em uma amostra biológica.

[00051] Entretanto, foi somente usando o método de identificação de biomarcador baseado em aptâmeros descrito neste pedido, em que mais de 800 valores de biomarcadores potenciais separados foram individualmente rastreados de um grande número de indivíduos tendo

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20/284 sido anteriormente diagnosticados como tendo ou não câncer que foi possível identificar os biomarcadores de câncer descritos neste pedido. Esta abordagem de descoberta está em contraste com a descoberta de biomarcadores de meios condicionados ou células lisadas como questiona um sistema de pacientes mais relevante que não requer tradução para a patologia humana.

[00052] Dessa forma, em um aspecto do pedido de patente imediato, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinhos ou em várias combinações para diagnosticar câncer. Modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos na Tabela 19, que foram identificados usando um ensaio baseado em múltiplos aptâmeros, como descrito geralmente no Exemplo 1 e mais especificamente no Exemplo

7. Os marcadores fornecidos na Tabela 19 são úteis na distinção de indivíduos que têm o câncer daqueles que não têm câncer.

[00053] Embora alguns biomarcadores de câncer descritos sejam úteis sozinhos para detecção e diagnóstico de câncer, os métodos que também são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer são cada um útil como um painel de três ou mais biomarcadores. Dessa forma, várias modalidades do pedido de patente imediato fornecem combinações compreendendo N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-65 biomarcadores.

[00054] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45,

3-50, 3-55, 3-60 ou 3-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 445, 4-50, 4-55, 4-60 ou 4-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 540, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60 ou 5-65. Em outras modalidades, N é

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21/284 selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30,

6- 35, 6-40, 6-45, 6-50, 6-55, 6-60 ou 6-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30,

7- 35 7-40, 7-45, 7-50, 7-55, 7-60 ou 7-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30,

8- 35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55, 8-60 ou 8-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35,

9- 40, 9-45, 9-50, 9-55, 9-60 ou 9-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30,

10- 35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, 10-60 ou 10-65. Será apreciado que N pode ser selecionado para englobar a faixas de ordem similar, mas mais altas.

[00055] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer baseado em pelo menos um valor de biomarcador.

[00056] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que a probabilidade do indivíduo tendo câncer é determinada baseada nos valores de biomarcadores.

[00057] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores

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22/284 selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer baseado nos valores de biomarcadores, e em que N = 3-10.

[00058] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que a probabilidade do indivíduo tendo câncer é determinada baseada nos valores de biomarcadores, e em que N = 3-

10.

[00059] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos um valor de biomarcador correspondente a pelo menos um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer baseado em pelo menos um valor de biomarcador.

[00060] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar que um indivíduo não tem câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um correspondente a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer baseado nos valores de biomarcadores, e em que N = 3-10.

[00061] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de

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23/284 biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer, e em que N = 3-10.

[00062] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer, e em que N = 3-10.

[00063] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis apresentados nas Tabelas 2029 em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer.

[00064] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N, em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer no indivíduo, e em que N = 3-10.

[00065] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores N,

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24/284 em que os biomarcadores são selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer no indivíduo, e em que N = 3-10.

[00066] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores selecionados a partir do grupo de painéis fornecidos nas Tabelas 20-29, em que uma classificação dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer no indivíduo.

[00067] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores que correspondem a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer baseado em um escore de classificação que se desvia de um limiar predeterminado, e em que N=3-

10.

[00068] Em outro aspecto, um método é fornecido para diagnosticar uma ausência de câncer em um indivíduo, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de valores de biomarcadores que correspondem a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer baseado em um escore de classificação que se desvia de um limiar predeterminado, e em que N=3-10.

[00069] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer. O método compreende: recuperação de uma informação computacional

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25/284 sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 19; execução com o computador de uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicação de uma probabilidade que o indivíduo tem câncer baseada em uma pluralidade de classificações.

[00070] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para classificar um indivíduo como tendo ou não câncer. O método compreende: recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 19; execução com o computador de uma classificação de cada um dos valores de biomarcadores; e indicação se o indivíduo tem câncer baseada em uma pluralidade de classificações. [00071] Em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores, em que N é como definido acima, na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; e o código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer como uma

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26/284 função dos valores de biomarcadores.

[00072] Em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar um status de câncer de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 19; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer do indivíduo como uma função dos valores de biomarcadores.

[00073] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer. O método compreende recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores apresentado na Tabela 19; execução com o computador de uma classificação de valor de biomarcadores; e indicação de uma probabilidade que o indivíduo tem câncer baseada na classificação.

[00074] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para classificar um indivíduo como tendo ou não câncer. O método compreende recuperação de uma informação computacional sobre biomarcadores para um indivíduo, em que a informação sobre biomarcadores compreende um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 19; execução com o computador de uma classificação de valor de biomarcadores; e indicação se o

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27/284 indivíduo tem câncer baseada na classificação.

[00075] Ainda em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores apresentados na Tabela 19; e o código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade que o indivíduo tenha câncer como uma função do valor de biomarcador.

[00076] Ainda em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar um status de câncer de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 19; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer do indivíduo como uma função do valor de biomarcador.

[00077] Ainda em outro aspecto, um método é fornecido para diagnóstico de câncer pancreático, o método incluindo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, do marcador tumoral CA 19-9 além de valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador em um painel de biomarcadores selecionados a partir do

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28/284 grupo de painéis apresentados na Tabela 1 em que uma classificação de valores combinados de CA 19-9 e de biomarcadores indica que o indivíduo tem câncer pancreático.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00078] A Figura 1A é um fluxograma de um método exemplar para detecção de câncer pancreático em uma amostra biológica.

[00079] A Figura 1B é um fluxograma de um método exemplar para detecção de câncer pancreático em uma amostra biológica usando um método de classificação naive Bayes.

[00080] A Figura 2 mostra uma curva ROC de um biomarcador único, CTSB, usando um classificador naive Bayes para um teste que detecta câncer pancreático.

[00081] A Figura 3 mostra curvas ROC de painéis de biomarcadores de dois a dez biomarcadores usando classificadores naive Bayes para um teste que detecta câncer pancreático.

[00082] A Figura 4 ilustra o aumento no escore de classificação (AUC) já que o número de biomarcadores é aumentado de um a dez usando a classificação naive Bayes de um painel de câncer pancreático. [00083] A Figura 5 mostra as distribuições de biomarcadores medidas para CTSB como uma função de distribuição cumulativa (cdf) em RFU transformado por log para o Gl e controles normais combinados (linha sólida) e o grupo de doença de câncer pancreático (linha pontilhada) junto com sua curva ajusta-se a uma cdf normal (linhas tracejadas) usada para treinar os classificadores naive Bayes.

[00084] A Figura 6 ilustra um sistema computacional exemplar para uso com vários métodos implementados por computador descritos neste pedido.

[00085] A Figura 7 é um fluxograma de um método de indicação da probabilidade que um indivíduo tenha câncer pancreático conforme uma modalidade.

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29/284 [00086] A Figura 8 é um fluxograma de um método de indicação da probabilidade que um indivíduo tenha câncer pancreático conforme uma modalidade.

[00087] A Figura 9 ilustra um ensaio exemplar de aptâmero que pode ser usado para detectar um ou mais biomarcadores de câncer pancreático em uma amostra biológica.

[00088] A Figura 10 mostra um histograma de frequências para as quais os biomarcadores foram usados na criação de classificadores para distinguir entre câncer pancreático e o Gl e controles normais de um conjunto agregado de biomarcadores potenciais.

[00089] A Figura 11A mostra um par de histogramas que resumem todos os escores de classificador naive Bayes de proteína única possível (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (sólidos) e grupo de marcadores randômicos (pontilhados).

[00090] A Figura 11B mostra um par de histogramas que resumem todos os escores de classificador naive Bayes de proteína de duas proteínas possíveis (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (sólidos) e grupo de marcadores randômicos (pontilhados).

[00091] A Figura 11C mostra um par de histogramas que resumem todos os escores de classificador de naive Bayes possíveis de três proteínas (AUC) usando os biomarcadores apresentados na Tabela 1 (sólidos) e grupo de marcadores randômicos (pontilhados).

[00092] A Figura 12 mostra AUC para classificadores naive Bayes usando 2-10 marcadores selecionados do painel completo (losango) e os escores obtidos deixando os melhores 5, 10, e 15 marcadores durante a geração de classificador.

[00093] A Figura 13 mostra o desempenho de três classificadores diferentes: CA19-9 sozinho, o painel de SOMAmer e a combinação de SOMAmers e CA19-9.

[00094] A Figura 14 mostra o desempenho de CA19-9 mais um

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30/284 (HAMP) ou dois biomarcadores (HAMP e CTSB) de SOMAmer.

[00095] A Figura 15 mostra o desempenho do classificador floresta aleatória do marcador 10.

[00096] A Figura 16A mostra o grupo de curvas ROC modeladas dos dados na Tabela 14 de painéis de um a cinco marcadores.

[00097] A Figura 16B mostra o grupo de curvas ROC computadas dos dados de treinamento de painéis de um a cinco marcadores como na Figura 12A.

[00098] As Figuras 17A e 17B mostram uma comparação do desempenho entre dez biomarcadores selecionados por um procedimento de seleção ganancioso (Tabela 19) e 1.000 conjuntos randomicamente escolhidos de dez biomarcadores “não marcadores”. A AUC média dos dez biomarcadores na Tabela 19 é mostrada como uma linha vertical pontilhada. Na Figura 17A, os conjuntos de dez biomarcadores foram randomicamente selecionados dos 10 analitos presentes nos 3 estudos de câncer que não foram selecionados pelo procedimento ganancioso. Na Figura 17B, o mesmo procedimento que 17A foi usado; entretanto, a amostragem foi restringida ao restante dos 55 biomarcadores da Tabela 1 que não foram selecionados pelo procedimento ganancioso.

[00099] A Figura 18 mostra curvas características operacionais do receptor (ROC) dos 3 classificadores naive Bayes apresentados na Tabela 19. Para cada estudo, a área sob a curva (AUC) também é exibida próxima à legenda.

DESCRIÇÃO DETALHADA [000100] Referência será feita agora detalhadamente a modalidades representativas da invenção. Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalidades enumeradas, será entendido que a invenção não é destinada a ser limitada àquelas modalidades. Ao contrário, a invenção é destinada a cobrir todas as alternativas,

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31/284 modificações, e equivalentes que possam estar incluídos dentro do escopo da presente invenção como definido pelas reivindicações.

[000101] Um versado na técnica reconhecerá muitos métodos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste pedido, que podem ser usados e está dentro do escopo da prática da presente invenção. A presente invenção não é de modo nenhum limitada aos métodos e materiais descritos.

[000102] A menos que definido de outra maneira, os termos técnicos e científicos usados neste pedido têm o mesmo significado que comumente entendido por um versado ordinário na técnica à qual esta invenção pertence. Embora qualquer método, dispositivos e materiais similares ou equivalentes aos descritos neste pedido possam ser usados na prática ou teste da invenção, os métodos, dispositivos e materiais preferenciais são descritos agora.

[000103] Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patentes citados neste pedido de patente são indicativos do nível de habilidade na técnica(s) à qual o pedido de patente pertence. Todas as publicações, documentos de patentes publicados e pedidos de patentes citados neste pedido são por meio deste incorporados na mesma extensão como se cada publicação individual, documento de patente publicado, ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicado como incorporado por referência.

[000104] Como usado neste pedido de patente, incluindo as reivindicações acrescentadas, as formas singulares “a”, “o”, “um” e “uma” incluem referências plurais, a menos que o conteúdo claramente dite de outra maneira, e sejam usadas intercambiavelmente “com pelo menos um” e “um ou mais.” Dessa forma, referência a “um aptâmero” inclui misturas de aptâmeros, referência a “uma sonda” inclui misturas de sondas, e similares.

[000105] Como usado neste pedido, o termo “aproximadamente”

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32/284 representa uma modificação insignificante ou variação do valor numérico tal que a função básica do item ao qual o valor numérico se relaciona seja inalterada.

[000106] Como usado neste pedido, os termos “compreende”, “compreendendo”, “incluem”, “incluindo”, “contém”, “contendo”, e qualquer variação dos mesmos, são destinados a cobrir uma inclusão não exclusiva, tal que um processo, método, produto derivado do processo, ou composição da matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou lista de elementos não inclui somente aqueles elementos mas pode incluir outros elementos não expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, produto derivado do processo ou composição da matéria.

[000107] O presente pedido de patente inclui biomarcadores, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e kits para detecção e diagnóstico de câncer pancreático e, mais geralmente, câncer.

[000108] Em um aspecto, um ou mais biomarcadores são fornecidos para uso sozinhos ou em várias combinações para diagnosticar câncer pancreático, permitir diagnóstico diferencial de câncer pancreático das condições GI não malignas incluindo pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno, monitorar a recidiva de câncer pancreático, ou tratar outras indicações clínicas. Como descrito detalhadamente abaixo, modalidades exemplares incluem os biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, que foram identificados usando um ensaio baseado em múltiplos aptâmeros que é descrito geralmente no Exemplo 1 e mais especificamente no Exemplo

2.

[000109] A Tabela 1, Col. 2 apresenta os achados obtidos de analisar centenas de amostras individuais de sangue de casos de câncer pancreático, e centenas de amostras de sangue individuais

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33/284 equivalentes do GI e controles normais. O GI e o grupo controle normal foram projetados para compatibilizar as populações com as quais um teste diagnóstico de câncer pancreático pode ter o maior benefício, incluindo indivíduos assintomáticos e indivíduos sintomáticos. O grupo controle normal representa indivíduos assintomáticos com um alto risco de câncer pancreático. O alto risco de câncer pancreático inclui história familiar de câncer pancreático, obesidade, fumo, diabetes, fibrose cística, pancreatite crônica ou hereditária, portador da mutação de BRCA, mutação de pl6 e síndrome de Peutz-Jeghers (Brand E et al. Gut 2007:56:1460). O grupo controle GI inclui sintomas abdominais não específicos, tais como pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno. As amostras dos controles normais foram combinadas com os controles GI para descobrir biomarcadores úteis tanto para rastreamento de indivíduos assintomáticos de alto risco como para diagnóstico diferencial em indivíduos sintomáticos. Biomarcadores potenciais foram medidos em amostras individuais antes de agrupar a doença e o sangue controle; isto permitiu uma melhor compreensão do indivíduo e variações de grupo nos fenótipos associados com a presença e a ausência da doença (neste caso, câncer pancreático). Uma vez que 823 medidas proteicas foram feitas em cada amostra, e várias centenas de amostras de cada uma da doença e as populações controle foram individualmente medidas, a Tabela 1, Col. 2 resultou de uma análise de um conjunto raramente grande de dados. As medidas foram analisadas usando os métodos descritos na seção, “Classificação de Biomarcadores e Cálculo dos Escores de Doença” neste pedido. A Tabela 1, Col. 2 lista os 65 biomarcadores encontrados ser úteis na distinção de amostras obtidas de indivíduos com câncer pancreático de amostras “controle” obtidas do GI e controles normais. Os controles GI incluem indivíduos com

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34/284 pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno.

[000110] Embora alguns biomarcadores de câncer pancreático descritos sejam úteis sozinhos para detecção e diagnóstico de câncer pancreático, métodos também são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer pancreático, onde cada seleção de subconjunto ou agrupamento é útil como um painel de três ou mais biomarcadores, intercambiavelmente referidos neste pedido como “um painel de biomarcador” e um painel. Dessa forma, várias modalidades do pedido de patente imediato fornecem combinações que compreendem N biomarcadores, em que N é pelo menos dois biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado a partir de 2-65 biomarcadores.

[000111] Ainda em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45,

2- 50, 2-55 ou 2-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45,

3- 50, 3-55 ou 3-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45,

4- 50, 4-55 ou 4-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45,

5- 50, 5-55 ou 5-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50,

6- 55 ou 6-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50,

7- 55 ou 7-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50,

8- 55 ou 8-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55

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35/284 ou 9-65. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 1055 ou 10-65. Será apreciado que N pode ser selecionado para englobar faixas de ordem similar, mas mais altas.

[000112] Em uma modalidade, o número de biomarcadores úteis para um subconjunto ou painel de biomarcadores é baseado na sensibilidade e valor de especificidade da combinação particular de valores de biomarcadores. Os termos “sensibilidade” e “especificidade” são usados neste pedido com respeito à capacidade de classificar corretamente um indivíduo, baseado em um ou mais valores de biomarcadores detectados na sua amostra biológica, como tendo câncer pancreático ou não tendo câncer pancreático. “Sensibilidade” indica o desempenho do biomarcador(es) com respeito a classificar corretamente indivíduos que têm câncer pancreático. “Especificidade” indica o desempenho de biomarcador(es) com respeito a classificar corretamente indivíduos que não têm câncer pancreático. Por exemplo, especificidade de 85% e sensibilidade de 90% de um painel de marcadores usado para testar o grupo de amostras controle e amostras de câncer pancreático indica que 85% das amostras controle foram corretamente classificadas como amostras controle pelo painel, e 90% das amostras de câncer pancreático foram corretamente classificadas como amostras de câncer pancreático pelo painel. O valor mínimo desejado ou preferencial pode ser determinado como descrito no Exemplo 3. Os painéis representativos são apresentados nas Tabelas 4-11, que apresentam uma série de 100 painéis diferentes de 3-10 biomarcadores, que têm os níveis indicados de especificidade e sensibilidade de cada painel. O número total de ocorrências de cada marcador em cada um destes painéis é indicado no fundo de cada Tabela.

[000113] Em um aspecto, o câncer pancreático é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra

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36/284 biológica do indivíduo e detectando valores de biomarcadores em que cada um corresponde a pelo menos um dos biomarcadores CTSB, C5a ou C5 e pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, Col. 2, em que N se iguala a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Em um aspecto adicional, o câncer pancreático é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de biomarcadores em que cada um corresponde aos biomarcadores CTSB, C5a ou C5 e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, Col. 2, em que N se iguala a 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7. Em um aspecto adicional, o câncer pancreático é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de biomarcadores em que cada um corresponde ao biomarcador CTSB e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, Col. 2, em que N se iguala a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9. Em um aspecto adicional, o câncer pancreático é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de biomarcadores em que cada um corresponde ao biomarcador C5a e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, Col. 2, em que N se iguala a 2, 3, 4, 5,

6, 7, 8 ou 9. Em um aspecto adicional, o câncer pancreático é detectado ou diagnosticado em um indivíduo conduzindo um ensaio em uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de biomarcadores em que cada um corresponde ao biomarcador C5 e um de pelo menos N biomarcadores adicionais selecionados a partir da lista de biomarcadores na Tabela 1, Col. 2, em que N se iguala a 2, 3, 4, 5, 6,

7, 8 ou 9.

[000114] Os biomarcadores de câncer pancreático identificados neste

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37/284 pedido representam um relativamente grande número de escolhas de subconjuntos ou painéis de biomarcadores que podem ser usados para detectar ou diagnosticar efetivamente o câncer pancreático. A seleção do número desejado de tais biomarcadores depende da combinação específica dos biomarcadores escolhidos. É importante lembrar-se de que os painéis de biomarcadores para detectar ou diagnosticar o câncer pancreático também podem incluir biomarcadores não encontrados na Tabela 1, Col. 2, e que a inclusão de biomarcadores adicionais não encontrados na Tabela 1, Col. 2 pode reduzir o número de biomarcadores no subconjunto ou painel particular que é selecionado da Tabela 1, Col. 2. O número de biomarcadores da Tabela 1, Col. 2 usado em um subconjunto ou painel também pode ser reduzido se informação biomédica adicional for usada em conjunto com os valores de biomarcadores para estabelecer sensibilidade aceitável e valores de especificidade de um ensaio dado.

[000115] Outro fator que pode afetar o número de biomarcadores a serem usados em um subconjunto ou painel de biomarcadores são os procedimentos usados para obter amostras biológicas de indivíduos que estão sendo diagnosticados para câncer pancreático. Em um ambiente de aquisição de amostra cuidadosamente controlado, o número de biomarcadores necessários para satisfazer a sensibilidade desejada e valores de especificidade será mais baixo do que em uma situação onde pode haver mais variação em coleta de amostra, manejo e armazenamento. No desenvolvimento da lista de biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, múltiplos sítios de coleta de amostra foram utilizados para coletar dados para o treinamento de classificadores. Isto fornece biomarcadores mais robustos que são menos sensíveis a variações em coleta de amostra, manejo e armazenamento, mas também podem requerer que o número de biomarcadores em um subconjunto ou painel seja maior que se os

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38/284 dados de treinamento fossem todos obtidos sob condições muito similares.

[000116] Um aspecto do pedido de patente imediato pode ser descrito geralmente com referência às Figuras 1A e 1B. Uma amostra biológica é obtida de um indivíduo ou indivíduos de interesse. A amostra biológica então é analisada para detectar a presença de um ou mais (N) biomarcadores de interesse e determinar um valor de biomarcador de cada um dos ditos N biomarcadores (referidos na Figura 1B como marcador RFU). Uma vez que um biomarcador foi detectado e um valor de biomarcador destinado a cada marcador é marcado ou classificado como descrito detalhadamente neste pedido. Os escores de marcador então são combinados para fornecer um escore diagnóstico total, que indica a probabilidade que o indivíduo de que a amostra foi obtida tenha câncer pancreático.

[000117] “Amostra biológica”, “amostra”, e “amostra teste” são usadas intercambiavelmente neste pedido para referir-se a qualquer fluido material, biológico, tecido, ou célula obtida ou de outra maneira derivado de um indivíduo. Isto inclui sangue (incluindo sangue inteiro, leucócitos, células mononucleares de sangue periférico, camada de células brancas, plasma e soro), saliva, lágrimas, muco, lavado nasal, aspirado nasal, respiração, urina, esperma, saliva, lavados peritoneais, ascite, fluido cístico, fluido de meninge, fluido amniótico, fluido pancreático, fluido glandular, fluido linfático, fluido pleural, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, raspado brônquico, fluido sinovial, aspirado articular, secreções de órgãos, células, um extrato celular, e fluido cerebrospinal. Isto também inclui frações experimentalmente separadas de todos os precedentes. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fracionada em soro, plasma ou em frações contendo tipos particulares de células sanguíneas, tais como células sanguíneas vermelhas ou células sanguíneas brancas (leucócitos). Se desejado,

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39/284 uma amostra pode ser uma combinação de amostras de um indivíduo, tais como uma combinação de uma amostra de tecido e fluido. O termo “amostra biológica” também inclui materiais contendo material sólido homogeneizado, tal como de uma amostra de fezes, uma amostra de tecido, ou uma biópsia de tecido, por exemplo. O termo “amostra biológica” também inclui materiais derivados de uma cultura tecidual ou uma cultura celular. Qualquer método adequado para obter uma amostra biológica pode ser empregado; métodos exemplares incluem, por exemplo, flebotomia, esfregaço (por exemplo, esfregaço bucal), e um procedimento de biópsia de aspirado por agulha fina. Tecidos exemplares suscetíveis de aspiração por agulha fina incluem linfonodo, pulmão, lavado de pulmão, BAL (lavagem broncoalveolar), tireoide, mama, pâncreas e fígado. As amostras também podem ser coletadas, por exemplo, pela microdissecação (por exemplo, microdissecação por captura a laser (LCM) ou microdissecação a laser (LMD)), lavado de bexiga, exame (por exemplo, um exame PAP), ou lavagem ductal. Uma “amostra biológica” obtida ou derivada de um indivíduo inclui qualquer tal amostra que foi processada por qualquer maneira adequada após ser obtida do indivíduo.

[000118] Além disso, deve ser compreendido que uma amostra biológica pode ser derivada tomando amostras biológicas de diversos indivíduos e agrupando-as ou agrupando uma alíquota da amostra biológica de cada indivíduo. A amostra agrupada pode ser tratada como uma amostra de um indivíduo único e se a presença do câncer for estabelecida na amostra agrupada, então cada amostra biológica individual pode ser re-testada para determinar que indivíduos têm câncer pancreático.

[000119] Para os fins deste relatório descritivo, a frase “dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo” é destinada a significar que os dados em alguma forma derivada, ou foram gerados

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40/284 usando, a amostra biológica do indivíduo. Os dados podem ter sido reformatados, revisados, ou matematicamente alterados até certo ponto após ter sido gerados, tal como pela conversão de unidades em um sistema de medida a unidades em outro sistema de medida; mas, os dados são entendidos ter sido derivados, ou foram gerados usando, a amostra biológica.

[000120] “Alvo”, “molécula alvo” e “analito” são usados intercambiavelmente neste pedido para referir-se a qualquer molécula de interesse que pode estar presente em uma amostra biológica. Uma “molécula de interesse” inclui qualquer variação menor de uma molécula particular, tal como, em caso de uma proteína, por exemplo, variações menores na sequência de aminoácido, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tais como conjugação com um componente de marcação, que não altera substancialmente a identidade da molécula. Uma “molécula alvo”, “alvo” ou “analito” são grupo de cópias de um tipo ou espécies de molécula ou estrutura multimolecular. “Moléculas alvo”, “alvo” e “analitos” referem-se a mais de um tal conjunto de moléculas. Moléculas alvo exemplares incluem proteínas, polipeptídeos, ácidos nucleicos, carboidratos, lipídios, polissacarídeos, glicoproteínas, hormônios, receptores, antígenos, anticorpos, affybodies, o miméticos de anticorpo, vírus, patógenos, substâncias tóxicas, substratos, metabólitos, análogos de estado de transição, cofatores, inibidores, fármacos, corantes, nutrientes, fatores de crescimento, células, tecidos, e qualquer fragmento ou porção de qualquer um dos precedentes.

[000121] Como usado neste pedido, “polipeptídeo”, “peptídeo” e “proteína” são usados intercambiavelmente neste pedido para referir-se a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, pode compreender aminoácidos modificados,

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41/284 e pode ser interrompido por não aminoácidos. Os termos também englobam um polímero de aminoácido que foi modificado naturalmente ou por intervenção; por exemplo, formação de ligação dissulfeto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação, ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipeptídeos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc.) bem como outras modificações conhecidas na técnica. Os polipeptídeos podem ser cadeias únicas ou cadeias associadas. Também estão incluídos dentro da definição pré-proteínas e proteínas maduras intactas; peptídeos ou polipeptídeos derivados de uma proteína madura; fragmentos de uma proteína; variantes de junção; formas recombinantes de uma proteína; variantes proteicas com modificações, deleções ou substituições de aminoácidos; digestões; e modificações pós-translação, tais como glicosilação, acetilação, fosforilação e similares.

[000122] Como usado neste pedido, “marcador” e “biomarcador” são usados intercambiavelmente para referir-se a uma molécula alvo que indica ou é um sinal de um processo normal ou anormal em um indivíduo ou de uma doença ou outra condição em um indivíduo. Mais especificamente, um “marcador” ou “biomarcador” são um parâmetro anatômico, fisiológico, bioquímico, ou molecular associado à presença de um estado ou processo fisiológico específico, ou normal ou anormal, e, se anormal, se crônico ou agudo. Os biomarcadores são detectáveis e mensuráveis por uma variedade de métodos incluindo ensaios de laboratório e imageamento médico. Quando um biomarcador é uma proteína, é também possível usar a expressão do gene correspondente como uma medida substituta da quantidade ou presença ou ausência do biomarcador proteico correspondente em uma amostra biológica ou

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42/284 o estado de metilação do gene que codifica o biomarcador ou proteínas que controla a expressão do biomarcador.

[000123] Como usado neste pedido, “valor de biomarcador”, “valor”, “nível de biomarcador” e “nível” são usados intercambiavelmente para referir-se a uma medida que é feita usando qualquer método analítico para detectar o biomarcador em uma amostra biológica e que indica a presença, ausência, quantidade absoluta ou concentração, quantidade relativa ou concentração, título, um nível, um nível de expressão, uma proporção de níveis medidos, ou similares, de, para, ou correspondente ao biomarcador na amostra biológica. A natureza exata do “valor” ou “nível” depende do desenho específico e componentes do método analítico particular empregado para detectar o biomarcador.

[000124] Quando um biomarcador indica ou é um sinal de um processo anormal ou uma doença ou outra condição em um indivíduo, aquele biomarcador é geralmente descrito como ou superexpresso ou subexpresso quando comparado a um nível de expressão ou valor do biomarcador que indica ou é um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição em um indivíduo. “Regulação para cima”, “regulada para cima”, “superexpressão”, “superexpresso”, e quaisquer variações dessas são usadas intercambiavelmente para referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que é maior do que um valor ou nível (ou a faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é tipicamente detectado em amostras biológicas similares de indivíduos saudáveis ou normais. Os termos também podem referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que é maior do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que pode ser detectado em um estágio diferente de uma doença particular.

[000125] “Regulação para baixo”, “regulada para baixo”, “subexpressão”, “subexpresso”, e quaisquer variações dessas são

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43/284 usadas intercambiavelmente para referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que é menor do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que é tipicamente detectado em amostras biológicas similares de indivíduos saudáveis ou normais. Os termos também podem referir-se a um valor ou nível de um biomarcador em uma amostra biológica que é menor do que um valor ou nível (ou faixa de valores ou níveis) do biomarcador que pode ser detectado em um estágio diferente de uma doença particular.

[000126] Além disso, um biomarcador que é superexpresso ou subexpresso também pode ser referido como sendo “ diferencialmente expresso” ou tendo um “nível diferencial” ou “valor diferencial” quando comparado a um nível de expressão ou valor “normal” do biomarcador que indica ou é um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição em um indivíduo. Dessa forma, “expressão diferencial” de um biomarcador também pode ser referida como uma variação de um nível de expressão “normal” do biomarcador. [000127] O termo “expressão gênica diferencial” e “expressão diferencial” é usado intercambiavelmente para referir-se a um gene (ou seu produto de expressão proteica correspondente) cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em um indivíduo sofrendo de uma doença específica, quanto à sua expressão em um indivíduo normal ou indivíduo controle. Os termos também incluem genes (ou produtos de expressão proteica correspondentes) cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em estágios diferentes da mesma doença. Também é entendido que um gene diferencialmente expresso pode ser ativado ou inibido ao nível de ácido nucleico ou nível de proteína, ou pode ser sujeito ao splicing alternativo para resultar em um produto polipeptídico diferente. Tais diferenças podem ser evidenciadas por uma variedade de modificações incluindo níveis de

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44/284 mRNA, expressão superficial, secreção ou outra divisão em compartimentos de um polipeptídeo. A expressão gênica diferencial pode incluir uma comparação da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos gênicos; ou uma comparação das proporções da expressão entre dois ou mais genes ou seus produtos gênicos; ou até uma comparação de dois produtos diferentemente processados do mesmo gene, que se diferenciam entre indivíduos normais e indivíduos que sofrem de uma doença; ou entre vários estágios da mesma doença. A expressão diferencial inclui ambas diferenças quantitativas, bem como qualitativas, no modelo de expressão temporal ou celular em um gene ou seus produtos de expressão entre, por exemplo, células normais e doentes, ou entre células que sofreram eventos de doença diferentes ou estágios de doença.

[000128] Como usado neste pedido, “indivíduo” refere-se a um indivíduo teste ou paciente. O indivíduo pode ser um mamífero ou um não mamífero. Em várias modalidades, o indivíduo é um mamífero. Um indivíduo mamífero pode ser humano ou não humano. Em várias modalidades, o indivíduo é o ser humano. Um indivíduo saudável ou normal é indivíduo no qual a doença ou condição de interesse (incluindo, por exemplo, doenças pancreáticas, doenças associadas às pancreáticas, ou outras condições pancreáticas) não são detectáveis por métodos diagnósticos convencionais.

[000129] “Diagnose”, “diagnosticar”, “diagnóstico” e variações dos mesmos referem-se à detecção, determinação ou reconhecimento de um status de saúde ou condição de um indivíduo com base em um ou mais sinais, sintomas, dados ou outra informação que pertença àquele indivíduo. O status de saúde de um indivíduo pode ser diagnosticado como saudável / normal (isto é, um diagnóstico da ausência de uma doença ou condição) ou diagnosticado como mal / anormal (isto é, um diagnóstico da presença, ou avaliação das características, de uma

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45/284 doença ou condição). Os termos “diagnose”, “diagnosticar”, “diagnóstico”, etc., englobam, com respeito a uma doença ou condição particular, a detecção inicial da doença; a caracterização ou classificação da doença; a detecção da progressão, remissão, ou recidiva da doença; e a detecção de resposta da doença após administração de um tratamento ou terapia ao indivíduo. O diagnóstico do câncer pancreático inclui distinção de indivíduos que têm o câncer dos indivíduos que não têm. Ainda inclui a distinção de GI e controles normais do câncer pancreático.

[000130] “Prognose”, “prognosticar”, “prognóstico”, e variações dos mesmos referem-se à predição de um curso futuro de uma doença ou condição em um indivíduo que tem a doença ou condição (por exemplo, predição da sobrevida do paciente), e tais termos englobam a avaliação da resposta da doença após administração de um tratamento ou terapia ao indivíduo.

[000131] “Avaliar”, “avaliando”, “avaliação” e variações dos mesmos englobam tanto “diagnose” como “prognose” e também englobam determinações ou predições sobre o curso futuro de uma doença ou condição em um indivíduo que não tem a doença bem como determinações ou predições quanto à probabilidade que uma doença ou condição ocorra em um indivíduo que aparentemente foi curado da doença. O termo “avaliar” também engloba a avaliação da resposta de um indivíduo a uma terapia, tal como, por exemplo, a previsão se um indivíduo provavelmente responderá favoravelmente a um agente terapêutico ou provavelmente não responderá a um agente terapêutico (ou experimentará efeitos tóxicos ou outros colaterais indesejáveis, por exemplo), seleção de um agente terapêutico para administração a um indivíduo, ou monitoramento ou determinação da resposta de um indivíduo a uma terapia que foi administrada ao indivíduo. Dessa forma, “avaliação” do câncer pancreático pode incluir, por exemplo, qualquer

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46/284 um dos seguintes: prognose do curso futuro de câncer pancreático em um indivíduo; predição da recidiva do câncer pancreático em um indivíduo que aparentemente foi curado de câncer pancreático; ou determinação ou predição da resposta de um indivíduo a um tratamento de câncer pancreático ou seleção de um tratamento de câncer pancreático para administrar a um indivíduo baseado em uma determinação dos valores de biomarcadores derivados da amostra biológica do indivíduo.

[000132] Qualquer um dos seguintes exemplos podem ser referidos como “diagnóstico” ou como “avaliação” de câncer pancreático: detectar inicialmente a presença ou ausência de câncer pancreático; determinar um estágio específico, tipo ou subtipo, ou outra classificação ou característica de câncer pancreático; determinar se uma massa suspeita é uma lesão benigna ou um tumor pancreático maligno; ou detectar/monitorar a progressão de câncer pancreático (por exemplo, monitorando crescimento tumoral ou extensão metastásica), remissão, ou recidiva.

[000133] Como usado neste pedido, “informação biomédica adicional” se refere a uma ou mais avaliações de um indivíduo, além de usar qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido, que estão associados ao risco de câncer ou, mais especificamente, risco de câncer pancreático. “Informação biomédica adicional” inclui qualquer um dos seguintes: descritores físicos de um indivíduo, incluindo uma massa pancreática observada por alguma varredura por tomografia computada helicoidal (CT) multifatia aumentada por contraste (multidetector) reconstrução tridimensional, ultrassom transcutâneo ou endoscópico (US ou EUS), colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (ERCP), visualização de ressonância magnética (MRI), colangiopancreatografia de MR (MRCP), ou ultrassom abdominal; altura e/ou peso de um indivíduo; modificação em peso; etnia de um indivíduo;

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47/284 história ocupacional; história familiar de câncer pancreático (ou outro câncer); a presença de um marcador(es) genético que está correlacionado a um risco mais alto de câncer pancreático (ou outro câncer) no indivíduo ou um membro da família; a presença ou ausência de uma massa pancreática ou outra massa abdominal; tamanho da massa; posição da massa; morfologia da massa e região abdominal associada (por exemplo como observado por imageamento); sintomas clínicos, tais como dor abdominal, perda de peso, anorexia, saciedade precoce, diarreia, ou esteatorreia, icterícia, início precoce de diabetes mellitus atípico, uma história de tromboflebite recente mas inexplicada, ou ataque prévio de pancreatite, e similares; valores de expressão gênica; descritores físicos de um indivíduo, incluindo descritores físicos observados por imageamento radiológico; a altura e/ou peso de um indivíduo; o sexo de um indivíduo; a etnia de um indivíduo; história de fumo; história de uso de álcool; história ocupacional; exposição a carcinógenos conhecidos (por exemplo, a exposição a qualquer um de asbesto, gás radônio, produtos químicos, fumaça de incêndio, e poluição do ar, que pode incluir emissões de fontes estacionárias ou móveis tais como emissões industriais/ de fábricas ou de automóvel/navio/avião); exposição indireta à fumaça; e história familiar de câncer pancreático ou outro câncer. O teste de níveis de biomarcadores em combinação com uma avaliação de qualquer informação biomédica adicional, incluindo outros testes de laboratório (por exemplo, teste CA 19-9, concentração sérica de bilirrubina, atividade de fosfatase alcalina, presença da anemia), por exemplo, pode melhorar a sensibilidade, especificidade e/ou AUC para detectar câncer pancreático (ou outros usos relacionados ao câncer pancreático) quando comparado ao teste de biomarcador sozinho ou avaliação de qualquer particular item da informação biomédica adicional sozinha (por exemplo, imageamento de ultrassom sozinho). Informação biomédica

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48/284 adicional pode ser obtida de um indivíduo usando técnicas de rotina conhecidas na técnica, tal como a partir dos próprios indivíduos pelo uso de um questionário de rotina do paciente ou questionário de história de saúde, etc., ou de um profissional médico, etc. O teste de níveis de biomarcadores em combinação com uma avaliação de qualquer informação biomédica adicional, por exemplo, pode melhorar a sensibilidade, especificidade e/ou AUC para detectar câncer pancreático (ou outros usos relacionados ao câncer pancreático) quando comparado ao teste de biomarcador sozinho ou avaliação de qualquer item particular de informação biomédica adicional sozinha (por exemplo, imageamento de CT sozinho).

[000134] O antígeno 19-9 (CA 19-9) associado ao câncer é um marcador sanguíneo conhecido do câncer pancreático. A sensibilidade e a especificidade relatadas de CA 19-9 para o câncer pancreático são de 80 a 90 por cento, respectivamente. Entretanto, estes valores estão estritamente relacionados ao tamanho tumoral. A exatidão de CA 19-9 para identificar pacientes com cânceres pequenos cirurgicamente resseccionáveis é limitada. CA 19-9 requer a presença do antígeno de grupo sanguíneo Lewis (uma glicosil transferase) a ser expresso. Entre indivíduos com um fenótipo Lewis-negativo (aproximadamente 5 a 10 por cento da população), níveis de CA 19-9 não são um marcador tumoral útil. A especificidade de CA 19-9 também é limitada. CA 19-9 é frequentemente elevado em pacientes com vários distúrbios pancreaticobiliares benignos. O grau de elevação de CA 19-9 (tanto na apresentação inicial como no ambiente pós-operatório) está associado ao prognóstico de longo prazo. Além disso, em pacientes que parecem ter a doença potencialmente resseccionável, a magnitude do nível de CA 19-9 também pode ajudar a predizer a presença da doença metastásica radiograficamente oculta também. O monitoramento serial de níveis de CA 19-9 são úteis para acompanhar pacientes após cirurgia

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49/284 potencialmente curativa e para aqueles que estão recebendo quimioterapia para a doença avançada. Níveis de CA 19-9 crescentes normalmente precedem o aparecimento radiográfico da doença recorrente, mas a confirmação da progressão de doença deve ser perseguida com estudos de imageamento e/ou biópsia. O teste de níveis de biomarcadores em combinação com CA 19-9, por exemplo, pode melhorar a sensibilidade, especificidade e/ou AUC para detectar câncer pancreático (ou outros usos relacionados ao câncer pancreático) quando comparados com CA 19-9 sozinho.

[000135] O termo “área sob a curva” ou “AUC” refere-se à área sob a curva de uma curva característica operacional de receptor (ROC), ambas as quais são bem conhecidas na técnica. As medidas de AUC são úteis para comparar a exatidão de um classificador através da faixa de dados completa. Os classificadores com uma maior AUC têm uma maior capacidade de classificar desconhecidos corretamente entre dois grupos de interesse (por exemplo, amostras de câncer pancreático e amostras normais ou controle). As curvas de ROC são úteis para traçar o desempenho de um atributo particular (por exemplo, qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido e/ou qualquer item de informação biomédica adicional) em distinção entre duas populações (por exemplo, casos tendo câncer pancreático e controles sem câncer pancreático). Tipicamente, os dados de atributo através da população inteira (por exemplo, os casos e controles) são classificados em ordem ascendente baseado no valor de um atributo único. Então, para cada valor daquele atributo, as taxas de verdadeiros-positivos e falsos-positivos dos dados são calculadas. A taxa de verdadeiros-positivos é determinada contando o número de casos acima do valor daquele atributo e em seguida dividindo pelo número total de casos. A taxa de falsos-positivos é determinada contando o número de controles acima do valor daquele atributo e em seguida dividindo pelo número total de controles. Embora

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50/284 esta definição se refira a cenários nos quais um atributo é elevado em casos em comparação aos controles, esta definição também se aplica a cenários nos quais um atributo é mais baixo em casos em comparação aos controles (em tal cenário, as amostras abaixo do valor daquele atributo seriam contadas). As curvas de ROC podem ser geradas para um atributo único bem como para outras produções únicas, por exemplo, uma combinação de dois ou mais atributos pode ser matematicamente combinada (por exemplo, adicionados, subtraídos, multiplicados, etc.) para fornecer um valor de soma único, e este valor de soma único pode ser traçado em uma curva de ROC. Adicionalmente, qualquer combinação de múltiplos atributos, nos quais a combinação deriva de um valor de saída único, pode ser traçada em uma curva ROC. Estas combinações de atributos podem compreender um teste. A curva de ROC é o gráfico da taxa de verdadeiros-positivos (sensibilidade) de um teste contra a taxa de falsos-positivos (especificidade 1) do teste.

[000136] Como usado neste pedido, “detecção” ou “determinação” com respeito a um valor de biomarcador incluem o uso de ambos os instrumentos necessários para observar e registrar um sinal correspondente a um valor de biomarcador e materiais necessários para gerar aquele sinal. Em várias modalidades, o valor do biomarcador é detectado usando qualquer método adequado, incluindo fluorescência, quimioluminescência, ressonância de plásmons de superfície, ondas acústicas de superfície, espectrometria de massa, espectroscopia em infravermelho, espectroscopia de Raman, microscopia de força atômica, microscopia de varredura de tunelamento, métodos de detecção eletroquímicos, ressonância magnética nuclear, pontos quânticos, e similares.

[000137] “Suporte sólido” refere-se neste pedido a qualquer substrato tendo uma superfície à qual as moléculas podem ser ligadas,

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51/284 diretamente ou indiretamente, por obrigações covalentes ou por não covalentes. Um “suporte sólido” pode ter uma variedade de formatos físicos, que podem incluir, por exemplo, uma membrana; um chip (por exemplo, um chip proteico); uma lâmina (por exemplo, uma lâmina de vidro ou lamínula); uma coluna; uma depressão, uma partícula contendo poro ou cavidade sólida, semissólida, tal como, por exemplo, uma conta; um gel; uma fibra, incluindo um material de fibra ótica; uma matriz; e um receptáculo de amostra. Receptáculos de amostra exemplares incluem poços de amostra, tubos, tubos capilares, frascos, e qualquer outro vaso, ranhura ou indentação capaz de manter uma amostra. Um receptáculo de amostra pode ser contido em uma plataforma multiamostra, tal como uma placa de microtítulo, lâmina, dispositivo microfluídico, e similares. Um suporte pode ser composto de um material natural ou sintético, material orgânico ou inorgânico. A composição do suporte sólido no qual os reagentes de captura são ligados geralmente depende do método de ligação (por exemplo, ligação covalente). Outros receptáculos exemplares incluem microgotículas e microfluidicos controlados ou emulsões oleosas/aquosas dentro das quais os ensaios e manipulações relacionadas podem ocorrer. Suportes sólidos adequados incluem, por exemplo, plásticos, resinas, polissacarídeos, sílica ou materiais baseados em sílica, funcionalizados de vidro, silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, membranas, náilon, fibras naturais (tal como, por exemplo, seda, lã e algodão), polímeros, e similares. O material que compõe o suporte sólido pode incluir grupos reativos tais como, por exemplo, grupos carbóxi, amino, ou hidroxilas, que são usados para a ligação dos reagentes de captura. Suportes sólidos poliméricos podem incluir, por exemplo, poliestireno, tetraftalato de polietilenoglicol, acetato de polivinil, cloreto de polivinila, polivinilpirrolidona, poliacrilonitrila, metacrilato de polimetila,

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52/284 politetrafluoroetileno, borracha de butila, borracha de estirenobutadieno, borracha natural, polietileno, polipropileno, (poli)tetrafluoroetileno, (poli)vinilidenofluoreto, policarbonato e polimetilpenteno. Partículas de suporte sólidas adequadas que podem ser usadas incluem, por exemplo, partículas codificadas, tais como partículas codificadas tipo Luminex, partículas magnéticas e partículas de vidro.

Usos Exemplares de Biomarcadores [000138] Em várias modalidades exemplares, métodos são fornecidos para diagnóstico de câncer pancreático em um indivíduo pela detecção de um ou mais valores de biomarcadores correspondentes a um ou mais biomarcadores que estão presentes na circulação de um indivíduo, tal como no soro ou plasma, por qualquer número de métodos analíticos, incluindo qualquer um dos métodos analíticos descritos neste pedido. Estes biomarcadores, por exemplo, são diferencialmente expressos em indivíduos com câncer pancreático quando comparados a indivíduos sem câncer pancreático. A detecção da expressão diferencial de um biomarcador em um indivíduo pode ser usada, por exemplo, para permitir o diagnóstico precoce de câncer pancreático, para distinguir entre uma massa benigna e maligna (tal como, por exemplo, uma massa observada em um exame de tomografia computadorizada (CT), MRI ou ultrassom), para monitorar a recidiva de câncer pancreático, ou para o diagnóstico diferencial de outras condições clínicas, tais como pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno.

[000139] Qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido pode ser usado em uma variedade de indicações clínicas de câncer pancreático, incluindo qualquer uma das seguintes: detecção de câncer pancreático (tal como em um indivíduo ou população de alto risco); caracterização de câncer pancreático (por exemplo, determinando tipo,

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53/284 sub-tipo ou estágio do câncer pancreático), tal como distinção entre câncer pancreático (câncer pancreático) e pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno e/ou entre adenocarcinoma e outros tipos de células malignas (ou de outra maneira facilitando histopatologia); determinação se uma massa pancreática é benigna ou um tumor pancreático maligno; determinação do prognóstico de câncer pancreático; monitoramento da progressão ou remissão de câncer pancreático; monitoramento da recidiva de câncer pancreático; monitoramento de metástase; seleção de tratamento; monitoramento de resposta a um agente terapêutico ou outro tratamento; estratificação de indivíduos por rastreamento com ultrassom endoscópico (EUS) (por exemplo, identificando aqueles indivíduos em maior risco de câncer pancreático e por meio disso mais provavelmente se beneficiando de rastreamento radiológico, dessa forma, aumentando o valor preditivo positivo de EUS); combinando teste de biomarcador com a informação biomédica adicional, tal como história de fumo ou álcool, etc., ou nível de CA 19-9, a presença de um marcador(es) genético que indica um risco mais alto de câncer pancreático, etc., ou com tamanho de massa, morfologia, presença da ascite, etc. (tal como para fornecer um ensaio de desempenho diagnóstico aumentado quando comparado com teste de CA 19-9 ou outro teste de biomarcador ou com tamanho de massa, morfologia, etc.); facilitação do diagnóstico de uma massa abdominal como maligna ou benigna; a facilitação de decisão clínica que faz uma vez uma massa abdominal é observada sobre CT, MRI, PET ou EUS (por exemplo, ordenando exames radiológicos repetidos se se considerar que a massa abdominal é o risco baixo, tal como se um teste baseado no biomarcador seja negativo, com ou sem categorização do tamanho de massa, ou consideração de biópsia se a massa for considerada de meio a alto risco, tal como se um teste baseado em

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54/284 biomarcadores seja positivo, com ou sem a categorização do tamanho de massa ou extensão da invasão de tecido); e facilitação de decisões quanto ao acompanhamento clínico (por exemplo, se é preciso implementar exames radiológicos de imageamento repetidos, biópsia de agulha fina, ou cirurgia após observar uma massa abdominal no imageamento). O teste de biomarcador pode melhorar o valor preditivo positivo (PPV) ao longo do rastreamento de EUS de indivíduos de alto risco sozinho. Além da sua utilidade em conjunto com o rastreamento de EUS, os biomarcadores descritos neste pedido também podem ser usados em conjunto com qualquer outra modalidade de imageamento usada para câncer pancreático, tal como exame de CT, MRI ou PET. Além disso, os biomarcadores descritos também podem ser úteis para permitir alguns destes usos antes que as indicações de câncer pancreático sejam detectadas por modalidades de imageamento ou outros correlativos clínicos, ou antes que os sintomas apareçam. Ainda inclui distinção de pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno do câncer pancreático.

[000140] Como um exemplo da maneira na qual qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido pode ser usado para diagnosticar câncer pancreático, a expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores descritos em um indivíduo que não é conhecido por ter câncer pancreático pode indicar que o indivíduo tem câncer pancreático, por meio disso permitindo detecção do câncer pancreático em um estágio precoce da doença quando o tratamento é o mais eficaz, possivelmente antes que o câncer pancreático seja detectado por outros meios ou antes que os sintomas apareçam. A superexpressão de um ou mais dos biomarcadores durante o curso do câncer pancreático pode ser indicativa da progressão de câncer pancreático, por exemplo, um tumor pancreático está crescendo e/ou sofrendo metástase (e dessa

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55/284 forma indica um prognóstico ruim), ao passo que uma redução no grau ao qual um ou mais dos biomarcadores é diferencialmente expresso (isto é, em testes de biomarcador subsequentes, o nível de expressão no indivíduo está movendo-se em direção ou aproximando-se de um nível de expressão “normal”) pode ser indicativo da remissão do câncer pancreático, por exemplo, um tumor pancreático está encolhendo (e dessa forma indica um prognóstico bom ou melhor). Similarmente, um aumento no grau ao qual um ou mais dos biomarcadores é diferencialmente expresso (isto é, em testes subsequentes de biomarcadores, o nível de expressão no indivíduo está se afastando de um nível de expressão “normal”) durante o curso do tratamento de câncer pancreático pode indicar que o câncer pancreático está progredindo e por isso indica que o tratamento é ineficaz, ao passo que uma redução na expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores durante o curso do tratamento de câncer pancreático pode ser indicativa da remissão de câncer pancreático e por isso indica que o tratamento está funcionando com sucesso. Adicionalmente, um aumento ou redução na expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores após um indivíduo ser aparentemente curado do câncer pancreático pode ser indicativo da recidiva de câncer pancreático. Em uma situação, tal como aquela, por exemplo, o indivíduo pode ser reiniciado na terapia (ou regime terapêutico modificado como, por exemplo, aumentar a quantidade e/ou frequência de dosagem, se o indivíduo manteve a terapia) em um estágio mais adiantado que se a recidiva do câncer pancreático não foi detectada até depois. Além disso, um nível de expressão diferencial de um ou mais dos biomarcadores em um indivíduo pode ser preditivo da resposta do indivíduo a um agente terapêutico particular. No monitoramento de recidiva ou progressão de câncer pancreático, modificações nos níveis de expressão de biomarcador podem indicar a necessidade de imageamento repetida

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56/284 (por exemplo, repetir EUS), tal como para determinar a atividade de câncer pancreático ou determinar a necessidade de modificações no tratamento.

[000141] A detecção de qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido pode ser particularmente útil seguinte ou em conjunto com o tratamento de câncer pancreático, tal como para avaliar o êxito do tratamento ou monitorar a remissão, recidiva, e/ou progressão do câncer pancreático (incluindo metástase) após tratamento. O tratamento de câncer pancreático pode incluir, por exemplo, a administração de um agente terapêutico ao indivíduo, o desempenho da cirurgia (por exemplo, resseção cirúrgica de pelo menos uma porção de um tumor pancreático ou remoção do tecido pancreático e circundante), a administração de terapia de radiação, ou qualquer outro tipo de tratamento de câncer pancreático usado na técnica, e qualquer combinação destes tratamentos. Por exemplo, qualquer um dos biomarcadores pode ser detectado pelo menos uma vez após o tratamento ou pode ser detectado múltiplas vezes após o tratamento (tal como em intervalos periódicos), ou pode ser detectado tanto antes como após tratamento. Níveis de expressão diferenciais de qualquer um dos biomarcadores em um indivíduo ao longo do tempo podem ser indicativos de progressão, remissão, ou recidiva do câncer pancreático, exemplos os quais incluem qualquer um dos seguintes: um aumento ou redução no nível de expressão dos biomarcadores após tratamento comparado ao nível de expressão do biomarcador antes do tratamento; um aumento ou redução no nível de expressão do biomarcador em um ponto de tempo posterior após o tratamento comparado ao nível de expressão do biomarcador em um ponto de tempo mais precoce após tratamento; e um nível de expressão diferencial do biomarcador em um ponto de tempo único após tratamento comparado aos níveis normais do biomarcador.

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57/284 [000142] Como um exemplo específico, os níveis de biomarcadores de qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido podem ser determinados em amostras séricas ou plasmáticas pré-cirurgia e póscirurgia (por exemplo, 2 a 8 semanas após cirurgia). Um aumento no nível(is) de expressão do biomarcador na amostra de pós-cirurgia comparada com a amostra pré-cirurgia pode indicar a progressão de câncer pancreático (por exemplo, cirurgia mal sucedida), ao passo que uma redução no nível(is) de expressão do biomarcador na amostra póscirurgia comparada com a amostra pré-cirurgia pode indicar regressão do câncer pancreático (por exemplo, a cirurgia removeu com sucesso o tumor pancreático). Análises similares dos níveis de biomarcadores podem ser realizadas antes e após outras formas de tratamento, tal como antes e após terapia de radiação ou administração de um agente terapêutico ou vacina de câncer.

[000143] Além do teste de níveis de biomarcadores como um teste diagnóstico autônomo, os níveis de biomarcadores também podem ser feitos em conjunto com a determinação de SNPs ou outras lesões genéticas ou variabilidade que são indicativas do risco aumentado de suscetibilidade à doença. (Ver, por exemplo, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).

[000144] Além do teste de níveis de biomarcadores como um teste diagnóstico autônomo, os níveis de biomarcadores também podem ser feitos em conjunto com o rastreamento radiológico. Além do teste de níveis de biomarcadores como um teste diagnóstico autônomo, os níveis de biomarcadores também podem ser feitos em conjunto com sintomas relevantes ou teste genético. A detecção de qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido pode ser útil depois que a massa pancreática foi observada pelo imageamento ajudar no diagnóstico de câncer pancreático e guiar apropriadamente a assistência clínica do indivíduo, incluindo a assistência por um especialista cirúrgico

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58/284 apropriado ou por terapia paliativa no paciente não resseccionável. Além do teste de níveis de biomarcadores em conjunto com sintomas relevantes ou fatores dos riscos, a informação quanto aos biomarcadores também pode ser avaliada em conjunto com outros tipos de dados, particularmente dados que indicam o risco de um indivíduo para câncer pancreático (por exemplo, história clínica do paciente, sintomas, história familiar de câncer pancreático, história de uso de fumo ou álcool, início súbito de diabetes mellitus, icterícia, fatores de risco, tais como a presença de um marcador(es) genético, e/ou o status de outros biomarcadores, etc.). Estes vários dados podem ser avaliados por métodos automatizados, tais como um programa de computador, que pode ser incorporado em um computador ou outro aparelho/dispositivo.

[000145] Além do teste de níveis de biomarcadores em conjunto com o rastreamento radiológico em indivíduos de alto risco (por exemplo, avaliação de níveis de biomarcadores em conjunto com o tamanho ou outras características de uma massa pancreática observada em um exame de imageamento), informação quanto aos biomarcadores também pode ser avaliada em conjunto com outros tipos de dados, particularmente dados que indicam o risco de um indivíduo do câncer pancreático (por exemplo, história clínica paciente, sintomas, história familiar de câncer, fatores dos riscos tal como se o indivíduo é fumante, usuário pesado de álcool e/ou status de outros biomarcadores, etc.). Estes vários dados podem ser avaliados por métodos automatizados, tais como um programa de computador, que pode ser incorporado em um computador ou outro aparelho/dispositivo.

[000146] Qualquer um dos biomarcadores descritos também pode ser usado em testes de imageamento. Por exemplo, um agente de imageamento pode ser acoplado a qualquer um dos biomarcadores descritos, que podem ser usados para ajudar no diagnóstico de câncer

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59/284 pancreático, monitorar a progressão/remissão de doença ou metástase, monitorar a recidiva da doença, ou monitorar a resposta à terapia, entre outros usos.

Detecção e Determinação de Biomarcadores e Valores de Biomarcadores [000147] Um valor de biomarcador para os biomarcadores descritos neste pedido pode ser detectado usando qualquer uma de uma variedade de métodos analíticos conhecidos. Em uma modalidade, um valor de biomarcador é detectado usando um reagente de captura. Como usado neste pedido, um “agente de captura” ou “reagente de captura” refere-se a uma molécula que é capaz de ligação específica a um biomarcador. Em várias modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao biomarcador na solução ou pode ser exposto ao biomarcador enquanto o reagente de captura é imobilizado em um suporte sólido. Em outras modalidades, o reagente de captura contém um atributo que é reativo com um atributo secundário em um suporte sólido. Nestas modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao biomarcador na solução, e em seguida o atributo no reagente de captura pode ser usado em conjunto com o atributo secundário no suporte sólido para imobilizar o biomarcador no suporte sólido. O reagente de captura é selecionado baseado no tipo de análise a ser conduzida. Os reagentes de captura incluem mas não são limitados a aptâmeros, anticorpos, adnectinas, anquirinas, outros miméticos de anticorpo e outras estruturas proteicas, autoanticorpos, quimeras, pequenas moléculas, um fragmento F(ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação ao ligante, affycorpos, nanocorpos, polímeros impressos, avímeros, peptideomiméticos, um receptor hormonal, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.

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60/284 [000148] Em algumas modalidades, um valor de biomarcador é detectado usando um complexo de biomarcador/reagente de captura.

[000149] Em outras modalidades, o valor de biomarcador é derivado do complexo de reagente de biomarcador/reagente de captura e é detectado indiretamente, tal como, por exemplo, em consequência de uma reação que é subsequente à interação de reagente de biomarcador/reagente de captura, mas é dependente da formação do complexo de biomarcador/reagente de captura.

[000150] Em algumas modalidades, o valor de biomarcador é detectado diretamente do biomarcador em uma amostra biológica.

[000151] Em uma modalidade, os biomarcadores são detectados usando um formato multiplexado que permite à detecção simultânea de dois ou mais biomarcadores em uma amostra biológica. Em uma modalidade do formato multiplexado, os reagentes de captura são imobilizados, diretamente ou indiretamente, covalentemente ou não covalentemente, em posições discretas em um suporte sólido. Em outra modalidade, um formato multiplexado usa suportes sólidos discretos onde cada suporte sólido tem um reagente de captura único associado a aquele suporte sólido, tal como, por exemplo pontos dos quanta. Em outra modalidade, um dispositivo individual é usado para a detecção de cada um de múltiplos biomarcadores a serem detectados em uma amostra biológica. Dispositivos individuais podem ser configurados para permitir cada biomarcador na amostra biológica ser processado simultaneamente. Por exemplo, uma placa de microtítulo pode ser usada tal que cada poço na placa seja usado para analisar unicamente um dos múltiplos biomarcadores a serem detectados em uma amostra biológica.

[000152] Em uma ou mais das modalidades precedentes, uma marcação fluorescente pode ser usada para marcar um componente do complexo biomarcador/captura para permitir a detecção do valor de

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61/284 biomarcador. Em várias modalidades, o marcador fluorescente pode ser conjugado a um reagente de captura específico para qualquer um dos biomarcadores descritos neste pedido usando técnicas conhecidas, e o marcador fluorescente então pode ser usado para detectar o valor de biomarcador correspondente. Marcadores fluorescentes adequados incluem quelatos de terras raras, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansil, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, Lissamina, ficoeritrina, Texas Red, e outros compostos.

[000153] Em uma modalidade, o marcador fluorescente é uma molécula de corante fluorescente. Em algumas modalidades, a molécula de corante fluorescente inclui pelo menos um sistema anelar de indólio substituído no qual o substituinte no carbono 3 do anel indólio contém um grupo quimicamente reativo ou uma substância conjugada. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui uma molécula AlexaFluor, tal como, por exemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680 ou AlexaFluor 700. Em outras modalidades, a molécula de corante inclui o primeiro tipo e o segundo tipo de molécula de corante, tal como, por exemplo, duas moléculas de AlexaFluor diferentes. Em outras modalidades, a molécula de corante inclui o primeiro tipo e o segundo tipo de molécula de corante, e as duas moléculas de corante têm espectros de emissão diferentes.

[000154] A fluorescência pode ser medida com uma variedade de instrumentação compatível com uma larga faixa de formatos de ensaio. Por exemplo, espectrofluorímetros foram projetados para analisar placas de microtítulo, lâminas de microscópio, arranjos impressos, cubetas, etc. Ver Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Applications; editores Philip E. Stanley e Larry J. Kricka, World Scientific Publishing Company, January 2002.

[000155] Em uma ou mais das modalidades precedentes, um marcador de quimioluminescência pode ser opcionalmente usado para

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62/284 marcar um componente do complexo biomarcador/captura para permitir a detecção de um valor de biomarcador. Materiais quimioluminescentes adequados incluem qualquer um de cloreto de oxalila, Rodamina 6G, Ru(bipy)32 +, TMAE (tetrakis(dimetilamino) etileno), Pirogalol (1,2,3-trihidroxibenzeno), Lucigenina, peroxioxalatos, oxalatos de arila, ésteres de acridínio, dioxetanos, e outros.

[000156] Ainda em outras modalidades, o método de detecção inclui uma combinação de enzima/substrato que gera um sinal detectável que corresponde ao valor do biomarcador. Geralmente, a enzima catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida usando várias técnicas, incluindo espectrofotometria, fluorescência e quimioluminescência. Enzimas adequadas incluem, por exemplo, luciferases, luciferina, malato desidrogenase, urease, peroxidase de rábano silvestre (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucoamilase, lisozima, glicose oxidase, galactose oxidase, e glicose-6fosfato desidrogenase, uricase, xantina oxidase, lactoperoxidase, microperoxidase, e similares.

[000157] Ainda em outras modalidades, o método de detecção pode ser uma combinação de fluorescência, quimioluminescência, radionuclídeo ou combinações de enzima/substrato que geram um sinal mensurável. A sinalização multimodal pode ter características únicas e vantajosas em formatos de ensaio de biomarcadores.

[000158] Mais especificamente, os valores de biomarcadores dos biomarcadores descritos neste pedido podem ser detectados usando métodos analíticos conhecidos incluindo, ensaios de aptâmero singleplex, ensaios de aptâmero multiplex, imunoensaios singleplex ou multiplex, perfil de expressão de mRNA, perfil de expressão de miRNA, análise espectrométrica de massa, métodos histológicos/citológicos, etc. como detalhados abaixo.

Determinação de Valores de Biomarcadores Usando Ensaios

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Baseados em Aptâmeros [000159] Ensaios dirigidos à detecção e quantificação de moléculas fisiologicamente significantes em amostras biológicas e outras amostras são instrumentos importantes na pesquisa científica e no campo de assistência de saúde. Uma classe de tais ensaios envolve o uso de um microarranjo que inclui um ou mais aptâmeros imobilizados em um suporte sólido. Os aptâmeros são cada um capaz de ligação a uma molécula alvo de uma maneira altamente específica e com afinidade muito alta. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.475.096 intitulada “Nucleic Acid Ligands”; ver também, por exemplo, Patente U.S. No. 6.242.246, Patente U.S. No. 6.458.543, e Patente U.S. No. 6.503.715, cada uma das quais é intitulada “Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”. Uma vez que o microarranjo é contatado com uma amostra, os aptâmeros ligam-se às suas respectivas moléculas alvo presentes na amostra e por meio disso permitem uma determinação de um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador.

[000160] Como usado neste pedido, um “aptâmero” refere-se a um ácido nucleico que tem uma afinidade de ligação específica a uma molécula alvo. É reconhecido que as interações de afinidade são uma questão de grau; entretanto, neste contexto, “afinidade de ligação específica” de um aptâmero por seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo geralmente com um grau muito mais alto de afinidade do que se liga a outros componentes em uma amostra teste. Um “aptâmero” é grupo de cópias de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma particular sequência nucleotídica. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleotídeos, incluindo qualquer número de nucleotídeos quimicamente modificados. “Aptâmeros” referem-se a mais de um tal conjunto de moléculas. Aptâmeros diferentes podem ter os mesmos ou diferentes números de nucleotídeos. Aptâmeros podem ser DNA ou RNA ou ácidos nucleicos

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64/284 quimicamente modificados e podem ser de fita única, fita dupla, ou conter regiões de fita duplas, e podem incluir estruturas ordenadas mais altas. Um aptâmero também pode ser um fotoaptâmero, onde um grupo funcional fotorreativo ou quimicamente reativo está incluído no aptâmero para permitir a ele ser covalentemente ligado ao seu alvo correspondente. Qualquer um dos métodos de aptâmeros descritos neste pedido pode incluir o uso de dois ou mais aptâmeros que especificamente se ligam à mesma molécula alvo. Tal como será descrito a seguir, um aptâmero pode incluir um marcador. Se um aptâmero incluir um marcador, todas as cópias do aptâmero não precisam ter o mesma marcador. Além disso, se os aptâmeros diferentes cada um incluem um marcador, estes aptâmeros diferentes podem ter o mesmo marcador ou um marcador diferente.

[000161] Um aptâmero pode ser identificado usando qualquer método conhecido, incluindo o processo SELEX. Uma vez identificado, um aptâmero pode ser preparado ou sintetizado conforme qualquer método conhecido, incluindo métodos sintéticos químicos e métodos sintéticos enzimáticos.

[000162] Como usado neste pedido, um “SOMAmer” ou Aptâmero Modificado por Taxa de Dissociação Lenta refere-se a um aptâmero tendo características melhoradas de taxa de dissociação. SOMAmers podem ser gerados usando os métodos SELEX melhorados descritos na Publicação U.S. No. 2009/0004667, intitulada “Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates.” [000163] Os termos “SELEX” e “processo SELEX” são usados intercambiavelmente neste pedido para referir-se geralmente a uma combinação (1) da seleção de aptâmeros que interagem com uma molécula alvo de uma maneira desejável, que por exemplo se liga com alta afinidade a uma proteína, (2) com a amplificação daqueles ácidos nucleicos selecionados. O processo SELEX pode ser usado para

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65/284 identificar aptâmeros com alta afinidade a um alvo ou biomarcador específico.

[000164] SELEX geralmente inclui a preparação de uma mistura candidata de ácidos nucleicos, ligando a mistura candidata à molécula alvo desejada para formar um complexo de afinidade, separação dos complexos de afinidade dos ácidos nucleicos candidatos não ligados, separação e isolamento do ácido nucleico do complexo de afinidade, purificação do ácido nucleico, e identificação de uma sequência de aptâmero específica. O processo pode incluir múltiplos ciclos para refinar mais a afinidade do aptâmero selecionado. O processo pode incluir etapas de amplificação em um ou mais pontos no processo. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.475.096, intitulada “Nucleic Acid Ligands”. O processo SELEX pode ser usado para gerar um aptâmero que covalentemente se liga a seu alvo bem como um aptâmero que não se liga covalentemente ao seu alvo. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.705.337 intitulada “Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX.” [000165] O processo SELEX pode ser usado para identificar aptâmeros de alta afinidade contendo nucleotídeos modificados que conferem características melhoradas ao aptâmero, tais como, por exemplo, estabilidade melhorada in vivo ou características de entrega melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições das bases. Aptâmeros identificados pelo processo SELEX contendo nucleotídeos modificados são descritos na Patente U.S. No. 5.660.985, intitulada “High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides”, que descreve oligonucleotídeos contendo derivados de nucleotídeo quimicamente modificados nas posições 5' e 2' de pirimidinas. A Patente U.S. No. 5.580.737, ver supra, descreve aptâmeros altamente específicos contendo um ou mais nucleotídeos modificados com 2'-amino (2'-NH2),

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2’-fluoro (2’-F), e/ou 2’-O-metil (2’-OMe). Ver também, Publicação de Pedido de Patente U.S. 20090098549, intitulada “SELEX and PHOTOSELEX”, que descreve bibliotecas de ácidos nucleicos tendo propriedades físicas e químicas expandidas e seu uso em SELEX e photoSELEX.

[000166] SELEX também pode ser usado para identificar aptâmeros que têm características desejáveis de taxa de dissociação. Ver Publicação de Pedido de Patente U.S. 20090004667, intitulada “Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates”, que descreve métodos SELEX melhorados para gerar aptâmeros que podem ligar-se a moléculas alvo. Métodos para produção de aptâmeros e fotoaptâmeros tendo taxas de dissociação mais lentas a partir das suas respectivas moléculas alvo são descritos. Os métodos envolvem contatar a mistura candidata com a molécula alvo, permitir a formação de complexos ácido nucleicos-alvo ocorrer, e realizar um processo de enriquecimento de taxa de dissociação lenta em que os complexos ácido nucleico-alvo com taxas de dissociação rápidas se dissociarão e não se reformarão, enquanto os complexos com taxas de dissociação lentas permanecerão intactos. Adicionalmente, os métodos incluem o uso de nucleotídeos modificados na produção das misturas candidatas de ácidos nucleicos para gerar aptâmeros com o desempenho de taxa de dissociação melhorado.

[000167] Uma variação deste ensaio emprega aptâmeros que incluem grupos funcionais fotorreativos que permitem os aptâmeros se ligarem covalentemente ou “fotointerligação” a suas moléculas alvo. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 6.544.776 intitulada “Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”. Estes aptâmeros fotorreativos são também referidos como fotoaptâmeros. Ver, por exemplo, Patente U.S. No. 5.763.177, Patente U.S. No. 6.001.577, e Patente U.S. No. 6.291.184, cada uma das quais é intitulada “Systematic Evolution of Nucleic Acid

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Ligands by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX”; ver também, por exemplo, Patente U.S. No. 6.458.539, intitulada “Photoselection of Nucleic Acid Ligands”. Após o microarranjo ser contatado com a amostra e os fotoaptâmeros terem tido uma oportunidade de ligar-se às suas moléculas alvo, os fotoaptâmeros são fotoativados, e o suporte sólido é lavado para remover quaisquer moléculas não ligadas especificamente. Condições severas de lavagem podem ser usadas, uma vez que as moléculas alvo que estão ligadas aos fotoaptâmeros geralmente não são removidas, devido às ligações covalentes criadas pelo grupo(s) funcional fotoativado dos fotoaptâmeros. Desta maneira, o ensaio permite a detecção de um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra teste.

[000168] Em ambos destes formatos de ensaio, os aptâmeros são imobilizados no suporte sólido antes de ser contatados com a amostra. Em certas circunstâncias, entretanto, a imobilização dos aptâmeros antes do contato com a amostra pode não fornecer um ensaio ótimo. Por exemplo, a pré-imobilização dos aptâmeros pode resultar na mistura ineficiente dos aptâmeros com as moléculas alvo na superfície do suporte sólido, possivelmente levando a longos tempos de reação e, por isso, períodos de incubação extensos para permitir a ligação eficiente dos aptâmeros às suas moléculas alvo. Além disso, quando os fotoaptâmeros são empregados no ensaio e dependendo do material utilizado como um suporte sólido, o suporte sólido pode tender a dispersar ou absorver a luz usada para efetuar a formação de ligações covalentes entre os fotoaptâmeros e suas moléculas alvo. Além disso, dependendo do método empregado, a detecção de moléculas alvo ligadas aos seus aptâmeros pode ser sujeita à imprecisão, uma vez que a superfície do suporte sólido também pode ser exposta e afetada por qualquer agente de marcação que é usado. Finalmente, a imobilização

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68/284 dos aptâmeros no suporte sólido geralmente envolve uma etapa de preparação do aptâmero (isto é, a imobilização) antes da exposição dos aptâmeros à amostra, e esta etapa de preparação pode afetar a atividade ou funcionalidade dos aptâmeros.

[000169] Ensaios de aptâmero que permitem um aptâmero capturar seu alvo na solução e em seguida empregar as etapas de separação que são projetadas para remover componentes específicos da mistura alvo do aptâmero antes da detecção também foram descritos (ver Publicação de Pedido de Patente U.S. 20090042206, intitulada “Multiplexed Analyses of Test Samples”). Os métodos de ensaio de aptâmero descritos permitem a detecção e quantificação de um alvo não ácido nucleico (por exemplo, um alvo proteico) em uma amostra teste detectando e quantificando um ácido nucleico (isto é, um aptâmero). Os métodos descritos criam um substituto de ácido nucleico (isto é, o aptâmero) para detectar e quantificar um alvo não ácido nucleico, dessa forma permitindo larga variedade de tecnologias de ácidos nucleicos, incluindo a amplificação, serem aplicadas a uma faixa mais larga de alvos desejados, incluindo alvos proteicos.

[000170] Aptâmeros podem ser construídos para facilitar a separação dos componentes de ensaio de um complexo aptâmero biomarcador (ou complexo covalente fotoaptâmero biomarcador) e permitir o isolamento do aptâmero para detecção e/ou quantificação. Em uma modalidade, estes construtos podem incluir um elemento clivável ou liberável dentro da sequência de aptâmero. Em outras modalidades, funcionalidade adicional pode ser introduzida no aptâmero, por exemplo, um componente marcado ou detectável, um componente espaçador, ou um marcador de ligação específica ou elemento de imobilização. Por exemplo, o aptâmero pode incluir um marcador unido ao aptâmero através de uma porção clivável, um marcador, um componente espaçador separando o marcador, e a porção clivável. Em uma

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69/284 modalidade, um elemento clivável é um ligante fotoclivável. O ligante fotoclivável pode ser ligado a uma porção biotina e uma seção espaçadora, pode incluir um grupo NHS da derivatização de aminas, e pode ser usado para introduzir um grupo biotina a um aptâmero, por meio disso permitindo liberação do aptâmero depois em um método de ensaio.

[000171] Ensaios homogêneos, feitos com todos os componentes de ensaio na solução, não requerem separação de amostra e reagentes antes da detecção do sinal. Estes métodos são rápidos e fáceis usar. Estes métodos geram o sinal baseado em uma captura molecular ou reagente de ligação que reage com seu alvo específico. Para o câncer pancreático, os reagentes de captura molecular seriam um aptâmero ou um anticorpo ou similares e o alvo específico seria um biomarcador de câncer pancreático da Tabela 1, Col. 2.

[000172] Em uma modalidade, um método da geração de sinal tira proveito da modificação de sinal de anisotropia devido à interação de um reagente de captura marcado com o fluoróforo com seu alvo biomarcador específico. Quando a captura marcada reage com seu alvo, o peso molecular aumentado faz com que o movimento rotativo do fluoróforo ligado ao complexo se torne muito mais lento, modificando o valor de anisotropia. Monitorando a modificação de anisotropia, os eventos de ligação podem ser usados para medir quantitativamente os biomarcadores em soluções. Outros métodos incluem ensaios de polarização de fluorescência, métodos de farol molecular, extinção de fluorescência resolvida por tempo, quimioluminescência, transferência de energia de ressonância de fluorescência, e similares.

[000173] Um ensaio de aptâmero baseado na solução exemplar que pode ser usado para detectar um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador em uma amostra biológica inclui o seguinte: (a) preparação de uma mistura contatando a amostra biológica com um

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70/284 aptâmero que inclui um primeiro marcador e tem uma afinidade específica para o biomarcador, em que um complexo de afinidade de aptâmero é formado quando o biomarcador está presente na amostra;

(b) exposição da mistura a um primeiro suporte sólido incluindo um primeiro elemento de captura, e permitindo o primeiro marcador associar-se com o primeiro elemento de captura; (c) remoção de qualquer componente da mistura não associada com o primeiro suporte sólido; (d) ligação de um segundo marcador ao componente de biomarcador do complexo de afinidade de aptâmero; (e) liberação do complexo de afinidade de aptâmero do primeiro suporte sólido; (f) exposição do complexo de afinidade de aptâmero liberado a um segundo suporte sólido que inclui um segundo elemento de captura e permitindo o segundo marcador associar-se com o segundo elemento de captura; (g) remoção de qualquer aptâmero não complexado da mistura particionando o aptâmero não complexado do complexo de afinidade de aptâmero; (h) eluição do aptâmero do suporte sólido; e (i) detecção do biomarcador detectando o componente de aptâmero do complexo de afinidade de aptâmero.

[000174] Qualquer meio conhecido na técnica pode ser usado para detectar um valor de biomarcador detectando o componente de aptâmero de um complexo de afinidade de aptâmero. Diversos métodos de detecção diferentes podem ser usados para detectar o componente de aptâmero de um complexo de afinidade, tais como, por exemplo, ensaios de hibridização, espectroscopia de massa, ou QPCR. Em algumas modalidades, os métodos de sequenciamento de ácidos nucleicos podem ser usados para detectar o componente de aptâmero de um complexo de afinidade de aptâmero e por meio disso detectar um valor de biomarcador. Resumidamente, uma amostra teste pode ser submetida a qualquer tipo de método de sequenciamento de ácido nucleico para identificar e quantificar a sequência ou sequências de um

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71/284 ou mais aptâmeros presentes na amostra teste. Em algumas modalidades, a sequência inclui a molécula de aptâmero inteira ou qualquer porção da molécula que possa ser usada para identificar unicamente a molécula. Em outras modalidades, o sequenciamento de identificação é uma sequência específica adicionada ao aptâmero; tais sequências muitas vezes são referidas como “marcadores”, “códigos de barra”, ou “códigos postais”. Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui etapas enzimáticas para amplificar a sequência de aptâmero ou converter qualquer tipo de ácido nucleico, incluindo RNA e DNA contendo modificações químicas para qualquer posição, para qualquer outro tipo de ácido nucleico apropriado para o sequenciamento.

[000175] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui uma ou mais etapas de clonagem. Em outras modalidades o método de sequenciamento inclui um método de sequenciamento direto sem clonagem.

[000176] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui uma abordagem dirigida com iniciadores específicos que visam um ou mais aptâmeros na amostra teste. Em outras modalidades, o método de sequenciamento inclui uma abordagem forçada abrangente que visa todos os aptâmeros na amostra teste.

[000177] Em algumas modalidades, o método de sequenciamento inclui etapas enzimáticas para amplificar a molécula visada para o sequenciamento. Em outras modalidades, o método de sequenciamento sequencia diretamente moléculas únicas. Um método exemplar baseado no sequenciamento de ácido nucleico que pode ser usado para detectar um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador em uma amostra biológica inclui o seguinte: (a) conversão de uma mistura de aptâmeros que contêm nucleotídeos quimicamente modificados a ácidos nucleicos não modificados com uma etapa

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72/284 enzimática; (b) sequenciamento forçado abrangente dos ácidos nucleicos não modificados resultantes com uma plataforma de sequenciamento compactamente paralela tal como, por exemplo, o Sistema de Sequenciamento 454 (454 Life Sciences/Roche), Sistema de Sequenciamento Illumina (Illumina), Sistema de Sequenciamento ABI SOLiD (Applied Biosystems), Sequenciador de Molécula Única HeliScope (Helicos Biosciences), ou Sistema de Sequenciamento de Molécula Única em Tempo Real Pacific Biosciences (Pacific BioSciences) ou Sistema de Sequenciamento Polonator G (Dover Systems); e (c) identificação e quantificação dos aptâmeros presentes na mistura por sequência específica e contagem de sequência.

Determinação de Valores de Biomarcador usando Imunoensaios [000178] Métodos de imunoensaio são baseados na reação de um anticorpo ao seu alvo ou analito correspondente e podem detectar o analito em uma amostra dependendo do formato de ensaio específico. Para melhorar a especificidade e sensibilidade de um método de ensaio baseado em imunorreatividade, os anticorpos monoclonais muitas vezes são usados por causa de seu reconhecimento de epítopo específico. Anticorpos policlonais também foram usados com sucesso em vários imunoensaios por causa de sua afinidade aumentada para o alvo quando comparados a anticorpos monoclonais. Imunoensaios foram projetados para o uso com uma ampla faixa de matrizes de amostra biológicas. Formatos de imunoensaio foram projetados para fornecer resultados qualitativos, semiquantitativos e quantitativos.

[000179] Resultados quantitativos são gerados pelo uso de uma curva padrão criada com concentrações conhecidas do analito específico a ser detectado. A resposta ou sinal de uma amostra desconhecida são traçados para a curva padrão, e uma quantidade ou valor correspondente ao alvo na amostra desconhecida são estabelecidos. [000180] Numerosos formatos de imunoensaio foram projetados.

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ELISA ou EIA podem ser quantitativos para a detecção de um analito. Este método depende da ligação de um marcador ao analito ou ao anticorpo e o componente de marcador inclui, diretamente ou indiretamente, uma enzima. Testes ELISA podem ser formatados para direto, indireto, competitivo, ou de detecção de sanduíche do analito. Outros métodos dependem de marcadores tais como, por exemplo, radioisótopos (I125) ou fluorescência. Técnicas adicionais incluem, por exemplo, aglutinação, nefelometria, turbidimetria, Western blot, imunoprecipitação, imunocitoquímica, imuno-histoquímica, citometria de fluxo, ensaio Luminex, e outros (ver ImmunoAssay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicado por Taylor & Francis, Ltd., edição 2005).

[000181] Formatos de ensaio exemplares incluem ensaio imunoabsorvente ligado à enzima (ELISA), radioimunoensaio, fluorescente, quimioluminescência, e transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) ou imunoensaios FRET resolvidos no tempo (TR-FRET). Exemplos de procedimentos para detectar biomarcadores incluem imunoprecipitação de biomarcador seguida por métodos quantitativos que permitem o tamanho e a discriminação do nível de peptídeo, tal como eletroforese em gel, eletroforese capilar, eletrocromatografia planar, e similares.

[000182] Métodos de detecção e/ou quantificação de um marcador detectável ou material de geração de sinal dependem na natureza do marcador. Os produtos de reações catalisadas por enzimas apropriadas (onde o marcador detectável é uma enzima; ver acima) pode ser, sem limitação, fluorescente, luminescente, ou radioativo ou podem absorver luz visível ou ultravioleta. Exemplos de detectores adequados para detectar tais marcadores detectáveis incluem, sem limitação, filme de raios X, contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espectrofotômetros, colorímetros, fluorômetros, luminômetros e

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74/284 densitômetros.

[000183] Qualquer um dos métodos para detecção pode ser realizado em qualquer formato que permita em qualquer preparação adequada, processamento, e análise das reações. Isto pode ser, por exemplo, em placas de ensaio multipoços (por exemplo, 96 poços ou 384 poços) ou usando qualquer arranjo ou microarranjo adequado. Soluções estoque de vários agentes podem ser feitas manualmente ou roboticamente, e toda a pipetagem subsequente, diluição, mistura, distribuição, lavagem, incubação, leitura de amostra, coleta de dados e análise podem ser feitos roboticamente usando programa de análise, robótica, e instrumentação de detecção comercialmente disponíveis capaz de detectar um marcador detectável.

Determinação de Valores de Biomarcadores usando Perfil de Expressão Gênica [000184] A medida de mRNA em uma amostra biológica pode ser usada como um representante para detecção do nível da proteína correspondente na amostra biológica. Dessa forma, qualquer um dos biomarcadores ou painéis de biomarcadores descritos neste pedido também podem ser detectados por detecção do RNA apropriado.

[000185] Níveis de expressão de mRNA são medidos pela reação de polimerase em cadeia quantitativa em transcrição reversa (RT-PCR seguido com qPCR). RT-PCR é usada para criar um cDNA do mRNA. O cDNA pode ser usado em um ensaio de qPCR para produzir a fluorescência conforme o processo de amplificação de DNA progride. Na comparação com uma curva padrão, qPCR pode produzir uma medida absoluta, tal como o número de cópias do mRNA por célula. Nothern blots, microarranjos, análise de Invasor, e RT-PCR combinados com eletroforese capilar foram todos usados para medir os níveis de expressão do mRNA em uma amostra. Ver Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press,

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2004.

[000186] Moléculas de miRNA são pequenos RNAs que são não codificantes mas podem regular a expressão gênica. Qualquer um dos métodos ajustados à medida de níveis de expressão de mRNA também podem ser usados para o miRNA correspondente. Recentemente muitos laboratórios investigaram o uso de miRNAs como biomarcadores para doenças. Muitas doenças envolvem a regulação transcricional comum, e não é surpreendente que os miRNAs pudessem satisfazer um papel como biomarcadores. A conexão entre concentrações de miRNA e doença é muitas vezes ainda menos clara do que as conexões entre níveis proteicos e doença, ainda que o valor de biomarcadores de miRNA pudesse ser substancial. Naturalmente, como com qualquer RNA expresso diferencialmente durante a doença, os problemas que ficam à frente do desenvolvimento de um produto diagnóstico in vitro incluirá a exigência que os miRNAs sobrevivam na célula doente e sejam facilmente extraídos para análise, ou que os miRNAs sejam lançados no sangue ou outras matrizes onde devem sobreviver muito tempo para serem medidos. Biomarcadores proteicos têm exigências similares, embora muitos biomarcadores proteicos potenciais sejam secretados intencionalmente no sítio de patologia e funcionam, durante a doença, de uma maneira parácrina. Muitos biomarcadores proteicos potenciais são projetados para funcionar fora das células dentro das quais aquelas proteínas são sintetizadas.

Detecção de Biomarcadores Usando Tecnologias de Imageamento Molecular In Vivo [000187] Qualquer um dos biomarcadores descritos (ver Tabela 1, Col. 2) também podem ser usados em testes de imageamento molecular. Por exemplo, um agente de imageamento pode ser acoplado a qualquer um dos biomarcadores descritos, que podem ser usados para ajudar no diagnóstico de câncer pancreático, monitorar a

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76/284 progressão/remissão ou metástase da doença, monitorar a recidiva da doença, ou monitorar a resposta à terapia, entre outros usos.

[000188] Tecnologias de imageamento in vivo fornecem métodos não invasivos para determinar o estado de uma doença particular no corpo de um indivíduo. Por exemplo, porções inteiras do corpo, ou até o corpo inteiro, podem ser examinadas como uma imagem tridimensional, por meio disso fornecendo informação valiosa acerca de morfologia e estruturas no corpo. Tais tecnologias podem ser combinadas com detecção dos biomarcadores descritos neste pedido para fornecer a informação acerca do status de câncer, em particular o status do câncer pancreático, de um indivíduo.

[000189] O uso de tecnologias de imageamento molecular in vivo está expandindo-se devido a vários avanços na tecnologia. Estes avanços incluem o desenvolvimento de novos agentes de contraste ou marcadores, tais como radiomarcadores e/ou marcadores fluorescentes, que podem fornecer sinais fortes dentro do corpo; e o desenvolvimento da nova tecnologia poderosa de imageamento, que pode detectar e analisar estes sinais do exterior do corpo, com sensibilidade e exatidão suficientes para fornecer informação útil. O agente de contraste pode ser visualizado em um sistema de imageamento apropriado, por meio disso fornecendo uma imagem da porção ou porções do corpo no qual o agente de contraste está localizado. O agente de contraste pode estar ligado ou associado a um reagente de captura, tal como um aptâmero ou um anticorpo, por exemplo, e/ou com um peptídeo ou proteína, ou um oligonucleotídeo (por exemplo, para detecção da expressão gênica), ou um complexo contendo algum destes com uma ou mais macromoléculas e/ou outras formas particuladas.

[000190] O agente de contraste também pode apresentar um átomo radioativo que é útil no imageamento. Átomos radioativos adequados

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77/284 incluem tecnécio-99m ou iodo-123 para estudos cintilográficos. Outras porções prontamente detectáveis incluem, por exemplo, marcadores de spin para imageamento de ressonância magnética (MRI) tal como, por exemplo, novamente iodo-123, iodo-131, índio-111, flúor-19, carbono13, nitrogênio-15, oxigênio-17, gadolínio, manganês ou ferro. Tais marcadores são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente selecionados por um versado ordinário na técnica.

[000191] Técnicas de imageamento padrão incluem mas não são limitadas a imageamento por ressonância magnética, varredura por tomografia computadorizada, tomografia por emissão de pósitrons (PET), tomografia computadorizada por emissão de fóton único (SPECT), e similares. Para imageamento diagnóstico in vivo, o tipo do instrumento de detecção disponível é um fator principal na seleção de um agente de contraste dado, tal como um radionuclídeo dado e o biomarcador particular que é usado para o alvo (proteína, mRNA, e similares). O radionuclídeo escolhido tipicamente tem o tipo de decadência que é detectável pelo tipo do instrumento dado. Também, ao selecionar um radionuclídeo para o diagnóstico in vivo, sua meiavida deve ser bastante longa para permitir a detecção no momento da absorção máxima pelo tecido alvo mas bastante curto que a radiação deletéria do hospedeiro seja minimizada.

[000192] Técnicas de imageamento exemplares incluem mas não são limitadas a PET e SPECT, que são técnicas de imageamento nas quais um radionuclídeo é sinteticamente ou localmente administrado a um indivíduo. A absorção subsequente do radiotraçador é medida ao longo do tempo e usada para obter a informação sobre o tecido visado e o biomarcador. Por causa das emissões de alta energia (raio gama) dos isótopos específicos empregados e a sensibilidade e sofisticação dos instrumentos usados para detectá-los, a distribuição bidimensional da radioatividade pode ser inferida do exterior do corpo.

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78/284 [000193] Nuclídeos emissores deo pósitrons comumente usados em PET incluem, por exemplo, carbono-11, nitrogênio-13, oxigênio-15 e flúor-18. Os isótopos que decaem por captura de elétrons e/ou emissão gama são usados em SPECT e incluem, por exemplo iodo-123 e tecnécio-99m. Um método exemplar para marcar aminoácidos com tecnécio-99m é a redução do íon pertecnetato na presença de um precursor quelante para formar o complexo precursor tecnécio-99mlábil, que, por sua vez, reage com o grupo de ligação metálico de um peptídeo quimiotático bifuncionalmente modificado para formar um conjugado tecnécio-99m-peptídeo quimiotático.

[000194] Anticorpos são frequentemente usados para tais métodos diagnósticos de imageamento in vivo. A preparação e o uso de anticorpos para diagnóstico in vivo são bem conhecidos na técnica. Anticorpos marcados que especificamente se ligam a qualquer um dos biomarcadores na Tabela 1, Col. 2 podem ser injetados em um indivíduo suspeito em ter um certo tipo de câncer (por exemplo, câncer pancreático), detectável de acordo com o biomarcador particular usado, com o objetivo de diagnosticar ou avaliar o status da doença do indivíduo. O marcador usado será selecionado conforme a modalidade de imageamento a ser usada, como anteriormente descrito. A localização do marcador permite a determinação da extensão do câncer. A quantidade do marcador dentro de um órgão ou tecido também permite a determinação da presença ou ausência do câncer naquele órgão ou tecido.

[000195] Similarmente, os aptâmeros podem ser usados para tais métodos diagnósticos por imageamento in vivo. Por exemplo, um aptâmero que foi usado para identificar um biomarcador particular descrito na Tabela 1, Col. 2 (e por isso se liga especificamente àquele biomarcador particular) pode ser apropriadamente marcado e injetado em um indivíduo suspeito em ter o câncer pancreático, detectável de

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79/284 acordo com o biomarcador particular, com o objetivo de diagnosticar ou avaliar o status de câncer pancreático do indivíduo. O marcador usado será selecionado conforme a modalidade de imageamento a ser usada, como anteriormente descrito. A localização do marcador permite a determinação da extensão do câncer. A quantidade do marcador dentro de um órgão ou tecido também permite a determinação da presença ou ausência do câncer naquele órgão ou tecido. Agentes de imageamento direcionados para o aptâmero podem ter características únicas e vantajosas que se relacionam com penetração tecidual, distribuição tecidual, cinética, eliminação, potência, e seletividade quando comparados a outros agentes de imageamento.

[000196] Tais técnicas também podem ser opcionalmente realizadas com oligonucleotídeos marcados, por exemplo, para detecção da expressão gênica por imageamento com oligonucleotídeos antissentido. Estes métodos são usados para hibridização in situ, por exemplo, com moléculas fluorescentes ou radionuclídeos como o marcador. Outros métodos para detecção da expressão gênica incluem, por exemplo, detecção da atividade de um gene repórter.

[000197] Outro tipo geral de tecnologia de imageamento é imageamento ótico, na qual os sinais fluorescentes dentro do indivíduo são detectados por um dispositivo ótico que é externo ao indivíduo. Estes sinais podem ser devido à fluorescência real e/ou à bioluminescência. Melhorias na sensibilidade dos dispositivos de detecção ótica aumentaram a utilidade dos ensaios diagnósticos de imageamento ótico in vivo.

[000198] O uso do imageamento de biomarcador molecular in vivo está aumentando, incluindo para testes clínicos, por exemplo, para medir mais rapidamente a eficácia clínica em testes de novas terapias de câncer e/ou evitar o tratamento prolongado com um placebo daquelas doenças, tais como esclerose múltipla, na qual pode ser

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80/284 considerado que tal tratamento prolongado é eticamente duvidoso. [000199] Para uma revisão de outras técnicas, ver N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009.

Determinação de Valores de Biomarcadores usando Métodos de Histologia/Citologia [000200] Para avaliação de câncer pancreático, uma variedade de amostras de tecido pode ser usada em métodos histológicos ou citológicos. A seleção de amostra depende da posição do tumor primário e os sítios das metástases. Por exemplo, as amostras de tecido (biópsia com fórceps, aspiração com agulha fina (FNA), e/ou citologia por escovado) coletadas no momento da colangiopancreatografia retrógrada endoscópica (ERCP), ou FNA guiada por ultrassom endoscópico (EUS) podem ser usadas para a histologia. Ascite ou lavagens peritoneais ou fluido pancreático podem ser usados para citotologia. Qualquer um dos biomarcadores identificados neste pedido que foram mostrados ser regulados para cima (ver a Tabela 1, Col. 6) nos indivíduos com pancreático podem ser usados para marcar um espécime histológico como uma indicação da doença.

[000201] Em uma modalidade, um ou mais reagentes de captura específicos para os biomarcadores correspondentes são usados em uma avaliação citológica de uma amostra celular pancreática e podem incluir um ou mais dos seguintes: coleta de uma amostra celular, fixação da amostra celular, desidratação, depuração, imobilização da amostra celular em uma lâmina de microscópio, permeabilização da amostra celular, tratamento para recuperação de analito, marcação, desmarcação, lavagem, bloqueio, e reação com um ou mais reagentes de captura em uma solução tamponada. Em outra modalidade, a amostra celular é produzida de um bloco celular.

[000202] Em outra modalidade, um ou mais reagentes de captura específicos para os biomarcadores correspondentes são usados em

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81/284 uma avaliação histológica de uma amostra de tecido pancreático e podem incluir um ou mais dos seguintes: coleta de um espécime de tecido, fixação da amostra de tecido, desidratação, depuração, imobilização da amostra de tecido em uma lâmina de microscópio, permeabilização da amostra de tecido, tratamento para recuperação de analito, marcação, desmarcação, lavagem, bloqueio, reidratação, e reação com reagentes de captura em uma solução tamponada. Em outra modalidade, fixação e desidratação são substituídos por congelamento.

[000203] Em outra modalidade, um ou mais aptâmeros específicos para os biomarcadores correspondentes são reagidos com a amostra histológica ou citológica e podem servir como ácido nucleico alvo em um método de amplificação de ácidos nucleicos. Métodos de amplificação de ácidos nucleicos adequados incluem, por exemplo, PCR, q-beta replicase, amplificação por círculo rolante, remoção de fita, amplificação dependente de helicase, amplificação isotérmica mediada por alça, reação em cadeia de ligase, e restrição e circularização auxiliada por amplificação por círculo rolante.

[000204] Em uma modalidade, um ou mais reagentes de captura específicos para os biomarcadores correspondentes para uso na avaliação histológica ou citológica é misturada em uma solução tamponada que podem incluir qualquer um dos seguintes: materiais de bloqueio, competidores, detergentes, estabilizantes, veículo de ácido nucleico, materiais polianiônicos, etc.

[000205] Um “protocolo de citologia” geralmente inclui coleta de amostra, fixação de amostra, imobilização de amostra e marcação. “Preparação celular” pode incluir várias etapas de processamento após coleta de amostra, incluindo o uso de um ou mais aptâmeros de taxa de dissociação lenta para a marcação das células preparadas.

[000206] A coleta de amostra pode incluir diretamente a colocação da

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82/284 amostra em um recipiente de transporte não tratado, colocação da amostra em um recipiente de transporte contendo algum tipo de meios, ou colocação da amostra diretamente para uma lâmina (imobilização) sem qualquer tratamento ou fixação.

[000207] A imobilização da amostra pode ser melhorada aplicando uma porção do espécime coletado a uma lâmina de vidro que é tratada com polilisina, gelatina, ou um silano. As lâminas podem ser preparadas com o esfregaço de uma camada fina e uniforme de células através da lâmina. Cuidado é geralmente tomado para minimizar torção mecânica e artefatos de secagem. Espécimes líquidos podem ser processados em um método de bloco de células. Ou, alternativamente, os espécimes líquidos podem ser misturados 1:1 com a solução fixadora por aproximadamente 10 minutos à temperatura ambiente.

[000208] Blocos de células podem ser preparados de efusões residuais, saliva, sedimento de urina, fluidos gastrointestinais, raspagem de células, ou aspirados de agulha fina. As células são concentradas ou empacotadas por centrifugação ou filtração de membrana. Diversos métodos para preparação de bloco celular foram desenvolvidos. Procedimentos representativos incluem sedimento fixo, ágar bacteriano, ou métodos de filtração de membrana. No método de sedimento fixo, o sedimento celular é misturado com um fixador como Bouins, ácido pícrico, ou formalina tamponada e em seguida a mistura é centrifugada para precipitar as células fixadas. O sobrenadante é removido, secando o precipitado celular tão completamente quanto possível. O precipitado é coletado e envolvido em papel de lente e em seguida colocado em um cassete de tecido. O cassete de tecido é colocado em um jarro com fixador adicional e processado como uma amostra de tecido. O método de ágar é muito similar mas o precipitado é removido e seco em papel toalha e em seguida cortado na metade. O lado de corte é colocado em uma gota de ágar fundido em uma lâmina

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83/284 de vidro e em seguida o precipitado é recoberto com ágar assegurandose que nenhuma bolha se forme no ágar. Permite-se que o ágar endureça e em seguida qualquer ágar excessivo é cortado. Este é colocado em um cassete de tecido e o processo de tecido completado. Alternativamente, o precipitado pode ser diretamente suspenso em ágar líquido 2% a 65°C e a amostra centrifugada. Permite-se que o precipitado de células em ágar solidifique por uma hora a 4°C. O ágar sólido pode ser removido do tubo da centrífuga e cortado na metade. O ágar é envolvido em papel de filtro e em seguida o cassete de tecido. Processamento deste ponto para a frente é como descrito acima. A centrifugação pode ser substituída em qualquer destes procedimentos com a filtração de membrana. Qualquer um destes processos pode ser usado para gerar uma “amostra de bloco de células”.

[000209] Blocos de células podem ser preparados usando resina especializada incluindo resinas Lowicryl, LR White, LR Gold, Unicryl e MonoStep. Estas resinas têm baixa viscosidade e podem ser polimerizadas em temperaturas baixas e com luz ultravioleta (UV). O processo de incorporação depende progressivamente do resfriamento da amostra durante a desidratação, transferindo a amostra para a resina, e polimerização de um bloco em baixa temperatura final no comprimento de onda de UV apropriado.

[000210] Seções de bloco de células podem ser marcadas com hematoxilina-eosina para o exame citomorfológico enquanto seções adicionais são usadas para o exame de marcadores específicos.

[000211] Se o processo for citológico ou histológico, a amostra pode ser fixada antes de processamento adicional para prevenir a degradação de amostra. Este processo é chamado “fixação” e descreve uma ampla faixa de materiais e procedimentos que podem ser usados intercambiavelmente. O protocolo e reagentes de fixação de amostra são melhor selecionados empiricamente baseados nos alvos a serem

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84/284 detectados e tipo de célula/tecido específico a serem analisados. A fixação de amostra depende de reagentes, tais como etanol, polietilenoglicol, metanol, formalina ou isopropanol. As amostras devem ser fixadas em seguida após coleta e afixação à lâmina o mais rapidamente possível. Entretanto, o fixador selecionado pode introduzir modificações estruturais em vários alvos moleculares que tornam sua detecção subsequente mais difícil. Os processos de fixação e imobilização e sua sequência podem modificar a aparência da célula e estas modificações devem ser esperadas e reconhecidas pelo citotecnologista. Fixadores podem causar a diminuição de certos tipos celulares e fazer com que o citoplasma pareça granular ou reticular. Muitos fixadores funcionam interligando componentes celulares. Isto pode danificar ou modificar epítopos específicos, gerar novos epítopos, provocar associações moleculares, e reduzir a permeabilidade de membrana. Fixação com formalina é uma das abordagens citológicas/histológicas mais comuns. A formalina forma pontes de metila entre proteínas vizinhas ou dentro de proteínas. Precipitação ou coagulação também são usadas para fixação e etanol é frequentemente usado neste tipo de fixação. Uma combinação de reticulação e precipitação também pode ser usada para fixação. Um processo de fixação forte é o melhor na conservação de informação morfológica enquanto um processo de fixação mais fraca é o melhor para a preservação alvos moleculares.

[000212] Um fixador representativo é etanol absoluto 50%, polietilenoglicol 2 mM (PEG), formaldeído 1,85%. Variações nesta formulação incluem etanol (50% a 95%), metanol (20% a 50%), e formalina (formaldeído) somente. Outro fixador comum é PEG 1500 2%, etanol 50% e metanol 3%. As lâminas são colocadas no fixador por aproximadamente 10 a 15 minutos à temperatura ambiente e em seguida removidas e permitidas secar. Uma vez que as lâminas são

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85/284 fixadas, podem ser enxaguadas com uma solução tamponada como PBS.

[000213] Uma ampla faixa de corantes pode ser usada para destacar diferencialmente e contrastar ou “marcar” atributos celulares, subcelulares e teciduais ou estruturas morfológicas. Hematoxilina é usada para marcar núcleos com uma cor azul ou preta. Laranja G-6 e Eosina Azur ambas marcam o citoplasma da célula. Laranja G marca de amarelo células contendo queratina e glicogênio. Eosina Y é usada para marcar nucléolos, cílios, células sanguíneas vermelhas, e células escamosas epiteliais superficiais. Marcadores Romanowsky são usados para lâminas secas no ar e são úteis em aumento de pleomorfismo e distinção extracelular do material intracitoplasmático.

[000214] O processo de marcação pode incluir um tratamento para aumentar a permeabilidade das células à marcação. O tratamento das células com um detergente pode ser usado para aumentar a permeabilidade. Para aumentar a célula e a permeabilidade de tecido, as amostras fixadas podem ser ainda tratadas com solventes, saponinas, ou detergentes não iônicos. Digestão enzimática também pode melhorar a aceitabilidade de alvos específicos em uma amostra de tecido.

[000215] Após marcação, a amostra é desidratada usando uma sucessão de enxagues de álcool com a concentração de álcool crescente. A lavagem final é feita com xileno ou um substituto de xileno, tal como um terpeno de cítricos, que tem um índice refrativo próximo daquele da lamínula a ser aplicada à lâmina. Esta etapa final é referida como clarificação. Uma vez que a amostra é desidratada e clarificada, um meio de montagem é aplicado. O meio de montagem é selecionado para ter um índice refrativo próximo do vidro e é capaz de ligação da lamínula à lâmina. Também inibirá secagem adicional, encolhimento, ou desbotamento da amostra celular.

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86/284 [000216] Apesar dos marcadores ou processamento usado, a avaliação final do espécime citológico pancreático é feita por algum tipo de microscopia para permitir uma inspeção visual da morfologia e uma determinação da presença ou ausência do marcador. Métodos microscópicos exemplares incluem de campo claro, contraste de fase, fluorescência e contraste de interferência diferencial.

[000217] Se testes secundários forem necessários na amostra após o exame, a lamínula pode ser removida e a lâmina desmarcada. Desmarcação envolve a utilização dos sistemas de solventes originais usados na marcação da lâmina originalmente sem o corante adicionado e em uma ordem reversa para o procedimento de marcação original. Desmarcação também pode ser completada embebendo a lâmina em um álcool ácido até que as células estejam sem cor. Uma vez sem cor, as lâminas são bem enxaguadas em um banho de água e o segundo procedimento de marcação aplicado.

[000218] Além disso, a diferenciação molecular específica pode ser possível em conjunto com a análise morfológica celular pelo uso de reagentes moleculares específicos, tais como anticorpos ou sondas de ácidos nucleicos ou aptâmeros. Isto melhora a exatidão da citologia diagnóstica. Microdissecação pode ser usada para isolar um subconjunto de células para avaliação adicional, especialmente, da avaliação genética de cromossomos anormais, expressão gênica ou mutações.

[000219] A preparação de uma amostra de tecido para avaliação histológica envolve fixação, desidratação, infiltração, incorporação e secionamento. Os reagentes de fixação usados em histologia são muito similares ou idênticos aos usados na citologia e têm os mesmos problemas de conservar atributos morfológicos em detrimento dos moleculares, tais como proteínas individuais. O tempo pode ser poupado se a amostra de tecido não for fixada e desidratada mas ao

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87/284 invés disso for congelada e em seguida seccionada enquanto congelada. Este é um procedimento de processamento mais suave e pode conservar mais marcadores individuais. Entretanto, o congelamento não é aceitável para o armazenamento de longo prazo de uma amostra de tecido já que informação subcelular é perdida devido à introdução de cristais de gelo. O gelo na amostra de tecido congelada também impede o processo de secionamento de produzir uma fatia muito fina e dessa forma alguma resolução microscópica e imageamento de estruturas subcelulares podem ser perdidos. Além da fixação com formalina, tetróxido de ósmio é usado para fixar e marcar fosfolipídeos (membranas).

[000220] A desidratação de tecidos é realizada com sucessivas lavagens de concentração crescente de álcool. A clarificação emprega um material que é miscível com álcool e o material incorporado e envolve um processo gradual iniciando em álcool:reagente de clarificação 50:50 e em seguida 100% agente de clarificação (xileno ou substituto de xileno). A infiltração envolve a incubação do tecido com uma forma líquida do agente incorporador (cera quente, solução de nitrocelulose) primeiro em agente incorporador:agente de clarificação 50:50 e agente incorporador 100%. A incorporação é completada colocando o tecido em um molde ou cassete e preenchendo com o agente incorporador fundido, tal como cera, ágar ou gelatina. Permitese que o agente incorporador endureça. A amostra de tecido endurecida então pode ser cortada em seção fina para marcação e exame subsequente.

[000221] Antes da marcação, a seção de tecido é desparafinada e reidratada. Xileno é usado para desparafinar a seção, uma ou mais modificações do xileno podem ser usadas, e o tecido é reidratado por sucessivas lavagens em álcool de concentração decrescente. Antes de desparafinar, a seção de tecido pode ser imobilizada por calor a uma

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88/284 lâmina de vidro a aproximadamente 80°C por aproximadamente 20 minutos.

[000222] A microdissecação de captura a laser permite o isolamento de um subconjunto de células para análise adicional de uma seção de tecido.

[000223] Como na citologia, para aumentar o imageamento dos atributos microscópicos, a seção ou fatia de tecido podem ser marcadas com uma variedade de marcadores. Uma grande lista de marcadores comercialmente disponíveis pode ser usada para potencializar ou identificar atributos específicos.

[000224] Para aumentar mais a interação de reagentes moleculares com amostras citológicas/histológicas, diversas técnicas para “recuperação de analito” foram desenvolvidas. A primeira tal técnica usa o aquecimento de alta temperatura de uma amostra fixada. Este método também é referido como recuperação de epítopo induzida por calor ou HIER. Uma variedade de técnicas de aquecimento foi usada, incluindo aquecimento a vapor, micro-ondas, autoclavagem, banhos de água, e cozimento sob pressão ou uma combinação destes métodos de aquecimento. As soluções de recuperação de analito incluem, por exemplo, água, citrato e tampões salinos normais. A chave para a recuperação de analito é o tempo em alta temperatura mas temperaturas mais baixas com tempos mais longos também foram usadas com sucesso. Outra chave para a recuperação de analito é o pH da solução de aquecimento. O pH baixo foi descoberto fornecer melhor imunomarcação mas também dá origem a valores de fundo que frequentemente requerem o uso de uma segunda seção de tecido como um controle negativo. O benefício mais consistente (imunomarcação aumentada sem aumento no valor de fundo) é geralmente obtido com uma solução de alto pH apesar da composição dos tampões. O processo de recuperação de analito de um alvo específico é

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89/284 empiricamente otimizado para o alvo usando calor, tempo, pH e composição dos tampões como variáveis para otimização de processo. Usar o método de recuperação de analito com micro-ondas permite marcação sequencial de alvos diferentes com reagentes de anticorpo. Mas também foi mostrado que o tempo necessário para atingir complexos anticorpo e enzima entre as etapas marcação degradou os analitos de membrana celular. Os métodos de aquecimento com microondas melhoraram métodos de hibridização in situ também.

[000225] Para iniciar o processo de recuperação de analito, a seção é primeiro desparafinada e hidratada. A lâmina então é colocada no tampão de citrato de sódio 10 mM pH 6,0 em uma placa ou jarra. Um procedimento representativo usa um micro-ondas 1100W e a lâmina é submetida a micro-ondas em potência de 100% por 2 minutos seguidos por submissão das lâminas a micro-ondas usando potência de 20% por 18 minutos após verificar estar seguro que a lâmina permanece recoberta no líquido. A lâmina então é permitida resfriar no recipiente descoberto e em seguida enxaguada com água destilada. HIER pode ser usada em combinação com digestão enzimática para melhorar a reatividade do alvo a reagentes imunoquímicos.

[000226] Tal protocolo de digestão enzimática usa proteinase K. Uma concentração 20 g/ml de proteinase K é preparada em Tris Base 50 mM, EDTA 1 mM, Triton X-100 0,5%, tampão pH 8,0. O processo primeiro envolve seções de desparafinização em 2 modificações do xileno, 5 minutos cada uma. Então a amostra é hidratada em 2 modificações de etanol 100% por 3 minutos cada uma, etanol 95% e 80% por 1 minuto cada uma, e em seguida enxaguada em água destilada. As seções são recobertas com solução de trabalho de Proteinase K e incubadas 10 a 20 minutos a 37°C em câmara umedecida (o tempo ótimo de incubação pode variar dependendo de tipo de tecido e grau de fixação). As seções são resfriadas à temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida

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90/284 enxaguadas em PBS Tween 20 por 2x2 min. Se desejado, as seções podem ser bloqueadas para eliminar a interferência potencial de compostos endógenos e enzimas. A seção então é incubada com o anticorpo primário em diluição apropriada no tampão de diluição de anticorpo primário por 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. A seção então é enxaguada com PBS Tween 20 por 2x2 min. Bloqueio adicional pode ser realizado, se necessário para aplicação específica, seguido pelo enxague adicional com PBS Tween 20 por 3x2 min e em seguida finalmente o protocolo de imunomarcação completo. [000227] Um tratamento simples com SDS 1% à temperatura ambiente também foi demonstrado melhorar a marcação imunohistoquímica. Métodos de recuperação de analito foram aplicados para fazer seções montadas em lâmina bem como seções de livre flutuação. Outra opção de tratamento é colocar a lâmina em uma jarra contendo ácido cítrico e Nonident P40 0,1 em pH 6,0 e aquecimento a 95°C. A lâmina então é lavada com uma solução de tampões como PBS. [000228] Para marcação imunológica de tecidos pode ser útil bloquear a associação não específica do anticorpo com proteínas de tecido imergindo a seção em uma solução proteica como soro ou leite em pó desnatado.

[000229] O bloqueio de reações pode incluir a necessidade de reduzir o nível de biotina endógena; eliminar os efeitos de carga endógena; inativar as nucleases endógenas; e/ou inativar enzimas endógenas como peroxidase e fosfatase alcalina. Nucleases endógenas podem ser inativadas pela degradação com proteinase K, por tratamento de calor, uso de um agente quelante, tal como EDTA ou EGTA, a introdução de DNA ou RNA carreador, tratamento com um caótropo, tal como ureia, tioureia, hidrocloreto de guanidina, tiocianato de guanidina, perclorato de lítio, etc., ou dietil pirocarbonato. Fosfatase alcalina pode ser inativada por tratamento com HCl 0,1 N por 5 minutos à temperatura

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91/284 ambiente ou tratamento com levamisol 1 mM. Atividade de peroxidase pode ser eliminada pelo tratamento com peróxido de hidrogênio 0,03%. Biotina endógena pode ser bloqueada imergindo a lâmina ou seção em uma solução de avidina (estreptavidina, neutravidina pode ser substituída) por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. A lâmina ou seção então são lavadas por pelo menos 10 minutos no tampão. Isto deve ser repetido pelo menos três vezes. Então a lâmina ou seção são embebidas em uma solução de biotina por 10 minutos. Isto pode ser repetido pelo menos três vezes com uma solução de biotina fresca cada vez. O procedimento de lavagem de tampão é repetido. Os protocolos de bloqueio devem ser minimizados para prevenir danificar a estrutura da célula ou tecido ou o alvo ou alvos de interesse mas um ou mais destes protocolos podem ser combinados para “bloquear” uma lâmina ou seção antes da reação com um ou mais aptâmeros de taxa de dissociação lenta. Ver Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, autorado por Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998.

Determinação de Valores de Biomarcadores usando Métodos de Espectrometria de Massa [000230] Uma variedade de configurações dos espectrômetros de massa pode ser usada para detectar valores de biomarcadores. Vários tipos de espectrômetros de massa estão disponíveis ou podem ser produzidos com várias configurações. Em geral, um espectrômetro de massa tem os seguintes componentes principais: uma entrada de amostra, uma fonte iônica, um analisador de massa, um detector, um sistema de vácuo, e sistema de controle do instrumento, e um sistema de dados. A diferença na entrada de amostra, fonte iônica, e analisador de massa geralmente define tipo do instrumento e suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cromatografia líquida em coluna capilar ou pode ser uma sonda ou estágio diretos tal como

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92/284 usados na dessorção a laser assistida por matriz. Fontes iônicas comuns são, por exemplo, eletropulverização, incluindo nanopulverização e micropulverização ou dessorção a laser assistida por matriz. Analisadores de massa comuns incluem um filtro de massa quadrupolo, analisador de massa por captura de íons e analisador de massa por tempo de voo. Métodos de espectrometria de massa adicionais são bem conhecidos na técnica (ver Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter e Sherman, New York (2000)).

[000231] Valores de biomarcador e biomarcadores de proteína podem ser detectados e medidos por qualquer um dos seguintes: espectrometria de massa por ionização por eletropulverização (ESIMS), ESI-MS/MS, ESI-MS / (MS)n, espectrometria de massa por tempo de voo de ionização de dessorção a laser assistida por matriz (MALDITOF-MS), espectrometria de massa por tempo de voo de dessorção/ionização a laser aumentada por superfície (SELDI-TOFMS), dessorção/ionização em silício (DIOS), espectrometria de massa iônica secundária (SIMS), tempo do voo quadrupolo (Q-TOF), tecnologia tempo do voo de tandem (TOF/TOF), chamada ultraflex III TOF/TOF, espectrometria de massa de ionização química à pressão atmosférica (APCI-MS), APCI-MS/MS, APCI-(MS)N, espectrometria de massa por fotoionização à pressão atmosférica (APPI-MS), APPIMS/MS, e APPI-(MS)N, espectrometria de massa quadrupolo, espectrometria de massa com transformada de Fourier (FTMS), espectrometria de massa quantitativa, e espectrometria de massa de captura de íons.

[000232] Estratégias de preparação de amostra são usadas para marcar e enriquecer amostras antes da caracterização espectroscópica de massa de biomarcadores proteicos e valores de biomarcadores de determinação. Os métodos de marcação incluem mas não são limitados à marcação isobárica para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) e

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93/284 marcação de isótopo estável com aminoácidos na cultura celular (SILAC). Os reagentes de captura usados para enriquecer seletivamente amostras de proteínas de biomarcador de candidato antes da análise espectroscópica de massa incluem mas não são limitados a aptâmeros, anticorpos, sondas de ácidos nucleicos, quimeras, pequenas moléculas, um fragmento F(ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia única, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação a ligante, affycorpos, nanocorpos, anquirinas, anticorpos de domínio, estruturas de anticorpo alternativas (por exemplo, diacorpos etc.) polímeros impressos, avímeros, peptideomiméticos, peptoides, ácidos nucleicos peptídicos, ácido nucleico de treose, um receptor hormonal, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.

Determinação de Valores de Biomarcadores usando um Ensaio de Ligação de Proximidade [000233] Um ensaio de ligação de proximidade pode ser usado para determinar valores de biomarcadores. Resumidamente, uma amostra teste é contatada com um par de sondas de afinidade que podem ser um par de anticorpos ou um par de aptâmeros, com cada membro do par estendido com um oligonucleotídeo. Os alvos do par de sondas de afinidade podem ser dois determinantes distintos em uma proteína ou um determinante em cada uma de duas proteínas diferentes, que podem existir como complexos homo- ou heteromultiméricos. Quando as sondas se ligam aos determinantes alvo, as extremidades livres das extensões de oligonucleotídeo são trazidas em proximidade suficientemente maior para hibridizar em conjunto. A hibridização das extensões de oligonucleotídeo é facilitada por um oligonucleotídeo conector comum que serve como ponte em conjunto às extensões de oligonucleotídeo quando são posicionados em proximidade suficiente.

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Uma vez que as extensões de oligonucleotídeo das sondas são hibridizadas, as extremidades das extensões são unidas pela ligação de DNA enzimática.

[000234] Cada extensão de oligonucleotídeo compreende um sítio de iniciador para amplificação por PCR. Uma vez que as extensões de oligonucleotídeo são ligadas em conjunto, os oligonucleotídeos formam uma sequência de DNA contínua que, pela amplificação por PCR, revela informação quanto à identidade e quantidade da proteína alvo, bem como, informação quanto a interações proteína-proteína onde os determinantes alvo estão em duas proteínas diferentes. A ligação de proximidade pode fornecer um ensaio altamente sensível e específico de concentração proteica em tempo real e informação sobre interação pelo uso de PCR em tempo real. As sondas que não se ligam aos determinantes de interesse não têm as extensões de oligonucleotídeo correspondentes trazidas para proximidade e nenhuma ligação ou amplificação por PCR pode prosseguir, não resultando em nenhum sinal sendo produzido.

[000235] Os ensaios precedentes permitem a detecção de valores de biomarcadores que são úteis em métodos para diagnosticar o câncer pancreático, onde os métodos compreendem a detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, de pelo menos N valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador selecionado a partir do grupo consistindo dos biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação, como descrita detalhadamente abaixo, usando os valores de biomarcadores, indica se o indivíduo tem câncer pancreático. Embora alguns biomarcadores de câncer pancreático descritos sejam úteis sozinhos para detecção e diagnóstico de câncer pancreático, métodos também são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer pancreático que são cada um útil como um

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95/284 painel de três ou mais biomarcadores. Dessa forma, várias modalidades do pedido de patente imediato fornecem combinações compreendendo N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-65 biomarcadores. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de qualquer uma das faixas acima descritas, bem como faixas de ordem similar, mas mais altas. Conforme qualquer um dos métodos descritos neste pedido, os valores de biomarcadores podem ser detectados e classificados individualmente ou podem ser detectados e classificados coletivamente, como, por exemplo, em um formato de ensaio múltiplo.

[000236] Em outro aspecto, métodos são fornecidos para detecção de uma ausência de câncer pancreático, os métodos compreendendo detecção, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos N valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um biomarcador selecionado a partir do grupo consistindo dos biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, em que uma classificação, como descrito detalhadamente abaixo, dos valores de biomarcadores indica uma ausência de câncer pancreático no indivíduo. Enquanto alguns biomarcadores de câncer pancreático descritos são úteis sozinhos para detectar e diagnosticar a ausência do câncer pancreático, métodos também são descritos neste pedido para o agrupamento de múltiplos subconjuntos dos biomarcadores de câncer pancreático que são cada um útil como um painel de três ou mais biomarcadores. Dessa forma, várias modalidades do pedido de patente imediato fornecem combinações que compreendem N biomarcadores, em que N é pelo menos três biomarcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-65 biomarcadores. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de alguma das faixas acima descritas, bem como faixas de ordem similar,

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96/284 mas mais altas. Conforme qualquer um dos métodos descritos neste pedido, os valores de biomarcadores podem ser detectados e classificados individualmente ou podem ser detectados e classificados coletivamente, como, por exemplo, em um formato de ensaio múltiplo. Classificação de Biomarcadores e Cálculo de Escores de Doença [000237] Um biomarcador “assinatura” de um dado teste diagnóstico contém o grupo de marcadores, cada marcador tendo níveis diferentes nas populações de interesse. Níveis diferentes, neste contexto, podem referir-se a meios diferentes dos níveis de marcador dos indivíduos em dois ou mais grupos, ou variações diferentes em dois ou mais grupos, ou uma combinação de ambos. Para a forma mais simples de um teste diagnóstico, estes marcadores podem ser usados para destinar uma amostra desconhecida de um indivíduo em um de dois grupos, doentes ou não doentes. A atribuição de uma amostra em um de dois ou mais grupos é conhecida como classificação, e o procedimento usado para realizar esta nomeação é conhecido como um classificador ou um método de classificação. Os métodos de classificação também podem ser referidos como métodos de classificação. Há muitos métodos de classificação que podem ser usados para construir um classificador diagnóstico do grupo de valores de biomarcadores. Em geral, os métodos de classificação são mais facilmente realizados usando técnicas de aprendizagem supervisadas onde um conjunto de dados é coletado usando amostras obtidas de indivíduos dentro de dois (ou mais, para múltiplos estados de classificação) grupos distintos que se deseja distinguir. Uma vez que a classe (grupo ou população) ao qual cada amostra pertence é conhecida com antecedência por cada amostra, o método de classificação pode ser treinado para dar a resposta de classificação desejada. É também possível usar técnicas de aprendizagem não supervisadas para produzir um classificador diagnóstico.

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97/284 [000238] Abordagens comuns para desenvolver classificadores diagnósticos incluem árvores de decisão; bagging, boosting, florestas e florestas randômicas; a aprendizagem baseada em regra de inferência; Parzen Windows; modelos lineares; logística; métodos de redes neurais; agrupamento não supervisado; meios K;

ascendente/descendente hierárquico; aprendizagem semi-supervisada; métodos de protótipo; vizinhança mais próxima; estimativa de densidade central; máquinas de vetor de suporte; modelos de Markov ocultos; Aprendizagem de Boltzmann; e os classificadores podem ser combinados simplesmente ou de modo que minimizem funções objetivas particulares. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pattern Classification, R.O. Duda, et al., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editores, Springer Science +Business Media, LLC, 2a edição, 2009; cada um dos quais é incorporado por referência em sua totalidade.

[000239] Para produzir um classificador usando técnicas de aprendizagem supervisada, um conjunto de amostras chamado dados de treinamento é obtido. No contexto de testes diagnósticos, os dados de treinamento incluem amostras dos grupos distintos (classes) às quais as amostras desconhecidas serão depois atribuídas. Por exemplo, as amostras coletadas de indivíduos em uma população controle e indivíduos em uma população particular de doença podem constituir dados de treinamento para desenvolver um classificador que pode classificar amostras desconhecidas (ou, mais particularmente, os indivíduos de que as amostras foram obtidas) como tendo a doença ou sendo livre da doença. O desenvolvimento do classificador dos dados de treinamento é conhecido como treinamento do classificador. Detalhes específicos em treinamento do classificador dependem na natureza da técnica de aprendizagem supervisada. Para fins de

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98/284 ilustração, um exemplo do treinamento de um classificador naive Bayesiano será descrito abaixo (ver, por exemplo, Pattern Classification, R.O. Duda, et al. editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al., editores, Springer Science +Business Media, LLC, 2a edição, 2009).

[000240] Desde então tipicamente há muitos mais valores de biomarcadores potenciais do que amostras em um conjunto de treinamento, cuidado deve ser tomado para evitar sobreajustamento. Sobreajustamento ocorre quando um modelo estatístico descreve erro randômico ou ruído em vez da relação subjacente. Sobreajustamento pode ser evitado por uma variedade de formas, incluindo, por exemplo, limitando o número de marcadores usados no desenvolvimento do classificador, supondo que as respostas de marcador sejam independentes um do outro, limitando a complexidade do modelo estatístico subjacente empregado, e assegurando que o modelo estatístico subjacente se conforma com os dados.

[000241] Um exemplo ilustrativo do desenvolvimento de um teste diagnóstico usando grupo de biomarcadores inclui a aplicação de um classificador naive Bayes, um classificador probabilístico simples baseado no teorema de Bayes com tratamento independente estrito dos biomarcadores. Cada biomarcador é descrito por uma função de densidade de probabilidade dependente de classe (pdf) para os valores de RFU medidos ou valores de log de RFU (unidades de fluorescência relativa) em cada classe. Supõe-se que pdfs juntos para o conjunto de marcadores em uma classe seja o produto de pdfs dependente da classe individual de cada biomarcador. O treinamento de um classificador naive Bayes neste contexto para atingir a atribuição de parâmetros (“configuração”) para caracterizar pdfs dependentes de classe. Qualquer modelo subjacente de pdfs dependentes de classe

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99/284 pode ser usado, mas o modelo deve geralmente conformar-se com os dados observados no conjunto de treinamento.

[000242] Especificamente, a probabilidade dependente da classe de medir um valor x_; para o biomarcador / na classe de doença é escrita como p(Xi\d) e a probabilidade de naive Bayes total de observação de n marcadores com valores ---^) _são escritos como = ΠΓ₌ιρ(^|(ί) ...... ~ . ..

onde 0 indivíduo x_;s sao os níveis de biomarcadores medidos em RFU ou em log de RFU. A atribuição de classificação já que um desconhecido é facilitado calculando a probabilidade de ser doente tendo medido em comparação com a probabilidade de ser livre de doença (controle) para os mesmos valores medidos. A proporção desta probabilidade é computada de pdfs dependentes da classe por aplicação de teorema Bayes, isto é,

7-ΧΦ) p(x\d)p(d)

7·φ|φ1 — p(d)) onde p(d) é a prevalência da doença na população apropriada para 0 teste. Tomando 0 logaritmo de ambos os lados desta proporção e substituição da probabilidade de naive Bayes dependente da classe acima fornece

φ) = Ê 44Φ + ln (-φ)

7>(φ)/ _i=í \p(xi\c) J /Φ)/. Essa forma é conhecida como a proporção de probabilidade de log e simplesmente afirma que a probabilidade de log de ser livre da doença particular vs ter a doença e é principalmente composto da soma das proporções de probabilidade de log individuais dos biomarcadores individuais n. Na sua forma mais simples, uma amostra desconhecida (ou, mais particularmente, 0 indivíduo de que a amostra foi obtida) é classificada como sendo sem doença se a proporção acima é maior do que zero e tendo a doença se a proporção for menor do que zero.

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100/284 [000243] Em uma modalidade exemplar, pdfs de biomarcador dependente de classe p(Xi|c) e p(x,|d) são assumidos ser distribuições normais ou log normais nos valores de RFU medidos Xi, isto é, / . I \ 1 í (^í \

PvW ^{— e3}P I 9 2 I «...

72^ v 2v_r.i _{com uma} expressão similar para com e. Parameterização do modelo requer a estimativa de dois parâmetros de cada pdf dependente de classe, uma média μ e uma variância o², dos dados de treinamento. Isto pode ser realizado de diversos modos, incluindo, por exemplo, por estimativas de probabilidade máximas, por menos-quadrados, e por algum outros métodos conhecidos por um versado na técnica. Substituir as distribuições normais para e em a proporção de probabilidade do log definida acima fornece a seguinte _{„ (Ϊφ Ί = <> téô -1 £ ί(^Χ1~'·/γ - ₊ f Ί expressão:

[000244] Uma vez que o grupo de ps e o²s foram definidos para cada pdf em cada classe dos dados de treinamento e a prevalência de doença na população é especificada, o classificador Bayes é totalmente determinado e pode ser usado para classificar amostras desconhecidas com valores medidos x.

[000245] O desempenho do classificador naive Bayes depende do número e qualidade dos biomarcadores usados para construir e treinar o classificador. Um biomarcador único executará conforme sua distância KS (Kolmogorov-Smirnov), como definido no Exemplo 3, abaixo. Se um desempenho de classificador métrico é definido como a área sob a curva característica (AUC) de operador de receptor, um classificador perfeito terá um escore de 1 e um classificador randômico, em média, terá um escore de 0,5. A definição da distância KS entre dois conjuntos A e B de tamanhos n e m é o valor, D_n,_m = sup_x\FA,n(x) Fe,m(x)\, que é a maior diferença entre duas funções de distribuição cumulativas empíricas (cdf). A cdf empírica para um conjunto A de n

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observações X é definido como ^{) n}§^Ix'~ onde Ixí<_x é a função de indicador que é igual a 1 se Xi<x e for de outra maneira igual a 0. Por definição, este valor é limitado entre 0 e 1, onde uma distância KS de 1 indica que as distribuições empíricas não ficam sobrepostas.

[000246] A adição de marcadores subsequentes com boas distâncias KS (> 0,3, por exemplo) melhorará, em geral, o desempenho de classificação se os marcadores posteriormente adicionados forem independentes do primeiro marcador. Usando a sensibilidade mais especificidade como um escore de classificador, é fácil gerar muitos altos classificadores de marcação com uma variação de um algoritmo ganancioso. (Um algoritmo ganancioso é qualquer algoritmo que segue o problema resolvendo meta-heurístico de fazer a escolha localmente ótima em cada estágio com esperança de encontrar a condição favorável global.) [000247] A abordagem de algoritmo usada aqui é descrita detalhadamente no Exemplo 4. Resumidamente, todos os classificadores de analito únicos são gerados de um arranjo de biomarcadores potenciais e adicionados a uma lista. Depois, todas as adições possíveis de um segundo analito a cada um dos classificadores de analito único armazenados então são realizadas, salvando um número predeterminado dos melhores pares de marcação, digamos, por exemplo, mil, em uma nova lista. Os três classificadores de marcador possíveis são explorados usando esta nova lista dos melhores classificadores de dois marcadores, novamente salvando mil melhor destes. Este processo continua até o escore estabilizar ou começar a deteriorar-se quando os marcadores adicionais são adicionados. Aqueles classificadores de alta marcação que permanecem após convergência podem ser avaliados para o desempenho desejado de um uso desejado. Por exemplo, em uma aplicação diagnostica, os classificadores com uma alta sensibilidade e especificidade modesta

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102/284 podem ser mais desejáveis do que sensibilidade modesta e alta especificidade. Em outra aplicação diagnostica, os classificadores com uma alta especificidade e uma sensibilidade modesta podem ser mais desejáveis. O nível desejado do desempenho é geralmente selecionado baseado em uma escolha que deve ser feita entre o número de falsospositivos e falsos-negativos que podem ser cada um tolerados para a aplicação diagnóstica particular. Tais escolhas geralmente dependem das consequências médicas de um erro, falso-positivo e falso-negativo. [000248] Várias outras técnicas são conhecidas na técnica e podem ser empregadas para gerar muitos classificadores potenciais de uma lista de biomarcadores usando um classificador naive Bayes. Em uma modalidade, o que é mencionado como um algoritmo genético pode ser usado para combinar marcadores diferentes usando o escore de aptidão como definido acima. Os algoritmos genéticos são particularmente bem ajustados à exploração de uma grande população diversa de classificadores potenciais. Em outra modalidade, a chamada otimização por colônia de formigas pode ser usada para gerar conjuntos de classificadores. Outras estratégias que são conhecidas na técnica também podem ser empregadas, incluindo, por exemplo, outras estratégias evolutivas bem como anelamento simulado e outros métodos de pesquisa estocásticos. Métodos meta-heurísticos, tais como, por exemplo, pesquisa de harmonia também pode ser empregada.

[000249] Modalidades exemplares usam qualquer quantidade dos biomarcadores de câncer pancreático listados na Tabela 1, Col. 2 em várias combinações para produzir testes diagnósticos para detecção de câncer pancreático (ver o Exemplo 2 para uma descrição detalhada de como estes biomarcadores foram identificados). Em uma modalidade, um método para diagnosticar o câncer pancreático usa um método de classificação naive Bayes em conjunto com qualquer quantidade dos

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103/284 biomarcadores de câncer pancreático listados na Tabela 1, Col. 2. Em um exemplo ilustrativo (Exemplo 3), o teste mais simples de detecção de câncer pancreático de uma população de GI e controles normais pode ser construído usando um biomarcador único, por exemplo, CTSB que é diferencialmente expresso no câncer pancreático com uma distância KS de 0,52. Usando os parâmetros, pcj, Ocj, pa.i e Qd.i para CTSB da Tabela 16 e a equação da probabilidade de log descrita acima, um teste diagnóstico com uma AUC de 0,79 pode ser derivado, ver a Tabela 15. A curva ROC deste teste é exibida na Figura 2.

[000250] A adição do biomarcador C5a, por exemplo, com uma distância KS de 0,40, significativamente melhora o desempenho de classificador para uma AUC de 0,85. Observar que o escore de um classificador construído de dois biomarcadores não é uma soma simples das distâncias KS; as distâncias KS não são aditivas combinando biomarcadores e é necessário muitos marcadores mais fracos para alcançar o mesmo nível do desempenho que um marcador forte. Adicionando um terceiro marcador, C5, por exemplo, potencializa o desempenho de classificador a uma AUC de 0,88. Biomarcadores adicionais adicionados, tais como, por exemplo, CCL18, CSF1R, KLK7, ETHE1, C5-C6, KLK8, e VEGFA, produzem uma série de testes de câncer pancreático resumidos na Tabela 15 e exibida como uma série de curvas ROC na Figura 3. O escore dos classificadores como uma função do número de analitos usados na construção de classificador é exibido na Figura 4. A AUC deste classificador de dez marcadores exemplar é 0,91.

[000251] Os marcadores listados na Tabela 1, Col. 2 podem ser combinados de muitos modos para produzir classificadores para diagnosticar o câncer pancreático. Em algumas modalidades, os painéis de biomarcadores são compreendidos de números diferentes de analitos dependendo de um critério de desempenho diagnóstico

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104/284 específico que é selecionado. Por exemplo, certas combinações de biomarcadores produzirão testes que são mais sensíveis (ou mais específicos) do que outras combinações.

[000252] Uma vez que um painel é definido para incluir um conjunto particular de biomarcadores da Tabela 1, Col. 2 e um classificador é construído do grupo de dados de treinamento, a definição do teste diagnóstico é completa. Em uma modalidade, o procedimento usado para classificar uma amostra desconhecida é delineado na Figura 1A. Em outra modalidade o procedimento usado para classificar uma amostra desconhecida é delineado na Figura 1B. A amostra biológica é apropriadamente diluída e em seguida corrida em um ou mais ensaios para produzir os níveis de biomarcadores quantitativos relevantes usados para a classificação. Os níveis de biomarcadores medidos são usados como entrada para o método de classificação que introduzem uma classificação e um escore opcional da amostra que reflete a confiança da nomeação de classe.

[000253] A Tabela 1 identifica 65 biomarcadores que são úteis para diagnosticar o câncer pancreático. Isto é um número surpreendentemente maior do que esperado quando comparado com o que é tipicamente encontrado durante os esforços de descoberta de biomarcadores e pode ser atribuível à escala do estudo descrito, que englobou mais de 800 proteínas medidas em centenas de amostras individuais, em alguns casos em concentrações na faixa baixa de femtomolar. Presumivelmente, os escores de biomarcadores descobertos refletem as diversas vias bioquímicas envolvidas tanto na biologia tumoral como na resposta do corpo à presença do tumor; cada via e processo envolve muitas proteínas. Os resultados mostram que nenhuma proteína única de um pequeno grupo de proteínas é unicamente informativa sobre tais processos complexos; ao invés disso, que múltiplas proteínas estão envolvidas em processos relevantes, tais

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105/284 como apoptose ou reparo de matriz extracelular, por exemplo.

[000254] Considerando os numerosos biomarcadores identificados durante o estudo descrito, seria esperado ser capaz de derivar grandes números de classificadores de alta performance que podem ser usados em vários métodos diagnósticos. Para testar esta noção, dezenas de milhares de classificadores foram avaliadas usando os biomarcadores na Tabela 1. Como descrito no Exemplo 4, muitos subconjuntos dos biomarcadores apresentados na Tabela 1 podem ser combinados para gerar classificadores úteis. Por meio de exemplo, descrições são fornecidas para classificadores contendo 1,2 e 3 biomarcadores para detecção de câncer pancreático. Como descrito no Exemplo 4, todos os classificadores que foram construídos usando os biomarcadores na Tabela 1 têm performance distintamente melhor do que classificadores que foram construídos usando “não marcadores”.

[000255] O desempenho de classificadores obtidos por exclusão randômica de alguns marcadores na Tabela 1, que resultou em menores subconjuntos para construir os classificadores, também foi testado. Como descrito no Exemplo 4, Parte 3, os classificadores que foram construídos de subconjuntos randômicos dos marcadores na Tabela 1 tiveram performance similar a classificadores ótimos que foram construídos usando a lista completa de marcadores na Tabela 1.

[000256] O desempenho de classificadores de dez marcadores obtidos pela exclusão dos “melhores” marcadores individuais da agregação de dez marcadores também foi testado. Como descrito no Exemplo 4, Parte 3, classificadores construídos sem “os melhores” marcadores na Tabela 1 também tiveram boa performance. Muitos subconjuntos dos biomarcadores listados na Tabela 1 tiveram performance próxima de ótima, até após remover os melhores 15 dos marcadores listados na Tabela. Isto implica que as características de desempenho de qualquer classificador particular são prováveis não

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106/284 devido a qualquer pequeno grupo principal de biomarcadores e que o processo de doença impacta numerosas prováveis vias bioquímicas, que altera o nível de expressão de muitas proteínas.

[000257] Os resultados a partir do Exemplo 4 sugerem certas conclusões possíveis: Em primeiro lugar, a identificação de um grande número de biomarcadores permite sua agregação em um número vasto de classificadores que oferecem desempenho similarmente alto. Em segundo lugar, os classificadores podem ser construídos tal que biomarcadores particulares possam ser substituídos por outros biomarcadores de uma maneira que reflete a redundância que indubitavelmente penetra as complexidades dos processos de doença subjacentes. Isto é, a informação sobre a doença contribuída por qualquer biomarcador individual identificado na Tabela 1 fica sobreposta com a informação contribuída por outros biomarcadores, tais que pode ser que nenhum biomarcador particular ou pequeno grupo de biomarcadores na Tabela 1 devam estar incluídos em qualquer classificador.

[000258] Modalidades exemplares usam classificadores naive Bayes construídos dos dados na Tabela 16 para classificar uma amostra desconhecida. O procedimento é delineado nas Figuras 1A e 1B. Em uma modalidade, a amostra biológica é opcionalmente diluída e dirigida em um ensaio de aptâmero multiplex. Os dados do ensaio são normalizados e calibrados como delineado no Exemplo 3, e os níveis de biomarcadores resultantes são usados como entrada para um esquema de classificação Bayes. A proporção de probabilidade de log é computada para cada biomarcador medido individualmente e em seguida somada para produzir um escore de classificação final, que também é referido como um escore diagnóstico. A nomeação resultante bem como o escore de classificação total pode ser relatada. Opcionalmente, fatores dos riscos de probabilidade de log individuais

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107/284 computados para cada nível de biomarcador podem ser relatados também. Os detalhes do cálculo de escore de classificação são apresentados no Exemplo 3.

Kits [000259] Qualquer combinação dos biomarcadores da Tabela 1, Col. 2 (bem como informação biomédica adicional) pode ser detectada usando um kit adequado, tal como para uso na execução dos métodos descritos neste pedido. Além disso, qualquer kit pode conter um ou mais marcadores detectáveis como descritos neste pedido, tais como uma porção fluorescente, etc.

[000260] Em uma modalidade, um kit inclui um ou mais reagentes de captura (tais como, por exemplo, pelo menos um aptâmero ou anticorpo) para detectar um ou mais biomarcadores em uma amostra biológica, em que os biomarcadores incluem qualquer um dos biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, e opcionalmente (b) um ou mais programa ou produtos de programa de computador para classificar o indivíduo do qual a amostra biológica foi obtida como tendo ou não tendo câncer pancreático ou para determinar a probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático, como ainda descrito neste pedido. Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programa de computador, uma ou mais instruções para realizar manualmente as etapas acima por um ser humano podem ser fornecidas.

[000261] A combinação de um suporte sólido com um reagente de captura correspondente e um material de geração de sinal é referida neste pedido como um “dispositivo de detecção” ou “kit”. O kit também pode incluir instruções para usar os dispositivos e reagentes, tratar a amostra e analisar os dados. O kit ainda pode ser usado com um sistema computacional ou programa para analisar e relatar o resultado da análise da amostra biológica.

[000262] Os kits também podem conter um ou mais reagentes (por

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108/284 exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens, ou tampões) para processar uma amostra biológica. Qualquer um dos kits descritos neste pedido também pode incluir, por exemplo, tampões, agentes de bloqueio, materiais de matriz de espectrometria de massa, agentes de captura de anticorpo, amostras controle positivas, amostras controle negativas, programa e informação, tais como protocolos, orientação e dados de referência.

[000263] Em um aspecto, a invenção fornece kits para análise do status de câncer pancreático. Os kits incluem iniciadores de PCR de um ou mais biomarcadores selecionados a partir da Tabela 1, Col. 2. O kit pode incluir ainda instruções de uso e correlação dos biomarcadores com o câncer pancreático. O kit também pode incluir um arranjo de DNA contendo o complemento de um ou mais dos biomarcadores selecionados a partir da Tabela 1, Col. 2, reagentes, e/ou enzimas para amplificar ou isolar DNA de amostra. Os kits podem incluir reagentes de PCR em tempo real, por exemplo, sondas e/ou iniciadores TaqMan, e enzimas.

[000264] Por exemplo, um kit pode compreender (a) reagentes compreendendo pelo menos reagente de captura para quantificar um ou mais biomarcadores em uma amostra teste, em que os ditos biomarcadores compreendem os biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2, ou qualquer outro biomarcador ou painéis de biomarcadores descritos neste pedido, e opcionalmente (b) um ou mais algoritmos ou programas de computador para executar as etapas de comparação da quantidade de cada biomarcador quantificado na amostra teste a um ou mais cortes predeterminados e atribuir um escore de cada biomarcador quantificado baseado na dita comparação, combinando escores destinados de cada biomarcador quantificado para obter um escore total, comparando o escore total com um escore predeterminado, e usando a dita comparação para determinar se um

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109/284 indivíduo tem câncer pancreático. Alternativamente, em vez de um ou mais algoritmos ou programas de computador, uma ou mais instruções para executar manualmente as etapas acima por um ser humano podem ser fornecidas.

Métodos e Programas Computacionais [000265] Uma vez que um biomarcador ou painel de biomarcadores é selecionado, um método para diagnosticar um indivíduo pode compreender o seguinte: 1) coletar ou de outra maneira obter uma amostra biológica; 2) executar um método analítico para detectar e medir o biomarcador ou biomarcadores no painel na amostra biológica; 3) realizar qualquer normalização de dados ou padronização necessária para o método usado para coletar valores de biomarcadores; 4) calcular o escore do marcador; 5) combinar os escores de marcador para obter um escore diagnóstico total; e 6) relatar o escore diagnóstico do indivíduo. Nesta abordagem, o escore diagnóstico pode ser um número único determinado da soma de todos os cálculos de marcador que é comparado com um valor liminar preajustado que é uma indicação da presença ou ausência da doença. Ou o escore diagnóstico pode ser uma série de barras que cada uma representa um valor de biomarcador e o modelo das respostas pode ser comparado com um modelo preajustado de determinação da presença ou ausência da doença.

[000266] Pelo menos algumas modalidades dos métodos descritos neste pedido podem ser implementadas com o uso de um computador. Um exemplo de um sistema computacional 100 é mostrado na Figura 6. Com referência à Figura 6, o sistema 100 é mostrado compreendido de elementos de maquinário que são eletricamente acoplados via barramento 108, incluindo um processador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de saída 103, dispositivo de armazenamento 104, leitor de mídia de armazenamento legível por computador 105a, sistema de comunicações 106, aceleramento de processamento (por exemplo,

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DSP ou processadores de propósito especial) 107 e memória 109. O leitor de mídia de armazenamento legível pelo computador 105a é acoplado ainda a mídias de armazenamento legíveis por computador 105b, a combinação que representa inclusivamente dispositivos de armazenamento remoto, local, fixo e/ou removível mais mídia de armazenamento, memória, etc. para conter temporariamente e/ou mais permanentemente informação legível pelo computador, que pode incluir o dispositivo de armazenamento 104, memória 109 e/ou qualquer outro tal sistema acessível de recurso 100. O sistema 100 também compreende elementos de programa (mostrado como atualmente localizado dentro da memória de trabalho 191) incluindo um sistema operacional 192 e outro código 193, tais como programas, dados e similares.

[000267] Com respeito à Figura 6, o sistema 100 tem flexibilidade e configurabilidade extensas. Dessa forma, por exemplo, uma arquitetura única poderia ser utilizada para implementar um ou mais servidores que podem ser ainda configurados conforme protocolos desejáveis atualmente, variações de protocolo, extensões, etc. Entretanto, será evidente para os versados na técnica que as modalidades podem ser bem utilizadas conforme as exigências de aplicação mais específicas. Por exemplo, um ou mais elementos de sistema poderiam ser implementados como sub-elementos dentro de um sistema do componente 100 (por exemplo, dentro do sistema de comunicações 106). O maquinário construído também poderia ser utilizado e/ou os elementos particulares poderiam ser implementados em maquinário, programa ou ambos. Além disso, embora conexão a outros dispositivos computacionais, tais como dispositivos de entrada/saída de rede (não mostrado) possa ser empregada, deve ser entendido que conexão ou conexões com fio, sem fio, modem, e/ou outras para outros dispositivos computacionais também poderiam ser utilizadas.

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111/284 [000268] Em um aspecto, o sistema pode compreender um banco de dados contendo os atributos da característica de biomarcadores do câncer pancreático. Os dados de biomarcadores (ou informação sobre biomarcadores) podem ser utilizados como uma entrada ao computador do uso como a parte de um método implementado por computador. Dados de biomarcadores podem incluir os dados como descrito neste pedido.

[000269] Em um aspecto, o sistema compreende ainda um ou mais dispositivos para fornecer dados de entrada a um ou mais processadores.

[000270] O sistema compreende ainda uma memória para armazenar um conjunto de dados de elementos de dados classificados.

[000271] Em outro aspecto, o dispositivo para fornecer dados de entrada compreende um detector para detectar a característica do elemento de dados, por exemplo, tal como um espectrômetro de massa ou leitor de chip gênico.

[000272] O sistema adicionalmente pode compreender um sistema de gestão de banco de dados. Pedidos ou consultas do usuário podem ser formatados em uma linguagem apropriada entendida pelo sistema de gestão de banco de dados que processa a consulta para extrair a informação relevante do banco de dados de conjuntos de treinamento.

[000273] O sistema pode ser conectável a uma rede à qual um servidor de rede e um ou mais clientes são unidos. A rede pode ser uma rede de área local (rede local) ou uma rede de área ampla (WAN), como é conhecido na técnica. Preferencialmente, o servidor inclui o maquinário necessário para execução de produtos de programa de computador (por exemplo, programa) para acessar dados do banco de dados para processar pedidos de usuário.

[000274] O sistema pode incluir um sistema operacional (por exemplo, UNIX ou Linux) para executar instruções de um sistema de gestão de

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112/284 banco de dados. Em um aspecto, o sistema operacional pode operar uma rede de comunicações global, tal como a Internet, e utilizar um servidor de rede de comunicações global para conectar-se a tal rede. [000275] O sistema pode incluir um ou mais dispositivos que compreendem uma interface de exibição gráfica compreendendo elementos de interface, tais como botões, menus ativáveis, barras de rolagem, campos para introdução de texto, e similares como são rotineiramente encontrados em interfaces gráficas de usuário conhecidas na técnica. Pedidos que entraram em uma interface de usuário podem ser transmitidos a um programa aplicativo no sistema para formatação para procurar a informação relevante em um ou mais dos bancos de dados de sistema. Pedidos ou consultas introduzidos por um usuário podem ser construídos em qualquer linguagem de banco de dados adequada.

[000276] A interface gráfica de usuário pode ser gerada por um código de interface de usuário gráfico como parte do sistema operacional e pode ser usada para introduzir dados e/ou exibir dados inseridos. O resultado dos dados processados pode ser exibido na interface, impresso em uma impressora em comunicação com o sistema, salvo em um dispositivo de memória, e/ou transmitido pela rede ou pode ser fornecido na forma de meio legível por computador.

[000277] O sistema pode estar em comunicação com um dispositivo de entrada para fornecer dados quanto a elementos de dados ao sistema (por exemplo, valores de expressão). Em um aspecto, o dispositivo de entrada pode incluir um sistema de perfil de expressão gênica incluindo, por exemplo, um espectrômetro de massa, chip gênico ou leitor de arranjos e similares.

[000278] Os métodos e aparelho para analisar a informação sobre biomarcadores de câncer pancreático de acordo com várias modalidades podem ser implementados de qualquer maneira

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113/284 adequada, por exemplo, usando um programa de computador que opera um sistema computacional. Um sistema computacional convencional compreendendo um processador e uma memória de acesso randômico, tal como um servidor de aplicações remotamente acessível, servidor de rede, computador pessoal ou estação de trabalho pode ser usado. Componentes adicionais do sistema computacional podem incluir dispositivos de memória ou sistemas de armazenamento de informação, tais como um sistema de armazenamento de massa e uma interface de usuário, por exemplo, um monitor convencional, teclado e dispositivo de rastreamento. O sistema computacional pode ser um sistema autônomo ou parte de uma rede de computadores incluindo um servidor e um ou mais bancos de dados.

[000279] O sistema de análise de biomarcadores de câncer pancreático pode fornecer funções e operações para completar a análise de dados, tais como coleta, processamento, análise, reportagem e/ou diagnóstico de dados. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema computacional pode executar o programa de computador que pode receber, armazenar, procurar, analisar e reportar informação que se relaciona aos biomarcadores de câncer pancreático. O programa de computador pode compreender múltiplos módulos que realizam várias funções ou operações, tais como um módulo de processamento para processar dados brutos e gerar dados suplementares e um módulo de análise para analisar dados brutos e dados suplementares para gerar um status e/ou diagnóstico de câncer pancreático. Diagnosticar status de câncer pancreático pode compreender a geração ou coleta de qualquer outra informação, incluindo informação biomédica adicional, quanto à condição do indivíduo em relação à doença, identificar se testes adicionais podem ser desejáveis, ou de outra maneira avaliação do status de saúde do indivíduo.

[000280] Referindo-se agora à Figura 7, um exemplo de um método

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114/284 de utilizar um computador conforme princípios de uma modalidade descrita pode ser visto. Na Figura 7, o fluxograma 3000 é mostrado. No bloco 3004, a informação sobre biomarcadores pode ser recuperada para um indivíduo. A informação sobre biomarcadores pode ser recuperada de um banco de dados de computador, por exemplo, após teste da amostra biológica do indivíduo ser realizado. A informação sobre biomarcadores pode compreender valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores selecionados a partir de um grupo consistindo dos biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, em que N = 2-65. No bloco 3008, um computador pode ser utilizado para classificar cada um dos valores de biomarcadores. E, no bloco 3012, uma determinação pode ser feita quanto à probabilidade que um indivíduo tenha câncer pancreático baseado em uma pluralidade de classificações. A indicação pode ser produção a uma exposição ou outro dispositivo de indicação para que seja visível por uma pessoa. Dessa forma, por exemplo, pode ser exibido em uma tela de exibição de um computador ou outro dispositivo de saída.

[000281] Referindo-se agora à Figura 8, um método alternativo de utilizar um computador conforme outra modalidade pode ser ilustrado através do fluxograma 3200. No bloco 3204, um computador pode ser utilizado para recuperar a informação sobre biomarcadores de um indivíduo. A informação sobre biomarcadores compreende um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador selecionado a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2. No bloco 3208, uma classificação de valor de biomarcadores pode ser realizada com o computador. E, no bloco 3212, uma indicação pode ser feita quanto à probabilidade que o indivíduo tenha câncer pancreático baseado na classificação. A indicação pode ser enviada a um monitor ou outro dispositivo de de visualização para que seja visível por uma pessoa.

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Dessa forma, por exemplo, pode ser exibido em uma tela de exibição de um computador ou outro dispositivo de saída.

[000282] Algumas modalidades descritas neste pedido podem ser implementadas para incluir um produto de programa de computador. Um produto de programa de computador pode incluir um meio legível por computador tendo código de programa legível por computador incorporado no meio para fazer com que a um programa aplicativo execute em um computador com um banco de dados.

[000283] Como usado neste pedido, um “produto de programa de computador” refere-se a um conjunto organizado de instruções na forma de instruções de linguagem natural ou de programação que está contido em meios físicos de qualquer natureza (por exemplo, escritos, eletrônicos, magnéticos, óticos ou de outra maneira) e que podem ser usados com um computador ou outro sistema de processamento de dados automatizado. Tais instruções de linguagem de programação, quando realizadas por um computador ou sistema de processamento de dados, fazem com que o computador ou sistema de processamento de dados atue conforme o conteúdo particular das instruções. Os produtos de programa de computador incluem sem limitação: programas em código fonte e objeto e/ou teste ou bibliotecas de dados introduzidas em um meio legível por computador. Além disso, o produto de programa de computador que permite um sistema computacional ou equipamento de processamento de dados do dispositivo atuar de modos pré-selecionados pode ser fornecido em diversas formas, incluindo, mas não limitadas ao código fonte original, código de montagem, código objeto, linguagem de máquina, versões encriptadas ou comprimidas dos precedentes e todos e quaisquer equivalentes.

[000284] Em um aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O produto de programa de computador inclui um meio legível por

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116/284 computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de biomarcadores em que cada um corresponde a um de pelo menos N biomarcadores na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2, em que N = 265; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer pancreático do indivíduo como uma função dos valores de biomarcadores.

[000285] Ainda em outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer pancreático. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador incorporando o código do programa executável pelo processador de um dispositivo ou sistema computacional, o código de programa compreendendo: o código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de biomarcador correspondente a um biomarcador na amostra biológica selecionada a partir do grupo de biomarcadores fornecidos na Tabela 1, Col. 2; e o código que executa um método de classificação que indica um status de câncer pancreático do indivíduo como uma função do valor de biomarcador.

[000286] Embora várias modalidades tenham sido descritas como métodos ou aparelhos, deve ser entendido que as modalidades podem ser implementadas pelo código acoplado a um computador, por exemplo, código residente em um computador ou acessível por computador. Por exemplo, o programa e os bancos de dados podem ser utilizados para implementar muitos dos métodos discutidos acima. Dessa forma, além das modalidades executadas pelo maquinário, também é observado que estas modalidades podem ser realizadas pelo

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117/284 uso de um artigo de produção constituído por um meio utilizável por computador tendo um código de programa legível por computador incorporado neste, que o faz capaz das funções descritas nesta descrição. Por isso, é desejado que as modalidades também sejam consideradas protegidas por esta patente nos seus meios de código de programa também. Além disso, as modalidades podem ser personificadas como código armazenado em uma memória legível por computador virtualmente de qualquer tipo incluindo, sem limitação, memória de acesso aleatório, ROM, meios magnéticos, meios óticos ou meios magneto-óticos. Ainda mais geralmente, as modalidades podem ser implementadas no programa, ou no maquinário, ou qualquer combinação dos mesmos incluindo, mas não limitadas ao programa que é executado em um processador de propósito geral, microcódigo, PLAs ou ASICs.

[000287] Também é idealizado que as modalidades podem ser realizadas como sinais de computador incorporados em uma onda carreadora, bem como sinais (por exemplo, elétricos e óticos) propagados por um meio de transmissão. Dessa forma, vários tipos da informação discutida acima podem ser formatados em uma estrutura, tal como uma estrutura de dados, e transmitidos como um sinal elétrico por um meio de transmissão ou armazenados em um meio legível por computador.

[000288] Também está previsto que muitas das estruturas, materiais e ações citados neste pedido podem ser citados como meios para realizar uma função ou etapa para realizar uma função. Por isso, deve ser entendido que tal linguagem tem direito a cobrir todas tais estruturas, materiais ou ações descritos dentro deste relatório descritivo e seus equivalentes, incluindo a matéria incorporada por referência.

[000289] O processo de identificação de biomarcador, usando os biomarcadores descritos neste pedido, e vários métodos para

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118/284 determinar valores de biomarcadores são descritos detalhadamente acima com respeito ao câncer pancreático. Entretanto, a aplicação do processo, o uso de biomarcadores identificados, e os métodos para determinar valores de biomarcadores são totalmente aplicáveis a outros tipos específicos do câncer, geralmente para o câncer, a qualquer outra doença ou condição médica, ou para a identificação de indivíduos que podem ou não podem ser beneficiados por um tratamento médico ancilar. Exceto ao referir-se a resultados específicos relacionados ao câncer pancreático, como é claro a partir do contexto, possa ser entendido que referências neste pedido para o câncer pancreático incluem outros tipos de câncer, geralmente câncer, ou qualquer outra doença ou condição médica.

EXEMPLOS [000290] Os seguintes exemplos são fornecidos para fins ilustrativos somente e não são destinados a limitar o escopo do pedido de patente como definido pelas reivindicações acrescentadas. Todos os exemplos descritos neste pedido foram realizados usando técnicas padrão, que são bem conhecidas e rotina para aqueles versados na técnica. Técnicas de biologia molecular regulares descritas nos seguintes exemplos podem ser realizadas como descritas em manuais padrão de laboratório, tais como Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001).

Exemplo 1. Análise de Aptâmero Multiplexada de Amostras [000291] Este exemplo descreve o ensaio de aptâmero múltiplo usado para analisar as amostras e controles para a identificação dos biomarcadores apresentados na Tabela 1, Col. 2 (ver a Figura 9) e a identificação dos biomarcadores de câncer apresentados na Tabela 19. Para estudos de câncer pancreático, câncer de pulmão e mesotelioma, a análise multiplexada utilizou 823 aptâmeros, cada um único para um

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119/284 alvo específico.

[000292] Neste método, as pontas das pipetas foram modificadas para cada adição de solução.

[000293] Também, a menos que de outra maneira indicado, a maior parte das transferências de solução e adições de lavagem usaram a plataforma de 96 poços de um Beckman Biomek FxP. As etapas do método pipetado manualmente usaram um P200 Pipetteman de doze canais (Rainin Instruments, LLC, Oakland, CA), a menos que de outra maneira indicado. Um tampão adaptado referido como SB17 foi preparado internamente, compreendendo HEPES 40 mM, NaCl 100 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM, EDTA 1 mM em pH 7,5. Um tampão adaptado referido como SB18 foi preparado internamente, compreendendo HEPES 40 mM, NaCl 100 mM, KCl 5 mM, MgCl2 5 mM em pH 7,5. Todas as etapas foram realizadas à temperatura ambiente a menos que de outra maneira indicado.

1. Preparação de Solução Estoque de Aptâmero [000294] Para aptâmeros sem um ligante de biotina fotoclivável, soluções estoque de aptâmero adaptadas 10%, plasma 1% e de 0,03% foram preparadas em concentração de 8x em SB17 1x, Tween-20 0,05% com iniciadores fotocliváveis, biotinilados apropriados, onde a concentração de iniciador resultante foi 3 vezes a concentração de aptâmero relevante. Os iniciadores hibridizaram com a totalidade ou parte do aptâmero correspondente.

[000295] Cada uma das 3 soluções de aptâmero 8x foram diluídas 1:4 separadamente em SB17 1x, Tween-20 0,05% (1500 pL de 8x estoque em 4500 μ\- de SB17 1x, Tween-20 0,05%) para alcançar uma concentração de 2x. Cada master mix de aptâmero diluído então foi particionado, 1500 pL cada um, em 4 tubos de tampa rosqueável de 2 mL e levados a 95°C por 5 minutos, seguidos por uma incubação a 37°C por 15 minutos. Após incubação dos 4 tubos de 2 mL correspondentes

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120/284 a um master mix de aptâmero particular, foram combinados em uma cuba de reagente, e 55 μΐ de uma mistura de aptâmero 2x (para as três misturas) foram pipetados manualmente em uma placa Hybaid de 96 poços e a folha de placa selada. O resultado final foram 3 placas Hybaid de 96 poços, seladas com folha. A concentração individual de aptâmero foi 0,5 nM.

2. Preparação de Amostra de Análise [000296] As alíquotas congeladas de plasma 100%, armazenadas a 80°C, foram colocadas em banho de água a 25°C por 10 minutos. As amostras descongeladas foram colocadas em gelo, suavemente centrifugadas (configurada em 4) por 8 segundos e em seguida recolocadas no gelo.

[000297] Uma solução de amostra 20% foi preparada transferindo 16 μΐ da amostra usando um pipetador de 50 μΐ de 8 canais em placas Hybaid de 96 poços, cada poço contendo 64 μΐ do diluente de amostra apropriado a 4°C (SB18 0,8x, Tween-20 0,05%, Z-block_2 2 μΜ, MgCb 0,6 mM para o plasma). Esta placa foi armazenada em gelo até que as seguintes etapas de diluição de amostra fossem iniciadas.

[000298] Para começar equilíbrio da amostra e aptâmero, a placa da amostra 20% foi brevemente centrifugada e colocada no Beckman FX onde foi misturada por pipetagem de cima para baixo com o pipetador de 96 poços. Uma amostra 2% então foi preparada diluindo 10 μΐ da amostra 20% em 90 μΐ de SB17 1x, Tween-20 0,05%. Depois, a diluição de 6 μΐ da amostra 2% resultante em 194 μΐ de SB17 1x, Tween-20 0,05% produziu uma placa de amostra 0,06%. As diluições foram feitas em Beckman Biomek FxP. Após cada transferência, as soluções foram misturadas por pipetagem de cima para baixo. 3 placas de diluição de amostra então foram transferidas para suas respectivas soluções de aptâmero adicionando 55 μΐ da amostra a 55 μΐ da mistura de aptâmero 2x apropriada. As soluções de amostra

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121/284 e aptâmero foram misturadas no robô por pipetagem de cima para baixo.

3. Ligação de Equilíbrio de Amostra [000299] As placas de amostra/aptâmero foram seladas com folhas e colocadas em uma incubadora a 37°C por 3,5 horas antes de prosseguir à etapa Catch 1.

4. Preparação da placa de contas Catch 2 [000300] Uma alíquota de 5,5 mL de contas de Estreptavidina C1 MyOne (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA) (10 mg/mL) foram lavadas 2 vezes com volumes iguais de NaOH 20 mM (incubação de 5 minutos para cada lavagem), 3 vezes com volumes iguais de SB17 1x, Tween20 0,05% e ressuspensas em 5,5 mL de SB17 1x, Tween-20 0,05%. Usando um pipetador multicanal de extensão 12, 50 pL desta solução foram manualmente pipetados em cada um dos poços de uma placa Hybaid de 96 poços. A placa então foi coberta com folha e armazenada a 4°C para uso no ensaio.

5. Preparação de placas de conta Catch 1 [000301] Três placas 0,45 pL Millipore HV (membrana Durapore, CatNo.MAHVN4550) foram equilibradas com 100 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% por pelo menos 10 minutos. O tampão de equilíbrio então foi filtrado através da placa e 133,3 pL de uma pasta fluida de contas estreptavidina-agarose 7,5% (em SB17 1x, Tween-20 0,05%) foram adicionados em cada um dos poços. Para manter as contas estreptavidina - agarose suspensas ao transferi-las para a placa de filtro, a solução de conta foi manualmente misturada com um pipetador de 12 canais de 200 pL, 15 vezes. Após as contas serem distribuídas através das 3 placas de filtro, um vácuo foi aplicado para remover o sobrenadante das contas. Finalmente, as contas foram lavadas nas placas de filtro com 200 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% e em seguida ressuspensas em 200 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05%. Os fundos das

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122/284 placas de filtro foram marcados e as placas armazenadas para o uso no ensaio.

6. Carregamento do Cytomat [000302] O cytomat foi carregado com todas as pontas, placas, todos os reagentes em cubas (exceto o reagente NHS-biotina que foi preparado fresco corretamente antes da adição às placas), 3 placas de filtro Catch 1 preparadas e 1 placa MyOne preparada.

7. Catch 1 [000303] Após um tempo de equilíbrio de 3,5 horas, as placas de amostra/aptâmero foram removidas da incubadora, centrifugadas por aproximadamente 1 minuto, removidas da folha, e colocadas no suporte do Beckman Biomek FxP. O programa Beckman Biomek FxP foi iniciado. Todas as etapas subsequentes em Catch 1 foram realizadas pelo robô Beckman Biomek FxP a menos que de outra maneira observado. Dentro do programa, vácuo foi aplicado às placas de filtro Catch 1 para remover o sobrenadante das contas. Cem microlitros de cada uma das reações de ligação de equilíbrio 10%, 1% e 0,03% foram adicionados às suas respectivas placas de filtração Catch 1, e cada placa foi misturada usando um agitador orbital de suporte em 800 rpm por 10 minutos.

[000304] A solução não ligada foi removida através de filtração a vácuo. As contas Catch 1 foram lavadas com 190 pL de biotina 100 pM em SB17 1x, Tween-20 0,05% seguido por 190 pL de SB17 1x, Tween20 0,05% dispensando a solução e imediatamente extraindo a vácuo para filtrar a solução através da placa.

[000305] A seguir, 190 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% foram adicionados às placas Catch 1. As placas foram marcadas para remover gotículas usando uma estação de blot de suporte e em seguida incubadas com agitadores orbitais em 800 rpm por 10 minutos a 25°C. [000306] O robô removeu esta lavagem através de filtração a vácuo e

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123/284 marcou o fundo da placa de filtro para remover gotículas usando a estação de blot no suporte.

8. Marcação [000307] Uma alíquota de NHS-PEO4-biotina foi descongelada a 37°C por 6 minutos e em seguida diluída 1:100 com tampão de marcação (SB17 em pH=7,25 Tween-20 0,05%). O reagente NHS-PE04-biotina foi dissolvido em concentração de 100 mM em DMSO anidro e foi armazenado congelado a -20°C. Em um pedidod do robô, o reagente NHS-PE04-biotina diluído foi manualmente adicionado a uma cuba no suporte e o programa do robô foi manualmente reiniciado para dispensar 100 pL de NHS-PE04-biotina em cada um dos poços de cada placa de filtro Catch 1. Permitiu-se que esta solução incubasse com as contas de Catch 1 agitando em 800 rpm por 5 minutos nos agitadores orbitais.

9. Desafio Cinético e Fotoclivagem [000308] A reação de marcação foi extinta pela adição de 150 pL de glicina 20 mM em SB17 1x, Tween-20 0,05% às placas Catch 1 enquanto ainda continha o marcador NHS. As placas então foram incubadas por 1 minuto em agitadores orbitais em 800 rpm. A solução de marcador NHS/glicina foi removida através de filtração a vácuo. Depois, 190 pL de glicina 20 mM (SB17 1x, Tween-20 0,05%) foram adicionados a cada placa e incubados por 1 minuto em agitadores orbitais em 800 rpm antes da remoção por filtração a vácuo.

[000309] 190 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% foram adicionados a cada placa e removidos por filtração a vácuo.

[000310] Os poços da placas de Catch 1 foram posteriormente lavados três vezes adicionando 190 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05%, colocando as placas em agitadores orbitais por 1 minuto em 800 rpm seguidos por filtração a vácuo. Após a última lavagem, as placas foram colocadas acima de uma placa de poços profundos de 1 mL e removidas

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124/284 do suporte. As placas Catch 1 foram centrifugadas em 1000 rpm por 1 minuto para remover tanto quanto possível o volume estranho das contas de agarose antes da eluição.

[000311] As placas foram colocadas de volta para o Beckman Biomek FxP e 85 pL de DxSO4 10 mM em SB17 1x, Tween-20 0,05% foram adicionados a cada um dos poços das placas de filtro.

[000312] As placas de filtro foram removidas do suporte, colocadas em um Variomag Thermoshaker (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA) sob fontes luminosas BlackRay (Ted Pella, Inc, Redding, CA), e irradiadas por 10 minutos agitando em 800 rpm.

[000313] As soluções fotoclivadas foram sequencialmente eluídas de cada placa Catch 1 em uma placa de poço profundo comum por colocação primeiro de 1 placa de filtro Catch 10% acima de uma placa de poços profundos de 1 mL e centrifugação em 1000 rpm por 1 minuto. As placas Catch 1 1% e 0,03% então foram sequencialmente centrifugadas na mesma placa de poços profundos.

10. Captura de contas Catch 2 [000314] O bloco de poços profundos de 1 mL contendo os eluatos combinados de Catch 1 foram colocados no suporte Beckman Biomek FxP para Catch 2.

[000315] O robô transferiu todo o eluato fotoclivado da placa de poços profundos de 1 mL para a placa Hybaid contendo contas magnéticas Catch 2 MyOne anteriormente preparadas (após remoção do tampão MyOne via separação magnética).

[000316] A solução foi incubada sob agitação em 1350 rpm por 5 minutos a 25°C em um Variomag Thermoshaker (Thermo Fisher Scientific, Inc, Waltham, MA).

[000317] O robô transferiu a placa para a estação separadora magnética de suporte. A placa foi incubada no magneto por 90 segundos antes de remoção e descarte do sobrenadante.

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11. Lavagens com glicerol 30% a 37°C [000318] A placa Catch 2 foi movida para o agitador térmico de suporte e 75 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% foram transferidos para cada um dos poços. A placa foi misturada por 1 minuto em 1350 rpm e 37°C para ressuspender e aquecer as contas. A cada um dos poços da placa Catch 2, 75 pL de glicerol 60% a 37°C foram transferidos e a placa continuou a ser misturada por outro minuto em 1350 rpm e 37°C. O robô transferiu a placa a 37°C para o separador magnético onde foi incubada no magneto por 2 minutos e em seguida o robô removeu e descartou o sobrenadante. Estas lavagens foram repetidas mais duas vezes.

[000319] Após remoção da terceira lavagem com glicerol 30% das contas Catch 2, 150 pL de SB17 1x, Tween-20 0,05% foram adicionados a cada um dos poços e incubados a 37°C, agitando em 1350 rpm por 1 minuto, antes da remoção por separação magnética no magneto a 37°C. [000320] As contas Catch 2 foram lavadas uma última vez usando 150 pL de SB19 1x, Tween-20 0,05% com incubação por 1 minuto agitando em 1350 rpm a 25°C antes da separação magnética.

12. Eluição e Neutralização de Conta Catch 2 [000321] Os aptâmeros foram eluídos das contas Catch 2 pela adição de 105 pL de CAPSO 100 mM com NaCl 1 M, Tween-20 0,05% a cada um dos poços. As contas foram incubadas com esta solução com agitação em 1350 rpm por 5 minutos.

[000322] A placa Catch 2 então foi colocada no separador magnético por 90 segundos antes da transferência de 90 pL do eluato a uma nova placa de 96 poços contendo 10 pL de HCl 500 mM, HEPES 500 mM, Tween-20 0,05% em cada um dos poços. Após a transferência, a solução foi misturada roboticamente por pipetagem de 90 pL de cima para baixo de cinco vezes.

13. Hibridização [000323] O Beckman Biomek FxP transferiu 20 pL do eluato de Catch

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126/284 neutralizado a uma placa Hybaid fresca, e 5 μΐ de Agilent Block 10x, contendo uma amostra preparada teste 10x de controles de hibridização, foram adicionados a cada um dos poços. Depois, 25 μΐ de tampão de Hibridização 2x Agilent foi pipetado manualmente a cada um dos poços da placa contendo as amostras neutralizadas e tampão de bloqueio e a solução foi misturada por pipetagem manual de 25 μΐ de cima para baixo de 15 vezes lentamente para evitar formação extensa de bolhas. A placa foi girada em 1000 rpm por 1 minuto.

[000324] Uma lâmina de vedação foi colocada em uma câmara de hibridização Agilent e 40 μΐ de cada uma das amostras contendo solução de hibridização e bloqueio foram manualmente pipetados em cada vedação. Um pipetador variável de 8 canais foi usado de uma maneira destinada a minimizar a formação de bolhas. As lâminas de microarranjo Agilent adaptadas (Agilent Technologies, Inc, Santa Clara, CA), com seu Número de Código de Barras à frente, então foram lentamente abaixadas para as lâminas de vedação (ver o manual Agilent para descrição detalhada).

[000325] O topo das câmaras de hibridização foi colocado no sanduíche de lâmina/reforço de lâmina e os suportes de fixação deslizaram sobre a montagem inteira. Estas montagens foram apertadas firmemente virando os parafusos com segurança.

[000326] Cada sanduíche de lâmina/reforço de lâmina foi visualmente inspecionado para assegurar que a bolha de solução pode mover-se livremente dentro da amostra. Se a bolha não se moveu livremente, a montagem de câmara de hibridização foi suavemente batida para desalojar as bolhas alojadas perto da vedação.

[000327] As câmaras de hibridização montadas foram incubadas em um forno de hibridização Agilent por 19 horas a 60°C girando em 20 rpm.

14. Lavagem Pós-Hibridização

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127/284 [000328] Aproximadamente 400 mL de tampão de Lavagem Agilent 1 foram colocados em cada uma de duas placas de marcação de vidro separadas. Uma das placas de marcação foi colocada em uma placa de movimento magnético e um porta- lâmina e a barra de agitação foram colocados no tampão.

[000329] Uma placa de marcação de lavagem Agilent 2 foi preparada colocando uma barra de movimento em um placa de marcação de vidro vazia.

[000330] Uma quarta placa de marcação de vidro foi deixada de lado para lavagem final com acetonitrila.

[000331] Cada uma das seis câmaras de hibridização foi desmontada. Um por um, o sanduíche lâmina/reforço foi removido da sua câmara de hibridização e submergido na placa de marcação e contendo Lavagem

1. O sanduíche de lâmina/reforço foi retirado usando um par de pinças, submergindo ainda a lâmina de microarranjo. A lâmina foi rapidamente transferida no porta-lâmina na placa de marcação de Lavagem 1 na placa de movimento magnético.

[000332] O porta-lâmina foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em uma configuração baixa e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[000333] Quando um minuto estava faltando para a Lavagem 1, o tampão de Lavagem 2 pré-aquecido a 37°C em uma incubadora foi adicionado à segunda placa de marcação preparada. O porta-lâmina foi rapidamente transferido para o tampão de Lavagem 2 e qualquer tampão em excesso no fundo do porta-lâmina foi removido raspando-a no topo da placa de marcação. O porta-lâmina foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em uma configuração baixa e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[000334] O porta-lâmina foi lentamente retirado da Lavagem 2, tomando aproximadamente 15 segundos para remover as lâminas da

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128/284 solução.

[000335] Com um minuto faltando para a Lavagem 2 em acetonitrila (ACN) foi adicionado à quarta placa de marcação. O porta-lâmina foi transferido para a placa de marcação de acetonitrila. O porta-lâmina foi suavemente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado em uma configuração baixa e as lâminas incubadas por 5 minutos.

[000336] O porta-lâmina foi lentamente retirado da placa de marcação de ACN e colocado em uma toalha absorvente. As bordas do fundo das lâminas foram rapidamente secas e a lâmina foi colocada em uma caixa de lâmina limpa.

15. Imageamento de Microarranjo [000337] As lâminas de microarranjo foram colocadas em suportes de lâminas para varredura Agilent e carregadas no digitalizador de microarranjos Agilent de acordo com as instruções de fabricantes.

[000338] As lâminas foram imageadas no canal Cy3 em uma resolução de 5 pm na configuração PMT 100% e a opção XRD acionada em 0,05. As imagens tiff resultantes foram processadas usando a versão 10.5 do programa de extração de atributo Agilent.

Exemplo 2. Identificação de Biomarcador [000339] A identificação de biomarcadores de câncer pancreático potenciais foi realizada para o diagnóstico do câncer pancreático em indivíduos assintomáticos e indivíduos sintomáticos com pancreatite aguda ou crônica (ou ambas), obstrução pancreática, GERD, cálculos biliares, ou imageamento anormal depois encontrado ser benigno, coletivamente o GI e controles normais. Os critérios de inscrição deste estudo tinham 18 anos de idade ou mais velhos, capazes de dar o consentimento informado, e a amostra plasmática e o diagnóstico documentado de câncer pancreático ou achados benignos. Para os casos, as amostras de sangue coletadas antes do tratamento ou cirurgia

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129/284 e posteriormente diagnosticadas com câncer pancreático. Os critérios de exclusão incluíram diagnóstico prévio ou tratamento de câncer (excluindo carcinoma de células escamosas da pele) dentro dos 5 anos do sorteamento do sangue. As amostras plasmáticas foram coletadas de 2 sítios diferentes e incluídas 143 amostras de câncer pancreático e 115 amostras de grupo controle. O ensaio de afinidade de aptâmero multiplex como descrito no Exemplo 1 foi usado para medir e relatar o valor de RFU de 823 analitos em cada uma destas 258 amostras. Uma vez que as amostras plasmáticas foram obtidas de 2 estudos independentes e sítios de acordo com protocolos similares, um exame de diferenças do sítio antes da análise da descoberta de biomarcadores foi realizado.

[000340] Cada um dos casos e populações controle foi separadamente comparado gerando funções de distribuição cumulativas dependentes de classe (cdfs) para cada um dos 823 analitos. A distância KS (unidade estatística de Kolmogorov-Smirnov) entre valores de dois conjuntos de amostras é uma medida não paramétrica da extensão até a qual a distribuição empírica dos valores de um conjunto (Conjunto A) se diferencia da distribuição de valores de outro conjunto (Conjunto B). Para qualquer valor de um limiar T alguma proporção dos valores do Conjunto A será menor do que T, e alguma proporção dos valores do Conjunto B será menor do que T. A distância KS mede a diferença máxima (não assinada) entre a proporção dos valores dos dois conjuntos de qualquer escolha de T.

[000341] Este conjunto de biomarcadores potenciais pode ser usado para construir classificadores que destinam amostras a um grupo controle ou de doença. De fato, muitos tais classificadores foram produzidos destes conjuntos de biomarcadores e a frequência com a qual qualquer biomarcador foi usado em bons classificadores de marcação determinada. Aqueles biomarcadores que ocorreram ainda

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130/284 mais frequentemente entre os classificadores de marcação superiores foram os mais úteis para criar um teste diagnóstico. Neste exemplo, os classificadores Bayesianos foram usados para explorar o espaço de classificação mas muitas outras técnicas de aprendizagem supervisadas podem ser empregadas com esta finalidade. A aptidão de marcação de qualquer classificador individual foi medida pela área sob a curva característica de operação do receptor (AUC da ROC) do classificador na superfície Bayesiana que assume uma prevalência de doença de 0,5. Esta marcação métrica varia de zero a um, com um sendo um classificador sem erros. Os detalhes de construção de um classificador Bayesiano de medidas demográficas de biomarcador são descritos no Exemplo 3.

[000342] Usando os 65 analitos na Tabela 1, um total de 973 classificadores de 10 analitos foi descoberto com uma AUC de 0,90 para diagnosticar o câncer pancreático do grupo controle. Deste conjunto de classificadores, foi descoberto que um total de 11 biomarcadores estava presente em 30% ou mais dos classificadores de alto escore. A tabela 13 fornece uma lista destes biomarcadores potenciais e a Figura 10 é um gráfico de frequência dos biomarcadores identificados.

Exemplo 3. Classificação naive Bayesiana de Câncer Pancreático [000343] Da lista de biomarcadores identificados como úteis para discriminar entre câncer pancreático e controles, um painel de dez biomarcadores foi selecionado e um classificador naive Bayes foi construído, ver a Tabela 16. As funções de densidade de probabilidade dependentes de classe (pdfs), p(Xi\c) e p(Xi\d), onde Xi é o log do valor de RFU medido do biomarcador i, e c e d referem-se a populações controle e de doença, foram modeladas como funções de distribuição log-normal caracterizadas por uma média μ e uma variância σ². Os parâmetros para pdfs dos dez biomarcadores são listados na Tabela 16 e um exemplo dos dados brutos junto com o ajsute de modelo a um pdf

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131/284 normal é exibido na Figura 5. A suposição subjacente parece ajustar os dados muito bem como evidenciado pela Figura 5.

[000344] A classificação naive Bayes de tal modelo é dada pela seguinte equação, onde p(d) é a prevalência da doença na população, 'ν(Φ) / έί J v-p(4)/ apropriada ao teste e n = 10. Cada um dos termos na adição é uma proporção de probabilidade do log para um marcador individual e a proporção de probabilidade do log total de uma amostra x ser livre da doença de interesse (isto é, neste caso, câncer pancreático) contra ter a doença é simplesmente a soma destes termos de indivíduo mais um termo que contabiliza a prevalência da doença. Para simplicidade, assumimos p(d) = 0,5 de forma que

In

= 0.

[000345] Considerando uma medida de amostra desconhecida em log(RFU) para cada um dos dez biomarcadores de 6,3, 9,3, 8,7, 10,8,

7,4, 11,4, 11,7, 9,0, 8,0, 7,3, o cálculo da classificação é detalhado na Tabela 16. Os componentes individuais que compreendem a proporção de probabilidade de log da doença contra a classe de controle são tabulados e podem ser computados dos parâmetros na Tabela 16 e os valores dex. A soma das proporções de probabilidade de log individuais é -3,044, ou uma probabilidade de ser livre da doença contra ter a doença de 21, onde probabilidade e^{3 044} = 21. Os primeiros 3 valores de biomarcadores têm probabilidades mais consistentes com o grupo de doença (probabilidade de log>0) mas os 7 biomarcadores remanescentes são consistentemente encontrados favorecendo o grupo controle. A multiplicação das probabilidades em conjunto dá os mesmos resultados que aquele mostrado acima; uma probabilidade de 21 que a amostra desconhecida está livre da doença. De fato, esta amostra veio da população controle no conjunto de treinamento.

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Exemplo 4. Algoritmo Ganancioso para Seleção de Painéis de Biomarcadores para Classificadores.

[000346] Este exemplo descreve a seleção de biomarcadores da Tabela 1 para formar painéis que podem ser usados como classificadores em qualquer um dos métodos descritos neste pedido. Os subconjuntos dos biomarcadores na Tabela 1 foram selecionados para construir classificadores com bom desempenho. Este método também foi usado para determinar que marcadores potenciais foram incluídos como biomarcadores no Exemplo 2.

[000347] A medida do desempenho de classificador usado aqui é a AUC; um desempenho de 0,5 é a expectativa de base de um classificador randômico (lançamento de moeda), um classificador pior do que randômico marcaria entre 0,0 e 0,5, um classificador com melhor desempenho do que o randômico marcaria entre 0,5 e 1,0. Um classificador perfeito sem erros teria uma sensibilidade de 1,0 e uma especificidade de 1,0. Pode-se aplicar os métodos descritos no Exemplo 4 a outras medidas comuns de desempenho, tais como a medida F, a soma de sensibilidade e especificidade, ou o produto de sensibilidade e especificidade. Especificamente poderia querer tratar a sensibilidade e especificidade com peso diferente, para selecionar aqueles classificadores que realizam com especificidade mais alta à custa de um pouco de sensibilidade, ou selecionar aqueles classificadores que realizam com sensibilidade mais alta à custa de um pouco de especificidade. Uma vez que o método descrito aqui somente envolve uma medida de “desempenho”, qualquer esquema de ponderação que resulta em uma medida de desempenho única pode ser usado. Aplicações diferentes terão benefícios diferentes de achados verdadeiros-positivos e verdadeiros-negativos, e também custos diferentes associados com achados falsos-positivos de achados falsosnegativos. Por exemplo, rastreamento de indivíduos de alto risco

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133/284 assintomáticos e o diagnóstico diferencial de câncer pancreático de sintomas GI benignos não terão em geral a mesma troca ótima entre especificidade e sensibilidade. As diferentes demandas dos dois testes requererão em geral a ponderação diferente que estabelece classificações incompatíveis positivas e negativas, refletidas na medida de desempenho. Modificar a medida de desempenho em geral mudará o subconjunto exato de marcadores selecionados a partir da Tabela 1, Col. 2 para um conjunto dado de dados.

[000348] Para a abordagem Bayesiana para a discriminação de amostras de câncer pancreático de amostras controle descritas no Exemplo 3, o classificador foi completamente parametrado pelas distribuições de biomarcadores na doença e amostras de treinamento benignas, e a lista de biomarcadores foi escolhida da Tabela 1; isto é, o subconjunto de marcadores para inclusão escolhido determinou um classificador de uma maneira individual dado o conjunto de dados de treinamento.

[000349] O método ganancioso empregado aqui foi usado para procurar o subconjunto ótimo de marcadores da Tabela 1. Para pequenos números de marcadores ou classificadores com relativamente poucos marcadores, cada subconjunto possível de marcadores foi enumerado e avaliado em termos de desempenho do classificador construído com aquele conjunto particular de marcadores (ver o Exemplo 4, Parte 2). (Esta abordagem é bem conhecida no campo da estatística como “a melhor seleção de subconjunto”; ver, por exemplo, Hastie et al). Entretanto, para os classificadores descritos neste pedido, o número de combinações de múltiplos marcadores pode ser muito grande, e não foi factível avaliar cada conjunto possível de 10 marcadores, como há 30.045.015 combinações possíveis que podem ser geradas de uma lista de somente 30 analitos totais. Por causa da impraticabilidade da pesquisa em cada subconjunto de marcadores, o

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134/284 subconjunto único ótimo não pode ser encontrado; entretanto, usando esta abordagem, muitos subconjuntos excelentes foram encontrados, e, em muitos casos, algum destes subconjuntos pode representar um ótimo.

[000350] Em vez de avaliar cada conjunto possível de marcadores, uma abordagem gradual avançada “gananciosa” pode ser seguida (ver, por exemplo, Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data.

[000351] PLoS ONE 2(10): e1002.

doi:10.1371/journal.pone.0001002). Usando este método, um classificador é iniciado com o melhor marcador único (baseado na distância KS dos marcadores individuais) e é desenvolvido em cada etapa tentando, por sua vez, cada membro de uma lista de marcadores que não é correntemente membro do conjunto de marcadores no classificador. Um marcador que tem o melhor escore em combinação com o classificador existente é adicionado ao classificador. Isto é repetido até que nenhuma melhora adicional no desempenho seja alcançada. Infelizmente, esta abordagem pode perder combinações valiosas de marcadores para os quais alguns marcadores individuais não são todos escolhidos antes do processo parar.

[000352] O procedimento ganancioso usado aqui foi uma elaboração da abordagem gradual avançada precedente, em que, para alargar a pesquisa, ao invés de manter somente um classificador candidato único (subconjunto de marcadores) em cada etapa, uma lista de classificadores candidatos foi mantida. A lista foi semeada com cada subconjunto de marcadores (usando cada marcador na tabela sozinho). A lista foi expandida em etapas derivando novos classificadores (subconjuntos de marcadores) daqueles correntemente na lista e adicionando-os à lista. Cada subconjunto de marcadores correntemente na lista foi expandido adicionando qualquer marcador da Tabela 1 já não

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135/284 faz parte daquele classificador, e que não ia, na sua adição ao subconjunto, duplicar um subconjunto existente (estes são denominados “marcadores permissíveis”). Cada subconjunto de marcadores existente foi expandido por cada marcador permissível da lista. Claramente, tal processo geraria consequentemente cada subconjunto possível, e a lista ficaria sem espaço. Por isso, todos os classificadores gerados foram guardados somente enquanto a lista foi menor do que algum tamanho predeterminado (muitas vezes o suficiente para manter os três subconjuntos de marcadores). Uma vez que a lista alcançou o limite de tamanho predeterminado, tornou-se elitista; isto é, somente aqueles classificadores que mostraram certo nível de desempenho foram mantidos na lista, e os outros caíram para o fim da lista e foram perdidos. Isto foi alcançado mantendo a lista classificada em ordem de desempenho de classificador; os novos classificadores que foram pelo menos tão bem como o pior classificador atualmente na lista foram inseridos, forçando a expulsão do com mal resultado corrente. Um detalhe de implementação adicional é que a lista foi completamente substituída em cada etapa geracional; por isso, cada classificador na lista tinha o mesmo número de marcadores, e em cada etapa o número de marcadores por classificador cresceu por um.

[000353] Uma vez que este método produziu uma lista de classificadores candidatos usando combinações diferentes dos marcadores, pode-se perguntar se os classificadores podem ser combinados a fim de evitar erros que poderiam ser feitos pelo melhor classificador único, ou por grupos de minoria dos melhores classificadores. Tais métodos “conjunto” e “comitê de especialistas” são bem conhecidos nos campos de estatística e aprendizagem de máquina e incluem, por exemplo, “Calcular média”, “Votação”, “Empilhamento”, “Bagging’ e “Boosting’ (ver, por exemplo, Hastie et al.) . Estas combinações de classificadores simples fornecem um método para

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136/284 reduzir a variação nas classificações devido ao ruído em qualquer conjunto particular de marcadores pela inclusão de vários classificadores diferentes e por isso informação de um maior conjunto dos marcadores da tabela de biomarcador, que efetivamente calcula a média entre os classificadores. Um exemplo da utilidade desta abordagem é que pode prevenir valores atípicos em um marcador único de afetar adversamente a classificação de uma amostra única. A exigência de medir um maior número de sinais pode ser impraticável em ensaios convencionais “marcador de um de cada vez” de anticorpo mas não tem nenhum aspecto negativo de um ensaio de aptâmero totalmente multiplex. Técnicas, tais como estas, beneficiam-se de uma tabela mais extensa de biomarcadores e usam múltiplas fontes de informação acerca dos processos de doença para fornecer uma classificação mais robusta.

[000354] Os biomarcadores selecionados na Tabela 1 deram origem a classificadores que têm desempenho melhor do que os classificadores construídos com “não marcadores” (isto é, proteínas que têm sinais que não encontraram os critérios da inclusão na Tabela 1 (como descrito no Exemplo 2)).

[000355] Para classificadores contendo somente um, dois e três marcadores, todos os classificadores possíveis obtidos usando os biomarcadores na Tabela 1 foram enumerados e examinados na distribuição do desempenho em comparação com classificadores construídos de uma tabela similar de sinais de não marcadores randomicamente selecionados.

[000356] Na Figura 11, a AUC foi usada como medidade desempenho; um desempenho de 0,5 é a expectativa de base deum classificador randômico (lançamento de moeda). O histogramado desempenho de classificador foi comparado com o histograma do desempenho de uma lista exaustiva similar de classificadores

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137/284 construída de uma tabela de “não marcadores” de 65 sinais de não marcadores; os 65 sinais foram randomicamente escolhidos de aptâmeros que não demonstraram sinalização diferencial entre populações controle e de doença.

[000357] A Figura 11 mostra histogramas de desempenho de todos possíveis um, dois, e três classificadores de marcador construídos dos parâmetros de biomarcador na Tabela 14 de biomarcadores que podem discriminar entre o grupo controle e câncer pancreático e comparam estes classificadores com todos possíveis classificadores de um, dois e três marcadores construídos usando 65 sinais de RFU de aptâmeros “de não marcador”. A figura 11A mostra os histogramas do desempenho de classificador de marcador único, a Figura 11B mostra o histograma de desempenho de classificador de dois marcadores, e a Figura 11C mostra o histograma de desempenho de classificador de três marcadores.

[000358] Na Figura 11, linhas sólidas representam os histogramas de desempenho de classificador de todos classificadores de um, dois e três marcadores usando os dados de biomarcador para GI e controles normais e câncer pancreático na Tabela 14. As linhas pontilhadas são histogramas de desempenho de classificador de todos os classificadores de um, dois e três marcadores usando os dados para controles e câncer pancreático mas usando o conjunto de sinais de não marcador randômicos.

[000359] Os classificadores construídos dos marcadores listados na Tabela 1 formam um histograma distinto, bem separado dos classificadores construídos com sinais dos “não marcadores” para todas comparações de um marcador, de dois marcadores e de três marcadores. O desempenho e o escore de AUC dos classificadores construídos dos biomarcadores na Tabela 1 também aumentam mais rápido com o número de marcadores do que fazem os classificadores

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138/284 construídos dos não marcadores, a separação aumenta entre os classificadores de não marcador e marcador já que o número de marcadores por classificador aumenta. Todos os classificadores usando construídos dos biomarcadores listados na Tabela 14 têm desempenho distintamente melhor do que classificadores construídos usando os “não marcadores”.

[000360] As distribuições do desempenho de classificador mostram que há muitos classificadores de marcadores múltiplo possíveis que podem ser derivados do conjunto de analitos na Tabela 1. Embora alguns biomarcadores sejam melhores do que outros sozinhos, como evidenciado pela distribuição de escores de classificador e AUCs para analitos únicos, foi desejável determinar se tais biomarcadores devem construir classificadores de alto desempenho. Para fazer esta determinação, o comportamento do desempenho de classificador foi examinado omitindo algum número dos melhores biomarcadores. A figura 12 compara o desempenho de classificadores construídos com a lista completa de biomarcadores na Tabela 1 com o desempenho de classificadores construídos com subconjuntos de biomarcadores da Tabela 1 que excluiu marcadores mais bem classificados.

[000361] A Figura 12 demonstra que os classificadores construídos sem os melhores marcadores têm bom desempenho, implicando que o desempenho dos classificadores não foi devido a algum pequeno grupo principal de marcadores e que as modificações nos processos subjacentes associados com a doença são refletidas nas atividades de muitas proteínas. Muitos subconjuntos dos biomarcadores na Tabela 1 tiveram desempenho perto do ótimo, mesmo após remover os melhores 15 dos 65 marcadores da Tabela 1. Após deixar 15 marcadores mais bem classificados (classificados pela distância KS) da Tabela 1, o desempenho de classificador aumentou com o número de marcadores selecionados a partir da tabela para alcançar uma AUC de quase 0,87,

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139/284 perto do desempenho do escore de classificador ótimo de 0,91 selecionado da lista completa de biomarcadores.

[000362] Finalmente, a Figura 16 mostra como o desempenho de ROC de classificadores típicos construídos da lista de parâmetros na Tabela 14 de acordo com o Exemplo 3. Um classificador de cinco analitos foi construído com CTSB, C5a, C5, CCL18, e CSF1R. A figura 16A mostra o desempenho do modelo, assumindo a independência destes marcadores, como no Exemplo 3, e a Figura 16B mostra as curvas ROC empíricas geradas do conjunto de dados de estudo costumaram usadas para definir os parâmetros na Tabela 14. Pode ser visto que o desempenho de um número dado de marcadores selecionados estava qualitativamente de acordo, e este acordo quantitativo em geral foi muito bom, como evidenciado pelas AUCs, embora o cálculo de modelo tenda a superestimar o desempenho do classificador. Isto é compatível com a noção que a informação contribuída por qualquer biomarcador particular acerca dos processos da doença é redundante com a informação contribuída por outros biomarcadores fornecidos na Tabela 1 enquanto o cálculo do modelo assume a independência completa. A figura 16 demonstra dessa forma que a Tabela 1 em combinação com os métodos descritos no Exemplo 3 permite a construção e avaliação de muitos classificadores úteis para a discriminação do câncer pancreático do grupo controle.

Exemplo 5. Incorporação de CA19-9 [000363] O antígeno 19-9 (CA 19-9) associado ao câncer é um marcador sérico conhecido do câncer pancreático. A sensibilidade e especificidade relatadas de CA 19-9 para o câncer pancreático são 80 a 90 por cento, respectivamente. Entretanto, a exatidão de CA 19-9 para identificar pacientes com cânceres pequenos cirurgicamente resseccionáveis é limitada. A especificidade de CA 19-9 também é limitada; CA 19-9 é frequentemente elevado em pacientes com vários

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140/284 distúrbios pancreático-biliares benignos.

[000364] O grau da elevação de CA 19-9 no câncer pancreático associa-se com o prognóstico de longo prazo. Além disso, em pacientes que parecem ter a doença potencialmente resseccionável, a magnitude do CA 19-9 nível também pode ajudar a predizer a presença da doença metastásica radiograficamente oculta. O monitoramento serial de CA 19-9 níveis são úteis para seguir pacientes após cirurgia potencialmente curativa e para aqueles que estão recebendo a quimioterapia da doença avançada. CA crescente 19-9 níveis normalmente precedem a aparência radiográfica da doença recorrente, mas confirmação da progressão de doença deve ser perseguido com estudos de imageamento e/ou biópsia. O teste de níveis de biomarcadores na combinação com CA 19-9 pode melhorar a sensibilidade, a especificidade, e/ou a AUC para detectar o câncer pancreático (ou outros usos relacionados ao câncer pancreático) comparando com CA 19-9 sozinho.

[000365] Um nível elevado de CA19-9 é considerado ser 35 a 40 U/ml no soro.

[000366] Foram recebidas medidas de CA19-9 clínicas de um subconjunto das amostras de treinamento. De 100 casos originais e 69 controles, tínhamos medidas CA19-9 de 99 casos e 52 controles. Por isso, treinamos um novo conjunto de modelos floresta aleatória neste subconjunto de amostras usando os subconjuntos de SOMAmers na Tabela 1. Também treinamos novos classificadores que incorporaram a medida de CA19-9 com o nosso painel de SOMAmer (painel combinado).

[000367] O desempenho de classificador de três abordagens diferentes (SOMAmer, CA19-9 e um painel combinado) é mostrado na Figura 13. O painel de SOMAmer e CA19-9 tem desempenho similar entretanto quando os dois são combinados em um classificador único o

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141/284 desempenho melhora dramaticamente. Para uma especificidade de 100%, o painel de SOMAmer e CA19-9 têm uma sensibilidade somente menor que 50%, ao passo que o classificador combinado tem uma sensibilidade de aproximadamente 75%.

[000368] Análise adicional revelou que quando CA19-9 está incluído no classificador, o número de SOMAmers necessários para o mesmo desempenho relativo é reduzido. A figura 14 mostra o desempenho de classificadores floresta aleatória usando CA19-9 e ou um ou dois SOMAmers adicionais. O painel esquerdo mostra o desempenho de um modelo treinado usando CA19-9 e HAMP e o painel direito mostra o desempenho de CA19-9, HAMP e CTSB.

Exemplo 6. Painel de Biomarcador Clínico [000369] Um classificador floresta aleatória foi construído de um painel de biomarcadores selecionados que pode ser o mais apropriado para o uso em um teste diagnóstico clínico. Diferentemente dos modelos selecionados pelo algoritmo avançado ganancioso de naive Bayes, o classificador floresta aleatória não supõe que as medidas de biomarcador sejam randomicamente distribuídas. Por isso, este modelo pode utilizar biomarcadores da Tabela 1 que não são eficazes no classificador naive Bayes.

[000370] O painel foi selecionado usando um procedimento de eliminação para trás que utilizou a medida de importância gini fornecida pelo classificador floresta aleatória. A importância gini é uma medida da eficácia de um biomarcador em classificar corretamente amostras no conjunto de treinamento. Esta medida da importância de biomarcador pode ser usada para eliminar marcadores que são menos essenciais para o desempenho do classificador. O procedimento de eliminação para trás foi iniciado construindo um classificador floresta aleatória que incluiu todos os 65 na Tabela 1. O biomarcador menos importante então foi eliminado e um novo modelo foi construído com os biomarcadores

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142/284 restantes. Este procedimento continuou até que o somente um biomarcador único permanecesse.

[000371] O painel final que foi selecionado forneceu o melhor equilíbrio entre a maior AUC e o número mais baixo de marcadores no modelo. O painel de dez biomarcadores que satisfizeram estes critérios é composto dos seguintes analitos, APOAl, CTSB, C2, MMP7, HAMP, TFPI, C5, c5a, SFRP1 e ETHE1. Um gráfico da curva ROC deste painel de biomarcador é mostrado na Figura 15. A figura indica dois cortes de decisão possíveis ilustrados por flechas: um corte sintomático onde uma sensibilidade de 84% ou mais pode ser obtida com especificidade de pelo menos 80%; e um corte assintomático onde uma especificidade de 97,5% pode ser obtida com sensibilidade de pelo menos 60%.

Exemplo 7. Biomarcadores para o Diagnóstico de Câncer [000372] A identificação de biomarcadores potenciais para o diagnóstico geral do câncer foi realizada. Tanto o caso como as amostras controle foram avaliados de 3 tipos diferentes de câncer (câncer pancreático, câncer de pulmão e mesotelioma). Através dos sítios de coleta, os critérios de inclusão tinham pelo menos 18 anos com o consentimento informado assinado. Tanto os casos como os controles foram excluídos para malignidade conhecida exceto o câncer em questão.

[000373] Câncer Pancreático. O caso e as amostras controle foram obtidos como descrito no Exemplo 2.

[000374] Câncer de Pulmão. O caso e as amostras controle foram obtidos de três biorrepositórios de centro de câncer acadêmico e um biorrepositório comercial para identificar marcadores potenciais do diagnóstico diferencial de câncer de pulmão de não pequenas células (NSCLC) de um grupo controle de fumantes de alto risco e indivíduos com nódulos pulmonares benignos. O estudo foi composto de 978 amostras coletadas de fumantes e pacientes com nódulos benignos

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143/284 bem como 320 indivíduos diagnosticados com NSCLC.

[000375] Mesotelioma Pleural. O caso e as amostras controle foram obtidos de um biorrepositório de centro de câncer acadêmico para identificar marcadores potenciais para o diagnóstico diferencial do mesotelioma pleural maligno de indivíduos com uma história de exposição ao asbesto ou doença de pulmão benigna, incluindo achados de radiologia suspeitos que foram depois diagnosticados como não malignos. O estudo foi composto de 30 amostras coletadas de indivíduos expostos de asbesto e 41 amostras coletadas de pacientes de mesotelioma.

[000376] Uma lista final de biomarcadores de câncer foi identificada combinando os conjuntos de biomarcadores considerados para cada um dos 3 estudos de câncer diferentes. Classificadores bayesianos que usaram conjuntos de biomarcadores de tamanho crescente foram sucessivamente construídos usando um algoritmo ganancioso (como descrito em maiores detalhes na Seção 7.2 deste Exemplo). Os conjuntos (ou painéis) de biomarcadores que foram úteis para diagnosticar o câncer em geral entre tipos de câncer foram compilados como uma função do tamanho do conjunto (ou painel) e analisados para seu desempenho. Esta análise resultou na lista de 10 biomarcadores de câncer mostrados na Tabela 19, cada um dos quais esteve presente em pelo menos um destes conjuntos de marcadores sucessivos, que variaram de tamanho de três a dez marcadores. Como um exemplo ilustrativo, descrevemos a geração de um painel específico composto de dez biomarcadores de câncer, que é mostrado na Tabela 32.

7.1 Classificação Naive Bayesiana de Câncer [000377] Da lista de biomarcadores na Tabela 1, um painel de dez biomarcadores de câncer potenciais foi selecionado usando um algoritmo ganancioso para a seleção de biomarcador, como delineado na Seção 7.2 deste Exemplo. Um classificador naive Bayes distinto foi

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144/284 construído para cada um dos 3. As funções de densidade de probabilidade dependentes de classe (pdfs), p(Xi\c) e p (Xi\d), onde x_; é o log do valor de RFU medido do biomarcador i, e c e d referem-se a populações controle e de doença, foram modeladas como funções de distribuição log-normal caracterizadas por uma média μ e variância o². Os parâmetros de pdfs dos 3 modelos compostos de dez biomarcadores potenciais são listados na Tabela 31.

[000378] A classificação naive Bayes de tal modelo é dada pela seguinte equação, onde p(d) é a prevalência da doença na população, ln

Ρ’ά,ί ^2 &d,i V_C,i p(d) \ — / apropriado para o teste e n = 10. Cada um dos termos na adição é uma proporção de probabilidade de log para um marcador individual e a proporção de probabilidade de log total de uma amostra x ser livre da doença de interesse (isto é, neste caso, cada particular doença de 3 tipos de câncer diferentes) contra ter a doença é simplesmente a soma destes termos individuais mais um termo que contabiliza a prevalência da doença. Para a simplicidade, assumimos que p(d) = 0,5 de forma que f Lq

V-pW/ [000379] Considerando uma medida de amostra desconhecida em log(RFU) para cada um dos dez biomarcadores de 10,1, 8,9, 8,8, 8,8, 9,1, 7,3, 8,2, 9,5, 6,7, 7,7, o cálculo da classificação é detalhado na Tabela 32. Os componentes individuais que compreendem a proporção de probabilidade de log da doença contra a classe controle são tabulados e podem ser computados dos parâmetros na Tabela 31 e os valores de ~x. A soma das proporções de probabilidade de log individual é -4,568, ou uma probabilidade de ser livre da doença contra ter a doença de 96, onde probabilidade e^{4 568} = 96. Somente 1 dos valores de biomarcadores tem probabilidades mais compatíveis com o grupo de doença (probabilidade de log > 0) mas os 9 biomarcadores

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145/284 remanescentes são todos consistentemente encontrados para favorecer o grupo controle. A multiplicação das probabilidades em conjunto dá os mesmos resultados que aqueles mostrados acima; uma probabilidade de 96 que a amostra desconhecida esteja livre da doença. De fato, esta amostra veio da população controle no conjunto de treinamento NSCLC.

7.2 Algoritmo Ganancioso para Seleção de Painéis de Biomarcadores para Classificadores de Câncer

Parte 1 [000380] Os subconjuntos dos biomarcadores na Tabela 1 foram selecionados para construir classificadores potenciais que podem ser usados para determinar quais dos marcadores podem ser usados como biomarcadores de câncer gerais para detectar câncer.

[000381] Dado grupo de marcadores, um modelo distinto foi treinado para cada um dos 3 estudos de câncer, portanto uma medida global do desempenho deve selecionar o grupo de biomarcadores que foi capaz de classificar simultaneamente muitos tipos diferentes de câncer. A medida do desempenho de classificador usado aqui foi a média da área sob a curva ROC através de todos os classificadores naive Bayes. A curva ROC é um gráfico de uma taxa de verdadeirospositivos de classificador único (sensibilidade) contra a taxa de falsospositivos (especificidade 1). A área sob a curva ROC (AUC) varia de 0 a 1,0, onde uma AUC de 1,0 corresponde à classificação perfeita e uma AUC de 0,5 corresponde ao classificador randômico (lançamento de moeda). Pode-se aplicar outras medidas comuns de desempenho, tais como a medida F ou soma ou produto de sensibilidade e especificidade. Especificamente, a sensibilidade e especificidade poderiam querer ser tratadas com peso diferente, a fim de selecionar aqueles classificadores que têm desempenho com especificidade mais alta à custa de um pouco de sensibilidade, ou selecionar aqueles

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146/284 classificadores que têm desempenho com sensibilidade mais alta à custa da especificidade. Decidimos usar a AUC porque engloba todas as combinações de sensibilidade e especificidade em uma medida única. Aplicações diferentes terão benefícios diferentes de achados verdadeiros-positivos e verdadeiros-negativos, e têm custos diferentes associados com achados falsos-positivos de achados falsos-negativos. Modificar a medida de desempenho pode modificar o subconjunto exato de marcadores selecionados para um conjunto dado de dados.

[000382] Para a abordagem Bayesiana para a discriminação de amostras de câncer de amostras controle descritas na Seção 7.1 deste Exemplo, o classificador foi completamente parametrado pelas distribuições de biomarcadores em cada um dos 3 estudos de câncer, e a lista de biomarcadores foi escolhida da Tabela 19. Isto é, o subconjunto de marcadores escolhidos para a inclusão determinou um classificador de uma maneira individual dado um conjunto de dados de treinamento.

[000383] O método ganancioso empregado aqui foi usado para procurar o subconjunto ótimo de marcadores da Tabela 1. Para pequenos números de marcadores ou classificadores com relativamente poucos marcadores, cada subconjunto possível de marcadores foi enumerado e avaliado em termos de desempenho do classificador construído com aquele conjunto particular de marcadores (ver o Exemplo 4, Parte 2). (Esta abordagem é bem conhecida no campo da estatística como “a melhor seleção de subconjunto”; ver, por exemplo, Hastie et al). Entretanto, para os classificadores descritos neste pedido, o número de combinações de múltiplos marcadores pode ser muito grande, e não foi factível avaliar cada conjunto possível de 10 marcadores, como há 30.045.015 combinações possíveis que podem ser geradas de uma lista de somente 30 analitos totais. Por causa da

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147/284 impraticabilidade da pesquisa em cada subconjunto de marcadores, o subconjunto único ótimo não pode ser encontrado; entretanto, usando esta abordagem, muitos subconjuntos excelentes foram encontrados, e, em muitos casos, algum destes subconjuntos pode representar um ótimo.

[000384] Em vez de avaliar cada conjunto possível de marcadores, uma abordagem gradual avançada “gananciosa” pode ser seguida (ver, por exemplo, Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data.

[000385] PLoS ONE 2 (10): e1002.

doi:10.1371/journal.pone.0001002). Usando este método, um classificador é iniciado com o melhor marcador único (baseado na distância KS dos marcadores individuais) e é desenvolvido em cada etapa por tentativa, por sua vez, de cada membro de uma lista de marcador que não é correntemente membro do conjunto de marcadores no classificador. Um marcador que têm escores do melhor na combinação com o classificador existente é adicionado ao classificador. Isto é repetido até que nenhuma melhora adicional no desempenho seja alcançada. Infelizmente, esta abordagem pode perder combinações valiosas de marcadores para as quais alguns marcadores individuais não são todos escolhidos antes do processo parar.

[000386] O procedimento ganancioso usado aqui foi uma elaboração da abordagem gradual avançada precedente, em que, para alargar a pesquisa, antes que manter somente um subconjunto de marcador único em cada etapa, uma lista de conjuntos de marcador de candidato foi mantida. A lista foi semeada com uma lista de marcadores únicos. A lista foi expandida em etapas derivando novos subconjuntos de marcadores daqueles atualmente na lista e adicionando-os à lista. Cada subconjunto de marcador atualmente na lista foi expandido adicionando qualquer marcador da Tabela 1 não já

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148/284 parte daquele classificador, e que não iria, na sua adição ao subconjunto, duplicar um subconjunto existente (estes são denominados “marcadores permissíveis”). Cada vez quando um novo conjunto de marcadores foi definido, o grupo de classificadores compostos de um para cada estudo de câncer foi treinado usando estes marcadores, e o desempenho global foi medido via AUC média através dos 3 estudos. Para evitar o potencial sobreajustamento, a AUC de cada modelo de estudo de câncer foi calculada através de um procedimento de validação cruzado décuplo. Cada subconjunto de marcador existente foi expandido por cada marcador permissível da lista. Claramente, tal processo geraria consequentemente cada subconjunto possível, e a lista ficaria sem espaço. Por isso, todos os conjuntos de marcador gerados foram mantidos somente enquanto a lista foi menor que algum tamanho predeterminado. Uma vez que a lista alcançou o limite de tamanho predeterminado, tornou-se elitista; isto é, somente aqueles conjuntos de classificador que mostraram certo nível de desempenho foram mantidos na lista, e os outros caíram para o fim da lista e foram perdidos. Isto foi alcançado mantendo a lista classificada da ordem do desempenho de conjunto de classificador; novos conjuntos de marcadores cujos classificadores foram globalmente pelo menos tão bons quanto o pior conjunto de classificadores atualmente na lista foi inserido, forçando a expulsão dos conjuntos de classificadores de fundo com mal resultado correntes. Um detalhe de implementação adicional é que a lista foi completamente substituída em cada etapa geracional; por isso, cada conjunto de marcador na lista tinha o mesmo número de marcadores, e em cada etapa o número de marcadores por classificador cresceu por um.

[000387] Em uma modalidade, o conjunto (ou painel) de biomarcadores úteis para construir classificadores para diagnosticar o

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149/284 câncer geral do não câncer é baseado na AUC média da combinação particular de biomarcadores usada no esquema de classificação. Identificamos muitas combinações de biomarcadores derivados dos marcadores na T abela 19 que foram capazes de classificar efetivamente amostras de câncer diferentes de controles. Os painéis representativos são apresentados nas Tabelas 22 a 29, que apresentam uma série de 100 painéis diferentes de 3 a 10 biomarcadores, que têm AUC de validação cruzada média indicada (CV) de cada painel. O número total de ocorrências de cada marcador em cada um destes painéis é indicado no fundo de cada tabela.

[000388] Os biomarcadores selecionados na Tabela 19 deram origem a classificadores que executam melhor do que classificadores construídos com “não marcadores”. Na Figura 17, exibimos o desempenho dos nossos dez classificadores de biomarcadores em comparação com o desempenho de outros classificadores possíveis. [000389] A Figura 17A mostra a distribuição de AUCs médias de classificadores construídos de conjuntos randomicamente escolhidos de dez “não marcadores” tomados do conjunto inteiro dos 10 presentes nos 3 estudos, excluindo os dez marcadores na Tabela 19. O desempenho de dez biomarcadores potenciais de câncer é exibido como uma linha tracejada vertical. Este gráfico claramente mostra que o desempenho de dez biomarcadores potenciais está bem além da distribuição de outras combinações de marcador.

[000390] A Figura 17B exibe uma distribuição similar como a Figura 17A, entretanto os conjuntos randomicamente escolhidos foram restringidos aos 55 biomarcadores da Tabela 1 que não foram selecionados pelo procedimento de seleção de biomarcador ganancioso de dez classificadores de analito. Este gráfico demonstra que os dez marcadores escolhidos pelo algoritmo ganancioso representam um subconjunto de biomarcadores que generaliza a outros tipos de câncer

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150/284 muito melhores do que classificadores construídos com os 55 biomarcadores restantes.

[000391] Finalmente, a Figura 18 mostra a curva ROC do classificador de cada um dos 3 classificadores de estudos de câncer. As modalidades precedentes e os exemplos são destinados somente como exemplos. Nenhuma modalidade, exemplo, ou elemento particular de uma modalidade ou exemplo particular deve ser interpretado como um elemento crítico, necessário ou essencial ou característico de qualquer uma das reivindicações. Além disso, nenhum elemento descrito neste pedido é necessário para a prática das reivindicações acrescentadas a menos que expressamente descrito como “essencial” ou “crítico”. Várias alterações, modificações, substituições e outras variações podem ser feitas às modalidades descritas sem se afastar do escopo do presente pedido de patente, que é definido pelas reivindicações acrescentadas. O relatório descritivo, inclusive as figuras e os exemplos, deve ser considerado de uma maneira ilustrativa, em vez de uma restritiva, e todas tais modificações e substituições são destinadas a estar incluídas dentro do escopo do pedido de patente. Conseqüentemente, o escopo do pedido de patente deve ser determinado pelas reivindicações acrescentadas e seus equivalentes legais, em vez de pelos exemplos dados acima. Por exemplo, as etapas citadas em qualquer um dos métodos ou reivindicações do processo podem ser realizadas em qualquer ordem factível e não são limitadas a uma ordem apresentada em nenhuma das modalidades, exemplos ou reivindicações. Além disso, em qualquer um dos métodos acima mencionados, um ou vários biomarcadores da Tabela 1 ou Tabela 19 podem ser especificamente excluídos como um biomarcador individual ou como um biomarcador de qualquer painel.

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Tabela 1: Biomarcadores de Câncer

Coluna No.1	Coluna No.2	Coluna No.3	Coluna No.4	Coluna No.5	Coluna No.6
Biomarcador No.	Símbolo(s) de Gene Entrez para Designação de Biomarcador	ID de Gene Entrez	ID SwissProt	Nome Público	Direção
1	ACP5	54	P13686	TrATPase	Para cima
2	ACY1	95	Q03154	Aminoacilase-1	Para cima
3	AHSG	197	P02765	a2-HS- Glicoproteína	Para baixo
4	ALPL	249	P05186	Fosfatase alcalina, osso	Para baixo
5	APOA1	335	P02647	Apo A-I	Para baixo
6	APOE	348	P02649	Apo E2	Para cima
7	BMP6	654	P22004	BMP-6	Para cima
8	C2	717	P06681	C2	Para cima
9	C5	727	P01031	C5	Para cima
10	C5	727	P01031	C5a	Para cima
11	C5-C6	727; 729	P01031; P13671	Complexo C5b,6	Para cima

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12	C9	735	P02748	C9	Para cima
13	CCL18	6362	P55774	MIP-4	Para cima
14	CCL23	6368	P55773	MPIF-1	Para cima
15	CCL23	6368	P55773	Ck-/3-8-l	Para cima
16	CDK5-CDK5R1	1020; 1775	Q00535; Q15078	CDK5/p35	Para cima
17	CKB-CKM-	1152; 1158	P12277; P06732	CK-MB	Para baixo
18	CKM	1158	P06732	CK-MM	Para baixo
19	CRP	1401	P02741	CRP	Para cima
20	CSF1R	1436	P07333	M-CSF R	Para cima
21	CTSB	1508	P07858	Catepsina B	Para cima
22	ENTPD1	953	P49961	CD39	Para cima
23	ESM1	11082	Q9NQ30	Endocano	Para cima
24	ETHE1	23474	095571	ETHE1	Para cima
25	FCGR3B	2215	075015	FC73B	Para cima
26	FGFR3	2261	P22607	FGFR-3	Para cima

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27	FSTL3	10272	095633	FSTL3	Para cima
28	GDF11	10220	095390	GDF-11	Para baixo
29	GFRA1	2674	P56159	GFRor-7	Para cima
30	HAMP	57817	P81172	Hepcidina-25	Para cima
31	HINT1	3094	P49773	HINT1	Para baixo
32	IDUA	3425	P35475	IDUA	Para cima
33	IL11RA	3590	Q14626	IL-11 Ra	Para baixo
34	IL12A-IL12B	3592; 3593	P29459; P29460	IL-12	Para baixo
35	IL18R1	8809	Q13478	IL-18 Ra	Para cima
36	IL1RL1	9173	Q01638	IL-1 R4	Para cima
37	INSR	3643	P06213	IR	Para cima
38	KIT	3815	P10721	SCF sR	Para baixo
39	KLK3- SERPINA3	354; 12	P07288; P01011	PSA-ACT	Para cima
40	KLK7	5650	P49862	calicreína 7	Para baixo
41	KLK8	11202	060259	calicreína 8	Para cima

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42	KLKB1	3818	P03952	Precalicreína	Para baixo
43	LBP	3929	P18428	LBP	Para cima
44	LTF	4057	P02788	Lactoferrina	Para baixo
45	MCM2	4171	P49736	MCM2	Para cima
46	MDK	4192	P21741	Midquina	Para cima
47	MMP7	4316	P09237	MMP-7	Para cima
48	MRC1	4360	P22897	Receptor de manose de Macrófago	Para cima
49	NIDI	4811	P14543	Nidógeno	Para cima
50	NID2	22795	Q14112	Nidógeno-2	Para cima
51	NRP1	8829	014786	NRP1	Para cima
52	PLAT	5327	P00750	tPA	Para cima
53	SERPINA5	5104	P05154	Inibidor de Proteína C	Para baixo
54	SERPINF2	5345	P08697	a2-Antiplasmina	Para baixo
55	SFRP1	6422	Q8N474	FRP-1, solúvel	Para cima

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56	SGTA	6449	043765	SGTa	Para baixo
57	TFPI	7035	P10646	TFPI	Para cima
58	THBS2	7058	P35442	Trombospondina- 2	Para cima
59	THBS4	7060	P35443	Trombospondina - 4	Para baixo
60	TIMP1	7076	P01033	TIMP-1	Para cima
61	TNFRSF18	8784	Q9Y5U5	GITR/TNFRSF18	Para baixo
62	TNFRSF1B	7133	P20333	TNF sR-II	Para cima
63	TOPI	7150	P11387	Topoisomerase I	Para baixo
64	VEGFA	7422	P15692	VEGF	Para baixo
65	VEGFC	7424	P49767	VEGF-C	Para cima
Tabela 2: Painéis de 1 E	liomarcador

Marcadores	CV AUC
1	CTSB	0,780
2	C2	0,771
3	APOA1	0,754
4	C5	0,745
5	TFPI	0,739
6	C5a	0,724
7	TIMP1	0,720

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8	FCGR3B	0,719
9	HAMP	0,718
10	CRP	0,717
11	NRP1	0,716
12	THBS2	0,715
13	MMP7	0,711
14	CCL18	0,709
15	CSF1R	0,705
16	ACP5	0,704
17	LBP	0,703
18	MRC1	0,699
19	PLAT	0,699
20	GFRA1	0,698
21	CCL23	0,696
22	KLK7	0,696
23	MDK	0,694
24	CKB-CKM	0,694
25	KLK3-SERPINA3	0,693
26	CKM	0,693
27	GDF11	0,692
28	IL11RA	0,690
29	IL1RL1	0,690
30	ETHE1	0,684
31	FSTL3	0,681
32	KIT	0,680
33	FGFR3	0,677
34	KLKB1	0,677
35	THBS4	0,669
36	ACY1	0,666

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37	C5-C6	0,664
38	INSR	0,663
39	IL18R1	0,663
40	BMP6	0,663
41	TNFRSF1B	0,660
42	C9	0,657
43	SERPINA5	0,655
44	IL12A-IL12B	0,655
45	NID2	0,649
46	TOPI	0,647
47	NIDI	0,642
48	CCL23	0,641
49	MCM2	0,641
50	AHSG	0,638
51	VEGFC	0,637
52	ENTPD1	0,637
53	HINT1	0,637
54	ALPL	0,635
55	LTF	0,632
56	ESM1	0,625
57	SERPINF2	0,624
58	CDK5-CDK5R1	0,623
59	SGTA	0,603
60	KLK8	0,597
61	IDUA	0,594
62	SFRP1	0,586
63	VEGFA	0,585
64	APOE	0,574
65	TNFRSF18	0,527

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 161/374

158/284

Tabela 3: Painéis de 2 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5	CTSB	0,848
2	C5a	CTSB	0,841
3	CTSB	ETHE1	0,833
4	CTSB	HAMP	0,830
5	CTSB	THBS4	0,830
6	KIT	CTSB	0,829
7	C9	CTSB	0,828
8	CTSB	KLK7	0,826
9	CTSB	C2	0,821
10	C5	APOA1	0,820
11	CTSB	CRP	0,818
12	CCL23	CTSB	0,817
13	C5-C6	CTSB	0,814
14	CTSB	IL11RA	0,812
15	CCL18	CTSB	0,811
16	APOA1	CTSB	0,809
17	C5	CSF1R	0,808
18	GDF11	CTSB	0,807
19	C5	C2	0,806
20	C2	TFPI	0,806
21	C5	CCL18	0,804
22	C2	IL11RA	0,803
23	CCL23	CTSB	0,802
24	TIMP1	C5	0,801
25	CTSB	LBP	0,799
26	CTSB	TFPI	0,799
27	PLAT	C5	0,799

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 162/374

159/284

28	CTSB	AHSC	0,799
29	CCL18	C2	0,799
30	C5	MRC1	0,799
31	APOA1	C2	0,798
32	C5	FCCR3B	0,797
33	C5	TFPI	0,797
34	ALPL	CTSB	0,796
35	C5	MMP7	0,796
36	CTSB	KLK3-SERPINA3	0,795
37	MMP7	CTSB	0,795
38	MMP7	C2	0,794
39	TFPI	HAMP	0,793
40	CCL18	ETHE1	0,793
41	C2	HAMP	0,792
42	PLAT	C2	0,792
43	CTSB	NRP1	0,792
44	LTF	CTSB	0,791
45	C5	ACP5	0,790
46	APOA1	TFPI	0,790
47	C5a	TNFRSF1B	0,789
48	C5a	CCL18	0,789
49	CKM	CTSB	0,789
50	C5	THBS2	0,789
51	C2	CRP	0,788
52	C5a	KLK7	0,788
53	C2	THBS4	0,788
54	CSF1R	THBS4	0,788
55	C5a	FSTL3	0,788
56	C5	NRP1	0,788

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 163/374

160/284

57	C5a	C2	0,788
58	C5a	TFPI	0,787
59	CTSB	CKB-CKM	0,787
60	C5a	NRP1	0,787
61	CSF1R	APOA1	0,787
62	TFPI	CRP	0,787
63	MMP7	KLK7	0,787
64	C5a	FCGR3B	0,787
65	C2	ETHE1	0,786
66	CCL23	C2	0,786
67	PLAT	CTSB	0,786
68	CCL18	TFPI	0,786
69	ACP5	CRP	0,785
70	C2	KLK7	0,785
71	C5	CCL23	0,784
72	MMP7	C5a	0,784
73	APOA1	KLK7	0,784
74	C5	CFRA1	0,784
75	C5	HAMP	0,784
76	C5	C5a	0,784
77	NRP1	CRP	0,783
78	KIT	C2	0,783
79	C5	IL1RL1	0,783
80	APOA1	ETHE1	0,783
81	CTSB	CDK5-CDK5R1	0,782
82	CSF1R	CRP	0,782
83	TIMP1	CTSB	0,782
84	IL1RL1	CTSB	0,782
85	CSF1R	C5a	0,782

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 164/374

161/284

86	TIMP1	C5a	0,781
87	TFPI	KLK7	0,781
88	C5	KLKB1	0,781
89	CTSB	FCGR3B	0,781
90	APOA1	MMP7	0,781
91	IL12A-IL12B	CTSB	0,781
92	C5	MDK	0,780
93	MDK	CTSB	0,780
94	C5	TNFRSF1B	0,780
95	C2	ACP5	0,780
96	IL12A-IL12B	C2	0,780
97	NRP1	TFPI	0,780
98	C5	KIT	0,779
99	FCGR3B	ETHE1	0,779
100	C5-c6	C2	0,779

Tabela 4: Painéis de 3 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5	C5a	CTSB	0,871
2	C5	CTSB	ETHE1	0,870
3	C5	CTSB	HAMP	0,866
4	C5	CCL18	CTSB	0,865
5	C5	KIT	CTSB	0,862
6	C5	CTSB	THBS4	0,861
7	KIT	C5a	CTSB	0,861
8	C5a	CCL18	CTSB	0,859
9	CTSB	HAMP	ETHE1	0,859
10	CTSB	KLK7	HAMP	0,859
11	C5a	CTSB	KLK7	0,859
12	C9	C5	CTSB	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 165/374

162/284

13	C5-C6	C5a	CTSB	0,858
14	C5a	CTSB	ETHE1	0,858
15	C5	ALPL	CTSB	0,857
16	C5a	CTSB	HAMP	0,856
17	KIT	CTSB	HAMP	0,856
18	KIT	CTSB	ETHE1	0,854
19	C5	LTF	CTSB	0,854
20	C5a	CTSB	THBS4	0,854
21	C5	CCL23	CTSB	0,854
22	C5	APOA1	CTSB	0,854
23	CCL18	CTSB	ETHE1	0,853
24	C5	CTSB	IL11RA	0,853
25	C5	CTSB	C2	0,852
26	C5a	CTSB	C2	0,852
27	CTSB	THBS4	ETHE1	0,852
28	CTSB	KLK7	ETHE1	0,851
29	C5-C6	CTSB	HAMP	0,851
30	C5a	CCL23	CTSB	0,850
31	C9	CTSB	ETHE1	0,850
32	C5	CTSB	KLK7	0,849
33	C5-C6	CTSB	ETHE1	0,849
34	GDF11	C5a	CTSB	0,849
35	CTSB	THBS4	HAMP	0,848
36	CCL23	CTSB	ETHE1	0,848
37	PLAT	C5	CTSB	0,848
38	C5a	CTSB	IL11RA	0,848
39	PLAT	C5a	CTSB	0,848
40	C9	KIT	CTSB	0,847
41	C5	VEGFA	CTSB	0,847

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 166/374

163/284

42	CTSB	C2	HAMP	0,847
43	C5	CCL23	CTSB	0,847
44	CTSB	C2	ETHE1	0,847
45	C5	CSF1R	APOA1	0,846
46	CCL18	CTSB	HAMP	0,846
47	CTSB	C2	IL11RA	0,846
48	C5a	CCL23	CTSB	0,846
49	CDF 11	CTSB	HAMP	0,846
50	C9	CTSB	THBS4	0,845
51	C5a	CTSB	CDK5-CDK5R1	0,845
52	APOA1	CTSB	ETHE1	0,845
53	C9	C5a	CTSB	0,845
54	C9	CCL18	CTSB	0,844
55	C5	CTSB	TFPI	0,844
56	CCL18	CTSB	THBS4	0,844
57	KIT	CTSB	THBS4	0,844
58	C9	CTSB	KLK7	0,844
59	CTSB	C2	THBS4	0,844
60	C5-C6	CCL18	CTSB	0,843
61	C5	CSF1R	CTSB	0,843
62	C9	CTSB	HAMP	0,843
63	C5	CTSB	ACP5	0,843
64	C5	CSF1R	CCL18	0,842
65	C5-C6	KIT	CTSB	0,842
66	C5	MMP7	CTSB	0,842
67	PLAT	C9	CTSB	0,842
68	C5	CTSB	NRP1	0,842
69	MMP7	C5a	CTSB	0,842
70	C5	CTSB	LBP	0,841

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 167/374

164/284

71	CSF1R	C5a	CTSB	0,841
72	C5-C6	C9	CTSB	0,841
73	C5	GDF11	CTSB	0,841
74	KIT	CCL18	CTSB	0,840
75	CTSB	THBS4	CRP	0,840
76	C5	CTSB	AHSC	0,840
77	C9	CTSB	C2	0,840
78	LTF	C5a	CTSB	0,840
79	C5a	CTSB	TFPI	0,840
80	C5a	CTSB	TNFRSF1B	0,839
81	ALPL	C5a	CTSB	0,839
82	C5a	CTSB	NRP1	0,839
83	APOA1	C5a	CTSB	0,839
84	CCL23	CTSB	ETHE1	0,839
85	C5a	CTSB	FCGR3B	0,838
86	CTSB	TFPI	ETHE1	0,838
87	C5	KLK8	CTSB	0,838
88	C5-C6	C5	CTSB	0,838
89	C5a	CTSB	KLK3-SERPINA3	0,838
90	CTSB	LBP	ETHE1	0,838
91	CTSB	IL11RA	ETHE1	0,838
92	CTSB	HAMP	IL11RA	0,838
93	ALPL	CTSB	KLK7	0,838
94	CCL18	CTSB	KLK7	0,838
95	C5a	CTSB	INSR	0,838
96	CTSB	C2	KLK7	0,838
97	CTSB	AHSC	ETHE1	0,838
98	C5-C6	CTSB	THBS4	0,838
99	C5	CTSB	KLKB1	0,837

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 168/374

165/284

100

C5a

CTSB

LBP

0,837

Tabela 5: Painéis de 4 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5	CCL18	CTSB	ETHE1	0,882
2	C5	C5a	CCL18	CTSB	0,880
3	C5	CTSB	HAMP	ETHE1	0,880
4	C5	KIT	C5a	CTSB	0,880
5	C5	C5a	CTSB	ETHE1	0,880
6	C5	CTSB	THBS4	ETHE1	0,878
7	C5	LTF	CTSB	ETHE1	0,877
8	C5	CSF1R	C5a	CTSB	0,877
9	PLAT	C5	C5a	CTSB	0,876
10	C5	ALPL	CTSB	ETHE1	0,876
11	C5	KIT	CTSB	ETHE1	0,875
12	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,875
13	C5	KIT	CTSB	HAMP	0,875
14	C5	CCL23	CTSB	ETHE1	0,875
15	C5a	CTSB	KLK7	ETHE1	0,875
16	PLAT	C5	CTSB	ETHE1	0,875
17	C5	C5a	CTSB	HAMP	0,874
18	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1	0,874
19	C5	KIT	CCL18	CTSB	0,874
20	C9	C5	CTSB	ETHE1	0,874
21	C5	CCL18	CTSB	THBS4	0,874
22	C5-C6	CCL18	CTSB	ETHE1	0,874
23	C5	LTF	C5a	CTSB	0,874
24	C5	ALPL	C5a	CTSB	0,873
25	KIT	CTSB	HAMP	ETHE1	0,873
26	C5	C5a	CTSB	KLK7	0,873

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 169/374

166/284

27	C5	C5a	CTSB	THBS4	0,872
28	C5-C6	C5a	CCL18	CTSB	0,872
29	C5	CTSB	KLK7	HAMP	0,872
30	C5	C5a	CTSB	ACP5	0,872
31	C5	C5a	CTSB	IL11RA	0,872
32	C5	C5a	CCL23	CTSB	0,872
33	C5	CCL18	CTSB	HAMP	0,872
34	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,872
35	C5	KIT	VEGFA	CTSB	0,871
36	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,871
37	C5	APOA1	CTSB	ETHE1	0,871
38	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1	0,871
39	KIT	C5a	CTSB	ETHE1	0,871
40	PLAT	C9	C5	CTSB	0,871
41	C5	ALPL	CTSB	THBS4	0,870
42	C5	ALPL	CCL18	CTSB	0,870
43	C5	CSF1R	CTSB	ETHE1	0,870
44	C5	CTSB	THBS4	HAMP	0,870
45	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	0,870
46	C5	CTSB	KLK7	ETHE1	0,869
47	ALPL	C5a	CTSB	KLK7	0,869
48	MMP7	C5a	CTSB	KLK7	0,869
49	C5	LTF	CCL18	CTSB	0,869
50	C9	C5	KIT	CTSB	0,869
51	C5-C6	CTSB	HAMP	ETHE1	0,869
52	C5	ALPL	CTSB	HAMP	0,869
53	LTF	C5a	CTSB	KLK7	0,869
54	C5-C6	KIT	C5a	CTSB	0,869
55	C5	ALPL	CTSB	IL11RA	0,868

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 170/374

167/284

56	KIT	C5a	CTSB	HAMP	0,868
57	C9	C5	CCL18	CTSB	0,868
58	C5	LTF	CTSB	THBS4	0,868
59	C5	CTSB	ACP5	ETHE1	0,868
60	C5	CCL18	CTSB	IL11RA	0,868
61	CCL18	CTSB	HAMP	ETHE1	0,868
62	PLAT	KIT	C5a	CTSB	0,868
63	C5-C6	C5a	CTSB	ETHE1	0,868
64	C5	C5a	CTSB	C2	0,868
65	C9	C5	ALPL	CTSB	0,868
66	C5	CTSB	IL11RA	ETHE1	0,868
67	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1	0,868
68	C5	CTSB	C2	ETHE1	0,868
69	C5	KIT	CTSB	THBS4	0,867
70	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1	0,867
71	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,867
72	C5	CSF1R	CCL18	ETHE1	0,867
73	KIT	CCL18	CTSB	ETHE1	0,867
74	C5	C5a	CTSB	CDK5-CDK5R1	0,867
75	C5	C5a	CCL23	CTSB	0,867
76	C5	KIT	ALPL	CTSB	0,867
77	KIT	CSF1R	C5a	CTSB	0,867
78	C5	KIT	LTF	CTSB	0,867
79	C5	LTF	CTSB	IL11RA	0,867
80	C9	C5	CSF1R	CTSB	0,866
81	C5-C6	C5a	CTSB	KLK7	0,866
82	C5	C5a	CTSB	INSR	0,866
83	C5a	CCL23	CTSB	KLK7	0,866
84	C5	GDF11	CTSB	HAMP	0,866

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 171/374

168/284

85	C5	GDF11	C5a	CTSB	0,866
86	C5	CSF1R	CTSB	HAMP	0,866
87	C5	C5a	CTSB	TNFRSF1B	0,866
88	C5	CCL23	CTSB	ETHE1	0,866
89	C9	C5	LTF	CTSB	0,866
90	C9	C5	CTSB	HAMP	0,866
91	C9	C5	CTSB	THBS4	0,866
92	C5	LTF	CTSB	HAMP	0,866
93	C5-C6	C5	C5a	CTSB	0,865
94	C5	KLK8	C5a	CTSB	0,865
95	C5	VEGFA	CTSB	ETHE1	0,865
96	C5a	CTSB	HAMP	ETHE1	0,865
97	C5	MMP7	C5a	CTSB	0,865
98	C5	C5a	CTSB	ESM1	0,865
99	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	0,865
100	C5a	CTSB	C2	ETHE1	0,865
Tabela	6: Painéis de 5 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5	CSF1R	C5a	CTSB	ETHE1	0,892
2	C5	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1	0,889
3	C5	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1	0,888
4	C5	CSF1R	CCL18	CTSB	ETHE1	0,887
5	PLAT	C5	C5a	CTSB	ETHE1	0,886
6	C5	KIT	CSF1R	C5a	CTSB	0,886
7	C5	KIT	CCL18	CTSB	ETHE1	0,886
8	C5	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,886
9	C5	LTF	CCL18	CTSB	ETHE1	0,886
10	C5	KIT	C5a	CTSB	ETHE1	0,885
11	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1	0,885

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 172/374

169/284

12	C5	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,885
13	C5	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	0,885
14	C5	ALPL	CCL18	CTSB	ETHE1	0,884
15	C5	C5a	CTSB	KLK7	ETHE1	0,884
16	C5	ALPL	CTSB	THBS4	ETHE1	0,884
17	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1	0,884
18	C5	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1	0,884
19	C5	CCL18	CTSB	HAMP	ETHE1	0,884
20	C5	KIT	CTSB	HAMP	ETHE1	0,884
21	C5	CSF1R	C5a	CTSB	THBS4	0,884
22	C5	LTF	CTSB	THBS4	ETHE1	0,884
23	C5	ALPL	C5a	CTSB	ETHE1	0,883
24	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1	0,883
25	C5	KIT	LTF	C5a	CTSB	0,883
26	PLAT	C5	KIT	C5a	CTSB	0,883
27	PLAT	C9	C5	CTSB	ETHE1	0,883
28	C5	LTF	C5a	CTSB	ETHE1	0,883
29	C5	CSF1R	CTSB	HAMP	ETHE1	0,883
30	C9	C5	CSF1R	CTSB	ETHE1	0,882
31	PLAT	C5	CTSB	THBS4	ETHE1	0,882
32	C5	C5a	CCL23	CTSB	ETHE1	0,882
33	C5	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,882
34	C5-C6	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1	0,882
35	C5	CSF1R	CTSB	THBS4	ETHE1	0,882
36	C5	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,882
37	C5	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,882
38	C5	KIT	ALPL	C5a	CTSB	0,882
39	C5	CCL23	CCL18	CTSB	ETHE1	0,881
40	PLAT	C5	CCL18	CTSB	ETHE1	0,881

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 173/374

170/284

41	C5	C5a	CTSB	THBS4	ETHE1	0,881
42	C5	KLK8	CCL18	CTSB	ETHE1	0,881
43	C5	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	0,881
44	C5	KIT	ALPL	CCL18	CTSB	0,881
45	PLAT	C5	C5a	CCL18	CTSB	0,881
46	C5	CCL18	CTSB	IL11RA	ETHE1	0,881
47	C5	C5a	CTSB	INSR	ETHE1	0,881
48	C5	KIT	C5a	CTSB	HAMP	0,881
49	C5	C5a	CTSB	ACP5	ETHE1	0,881
50	C5-C6	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1	0,880
51	C5	LTF	C5a	CTSB	KLK7	0,880
52	C5	C5a	CTSB	HAMP	ETHE1	0,880
53	C5	KIT	ALPL	CTSB	ETHE1	0,880
54	C5	KIT	LTF	CTSB	ETHE1	0,880
55	C5	ALPL	C5a	CTSB	KLK7	0,880
56	C5-C6	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,880
57	C5	CTSB	THBS4	HAMP	ETHE1	0,880
58	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,880
59	C5	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1	0,880
60	C5	CCL18	CTSB	ACP5	ETHE1	0,880
61	C5	KIT	LTF	CCL18	CTSB	0,880
62	MMP7	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,880
63	C5	KIT	C5a	CCL23	CTSB	0,880
64	C9	C5	CCL18	CTSB	ETHE1	0,880
65	C5	CSF1R	C5a	CTSB	HAMP	0,880
66	C5	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	0,880
67	C5	C5a	CCL18	CTSB	HAMP	0,880
68	C5	CSF1R	C5a	CTSB	IL11RA	0,880
69	C5a	CCL23	CTSB	KLK7	ETHE1	0,880

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 174/374

171/284

70	C5-C6	KIT	CCL18	CTSB	ETHE1	0,879
71	C5	CSF1R	CCL23	CTSB	ETHE1	0,879
72	C5	LTF	CCL23	CTSB	ETHE1	0,879
73	C5	KLK8	C5a	CCL18	CTSB	0,879
74	LTF	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,879
75	PLAT	C5	CCL23	CTSB	ETHE1	0,879
76	C5	KIT	CSF1R	CTSB	ETHE1	0,879
77	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,879
78	KIT	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1	0,879
79	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1	0,879
80	C5	KIT	C5a	CTSB	THBS4	0,879
81	C5	VEGFA	CCL18	CTSB	ETHE1	0,879
82	C5	CSF1R	C5a	CTSB	KLK7	0,879
83	CSF1R	C5a	CTSB	KLK7	ETHE1	0,879
84	C5-C6	C5a	CTSB	KLK7	ETHE1	0,879
85	MMP7	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,879
86	C5-C6	C5	CCL18	CTSB	ETHE1	0,879
87	C5	ALPL	CTSB	HAMP	ETHE1	0,879
88	C5	KIT	VEGFA	CTSB	ETHE1	0,879
89	C5	CCL18	CTSB	C2	ETHE1	0,879
90	C5	KIT	CCL18	CTSB	HAMP	0,879
91	C5	CCL23	CTSB	THBS4	ETHE1	0,879
92	C5	ALPL	C5a	CTSB	THBS4	0,879
93	C5	VEGFA	CTSB	THBS4	ETHE1	0,879
94	C5	LTF	CCL18	CTSB	THBS4	0,879
95	C5	LTF	CTSB	IL11RA	ETHE1	0,878
96	MMP7	C5a	CTSB	KLK7	ETHE1	0,878
97	C5	KIT	VEGFA	CCL18	CTSB	0,878
98	C5	ALPL	CCL18	CTSB	THBS4	0,878

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 175/374

172/284

99	C5-C6	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,878
100	C5	APOA1	CCL18	CTSB	ETHE1	0,878

Tabela 7: Painéis de 6 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,898
2	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	THBS4	0,896
3	C5 ETHE1	KIT	CSF1R	C5a	CTSB	0,895
4	C5 ETHE1	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,894
5	PLAT ETHE1	C5	CSF1R	C5a	CTSB	0,893
6	C5 ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	THBS4	0,893
7	C5 ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	THBS4	0,892
8	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	KLK7	0,892
9	C5 ETHE1	LTF	CCL18	CTSB	THBS4	0,892
10	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,892
11	C5 ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,892
12	C5 ETHE1	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,892
13	PLAT ETHE1	C5	C5a	CCL18	CTSB	0,891

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 176/374

173/284

14	C5 CTSB	KIT	CSF1R	C5a	CCL18	0,891
15	C5 THBS4	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,891
16	PLAT ETHE1	C5	KIT	C5a	CTSB	0,891
17	C5 ETHE1	KIT	LTF	CCL18	CTSB	0,891
18	C5-C6 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,890
19	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL23	CTSB	0,890
20	C5 ETHE1	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	0,890
21	C5 ETHE1	LTF	CCL18	CTSB	KLK7	0,890
22	C5 ETHE1	KIT	CCL18	CTSB	THBS4	0,890
23	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	0,890
24	C5 ETHE1	KIT	CCL18	CTSB	HAMP	0,890
25	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	IL11RA	0,890
26	C5 KLK7	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,890
27	C5 ETHE1	KIT	CSF1R	CCL18	CTSB	0,890
28	C5 ETHE1	KIT	VEGFA	CCL18	CTSB	0,889

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 177/374

174/284

29	C5 ETHE1	KIT	ALPL	CCL18	CTSB	0,889
30	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,889
31	PLAT ETHE1	C5	C5a	CTSB	KLK7	0,889
32	C5 CTSB	KIT	LTF	C5a	CCL18	0,889
33	C5 ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,889
34	PLAT ETHE1	C9	C5	CSF1R	CTSB	0,889
35	C5 ETHE1	KIT	LTF	C5a	CTSB	0,889
36	C5 ETHE1	LTF	CCL18	CTSB	IL11RA	0,889
37	LTF ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,889
38	C5 ETHE1	CSF1R	CTSB	KLK7	HAMP	0,889
39	C5-C6 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,888
40	C5 THBS4	KIT	CSF1R	C5a	CTSB	0,888
41	C5 THBS4	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,888
42	C5 ETHE1	KIT	ALPL	C5a	CTSB	0,888
43	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL23	CTSB	0,888

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 178/374

175/284

44	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,888
45	C5 ETHE1	ALPL	CTSB	KLK7	HAMP	0,888
46	C5 KLK7	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	0,888
47	C5 ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	KLK7	0,888
48	C5 ETHE1	ALPL	C5a	CTSB	KLK7	0,888
49	C5 ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	IL11RA	0,888
50	C5 ETHE1	KIT	CSF1R	CTSB	HAMP	0,888
51	C5 ETHE1	CSF1R	CCL23	CCL18	CTSB	0,888
52	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	0,888
53	C5 IL11RA	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,888
54	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	ACP5	0,888
55	CSF1R ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,888
56	C9 ETHE1	C5	CSF1R	CCL18	CTSB	0,888
57	PLAT ETHE1	C5	C5a	CCL23	CTSB	0,888
58	PLAT CTSB	C5	KIT	CSF1R	C5a	0,888

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 179/374

176/284

59	C5 ETHE1	LTF	C5a	CTSB	KLK7	0,888
60	C5-C6 ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	0,888
61	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	ACP5	0,888
62	C5 HAMP	CSF1R	C5a	CTSB	KLK7	0,888
63	C5 IL11RA	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,888
64	C5 ETHE1	CSF1R	ALPL	C5a	CTSB	0,888
65	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	HAMP	0,888
66	C5 ETHE1	C5a	CCL23	CTSB	KLK7	0,888
67	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,888
68	C5 ETHE1	KIT	KLK8	CCL18	CTSB	0,888
69	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	INSR	0,887
70	C5 ETHE1	LTF	CTSB	KLK7	HAMP	0,887
71	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	HAMP	0,887
72	C5-C6 ETHE1	KIT	CSF1R	C5a	CTSB	0,887
73	C5-C6 ETHE1	KIT	C5a	CCL18	CTSB	0,887

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 180/374

177/284

74	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,887
75	C5 ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	IL11RA	0,887
76	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	0,887
77	C5-C6 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	0,887
78	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	INSR	0,887
79	C9 ETHE1	C5	CSF1R	CTSB	THBS4	0,887
80	C5 ETHE1	CSF1R	LTF	C5a	CTSB	0,887
81	C5 THBS4	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	0,887
82	C5 ETHE1	KIT	C5a	CCL23	CTSB	0,887
83	C5 HAMP	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,887
84	MMP7 ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	HAMP	0,887
85	C5 ETHE1	C5a	CTSB	ACP5	KLK7	0,887
86	C5 ETHE1	MMP7	C5a	CTSB	KLK7	0,887
87	C5 ETHE1	CCL18	CTSB	THBS4	HAMP	0,887
88	C5-C6 KLK7	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,887

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 181/374

178/284

89	C5 ETHE1	CSF1R	ALPL	CTSB	THBS4	0,887
90	C5 ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	HAMP	0,887
91	C5 KLK7	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,887
92	C5-C6 ETHE1	KIT	CCL18	CTSB	HAMP	0,887
93	C5 ETHE1	KIT	C5a	CTSB	ACP5	0,887
94	PLAT ETHE1	C5	C5a	CTSB	THBS4	0,887
95	C5 THBS4	LTF	C5a	CCL18	CTSB	0,887
96	C5 CTSB	KIT	ALPL	C5a	CCL18	0,886
97	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	0,886
98	C5 ETHE1	VEGFA	CCL18	CTSB	THBS4	0,886
99	C5 ETHE1	KIT	C5a	CTSB	HAMP	0,886
100	C5 ETHE1	LTF	C5a	CCL23	CTSB	0,886

Tabela 8: Painéis de 7 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,900
2	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	0,900

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 182/374

179/284

3	PLAT CTSB	C5 ETHE1	KIT	CSF1R	C5a	0,899
4	C5 IL11RA	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,898
5	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,898
6	C5 KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,897
7	C5-C6 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,897
8	C5 HAMP	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	0,896
9	C5 THBS4	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,896
10	C5 KLK7	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,896
11	C5 CTSB	KIT ETHE1	VEGFA	CSF1R	CCL18	0,896
12	PLAT THBS4	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,896
13	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	0,895
14	PLAT CTSB	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	0,895
15	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R	C5a	CCL18	0,895
16	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	CTSB	0,895
17	C5 CTSB	KIT ETHE1	VEGFA	CSF1R	C5a	0,895

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 183/374

180/284

18	C5 THBS4	VEGFA ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	0,895
19	C5 KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL23	CTSB	0,895
20	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	KLK8	C5a	CCL18	0,894
21	C5-C6 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	0,894
22	C5-C6 CTSB	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	0,894
23	C5 CTSB	KIT ETHE1	LTF	C5a	CCL18	0,894
24	C5-C6 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894
25	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	LTF	C5a	0,894
26	PLAT CTSB	C5 ETHE1	KIT	C5a	CCL18	0,894
27	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	ALPL	C5a	0,894
28	C5 KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894
29	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	ALPL	C5a	CCL18	0,894
30	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	CCL18	0,894
31	C5-C6 KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894
32	C5 CDK5-CDK5R1	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 184/374

181/284

33	PLAT CTSB	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL23	0,894
34	C5 HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,894
35	C5 HAMP	CSF1R ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,894
36	C5 CTSB	KIT ETHE1	KLK8	C5a	CCL18	0,894
37	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CCL23	0,894
38	C5 THBS4	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894
39	C5 KLK7	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	CTSB	0,894
40	C5 HAMP	KIT ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	0,894
41	PLAT KLK7	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,894
42	C5 THBS4	KIT ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	0,894
43	C5 THBS4	KIT ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,894
44	C5 THBS4	KIT ETHE1	LTF	CCL18	CTSB	0,894
45	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	MMP7	C5a	CTSB	0,894
46	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	LTF	CCL18	CTSB	0,894
47	C5 ACP5	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,894

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 185/374

182/284

48	C5 CTSB	KIT ETHE1	ALPL	C5a	CCL18	0,894
49	C5 KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	ACP5	0,893
50	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	ALPL	C5a	CTSB	0,893
51	C5 THBS4	KIT ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	0,893
52	C5-C6 HAMP	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	0,893
53	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	CTSB	0,893
54	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	ALPL	C5a	CTSB	0,893
55	C5 ACP5	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,893
56	C5 TFPI	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,893
57	C5 HAMP	ALPL ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,893
58	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	ACP5	0,893
59	PLAT THBS4	C9 ETHE1	C5	CSF1R	CTSB	0,893
60	C5 CTSB	KIT ETHE1	LTF	C5a	CCL23	0,893
61	C5 FGFR3	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,893
62	PLAT KLK7	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,893

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 186/374

183/284

63	PLAT IL11RA	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,893
64	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	CCL18	0,893
65	C5 HAMP	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	CTSB	0,893
66	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL	C5a	CCL18	0,893
67	C5 HAMP	LTF ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,893
68	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	LTF	CCL18	0,893
69	PLAT CTSB	C5 ETHE1	CSF1R	C5a	CCL23	0,893
70	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R	ALPL	C5a	0,893
71	CSF1R HAMP	MMP7 ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	0,893
72	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	CTSB	0,892
73	C5 IL11RA	CSF1R ETHE1	ALPL	CCL18	CTSB	0,892
74	C5 KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
75	PLAT CTSB	C9 ETHE1	C5	CSF1R	C5a	0,892
76	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R	LTF	C5a	0,892
77	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	MMP7	C5a	0,892

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 187/374

184/284

78	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF	C5a	CCL18	0,892
79	C9 THBS4	C5 ETHE1	CSF1R	CCL18	CTSB	0,892
80	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	CDF11	C5a	CCL18	0,892
81	C5 THBS4	LTF ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
82	PLAT CTSB	C9 ETHE1	C5	CSF1R	CCL18	0,892
83	C5 CTSB	KIT ETHE1	VECFA	KLK8	CCL18	0,892
84	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	CTSB	0,892
85	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,892
86	C5 CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	CCL23	0,892
87	C5-C6 KLK7	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
88	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
89	C5 CTSB	CSF1R THBS4	ALPL	C5a	CCL18	0,892
90	C5 INSR	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,892
91	C5 CTSB	CSF1R IL11RA	LTF	C5a	CCL18	0,892
92	C5 ESM1	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 188/374

185/284

93	C5-C6 HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	KLK7	0,892
94	PLAT THBS4	C5 ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
95	C5 HAMP	ALPL ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	0,892
96	C5 IL11RA	LTF ETHE1	C5a	CCL18	CTSB	0,892
97	C5 CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	C5a	CCL18	0,892
98	C5 HAMP	LTF ETHE1	C5a	CTSB	KLK7	0,892
99	C5 KLK7	ALPL ETHE1	C5a	CCL23	CTSB	0,892
100	C5 CTSB	KIT THBS4	LTF	C5a	CCL18	0,892
Tabe	a 9: Painéis de	3 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,902
2	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,902
3	PLAT CCL18	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	0,901
4	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	0,901
5	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	0,901
6	C5-C6 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,900

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 189/374

186/284

7	C5-C6 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,900
8	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,899
9	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	ALPL	C5a	0,899
10	C5 KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,899
11	C5 CTSB	KIT THBS4	VEGFA ETHE1	CSF1R	CCL18	0,899
12	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	KLK8	C5a	0,899
13	C5 CTSB	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,899
14	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	C5a	0,899
15	C5 CTSB	CSF1R THBS4	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	0,899
16	C5-C6 CTSB	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,899
17	C5-C6 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,899
18	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	KLK8	0,898
19	PLAT CTSB	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,898
20	C5 CTSB	CSF1R IL11RA	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	0,898
21	C5 CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	0,898

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 190/374

187/284

22	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	0,898
23	C5 CTSB	CSF1R IL11RA	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,898
24	C5 CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	CCL18	0,898
25	C5 CCL23	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	0,898
26	C5 CTSB	ALPL KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	0,898
27	C5 CTSB	LTF KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	0,898
28	PLAT CCL23	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	0,898
29	C5 CTSB	KIT ACP5	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,898
30	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	0,898
31	C5-C6 KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,898
32	C5 CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	0,898
33	PLAT CTSB	C5 THBS4	KIT ETHE1	CSF1R	C5a	0,898
34	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	ALPL	CCL18	0,898
35	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	LTF	CCL18	0,898
36	C5 CTSB	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	0,898

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 191/374

188/284

37	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL23	0,898
38	C5 THBS4	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,898
39	C5 CTSB	CSF1R THBS4	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	0,898
40	C5 CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,898
41	C5-C6 CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	CCL18	0,897
42	PLAT CTSB	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,897
43	C5 CTSB	KIT TFPI	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,897
44	C5 CCL18	CSF1R CTSB	GDF11 ETHE1	LTF	C5a	0,897
45	C5 THBS4	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,897
46	C5 KLK7	KIT HAMP	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	0,897
47	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	LTF	C5a	0,897
48	PLAT CTSB	C5 IL11RA	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,897
49	C5 CTSB	LTF KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	CCL18	0,897
50	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	C5a	0,897
51	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	ALPL	C5a	0,897

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 192/374

189/284

52	C5 CTSB	IL12A-IL12B THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,896
53	C5 CTSB	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	0,896
54	PLAT CTSB	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	MMP7	C5a	0,896
55	C5 KLK7	CSF1R HAMP	MMP7 ETHE1	C5a	CTSB	0,896
56	C5 CTSB	KIT KLK7	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,896
57	C5 CTSB	KIT IL11RA	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,896
58	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	MMP7	C5a	0,896
59	C5 CTSB	CSF1R THBS4	LTF KLK7	C5a	CCL18	0,896
60	C5 THBS4	CSF1R INSR	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
61	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	0,896
62	C5 KLK7	KIT HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
63	C5 KLK7	LTF INSR	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
64	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	LTF	C5a	0,896
65	C5 CTSB	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	C5a	CCL23	0,896
66	C5-C6 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	0,896

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 193/374

190/284

67	C5 CTSB	VEGFA IL11RA	CSF1R ETHE1	C5a	CCL18	0,896
68	C5 ACP5	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
69	PLAT CTSB	C9 THBS4	C5 ETHE1	CSF1R	CCL18	0,896
70	PLAT C5a	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	ALPL	0,896
71	C5 CTSB	KIT THBS4	LTF ETHE1	C5a	CCL18	0,896
72	C5-C6 CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	0,896
73	C5 THBS4	KIT HAMP	CSF1R ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
74	PLAT KLK7	C5 HAMP	CSF1R ETHE1	C5a	CTSB	0,896
75	C5 KLK7	LTF HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
76	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R IL11RA	LTF	C5a	0,896
77	PLAT C5a	C5 CTSB	KIT ETHE1	VEGFA	CSF1R	0,896
78	C5 CTSB	KIT THBS4	ALPL ETHE1	C5a	CCL18	0,896
79	KIT KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
80	C5 CTSB	ALPL KLK7	C5a ETHE1	CCL23	CCL18	0,896
81	C5 THBS4	CSF1R ESM1	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 194/374

191/284

82	C5 TFPI	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
83	C5 CTSB	KIT THBS4	KLK8 ETHE1	C5a	CCL18	0,896
84	C5-C6 THBS4	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
85	PLAT CTSB	C5 KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	0,896
86	PLAT C5a	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	KLK8	0,896
87	C5 TFPI	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	CTSB	0,896
88	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	0,896
89	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	CCL23	0,896
90	PLAT	C5	ALPL	C5a	CCL18	0,896
	CTSB	KLK7	ETHE1
91	C5	KIT	CSF1R	ALPL	C5a	0,896
	CCL18	CTSB	THBS4
92	PLAT	C5	LTF	C5a	CCL18	0,896
	CTSB	KLK7	ETHE1
93	PLAT	C5	KIT	CSF1R	C5a	0,896
	CCL23	CTSB	ETHE1
94	PLAT	C9	C5	KIT	CSF1R	0,896
	CCL18	CTSB	ETHE1
95	C5	CSF1R	LTF	C5a	CTSB	0,895
	KLK7	HAMP	ETHE1
96	C5-C6	KIT	VEGFA	CSF1R	CCL18	0,895
	CTSB	THBS4	ETHE1

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 195/374

192/284

97	C5	ALPL	C5a	CCL18	CTSB	0,895
	THBS4	KLK7	ETHE1
98	CSF1R	LTF	C5a	CCL23	CCL18	0,895
	CTSB	KLK7	ETHE1
99	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	C5a	0,895
	CTSB	THBS4	ETHE1
100	C5	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	0,895
	THBS4	CDK5-CDK5R1	ETHE1
Tabe	a 10: Painéis de 9 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,903
2	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,902
3	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	0,902
4	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	0,902
5	C5-C6 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	0,902
6	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,902
7	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	ALPL ETHE1	C5a	0,902
8	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	C5a	0,902
9	C5 CCL18	CSF1R CTSB	ALPL KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,901
10	PLAT CCL18	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,901

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 196/374

193/284

11	C5 CTSB	CSF1R THBS4	ALPL KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,901
12	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R IL11RA	LTF ETHE1	C5a	0,901
13	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,901
14	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	KLK8 ETHE1	C5a	0,901
15	C5-C6 C5a	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	0,901
16	C5 CTSB	CSF1R THBS4	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,901
17	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R ETHE1	KLK8	0,901
18	C5 CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,901
19	C5-C6 CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,901
20	C5 CTSB	CSF1R TFPI	ALPL KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,900
21	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,900
22	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	0,900
23	C5-C6 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,900
24	PLAT C5a	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	KLK8	0,900
25	C5 CTSB	CSF1R TFPI	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,900

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 197/374

194/284

26	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,900
27	C5 CCL23	KIT CTSB	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	C5a	0,900
28	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,900
29	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,900
30	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF IL11RA	C5a ETHE1	CCL18	0,900
31	C5-C6 C5a	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	0,900
32	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,900
33	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R KLK7	ALPL ETHE1	C5a	0,900
34	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	0,900
35	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,900
36	C5 CCL23	KIT CCL18	CSF1R CTSB	LTF ETHE1	C5a	0,900
37	C5 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R ETHE1	KLK8	0,900
38	C5 CTSB	LTF THBS4	C5a KLK7	CCL23 ETHE1	CCL18	0,900
39	C5-C6 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,900
40	PLAT CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL ETHE1	C5a	0,900

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 198/374

195/284

41	C5-C6 CTSB	CSF1R THBS4	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,900
42	C5 CTSB	KIT KLK7	LTF HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,899
43	C5 CTSB	KIT THBS4	CSF1R INSR	C5a ETHE1	CCL18	0,899
44	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	C5a	0,899
45	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R IL11RA	ALPL ETHE1	C5a	0,899
46	C5 CCL18	CSF1R CTSB	ALPL KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,899
47	C5 CTSB	CSF1R THBS4	C5a KLK7	CCL23 ETHE1	CCL18	0,899
48	C5 THBS4	CSF1R KLK7	C5a HAMP	CCL18 ETHE1	CTSB	0,899
49	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,899
50	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	CCL23	0,899
51	C5 CCL18	KIT CTSB	LTF KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,899
52	C5-C6 CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL ETHE1	C5a	0,899
53	C5 CTSB	CSF1R KLK7	ALPL IL11RA	C5a ETHE1	CCL18	0,899
54	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,899
55	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF THBS4	C5a ETHE1	CCL23	0,899

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 199/374

196/284

56	C5-C6 CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,899
57	C5 CTSB	CSF1R THBS4	MMP7 KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,899
58	C5 CTSB	KIT ACP5	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL18	0,899
59	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	MMP7 ETHE1	C5a	0,899
60	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R TFPI	LTF ETHE1	C5a	0,899
61	C5 CCL18	KIT CTSB	LTF THBS4	C5a ETHE1	CCL23	0,899
62	C5-C6 C5a	PLAT CCL18	C5 CTSB	KIT ETHE1	CSF1R	0,899
63	PLAT CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,899
64	C5 CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,899
65	C5 CCL18	CSF1R CTSB	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,899
66	C9 CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,899
67	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R IL11RA	MMP7 ETHE1	C5a	0,899
68	C5 C5a	KIT CCL18	CSF1R CTSB	LTF ETHE1	KLK8	0,899
69	PLAT C5a	C5 CCL23	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	CSF1R	0,899
70	C5 CTSB	KIT TFPI	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL18	0,899

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 200/374

197/284

71	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL23	0,899
72	PLAT C5a	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	0,899
73	C5-C6 CCL18	PLAT CTSB	C5 THBS4	CSF1R ETHE1	C5a	0,899
74	C5 CCL18	CSF1R CTSB	MMP7 KLK7	ALPL ETHE1	C5a	0,899
75	C5 CTSB	KIT KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,899
76	C5 CTSB	KIT TFPI	CSF1R THBS4	LTF ETHE1	CCL18	0,899
77	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA IL11RA	CSF1R ETHE1	C5a	0,899
78	C5 CCL18	CSF1R CTSB	MMP7 KLK7	KLK8 ETHE1	C5a	0,899
79	PLAT CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,899
80	C5 CTSB	ALPL THBS4	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,899
81	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,899
82	PLAT CCL18	C5 CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	0,899
83	C5 CCL18	IL12A-IL12B CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,899
84	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R TFPI	ALPL ETHE1	C5a	0,898
85	C5 CTSB	KIT KLK7	VEGFA HAMP	CSF1R ETHE1	C5a	0,898

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 201/374

198/284

86	C5 CTSB	KIT TFPI	CSF1R THBS4	ALPL ETHE1	CCL18	0,898
87	PLAT C5a	C5 CCL23	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	LTF	0,898
88	C5-C6 CTSB	KIT TFPI	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL18	0,898
89	C5 CTSB	VEGFA ACP5	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,898
90	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	C5a	0,898
91	C5 CTSB	CSF1R TFPI	ALPL THBS4	C5a ETHE1	CCL18	0,898
92	C5 CTSB	CSF1R THBS4	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	CCL18	0,898
93	C5 CCL18	KIT CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,898
94	PLAT CCL23	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R ETHE1	C5a	0,898
95	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ESM1	C5a ETHE1	CCL18	0,898
96	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	CCL23	0,898
97	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R IL11RA	C5a ETHE1	CCL18	0,898
98	C5 CTSB	VEGFA THBS4	CSF1R KLK7	C5a ETHE1	CCL23	0,898
99	C5-C6 CTSB	KIT KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	CCL18	0,898
100	C5-C6 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	MMP7 ETHE1	C5a	0,898

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 202/374

199/284

Tabela 11: Painéis de 10 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC
1	C5-C6 C5a	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	0,905
2	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF THBS4	C5a KLK7	CCL23 ETHE1	0,904
3	C5 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	0,904
4	C5-C6 C5a	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	LTF ETHE1	0,904
5	C5 C5a	VEGFA CCL18	CSF1R CTSB	MMP7 KLK7	KLK8 ETHE1	0,904
6	C5-C6 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	0,904
7	C5-C6 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 ETHE1	0,903
8	C5-C6 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 IL11RA	C5a ETHE1	0,903
9	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R THBS4	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	0,903
10	C5 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	0,903
11	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R THBS4	MMP7 KLK7	C5a ETHE1	0,903
12	C5 CCL23	KIT CCL18	CSF1R CTSB	LTF THBS4	C5a ETHE1	0,903
13	C5 CCL18	CSF1R CTSB	ALPL THBS4	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	0,903
14	C5-C6	KIT	VEGFA	CSF1R	LTF	0,903
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 203/374

200/284

15	C5-C6	VEGFA	CSF1R	MMP7	C5a	0,903
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
16	C5	KIT	CSF1R	LTF	C5a	0,903
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
17	C5-C6	C5	VEGFA	CSF1R	C5a	0,903
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
18	C5	VEGFA	CSF1R	MMP7	C5a	0,903
	CCL18	CTSB	KLK7	IL11RA	ETHE1
19	C5-C6	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
20	C5-C6	CSF1R	LTF	C5a	CCL23	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
21	C5	KIT	CSF1R	LTF	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
22	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
23	C5	KIT	CSF1R	ALPL	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
24	C5-C6	C5	VEGFA	CSF1R	ALPL	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
25	C5	KIT	CSF1R	LTF	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
26	C5	CSF1R	LTF	KLK8	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
27	C5	CSF1R	ALPL	C5a	CCL23	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
28	C5-C6	VEGFA	CSF1R	MMP7	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
29	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	C5a	0,902

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 204/374

201/284

	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
30	C5	KIT	CSF1R	LTF	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1
31	C5	KIT	CSF1R	LTF	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	TFPI	THBS4	ETHE1
32	C5-C6	C5	VEGFA	CSF1R	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
33	C5	VEGFA	CSF1R	KLK8	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	KLK7	ESM1	ETHE1
34	PLAT	C5	VEGFA	CSF1R	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
35	C5-C6	C5	CSF1R	LTF	C5a	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
36	C5	VEGFA	CSF1R	C5a	CCL23	0,902
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
37	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	MMP7	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	ETHE1
38	C5	CSF1R	LTF	KLK8	C5a	0,902
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
39	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	KLK8	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	ETHE1
40	C5-C6	C5	KIT	CSF1R	LTF	0,902
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
41	C5	CSF1R	LTF	MMP7	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	KLK7	IL11RA	ETHE1
42	C5	VEGFA	CSF1R	KLK8	C5a	0,901
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
43	C5	KIT	CSF1R	ALPL	KLK8	0,901
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 205/374

202/284

44	KIT	VEGFA	CSF1R	MMP7	KLK8	0,901
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
45	C5	KIT	CSF1R	LTF	KLK8	0,901
	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	ETHE1
46	C5-C6	C5	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
47	C5-C6	KIT	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL23	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
48	C5-C6	VEGFA	CSF1R	KLK8	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
49	PLAT	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	0,901
	KLK8	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1
50	C5	VEGFA	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	KLK7	IL11RA	ETHE1
51	C5	KIT	CSF1R	ALPL	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	TFPI	THBS4	ETHE1
52	C5	CSF1R	MMP7	KLK8	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
53	C5	CSF1R	LTF	KLK8	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	TFPI	KLK7	ETHE1
54	C5	CSF1R	LTF	MMP7	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
55	C5	CSF1R	ALPL	KLK8	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	TFPI	KLK7	ETHE1
56	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	LTF	0,901
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
57	C5-C6	C5	VEGFA	CSF1R	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	ACP5	KLK7	ETHE1
58	PLAT	C5	KIT	CSF1R	KLK8	0,901

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 206/374

203/284

	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
59	C5	CSF1R	MMP7	C5a	CCL18	0,901
	CTSB	THBS4	KLK7	HAMP	ETHE1
60	C5-C6	KIT	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	KLK7	HAMP	ETHE1
61	PLAT	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	0,901
	C5a	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
62	C5-C6	VEGFA	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
63	C5	VEGFA	CSF1R	LTF	C5a	0,901
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
64	C5	CSF1R	ALPL	C5a	CCL18	0,901
	CTSB	TFPI	THBS4	KLK7	ETHE1
65	C5-C6	KIT	VEGFA	CSF1R	C5a	0,901
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
66	C5-C6 C5a	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	0,901
67	C5 C5a	KIT CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	MMP7 ETHE1	0,901
68	C5-C6 CCL23	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	0,901
69	PLAT CSF1R	C9 KLK8	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA ETHE1	0,901
70	C5-C6 C5a	PLAT CCL18	C5 CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R ETHE1	0,901
71	PLAT C5a	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 ETHE1	0,901
72	C5-C6 C5a	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	KLK8 ETHE1	0,901
73	C5-C6	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	0,901

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 207/374

204/284

	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
74	C5-C6 C5a	C5 CCL23	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R ETHE1	0,901
75	C5-C6 C5a	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R THBS4	KLK8 ETHE1	0,901
76	C5-C6 CCL23	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R THBS4	C5a ETHE1	0,901
77	C5 C5a	VEGFA CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	KLK8 ETHE1	0,901
78	C5 CTSB	CSF1R TFPI	LTF THBS4	C5a KLK7	CCL18 ETHE1	0,901
79	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R THBS4	LTF KLK7	C5a ETHE1	0,901
80	C5-C6 KLK8	C5 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R ETHE1	0,901
81	C5 CCL18	KIT CTSB	CSF1R KLK7	MMP7 HAMP	C5a ETHE1	0,901
82	C5 CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	MMP7 HAMP	C5a ETHE1	0,901
83	C5 CCL18	KIT CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	0,901
84	C5 C5a	VEGFA CCL18	CSF1R CTSB	ALPL KLK7	KLK8 ETHE1	0,901
85	C5 CCL23	CSF1R CCL18	LTF CTSB	MMP7 KLK7	C5a ETHE1	0,900
86	C5-C6 CCL18	KIT CTSB	VEGFA KLK7	CSF1R HAMP	C5a ETHE1	0,900
87	C5-C6 CCL23	KIT CCL18	CSF1R CTSB	LTF KLK7	C5a ETHE1	0,900
88	C5-C6	PLAT	C5	KIT	VEGFA	0,900

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 208/374

205/284

	CSF1R	C5a	CCL18	CTSB	ETHE1
89	C5 CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R KLK7	KLK8 IL11RA	C5a ETHE1	0,900
90	C5 CCL23	CSF1R CCL18	ALPL CTSB	KLK8 KLK7	C5a ETHE1	0,900
91	C5 C5a	KIT CCL18	VEGFA CTSB	CSF1R TFPI	KLK8 ETHE1	0,900
92	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	C5a	0,900
	CCL18	CTSB	ACP5	KLK7	ETHE1
93	PLAT	C5	CSF1R	ALPL	C5a	0,900
	CCL18	CTSB	THBS4	KLK7	ETHE1
94	C5	KIT	VEGFA	CSF1R	C5a	0,900
	CCL23	CCL18	CTSB	THBS4	ETHE1
95	C5	VEGFA	CSF1R	MMP7	ALPL	0,900
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	IL11RA
96	PLAT	C5	CSF1R	LTF	C5a	0,900
	CCL23	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1
97	C5	VEGFA	CSF1R	LTF	MMP7	0,900
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	IL11RA
98	C5	CSF1R	LTF	C5a	CCL18	0,900
	CTSB	KLK7	HAMP	IL11RA	ETHE1
99	C5-C6	KIT	VEGFA	CSF1R	MMP7	0,900
	C5a	CCL18	CTSB	IL11RA	ETHE1
100	C5-C6	C5	KIT	CSF1R	LTF	0,900
	C5a	CCL18	CTSB	KLK7	ETHE1

Tabela 12: Contagens de marcadores em painéis de biomarcadores

	Tamanho do Painel
Biomarcador	3	4	5	6	7	8	9	10
ACP5	35	35	40	54	58	60	54	59

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 209/374

206/284

ACY1	7	5	2	0	1	0	0	0
AHSG	18	15	3	0	0	0	0	0
ALPL	28	69	109	146	171	179	178	190
APOA1	89	48	22	13	5	3	7	9
APOE	5	1	0	0	0	0	0	0
BMP6	5	1	0	0	0	0	0	0
C2	156	106	100	64	48	41	47	66
C5	256	373	600	731	777	806	819	808
C5a	153	370	552	641	751	862	920	958
C5-C6	45	92	103	114	134	175	217	287
C9	58	119	109	91	73	74	67	71
CCL18	119	157	284	459	605	694	807	893
CCL23	23	35	30	26	26	23	17	17
CCL23	45	57	65	94	115	152	158	182
CDK5-CDK5R1	12	19	19	12	11	14	16	16
CKB-CKM	14	7	1	1	0	0	0	0
CKM	6	0	0	0	0	0	0	0
CRP	65	0	0	0	0	0	0	0
CSF1R	98	74	131	266	442	671	810	913
CTSB	586	963	990	995	999	1000	1000	1000
ENTPD1	4	6	2	0	0	0	0	0
ESM1	14	13	16	17	14	17	27	30
ETHE1	118	237	403	613	778	870	923	955
FCGR3B	34	14	5	2	1	0	0	0
FGFR3	13	10	11	14	10	16	11	8
FSTL3	9	4	1	0	0	0	0	0
GDF11	29	43	31	20	17	20	19	20
GFRA1	10	4	0	0	0	0	0	0
HAMP	93	202	239	218	193	166	154	131

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 210/374

207/284

HINT1	14	19	14	14	14	10	8	10
IDUA	4	3	1	0	0	0	0	0
IL11RA	58	78	69	68	73	77	109	150
IL12A-IL12B	18	15	10	13	10	11	13	13
IL18R1	7	1	0	0	0	0	0	0
IL1RL1	17	10	3	0	0	0	0	0
INSR	21	26	24	27	44	42	49	44
KIT	63	142	202	251	306	348	392	445
KLK3- SERPIN A3	18	12	2	0	0	0	0	0
KLK7	89	127	231	317	410	511	606	714
KLK8	19	27	40	59	90	137	205	294
KLKB1	12	7	1	0	0	0	0	0
LBP	22	21	5	0	0	0	0	0
LTF	30	66	106	161	202	252	310	347
MCM2	6	4	0	0	0	0	0	0
MDK	14	3	0	0	0	0	0	0
MMP7	56	42	56	73	97	130	194	270
MRC1	19	4	3	1	0	0	1	0
NIDI	7	2	0	0	0	0	0	0
NID2	7	0	0	0	0	0	0	0
NRP1	44	20	12	5	2	2	2	1
PLAT	48	54	92	123	143	145	165	177
SERPINA5	5	0	0	0	0	0	0	0
SERPINF2	5	3	3	0	0	0	0	0
SGTA	3	2	1	0	0	0	0	0
TFPI	100	60	51	46	57	70	91	111
THBS2	4	0	0	0	0	0	0	0
THBS4	66	110	146	193	243	276	334	354
TIMP1	22	2	0	0	0	0	0	0

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TNFRSF18	8	9	3	0	1	3	2	2
TNFRSF1B	20	12	8	6	4	1	0	0
TOPI	6	3	0	0	0	0	0	0
VEGFA	16	33	47	51	75	142	268	455
VEGFC	5	4	2	1	0	0	0	0

Tabela 13: Analitos em dez classificadores de marcadores

CTSB	C5a
ETHE1	CSF1R
CCL18	C5
KLK7	VEGFA
KIT	THBS4
LTF

Tabela 14: Parâmetros derivados do conjunto de treinamento para o classificador naYve Bayes.

Biomarcador	Pc	Pc Pd	Gc	Qd
CSF1R	10,712	10,995	0,398	0,399
CTSB	8,836	9,398	0,287	0,621
IL1RL1	9,702	10,189	0,533	0,780
GDF11	8,889	8,578	0,291	0,379
ETHE1	7,373	7,443	0,119	0,121
CCL23	8,795	8,975	0,312	0,329
FGFR3	6,992	7,166	0,178	0,225
KIT	9,770	9,623	0,287	0,318
FSTL3	8,787	9,029	0,290	0,374
THBS2	7,481	7,922	0,270	0,633
SERPINF2	9,264	9,175	0,115	0,162
TNFRSF1B	10,748	11,028	0,380	0,452
TNFRSF18	12,308	12,279	0,139	0,168
BMP6	7,958	8,138	0,142	0,239

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 212/374

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GFRA1	7,324	7,465	0,182	0,200
CRP	11,965	12,304	0,735	0,233
SERPINA5	10,309	10,101	0,300	0,419
KLKB1	11,802	11,666	0,159	0,211
APOE	8,081	8,314	0,406	0,656
SFRP1	7,096	7,219	0,221	0,309
C2	11,506	11,611	0,100	0,132
CKM	7,313	7,192	0,154	0,116
TFPI	10,179	10,490	0,261	0,352
INSR	8,480	8,633	0,224	0,255
NID2	8,595	8,806	0,213	0,384
HAMP	10,424	11,079	0,788	0,617
MDK	8,034	8,495	0,570	0,578
CDK5-CDK5R1	6,937	6,994	0,108	0,111
NIDI	9,771	9,941	0,213	0,357
VEGFC	7,454	7,540	0,118	0,126
C9	11,911	12,076	0,234	0,233
LTF	10,120	9,870	0,442	0,419
IL12A-IL12B	7,311	7,273	0,052	0,057
C5	9,485	9,603	0,119	0,143
IL18R1	7,643	7,845	0,186	0,475
CCL18	11,320	11,616	0,477	0,398
VEGFA	8,532	8,601	0,170	0,134
IDUA	8,428	8,694	0,366	0,558
TOPI	6,892	6,842	0,088	0,091
C5-C6	6,506	6,593	0,133	0,144
TIMP1	9,815	10,148	0,264	0,430
C5a	11,354	11,606	0,254	0,246
THBS4	10,013	9,794	0,359	0,400

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 213/374

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ENTPD1	7,225	7,299	0,110	0,103
LBP	9,102	9,489	0,439	0,548
KLK3- SERPINA3	9,034	9,287	0,353	0,422
MCM2	7,794	7,975	0,226	0,359
SGTA	5,920	5,883	0,060	0,079
ESM1	9,715	9,919	0,330	0,476
PLAT	8,517	8,838	0,461	0,502
KLK7	8,322	7,989	0,321	0,391
CCL23	7,909	8,097	0,227	0,267
ACP5	10,198	10,436	0,292	0,343
NRP1	8,832	9,047	0,243	0,256
MMP7	9,084	9,574	0,437	0,706
ACY1	9,898	10,411	0,628	0,919
ALPL	10,577	10,290	0,377	0,417
IL11RA	7,312	7,213	0,110	0,107
APOA1	9,701	9,480	0,171	0,295
CKB-CKM	7,506	7,025	0,653	0,479
KLK8	7,361	7,421	0,100	0,178
AHSG	11,914	11,826	0,133	0,167
HINT1	5,835	5,793	0,086	0,104
MRC1	9,628	9,995	0,370	0,490
FCGR3B	10,920	11,145	0,255	0,269

Tabela 15: AUC para combinações exemplares de biomarcadores

No											AUC
1	CTS B										0,79 1
2	CTS B	C5 a									0,85 3

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 214/374

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3	CTS B	C5 a	C5								0,88 0
4	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8							0,89 0
5	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R						0,89 5
6	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R	KLK7					0,89 5
7	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R	KLK7	ETHE 1				0,90 6
8	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R	KLK7	ETHE 1	C5- C6			0,90 2
9	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R	KLK7	ETHE 1	C5- C6	KLK8		0,90 3
10	CTS B	C5 a	C5	CCL1 8	CSF1 R	KLK7	ETHE 1	C5- C6	KLK8	VEGF A	0,91 3

Tabela 16: Cálcu os derivados do conjunto de treinamento para o classificador naive Bayes.

Biomarcador	Pc	Pd	Oc	Od	X	p(c|x)	p(d\x)	ln(j)(d\x)/p(c\x))
CSF1R	10,7 12	10,99 5	0,398	0,399	10,75 1	0,997	0,831	-0,182
CTSB	8,83 6	9,398	0,287	0,621	9,036	1,091	0,542	-0,700
CCL18	11,3 20	11,61 6	0,477	0,398	11,65 8	0,651	0,996	0,425
KLK7	8,32 2	7,989	0,321	0,391	8,048	0,862	1,009	0,158
VEGFA	8,53 2	8,601	0,170	0,134	8,687	1,554	2,425	0,445

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 215/374

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ETHE1	7,37 3	7,443	0,119	0,121	7,313	2,932	1,845	-0,463
C5-C6	6,50 6	6,593	0,133	0,144	6,349	1,490	0,662	-0,811
C5a	11,3 54	11,60 6	0,254	0,246	11,40 0	1,547	1,139	-0,306
KLK8	7,36 1	7,421	0,100	0,178	7,420	3,344	2,237	-0,402
C5	9,48 5	9,603	0,119	0,143	9,306	1,084	0,324	-1,207

Tabela 17: Características clínicas do conjunto de treinamento

Metadados	Níveis	Controle	Câncer Pancreático	valor p
Amostras		115	143
GÊNERO	F	59	70
	M	56	73	8,02e-01
IDADE	Média	57,6	68,6
	SD	13,7	9,7	8,98e-12

Tabela 18: Dez proteínas de classificador de biomarcadores

Biomarcador	ID UniProt	Direção*	Processo Biológico (GO)
C5-C6	P01031 P13671	Para cima	processo do sistema imune regulação do processo do sistema imune proteólise resposta ao estresse regulação de morte celular sinalização regulação da via de sinalização

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C5	P01031	Para cima	processo do sistema imune regulação do processo do sistema imune proteólise resposta ao estresse sinalização regulação da via de sinalização
VEGFA	P15692	Para baixo	processo do sistema imune regulação do processo do sistema imune resposta ao estresse regulação de morte celular sinalização regulação da via de sinalização
CSF1R	P07333	Para cima	proliferação celular processo de sinalização sinalização
KLK8	060259	Para cima	proteólise resposta ao estresse proliferação celular
C5a	P01031	Para cima	processo do sistema imune regulação do processo do sistema imune proteólise resposta ao estresse sinalização regulação da via de sinalização
CCL18	P55774	Para cima	processo do sistema imune resposta ao estresse comunicação celular

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 217/374

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			processo de sinalização sinalização
CTSB	P07858	Para cima	proteólise resposta ao estresse regulação de morte celular
KLK7	P49862	Para baixo	proteólise
ETHE1	095571	Para cima

Tabela 19: Biomarcadores de câncer gerais

ACY1	APOA1
C5	CCL23
CKB-CKM	CKM
ENTPD1	GDF11
HAMP	HINT1
KIT	KLK3-SERPINA3
LBP	SERPINF2
THBS2	TIMP1
C9	FSTL3
IL12A-IL12B	CDK5-CDK5R1
CCL23

Tabela 20: Painéis de 1 Biomarcador

Marcadores	CV AUC Médio
1	KIT	0,753
2	CKB-CKM	0,750
3	C9	0,740
4	APOA1	0,740
5	KLK3-SERPINA3	0,732
6	CKM	0,730
7	CCL23	0,713
8	CCL23	0,705

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 218/374

215/284

9	TIMP1	0,695
10	LBP	0,691
11	C5	0,690
12	ACY1	0,676
13	HAMP	0,670
14	CDK5-CDK5R1	0,670
15	HINT1	0,669
16	SERPINF2	0,663
17	GDF11	0,656
18	ENTPD1	0,651
19	THBS2	0,650
20	FSTL3	0,643
21	IL12A-IL12B	0,640

Tabela 21: Painéis de 2 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	KIT	APOA1	0,808
2	APOA1	CKB-CKM	0,801
3	KIT	CCL23	0,791
4	C9	KIT	0,791
5	KIT	CKB-CKM	0,790
6	C9	CKB-CKM	0,789
7	C9	APOA1	0,789
8	KIT	LBP	0,787
9	TIMP1	KIT	0,787
10	C5	KIT	0,787
11	C9	CKM	0,786
12	CKM	APOA1	0,786
13	C5	APOA1	0,785
14	KIT	CCL23	0,784

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216/284

15	TIMP1	CKB-CKM	0,782
16	CCL23	CKB-CKM	0,781
17	KIT	CKM	0,780
18	KIT	ACY1	0,780
19	KIT	KLK3- SERPIN A3	0,780
20	CKM	CCL23	0,778
21	CKB-CKM	HINT1	0,778
22	KIT	CDK5-CDK5R1	0,777
23	SERPINF2	CKB-CKM	0,777
24	APOA1	ACY1	0,777
25	KIT	SERPINF2	0,776
26	LBP	CKB-CKM	0,776
27	CKB-CKM	KLK3- SERPIN A3	0,776
28	APOA1	KLK3- SERPIN A3	0,776
29	APOA1	CCL23	0,775
30	TIMP1	CKM	0,774
31	C9	ACY1	0,774
32	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,773
33	IL12A-IL12B	CKB-CKM	0,773
34	TIMP1	C9	0,773
35	APOA1	HINT1	0,773
36	C5	CCL23	0,772
37	KIT	HINT1	0,772
38	IL12A-IL12B	KIT	0,771
39	CKM	SERPINF2	0,771
40	ACY1	CKB-CKM	0,770
41	APOA1	CCL23	0,770
42	C9	CDK5-CDK5R1	0,769
43	C5	CKB-CKM	0,769

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44	C9	HINT1	0,769
45	CKM	CCL23	0,767
46	CCL23	KLK3- SERPIN A3	0,767
47	CKM	KLK3- SERPIN A3	0,767
48	C9	FSTL3	0,767
49	APOA1	LBP	0,766
50	C9	SERPINF2	0,766
51	C9	CCL23	0,765
52	CKM	LBP	0,765
53	CCL23	CKB-CKM	0,764
54	KIT	ENTPD1	0,764
55	CKM	HINT1	0,764
56	C9	LBP	0,764
57	C9	C5	0,764
58	KIT	HAMP	0,764
59	FSTL3	CKB-CKM	0,763
60	KIT	FSTL3	0,763
61	CKM	CKB-CKM	0,762
62	HAMP	CKB-CKM	0,762
63	CKM	ACY1	0,762
64	TIMP1	APOA1	0,762
65	APOA1	CDK5-CDK5R1	0,761
66	C5	KLK3- SERPIN A3	0,761
67	C5	HINT1	0,760
68	C9	GDF11	0,760
69	C9	THBS2	0,760
70	CKM	CDK5-CDK5R1	0,760
71	ENTPD1	CKB-CKM	0,759
72	C5	CCL23	0,759

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73	CCL23	ACY1	0,758
74	CCL23	ACY1	0,758
75	C5	CDK5-CDK5R1	0,757
76	C5	CKM	0,757
77	TIMP1	KLK3- SERPIN A3	0,757
78	CKM	HAMP	0,757
79	C9	HAMP	0,757
80	C9	CCL23	0,757
81	C9	IL12A-IL12B	0,756
82	LBP	ACY1	0,756
83	C9	ENTPD1	0,754
84	CKM	ENTPD1	0,754
85	APOA1	SERPINF2	0,754
86	LBP	HINT1	0,754
87	CDK5-CDK5R1	KLK3- SERPIN A3	0,754
88	APOA1	ENTPD1	0,753
89	TIMP1	CCL23	0,753
90	KIT	GDF11	0,753
91	GDF11	KLK3- SERPIN A3	0,753
92	IL12A-IL12B	CKM	0,753
93	C5	SERPINF2	0,752
94	APOA1	GDF11	0,752
95	CCL23	KLK3- SERPIN A3	0,751
96	CCL23	CDK5-CDK5R1	0,751
97	ACY1	KLK3- SERPIN A3	0,749
98	C9	KLK3- SERPIN A3	0,749
99	LBP	CDK5-CDK5R1	0,749
100	APOA1	HAMP	0,748

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Tabela 22: Painéis de 3 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5	KIT	APOA1	0,830
2	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,826
3	C9	KIT	APOA1	0,822
4	KIT	APOA1	ACY1	0,820
5	KIT	APOA1	CDK5-CDK5R1	0,819
6	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,819
7	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,818
8	C9	KIT	CKB-CKM	0,817
9	C9	KIT	ACY1	0,816
10	KIT	APOA1	LBP	0,816
11	C5	KIT	CCL23	0,816
12	C5	APOA1	CKB-CKM	0,816
13	TIMP1	C9	KIT	0,815
14	C9	APOA1	CKB-CKM	0,815
15	C5	KIT	CDK5-CDK5R1	0,815
16	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,815
17	KIT	CKM	APOA1	0,815
18	KIT	APOA1	CCL23	0,815
19	TIMP1	KIT	APOA1	0,814
20	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,813
21	C9	KIT	CKM	0,813
22	APOA1	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,812
23	KIT	APOA1	CCL23	0,812
24	C9	CKM	APOA1	0,812
25	TIMP1	KIT	CDK5-CDK5R1	0,812
26	C5	KIT	CKB-CKM	0,812
27	TIMP1	APOA1	CKB-CKM	0,812

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28	KIT	APOA1	HINT1	0,812
29	C9	KIT	HINT1	0,811
30	KIT	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,811
31	KIT	LBP	CKB-CKM	0,811
32	IL12A-IL12B	KIT	APOA1	0,811
33	C9	C5	KIT	0,811
34	C5	KIT	CCL23	0,811
35	C5	KIT	HINT1	0,811
36	KIT	CCL23	ACY1	0,809
37	C9	KIT	CCL23	0,809
38	APOA1	CKB-CKM	KLK3-SERPINA3	0,809
39	KIT	CCL23	ACY1	0,809
40	APOA1	SERPINF2	CKB-CKM	0,808
41	C9	ACY1	CKB-CKM	0,808
42	TIMP1	KIT	CKB-CKM	0,808
43	KIT	APOA1	KLK3-SERPINA3	0,808
44	IL12A-IL12B	APOA1	CKB-CKM	0,808
45	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,807
46	C5	APOA1	CDK5-CDK5R1	0,807
47	C5	APOA1	CCL23	0,807
48	KIT	ACY1	CKB-CKM	0,807
49	C5	KIT	ACY1	0,807
50	TIMP1	C5	KIT	0,807
51	C9	C5	CKB-CKM	0,806
52	C5	APOA1	HINT1	0,806
53	C9	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,806
54	C9	CKB-CKM	HINT1	0,806
55	C5	CCL23	CKB-CKM	0,806
56	C5	KIT	SERPINF2	0,806

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 224/374

221/284

57	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,806
58	C5	CKM	APOA1	0,806
59	CKM	APOA1	CCL23	0,806
60	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,806
61	C5	CKB-CKM	HINT1	0,806
62	APOA1	HAMP	CKB-CKM	0,806
63	KIT	LBP	CDK5-CDK5R1	0,805
64	TIMP1	KIT	CCL23	0,805
65	KIT	APOA1	ENTPD1	0,805
66	TIMP1	C9	CKB-CKM	0,805
67	C5	APOA1	ACY1	0,804
68	C9	KIT	CDK5-CDK5R1	0,804
69	TIMP1	KIT	CKM	0,804
70	C9	APOA1	CDK5-CDK5R1	0,804
71	C9	CCL23	CKB-CKM	0,804
72	KIT	CKB-CKM	HINT1	0,804
73	TIMP1	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,804
74	KIT	APOA1	SERPINF2	0,804
75	KIT	CKM	LBP	0,803
76	CKM	APOA1	ACY1	0,803
77	C5	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,803
78	KIT	APOA1	HAMP	0,803
79	TIMP1	C9	CKM	0,803
80	KIT	LBP	ACY1	0,803
81	C9	CKM	ACY1	0,803
82	C5	IL12A-IL12B	KIT	0,803
83	LBP	CKB-CKM	HINT1	0,803
84	C9	CKM	CDK5-CDK5R1	0,803
85	C9	KIT	FSTL3	0,802

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 225/374

222/284

86	LBP	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,802
87	C9	KIT	SERPINF2	0,802
88	APOA1	FSTL3	CKB-CKM	0,802
89	C5	KIT	CKM	0,802
90	KIT	CKM	CDK5-CDK5R1	0,802
91	TIMP1	KIT	ACY1	0,802
92	C9	IL12A-IL12B	CKB-CKM	0,801
93	KIT	CCL23	CDK5-CDK5R1	0,801
94	KIT	CCL23	LBP	0,801
95	C9	KIT	LBP	0,801
96	CCL23	CDK5-CDK5R1	CKB-CKM	0,801
97	KIT	SERPINF2	LBP	0,801
98	C5	KIT	ENTPD1	0,801
99	APOA1	ENTPD1	CKB-CKM	0,800
100	KIT	CKM	ACY1	0,800

Tabela 23: Painéis de 4 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,845
2	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,839
3	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,839
4	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,838
5	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,837
6	C9	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,835
7	C5	KIT	APOA1	HINT1	0,835
8	C5	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,835
9	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,834

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 226/374

223/284

10	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,834
11	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,833
12	C9	KIT	APOA1	ACY1	0,833
13	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,833
14	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,833
15	C9	KIT	CKM	APOA1	0,833
16	C5	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,833
17	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,832
18	C5	KIT	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,832
19	C5	KIT	CKM	APOA1	0,832
20	TIMP1	KIT	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,832
21	C9	C5	KIT	CKB-CKM	0,832
22	TIMP1	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,832
23	TIMP1	C5	KIT	CDK5- CDK5R1	0,831
24	C9	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,831
25	C5	KIT	CCL23	ACY1	0,831
26	C5	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	0,831
27	C5	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,830
28	C9	C5	KIT	APOA1	0,830
29	KIT	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,830
30	C9	KIT	ACY1	CKB-CKM	0,830
31	C5	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,830
32	C5	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,829

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 227/374

224/284

33	C9	KIT	CCL23	ACY1	0,829
34	C9	KIT	APOA1	CCL23	0,829
35	C5	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,829
36	C5	KIT	APOA1	SERPINF2	0,829
37	APOA1	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,829
38	C5	KIT	APOA1	ENTPD1	0,829
39	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,829
40	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,829
41	C9	KIT	APOA1	HINT1	0,829
42	KIT	LBP	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,829
43	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,828
44	TIMP1	KIT	APOA1	ACY1	0,828
45	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,828
46	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,828
47	TIMP1	C9	KIT	CDK5- CDK5R1	0,828
48	C5	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,828
49	KIT	CKM	APOA1	ACY1	0,828
50	TIMP1	C5	KIT	APOA1	0,828
51	C5	KIT	CCL23	ACY1	0,828
52	C9	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,828
53	APOA1	LBP	ACY1	CKB-CKM	0,827
54	TIMP1	C9	KIT	CKB-CKM	0,827
55	C9	KIT	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,827
56	KIT	APOA1	LBP	ACY1	0,827

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 228/374

225/284

57	KIT	APOA1	SERPINF2	CKB-CKM	0,827
58	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,827
59	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,827
60	C9	KIT	CKM	ACY1	0,827
61	TIMP1	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,827
62	C5	KIT	APOA1	LBP	0,827
63	TIMP1	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,827
64	KIT	CKM	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,826
65	KIT	APOA1	HAMP	CKB-CKM	0,826
66	C5	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,826
67	TIMP1	C9	KIT	APOA1	0,826
68	C9	KIT	CKB-CKM	HINT1	0,826
69	APOA1	LBP	CKB-CKM	HINT1	0,826
70	C9	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,826
71	TIMP1	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,826
72	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,826
73	C9	CKM	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,826
74	C5	KIT	CKB-CKM	HINT1	0,825
75	C5	KIT	SERPINF2	CDK5- CDK5R1	0,825
76	C9	KIT	CKM	CDK5-	0,825

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 229/374

226/284

				CDK5R1
77	TIMP1	C9	KIT	ACY1	0,825
78	C5	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,825
79	KIT	APOA1	ENTPD1	CKB-CKM	0,825
80	C9	KIT	APOA1	LBP	0,825
81	C5	KIT	APOA1	KLK3- SERPINA3	0,825
82	C9	KIT	CKM	HINT1	0,825
83	C5	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,825
84	KIT	LBP	ACY1	CKB-CKM	0,825
85	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,825
86	C9	CKM	APOA1	ACY1	0,824
87	KIT	CKM	APOA1	LBP	0,824
88	C9	KIT	CKM	CCL23	0,824
89	TIMP1	C5	KIT	ACY1	0,824
90	C9	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,824
91	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,824
92	C5	KIT	ACY1	CKB-CKM	0,824
93	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,824
94	APOA1	ACY1	FSTL3	CKB-CKM	0,824
95	C9	C5	KIT	CKM	0,824
96	C5	KIT	CKM	CDK5- CDK5R1	0,824
97	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,824

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 230/374

227/284

98	C5	APOA1	SERPINF2	CKB-CKM	0,824
99	C5	KIT	APOA1	HAMP	0,824
100	C9	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,824

Tabela 24: Painéis de 5 Biomarcadores

Marcadore s	CV AUC Médio
1	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,854
2	C5	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,851
3	C5	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,849
4	C5	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,847
5	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,847
6	KIT	APOA1	LBP	ACY1	CKB-CKM	0,847
7	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,847
8	TIMP1	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,847
9	C5	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,846
10	C5	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,846
11	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,845
12	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,845
13	C5	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,845
14	TIMP1	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,845
15	TIMP1	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,844

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 231/374

228/284

16	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,844
17	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,844
18	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,844
19	C5	KIT	CKM	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,844
20	C5	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,844
21	C5	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,844
22	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,843
23	C5	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,843
24	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,843
25	C9	KIT	CKM	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,843
26	C5	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,843
27	C9	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,843
28	C5	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,843
29	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,843
30	C9	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,843
31	C9	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,843
32	TIMP1	C5	KIT	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,843
33	C5	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,843
34	C9	KIT	CKM	APOA1	ACY1	0,843

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 232/374

229/284

35	TIMP1	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,842
36	C5	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,842
37	C5	KIT	APOA1	SERPINF2	CKB-CKM	0,842
38	C5	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,841
39	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HAMP	CKB-CKM	0,841
40	C5	APOA1	CCL23	CKB-CKM	HINT1	0,841
41	C5	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	HINT1	0,841
42	C9	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,841
43	C5	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,841
44	TIMP1	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,841
45	C9	KIT	APOA1	CKB-CKM	HINT1	0,841
46	C5	APOA1	ACY1	CKB-CKM	HINT1	0,840
47	TIMP1	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,840
48	C9	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,840
49	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	FSTL3	0,840
50	C9	KIT	CKM	APOA1	HINT1	0,840
51	C9	C5	KIT	ACY1	CKB-CKM	0,840
52	C9	C5	KIT	CKM	APOA1	0,840
53	C5	KIT	CKM	APOA1	ACY1	0,840
54	C5	KIT	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,840
55	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,840

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 233/374

230/284

56	C5	KIT	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,840
57	C5	KIT	APOA1	SERPINF2	CDK5- CDK5R1	0,840
58	C9	KIT	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,839
59	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	HINT1	0,839
60	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,839
61	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,839
62	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HINT1	0,839
63	C9	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,839
64	C9	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,839
65	C5	KIT	LBP	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,839
66	KIT	APOA1	CCL23	LBP	CKB-CKM	0,839
67	KIT	APOA1	CCL23	LBP	CKB-CKM	0,839
68	KIT	APOA1	SERPINF 2	ACY1	CKB-CKM	0,838
69	C5	KIT	APOA1	ACY1	FSTL3	0,838
70	C5	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CCL23	0,838
71	KIT	APOA1	ACY1	FSTL3	CKB-CKM	0,838
72	C5	KIT	APOA1	ENTPD1	CKB-CKM	0,838
73	C9	C5	KIT	CCL23	CKB-CKM	0,838
74	C5	APOA1	SERPINF 2	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,838
75	C9	C5	KIT	CKB-CKM	HINT1	0,838
76	KIT	CKM	APOA1	LBP	CDK5-	0,838

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 234/374

231/284

					CDK5R1
77	C9	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,838
78	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	HINT1	0,838
79	TIMP1	C9	C5	KIT	CKB-CKM	0,838
80	C5	KIT	SERPINF 2	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,838
81	C5	KIT	CCL23	CKB-CKM	HINT1	0,838
82	C5	KIT	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,838
83	C5	KIT	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,838
84	C5	KIT	APOA1	LBP	ACY1	0,838
85	TIMP1	C5	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,838
86	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,838
87	TIMP1	C5	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,838
88	C9	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,838
89	KIT	APOA1	SERPINF 2	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,838
90	TIMP1	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,838
91	TIMP1	KIT	LBP	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,838
92	C5	KIT	APOA1	CCL23	HINT1	0,838
93	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	HINT1	0,838
94	C9	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,837
95	C9	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,837
96	C5	KIT	LBP	ACY1	CKB-CKM	0,837
97	C5	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,837

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 235/374

232/284

98	C5	KIT	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	HINT1	0,837
99	C5	APOA1	CCL23	ACY1	CKB-CKM	0,837
100	C5	KIT	APOA1	FSTL3	CKB-CKM	0,837

Tabela 25: Painéis de 6 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,860
2	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,859
3	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,858
4	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,857
5	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,856
6	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,856
7	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,855
8	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,855
9	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	ACY1	0,855
10	TIMP1 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,854
11	C5 HINTl	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,854
12	C5	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,853

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 236/374

233/284

	HINTI
13	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,853
14	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	SERPIN F2	CDK5- CDK5R1	0,853
15	C5 HINTl	KIT	APOA1	ACY1	CKB-CKM	0,852
16	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,852
17	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	ACY1	0,852
18	C9 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	CKM	APOA1	0,852
19	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CCL23	0,852
20	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	SERPIN F2	ACY1	0,851
21	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	FSTL3	0,851
22	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,851
23	C9 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,851
24	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,851
25	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,851

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 237/374

234/284

26	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,851
27	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,851
28	C9 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,850
29	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,850
30	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	LBP	0,850
31	C9 ACY1	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,850
32	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,850
33	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	APOA1	CCL23	ACY1	0,850
34	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	ACY1	0,850
35	C5 CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,850
36	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,849
37	C5 CKB-CKM	KIT	LBP	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,849
38	IL12A-IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,849
39	C5	KIT	CCL23	ACY1	CDK5-	0,849

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 238/374

235/284

	CKB-CKM				CDK5R1
40	IL12A-IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,849
41	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	FSTL3	0,849
42	C9 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,849
43	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	CDK5- CDK5R1	0,849
44	C9 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	ACY1	0,849
45	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	LBP	0,849
46	C5 CKB-CKM	KIT	CCL23	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,849
47	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	SERPIN F2	CCL23	0,848
48	C9 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,848
49	C5 HINTI	KIT	APOA1	LBP	CKB-CKM	0,848
50	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	SERPINF2	0,848
51	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,848
52	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,848
53	C5	IL12A-	KIT	APOA1	LBP	0,848

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 239/374

236/284

	CKB-CKM	IL12B
54	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	LBP	0,848
55	TIMP1 HINTI	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,848
56	C9 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,848
57	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	ACY1	0,848
58	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPIN F2	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,848
59	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,848
60	C9 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	ACY1	0,848
61	C9 CKB-CKM	C5	KIT	CCL23	ACY1	0,847
62	TIMP1 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,847
63	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	CDK5- CDK5R1	0,847
64	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CCL23	0,847
65	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,847
66	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	FSTL3	0,847
67	C5 HINTl	KIT	APOA1	CCL23	CKB-CKM	0,847

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 240/374

237/284

68	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	ACY1	0,847
69	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CCL23	0,847
70	TIMP1 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,847
71	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	APOA1	LBP	ACY1	0,847
72	TIMP1 CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,847
73	TIMP1 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,847
74	C5 CKB-CKM	KIT	SERPIN F2	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,847
75	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,847
76	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	APOA1	CCL23	LBP	0,847
77	C9 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,847
78	TIMP1 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	ACY1	0,847
79	C5 ACY1	KIT	CKM	APOA1	CCL23	0,847

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 241/374

238/284

80	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,847
81	C5 HINTI	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	CKB-CKM	0,847
82	C9 HINTI	C5	KIT	CKM	APOA1	0,847
83	TIMP1 CKB-CKM	C9	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,847
84	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,846
85	C9 CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,846
86	C5 CKB-CKM	KIT	CCL23	LBP	CDK5- CDK5R1	0,846
87	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	LBP	CDK5- CDK5R1	0,846
88	IL12A-IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,846
89	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	CKM	APOA1	0,846
90	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	HAMP	0,846
91	TIMP1 CKB-CKM	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,846
92	C9 HINTl	C5	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,846
93	C5 HINTl	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	CKB-CKM	0,846

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 242/374

239/284

94	C5 FSTL3	KIT	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,846
95	C9 CDK5- CDK5R1	C5	KIT	APOA1	CCL23	0,846
96	C5 ACY1	KIT	CKM	APOA1	LBP	0,846
97	C9 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	LBP	0,846
98	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	HAMP	0,846
99	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	SERPINF2	0,846
100	C9 CKB-CKM	C5	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	0,846

Tabela 26: Painéis de 7 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,864
2	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,863
3	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	0,863
4	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,861

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 243/374

240/284

5	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	0,861
6	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	ACY1	0,860
7	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	0,860
8	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,860
9	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	0,859
10	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	0,859
11	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	0,859
12	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,859
13	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,859
14	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	0,859
15	C5	IL12A-	KIT	APOA1	CCL23	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 244/374

241/284

	CDK5- CDK5R1	IL12B CKB-CKM
16	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,858
17	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	ACY1	0,858
18	C5 ACY1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,858
19	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	CCL23	0,858
20	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,857
21	C9 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,857
22	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	CCL23	0,857
23	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	IL12A- IL12B	KIT	APOA1	0,856
24	TIMP1 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,856
25	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	CCL23	0,856
26	C5	KIT	APOA1	CCL23	SERPINF	0,856

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 245/374

242/284

	ACY1	CKB-CKM			2
27	C9 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	0,856
28	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	0,856
29	C5 ACY1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,856
30	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	0,856
31	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	SERPINF 2	0,856
32	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	CCL23	0,856
33	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,855
34	C9 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,855
35	TIMP1 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	0,855
36	KIT CDK5-	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	ACY1	0,855

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 246/374

243/284

	CDK5R1
37	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	LBP	0,855
38	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,855
39	C9 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,855
40	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CCL23	0,855
41	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	SERPINF 2	0,855
42	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	0,854
43	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CCL23	0,854
44	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,854
45	C5 CKB- CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	LBP	0,854
46	C5 ACY1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	0,854
47	C9 ACY1	KIT CDK5-	CKM	APOA1	CCL23	0,854

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 247/374

244/284

		CDK5R1
48	C5 SERPIN F2	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	CCL23	0,854
49	TIMP1 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,854
50	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,854
51	C5 HAMP	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,854
52	TIMP1 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	0,854
53	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,854
54	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	CCL23	0,854
55	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,854
56	TIMP1 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,854
57	TIMP1 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,854
58	C9 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	ACY1	0,854
59	C5	IL12A-	KIT	APOA1	SERPINF	0,854

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 248/374

245/284

	CDK5- CDK5R1	IL12B CKB-CKM			2
60	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,854
61	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	ACY1	0,854
62	C9 CDK5- CDK5R1	C5 HINT1	KIT	CKM	APOA1	0,854
63	TIMP1 CKB- CKM	C5 HINT1	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,854
64	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	LBP	0,854
65	TIMP1 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	0,853
66	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,853
67	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	0,853
68	C5 LBP	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CCL23	0,853
69	C9 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	0,853

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 249/374

246/284

70	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	CCL23	LBP	ACY1	0,853
71	C5 CKB- CKM	KIT HINT1	APOA1	LBP	ACY1	0,853
72	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	LBP	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,853
73	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HINT1	CKM	APOA1	LBP	0,853
74	C9 CKB- CKM	C5 HINT1	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,853
75	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	LBP	0,853
76	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT	CKM	APOA1	0,853
77	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,853
78	TIMP1 HAMP	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,853
79	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	ACY1	0,853
80	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	SERPINF 2	0,853

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 250/374

247/284

81	TIMP1 CKB- CKM	C5 HINT1	KIT	APOA1	ACY1	0,853
82	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,852
83	C5 FSTL3	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	CDK5- CDK5R1	0,852
84	C5 CCL23	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	SERPINF 2	0,852
85	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	CCL23	LBP	ACY1	0,852
86	C9 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	0,852
87	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,852
88	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	CDK5- CDK5R1	0,852
89	TIMP1 CDK5- CDK5R1	C5 CKB-CKM	KIT	LBP	ACY1	0,852
90	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	CCL23	0,852
91	C5 CKB- CKM	KIT HINT1	APOA1	SERPINF2	CDK5- CDK5R1	0,852

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 251/374

248/284

92	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	LBP	0,852
93	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	CDK5- CDK5R1	0,852
94	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,852
95	C5 CKB- CKM	KIT HINT1	APOA1	CCL23	ACY1	0,852
96	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HINT1	CKM	APOA1	CCL23	0,852
97	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	LBP	ACY1	0,852
98	TIMP1 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT	APOA1	LBP	0,852
99	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	APOA1	0,852
100	TIMP1 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	ACY1	0,852

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 252/374

249/284

Tabela 27: Painéis de 8 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,864
2	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,864
3	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,864
4	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,863
5	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	0,863
6	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,863
7	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,862
8	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,862
9	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,862

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 253/374

250/284

10	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	CCL23	0,862
11	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	SERPINF2	0,861
12	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,861
13	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	LBP	ACY1	0,861
14	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,861
15	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	LBP	0,860
16	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	ACY1	0,860
17	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	0,860
18	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5-	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,860

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 254/374

251/284

		CDK5R1
19	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	CCL23	0,860
20	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	CCL23	0,859
21	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	ACY1	0,859
22	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	LBP	0,859
23	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	ACY1	0,859
24	TIMP1 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	0,859
25	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	ACY1	0,859
26	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,859
27	C5 CDK5-	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	ACY1	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 255/374

252/284

	CDK5 R1
28	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	0,859
29	C5 CCL23	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,859
30	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	CCL23	LBP	0,859
31	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,859
32	C9 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,859
33	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,859
34	C5 FSTL3	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	ACY1	CDK5- CDK5R1	0,858
35	TIMP1 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,858
36	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	LBP	ACY1	0,858
37	C5	IL12A-IL12B	KIT	APOA1	ACY1	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 256/374

253/284

	CDK5- CDK5 R1	HAMP	CKB-CKM
38	TIMP1 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,858
39	TIMP1 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	0,858
40	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	SERPIN F2	CCL23	0,858
41	TIMP1 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,858
42	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,858
43	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	CCL23	0,858
44	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	SERPINF2	0,857
45	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 CKB-CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	0,857
46	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	SERPINF2	0,857

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 257/374

254/284

47	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 CKB-CKM	KIT HINTl	APOA1	ACY1	0,857
48	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B CKB-CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	0,857
49	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	CCL23	ACY1	0,857
50	C5 SERPI NF2	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	CCL23	0,857
51	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	ACY1	0,857
52	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11	CCL23	0,857
53	TIMP1 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	0,857
54	C9 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT HINTl	APOA1	CCL23	0,857
55	TIMP1 CDK5- CDK5	C5 FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	ACY1	0,857

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 258/374

255/284

	R1
56	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,857
57	C9 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HINT1	CKM	APOA1	0,857
58	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	ACY1	0,857
59	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	CCL23	0,857
60	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	ACY1	0,857
61	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,857
62	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	CCL23	0,857
63	C9 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,857
64	TIMP1	C9	KIT	APOA1	CCL23	0,856
ACY1	CDK5-	CKB-CKM

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 259/374

256/284

	CDK5R1
65	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,856
66	C9 CCL23	C5 CCL23	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,856
67	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,856
68	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,856
69	TIMP1 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,856
70	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,856
71	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	GDF11	0,856
72	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT HINT1	CKM	APOA1	0,856
73	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,856

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 260/374

257/284

74	TIMP1 ACY1	C5 CKB-CKM	KIT HINT1	APOA1	CCL23	0,856
75	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B FSTL3	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,856
76	TIMP1 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,856
77	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	0,856
78	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HINT1	APOA1	CCL23	0,856
79	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,856
80	C5 SERPI NF2	KIT LBP	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	CCL23	0,856
81	C9 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	CCL23	0,856
82	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,856
83	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	LBP	0,856

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 261/374

258/284

84	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	LBP	0,856
85	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	SERPINF2	0,856
86	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 CKB-CKM	KIT HINT1	APOA1	CCL23	0,856
87	IL12A- IL12B CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	ACY1	0,856
88	TIMP1 CCL23	C9 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,856
89	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HINT1	CKM	APOA1	0,856
90	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,855
91	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	LBP	0,855
92	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	SERPINF2	0,855

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 262/374

259/284

93	C9 APOA 1	C5 CCL23	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT	CKM	0,855
94	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,855
95	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM FSTL3	APOA1	CCL23	0,855
96	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 HAMP	IL12A- IL12B CKB-CKM	KIT	APOA1	0,855
97	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,855
98	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	CCL23	0,855
99	C9 CCL23	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	APOA1	0,855
100	C9 CDK5- CDK5 R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	ACY1	0,855

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 263/374

260/284

Tabela 28: Painéis de 9 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,864
2	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,864
3	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	CCL23	0,863
4	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,863
5	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,863
6	TIMP1 LBP	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,862
7	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	LBP	0,862
8	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	SERPIN F2	0,862

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 264/374

261/284

9	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,862
10	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,861
11	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,861
12	TIMP1 SERPI NF2	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,861
13	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,861
14	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,861
15	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	0,861
16	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,861

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 265/374

262/284

17	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,861
18	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A-IL12B HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	0,861
19	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	LBP	0,861
20	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,861
21	TIMP1 SERPI NF2	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,860
22	C5 SERPI NF2	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23	0,860
23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	LBP	0,860
24	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	LBP	0,860
25	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,860

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 266/374

263/284

26	C5 SERPI NF2	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,860
27	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	LBP	0,860
28	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,860
29	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	CCL23	0,860
30	TIMP1 CCL23	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,860
31	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HINTl	APOA1	0,860
32	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,860
33	C9 SERPI NF2	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,859
34	TIMP1 CCL23	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 267/374

264/284

35	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPINF2 HINTl	CCL23	0,859
36	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	0,859
37	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	CCL23	0,859
38	C5 CCL23	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	SERPIN F2	0,859
39	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,859
40	TIMP1 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	CCL23	0,859
41	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPINF2 HINTl	CCL23	0,859
42	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CDF 11 CKB-CKM	CCL23	0,859
43	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	SERPINF2 CKB-CKM	LBP	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 268/374

265/284

44	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINTl	CCL23	0,859
45	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,859
46	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINTl	LBP	0,859
47	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,859
48	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,859
49	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINTl	CCL23	0,858
50	C9 APOA 1	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	0,858
51	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	ACY1	0,858
52	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 269/374

266/284

53	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	LBP	0,858
54	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858
55	TIMP1 LBP	C9 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858
56	C9 CCL23	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,858
57	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	LBP	0,858
58	C5 SERPI NF2	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CDF 11 CKB-CKM	CCL23	0,858
59	TIMP1 SERPI NF2	C5 CCL23	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,858
60	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	CCL23	0,858
61	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,858
62	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 270/374

267/284

63	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	SERPINF2 CKB-CKM	CCL23	0,858
64	TIMP1 CCL23	C5 SERPINF2	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,858
65	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 HAMP	LBP CKB-CKM	ACY1	0,858
66	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	0,858
67	TIMP1 ACY1	C9 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858
68	TIMP1 CCL23	C5 LBP	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1	0,858
69	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11 HINT1	CCL23	0,858
70	C5 CDK5- CDK5 R1	IL12A-IL12B FSTL3	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	ACY1	0,858
71	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 271/374

268/284

72	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	LBP	0,858
73	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858
74	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	0,858
75	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	LBP	0,858
76	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11	0,858
77	C9 LBP	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	0,858
78	C5 CCL23	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPIN F2	0,858
79	C9 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,858
80	TIMP1 CCL23	C5 CDK5- CDK5R1	IL12A-IL12B HAMP	KIT CKB-CKM	APOA1	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 272/374

269/284

81	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CDF 11 CKB-CKM	CCL23	0,858
82	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HAMP	APOA1	0,858
83	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11	0,858
84	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,857
85	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,857
86	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	CCL23	0,857
87	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,857
88	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23	0,857
89	C5 CDK5- CDK5 R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	ACY1	0,857

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 273/374

270/284

90	TIMP1 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	LBP	0,857
91	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,857
92	TIMP1 SERPI NF2	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11	0,857
93	C9 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINT1	CCL23	0,857
94	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPIN F2	0,857
95	TIMP1 APOA 1	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM	0,857
96	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HINT1	APOA1	0,857
97	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	SERPIN F2	0,857
98	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CDF 11	0,857

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 274/374

271/284

99	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1	0,857
100	TIMP1 CDK5- CDK5 R1	C5 FSTL3	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	ACY1	0,857
Tabela 29:	Painéis de 1	0 Biomarcadores

Marcadores	CV AUC Médio
1	C5 CCL23	IL12A- IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	0,863
2	TIMP1 CCL23	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,863
3	TIMP1 CCL23	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,862
4	TIMP1 SERPIN F2	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,862
5	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,862
6	C5 SERPIN F2	IL12A- IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,862

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 275/374

272/284

7	TIMP1 SERPIN F2	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,862
8	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,862
9	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	0,861
10	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,.861
11	C9 SERPIN F2	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINT1	0,861
12	C5 CCL23	IL12A- IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,861
13	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,861
14	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,861
15	TIMP1 SERPIN F2	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,861

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 276/374

273/284

16	TIMP1 CCL23	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,860
17	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	0,860
18	C9 SERPIN F2	C5 CCL23	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	0,860
19	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPINF2 HINT1	0,860
20	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CDF 11 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,860
21	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	0,860
22	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINT1	0,860
23	C9 APOA1	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	0,860
24	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,860

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 277/374

274/284

25 C C	:9 XL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM CKB-CKM	APOA1 HINT1	0,860
26 C L	:5 .BP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,860
27	C9 CCL23	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	CKM CKB-CKM	APOA1 HINT1	0,860
28	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,860
29	TIMP1 CCL23	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	0,860
30	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	0,860
31	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	0,860
32	TIMP1 SERPI NF2	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	0,860
33	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 278/374

275/284

34	C5 CCL23	KIT LBP	APOA1 ACY1	CCL23 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	0,859
35	C9 CCL23	C5 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,859
36	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HINT1	0,859
37	TIMP1 LBP	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	0,859
38	TIMP1 CCL23	C5 SERPINF 2	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,859
39	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	GDF11 CKB-CKM	0,859
40	C9 CCL23	C5 CCL23	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	0,859
41	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,859
42	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	LBP HINT1	0,859
43	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 279/374

276/284

44	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	0,859
45	TIMP1 SERPI NF2	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,859
46	TIMP1 CKM	C9 APOA1	C5 CCL23	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	0,859
47	TIMP1 SERPI NF2	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,859
48	C5 CCL23	IL12A- IL12B LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPINF2 HINT1	0,859
49	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,859
50	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,859
51	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	0,859
52	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 FSTL3	SERPINF2 CKB-CKM	0,859

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 280/374

277/284

53	TIMP1 CCL23	C9 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	0,859
54	TIMP1 CCL23	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,859
55	C9 CCL23	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINT1	0,859
56	TIMP1 GDF11	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,859
57	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	SERPINF2 HINT1	0,858
58	C5 CCL23	IL12A- IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	GDF11 CKB-CKM	0,858
59	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	LBP HINT1	0,858
60	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	GDF11 CKB-CKM	0,858
61	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 281/374

278/284

62	C5 SERPI NF2	IL12A- IL12B CCL23	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,858
63	C9 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 CKB-CKM	0,858
64	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,858
65	TIMP1 ACY1	C5 CDK5- CDK5R1	KIT HAMP	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,858
66	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,858
67	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
68	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CDF 11 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,858
69	TIMP1 LBP	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
70	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	SERPINF2 HINT1	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 282/374

279/284

71	C5 CCL23	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	GDF11 CKB-CKM	0,858
72	C5 CCL23	KIT LBP	APOA1 ACY1	CDF 11 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
73	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	APOA1 HINT1	0,858
74	C9 APOA 1	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HINT1	0,858
75	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	GDF11 HINT1	0,858
76	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 ACY1	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT CKB-CKM	0,858
77	TIMP1 LBP	C9 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	CCL23 CKB-CKM	0,858
78	TIMP1 LBP	C5 ACY1	IL12A-IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 CKB-CKM	0,858
79	C9 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 283/374

280/284

80 T C	•IMP1 C XL23 C	:9 ( XL23 A	:5 \CY1 C	KIT 3DK5- 3DK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,858
81	TIMP1 CCL23	C9 LBP	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,858
82	C9 CCL23	C5 SERPINF 2	KIT CCL23	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	0,858
83	C5 SERPI NF2	KIT LBP	APOA1 ACY1	CDF 11 CDK5- CDK5R1	CCL23 CKB-CKM	0,858
84	C9 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,858
85	C5 CCL23	IL12A- IL12B LBP	KIT ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	GDF11 CKB-CKM	0,858
86	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
87	C5 LBP	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
88	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 284/374

281/284

89	C5 CCL23	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	SERPINF2 HINT1	0,858
90	TIMP1 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	CCL23 HINT1	0,858
91	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 FSTL3	CCL23 HAMP	LBP CKB-CKM	0,858
92	TIMP1 APOA 1	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM CKB-CKM	0,858
93	C9 CCL23	C5 ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	CKM HAMP	APOA1 HINT1	0,858
94	TIMP1 GDF11	C5 CCL23	IL12A-IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,858
95	TIMP1 SERPI NF2	C5 CCL23	IL12A-IL12B LBP	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 CKB-CKM	0,858
96	C5 CCL23	IL12A- IL12B ACY1	KIT CDK5- CDK5R1	APOA1 HAMP	SERPINF2 CKB-CKM	0,858
97	C5 ACY1	IL12A- IL12B CDK5- CDK5R1	KIT FSTL3	APOA1 HAMP	GDF11 CKB-CKM	0,858

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 285/374

282/284

98	C5 SERPI NF2	IL12A- IL12B CCL23	KIT LBP	CKM ACY1	APOA1 CDK5- CDK5R1	0,858
99	TIMP1 APOA 1	C9 SERPINF 2	C5 CCL23	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	0,858
100	TIMP1 CCL23	C5 LBP	KIT ACY1	CKM CDK5- CDK5R1	APOA1 HINT1	0,858
Tabela 30:	Contad	ores de	marcadores em painéis de

biomarcadores

	Tamanho do Painel
Biomarcador	3	4	5	6	7	8	9	10
ACY1	141	192	308	399	489	590	658	759
APOA1	180	395	598	728	833	919	962	981
C5	163	285	437	559	644	693	773	834
C9	190	314	340	341	359	395	436	511
CCL23	151	168	191	202	238	273	308	363
CCL23	150	160	195	260	332	412	502	587
CDK5-CDK5R1	147	230	359	512	660	785	893	943
CKB-CKM	187	391	473	563	623	654	680	685
CKM	174	227	224	254	298	350	407	476
ENTPD1	107	57	38	31	27	12	8	14
FSTL3	112	89	87	101	107	136	170	190
GDF11	112	62	52	53	73	116	156	228
HAMP	107	67	73	96	134	199	265	322
HINT1	129	156	182	205	240	276	336	421
IL12A-IL12B	116	120	132	169	208	268	320	355

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 286/374

283/284

KIT	188	523	728	862	928	977	995	999
KLK3- SERPIN A3	166	71	40	28	23	22	21	13
LBP	146	177	208	250	326	383	471	565
SERPINF2	126	134	139	161	206	241	300	351
THBS2	72	7	0	0	0	0	0	0
TIMP1	136	175	196	226	252	299	339	403

Tabela 31: Parâmetros derivados de conjuntos de dados de câncer para classificadores naive Bayes

	Câncer Pancreático	NSCLC	Mesotelioma
		Control	Cânce	Control Câncer	Control Câncer
		e	r	e		e
ACY1	Média	9,90	10,41	9,70	9,43	9,29	8,67
	SD	0,63	0,92	0,45	0,46	0,57	0,65
APOA1	Média	9,70	9,48	8,77	8,65	9,22	8,97
	SD	0,17	0,30	0,21	0,23	0,13	0,24
C5	Média	9,49	9,60	10,13	10,20	10,05	10,19
	SD	0,12	0,14	0,12	0,14	0,11	0,16
CCL23	Média
	SD	0,23	0,27	0,15	0,20	0,08	0,23
CDK5-	Média	6,94	6,99	6,85	6,93	6,72	6,88
CDK5R1
	SD	0,11	0,11	0,12	0,15	0,11	0,12
CKB-CKM	Média	7,51	7,02	7,45	7,06	8,25	7,41
	SD	0,65	0,48	0,49	0,49	0,61	0,49
IL12A-IL12B	Média	7,31	7,27	8,86	8,80	7,76	7,71
	SD	0,05	0,06	0,11	0,13	0,05	0,07
KIT	Média	9,77	9,62	8,67	8,46	8,62	8,34
	SD	0,29	0,32	0,22	0,27	0,22	0,17

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 287/374

284/284

LBP	Média	9,10	9,49	8,32	8,47	9,19	9,51
	SD	0,44	0,55	0,32	0,50	0,26	0,68
SERPINF2	Média	9,26	9,18	8,97	8,85	8,80	8,67
	SD	0,12	0,16	0,21	0,19	0,21	0,26

Tabela 32: Cálculos derivados do conjunto de treinamento para classificador naive Bayes.

Biomarcador	Pc	Pd	Oc	Od	X	ρ(σ|.τ)	ϊΧΦ)	1η(ρ(ά\χ)/ρ(ο\χ)}
KIT	8,671	8,462	0,222	0,270	8,763	1,652	0,794	-0,732
SERPINF2	8,971	8,852	0,208	0,194	9,085	1,649	0,998	-0,503
CCL23	7,382	7,452	0,146	0,204	7,327	2,539	1,626	-0,445
IL12A-IL12B	8,857	8,798	0,115	0,131	8,863	3,478	2,691	-0,257
CDK5- CDK5R1	6,852	6,931	0,122	0,149	6,688	1,321	0,712	-0,618
CY1	9,701	9,435	0,449	0,459	9,526	0,823	0,853	0,035
APOA1	8,772	8,648	0,210	0,230	8,805	1,875	1,378	-0,308
CKB-CKM	7,449	7,062	0,495	0,487	7,742	0,676	0,309	-0,782
LBP	8,322	8,472	0,317	0,504	8,215	1,187	0,695	-0,536
C5	10,127	10,201	0,123	0,144	10,086	3,077	2,017	-0,422

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 288/374

Claims (4)

REIVINDICAÇÕES

1 a 13, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é classificado como tendo ou não tendo câncer pancreático, ou a probabilidade do indivíduo de ter câncer pancreático é determinada, baseada nos valores de biomarcadores e pelo menos um item da informação biomédica adicional correspondente ao referido indivíduo.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o referido indivíduo é classificado como tendo ou não tendo câncer pancreático, ou a probabilidade do indivíduo de ter câncer pancreático é determinada, baseada nos valores de biomarcadores e pelo menos um item da informação biomédica adicional correspondente ao referido indivíduo.

16. Método, de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que pelo menos um referido item da informação biomédica adicional é independentemente selecionado a partir do grupo consistindo em (a) informação correspondente à presença ou à ausência de uma massa pancreática ou outra massa abdominal, (b) informação correspondente a descritores físicos do dito indivíduo, (c) informação correspondente a uma modificação em peso do dito indivíduo, (d) informação correspondente à etnia do dito indivíduo, (e) informação correspondente ao sexo do dito indivíduo, (f) informação correspondente à história de fumo do dito indivíduo, (g) informação correspondente à história de uso de álcool do dito indivíduo, (h) informação correspondente à história ocupacional do dito indivíduo, (i) informação correspondente à história familiar do dito

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 291/374

1. Método para diagnosticar câncer pancreático em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende:

fornecer um painel de biomarcadores compreendendo N das proteínas biomarcadoras listadas na tabela 1;

detectar biomarcadores proteicos em uma amostra biológica de um indivíduo, para fornecer valores de biomarcadores em que cada um corresponde aos N biomarcadores no painel, em que o indivíduo é classificado como tendo ou não tendo câncer pancreático, ou a probabilidade do indivíduo de ter câncer pancreático é determinada, baseada nos valores dos biomarcadores, e em que N = pelo menos 3, em que o painel de biomarcadores compreende HAMP, e em que a amostra biológica é selecionada do grupo consistindo em sangue total, plasma, soro e fluido pancreático, ou em que a amostra biológica é tecido pancreático e em que os valores de biomarcadores derivam de uma análise histológica ou citológica do referido tecido pancreático.

2/4 histológico ou citológico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a amostra biológica é plasma.

7. Método de acordo comqualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um ser humano.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que (a) N = 4 - 65;

(b) N = 5 - 65;

(c) N = 6 - 65;

(d) N = 7 - 65;

(e) N = 8 - 65; ou (f) N = 9 - 65.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem alto risco de câncer pancreático devido ao fumo, consumo de álcool ou história familiar de câncer pancreático.

10. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que os biomarcadores são selecionados a partir da Tabela 18.

11. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que compreende ainda o biomarcador CA19-9.

12. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o painel de biomarcadores compreende o biomarcador CTSB.

13. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é um assintomático de alto risco de câncer pancreático.

14. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 290/374

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o diagnóstico compreende o diagnóstico diferencial de câncer pancreático de condições benignas, tais como pancreatite ou um distúrbio gastrointestinal.

3/4

3. Método, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem uma massa abdominal.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito ensaio in vitro compreende pelo menos um reagente de captura correspondente a cada um dos ditos biomarcadores, e compreendendo ainda seleção do dito pelo menos reagente de captura do grupo consistindo em aptâmeros e anticorpos.

5. Método, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado do grupo consistindo em um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmeros, um ensaio

Petição 870190104867, de 17/10/2019, pág. 289/374

4/4 indivíduo de câncer pancreático ou outro câncer, (j) informação correspondente à presença ou à ausência no dito indivíduo de pelo menos um marcador genético que está correlacionado com um risco mais alto de câncer pancreático ou câncer no dito indivíduo ou um membro da família do dito indivíduo, (k) informação correspondente a sintomas clínicos do dito indivíduo, (l) informação correspondente a outros testes de laboratório, (m) informação correspondente a valores de expressão gênica do dito indivíduo, e (n) informação correspondente à exposição do dito indivíduo a carcinógenos conhecidos.