JP6124986B2 - 拡張期心不全を処置するための増殖分化因子（ｇｄｆ） - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、35 U.S.C.§119(e)の下で、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、2012年3月19日に提出された米国仮出願第61/612,550号および2012年5月22日に提出された米国仮出願第61/649,962号の恩典を主張する。

配列表
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、EFS-Webを介してASCIIフォーマットで提出されている配列表を含む。2013年3月7日に作成された該ASCIIコピーのファイル名は、043214-073892-PCT_SL.txtであり、サイズは58,885バイトである。

技術分野
本明細書において記述される技術の態様は、拡張期心不全、心肥大、および関連状態の処置に関する。

背景
多細胞生物の加齢により、正常な心機能が失われる可能性があり、最終的に心不全が起こりうる。心不全は、50歳を超える人々では約1％が罹患するが、75歳を超える人々では5％超が罹患し、わが国において高齢者の割合の急増が続いていることから、加齢関連心不全がますます有病率の高い健康状態となるのは確実である。ほとんどの加齢関連心不全は、正常な収縮機能を伴い、これは心肥大（すなわち、心組織の肥大）に関連することの多い状態であり、「拡張期心不全」と呼ばれる（G, P. Aurigemma, N Engl J Med 355, 308 (Jul 20, 2006)（非特許文献1））。拡張期心不全は、心不全の症例の40〜60％を占める（非特許文献1）; S. A. Hunt et al., Circulation 2009 119:e391（非特許文献2）; D. W. Kitzman, K. R. Daniel, Clin Geriatr Itled 2007 23:83（非特許文献3）; J. C. Finerty, Physiol Rev 1952 32:277（非特許文献4））。拡張期心不全の予後は収縮期心不全と同程度に不良であり得（非特許文献1）、心不全による初回入院後の5年死亡リスクは、一般的な悪性腫瘍の5年死亡リスクにほぼ等しい（D. E. Wright, et al. Science 2001 294: 1933（非特許文献5））。収縮期心不全の処置は大きく進歩しており、過去20年間で転帰は実質的に改善されているが、拡張期心不全の処置はなかなか進歩が見られない（非特許文献2）。実際のところ、加齢に伴う拡張機能障害に関連する心室「硬化」を経験している患者のための具体的な治療はないとも言える（非特許文献3）。この臨床での現実こそが、収縮期心不全の死亡率は低下しているのに拡張期心不全はそうではないという知見（非特許文献4）の説明となり得、かつ拡張期不全を標的とする新規治療戦略に対する臨床上の強い必要性を浮き彫りにする。

拡張期心不全は、長期にわたる高血圧症、大動脈弁狭窄症などの弁膜症、遺伝性肥大型心筋症を含む、多様な病態生理学的状況で、および加齢の結果として起こる、臨床症候群である。これらの異なる病因は、いくつかの共通の病態生理学的な筋道に、最も明白には、細胞の肥大または心筋細胞径の増加に収束し、これはつまり、拍出能（収縮機能）の有意な低下を伴わない、心臓壁の厚さの増加ということである。心筋の肥大は、拡張期心不全を引き起こす弛緩障害または硬化の増加に寄与する、重要な要因である（A. J. Wagers, et al., Science 2002 297:2256（非特許文献6））。

G, P. Aurigemma, N Engl J Med 355, 308 (Jul 20, 2006) S. A. Hunt et al., Circulation 119, e391 (Apr 14, 2009) D. W. Kitzman, K. R. Daniel, Clin Geriatr Itled 23, 83 (Feb, 2007) J. C. Finerty, Physiol Rev 1952 32:277 D. E. Wright, et al. Science 2001 294: 1933 A. J. Wagers, et al., Science 2002 297:2256

概要
本明細書において記述される技術の態様は、動物の血液中のGDF11レベルが年齢とともに減少し、GDF11レベルのこの減少が高齢化した動物の心肥大に関連するという発見に基づいている。本発明者らは、特にGDF11が加齢に関連する心臓の状態を含む心臓の状態に関連することから、動物においてGDF11レベルを増加させることが治療的に有望であることをさらに発見した。

したがって、1つの局面において、本明細書において、対象におけるGDF11ポリペプチドレベルを増加させる組成物を該対象に投与する段階を含む、心血管状態を処置する方法が提供される。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルは、対象の循環血液中のGDF11レベルである。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルは、対象の心組織におけるGDF11レベルである。

いくつかの態様において、対象は、拡張期心不全、心肥大、加齢関連心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化からなる群より選択される状態を有するかまたは有すると診断されている。

いくつかの態様において、組成物は、GDF11ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む。

いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:1、2、14および／または15のいずれかのアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドのホモ二量体を含む。いくつかの態様において、組成物は、SEQ ID NO:1、2、14、および／または15のいずれかのアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドの複合体を含む。

いくつかの態様において、組成物は、GDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む。

いくつかの態様において、組成物は、静脈内、皮下、動脈内、および冠動脈内からなる群より選択される経路によって投与される。いくつかの態様において、GDF11のレベルは、少なくとも100％増加する。いくつかの態様において、GDF11レベルは、健康な参照レベルの少なくとも75％まで増加する。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、単離されたGDF11ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、拡張期心不全、心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化からなる群より選択される状態を処置するための、GDF11ポリペプチドの使用に関する。

異時性並体結合が、加齢関連心肥大を回復(reverse)させることを実証する。実験の概略図を示す。若齢の等時性並体結合マウス、異時性並体結合マウス、および老齢の等時性並体結合マウスを6対ずつ作製した。手術から4週間後に、マウスを屠殺して、分析のために組織を採取した。 異時性並体結合が、加齢関連心肥大を回復させることを実証する。若齢の循環血液に4週間曝露された老齢マウスにおいて心臓の大きさが劇的に減少したことを実証する。異時性並体結合マウスにおいて、老齢の心臓の肥大は縮小しているように見える一方、若齢の並体結合された心臓は、肥大を発症しない。 異時性並体結合が、加齢関連心肥大を回復させることを実証する。並体結合から4週間後の心臓重量：脛骨長比を表すグラフを示す。データを平均値±s.e.m.として示す。 図2A〜2Bは、若齢の循環血液に曝露することによる加齢関連心筋細胞肥大の回復を実証する。図2Aは、雌性マウスにおけるPAS染色に基づくLVの筋細胞断面積を示す。各動物に関して筋細胞の大きさを、独立した5個の心筋標本における100〜200個の筋細胞の断面積測定値から決定した。結果は、1群あたり4〜12匹の動物の平均値に基づく。図2Bは、雄性マウスを用いて実験を行った場合の結果を示す。データを平均値±s.e.m.として示す。 図3A〜3Cは、若齢の循環血液に曝露された老齢マウスにおける心肥大の回復が、老齢の異時性並体結合マウスにおける血圧の低下によって説明されないことを実証する。図3Aは、血圧および脈拍の測定値を示す。コンピューター化されたテールカフシステムを用いて、手術を行っていない若齢および老齢マウスにおいてベースラインでの収縮期血圧を測定した。同じシステムを用いて脈拍を測定した。若齢（2ヶ月齢）マウスは、老齢（21ヶ月齢）のマウスと比較して有意に高い収縮期血圧を示し、脈拍に差はない。図2Bは、マウスを結合してから4、7、および10週間後に、同時に血圧を測定するために並体結合ペアを保持するように改変したテールカフシステムを用いた場合の結果を示す。老齢の異時性マウスは、7および10週間の時点で収縮期血圧の有意な上昇を示した；老齢の等時性マウスは、ベースライン値と比較した場合に、7週間の時点で血圧の有意な上昇を示した、^*：P＜0.05。図3Cは、結合してから10週間後、ペアのマウスに同時に末端動脈内カテーテル法を行うことによって決定した場合の平均動脈圧に関して得られた値を示す。異なる群間で有意差は観察されなかった。データを平均値±s.e.m.として示す。 図4A〜4Cは、若齢の全身循環血液による老化した心筋の心臓リモデリングに関する分子的証拠を示す。RNAを心臓から抽出して、リアルタイムPCRによって分析した。ANP（図4A）およびBNP（図4B）レベルは、老齢の等時性マウスと比較した場合に、若齢の循環血液に曝露された老齢マウスにおいて有意に減少した。図4Cは、老齢の等時性マウスと比較した場合に、若齢の循環血液に曝露された老齢マウスではSERCA-2転写物レベルが有意に高かったことを実証するグラフを示す。転写物レベルを、リアルタイムPCRによって測定して、Y-IP群に対して標準化した。データを平均値±s.e.m.として示す。 キメラ現象の確認を示す。一方のパートナー（CD45.1+）からのドナー由来血液細胞が他方のパートナー（CD45.2+）の脾臓に出現する頻度を測定することによって、並体結合ペアにおいて血液のキメラ現象を確認した。パートナー由来細胞は典型的に、脾細胞の40〜50％に相当し、これは、並体結合による交叉循環の確立と整合した。老齢のCD45.1+マウスは市販されていないことから、老齢の並体結合ペアにおけるキメラ現象の確立を確認することはできなかったが、本発明者らのこのモデルに関する幅広い経験およびGFP^young/WT^oldペアに由来する非公表データにより、これらの完全な同遺伝子型ペアにおいても交叉循環が等しく有効に確立されるという結論が強く支持される。 図6A〜6Bは、実験の設計および心臓重量の評価を示す。図6Aは、若齢の等時性並体結合マウス、異時性並体結合マウス、および老齢の等時性並体結合マウスを作製した実験の概略図を示す。手術してから10週間後にマウスを屠殺して、分析のために組織を採取した。図6Bは、並体結合から10週間後の心臓重量：脛骨長比を表すグラフを示す。データを平均値±SEMとして示す。 図7A〜7Bは、若齢マウスが老齢マウスより高いGDF11レベルを有することを実証する。図7Aは、ELISAアッセイの結果を示し、図7Bはウェスタンブロットの結果を示す。 ヒトGDF11前駆体ポリペプチド（問い合わせ配列；SEQ ID NO:1の62〜407位の残基）とヒトGDF8前駆体ポリペプチド（対象配列；SEQ ID NO:18）とのアラインメントを示す。 ヒトGDF11前駆体ペプチド（問い合わせ配列；SEQ ID NO:1の47〜407位の残基）とマウスGDF11前駆体ペプチド（対象配列；SEQ ID NO:19）とのアラインメントを示す。 図10A〜10Dは、若齢のCD45.1マウスとCD45.2マウスの間の血圧の差が心肥大の回復を説明しないことを実証する。図10Aは、CD45.2マウスのみを用いた、並体結合から4週間後の心臓重量／脛骨長比を表すグラフを示す。図10Bは、CD45.2マウスにおけるPAS染色に基づく、左室筋細胞断面積のグラフを示す。老齢マウスを若齢CD45.2マウスの循環血液に曝露すると、心肥大が回復する。図10Cは、若齢のCD45.1またはCD45.2マウスに結合した老齢マウスが、4週間後にテールカフシステムによって測定した血圧において差を示さないことを実証するグラフを示す。図10Dは、末端動脈内カテーテル法による測定によって、群間で血圧の有意な差が検出されなかったことを実証するグラフを示す。データを平均値±s.e.m.として示す。 図11A〜11Cは、偽性の異時性並体結合が老齢マウスにおける心肥大を回復しないことを実証する。図11Aは、偽性の異時性並体結合によって結合した若齢または老齢のマウスから単離された脾細胞によるCD45.1発現（y軸）またはCD45.2発現（x軸）を示すフローサイトメトリープロットを示す。偽性並体結合ペアは、実験的並体結合において観察されるパートナー由来血液細胞の交叉循環を示さなかった。図11Bは、偽性並体結合から4週間後の心臓重量／脛骨長比を表すグラフを示す。図11Cは、偽性並体結合から4週間後のPAS染色に基づく左室筋細胞断面積のグラフを示す。データを平均値±s.e.m.として示す。 図12A〜12Fは、加齢マウスにおいてGDF11循環レベルが減少すること、およびGDF11が「若い」レベルまで復帰すると、心肥大の回復および分子リモデリングが促進されることを実証する。図12Aは、若齢マウス（1群あたりn＝3匹）と比較して老齢マウスの血漿中のGDF11レベルが減少していることを実証するウェスタンブロット分析の結果を示す。同様に、GDF11は、若齢の等時性（Y-IP）マウスと比較して老齢の等時性（O-IP）マウスの血漿において減少し、若齢の循環血液に曝露した後の老齢マウス（O-HP）では「若い」レベルまで復帰する（1群あたりn＝3匹）。図12Bは、rGDF11またはミオスタチンに曝露された心筋細胞における、³H-ロイシン取り込みによって測定したフェニレフリン誘発心肥大のグラフを示す。rGDF11（50 nM）は、フェニレフリン誘発³H-ロイシン取り込みを防止した。図12Cは、TGFβ経路を通してGDF11がシグナル伝達して、ヒト心筋細胞におけるフォークヘッド(Forkhead)転写因子リン酸化を抑制することを実証する。無血清培地（対照）、または表記のタンパク質を含む同じ培地によって15分間刺激したヒト人工多能性幹細胞由来の心筋細胞のウェスタンブロット。図12Dは、老齢（23ヶ月齢）マウスにおけるrGDF11治療の無作為溶媒対照試験のグラフを示す。rGDF11（0.1 mg/kg）または生理食塩水（溶媒対照）を30日間毎日腹腔内注射によって投与した。グラフは心臓重量／脛骨長比を表す。図12Eは、PAS染色後に測定した左室筋細胞断面積のグラフを示す。rGDF11治療によって、筋細胞断面積の減少が起こる。図12Fは、rGDF11または生理食塩水によって処置された老齢マウスから採取した心臓におけるANP、BNP、またはSERCA-2の発現のグラフを示す。リアルタイムPCR転写物の測定値を、生理食塩水群のレベルに対して標準化する。データを平均値±s.e.m.として示す。 図13A〜13Cは、脾臓が、分析した組織の中で有意に高いレベルのGDF11発現を有すること、ならびにGDF11発現およびタンパク質合成の有意な月齢依存的減少を示すことを実証する。図13Aは、若齢（3ヶ月齢）マウスから採取した組織におけるGDF11発現のグラフを示す。リアルタイムPCR転写物の測定値を肝臓におけるレベルに対して標準化する。脾臓における遺伝子発現は、他の全ての組織と比較して有意に高かった（^* P＜0.05）。図13Bは、若齢（3ヶ月齢）および老齢（24ヶ月齢）マウスから採取した脾臓におけるGDF11発現のグラフを示す。リアルタイムPCR転写物の測定値を、若齢マウスにおけるレベルに対して標準化する。図13Cは、若齢および老齢マウスの脾臓におけるGDF11のウェスタンブロット分析のグラフを示す。GDF11の密度測定（任意の単位、平均値±s.e.m.）は、α-チューブリンに対して標準化された。データを平均値±s.e.m.として示す。 GDF11レベルが、単回腹腔内ボーラス後の血漿中で24時間持続的に増加しうることを実証する。血漿中のGDF11レベルを、0.1 mg/kgの組み換え型GDF11を単回腹腔内注射後の表記の時間におけるウェスタン分析によって評価した（n＝3）。 図15A〜15Cは、若齢マウスにおける大動脈縮窄術による圧負荷後の心肥大の発症が、rGDF11の添加により防止されなかったことを実証する。図15Aは、rGDF11または溶媒による処置から30日後の心臓重量／脛骨長比を表すグラフを示す。rGDF11を注射したマウス（n＝10）における比は、溶媒を注射したマウス（n＝9）において測定された比と有意差がなかった（9.08±0.71対9.89±0.69 mm/mg、P=ns）。図15Bは、rGDF11または溶媒による処置から30日後のPAS染色後に測定された左室筋細胞断面積のグラフを示す。心筋細胞断面積は、2つの群において有意差がなかった（rGDF11処置群において286.4±12.89μm2、溶媒処置群において304.2±17.3μm2、P=ns）。図15Cは、rGDF11または溶媒による処置から30日後の心エコーデータを含む表を示す。心室リモデリングまたは機能に関して心エコーパラメータに有意差は認められなかった。AWT＝前壁厚；PWT＝後壁厚；EDD＝拡張末期径；ESD＝収縮末期径；FS＝短縮率。データを平均値±s.e.m.として示す。 1群あたりn＝3人の正常なヒトにおける年齢および性別毎の血清中のGDF11タンパク質測定値のグラフを示す。若齢および老齢マウスのおおよそのレベルを、任意の単位でグラフの左に示す。

詳細な説明
本明細書において記述される技術の態様は、動物が年をとるにつれて、そのGDF11ポリペプチドレベルが減少して、それによって心肥大が起こるという発見に基づいている。本明細書において、拡張期心不全、心肥大、加齢関連心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、および／または加齢による心臓の硬化を含むがこれらに限定されるわけではない心臓の状態を処置するための方法および組成物が記述される。これらの方法および組成物は、概して、本明細書において記述される心臓の状態を処置、予防、または回復させるために対象におけるGDF11ポリペプチドのレベルを増加させることに関する。

便宜上、本明細書、実施例、および添付の特許請求の範囲において用いられる特定の用語をここに集める。それ以外であると明記している場合を除き、または文脈から暗示される場合を除き、以下の用語および表現は、以下に提供される意味を含む。それ以外であると明白に述べている場合を除き、または文脈から明らかである場合を除き、以下の用語および表現は、それが属する技術分野においてその用語または表現が持つ意味を除外しない。本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ制限されることから、定義は、特定の態様の説明を補助するために提供され、特許請求される本発明を制限することは意図されていない。それ以外であると定義している場合を除き、本明細書において用いられる全ての技術・科学用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。

本明細書において用いられる場合、「心血管状態」という用語は、循環GDF11ポリペプチドの減少によって媒介されるまたは該減少を特徴とする状態を意味する。心血管状態の非制限的な例には、拡張期心不全、心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化が含まれる。

「減少する」、「低下する」、「低下した」、「低下」、「減少」および「阻害する」という用語は全て、本明細書において一般的に、参照と比較して統計学的に有意な量の減少を意味するために用いられる。しかし、誤解を避けるため、「低下する」、「低下」、または「減少する」または「阻害する」とは典型的に、参照レベルと比較して少なくとも10％の減少を意味し、たとえば、参照レベルと比較した場合の所定の実体もしくはパラメータの、少なくとも約20％、少なくとも約25％、少なくとも約30％、少なくとも約35％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、少なくとも約65％、少なくとも約70％、少なくとも約75％、少なくとも約80％、少なくとも約85％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、少なくとも約98％、少なくとも約99％、完全な欠如までの（完全な欠如を含む）減少、または、所定の処置がない場合と比較して10〜99％の任意の減少を含みうる。

「増加した」、「増加する」または「増強する」または「活性化する」という用語は全て、本明細書において一般的に統計学的に有意な量の増加を意味するために用いられ、誤解を避けるため、「増加した」、「増加する」、または「増強する」、または「活性化する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも10％の増加、たとえば、参照レベルと比較して少なくとも約20％、もしくは少なくとも約30％、もしくは少なくとも約40％、もしくは少なくとも約50％、もしくは少なくとも約60％、もしくは少なくとも約70％、もしくは少なくとも約80％、もしくは少なくとも約90％、もしくは100％までの（100％を含む）増加、または参照レベルと比較して10〜100％の任意の増加、または参照レベルと比較して少なくとも約2倍、もしくは少なくとも約3倍、もしくは少なくとも約4倍、もしくは少なくとも約5倍、もしくは少なくとも約10倍の増加、または参照レベルと比較して2倍から10倍もしくはそれ以上の任意の増加、もしくはそれより大きい増加を意味する。

本明細書において用いられる「単離された」、または「部分的に精製された」という用語は、核酸またはポリペプチドの場合、その天然起源において見られる核酸もしくはポリペプチドと共に存在しかつ／または細胞によって発現される際もしくは分泌型ポリペプチドの場合には分泌される際に核酸もしくはポリペプチドと共に存在するであろう少なくとも1つの他の成分（たとえば、核酸またはポリペプチド）から分離されている、核酸またはポリペプチドを意味する。化学合成された核酸もしくはポリペプチド、またはインビトロ転写／翻訳を用いて合成された核酸もしくはポリペプチドは、「単離された」と見なされる。

本明細書において用いられる「生物試料」という用語は、生物体から採取または単離された試料、たとえば心臓生検試料、血液試料、細胞溶解物、対象由来の組織試料のホモジネート、または対象由来の流体試料を意味する。例示的な生物試料には、心臓組織生検または血液および／または血清試料が含まれるがこれらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、試料は、摘出、生検、またはコア針生検からの試料である。加えて、細針吸引試料を用いることができる。試料は、パラフィン包埋組織および凍結組織を含みうる。「生物試料」という用語はまた、無処置のまたは前処置（または前処理）した生物試料も含む。いくつかの態様において、生物試料は、無処置の生物試料である。試料は、対象から細胞試料を採取することによって得ることができるが、既に単離された（たとえば、過去の時点で単離された、および同じ人または他者によって単離された）細胞を用いることによっても得ることができる。

本明細書において用いられる場合、「対象」は、ヒトまたは動物を意味する。通常、動物は、霊長類、齧歯類、家畜動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類は、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、たとえばアカゲザルを含む。齧歯類は、マウス、ラット、マーモット、フェレット、ウサギ、およびハムスターを含む。家畜および狩猟動物は、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ科の種、たとえばイエネコ、イヌ科の種、たとえばイヌ、キツネ、オオカミ、鳥類、たとえばニワトリ、エミュー、ダチョウ、ならびに魚類、たとえばマス、ナマズ、およびサケを含む。患者または対象には、前述の任意の部分集合、たとえば上記の全て（ヒト、霊長類、または齧歯類などの1つまたは複数の群または種を除く）が含まれる。ある態様において、対象は、単数の哺乳動物、たとえば霊長類、たとえばヒトである。「患者」、「個体」、および「対象」という用語は、本明細書において互換的に用いられる。

好ましくは、対象は哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシでありうるが、これらの例に限定されるわけではない。たとえば心肥大の動物モデルとなる対象として、たとえばヒト以外の哺乳動物を都合よく用いることができる。加えて、本明細書において記述される方法は、家畜動物および／またはペットを処置するために用いることができる。対象は雄性または雌性でありうる。

対象は、処置を必要とする状態（たとえば、心肥大）またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症に罹っているかもしくは有すると、以前に診断されているかもしくは同定されていて、かつ任意で、状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症に関する処置をまだ受ける必要がなかった、対象でありうる。または、対象は、処置を必要とする状態、またはそのような状態に関連する1つもしくは複数の合併症を有すると以前に診断されていなかった対象でもありうる。むしろ、対象は、状態または該状態に関連する1つもしくは複数の合併症に関する1つまたは複数の危険因子を示す対象を含みうる。特定の状態の処置を「必要とする対象」は、該状態を有する、該状態を有すると診断された、または所定の参照集団と比較して該状態を発症するリスクが高い対象でありうる。

本明細書において用いられる場合、「含み」または「含む」という用語は、組成物、方法、および該方法または該組成物にとって必須であるそれらの各構成要素に関して用いられるが、必須であるか否かに関わらず明記されていない要素を含めることは許容される。

「からなる」という用語は、本明細書において記述される組成物、方法、およびそれらの各構成要素を意味し、態様のその記述において記載されていない全ての要素を除外する。

本明細書において用いられる場合、「本質的にからなる」という用語は、所定の態様にとって必要な要素を意味する。この用語は、その態様の基本的かつ新規なまたは機能的な特徴に実質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。

本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「1つの」、「ある」、および「その」は、文脈が明らかにそれ以外であることを示している場合を除き、複数形を含む。このため、たとえば「その方法」という言及は、本明細書において記述される種類の、および／または本開示を読むことによって当業者に明らかとなるであろう種類の、1つまたは複数の方法および／または段階などを含む。同様に、「または」という用語は、文脈が明らかにそれ以外であると示している場合を除き「および」を含むと意図される。本明細書において記述される方法および材料と類似または同等の方法および材料を本開示の実践または試験において用いることができるが、適した方法および材料を以下に記述する。省略語「e.g.」は、ラテン語のexempli gratiaに由来し、本明細書において非制限的な例を示すために用いられる。このため、省略語「e.g.」は、「たとえば」という用語と同義である。

操作実施例(operating examples)以外において、またはそれ以外であると示している場合を除き、本明細書において用いられる成分の量または反応条件を表す全ての数字は、全ての例において「約」という用語によって修飾されていると理解すべきである。「約」という用語は、百分率に関連して用いる場合、±1％を意味しうる。

「統計学的に有意な」または「統計学的に」という用語は、統計学的有意性を意味し、一般的に、参照値の上方または下方の2標準偏差（2SD）の差を意味する。追加の定義は、以下の個別の章の本文に提供される。

細胞生物学および分子生物学における一般的な用語の定義は、"The Merck Manual of Diagnosis and Therapy", 19th Edition, published by Merck Research Laboratories, 2006 (ISBN 0-911910-19-0); Robert S. Porter et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); The ELISA guidebook (Methods in molecular biology 149) by Crowther J. R. (2000); Immunology by Werner Luttmann, published by Elsevier, 2006において見いだすことができる。分子生物学における一般的な用語の定義もまた、Benjamin Lewin, Genes X, published by Jones & Bartlett Publishing, 2009 (ISBN-10: 0763766321); Kendrew et al. (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1-56081-569-8) and Current Protocols in Protein Sciences 2009, Wiley Inter sciences, Coligan et al., edsにおいて見いだすことができる。

それ以外であると明記している場合を除き、本発明は、たとえば、その全内容がいずれも参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., USA (2001) and Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier Science Publishing, Inc., New York, USA (1995)において記述されるように、標準的な技法を用いて行われた。

本明細書において、対象におけるGDF11ポリペプチドレベルを増加させる組成物を該対象に投与する段階を含む方法が記述される。いくつかの態様において、対象は、加齢関連状態を有するか、または有すると診断されている対象である。本明細書において用いられる場合、「加齢関連状態」という用語は、集団でのその発生率または個体における重症度が加齢と相関する任意の疾患、障害、または望ましくない状態を意味する。いくつかの態様において、加齢関連状態は、心血管状態、心臓の老化、骨格筋の老化、または脳の老化である。任意の所定の器官の老化は、細胞充実度の低下、幹細胞のゲノム完全性の低下、細胞機能の低下（たとえば、筋組織における筋収縮の低下）、再生能の低下、萎縮（たとえば、皮膚の老化は、表皮の萎縮および／または皮脂腺の濾胞を含みうる）を含みうるがこれらに限定されるわけではない。加齢関連状態は、所定の器官の機能を低下させる状態または審美的に望ましくない状態でありうる（たとえば、皮膚または筋肉の老化は審美的に不都合でありうる）。追加の加齢関連状態は、サルコペニア、皮膚萎縮、筋消耗、脳の萎縮、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、肺気腫、骨粗鬆症、変形性関節症、免疫不全、高血圧、認知症、ハンチントン病、アルツハイマー病、白内障、加齢性難聴、前立腺癌、卒中、余命の減少、記憶喪失、しわ、腎機能障害、および加齢関連聴覚喪失を含みうるがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる場合、「代謝障害」は、細胞におけるエネルギーの産生または細胞、組織、器官、もしくは個体における毒素の蓄積に影響を及ぼすことによって、細胞、組織、もしくは器官に損傷を与えるかまたはそれらの正常な機能を妨害する、任意の疾患または障害を意味するものとする。本発明に関連する代謝障害は、II型糖尿病、代謝症候群、高血糖症、および肥満を含むがこれらに限定されるわけではない。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルを増加させる組成物が、拡張期心不全、心肥大、加齢関連心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、および／または加齢による心臓の硬化を有するか、または有すると診断されている対象に投与される。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルは、対象の循環血液中のGDF11レベルである。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルは、対象の心臓組織におけるGDF11レベルである。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドレベルは、GDF11ポリペプチドをコードするmRNAレベルを測定することによって決定される。対象におけるGDF11レベルは、対象から生物試料を得る段階、および生物試料中のGDF11レベルを決定する段階によって決定されうる。対象または対象から得られた試料中のポリペプチドレベルを決定する方法は、当技術分野において周知であり、中でも、ELISA、ラジオイムノアッセイ、免疫組織化学、GDF11に対して特異的な標識抗体を含む方法、ドットブロット分析、ノザンブロット、インサイチューハイブリダイゼーション、およびRT-PCRを含むがこれらに限定されるわけではない。GDF11に対して特異的な抗体は市販されており、たとえばAbcam; Cambridge, MAのカタログ番号ab71347である。いくつかの態様において、GDF11レベルは、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Souza et al., Molecular Endocrinology 2008 22:2689-2702に記述されるように測定されうる。

動物が年をとると、心臓組織は、組織の肥厚および／もしくは硬化または心肥大に関連する拡張機能の低下を経験することが多い。本明細書において用いられる場合、「心肥大」という用語は、筋細胞サイズの増大に一部起因する心臓の肥大を意味する。いくつかの態様において、筋細胞は、肥大性の成長を通じてストレスに応答する。心肥大はしばしば、有病率および死亡率のリスクの増加に関連する。いくつかの態様において、心肥大とは、左室心肥大である。「左室心肥大」という用語は、左心室の心筋組織が肥厚する障害を意味する。理論に拘束されることを望まないが、左室心肥大の原因には、たとえば高血圧症（たとえば、高血圧）、大動脈弁狭窄（たとえば、心臓の弁が完全に開くことができないこと）、および肥大型心筋症（たとえば、明白な原因無しに心筋組織が肥厚する障害）が含まれる。他の態様において、心肥大は右室心肥大である。「右室心肥大」という用語は、右室の心筋組織が肥厚する障害を意味する。理論に拘束されることを望まないが、右室肥大の原因には、たとえば肺気腫および嚢胞性線維症などの肺に損傷を与える疾患、慢性気管支炎および睡眠時無呼吸などの体内の酸素レベルを減少させる状態、肺動脈弁狭窄、慢性肺塞栓症、原発性肺高血圧症、非対称性中隔肥大、および特発性肥大性大動脈弁下部狭窄が含まれる。

心肥大の症状およびそれらを測定する方法は、当技術分野において周知であり、左室重量の増加；体重比の変化；心筋細胞のサイズ、重量、および構成の変化；心臓の遺伝子発現の変化；心機能（たとえば、拡張時心機能）の変化；類線維沈着；dP/dTの変化、すなわち時間に対する心室圧の変化速度；カルシウムイオン流入；一拍動の長さ；ならびに心室拍出量を含むがこれらに限定されるわけではない。心血管状態および／または心血管状態の処置の効能を検出するために有用な診断技法は、心エコー（たとえば、2次元および3次元）、MRI（たとえば、スピン-エコーMRI、またはシネ磁気共鳴血管造影）、胸部X腺検査、タリウム-201心筋イメージング、PET、ECG-ゲートCT、心臓カテーテル法、血管造影、電気生理学試験、および磁気共鳴分光法を含む。たとえば、心エコーは、心臓のサイズ、肥大のパターン、心臓の収縮機能、および流出較差の重症度を検出することができる一方、MRIは、心室の解剖学的構造、壁厚、心室機能、および心室拡張末期容積および心室収縮末期容積、弁機能障害、および流出路閉塞を評価することができる。

本明細書において記述される方法および組成物は、対象におけるGDF11ポリペプチドレベルを増加させることに関する。本明細書において用いられる場合、「GDF11」は、増殖因子のトランスフォーミング増殖因子βスーパーファミリーメンバーである「増殖分化因子11」（NCBI遺伝子ID番号：10220）を意味する。GDF11は、ALK4、ALK5、およびALK7を含むTGFβスーパーファミリーI型受容体に結合することが知られている。哺乳動物の発達の際のシグナル伝達に関して、GDF11は、ALK4およびALK5を主に使用する。いくつかの態様において、GDF11シグナル伝達はまた、ACVR2B受容体を介しても起こりうる。GDF11はまた、GDF8（ミオスタチンとしても知られる）とも近縁である。GDF11はまた、骨形態形成タンパク質11、すなわちBMP11とも呼ばれうる。本明細書において用いられる場合、「GDF11」は、GDF11のヒト前駆体ポリペプチド（SEQ ID NO: 1、NCBI Ref Seq: NP_005802）；ヒトプロペプチド（SEQ ID NO: 2）；ヒトN末端ポリペプチド（SEQ ID NO: 15）、およびヒト成熟型（SEQ ID NO:14）、ならびにウシ、イヌ、ネコ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、七面鳥、ウマ、魚、ヒヒ、および他の霊長類を含むがこれらに限定されるわけではない他の種のホモログを含みうる。この用語はまた、たとえば適切な動物モデルにおいて測定した場合に、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:14の完全長GDF11の心肥大減少（または予防）効果の少なくとも50％を維持するGDF11の断片または変種を意味する。野生型GDF11の心肥大減少または予防の活性を維持する保存的置換変種は、本明細書において定義される保存的置換を含むであろう。野生型の活性の少なくとも50％を維持しながら保存的置換を許容する可能性が最も高いアミノ酸の同定は、たとえば、他の種由来のGDF11ホモログまたはパラログとの配列アラインメントによって導かれる。GDF11ホモログ間で同一であるアミノ酸は、変化を許容する可能性がより低いが、保存的な違いを示すアミノ酸は、人工的変種の文脈における保存的変化を許容する可能性が明らかにかなり高い。同様に、非保存的な違いのある位置は、機能にとって重要である可能性がより低く、人工的変種において保存的置換を許容する可能性がより高い。たとえば心肥大を有する適切な動物モデルに変種を投与する段階、および本明細書において記述されるようにイメージングして、肥大の任意の回復を追跡する段階によって、該変種を、活性に関して試験することができる。

ヒトGDF11に関して、プロペプチド+シグナルの配列（たとえば、前駆体ポリペプチド）は407アミノ酸長である。24アミノ酸のシグナルペプチドを切断すると、383アミノ酸のプロペプチドが生成され、プロペプチドを切断すると、プロペプチドのC末端109アミノ酸に対応する109アミノ酸の成熟GDF11ポリペプチドが生じる。成熟ポリペプチドは、ジスルフィド結合したホモ二量体を形成する。また、プロペプチドの切断により、SEQ ID NO:1の25〜298位のアミノ酸を含むN末端ポリペプチド（たとえば、SEQ ID NO:15）も生成される。N末端GDF11ポリペプチドは、他の型のGDF11ポリペプチドと複合体を形成することによって、少なくともインビトロで、たとえば、SEQ ID NO:2および14のポリペプチドの活性に拮抗することができ、このため、本明細書において記述されるGDF11組成物の活性を調節するために用いられうる。このため、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドが心臓の状態、たとえば、中でも心肥大または硬化を減少させるかまたは予防する限り、および、たとえばSEQ ID NO:15のN末端GDF11ポリペプチドがそのような減少または予防に拮抗できる限り、SEQ ID NO:15のポリペプチドは、その用語が本明細書において用いられる「GDF11ポリペプチド」の意味から除外されうる。

本明細書において用いられる場合、「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、隣接残基のαアミノ基とカルボキシ基との間のペプチド結合によって他と結合している一連のアミノ酸残基を指定するために互換的に用いられる。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、そのサイズまたは機能によらず、修飾アミノ酸（たとえば、リン酸化、糖化、グリコシル化等）およびアミノ酸アナログを含むタンパク質アミノ酸のポリマーを意味する。「タンパク質」および「ポリペプチド」は、比較的大きいポリペプチドに関連して用いられることが多く、「ペプチド」という用語は、小さいポリペプチドに関連して用いられることが多いが、当技術分野におけるこれらの用語の使用は一部共通する。「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、本明細書において、遺伝子産物およびその断片について言及する場合、互換的に用いられる。このため、例示的なポリペプチドまたはタンパク質は、前述の遺伝子産物、天然のタンパク質、ホモログ、オルトログ、パラログ、断片および他の同等物、変種、断片、およびアナログを含む。本明細書において用いられるように、GDF11に関連して用いる場合の「プロペプチド」は、シグナルドメイン（たとえば、SEQ ID NO:1の1〜24位のアミノ酸）が、成熟型および／または活性型GDF11の形成の間に切除される、GDF11ポリペプチドを意味する。本明細書において用いる場合、GDF11に関連して用いられる「前駆体ペプチド」は、シグナルドメインを含むGDF11ポリペプチド、たとえばSEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むポリペプチドを意味する。

いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルを、GDF11ポリペプチドおよび／またはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を投与することによって増加させる。本明細書において記述される方法に従って対象に投与されるGDF11ポリペプチドは、本明細書において上述されたGDF11ポリペプチド、たとえばプロペプチドまたは成熟型を含みうる。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様において、対象に投与される組成物は、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列のポリペプチドを含むGDF11ポリペプチドホモ二量体を含みうる。いくつかの態様において、対象に投与される組成物は、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列のポリペプチドを含むGDF11ポリペプチドホモ二量体を含みうる。いくつかの態様において、対象に投与される組成物は、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列のポリペプチドを含むGDF11ポリペプチドホモ二量体を含みうる。いくつかの態様において、対象に投与される組成物は、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列のポリペプチドを含むGDF11ポリペプチドホモ二量体を含みうる。いくつかの態様において、対象に投与される組成物は、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:2、および／またはSEQ ID NO:1のアミノ酸配列のいずれかのポリペプチドを含むGDF11ポリペプチドヘテロ二量体を含みうる。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドの変種または断片が、対象に投与されうる。いくつかの態様において、GDF11の変種は、保存的修飾変種である。

本明細書において記述される局面のいずれかのいくつかの態様において、対象は、Collectin kidney 1（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 78989）（SEQ ID NO: 4）、カテプシンD（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 1509）（SEQ ID NO: 5）、Dickkopf関連タンパク質4（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 27121）（SEQ ID NO: 6）、赤血球膜タンパク質4.1（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 2035）（SEQ ID NO: 7）、エステラーゼD（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 2098）（SEQ ID NO: 8）、ヘモグロビン（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 3043または3047）（それぞれ、SEQ ID NO: 9および20）、インターロイキン-1受容体アクセサリタンパク質（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 3556）（SEQ ID NO: 21）、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 22914）（SEQ ID NO: 22）、Ras関連C3ボツリヌス毒素基質1（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 5879）（SEQ ID NO: 23）、GTP結合核タンパク質Ran（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 5901）（SEQ ID NO: 24）、組織メタロプロテアーゼ阻害物質3（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 7078）（SEQ ID NO: 25）、およびチミジル酸シンターゼ（たとえば、NCBI遺伝子ID番号: 7298）（SEQ ID NO: 26）から選択されるポリペプチドの変種または断片（たとえば、保存的修飾変種もしくは機能的断片またはそのようなポリペプチドをコードする核酸）を投与されうる。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、本明細書において記述される配列の変種、たとえば、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1、またはSEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドの変種でありうる。いくつかの態様において、変種は保存的置換変種である。変種は、たとえば天然ヌクレオチド配列の変異によって得ることができる。本明細書において言及される「変種」とは、天然または参照ポリペプチドと実質的に相同であるが、1つまたは複数の欠失、挿入、または置換のために該天然または参照ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を有する、ポリペプチドである。ポリペプチドをコードするDNA配列は、天然または参照DNA配列と比較した場合に1つまたは複数のヌクレオチド付加、欠失、または置換を含むが、参照タンパク質と比較して関連する生物活性を保持するすなわち野生型GDF11と同様に心肥大を少なくとも50％遅らせるまたは回復させることができる変種タンパク質またはその断片をコードする、配列を包含する。アミノ酸配列に関して、当業者は、コードされる配列において1つのアミノ酸または小さい割合（すなわち、5％以下、たとえば4％以下、または3％以下、または1％以下）のアミノ酸を変化させる、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個別の置換、欠失、または付加が、その変化によってアミノ酸と化学的に類似のアミノ酸との置換が起こる「保存的修飾変種」であることを認識するであろう。保存的であるか否かによらず、変種が野生型GDF11の活性の100％より高い、たとえば110％、125％、150％、175％、200％、500％、1000％、またはそれより高い活性を有するように、関連活性を向上させる可能性がある変更が存在すると予想される。

置換することができるアミノ酸残基を同定する1つの方法は、たとえばヒトGDF11を、1つまたは複数の非ヒト種由来のGDF11ホモログに対してアラインさせることである。アラインメントは、機能にとって必要である可能性がある残基のみならず、逆に変化を許容する可能性がある残基に関しても、手掛かりを提供することができる。たとえば、アラインメントにより、対応する位置で2つの同一または類似のアミノ酸が示される場合、その部位は機能的に重要である可能性がより高い。逆に、アラインメントにより、対応する位置の残基がサイズ、電荷、疎水性等の点で著しく異なると示される場合、その部位は、機能的ポリペプチドにおける変化を許容しうる可能性がより高い。同様に、同じ種由来の関連するポリペプチド、たとえば同じ活性を示さないGDF8とのアラインメントによっても、GDF11活性にとって必要な領域または構造に関する手引きが提供されうる。図8は、ワールドワイドウェブhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/上で無料で利用できるBLASTPプログラムのアラインメントツールのデフォルト設定を用いて作製した、ヒトGDF11前駆体ペプチド（問い合わせ配列；SEQ ID NO:1の62〜407位の残基）と、ヒトGDF8前駆体ペプチドとのアラインメントの例を示す。図9は、ワールドワイドウェブhttp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/上で無料で利用できるBLASTPプログラムのアラインメントツールのデフォルト設定を用いて作製した、ヒトGDF11前駆体ペプチド（問い合わせ配列；SEQ ID NO:1の47〜407位の残基）と、マウスGDF11前駆体ペプチドとのアラインメントの例を示す。変種アミノ酸またはDNA配列は、天然もしくは参照配列、たとえばSEQ ID NO:15、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:1、もしくはSEQ ID NO:2と、またはそれらアミノ酸配列の1つをコードする核酸と、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％、またはそれ以上同一でありうる。天然配列と変異体配列の間の相同性の程度（％同一性）は、たとえば、ワールドワイドウェブ上でこの目的のために一般的に用いられる無料で利用可能なコンピュータープログラムを用いて2つの配列を比較することによって、決定することができる。変種アミノ酸またはDNA配列は、それが由来する配列（本明細書において「当初の」配列と呼ばれる）と少なくとも90％、少なくとも91％、少なくとも92％、少なくとも93％、少なくとも94％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、少なくとも99％またはそれ以上類似でありうる。当初の配列と変異体配列の間の類似性の程度（％類似性）は、たとえば類似性マトリクスを用いることによって決定することができる。類似性マトリクスは、当技術分野において周知であり、類似性マトリクスを用いて2つの配列を比較するための多くのツール、たとえばBLASTp（ワールドワイドウェブhttp://blast.ncbi.nlm.nih.govにおいて利用可能）が、デフォルトパラメータセットと共にオンラインで無料で利用可能である。

成熟GDF11ポリペプチドは、たとえば、313位と372位、341位と404位、および345位と406位（シグナル配列を含む完全長のポリペプチドを基準として番号付けした）のアミノ酸の間でおそらく鎖内ジスルフィド結合を含むこと、および371位のアミノ酸が鎖間ジスルフィド結合におそらく関与していることに注意されたい。

たとえば1つの脂肪族残基を別の脂肪族残基で（たとえば、Ile、Val、Leu、またはAlaを、Ile、Val、Leu、またはAlaの別の１つで）置換することによって、または1つの極性残基を別の極性残基で（例えばLysとArg、GluとAsp、またはGlnとAsnとの間で）置換することによって、所定のアミノ酸を類似の生理化学的特徴を有する残基に交換することができる。他のそのような保存的置換、たとえば類似の疎水性特徴を有する領域全体の置換も周知である。保存的アミノ酸置換を含むポリペプチドは、天然または参照ポリペプチドの所望のアポトーシス活性が保持されていることを確認するために本明細書において記述されるアッセイの任意の1つにおいて試験することができる。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。そのような保存的修飾変種は、多形変種、種間ホモログ、および本開示と整合する対立遺伝子に加えて存在し、それらを除外しない。典型的には互いに対して保存的な置換は：1）アラニン（A）、グリシン（G）；2）アスパラギン酸（D）、グルタミン酸（E）；3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；4）アルギニン（R）、リジン（K）；5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；7）セリン（S）、トレオニン（T）；および8）システイン（C）、メチオニン（M）を含む（たとえば、Creighton, Proteins (1984)を参照されたい）。

また、ポリペプチドの適切なコンフォメーションの維持には関与しない任意のシステイン残基もまた、分子の酸化的安定性を改善するため、および異常な架橋形成を防止するために、一般的にはセリンに置換することができる。逆に、その安定性を改善するためまたはオリゴマー化を促進するために、システイン結合をポリペプチドに付加することができる。

いくつかの態様において、対象に投与されるGDF11ポリペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸置換または修飾を含みうる。いくつかの態様において、置換および／または修飾は、タンパク質分解を予防または減少させること、および／または対象におけるポリペプチドの半減期を延長することができる。いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、非制限的な例としてトランスフェリン（WO06096515A2）、アルブミン（Yeh et al., 1992）、成長ホルモン（US2003104578AA）；セルロース（Levy and Shoseyov, 2002）；および／またはFc断片（Ashkenazi and Chamow, 1997）などの他のポリペプチドまたはポリペプチドドメインにそれを結合または融合させることによって修飾することができる。前述の段落の参考文献は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、少なくとも1つのペプチド結合置換を含みうる。1つのペプチド結合または複数のペプチド結合、たとえば、2個の結合、3個の結合、4個の結合、5個の結合、または6個もしくはそれより多くの結合、または全てのペプチド結合を置換することができる。本明細書において記述される単離ペプチドは、1種類のペプチド結合置換、または複数種類のペプチド結合置換、たとえば2種類、3種類、4種類、5種類、またはそれより多くの種類のペプチド結合置換を含みうる。ペプチド結合置換の非制限的な例には、尿素、チオ尿素、カルバメート、スルホニル尿素、トリフルオロエチルアミン、オルト-(アミノアルキル)-フェニル酢酸、パラ-(アミノアルキル)-フェニル酢酸、メタ-(アミノアルキル)-フェニル酢酸、チオアミド、テトラゾール、ボロン酸エステル、オレフィン基およびその誘導体が含まれる。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、生きている生物によって産生されるポリペプチドおよび／またはタンパク質において一般的に見られる天然のアミノ酸、たとえばAla（A）、Val（V）、Leu（L）、Ile（I）、Pro（P）、Phe（F）、Trp（W）、Met（M）、Gly（G）、Ser（S）、Thr（T）、Cys（C）、Tyr（Y）、Asn（N）、Gln（Q）、Asp（D）、Glu（E）、Lys（K）、Arg（R）、およびHis（H）を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、別のアミノ酸を含みうる。別のアミノ酸の非制限的な例には、D-アミノ酸；β-アミノ酸；ホモシステイン、ホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール-2-カルボン酸、スタチン、1,2,3,4-テトラヒドロイソキノリン-3-カルボン酸、ペニシラミン（3-メルカプト-D-バリン）、オルニチン、シトルリン、α-メチル-アラニン、パラ-ベンゾイルフェニルアラニン、パラ-アミノフェニルアラニン、p-フルオロフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、およびtert-ブチルグリシン、ジアミノ酪酸、7-ヒドロキシ-テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ナフチルアラニン、ビフェニルアラニン、シクロヘキシルアラニン、アミノ-イソ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、tert-ロイシン、テトラヒドロイソキノリンカルボン酸、ピペコリン酸、フェニルグリシン、ホモフェニルアラニン、シクロヘキシルグリシン、デヒドロロイシン、2,2-ジエチルグリシン、1-アミノ-1-シクロペンタンカルボン酸、1-アミノ-1-シクロヘキサンカルボン酸、アミノ-安息香酸、アミノ-ナフトエ酸、γ-アミノ酪酸、ジフルオロフェニルアラニン、ニペコチン酸、α-アミノ酪酸、チエニル-アラニン、t-ブチルグリシン、トリフルオロバリン；ヘキサフルオロロイシン；フッ素化アナログ；アジド修飾アミノ酸；アルキン修飾アミノ酸；シアノ修飾アミノ酸；およびそれらの誘導体が含まれる。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドは、たとえばある部分を該ペプチドを構成するアミノ酸の1つまたは複数に付加することによって、修飾されうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、1つまたは複数の部分分子、たとえば1ペプチドあたり1つまたは複数の部分分子、1ペプチドあたり2つ以上の部分分子、1ペプチドあたり5個以上の部分分子、1ペプチドあたり10個以上の部分分子、または1ペプチドあたりそれより多くの部分分子を含みうる。いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、1種類または複数種類の修飾および／または部分、たとえば1種類の修飾、2種類の修飾、3種類の修飾、またはそれより多くの種類の修飾を含みうる。修飾および／または部分の非制限的な例には、PEG化、グリコシル化、HES化、ELP化、脂質付加、アセチル化、アミド化、エンドキャップ修飾、シアノ基、リン酸化、アルブミン、および環状化が含まれる。いくつかの態様において、エンドキャップ修飾は、N末端でのアセチル化、N末端アシル化、およびN末端ホルミル化を含みうる。いくつかの態様において、エンドキャップ修飾は、C末端でのアミド化、C末端でのアルコール、アルデヒド、エステル、およびチオエステル部分の導入を含みうる。GDF11ポリペプチドの半減期は、部分、たとえばPEGまたはアルブミンの付加によって延長することができる。

いくつかの態様において、対象に投与されるGDF11ポリペプチドは、本明細書において記述されるGDF11アミノ酸配列の1つの機能的断片でありうる。本明細書において用いられる場合、「機能的断片」は、本明細書において以下に記述されるアッセイに従って、対象における心肥大を遅らせるかまたは回復させることができるペプチドの断片またはセグメントである。機能的断片は、本明細書において開示される配列の保存的置換を含みうる。いくつかの態様において、機能的断片は、GDF11の12.5 kDa C末端を含みうる。いくつかの態様において、GDF11の12.5 kDa C末端は、単量体として機能しうる。いくつかの態様において、GDF11の12.5 kDa C末端は、ホモ二量体として機能しうる。いくつかの態様において、GDF11の12.5 kDa C末端は、GDF11プロペプチドとのヘテロ二量体として機能しうる。

当初のアミノ酸配列を変化させることは、当業者に公知のいくつかの技術のいずれかによって達成されうる。たとえば、天然配列の断片へのライゲーションを許容する制限部位が隣接する変異体配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の場所に変異を導入することができる。ライゲーション後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸挿入、置換、または欠失を有するアナログをコードする。または、オリゴヌクレオチド指定部位特異的変異誘発技法を用いて、必要な置換、欠失、または挿入によって変化させた特定のコドンを有する変化させたヌクレオチド配列を提供することができる。そのような変化を作製する技術は、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、Walder et al. (Gene 42: 133, 1986); Bauer et al. (Gene 37:73, 1985); Craik (BioTechniques, January 1985, 12-19); Smith et al. (Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenum Press, 1981);ならびに米国特許第4,518,584号および第4,737,462号によって開示される技術を含む。いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、化学合成することができ、変異を、化学合成プロセスの一部として組み入れることができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、薬学的に許容されるプロドラッグとして製剤化することができる。本明細書において用いられる場合、「プロドラッグ」とは、いくつかの化学的または生理的プロセス（たとえば、酵素的プロセスおよび代謝的加水分解）を介して治療物質へと変換されうる化合物を意味する。したがって、「プロドラッグ」という用語はまた、薬学的に許容される生物活性化合物の前駆体も意味する。プロドラッグは、対象に投与される時には不活性、すなわちエステルでありうるが、インビボで活性化合物に、たとえば加水分解によって遊離のカルボン酸または遊離のヒドロキシル、へと変換される。プロドラッグ化合物はしばしば、生物において溶解度、組織適合性、または遅延放出に関する利点を提供する。「プロドラッグ」という用語はまた、そのようなプロドラッグを対象に投与した場合に、インビボで活性化合物を放出する任意の共有結合担体を含むことを意味する。活性化合物のプロドラッグは、ルーチンの操作でまたはインビボのいずれかで、修飾が切断されて親の活性化合物になるように、活性化合物に存在する官能基を修飾することによって調製されうる。プロドラッグは、活性化合物のプロドラッグを対象に投与した場合に切断されて遊離のヒドロキシ、遊離のアミノ、または遊離のメルカプト基をそれぞれ形成する、任意の基にヒドロキシ、アミノ、またはメルカプト基が結合している化合物を含む。プロドラッグの例には、アルコールの酢酸誘導体、ギ酸誘導体、および安息香酸誘導体、または活性化合物におけるアミン官能基のアセトアミド誘導体、ホルムアミド誘導体、およびベンズアミド誘導体などが含まれるがこれらに限定されるわけではない。その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、

を参照されたい。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドは、薬学的に許容される溶媒化合物でありうる。「溶媒化合物」という用語は、適した溶媒分子が結晶格子の中に組み入れられている、本明細書において記述される固相状態のペプチドを意味する。治療投与に適した溶媒とは、投与用量で生理的に許容される。治療投与に適した溶媒の例は、エタノールおよび水である。水が溶媒である場合、溶媒化合物は水和物と呼ばれる。一般的に溶媒化合物は、化合物を適した溶媒に溶解させて、冷却または逆溶剤の使用により溶媒化合物を単離することによって、形成される。溶媒化合物は典型的に、周囲条件で乾燥されるかまたは共沸される。

本発明のペプチドは、組み換え法および化学合成を含む周知の方法を用いることによって合成することができる。その内容がいずれも参照により本明細書に組み入れられる、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed, Vols 1 to 8, Cold Spring Harbor, NY (1989); M.W. Pennington and B.M. Dunn, Methods in Molecular Biology: Peptide Synthesis Protocols, Vol 35, Humana Press, Totawa, NJ (1994) に記述される方法などの、ペプチドをコードする核酸を含むベクターを適した宿主細胞に導入することによってペプチドを産生する組み換え法は、当技術分野において周知である。ペプチドはまた、当技術分野において周知の方法を用いて化学合成することができる。たとえば、その全ての内容が参照により本明細書に組み入れられる、Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149 (1964); Bodanszky, M., Principles of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY (1984); Kimmerlin, T. and Seebach, D. J. Pept. Res. 65:229-260 (2005); Nilsson et al., Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. (2005) 34:91-118; W.C. Chan and P.D. White (Eds.) Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, Oxford University Press, Cary, NC (2000); N.L. Benoiton, Chemistry of Peptide Synthesis, CRC Press, Boca Raton, FL (2005); J. Jones, Amino Acid and Peptide Synthesis, 2 ^ndEd, Oxford University Press, Cary, NC (2002); および P. Lloyd- Williams, F. Albericio, and E. Giralt, Chemical Approaches to the synthesis of peptides and proteins, CRC Press, Boca Raton, FL (1997)を参照されたい。ペプチド誘導体もまた、その全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第4,612,302号；第4,853,371号；および第4,684,620号、ならびに米国特許出願公開第2009/0263843号に記述されるように調製することができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドをコードする核酸に関する。本明細書において用いられる場合、「核酸」または「核酸配列」という用語は、リボ核酸、デオキシリボ核酸、またはそれらのアナログの単位を組み込んでいる任意の分子、好ましくはポリマー分子を意味する。核酸は、一本鎖または二本鎖のいずれかでありうる。一本鎖核酸は、変性させた二本鎖DNAの一方の鎖の核酸でありうる。または、これは、いかなる二本鎖DNAにも由来しない一本鎖核酸でありうる。1つの局面において、鋳型核酸はDNAである。もう1つの局面において、鋳型はRNAである。適した核酸分子は、ゲノムDNAまたはcDNAを含むDNAである。他の適した核酸分子は、mRNAを含むRNAである。核酸分子は、ゲノムDNAのような天然起源でありうるか、または合成であり得る、すなわち、ヒトの行為に基づいて調製され得るか、またはこの２つの組み合わせであり得る。核酸分子はまた、2'-デオキシ、2'-デオキシ-2'-フルオロ、2'-O-メチル、2'-O-メトキシエチル（2'-O-MOE）、2'-O-アミノプロピル（2'-O-AP）、2'-O-ジメチルアミノエチル（2'-O-DMAOE）、2'-O-ジメチルアミノプロピル（2'-O-DMAP）、2'-O-ジメチルアミノエチルオキシエチル（2'-O-DMAEOE）、または2'-O-N-メチルアセトアミド（2'-O-NMA）、コレステロール付加、ならびに、特許および特許出願がいずれもその全内容が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許出願第20070213292号に記述されるホスホロチオエート骨格、および米国特許第6,268,490号に記述されるメチレン単位によって2'-酸素と4'-炭素原子の間が連結される特定のリボヌクレオシドなどの、特定の修飾を有しうる。

いくつかの態様において、GDF11ポリペプチドをコードする核酸は、SEQ ID NO:3のヌクレオチド配列を含みうる。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドをコードする核酸は、ベクターに含まれる。本明細書において記述される局面のいくつかにおいて、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドをコードする核酸配列、またはその任意のモジュールは、ベクターに機能的に連結される。本明細書において用いられる場合、「ベクター」という用語は、宿主細胞に送達するためにまたは異なる宿主細胞間を移動するために設計された、核酸構築物を意味する。本明細書において用いられるように、ベクターは、ウイルス性または非ウイルス性でありうる。「ベクター」という用語は、適切な制御要素に結合した場合に複製することができ、かつ遺伝子配列を細胞に移入することができる任意の遺伝子要素を含む。ベクターは、クローニングベクター、発現ベクター、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、ビリオン等を含みうるがこれらに限定されるわけではない。

本明細書において用いられる場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結した配列からRNAまたはポリペプチドの発現を誘導するベクターを意味する。発現される配列は細胞に対して異種であることが多いが、必ずしもその必要はない。発現ベクターは、追加の要素を含んでもよく、たとえば発現ベクターは、2つの複製システムを有してもよく、これにより、2つの生物において、たとえば発現のためのヒト細胞において、ならびにクローニングおよび増幅のための原核細胞宿主において維持されることが可能になる。「発現」という用語は、適用可能であれば、たとえば転写、転写物プロセシング、翻訳ならびにタンパク質フォールディング、修飾、およびプロセシングを含むがこれらに限定されない、RNAおよびタンパク質の産生、ならびに必要に応じてタンパク質の分泌に関係する細胞プロセスを意味する。「発現産物」は、遺伝子から転写されたRNA、および遺伝子から転写されたmRNAの翻訳によって得られたポリペプチドを含む。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に機能的に連結された場合に、インビトロまたはインビボでRNAに転写される核酸配列（DNA）を意味する。遺伝子は、コード領域の前および後に領域、たとえば5'非翻訳（5'UTR）または「リーダー」配列および3'UTRまたは「トレーラー」配列を、ならびに個々のコードセグメント（エキソン）の間に介在配列（イントロン）を含んでも含まなくてもよい。

本明細書において用いられる場合、「ウイルスベクター」という用語は、ウイルス起源の少なくとも1つの要素を含み、パッケージングされてウイルスベクター粒子となる能力を有する核酸ベクター構築物を意味する。ウイルスベクターは、非必須ウイルス遺伝子の代わりに、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含みうる。ベクターおよび／または粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで細胞に任意の核酸を移入する目的のために利用されうる。多数の形状のウイルスベクターが当技術分野において公知である。

「組み換えベクター」とは、インビボで発現することができる異種核酸配列または「トランスジーン」を含むベクターを意味する。本明細書において記述されるベクターは、いくつかの態様において、他の適した組成物および治療と組み合わせることができると理解すべきである。いくつかの態様において、ベクターはエピソームである。適したエピソームベクターを用いることは、対象において高コピー数の染色体外DNAとして関心対象のヌクレオチドを維持する手段を提供し、それによって染色体組み込みにより起こりうる影響が除外される。

いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、処置前の対象におけるGDF11レベルより少なくとも20％、たとえば20％以上、30％以上、40％以上、50％以上、100％以上、150％以上、200％以上、250％以上、300％以上、または350％以上増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、処置前の対象におけるGDF11レベルより少なくとも100％増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、処置前の対象におけるGDF11レベルより少なくとも200％増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、処置前の対象におけるGDF11レベルより少なくとも約250％増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、健康な参照レベルの少なくとも50％まで、たとえば50％以上、60％以上、70％以上、80％以上、90％以上、または100％以上まで増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、健康な参照レベルの少なくとも60％まで増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、健康な参照レベルの少なくとも75％まで増加する。いくつかの態様において、対象におけるGDF11レベルは、健康な参照レベルの少なくとも90％まで増加する。健康な参照レベルとは、心肥大、拡張期心不全、および関連状態のいかなる徴候および症状も示さないヒト対象集団におけるGDF11レベルの平均値でありうる。

いくつかの態様において、健康な参照レベルとは、心肥大、拡張期心不全、および関連状態のいかなる徴候および症状も示さない70歳未満のヒト対象集団におけるGDF11レベルの平均値である。いくつかの態様において、健康な参照レベルとは、心肥大、拡張期心不全、および関連状態のいかなる徴候および症状も示さない65歳未満のヒト対象集団におけるGDF11レベルの平均値でありうる。いくつかの態様において、健康な参照レベルは、本明細書における実施例において記述されるアプタマー技術によって測定した場合に、少なくとも8,500と同等の、たとえば8,500単位以上、9,000以上、または10,000以上と同等のレベルでありうる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される方法は、健康な参照レベルより低いGDF11レベルを有する対象を選択する段階、および本明細書において記述される処置を施す段階を含みうる。

いくつかの態様において、心臓の状態、たとえば本明細書において記述される心肥大または硬化を処置するために、対象におけるGDF11レベルを増加させる。いくつかの態様において、心臓の状態、たとえば本明細書において記述される心肥大または硬化を予防するために、対象におけるGDF11レベルを増加させる。低いまたは減少したGDF11ポリペプチドに関連する心臓の状態は、年齢が上がるにつれて起こるGDF11レベルの減少とともに発症する傾向がある。このため、正常で健康な若齢成人において見られるレベルまたはそれに近いレベルでGDF11ポリペプチドレベルを維持することによって、たとえば、老齢であるが心臓障害の発症前にGDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を投与することによって、そのような状態を予防するかまたは少なくとも遅らせることができると予想される。

本明細書において記述される技術の局面は、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドまたは本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む、組成物に関する。いくつかの態様において、組成物は薬学的組成物である。本明細書において用いられる場合、「薬学的組成物」という用語は、製薬産業において一般的に用いられる薬学的に許容される担体と組み合わせた活性物質を意味する。「薬学的に許容される」という表現は、本明細書において、妥当な利益／リスク比に相応し、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、健全な医学的判断の範囲内で、ヒトおよび動物の組織と接触させて用いるのに適している化合物、材料、組成物、および／または投与剤形を意味するために用いられる。

活性成分がその中に溶解または分散されている薬理学的組成物の調製は、当技術分野において十分に理解されており、一般的に、製剤に基づいて制限される必要はない。典型的に、そのような組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射可能なように調製されるが、使用前に液体中での溶液または懸濁液とするために適した固体剤形も同様に調製することができる。調製物はまた、乳化されうるか、またはリポソーム組成物として提示されうる。活性成分は、薬学的に許容されて、活性成分と適合性であり、本明細書において記述される治療方法において用いるために適した量である賦形剤と、混合することができる。適した賦形剤は、たとえば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、またはエタノールなどおよびそれらの組み合わせである。加えて、望ましければ、組成物は、活性成分の有効性を増強する湿潤剤または乳化剤、およびpH緩衝剤などの補助物質を微量で含みうる。本発明の治療組成物は、その中の成分の薬学的に許容される塩を含みうる。薬学的に許容される塩は、たとえば塩酸もしくはリン酸などの無機酸、または酢酸、酒石酸、およびマンデル酸などの有機酸によって形成される、（ポリペプチドの遊離のアミノ基によって形成される）酸付加塩を含む。遊離のカルボキシル基によって形成される塩もまた、たとえば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄などの無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、およびプロカインなどの有機塩基から誘導されうる。生理的に許容される担体は、当技術分野において周知である。例示的な液体担体は、活性成分および水の他に材料を含まないか、または生理的pH値のリン酸ナトリウム、生理食塩水、もしくはその両方、たとえばリン酸緩衝食塩水、などの緩衝液を含む、滅菌水溶液である。なおさらに、水性担体は、1つより多くの緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムおよび塩化カリウムなどの塩、デキストロース、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含みうる。液体組成物はまた、水に加えて、および水を除外して、液相を含みうる。そのような追加の液相の例は、グリセリン、綿実油などの植物油、および油-水型乳剤である。特定の障害または状態の処置において有効である本発明において用いられる活性物質の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定されうる。

いくつかの態様において、本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸は、徐放手段または遅延放出手段によって投与されうる。徐放性の薬学的製品は、その非徐放性相対物によって達成される場合より薬物治療を改善するという共通の目標を有する。理想的には、医学的処置において最適に設計された徐放性調製物を使用するということは、最短時間で状態を治癒または制御するために最少量の薬物が用いられることを特徴とする。徐放性製剤の利点は：1）薬物の持続的活性；2）投与頻度の低下；3）患者のコンプライアンスの増加；4）使用する全薬物量の減少；5）局所または全身副作用の減少；6）薬物蓄積の最小化；7）血中レベル変動の減少；8）処置の効能の改善；9）薬物活性増強または喪失の減少；および10）疾患または状態の制御速度の改善を含む。Kim, Cherng-ju, Controlled-release Dosage Form Design, 2 (Technomic Publishing, Lancaster, Pa.: 2000)。

通常の投与剤形は一般的に、製剤からの迅速かつ即時の薬物放出を提供する。薬物の薬理および薬物動態に応じて、通常の投与剤形を用いることによって、患者の血液および他の組織における薬物濃度の広範な変動が起こりうる。これらの変動は、投与回数、作用の開始、効能の持続、治療的血中レベルの維持、毒性、および副作用などの多くのパラメータに影響を及ぼしうる。好都合なことに、徐放性製剤を用いて、薬物の作用の開始、作用の持続、治療可能時間域内の血漿中レベル、およびピーク血中レベルを制御することができる。特に、徐放性または長期間放出型の投与剤形または製剤を用いて、薬物の過少量投与（すなわち、最低治療レベルより下）および薬物の毒性レベル超過の両方から起こりうる、可能性がある有害作用および安全上の懸念を最小限にしながら、薬物の最大限の効果を確実に達成することができる。

ほとんどの徐放性製剤は、所望の治療効果を直ちに生じる量の薬物（活性成分）を最初に放出して、長期間にわたってこの治療または予防効果レベルを維持するために他の量の薬物を徐々にかつ持続的に放出するように、設計される。体内における薬物のこの一定レベルを維持するために、該薬物は、代謝されて体から排泄される薬物量に取って代わる速度で投与剤形から放出されなければならない。活性成分の徐放性は、pH、イオン強度、浸透圧、温度、酵素、水、および他の生理的条件または化合物を含むがこれらに限定されるわけではない様々な条件によって刺激することができる。

多様な公知の徐放性または長期間放出型の投与剤形、製剤、および装置を、本開示の塩および組成物と共に用いるために適合させることができる。例として、その各々が参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第3,845,770号；第3,916,899号；第3,536,809号；第3,598,123号；第4,008,719号；第5674,533号；第5,059,595号；第5,591,767号；第5,120,548号；第5,073,543号；第5,639,476号；第5,354,556号；第5,733,566号；および第6,365,185 B1号に記述される投与剤形が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。これらの投与剤形を用いて、たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリクス、ゲル、透過性メンブレン、（OROS（登録商標）（Alza Corporation, Mountain View, Calif. USA）などの）浸透圧システムまたはそれらの組み合わせを用いて1つまたは複数の活性成分の遅延型または制御された放出を提供し、所望の放出プロファイルを多様な割合で提供することができる。

いくつかの態様において、本明細書において記述される技術は、組成物、たとえば本明細書において記述されるGDF11ポリペプチドを含む薬学的調製物の治療的有効量を含むシリンジに関する。

本明細書において用いられる場合、「治療的有効量」、「有効量」または「有効用量」という表現は、たとえば心肥大の処置、予防、または管理において治療的または美容上の利益を提供する量、たとえば、心肥大の少なくとも1つの症状、徴候、またはマーカーの統計学的に有意な減少を提供する量を意味する。治療的有効量の決定は、十分に当業者の能力範囲内である。一般的に、治療的有効量は、対象の既往、年齢、状態、性別、ならびに対象における医学的状態の重症度およびタイプ、ならびに他の薬学的活性な作用物質の投与によって変化しうる。

1つの局面において、本明細書において記述される技術は、対象にGDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を投与する段階を含む方法に関する。いくつかの態様において、対象は、心肥大、拡張期心不全、または本明細書において先に記述した関連状態の処置を必要としている。いくつかの態様において、方法は、対象を処置する方法である。いくつかの態様において、方法は、対象における心肥大、および／または拡張期心不全または関連状態を処置する方法である。そのような状態ならびにそれらを診断する方法は本明細書において先に記述されている。

疾患、障害、または医学的状態に関連して用いる場合の、本明細書において用いられる「処置する」、「処置」、「処置する（treating）」、または「改善」という用語は、症状または状態の進行または重症度を回復、軽減、改善、阻害、遅らせる、または停止させることを目的とする、状態の治療的処置を意味する。「処置する」という用語は、状態の少なくとも1つの有害な事象または症状を減少または軽減する段階を含む。1つまたは複数の症状または臨床マーカーが減少したら、処置は一般的に「有効」である。または、状態の進行が低下または停止したら、処置は「有効」である。すなわち、「処置」とは、症状またはマーカーの改善のみならず、処置の非存在下で予想されるであろう症状の進行または悪化の、停止または少なくとも遅延を含む。有益なまたは所望の臨床結果は、処置の非存在下で予想される臨床結果と比較して、たとえば心肥大の1つまたは複数の症状の軽減、障害の程度の減少、状態の安定化（すなわち、悪化しない）、心肥大の遅延または遅れ、および寿命の延長を含むがこれらに限定されるわけではない。本明細書において用いられる場合、「投与する」という用語は、本明細書において開示されるGDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を、作用部位への送達をもたらす方法または経路によって対象に留置することを意味する。GDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む薬学的組成物は、対象における有効な処置をもたらす任意の適した経路によって投与されうる。

本明細書において記述されるデータは、血管系を介しての全身投与が有効でありうることを示す。従って、静脈内経路を介しての投与が具体的に企図される。しかし、適切な製剤によって、たとえば、鼻内、動脈内；冠動脈内；経口、吸入によって、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、または当業者に公知の他の手段を含む他の経路が企図される。組成物は、投与製剤に適合する様式で、かつ治療的有効量で投与される。投与される量およびタイミングは、処置される対象、対象の全身が活性成分を利用する限度、および所望の治療効果の程度に依存する。

少なくとも1つの剤を含む治療組成物は、通常、たとえば単位用量で投与されうる。治療組成物に関連して用いる場合の「単位用量」という用語は、必要な生理的に許容される希釈剤、すなわち担体または溶媒に関連して所望の治療効果を生じるように計算された既定量の活性物質を各単位が含む、対象に対する単位投与に適した物理的に個別の単位を意味する。

剤の用量範囲は、その効力に依存し、かつ所望の効果、たとえば心肥大の速度の減少または心肥大の回復を生じるために十分に多い量である。用量は、許容されない有害な副作用を引き起こすほど大量であってはならない。一般的に、用量は患者の年齢、状態および性別と共に変化し、当業者によって決定されうる。何らかの合併症が認められる場合には、用量はまた、個々の医師によって調節されうる。典型的に、用量は、0.001 mg/kg体重から0.5 mg/kg体重の範囲でありうる。1つの態様において、用量範囲は、5μg/kg体重から30μg/kg体重でありうる。

先に記載した用量の投与を繰り返すことができる。いくつかの態様において、用量は、1日1回、または1日に複数回、たとえば1日3回投与されるが、これに限定されるわけではない。いくつかの態様において、先に列挙した用量は数週間または数ヶ月間にわたり毎日投与される。処置の期間は、対象の臨床での進行度および治療に対する応答に依存する。GDF11ポリペプチドが罹患個体において年齢と共に明らかに減少している場合、たとえば心肥大に関するGDF11ベースの処置の利益を確立および維持するためには、長期間の治療が必要であろうと予想される。

投与が必要な活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、各個体に固有のものである。しかし、全身適用に適した用量範囲が、本明細書において開示され、投与経路に依存する。投与に適したレジメンもまた、変更可能であるが、典型的には、初回投与後に、1回または複数回の間隔をあけた二次投与により反復用量を投与する。または、インビボ治療に関して明記された範囲で血中濃度を維持するために十分な持続的静脈内注入が企図される。いくつかの態様において、用量範囲は、50歳未満の正常で健康なヒト対象（たとえば、心肥大の徴候、症状、またはマーカーを有しない対象）集団の血液中に見られる範囲内に血中濃度を維持するために十分である。いくつかの態様において、用量範囲は、40歳未満の正常で健康なヒト対象に見られる範囲内に血中濃度を維持するために十分である。いくつかの態様において、用量範囲は、30歳未満の正常で健康なヒト対象に見られる範囲内に血中濃度を維持するために十分である。

治療的有効量は、たとえば心肥大において統計学的に有意な測定可能な変化を生じるために十分な剤の量である。そのような有効量は、臨床試験および動物試験において測定することができる。剤の効能は、たとえば、本明細書において先に記述したような心肥大の身体的指標を評価することによって決定することができる。実験系において、効能のアッセイは、心重量の測定に加え組織学顕微鏡によって決定される筋細胞サイズの決定、ならびに／またはANPおよびBNPなどの加齢心筋細胞マーカー遺伝子の発現の減少を含む。そのようなアッセイは当技術分野において周知であり、本明細書の実施例において詳細に記述される。心肥大を検出またはモニターするための臨床的に許容される方法を、本明細書において以下に記述する。加えて、剤の効能は、GDF11ポリペプチドまたはGDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む剤によって処置した対象における、GDF11ポリペプチドまたはその断片の増加によって測定されうる。

心肥大に関する所定の処置の効能は、熟練した臨床医によって決定されうる。しかし、たとえば本明細書において記述される剤による処置後に、たとえば心肥大の徴候または症状の任意の1つまたは全てが有益に変化すれば、他の臨床的に許容される症状が少なくとも10％改善または軽減すれば、処置は、その用語が本明細書において用いられる用語である「有効な処置」と見なされる。効能はまた、入院または医学的介入の必要性によって評価した場合に、個人が悪化していないこと（すなわち、疾患の進行が停止すること）によっても測定されうる。これらの指標を測定する方法は、当業者に公知であり、かつ／または本明細書において記述される。心肥大の程度および重症度ならびに／または心肥大の処置の効能は、たとえばMRIまたは二次元心エコーを用いて、肥大を測定するために心臓をイメージングすることによって決定されうる。心肥大のイメージングは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Agarwal and Hartnell "Imaging in Hypertrophic Cardiomyopathy" Medscape Reference, May 27, 2011（http://emedicine.medscape.com/article/348503-overviewにおいてオンラインで入手可能）においてより詳細に記述される。

いくつかの態様において、方法は、併用治療の一環として、心肥大または拡張期心不全に罹っている対象にとって有益な1つまたは複数の追加の作用物質、生物製剤、薬物、または処置と共に、本明細書において記述される薬学的組成物を投与する段階をさらに含む。いくつかのそのような態様において、作用物質、生物製剤、薬物、または処置は、高血圧のための処置（たとえば、サイアザイド系利尿剤；エナラプリル、リシノプリルおよびカプトプリルなどのACE阻害剤；ロサルタンまたはバルサルタンなどのARB；アテノロール、カルベジロール、メトプロロール、およびビソプロロールなどのβ遮断剤;アムロジピン、ジルチアゼム、ニフェジピン、およびベラパミルなどのカルシウムチャンネル遮断剤）；大動脈弁修復剤；筋を弛緩させるまたは筋収縮速度を遅らせる処置（たとえば、β遮断剤、カルシウムチャンネル遮断剤、またはジソピラミドもしくはアミオダロンなどの抗不整脈処置）；中隔筋切除；中隔アブレーション；ペースメーカー植え込み；および／または植え込み型除細動器の植え込みからなる群より選択されうる。

本開示の態様の説明は、網羅的であることも、本開示を厳密な開示された形式に制限することも、意図していない。本開示の特定の態様および実施例は、説明目的のために本明細書において記述されるが、関連する当業者によって認識されるように、本開示の範囲内で、様々な同等の修飾が可能である。たとえば、方法の段階または機能は、所定の順序で示されるが、別の態様は、異なる順序で機能を行ってもよく、または機能を実質的に同時に行ってもよい。本明細書において提供される本開示の教示は、必要に応じて他の技法または方法に適用されうる。本明細書において記述される様々な態様を組み合わせて、さらなる態様を提供することができる。本開示の局面は、本開示のなおさらなる態様を提供するために、必要であれば、上記の参考文献および出願の組成物、機能、および概念を使用するように変更することができる。これら、および他の変化を、詳細な説明に照らして本開示に行うことができる。

前述の態様のいずれかの特定の要素を、他の態様の要素と組み合わせてもよく、または置換してもよい。さらに、本開示のある態様に関連する利点がこれらの態様の文脈において記述されているが、他の態様もまた、そのような利点を示し得、必ずしも全ての態様が本開示の範囲内に入るためにそのような利点を示す必要はない。

特定された全ての特許および他の出願は、たとえば本発明に関連して用いられうるそのような刊行物に記述される方法論を説明および開示する目的のために参照により本明細書に明白に組み入れられる。これらの刊行物は、単にその開示が本出願の提出日より前になされたために提供される。この点に関していかなるものも、本発明者らが、先行発明であるとの理由でまたは他の何らかの理由により、そのような開示に先行する権利がないことの承認と解釈すべきではない。これらの文献の日付に関する言明または内容に関する説明は全て、本出願人が入手可能な情報に基づくものであり、これらの文献の日付または内容が正確であると決して認めるものではない。

本発明を、制限的であると解釈されるべきではない以下の実施例によってさらに説明する。

本明細書において記述される技術のいくつかの態様は、以下の番号をつけた項目のいずれかに従って定義されうる。
１．対象におけるGDF11ポリペプチドレベルを増加させる組成物を該対象に投与する段階を含む、加齢関連状態を処置する方法。
２．加齢関連状態が、心血管状態、心臓の老化、骨格筋の老化、および脳の老化からなる群より選択される、項目1記載の方法。
３．対象が、拡張期心不全、心肥大、加齢関連心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化からなる群より選択される状態を有するかまたは有すると診断されている、項目1〜2のいずれか１つに記載の方法。
４．GDF11ポリペプチドレベルが対象の循環血液中のGDF11レベルである、項目1〜3のいずれか１つに記載の方法。
５．GDF11ポリペプチドレベルが、対象の心組織におけるGDF11レベルである、項目1〜3のいずれか１つに記載の方法。
６．組成物がGDF11ポリペプチドを含む、項目1〜5のいずれか１つに記載の方法。
７．組成物が、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目1〜6のいずれか１つに記載の方法。
８．組成物が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目1〜6のいずれか１つに記載の方法。
９．組成物が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目1〜6のいずれか１つに記載の方法。
１０．組成物が、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目1〜6のいずれか１つに記載の方法。
１１．組成物が、SEQ ID NO:1、2、14、または15のいずれかのアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドのホモ二量体を含む、項目1〜10のいずれか１つに記載の方法。
１２．組成物が、SEQ ID NO:1、2、14、または15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドの複合体を含む、項目1〜11のいずれか１つに記載の方法。
１３．組成物が、GDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む、項目1〜12のいずれか１つに記載の方法。
１４．組成物が、静脈内、皮下、動脈内、および冠動脈内からなる群より選択される経路により投与される、項目1〜13のいずれか１つに記載の方法。
１５．GDF11レベルが少なくとも100％増加する、項目1〜14のいずれか１つに記載の方法。
１６．GDF11レベルが健康な参照レベルの少なくとも75％まで増加する、項目1〜15のいずれか１つに記載の方法。
１７．単離されたGDF11ポリペプチドおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
１８．心血管状態、心臓の老化、骨格筋の老化、脳の老化、拡張期心不全、心肥大、加齢関連心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化からなる群より選択される状態を処置するための、GDF11ポリペプチドの使用。
１９．GDF11ポリペプチドレベルが、対象の循環血液中のGDF11レベルである、項目18記載の方法。
２０．GDF11ポリペプチドレベルが、対象の心組織におけるGDF11レベルである、項目18〜19のいずれか１つに記載の方法。
２１．組成物が、GDF11ポリペプチドを含む、項目18〜20のいずれか１つに記載の方法。
２２．組成物が、SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目18〜21のいずれか１つに記載の方法。
２３．組成物が、SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目18〜22のいずれか１つに記載の方法。
２４．組成物が、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目18〜22のいずれか１つに記載の方法。
２５．組成物が、SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、項目18〜22のいずれか１つに記載の方法。
２６．組成物が、SEQ ID NO:1、2、14、または15のいずれかのアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドのホモ二量体を含む、項目18〜25のいずれか１つに記載の方法。
２７．組成物が、SEQ ID NO:1、2、14、または15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドの複合体を含む、項目18〜26のいずれか１つに記載の方法。
２８．組成物が、GDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む、項目18〜27のいずれか１つに記載の方法。
２９．組成物が、静脈内、皮下、動脈内、および冠動脈内からなる群より選択される経路によって投与される、項目18〜28のいずれか１つに記載の方法。
３０．GDF11レベルが少なくとも100％増加する、項目18〜29のいずれか１つに記載の方法。
３１．GDF11レベルが、健康な参照レベルの少なくとも75％まで増加する、項目18〜30のいずれか１つに記載の方法。

実施例1：加齢関連心肥大を回復させる循環因子としての増殖分化因子11の同定
心不全の最も一般的な型は、収縮機能が正常な状態で起こり、特異的処置がなく、高齢者においてしばしば心肥大を伴う。加齢において心肥大を促進する生物学的機序を明らかにするために、異なる月齢の動物を結合させて血液循環を共有させる外科技法である異時性並体結合を用いて循環因子の影響を試験した。若齢マウスの循環血液に4週間曝露した後、老齢マウスの心肥大は、心筋細胞のサイズの減少および分子リモデリングを伴って、劇的に縮小した。加齢関連肥大の回復は、並体結合の血行力学的または行動学的な効果が原因ではなく、血液由来因子が関係している。修飾アプタマー法によるプロテオミクスを用いて、TGFβスーパーファミリーメンバーであるGDF11が、年と共に減少する循環因子として若齢マウスにおいて同定された。GDF11を若いレベルまで回復させる老齢マウスの処置により、並体結合の効果が再現されかつ加齢関連肥大が回復し、これにより心臓の老化に関する新しい治療機会が提供された。

加齢に関連する疾患および障害の中で、最も障害が残る疾患の1つは、心不全に至る正常な心機能の喪失である。心不全は、50歳を超える人々ではおよそ1％が罹患するが、75歳を超える人々では5％超が罹患する。わが国において高齢者の割合の急増が続いていることから（Schocken et al., 2008）、加齢関連心不全の有病率はますます増加しつつある。

ほとんどの加齢関連心不全は、正常な収縮機能を伴う。この状態は心肥大することが多く、「収縮期心不全」に対し、「拡張期心不全」と呼ばれる（Aurigemma, 2006）。過去20年で転帰が実質的に改善されたことにより、収縮期心不全の処置は進歩しているが、拡張期心不全の処置はなかなか進歩がみられない（Hunt et al., 2009）。実際のところ、加齢に伴う拡張機能障害に関連する心室「硬化」を経験している患者のための具体的な治療はないとも言える（Kitzman and Daniel, 2007）。

新たな証拠は、全身性の因子が組織の老化に強い影響を及ぼすことを示している。これらのデータのいくつかは、19世紀に初めて開発された実験的並体結合モデル（Finerty, 1952）から明らかになった。並体結合では、2匹のマウスを、それ自体の共通の循環系を通して生理的レベルで細胞および可溶性因子を急速かつ持続的に交換しつつ共有血液循環を生じるように、外科的に結合させる（Wright et al., 2001）。動物のペアは、同じ月齢（等時性並体結合）または異なる月齢（異時性並体結合）でありうる。並体結合マウスは、それ自体の共通の血液循環によってのみ結合されているので、並体結合は、循環因子が組織機能を変化させることができるか否かを判定するための強力なモデルである（Balsam et al., 2004; Brack et al., 2007; Conboy et al., 2005; Eggan et al., 2006; Ruckh et al., 2012; Sherwood et al., 2004; Villeda et al., 2011 ; Wagers et al., 2002; Wright et al., 2001）。異時性並体結合実験は、「若い」全身環境に曝露後の、内因性の「老いた」骨格筋衛星細胞の適切な活性化および機能の復帰、ならびに損傷後の筋修復の成功によって示されるように、若齢循環血液からの血液由来シグナルが加齢組織の機能に重大な影響を及ぼしうることを示唆している（Conboy et al., 2005）。逆に、若齢マウスを老齢の全身環境に曝露することにより、若齢マウスにおける筋発生（Brack et al., 2008）および神経発生（Villeda et al., 2011）が阻害されうる。

本明細書では、並体結合モデルを用いて、若齢循環血液環境への曝露により加齢関連心肥大を回復させることができることが証明される。これらの実験は、加齢による心肥大が少なくとも部分的に循環因子によって媒介されることを明らかにし、かつこれによって、TGFβファミリーメンバーである全身性のGDF11が加齢関連心肥大を回復させることができるという発見をもたらした。これらのデータは、加齢関連心不全の少なくとも何らかの成分が、本質的にホルモン性でありかつ可逆的であることを示している。

結果
異時性並体結合は加齢関連心肥大を回復させる。
本発明者らは、若齢マウスに特異的な循環因子が心臓の老化を回復させうるという仮説を立てた。この仮説を調べるために、若齢の雌性C57BL/6マウス（Y-HP、2ヶ月齢）を、老齢のパートナー（O-HP、23ヶ月齢）に外科的に結合させる異時性並体結合（HP）ペアを作製して、これらを、同一の月齢で結合させた等時性並体結合（IP）ペア（若齢-若齢（Y-IP）、または老齢-老齢（O-IP））、ならびに対照として、ペアを形成していない同齢かつ同性のマウス（若齢Yおよび老齢O）と比較した（図1A）。C57Bl/6マウスにおける心臓の老化は、性差非依存的な加齢関連心肥大の発症を含むヒトの心臓の老化を再現する（Dai et al., 2009）。並体結合ペアを4週間維持した後、分析を行って、類似遺伝子性のマーカーを用いて、老齢（CD45.2+）対若齢（CD45.1+）パートナーの血液細胞を識別した（Wright et al., 2001）。この戦略によって、ペアにおける血液キメラ現象をモニターすることが可能となった。しかし、老齢のCD45.1+マウスは市販されていないので、等時性の老齢マウスペアを作製するのにはCD45.2+マウスのみを用いた。マウスを結合後4週目に安楽死させて、一方のパートナー（CD45.1+）からのドナー由来血液細胞が他方のパートナー（CD45.2+）の血液または脾臓に出現する頻度を測定することによって、ペアのほとんど（＞90％）において交叉循環を確認した（図5）。

老いた心臓に及ぼす若齢循環血液の顕著な効果は、肉眼で見て直ちに明白となった。若齢循環血液に4週間曝露した老齢マウス（O-HP）の心臓は、O-IPマウスの心臓より顕著に小さくなった。この知見は、心室中部から採取した短軸の組織学切片の盲検比較によって確認された（図1B）。心臓の重量を屠殺時に測定し、脛骨長に対して心重量を標準化した。これは、体格サイズの差に関して補正する標準的な方法（Yoshioka et al., 2007）であり、老齢のマウスを用いる場合には体重に対する標準化より適切である（Jackson et al., 2012; Yin et al., 1982）。並体結合の4週間後、若齢循環血液に曝露した老齢マウス（O-HP）では、老齢循環血液に曝露した老齢マウス（O-IP）と比較して、心重量対脛骨長比が有意に低かった（7.93±0.19対9.61±0.21 mm/mg、P＜0.05、図1C）。

次に、心臓の組織切片の盲検での形態測定分析を行うことによって（データは示していない）、心肥大の肉眼的縮小が細胞の肥大の変化によるものか否かを調べた。若齢マウスでは、3つの実験条件のいずれのLV心筋細胞断面積にも、有意差は見いだされなかった（Yにおいて186.7±4.9μm²、Y-IPにおいて243.1±12.1μm²、Y-HPにおいて232.2±16.4μm²）。公表されたデータ（Dai et al., 2009）から予想されたように、心筋細胞断面積の平均値は、老齢の等時性マウス（357.8±25.8μm²）および老齢の非並体結合対照マウス（348.3±12.6μm²）の心臓において有意に大きかった（図2A）。しかし、若齢循環血液に4週間曝露したマウス（O-HP）の老いた心臓は、O-IPの心臓と比較すると、筋細胞の大きさの有意な減少を示した（220.4±21.9対357.8±25.8μm²、P＜0.05）。このように、若齢循環血液に曝露すると、老いた心臓の肥大性の細胞表現型を、若齢成体マウスに典型的である形態学的表現型へと回復させる。

性差特異的効果の可能性を評価するために、雄性マウスを用いてこれらの実験を繰り返し、若齢循環血液への曝露後の加齢関連肥大において類似の縮小を認めた（図2B）。これらのデータにより、性差は、若齢循環血液による加齢関連肥大の回復における要因ではないことが示される。このように、加齢関連心肥大は、雄性および雌性マウスのいずれにおいても全身性の因子の活性を通して回復されうるが、そのような若い因子がこの加齢関連病態に及ぼす顕著な影響は、わずか4週間の並体結合で明白である。

若齢循環血液に曝露した老齢マウスにおける心肥大の回復は血圧の低下によって説明されない
これらのデータによって生じた重要な疑問は、血行力学的効果が、異時性並体結合後の老齢マウスにおいて認められた心肥大の縮小を媒介しうるか否かという点である。並体結合の状況における血行力学的問題を調べるために、雌性の異時性並体結合ペア（若齢の2ヶ月齢と老齢の21ヶ月齢）を作製して、交叉循環の発生を確認するために類遺伝子性のマーカーを用いて、同数の若齢および老齢の等時性並体結合ペア、ならびに同性かつ同齢の非並体結合対照と比較した（図6A）。

マウスを10週間結合して、この期間の間、並体結合マウスを保持するように改変したコンピューター化テールカフシステム（BP-2000, Visitech Systems, Apex, NC）（Krege et al., 1995）を用いて非侵襲性の血圧測定を行った。非並体結合対照（図3A）では、老齢の雌性マウス（23ヶ月齢および21ヶ月齢、n＝32）において、若齢（8週齢）のCD45.2雌性マウス（n＝12）と比較して有意に低い収縮期血圧が観察された（98.3±1.8対129.9±2.0 mmHg、P＜0.05）が、老齢CD45.2雌性マウスと若齢CD45.1雌性マウス（n＝16）との比較で差は観察されなかった（98.3±1.8対104.1±1.9 mmHg、Pは有意差なし）。群のあいだに心拍数の差は認められなかった（図3A）。これらのデータにより、試験登録時での血圧または心拍数の差が、O-HPマウスにおいて認められた筋細胞サイズおよび心室全体の重量の変化が確実に起こることの説明となる可能性は低いことが示唆される。

並体結合マウスにおける血行力学の変化に対する潜在的影響をさらに調べるために、異時性のペアにおいて非侵襲性の血圧測定を連続する複数の時点で行い、それらを等時性の若齢および老齢のペアと10週間にわたって比較した。群のいずれの若齢マウスの血圧にも経時的な変化は検出されなかった（図3B）。これに対し、若齢循環血液に曝露した老齢マウス（O-HP）は、7および10週目で収縮期血圧の有意な増加を示し、等時性ペアの老齢メンバーは、ベースライン測定と比較して7週目で血圧の有意な増加を示した。最後に、マウスを10週間結合した後、同時のマイクロナノメートルカテーテル法を用いて、末期動脈内血行力学の追跡を行った。これらの試験において、平均動脈圧は、いずれの群においても有意差がなかった（図3C）。安楽死後に、一方のパートナー（CD45.1+）からのドナー由来血液細胞が他方のパートナー（CD45.2+）の脾臓に出現する頻度を測定することによって交叉循環を確認し（データは示していない）、心重量の評価により、この10週間の実験におけるO-HPマウスもまた、老齢の対照と比較した場合に心重量-脛骨長指数の有意な減少を示したことが確認された（図6B）。加えて、若齢マウスが老齢マウスによって産生された肥大因子のシンクとなっているのではないかと予想された通り、老齢パートナーに10週間結合させた若齢マウスにおいて心臓のサイズは変化しておらず、これにより、老齢循環血液への長期間曝露は若齢マウスにおいて肥大を誘導しなかったことが示された（図6B）。最後に、並体結合マウスにおける血圧のこれらの直接測定と一貫して、アンジオテンシンIIおよびアルドステロンの血中レベルは、等時性並体結合で結合させた同齢の相手と比較して、異時性並体結合を行った動物において差がなかった（データは示していない）。したがって、血圧および血液量を調節するその能力に関して周知のレニン-アンジオテンシン-アルドステロン（RAA）系の変化が、異時性並体結合した老齢マウスにおける心筋のリモデリングに寄与している可能性は低い。

まとめると、これらのデータは、若齢循環血液に曝露された老齢マウスにおいて観察された心肥大の回復が、老齢マウスにおける単なる血圧低下または血圧の公知のエフェクターの調節によって説明され得ないことを、明らかに実証している。これらのデータは、（老齢マウスによって産生される肥大促進性因子の希釈よりむしろ）若齢マウスによって産生された抗肥大因子が、異時性並体結合によって誘導された心リモデリングに関係することを、さらに示している。

若齢のCD45.1マウスとCD45.2マウスの血圧の差は心肥大の回復を説明しない
若齢CD54.1マウスは、若齢CD45.2マウスと比較してベースラインで有意に低い血圧を有することから、CD45.2マウスのみを用いて並体結合実験を繰り返して、若齢CD45.2雌性マウス（Y-HP、2ヶ月齢）を老齢のCD45.2パートナー（O-HP、23ヶ月齢）に結合した異時性ペアを作製した。これらの異時性マウスを、並体結合の4週間後に等時性ペア（Y-IP、2ヶ月齢、またはO-IP、23ヶ月齢）と比較した。この実験におけるマウスは遺伝的に同一であったことから、フローサイトメトリーを用いてこれらのペアにおけるキメラ現象の確立を確認することができなかった；しかし、このモデルについての十分な経験は、完全な同遺伝子型ペアにおいて交叉循環が有効に確立されるという結論を強く支持する（Pietramaggiori et al., 2009）。

先の試験と同様に、並体結合を介して若齢CD45.2マウスの循環血液に曝露することにより、O-HP CD45.2マウス（n＝18）の心重量対脛骨長比はO-IPマウス（n＝22）と比較して減少した（8.03±0.38対9.07±0.24 mm/mg、P＜0.05、図10A）。心筋細胞の断面積もまた、O-HPマウスにおいてO-IPと比較して有意に減少した（286.3±22.7対366.4±25.4μm²、P＜0.05、図10B）。CD45.2マウスのみを用いた異時性ペアの老齢パートナーもまた、若齢CD45.1パートナーに結合されたO-HPマウスと同等の血圧プロファイルを4週間後に示した（図10C〜10D）。また、CD45.1の若齢パートナーを用いて得た結果と同様に、老齢パートナーに結合した若齢CD45.2マウスにおいても、異時性並体結合は心重量／脛骨長比（図10A）、心筋細胞サイズ（図10B）、または血圧（図10C〜10D）における変化を誘導しなかった。これらのデータは、若齢循環血液に曝露した老齢マウスにおいて観察された心肥大の縮小を、若齢CD45.1およびCD45.2 C57BL/6マウスにおいて観察された血圧の差によって説明することができないことを証明する。

異時性並体結合は分子リモデリングに関連する
心肥大は、多数の心マーカーの発現の変化に関連する。O-HPマウスにおける肥大の回復を分子レベルで評価するために、心筋肥大の分子マーカーである心房性ナトリウム利尿ペプチド（ANP）および脳のナトリウム利尿性ペプチド（BNP）の心臓での転写物発現を定量した（図4A〜4B）。ANPおよびBNP転写物レベルの有意な減少が、等時性の同齢対照と比較して、若齢循環血液に曝露した老齢マウスの心臓において検出された。筋小胞体のカルシウムATPアーゼ（SERCA-2）（その発現は年齢と共に変化し得（Dai et al., 2009）、かつ正常な拡張時弛緩にとって機能的に重要である）の転写物レベルも同様に定量した。SERCA-2発現は、O-IP対照と比較して、若齢循環血液に曝露した老齢マウス（O-HP）の心臓において有意に増加した（図4C）。これらのデータは、若齢の循環因子が、心筋細胞肥大と拡張機能とに関連する別個の分子経路を変化させるというさらなる証拠を提供する。

並体結合に関連する行動学的変化は異時性マウスにおける心肥大の回復を説明しない
並体結合モデルは、1世紀以上ものあいだ生理的研究のために用いられているが（Finerty, 1952）、並体結合ペア形成による身体の拘束によって、観察された心肥大回復に寄与する行動学的変化が起こった可能性を検討した。このため、「偽性並体結合」として本明細書において記述される外科技術を開発して、それによって、共有血液循環を生じないようにマウスの皮膚を無傷にしたままでマウスを外科的に結合した（図11A）。若齢雌性マウス（2ヶ月齢）を老齢のパートナー（23ヶ月齢）に結合した偽性異時性並体結合ペアを作製して、偽性等時性並体結合ペア（若齢-若齢または老齢-老齢）ならびに同齢の異時性および等時性並体結合ペアと比較した（図11A〜11C）。偽性ペアの心臓を、先の実験と同様に4週間後に分析した。有効な交叉循環が確立された従来の並体結合とは対照的に、偽性異時性並体結合を行った老齢マウスでは、老齢の等時性偽性結合マウスと比較して心重量対脛骨長比の有意な差は認められなかった（9.38±0.39対9.63±0.22 mm/mg、Pは有意差なし）（図11B）。これらのデータは、交叉循環および血液由来因子の交換が加齢関連心肥大の回復にとって必要であることを示している。この知見はまた、老齢の異時性偽性結合マウスにおける心筋細胞のサイズが、老齢の等時性偽性結合マウスにおける筋細胞のサイズと差がなかったことから、細胞レベルでも確認された（352.9±18.9対355.0±9.5 μm²、Pは有意差なし）（図11C）。最後に、ANP、BNPおよびSERCA-2転写物レベルを偽性結合ペアにおいて評価した。肥大に関するこれらの分子マーカーレベルは、老齢の異時性偽性結合マウスにおいて老齢の等時性偽性結合マウスと比較して有意に増加した（ANP）か、または変化せず（BNPおよびSERCA-2）（データは示していない）、心肥大の減少に関連する分子リモデリングが、共有血液循環の非存在下では起こらないことを示している。

異時性並体結合によって増殖分化因子11は老齢マウスの循環血液中で減少し、「若い」レベルに復帰する
上記の試験は、若齢対老齢マウスにおける血液由来因子の差が、異時性並体結合後の老齢マウスにおいて観察された心リモデリング誘導の根底にあることを強く示唆する。若い循環血液に曝露された老齢マウスにおける心肥大の縮小を説明しうる候補物質を同定するために、等時性または異時性の並体結合（期間4週間）を行った若齢または老齢マウスから採取した血清および血漿について一連のスクリーニングを行った。若齢循環血液に曝露された老齢の並体結合マウスまたは等時性対照からの血漿について、本発明者らは、69個のアミノ酸およびアミンのメタボロミクスプロファイリング、ならびに9種の脂質クラス、すなわちリゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、ホスファチジルコリン、ジアシルグリセロール、コレステロールエステル、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、およびトリアシルグリセロールからの142個の脂質を評価するリピドミクス分析を行った。しかし、メタボロミクスまたはリピドミクスクリーニングのいずれにおいても異時性および等時性並体結合マウスにおいて有意差は検出されなかった（データは示していない）。次に、若齢マウス（2ヶ月齢）10匹と老齢（23ヶ月齢）マウス10匹からの血漿試料を定量的に評価するために、アプタマー法による技術を用いて広い規模のプロテオミクス分析（SomaLogic, Inc. Boulder, CO）を行った。このアプローチにより、若齢マウスと老齢マウスとを信頼可能に識別する13個の分析物が明らかとなった（表1）。これらの候補の中の1つ（増殖分化因子11、GDF11、アクチビン／TGFβ増殖分化因子スーパーファミリーメンバー）が、等時性および異時性並体結合マウスの分析において、等時性の老齢ペア対等時性の若齢ペアの血漿中の量に差を示すこと、および老齢の異時性動物においてより「若い」発現プロファイルを示すことが確認された（図12A）。

血液中のGDF11の月齢依存的減少に関して可能性がある機序を解明するために、その発現を、ある範囲の組織および細胞集団において分析した。既に報告されたように（McPherron, 2010）、データは広範囲の発現を示唆しており、脾臓はGDF11 mRNAの最高レベルを示す（図13A）。次に、GDF11発現を月齢との相関関係で調べて、老齢（24ヶ月齢）および若齢（3ヶ月齢）のC57Bl/6マウスの組織を比較した（図13B〜13C）。GDF11遺伝子発現およびGDF11タンパク質レベルの両方の有意な低下が、老齢マウスの脾臓において検出された。これらのデータは、脾臓GDF11の減少が、加齢マウスにおける循環血液中のGDF11の低下に寄与しうることを示唆しているが、GDF11は多くの器官において産生されていることから（McPherron, 2010）、他の組織および器官における発現の変化も同様に寄与しうる。

GDF11はインビトロで心肥大を防止して、Forkhead転写因子のリン酸化を抑制する
次に、ロイシン取り込みアッセイを用いて、GDF11が新生仔心筋細胞培養物において抗肥大特性を示すか否かを調べた。血清を枯渇させた後、新生仔ラット心筋細胞を、組み換え型GDF11（rGDF11）または近縁のTGFβスーパーファミリータンパク質であるミオスタチンの3つの異なる濃度によって24時間処置し、次に³Hロイシンおよびフェニレフリン（50μM）に24時間曝露した。フェニレフリン誘発³Hロイシン取り込みの有意なおよび再現可能な阻害が、50 nM rGDF11によって処置した筋細胞において観察されたが、この効果は、同じ濃度のミオスタチンによる処置後では観察されなかった（図12B）。非心組織において既に示されているが、rGDF11またはミオスタチンがTGFβ経路を活性化する能力についてもヒト人工多能性幹細胞由来心筋細胞において試験した（Tsuchida et al., 2008）。細胞を無血清培地（対照）またはrGDF11（50 nM）もしくはミオスタチン（50 nM）を含む同じ培地によって15分間刺激した。rGDF11またはミオスタチンによって刺激した細胞は、pSMAD2およびpSMAD3の有意な増加を示し、TGFβ経路の活性化およびForkhead転写因子リン酸化の抑制と一貫した（図12C）。まとめると、これらのデータは、GDF11が心筋細胞レベルで直接の抗肥大効果を有することを示唆している。

GDF11はインビボで加齢関連心肥大を回復させる
GDF11に対して特異的な抗体によるマウス心切片の免疫組織化学染色により、心筋細胞の形質膜、具体的には介在板にGDF11が存在する証拠が証明され、このことは、GDF11が心筋細胞レベルで特異的効果を有するという考えを支持する（データは示していない）。心筋細胞におけるGDF11媒介シグナル伝達を支持するインビトロでの証拠（図12B〜12C）をまとめると、これらのデータにより、老齢マウスにおける循環血液中のGDF11の「若い」レベルへの復帰が加齢関連心肥大を回復しうるか否かを試験するための合理的根拠が提供された。rGDF11の最適な用量、投与の経路および間隔を決定するために、0.005から0.1 mg/kgの範囲の用量でボーラス腹腔内（i.p.）注射によってタンパク質をマウスに投与する用量反応試験を行った（データは示していない）。注射から1時間後の血漿中GDF11レベルにおける再現可能な増加は、最高用量（0.1 mg/kg）においてのみ観察された（図14）。さらに、0.1 mg/kg rGDF11の1回腹腔内注射後48時間のあいだに連続的に採取した血漿試料の分析から、GDF11レベルがこの1回注射後およそ24時間の間、持続的に上昇することが示された（図14）。

これらの結果に基づいて、心肥大の肉眼的および組織学的パラメータに及ぼすrGDF11の効果を試験するために、無作為盲検溶媒対照試験を設計した。老齢（23ヶ月齢）の雌性マウス（C57Bl/6）に、rGDF11（0.1 mg/kg）または生理食塩水の毎日腹腔内注射を30日間行った（1群あたりn＝16）。心重量対脛骨長比は、生理食塩水注射対照群と比較してrGDF11を注射した老齢マウスにおいて有意に低かった（図12D）。形態測定分析から、rGDF11処置によって、心筋細胞が、生理食塩水注射対照と比較して有意により小さくなったことがさらに証明された（図12E）。

rGDF11処置老齢マウスの心臓における分子変化も同様に調べた。いずれも心肥大に関連する分子マーカーであるBNPの有意な減少およびANPの類似の傾向が検出された（図12F）。逆に、拡張機能と相関するSERCA-2転写物レベル（Dai et al., 2009）は、生理食塩水で処置した同齢対照と比較してrGDF11を処置した心臓において増加した。肥大の分子マーカーにおけるrGDF11誘導性の減少およびSERCA-2発現の増加のこのパターンは、並体結合によって若齢循環血液に曝露された老齢マウスにおいて観察されたパターンと類似である。無作為化してrGDF11（0.1 mg/kg）または溶媒の腹腔内注射を30日間毎日行った24ヶ月齢の雄性C57BL/6マウスの心エコー評価を行った。本発明者らが評価した機能的パラメータはいずれも、2つの群のあいだで有意差がなかった（表2）。

GDF11はインビボでの圧負荷後の心肥大を防止しない
心筋細胞に及ぼすGDF11の効果が加齢関連心肥大に対して特異的であるか否かを決定するために、2ヶ月齢の雌性C57Bl/6マウスに、大動脈縮窄術を行った後、無作為化して、rGDF11（0.1 mg/kg）または溶媒のIP注射を30日間毎日行った。心エコー法の評価を15日目と、その後屠殺前に行った（図15C）。30日後、マウスを安楽死させて、組織学的および分子的な評価のために心臓を摘出した。心形態測定を、心重量対脛骨長比を測定することによって評価した。溶媒のみを投与したマウス（n＝9）の心臓と比較して、大動脈縮窄術を行ってrGDF11によって30日間処置したマウス（n＝10）において肥大の有意な減少は認められなかった（P＝0.4、図15A）。さらに、心筋細胞断面積に有意差はなかった（図15B）。心線維症の発症を評価したところ、2群のあいだでいかなる差も検出されなかった（データは示していない）。これらのデータにより、GDF11が全ての型の心肥大を防止するわけではないことが示唆される。

考察
左室肥大は、心臓の老化の重要な特徴であり、拡張機能障害、および収縮機能が保存された状態の心不全に寄与する（Lakatta and Levy, 2003）。Anversaとその共同研究者が行った、高血圧症を有しないまたは臨床的に明白な心血管疾患を有しない高齢の対象の剖検試験により、総心筋重量に変化はないものの心筋細胞の肥大および心筋細胞数の減少が記述されており、これは男性においてより顕著であるパターンであった（Olivetti et al., 1995）。しかし、類似の患者集団の横断研究では、男女いずれにおいても左室壁厚が増加することが示唆されている（Lakatta and Levy, 2003）。拡張機能障害を有する患者は、収縮機能障害を有する患者と比較すると、より高齢である傾向があり、肥満、糖尿病、高血圧、および女性である可能性が高く（Owan and Redfield, 2005）、このことは、根底にある明白な病的機序を示唆している。

この試験の中心仮説とは、加齢による心表現型が、若齢循環血液中の因子への曝露により回復可能であるという点である。この仮説を、外科的に吻合した並体結合マウスを用いて試験した。C57Bl/6マウスは、ヒトと類似の加齢関連心表現型を発症することから、これらのマウスをこれらの実験に用いた。加えて、性差が生理的心肥大において役割を果たしうることから（Foryst-Ludwig et al., 2011）、実験を雄性および雌性マウスの両方について行った。並体結合によって老齢マウスを若齢循環血液に曝露すると、性差非依存的に心筋細胞肥大の回復が再現性よく得られ、この心筋細胞サイズの減少は、心臓全体の重量の減少として現れた。この構造的変換には、不適応性の心リモデリングを促進することが知られているナトリウム利尿性ペプチドの心筋での遺伝子発現の減少、および、その発現が心筋の弛緩にとって不可欠であり、したがって正常な拡張機能にとって不可欠であるCa2+ ATPアーゼ（SERCA-2）の増加が付随した。まとめると、これらのデータは、若齢循環血液に存在する因子が心臓の老化の重要な構造的および分子的局面を逆転させることができるという概念と一致している。

老齢の並体結合マウスにおける心肥大縮小についての可能性がある機序として出現した可溶性物質を血液中に移入することによって、若齢マウスの血液中により高レベルで存在し抗肥大効果の根底にありうる候補因子を同定するための系統的研究を行った。プロテオミクス分析により、そのレベルが年齢と共に変化するいくつかの因子が同定され、他の因子もまた異時性並体結合において観察された効果に関与している可能性は除外できない；しかし、GDF11が、若齢対老齢の血漿中に存在する脂質プロファイル、代謝物、およびシグナル伝達タンパク質を比較する一連のスクリーニング分析から強い候補物質として出現した。GDF11発現は、広範囲の組織において検出可能であるが、脾臓は、最高濃度を示し、GDF11レベルの月齢依存的減少を示す。このため、脾臓は、血液中のGDF11に関与する可能性があり、脾臓における加齢関連物質の産生または分泌の欠如が、老齢マウスにおける血液中のGDF11の減少に関与しうる。

最近の研究から、GDF11（ならびに、受容体の多様性を考慮して、ミオスタチン、アクチビン、および他のTGFβファミリーメンバー（Tsuchida et al., 2008））によるシグナル伝達に拮抗する可溶性ActRIIBタンパク質（sActRIIB）によってカヘキシアマウスを処置すると、腫瘍を有する動物における心臓の萎縮を回復させることが示されている（Zhou et al., 2010）。プロテオミクスのデータと併せると、この試験は、GDF11が、若齢マウスにおいて見られる全身性の抗肥大活性のメディエータとして作用するという考え方をさらに支持した。その上、組織学データ（データは示していない）から、インビボで心筋細胞にGDF11が結合することが示唆された。それゆえ、無作為溶媒対照試験を行って、rGDF11を老齢マウスに30日間投与した。このrGDF11治療は、心重量測定および形態計測分析の両方によって示されるように、老齢マウスにおける心肥大の有意な縮小をもたらした。

その上、rGDF11は、インビトロで新生仔心筋細胞におけるフェニレフリン媒介肥大の用量依存的阻害を誘導したが、ミオスタチンは誘導せず、このことはGDF11が心筋細胞レベルで特異的かつ直接的な作用を有することを示唆している。しかし、理論に拘束されたくはないが、rGDF11およびミオスタチンはいずれも、心筋細胞におけるTGFβシグナル伝達経路を刺激したことから、抗肥大性FoxO因子の活性化がプロテアソーム媒介タンパク質分解を促進しうることを示唆している（Sandri et al., 2004）。

ミオスタチンが骨格筋重量を負に調節するという知見により、ミオスタチンのシグナル伝達を遮断することによる老齢および癌関連筋萎縮に関する治療戦略を開発した。興味深いことに、ミオスタチンヌルマウスは、加齢における心重量の重要な変化を一貫して示していないが（Cohn et al., 2007; Jackson et al., 2012）、可溶性のActRIIBアンタゴニストによる処置によって、骨格筋および心筋重量の両方の増加が起こり、このことは、このアンタゴニストの心臓への効果がミオスタチン以外のリガンドの阻害により生じる可能性があることを示唆している。実際に、類似のアクチビン受容体の組み合わせを通してシグナルを伝達するにもかかわらず、GDF11およびミオスタチンは、重複しない多くの機能を示す。ミオスタチンヌルマウスは、実質的に増加した骨格筋重量を示すが、GDF11ヌルマウスは、骨格および腎臓の異常を示し、生後24時間以内に死亡する（McPherron et al., 1999）。このため、心筋に関して報告されたActRIIBアンタゴニスト効果（Zhou et al., 2010）は、GDF11シグナル伝達の阻害による可能性があり、ミオスタチンに関する作用とは無関係でありうると企図される。

GDF11は、血圧の過剰負荷の状況では心肥大の予防において無効である。興味深いことに、本発明者らの予備試験から、GDF11処置が、骨格筋などの他の組織における加齢表現型に影響を及ぼしうることが示唆されている。

要約すると、異時性並体結合マウスの心臓における回復リモデリングの分析により、強力な抗肥大特性を有する加齢調節循環因子としてGDF11が同定された。これらの試験は、加齢関連心肥大におけるGDF11の関与を暗示する（表1）。さらに、GDF11は、ヒト多能性細胞由来心筋細胞において標的タンパク質（SMAD2/3）のリン酸化を刺激する（図12C）。本明細書において記述される結果は、血液中のGDF11を若いレベルに復帰させることによって、加齢による心肥大を標的とするための治療的可能性を提供する。

実験技法
動物
老齢（21〜23ヶ月齢）のC57Bl/6マウスを米国国立老化研究所（NIA）から得た：若齢（2ヶ月齢）C57Bl/6（CD45.1^-CD45.2⁺）または若齢B6.SJL（CD45.1⁺CD45.2^-）マウスをJAXから得た。

並体結合
並体結合は、既に記述された（Bunster and Meyer, 1933; Ruckh et al., 2012）とおりに行った。血液のキメラ現象は、並体結合ペアのサブセットにおいて、一方のパートナー(CD45.1⁺)からのドナー由来血液細胞が他方のパートナー（CD45.2⁺）の脾臓に出現する頻度を測定するフローサイトメトリーによって確認した。パートナー由来細胞は典型的に、脾細胞の40〜50％に相当し、並体結合交叉循環の確立と一致していた。CD45.1+マウスは市販されていないことから、本発明者らは、等時性並体結合ペアにおけるキメラ現象の確立を確認するためにこの方法を用いることができなかった。

偽性並体結合
共有血液循環を生じない外科的結合を達成するために、並体結合技法（Bunster and Meyer, 1933;Ruckh et al., 2012）の改変版として偽性並体結合を行った。マウスを筋肉が完全に弛緩するまで麻酔して、Bunster and Meyerの技法の改変版によって結合した。各マウスの対応する側部局面の毛を刈った後、各マウスの肘頭から膝関節まで、対応する皮膚の切開部を作製して、皮下筋膜を鈍的に切開して約1/2 cmの遊離皮膚を作製した。肘頭および膝関節を1本の2-0プロレン縫合糸によって結合した。縫合糸を、第一のマウスの皮膚および関節の中を連続的に通して、2匹のマウスの皮膚を分離するためにシリコンディスクの中に通して、次に、第二のマウスの皮膚および関節の中に通した。シリコンディスクが各マウスの皮膚を関節において分離し各マウスの皮膚弁のあいだで接触が起こらないように、縫合糸を結んだ。皮膚切開部をステープルで閉じた。マウスをつなぐプロレン縫合糸を、メッシュステープルによって補強した。

心筋細胞サイズの形態測定評価
マウスの心臓を4％パラホルムアルデヒドによって固定して、パラフィン包埋し、過ヨウ素酸シッフ（PAS）染色によって染色した。染色、スキャン、および定量は、心臓の5カ所の無作為に選択した切片を用いて盲検的に行った。

非侵襲性血圧測定
並体結合ペアの両方のメンバーの血圧を同時に測定することができるように、コンピューター化テールカフシステム（BP-2000, Visitech Systems, Apex, NC）を改変した。非手術マウスまたはマウスペアを、技法に慣らすために予め加温したテールカフ装置の中で5日間連続して訓練した後、心拍数および収縮期血圧を測定した。

神経ホルモン測定
血清試料中の血中アンジオテンシンIIおよびアルドステロンレベルを、ELISA（Enzo Life Sciences International, INC., USA）によって測定した。

プロテオミクス分析
マウス20匹からのEDTA血漿試料（20μl）を、1001個のタンパク質を同時に測定するためにSOMAmers（商標）を用いるSomaLogic（商標）プロテオミクス発見プラットフォーム（SOMAscan）において分析した。SOMAmers（商標）（遅いオフレートの修飾アプタマー）は、タンパク質標的に結合するためにSELEX（商標）（Tuerk and Gold, 1990）を通して考案された核酸ベースのタンパク質結合試薬である。 SOMAscan（商標）は、平衡時結合ならびに非結合のSOMAmers（商標）およびタンパク質の除去を通して、行列内のタンパク質濃度をSOMAmers（商標）の相対量へと変換する。SOMAmer（商標）の量は、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって測定される（詳しい説明に関しては、（Gold et al., 2010）を参照されたい）。

インビトロ心筋細胞肥大アッセイ
新生仔心筋細胞を、生後1日目のCD1ラット（Charles River）から単離した（Seki et al., 2009）。平板培養からおよそ36時間後に、心筋細胞を、ITS（PAA Laboratories）を添加した低グルコースDMEM中で、24時間血清枯渇した。心筋細胞を、ミオスタチン（R&D Systems）またはrGDF11（Peprotech）によって24時間前処置した後、フェニレフリン（50μM、Sigma）によって処置して、³H-ロイシン（1μCi/ml、Moravek）によってタンパク質合成／肥大をアッセイした。rGDF11およびミオスタチン処置は、フェニレフリンおよび³H-ロイシンに対する曝露期間中も継続した。³H-ロイシンによる標識から24時間後に、細胞を氷冷PBSによって洗浄して氷冷10％トリクロロ酢酸によって4℃で45分間固定した。細胞を0.05 M NaOHによって溶解して、液体シンチレーションによって分析した。

統計分析
データ比較を、両側分布および不等分散を仮定して、一元配置ANOVAおよびボンフェローニ事後補正またはスチューデントt-検定に供した。統計学的有意性をp＜0.05に関して割り付けした。結果を平均値の標準誤差として示す。

フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは全て、全てのインキュベーション段階のあいだ氷中で維持した新しく調製した固定されていない脾細胞において行った。細胞をHBSS/2％FBSによって10分間ブロックした後、1×10⁶個/250μLの濃度に浮遊させた。細胞を、CD45.1（eBioscience）およびCD45.2（eBioscience）に対して特異的な直接コンジュゲート一次抗体中で30分間インキュベートした後に、HBSS中で2回洗浄した後、フローサイトメトリー分析を行った。コンジュゲートしたアイソタイプ対照抗体を全ての実験において用いた。

遺伝子発現分析
肥大刺激によって一般的に誘導される発現遺伝子を定量するために、手術後4週目に、異なる実験群からの心臓を摘出して、液体窒素中で瞬間凍結した。RNAをTrizol試薬（Sigma）によって抽出し、ランダムプライマーを用いて、High Capacity cDNA逆転写キット（Applied Biosystems）によってcDNAに転写して、次にSYBR Green（商標）（Applied Biosystems）またはTaqMan（商標）（Applied Biosystems）、およびANP

GDF11（Mm01159973m1 TaqMan遺伝子発現アッセイ、Life technologies）に関するプライマーを用いて、Applied Biosystems 7300リアルタイムPCRシステムにおいてリアルタイムPCRによって分析した。結果をTATA結合タンパク質の発現に対して標準化して、△△Ct法に基づいて若齢の等時性動物と比較した増加倍率として表記した。

メタボロミクスおよびリピドミクスプロファイリング分析
LC-MS/MS分析
血漿中メタボロミクスプロファイリングを、HTS PALオートサンプラー（Leap Technologies, Carrboro, NC）および1200シリーズバイナリポンプ（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）を含むHPLCシステムに連結したTurbo Vエレクトロスプレー源 を備えた 4000 QTRAPトリプル四重極質量分析計（Applied Biosystems/Sciex, Foster City, CA）において行った。このLC-MS/MSシステムは、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（HILIC）を用いる極性代謝物分析のために、および同様に各々が血漿抽出、LS/MS獲得法および機器の構成に関して異なる方法を必要とする脂質分析のために用いた。MultiQuantソフトウェアv. 2.0.2（AB SCIEX, Foster City, CA）を、自動ピーク積分のために用いて、代謝物のピークもまた、積分の質に関して手動で審査した（Roberts et al., 2012）。
HILIC：
親水性相互作用液体クロマトグラフィーは、アミノ酸、ヌクレオチド、および神経伝達物質を含む親水性代謝物を分析するために適している。血漿10マイクロリットルを、0.2μg/mL（最終濃度）同位体標識バリン-d8およびフェニルアラニン-d8（Sigma-Aldrich; St Louis, MO）を含む74.9:24.9:0.2 vol/vol/volアセトニトリル/メタノール/蟻酸の90μLによって抽出した。試料を30秒間ボルテックスミキサーによって撹拌して、遠心分離し（10分、10,000 rpm、4℃）、上清をLC/MSシステムに直接注入した。試料に、150×2.1 mm Atlantis HILIC（商標）シリカカラム（Waters, Milford, MA）：移動相A、10 mM蟻酸アンモニウムおよび0.1％蟻酸；ならびに移動相B、0.1％蟻酸を含むアセトニトリルを用いて親水性相互作用クロマトグラフィーを行った。カラムを5％移動相Aによって0.5分間均一濃度で溶出し、次に、60％移動相への直線勾配によって10分間溶出した後、5％移動相Aへと17分間戻した。エレクトロスプレーイオン化（ESI）を、ポジティブ多重反応モニタリング（MRM）イオンモードで用いた。デクラスタリング電位および衝突エネルギーを、試料分析の前に参照標準物質を含めることによって各代謝物に関して最適にした。イオンスプレー電圧は5 kVであり、線源温度は425℃およびMRMウインドウは、70 msecに設定した。蟻酸、酢酸アンモニウム、LC/MS等級の溶媒、およびバリン-d8は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO）から得て、同位体標識分析標準物質の残りはCambridge Isotope Laboratories, Inc.（Andover, MA）から得た。試料を、内部変動が最小限となるように無作為に適用して、分析した全ての代謝物に対して時間ドリフトを計上するためにマウスのプールした血漿試料によって間隔をあけた。内部標準ピーク面積を品質管理のためにモニターして、および群の平均値から2標準偏差より大きく異なるピーク面積を有する個々の試料を再分析した。分析した代謝物を、以下の基準に基づいて選択した：1）公知の構造的同一性；2）多数の生化学経路に及ぶ分布；3）ハイスループット形式でLC/MSを用いた信頼可能な測定；および4）本発明者らのプラットフォームにおける低い欠測率（＜1％）。

脂質分析：
血漿10マイクロリットルを、0.25μg/ml（最終濃度）1-ドデカノイル-2-トリデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL）を含むイソプロパノール190μlによって抽出した。遠心分離後、上清を直接注射した後、150×3.0 mm Prosphere HP C4カラム（Grace, Columbia, MD）；移動相A、95:5:0.1 vol/vol/vol 10 mM酢酸アンモニウム/メタノール/酢酸：および移動相B、99.9:0.1 vol/volメタノール/酢酸を用いて逆相クロマトグラフィーを行った。カラムを、80％移動相Aによって均一濃度で2分間溶出した後、20％移動相Aへの直線勾配で1分間溶出し、0％移動相Aへの直線勾配で12分間溶出した後、0％移動相Aで10分間溶出し、および80％移動相Aへの直線勾配で9分間溶出した。ポジティブイオンモードでエレクトロスプレーイオン化およびQ1スキャンを用いてMS分析を行った。イオンスプレー電圧は5.0 kVであり、線源温度は400℃、デクラスタリング電位は、70 Vであった。各脂質分析物に関して、最初の数は脂質アシル鎖における炭素総数を示し、次の数（コロン後）は、脂質アシル鎖における二重結合の総数を示す。

免疫組織化学
マウス心臓を4％パラホルムアルデヒドによって固定し、パラフィン包埋して、切片にし、既に記述した標準的な免疫組織化学顕微鏡法によって染色した。試料をクエン酸ベースの緩衝液（Dako）中で95℃で20分間加熱することによる抗原回収段階を、全ての実験において用いた。一次抗体を以下のように用いた：ウサギGDF11抗体1：500（Abcam）ビオチニル化抗ウサギ二次抗体の後にABC試薬およびDAB（Vector Laboratories）を免疫組織化学のために用いた。

人工多能性幹細胞由来ヒト心筋細胞
人工多能性幹細胞由来ヒト心筋細胞（iPSC-CM）をCellular Dynamics International（CDI）から得て、製造元の説明書に従って培養した。簡単に説明すると、細胞を生存細胞約580,000個/ウェルで、5μg/mlフィブロネクチンコーティング6ウェルプレートにおいてCDI平板培養培地中で平板培養した。培地を2日後にCDI維持培地に交換して、さらに平板培養後4日目および6日目に、この培地による培地交換を2回行った。6日目の時点で、細胞が均一に拍動することが観察された。平板培養の7日後、培地を無血清DMEM（低グルコース）に交換して、細胞をさらに24時間インキュベートした。この時点で、細胞を対照の無血清培地に曝露したか、または50 nMミオスタチン（Peprotech）もしくは50 nM rGDF11（Peprotech）を含む同じ培地に15分間曝露した。溶解物を収集して、標準的な方法を用いてウェスタン分析を行った。用いた抗体は、Cell Signaling Technologyのホスホ-Fox01/Fox03a（9464）、ホスホ-SMAD2（3108）、ホスホ-SMAD3（9520）、GAPDH（2118）であった。

ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析は、既に記述されたとおりに（Seki et al., 2009）行った。メンブレン（フッ化ポリビニリデン、PerkinElmer Life Sciences）を一次抗体（抗GDF11、1 : 1000倍希釈、Abcam）と共にインキュベートして、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗体（1:2000倍、Bio-Rad）および高感度化学発光（PerkinElmer Life Sciences）によって検出した。脾臓のウェスタンブロット分析は、一次抗体（抗GDF11、Abcam、1:500倍希釈およびα-チューブリン、Sigma、1:1000倍希釈）と共にインキュベートしたメンブレン（immune-Blot PVDFメンブレン、Bio-Rad）によって行い、IRDyeコンジュゲート抗体（1 : 10000倍希釈、Li- Cor）によって検出した。メンブレンを、Odyssey CLx赤外線イメージングシステム（Li-Cor）によってスキャンして、Image Studioソフトウェア（Li-Cor）による密度測定によって定量した。

大動脈縮窄術および心エコー法
大動脈縮窄術（TAC）手技および心エコー法は、盲検プロトコールを用いてインビボ試験において行った。

参考文献：

（表１）プロテオミクス分析によって同定された血清分析物の一覧。表は、若齢マウスを老齢マウスと容易に識別する13個の分析物を要約する。

（表２）23ヶ月齢のC57Bl/6雄性マウスにおけるrGDF11または溶媒による処置の30日後での心エコーデータ。心エコーパラメータに、有意差は認められなかった。AWT＝左室前壁厚；PWT＝左室後壁厚；EDD＝拡張末期径；ESD＝収縮末期径；FS＝左室内径短縮率。データを平均値±S.E.M.で示す。

実施例2：GDF11
本明細書において記述されるように、加齢による心肥大は、若齢循環血液に曝露することによって数週間という期間で急速に回復させることができる。本明細書において先に紹介したデータは、心肥大の急速な縮小の原因である共有血液循環を介して若齢マウスから老齢マウスに移入された、循環因子が存在することを示唆している。

並体結合マウスにおいて観察された心肥大の縮小を説明しうる若齢マウスに存在する循環因子に関する偏見のない研究を行った。並体結合実験において用いた2つの月齢群（若齢成体マウスと老齢のマウス）由来の遺伝学的に同一のマウスから、血清を採取した。アプタマー法によるプロテオミクスプラットフォーム（Somalogic）を用いて、若齢マウスと比較して老齢マウスにおいて有意に減少した増殖分化因子（GDF）11と呼ばれる因子を同定した。血漿中GDF11レベルを若齢（2ヶ月齢）および老齢のマウス（23ヶ月齢）においてELISAによって測定した。血液中のGDF11レベルは、老齢マウス（17.4±3.9 ng/ml）と比較して若齢マウス（43.7±12.7 ng/ml）において有意に高かった（図7A）。これらの結果を、若齢（n＝3）および老齢（n＝3）マウスの血漿に関するウェスタン分析によって確認した。GDF11の成熟型に対応する12.5 kDaバンドは、若齢マウスにおいて明らかに目に見えるが、老齢マウスではより強度が低かった（各レーンに血漿5μlをロードした）（図7B）。さらに、老齢マウスを若齢循環血液に曝露すると、血液中GDF11が若齢マウスと類似のレベルまで復帰することが証明された（データは示していない）。これらのデータから、血液中のGDF11と心肥大のあいだの明確な反比例関係が出現する。その上、並体結合によって血液中のGDF11を復帰させることは、心肥大の縮小に関連する。これらのデータは、加齢によるGDF11の減少が、加齢関連心肥大において役割を果たしうること、およびGDF11の増加がこの肥大を予防および／または回復させることができることを示している。

活性なGDF11の投与は、心肥大の縮小を誘導することができ、拡張機能および臨床心不全を改善することができる。タンパク質分解の減少および半減期の延長をねらいとしたアミノ酸または他の修飾を伴うまたは伴わないGDF11を用いて、高血圧症、加齢、遺伝性肥大型心筋症、および心臓弁膜症に関連する障害を含む、心肥大および拡張期心不全を処置することができる。任意の病因の拡張期心不全を有する患者においてGDF11の若いレベルを復帰させる治療戦略が本明細書において記述される。

参考文献：

実施例3
GDF11は、他の組織における加齢表現型にも同様に影響を及ぼしうる。これらの効果は、皮膚、骨格筋、および脳を含むいくつかの異なる組織において調べられている。

骨格筋においてGDF11は、筋幹細胞ゲノム完全性、筋原性機能、および再生能の加齢関連障害を回復させることができる。

実施例4
正常なヒトにおける血清中GDF11タンパク質レベルを、実施例1に記述されるアプタマー技術を用いて決定した。ヒトにおけるレベルは、性差に依存するが、年齢70歳より上では男女いずれにおいても低下する。

Claims (14)

1. 対象における加齢による心肥大を処置するための、対象においてGDF11ポリペプチドレベルを増加させる哺乳動物のGDF11ポリペプチドを含む薬学的組成物。
2. 対象が、拡張期心不全、心肥大、加齢による心肥大、高血圧症、弁膜症、大動脈弁狭窄症、遺伝性肥大型心筋症、または加齢による心臓の硬化からなる群より選択される状態を有するかまたは有すると診断されている、請求項1に記載の薬学的組成物。
3. GDF11ポリペプチドレベルが対象の循環血液中のGDF11レベルである、請求項1〜2のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
4. GDF11ポリペプチドレベルが、対象の心組織におけるGDF11レベルである、請求項1〜2のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
5. SEQ ID NO:14のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
6. SEQ ID NO:2のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
7. SEQ ID NO:1のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
8. SEQ ID NO:15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドを含む、請求項1〜4のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
9. SEQ ID NO:1、2、14、または15のいずれかのアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドのホモ二量体を含む、請求項1〜8のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
10. SEQ ID NO:1、2、14、または15のアミノ酸配列を含むGDF11ポリペプチドの複合体を含む、請求項1〜9のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
11. GDF11ポリペプチドをコードする核酸を含む、請求項1〜10のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
12. 静脈内、皮下、動脈内、および冠動脈内からなる群より選択される経路で投与するための、請求項1〜11のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
13. GDF11レベルが少なくとも100％増加する、請求項1〜12のいずれか１項に記載の薬学的組成物。
14. GDF11レベルが健康な参照レベルの少なくとも75％まで増加する、請求項1〜13のいずれか１項に記載の薬学的組成物。

Images