ES2861440T3 - Uso de complejos del factor de transcripción de nucleosomas para la detección del cáncer - Google Patents

Abstract

Uso in vitro de un aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido o un aducto de nucleosoma- cofactor de transcripción específico de tejido como biomarcador en un fluido biológico para la detección o diagnóstico de un cáncer en un sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN

Uso de complejos del factor de transcripción de nucleosomas para la detección del cáncer

Campo de la invención

La invención se refiere a un método para la detección del cáncer, en particular para la identificación del cáncer primario en un sujeto con enfermedad de cáncer metastásica de sitio primario desconocido, mediante un aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido o un aducto de nucleosoma-cofactor de transcripción como biomarcador en un fluido biológico.

Antecedentes de la invención

Una amplia gama de análisis de sangre para inmunoensayos es de uso clínico común para abordar una amplia gama de necesidades clínicas. Algunos ejemplos ilustrativos incluyen el uso para detectar o investigar enfermedades virales, infarto de miocardio, enfermedad de la tiroides, infertilidad, afecciones ginecológicas, respuesta inflamatoria, estado inmunitario, alergias, estado de fármacos (farmacéuticos, androgénicos, recreativos y de mejora del rendimiento) y muchos más. Los sistemas de inmunoensayos automáticos que ofrecen las grandes empresas de diagnóstico tienen menús de cientos de pruebas de inmunoensayos. Las muchas ventajas de las pruebas de inmunoensayos incluyen su extrema sensibilidad y especificidad analíticas combinadas con robustez y fiabilidad, junto con un formato mínimamente invasivo para el paciente que requiere solo una gota de sangre, una flexibilidad extrema que permite realizar los ensayos en grandes laboratorios o en el consultorio del médico o en un formato de uso doméstico y todo a bajo costo. A pesar de esto, tan solo un análisis de sangre para un inmunoensayo es de uso clínico común para la detección del cáncer, el ensayo del antígeno prostático específico (“Prostate Specific Antigen”, PSA) para el cáncer de próstata. Otros biomarcadores proteicos clásicos del cáncer, como CA125, CA19.9, CEA (“carcinoembryonic antigen”, antígeno carcinoembrionario) y AFP (alfa-fetoproteína), se utilizan para controlar el tratamiento del cáncer, pero no se recomiendan para la detección del cáncer debido a su escasa precisión clínica.

Se están desarrollando métodos de detección de cáncer en sangre no basados en inmunoensayos, basados en la detección de células tumorales circulantes, pero no son de uso clínico común. De manera similar, se están desarrollando métodos para el ADN tumoral circulante (ADNtc), ARN u otros ácidos nucleicos circulantes, pero tampoco tienen un uso clínico generalizado. Existe una amplia variedad de métodos de ácidos nucleicos circulantes. Algunos se basan en la detección de mutaciones en la secuencia del ADNtc asociadas al cáncer u otros efectos de la secuencia del DNA asociados con el cáncer. Otros ejemplos incluyen métodos basados en la detección de secuencias de ADN metilado asociadas con el cáncer o secuencias de microARN asociadas con el cáncer. Las anomalías del ADN son características de todas las enfermedades cancerosas. El ADN de las células cancerosas se diferencia del de las células sanas de muchas maneras, incluidas, entre otras, mutaciones puntuales, estado de metilación, translocaciones, número de copias de genes, anomalías en microsatélites e integridad de la cadena de ADN. Cualquiera de estas mutaciones puede ser susceptible de un ensayo de ADNtc.

Cuando se detecta cáncer en una etapa temprana de la enfermedad, actualmente es probable que se realice mediante una prueba fecal, un método de endoscopia invasivo, un método de biopsia invasivo, un método de escaneo de rayos X potencialmente peligroso, un método de escaneo de resonancia magnética (MRI), una prueba de frotis cervical o sintomáticamente. Todos estos métodos tienen desventajas de invasividad, malestar, riesgo para el paciente, cumplimiento por parte del paciente y/o alto coste. En la actualidad, una vez detectado, el cáncer normalmente se confirma y diagnostica mediante ensayos de inmunohistoquímica (IHC) del tejido tumoral extraído en la biopsia. La detección temprana de cánceres conduce a mejores resultados para los pacientes y beneficios financieros para los proveedores de atención médica al evitar costosos tratamientos y estancias hospitalarias en los estadios tardío. Desafortunadamente, el cáncer en la actualidad a menudo permanece sin ser detectado hasta que alcanza un estadio tardío del desarrollo de la enfermedad, cuando puede haberse extendido más allá del sitio del tumor primario y las opciones de tratamiento son más limitadas, más costosas y menos efectivas, lo que conduce a malos resultados para los pacientes. Existe una clara necesidad médica insatisfecha de realizar más y mejores análisis de sangre para el cáncer.

Los pacientes diagnosticados con cáncer pueden presentar cáncer en estadio tardío o metastásico que ya se ha diseminado más allá del órgano en el que se desarrolló el cáncer primario. En muchos casos, el sitio donde se desarrolló originalmente el cáncer primario no está claro y estos casos se conocen como carcinomas de sitios primarios desconocidos (“carcinomas of unknown primary”, CUP) o tumores ocultos. La identificación del sitio del tumor primario en estos casos es de gran relevancia clínica, porque los cánceres se tratan según el lugar donde se desarrollaron originalmente, incluso si se han diseminado a otras partes del cuerpo. Esto es particularmente cierto para cualquier terapia dirigida que deba dirigirse al carcinoma del sitio primario. Por ejemplo, si un cáncer de pulmón primario se ha diseminado al hígado, es un cáncer de pulmón con metástasis hepáticas o secundarias. No es un cáncer de hígado porque las células cancerosas son células pulmonares cancerosas.

En muchos casos en los que un sujeto presenta cáncer metastásico, el sitio del cáncer primario está claro. Sin embargo, en los CUP no se puede determinar el cáncer primario. Esto puede ocurrir por varias razones, por ejemplo, porque el cáncer secundario ha crecido muy rápidamente, mientras que el cáncer primario aún es pequeño y no es visible en las exploraciones, o porque el cáncer primario ha desaparecido, quizás debido a un ataque inmunológico o el desprendimiento de un cáncer primario (por ejemplo, un cáncer colorrectal puede desprenderse de la pared intestinal y eliminarse del cuerpo con las heces).

En la actualidad, el tumor primario en pacientes que presentan enfermedad metastásica generalmente se localiza mediante el examen del paciente, los síntomas del paciente, la exploración y los ensayos de inmunohistoquímica (IHC) del tejido tumoral extraído en la biopsia. El sitio del tumor primario puede identificarse o confirmarse mediante IHC de factores de transcripción específicos de tejido.

El análisis del ADN del tumor circulante u otros métodos de biomarcadores pueden revelar la presencia de un cáncer primario en un sujeto sin identificar el sitio del cáncer. Esto puede conducir a una situación similar al CUP (excepto que no es necesario que haya metástasis) donde se sabe o se sospecha que un sujeto tiene cáncer, pero sin conocimiento del sitio del cáncer. Por ejemplo, un cáncer diagnosticado usando técnicas de secuencia de ADNtc puede identificar mutaciones genéticas asociadas al cáncer en la sangre de un sujeto que indican la presencia de un cáncer sin indicar el sitio del cáncer. Una situación similar puede ocurrir para la detección de cáncer mediante técnicas de células tumorales circulantes u otros métodos de detección de cáncer que pueden no revelar el sitio de un tumor detectado.

El cuerpo humano comprende varios cientos de tipos de células. Todos estos tipos de células contienen el mismo genoma, pero fenotipos muy diferentes y funciones diferentes en el cuerpo. Esta diversidad fenotípica se debe a la expresión diferencial del genoma en diferentes tipos de células. El control de la expresión génica diferencial no se comprende del todo, pero los mecanismos básicos incluyen la regulación génica mediante una serie de señales epigenéticas interconectadas asociadas con el gen, que incluyen el control del empaquetamiento de la cromatina como eucromatina o heterocromatina, el control del posicionamiento de los nucleosomas y los sitios accesibles a las nucleasas, la metilación del ADN y la variación en la estructura de las histonas de los nucleosomas alrededor de los cuales se envuelve el ADN y la variación en el factor de transcripción y la expresión del cofactor de transcripción y la interacción con los genes a los que se unen.

El nucleosoma es la unidad básica de la estructura de la cromatina y consiste en un complejo proteico de ocho histonas centrales altamente conservadas (que comprenden un par de cada una de las histonas H2A, H2B, H3 y H4). Alrededor de este complejo se envuelven aproximadamente 146 pares de bases de ADN. Otra histona, H1 o H5, actúa como enlazador y participa en la compactación de la cromatina. El ADN se enrolla alrededor de nucleosomas consecutivos en una estructura que a menudo se dice que se asemeja a "cuentas en una cuerda" y esto forma la estructura básica de la eucromatina abierta. En estado compactado o como heterocromatina, esta cuerda se enrolla y superenrolla para producir una estructura cerrada y compleja (Herranz y Esteller, 2007).

El recambio celular normal en humanos adultos implica la creación por división celular de unos 1011 células diarias y la muerte de un número similar, principalmente por apoptosis. Durante el proceso de apoptosis, la cromatina se descompone en fragmentos que incluyen mononucleosomas y oligonucleosomas que se liberan de las células. En condiciones normales, estos se eliminan y el nivel de nucleosomas circulantes que se encuentran en sujetos sanos es bajo. Se encuentran niveles elevados en sujetos con una variedad de afecciones, que incluyen muchos cánceres, enfermedades autoinmunitarias, afecciones inflamatorias, accidente cerebrovascular e infarto de miocardio (Holdenrieder y Stieber, 2009).

Los mononucleosomas y oligonucleosomas pueden detectarse mediante el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (“Enzyme-Linked ImmunoSorbant Assay”, ELISA) y se han informado varios métodos (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003). Estos ensayos suelen emplear un anticuerpo anti-histona (por ejemplo, anti-H2B, anti-H3 o anti-H1, H2A, H2B, H3 y H4) como anticuerpo de captura, y un anticuerpo anti-ADN o complejo anti-H2A-H2B-ADN como anticuerpo de detección. Se ha informado que el coeficiente de correlación entre los resultados de ELISA para los niveles de nucleosomas libres de células circulantes y los niveles de ADN circulante medidos por PCR en tiempo real (reacción en cadena de la polimerasa) es r = 0,531 en suero y r = 0,350 en plasma (Holdenrieder et al., 2005).

Los métodos ELISA de nucleosomas se utilizan en cultivos celulares, principalmente como método para detectar la apoptosis (Salgame et al., 1997; Holdenrieder et al., 2001; van Nieuwenhuijze et al., 2003), y también se utilizan para la medición de nucleosomas libres de células circulantes en suero y plasma (Holdenrieder et al., 2001). Los niveles de nucleosomas en suero y plasma libres de células liberados a la circulación por las células moribundas se han medido mediante métodos ELISA en estudios de varios cánceres diferentes para evaluar su uso como biomarcador potencial (Holdenrieder et al., 2001). Se informa que los niveles medios de nucleosomas circulantes son altos en la mayoría de los cánceres estudiados. Los niveles más altos de nucleosomas circulantes se observaron en sujetos con cáncer de pulmón. Sin embargo, se informa que los sujetos con tumores malignos tienen concentraciones en suero de nucleosomas que varían considerablemente y se encontró que algunos sujetos con enfermedad tumoral avanzada tenían niveles bajos de nucleosomas circulantes, dentro del intervalo medido para sujetos sanos (Holdenrieder et al., 2001). Debido a esto y a la variedad de causas no cancerosas de los niveles elevados de nucleosomas, los niveles circulantes de nucleosomas no se utilizan clínicamente como biomarcador de cáncer (Holdenrieder y Stieber, 2009).

La estructura de los nucleosomas puede variar por la modificación postranscripcional (“Post Transcriptional Modification”, PTM) de las proteínas de histonas y por la inclusión de proteínas de histonas variantes. La PTM de las proteínas de histona ocurre típicamente en las colas de las ocho histonas centrales y las modificaciones comunes incluyen acetilación, metilación o ubiquitinación de restos lisina, así como metilación de restos arginina y fosforilación de restos serina. Se sabe que las modificaciones de histonas están implicadas en la regulación epigenética de la expresión génica (Herranz y Esteller, 2007). La estructura del nucleosoma también puede variar mediante la inclusión de isoformas o variantes de histonas alternativas que son diferentes productos génicos o productos de corte y empalme y tienen diferentes secuencias de aminoácidos. Las variantes de histonas se pueden clasificar en varias familias que se subdividen en tipos individuales. Las secuencias de nucleótidos de un gran número de variantes de histonas son conocidas y están disponibles públicamente, por ejemplo, en la base de datos de histonas de Nationa1Human Genome Research Institute NHGRI (Mariño-Ramírez et al., 2011 y http://genome.nhgri.nih.gov/histones/complete.shtml), la base de datos GenBank (secuencia genética de NIH), la base de datos de secuencias de nucleótidos EMBL y la base de datos de ADN de Japón (“DNA Data Bank of Japan”, DDBJ).

Se ha demostrado que las variantes de histonas y los patrones de modificación de histonas presentes en células sanas y enfermas difieren en numerosos estudios (principalmente inmunohistoquímicos) (Herranz y Esteller, 2007). Una desventaja de los métodos inmunohistoquímicos para uso clínico es que la recolección de muestras de tejido es invasiva y requiere cirugía o biopsia.

Además de la señalización epigenética mediada por la estructura y posición del nucleosoma, el control de la expresión génica en las células también está mediado por modificaciones en la estructura del ADN asociado al nucleosoma, por ejemplo, por metilación del ADN (Herranz y Esteller, 2007). Se sabe en la técnica desde hace algún tiempo que el ADN puede metilarse en la posición 5 de los nucleótidos de citosina para formar 5-metilcitosina. La hipometilación global del ADN es un sello distintivo de las células cancerosas (Esteller, 2007 y Hervouet et al., 2010). La metilación global del ADN se puede estudiar en células mediante técnicas de inmunohistoquímica.

Se sabe desde hace muchos años que, además del ácido nucleico y las proteínas de histonas, la cromatina comprende un gran número de proteínas que no son histonas unidas a su ADN y/o histonas constituyentes (Yoshida y Shimura, 1972). Estas proteínas asociadas a la cromatina son de una amplia variedad de tipos y tienen una variedad de funciones e incluyen factores de transcripción, factores de potenciación de la transcripción, factores de represión de la transcripción, enzimas modificadoras de histonas, proteínas de reparación de daños en el ADN y muchas más. El estudio de las proteínas unidas a la cromatina se ha llevado a cabo en gran medida mediante métodos de inmunoprecipitación de cromatina (“Chromatin ImmunoPrecipitation”, ChIP). Estos métodos son bien conocidos en la técnica, pero son complejos, laboriosos y costosos.

En un método típico de ChIP, la cromatina celular se reticula de modo que todos los componentes de proteínas y ácidos nucleicos se unen covalentemente entre sí. Luego, la cromatina se cizalla para formar una preparación de mononucleosomas y oligonucleosomas. Se añade un anticuerpo contra la proteína de interés a la cromatina cizallada para inmunoprecipitar los fragmentos de cromatina que contienen la proteína. El anticuerpo normalmente se une a una fase sólida (por ejemplo, esferas de plástico) para facilitar el aislamiento del complejo de cromatina que contiene la proteína de interés. A continuación, se invierte la reticulación y la proteína se elimina mediante digestión con una proteinasa. El ADN asociado con el complejo de cromatina se aísla y analiza para determinar la secuencia de ADN, el gen o el locus asociado con la unión a la proteína concreta utilizando cualquiera de una variedad de técnicas que incluyen PCR seguida de electroforesis en gel, secuenciación de ADN (ChIP-Seq) o micromatrices de ADN (ChIP sobre chip). Estos métodos de ChIP revelan las secuencias de ADN asociadas con las proteínas de histonas unidas a la cromatina. Se han desarrollado derivados del método ChIP para facilitar los estudios de la asociación de proteínas que no son histonas con histonas y nucleosomas, incluidos, por ejemplo, ensayos asociados a histonas (Ricke y Bielinsky, 2005).

También se han detectado fragmentos de cromatina que contienen proteínas que no son histonas, en forma de aductos de nucleosoma-proteína o cromatosoma-proteína, en la circulación como aductos de nucleosoma-proteína. En el documento WO2013/084002 se describen ejemplos de ensayos para detectar aductos de proteína-nucleosoma libre de células.

Además de otros mecanismos de regulación epigenética, la expresión génica diferencial está regulada por variaciones en la expresión y actividad de los factores de transcripción. Los factores de transcripción son sustancias que contienen un dominio de unión al ADN (“DNA Binding Domain”, DBD) que se une a una secuencia génica específica asociada con el gen o genes cuya expresión se va a regular. Por ejemplo; el receptor de andrógenos (AR) es un factor de transcripción que se une a una secuencia de ADN específica llamada elemento de respuesta de andrógenos (“androgen response element”, ARE) en los cromosomas y sobrerregula o infrarregula la expresión de genes dependientes de andrógenos que contienen o están regulados por ARE. Cuando los factores de transcripción se unen a su secuencia génica diana, pueden promover o suprimir la expresión génica. Algunos factores de transcripción se expresan en todos o en la mayoría de los tejidos. Otros factores de transcripción pueden expresarse diferencialmente en diferentes tejidos y, por tanto, son más específicos de tejido.

La IHC ha demostrado que los factores de transcripción específicos de tejido aparecen en las células de ciertas células cancerosas primarias, pero no en otras. Por ejemplo, el factor de transcripción CDX2 aparece en células de cáncer gastroenterológico, particularmente en células de cáncer colorrectal, y su presencia mostrada por IHC en tejido extraído en biopsia o cirugía puede usarse para identificar un cáncer gastroenterológico primario.

De manera similar, se han descrito cofactores de transcripción específicos de tejido que incluyen, por ejemplo, FHL2, que se informa que es un cofactor del receptor de andrógenos (AR) específico de los tejidos de la próstata y el corazón (Muller e ta l, 2000).

Ballare et al. (2013) describe el requisito de nucleosomas para la unión y función óptimas del receptor de progesterona a genes inducidos por progesterona.

Snyder et al. (2016) describe el uso de "huellas" de factores de transcripción en fragmentos cortos de ADN libres de células aislados del plasma sanguíneo circulante en la identificación del tipo celular de origen.

Wittwer et al. (2013) describe la correlación de los niveles de nucleosomas circulantes y marcadores de muerte celular inmunogénica con el tiempo hasta la progresión y la supervivencia global en pacientes con cáncer de páncreas avanzado que se someten a quimioterapia.

Takaku et al. (2016) describe el mecanismo detrás de las funciones del factor de transcripción GATA3 como un factor de transcripción pionero y su capacidad para unirse a la cromatina inaccesible e inducir la remodelación de la cromatina o el deslizamiento del nucleosoma durante la transición mesenquimática a epitelial.

Yang y Schwartz (2011) revisan las marcas epigenéticas en el pulmón y sus efectos sobre la expresión génica en el pulmón asociadas con enfermedades pulmonares benignas y cáncer de pulmón.

Lin et al. (2011) describe alteraciones en los niveles de ARNm para los factores de transcripción GATA3, T-bet, RORyt y FOXP en células mononucleares de sangre periférica en pacientes con carcinoma hepatocelular.

En el presente documento, los inventores presentan métodos de inmunoensayo simples para la estimación directa de aductos de nucleosoma-factor de transcripción y nucleosoma-cofactor de transcripción en muestras biológicas. Mediante la selección de factores de transcripción y/o cofactores específicos de tejido, este método puede usarse como un análisis de sangre no invasivo o mínimamente invasivo para detectar un cáncer o para determinar o confirmar el sitio de un tumor primario en un sujeto con enfermedad metastásica. Hemos demostrado que tales aductos de nucleosomas pueden detectarse en muestras de suero y que tienen uso como biomarcadores en enfermedades.

Sumario de la invención

Según un primer aspecto de la invención se proporciona el uso in vitro de un aducto de nucleosoma-factor de transcripción de tejido o un aducto de nucleosoma-cofactor de transcripción específicos como biomarcador en un fluido biológico para la detección o diagnóstico de un cáncer en un sujeto.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos, o un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma;

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma cuando el primer agente de unión se une al nucleosoma o un componente del mismo, o dicho segundo agente de unión se une a un nucleosoma o componente del mismo cuando el primer agente de unión se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido, nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra;

en el que la presencia o el nivel del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma se usa como indicador del sitio de desarrollo de dicho cáncer.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos; y

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido en la muestra.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido;

(ii) poner en contacto la muestra con un segundo agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión a nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para evaluar la idoneidad de un sujeto animal o humano para un tratamiento médico que comprende las etapas de:

(i) detectar o medir un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto como se define en el método como se describe en el presente documento; y

(ii) usar el tipo de factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma detectado para determinar un tratamiento adecuado para el sujeto.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para controlar un tratamiento de un sujeto animal o humano que comprende las etapas de:

(i) detectar o medir un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto como se define en el método como se describe en el presente documento;

(ii) repetir la detección o medición del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto en una o más ocasiones; y

(iii) usar cualquier cambio en el nivel de factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma detectado como un parámetro para cualquier cambio en la condición del sujeto.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Resultados de ELISA del aducto GATA 3 unido a nucleosomas libres de células circulantes para muestras tomadas de un sujeto sano, 3 sujetos diagnosticados con cáncer de mama, 2 sujetos diagnosticados con cáncer de vejiga y una muestra de control negativo.

Figura 2: Resultados de ELISA del aducto TTF-1 unido a nucleosomas libres de células circulantes para muestras tomadas de un sujeto sano, 3 sujetos diagnosticados con cáncer de tiroides, 2 sujetos diagnosticados con cáncer de pulmón y una muestra de control negativo.

figura 3: Resultados de ELISA del aducto TTF-1 unido a nucleosomas libres de células circulantes para muestras tomadas de 3 sujetos sanos, 1 sujeto con diagnóstico de cáncer de tiroides, 4 sujetos con diagnóstico de cáncer de pulmón, 3 sujetos con diagnóstico de cáncer rectal, 3 sujetos con diagnóstico de cáncer de colon, 3 sujetos con diagnóstico con cáncer de mama y una muestra de control negativo.

Figura 4: Resultados del aducto ELISA CDX2 unido a nucleosomas libres de células circulantes para muestras tomadas de 3 sujetos sanos, 1 sujeto con diagnóstico de cáncer de tiroides, 4 sujetos con diagnóstico de cáncer de pulmón, 3 sujetos con diagnóstico de cáncer rectal, 3 sujetos con diagnóstico de cáncer de colon, 3 sujetos con diagnóstico de cáncer de mama y una muestra de control negativo.

Descripción detallada de la invención

Según un primer aspecto de la invención, se proporciona el uso in vitro de un aducto de nucleosoma y factor o cofactor de transcripción específico de tejido como biomarcador en un fluido biológico para la detección o diagnóstico de un cáncer en un sujeto.

En una realización, el aducto de nucleosoma-factor de transcripción o el aducto de nucleosoma-cofactor de transcripción específicos de tejido se usa para identificar el sitio de desarrollo del cáncer en el sujeto.

En una realización, el sujeto no ha sido diagnosticado previamente con cáncer (es decir, aparentemente está sano). Por ejemplo, el cáncer se detecta en una persona aparentemente sana en un ensayo de detección. En una realización, el sujeto ha sido identificado con síntomas asociados con el cáncer, es decir, el cáncer se detecta en una persona con síntomas de enfermedad. Los síntomas pueden indicar cáncer o un mal funcionamiento de un tejido u órgano en particular. Dichos síntomas pueden incluir dolor, sangrado inusual, un bulto o hinchazón inusual, tos persistente, dificultad para respirar y/o pérdida de peso inexplicable.

La presente invención tiene utilidad en pacientes que ya han sido diagnosticados con un cáncer primario sin conocimiento de la ubicación del cáncer, por ejemplo, usando un ensayo de ADNtc, un ensayo de células tumorales circulantes o sintomáticamente. Por lo tanto, de acuerdo con una realización de la invención, se proporciona el uso de un aducto de nucleosoma y factor o cofactor de transcripción específico de tejido como un biomarcador en un fluido biológico para la identificación o diagnóstico del sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que ha sido previamente diagnosticado con cáncer.

Los inventores han descubierto que los factores o cofactores de transcripción específicos de tejido pueden detectarse en nucleosomas libres de células y, por lo tanto, pueden usarse para detectar un cáncer y/o identificar el origen de un cáncer en un paciente, como en pacientes que han sido previamente diagnosticados con cáncer, pero sin conocimiento de su sitio de desarrollo. La identificación del sitio de desarrollo de un cáncer es fundamental para elegir la terapia adecuada y, por lo tanto, mejorar el pronóstico y el tratamiento de un paciente.

En una realización, el cáncer es un cáncer primario, es decir, el lugar donde comienza/se origina un cáncer en el cuerpo. En una realización alternativa, el cáncer es un cáncer secundario, es decir, una metástasis una vez que las células cancerosas se han diseminado a otra parte del cuerpo.

En una realización, el sujeto es un sujeto con cáncer metastásico de sitio primario desconocido (CUP). En esta realización, el sujeto puede haber sido diagnosticado con cáncer identificando una metástasis, pero sigue siendo importante localizar el cáncer primario para proporcionar el tratamiento apropiado.

En una realización, al sujeto se le diagnosticó previamente cáncer usando un método de ácido nucleico circulante, por ejemplo, usando ADNc, ARN, miARN u otros métodos basados en ácidos nucleicos en sangre circulante que detectan el cáncer per se. En una realización adicional, al sujeto se le diagnosticó previamente cáncer utilizando ADN tumoral circulante (ADNtc) como biomarcador. En una realización, al sujeto se le diagnosticó previamente cáncer mediante la detección de células tumorales circulantes. En estas realizaciones, el cáncer se detecta, pero con información insuficiente o nula sobre la ubicación original del cáncer en un sujeto.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido como un biomarcador en un fluido biológico para la identificación o diagnóstico del sitio, posición o ubicación del órgano de un cáncer primario en un sujeto con enfermedad metastásica. Los inventores han demostrado que tres de estos aductos que contienen TTF-1, CDX2 o GATA 3, que se expresan en tejido de cáncer de tiroides o pulmón (TTF-1), tejido de cáncer gastroenterológico (CDX2) y tejido de cáncer de mama (GATA 3) respectivamente, están presentes. en la circulación de sujetos con cáncer y que su presencia o nivel puede usarse para indicar que el paciente tiene un cáncer primario de tiroides, colorrectal o de mama, respectivamente, y que estos aductos de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido no están presentes habitualmente (o están presentes en niveles bajos) en la circulación de sujetos con otros cánceres o sujetos sanos.

En la bibliografía se informa que TTF-1 se expresa en la mayoría de las muestras de tejido de cáncer de pulmón, así como en la mayoría de las muestras de tejido de cáncer de tiroides. El tejido de cáncer colorrectal a veces presenta un nivel elevado de expresión tisular de TTF-1. Por lo tanto, los ensayos de tejido para TTF-1 pueden usarse para identificar tumores CUP como de origen primario de tiroides o pulmón, pero algunos otros cánceres, incluido el cáncer colorrectal, son posibles resultados "falsos positivos" que pueden identificarse erróneamente como cáncer de pulmón o tiroides. Los inventores han descubierto que los niveles de aductos de TTF-1 unido a nucleosomas circulantes están elevados en la sangre de sujetos con tumores de tiroides y menos elevados en sujetos con cáncer de pulmón. Sorprendentemente, los inventores también han descubierto que los niveles de aductos de TTF-1 unido a nucleosomas circulantes estaban elevados en la sangre de todos los sujetos diagnosticados con cáncer colorrectal (colon o recto). Esto indica que la especificidad de tejido de los niveles de aductos de nucleosoma-factor de transcripción libre de células en los fluidos corporales puede no ser, en todos los casos, la misma que la especificidad de los niveles de expresión del factor de transcripción en los tejidos cancerosos extraídos en la biopsia.

Se sabe que se produce una expresión de un factor de transcripción específico de tejido similar para muchos otros cánceres (Kandalaft y Gown, 2015) y será evidente para los expertos en la técnica que se pueden usar ensayos de aductos de nucleosomas análogos para aductos de nucleosomas-factor de transcripción específico de tejidos apropiados, para identificar el cáncer de sitio primario desconocido para la amplia gama de cánceres en los que ya se han identificado dichos factores de transcripción. Estos incluyen, por ejemplo, sin limitación, GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 (TP63) o P40 y/o cualquier cáncer en el que se pueda identificar cualquier expresión de un factor de transcripción específico de tejido. El método de la invención tiene utilidad clínica en cualquier situación en la que un sujeto pueda tener un cáncer no detectado o desconocido o se sabe que tiene un cáncer, pero se desconoce el sitio de desarrollo del tumor primario, incluso en los casos de CUP o cuando el cáncer es detectado sin conocimiento de su sitio de desarrollo. Esta última situación puede surgir, por ejemplo, cuando se utilizan métodos de detección de cáncer basados en ADNtc, ARN u otros métodos basados en ácidos nucleicos en sangre circulantes que detectan el cáncer per se o cuando se detectan células tumorales circulantes de origen primario desconocido. Existe una amplia variedad de métodos de ácidos nucleicos circulantes. Algunos se basan en la detección de mutaciones en la secuencia del ADNtc asociadas al cáncer u otros efectos de la secuencia del DNA asociados con el cáncer. Otros se basan en la detección de secuencias de microARN asociadas con el cáncer, secuencias de ADN metilado asociadas con el cáncer y otras. Las anomalías del ADN son características de todas las enfermedades cancerosas. El ADN de las células cancerosas se diferencia del de las células sanas de muchas maneras, incluidas, entre otras, mutaciones puntuales, estado de metilación, translocaciones, número de copias de genes, anomalías en microsatélites e integridad de la cadena de ADN. Sin embargo, las mutaciones genéticas son características de todos los cánceres y es posible que su presencia no proporcione información sobre la naturaleza del tumor primario. Como ejemplo ilustrativo, las mutaciones del gen P53 son comunes en el cáncer y su presencia en el ADNtc puede usarse como un biomarcador para la detección del cáncer. Sin embargo, debido a que las mutaciones de P53 están presentes en una amplia variedad de cánceres, su presencia no informará sobre la naturaleza del cáncer primario. Será evidente para los expertos en la técnica que la presente invención es útil para determinar el sitio del desarrollo del cáncer cuando el cáncer per se ha sido detectado por otro método utilizando cualquier biomarcador o por motivos sintomáticos, independientemente de ese método de detección. Por lo tanto, la presente invención es un ensayo secundario útil en pacientes previamente diagnosticados con cáncer pero que desconocen el origen, el sitio o la ubicación de la enfermedad.

Las referencias a "factor de transcripción" se refieren a proteínas que se unen al ADN y regulan la expresión génica estimulando (es decir, activadores) o suprimiendo (es decir, represores) la transcripción. Los factores de transcripción contienen uno o más dominios de unión al ADN (“DNA-binding domains”, DBD), que se unen a secuencias específicas de ADN adyacentes a los genes que regulan.

La expresión "factor de transcripción específico de tejido" como se describe en el presente documento se refiere a un factor de transcripción que siempre o habitualmente se expresa en ciertos tejidos o cánceres, mientras que rara vez o nunca se expresa en otros tejidos o cánceres. Dichos factores de transcripción específicos de tejido solo pueden expresarse en un número limitado de tejidos o tipos de cáncer, como solo en uno, dos, tres, cuatro o cinco tejidos o tipos de cáncer. La presencia o el nivel del aducto de nucleosoma-factor de transcripción libre de células en la circulación indica la muerte celular de las células que expresan ese factor de transcripción, y su especificidad de tejido puede usarse como biomarcador para indicar el tejido de origen como el sitio primario de desarrollo del tumor.

El término "cofactor" o la expresión ''cofactor del factor de transcripción" como se describen en el presente documento se refieren a proteínas que modulan los efectos de los factores de transcripción. Muchos factores de transcripción se unen a su secuencia de ADN diana solo en presencia de estos cofactores colaboradores que modulan la unión y, a veces, participan en el reclutamiento del complejo de preiniciación y la ARN polimerasa. Las referencias a realizaciones que implican factores de transcripción, como se usa en el presente documento, pueden aplicarse igualmente a cofactores.

Además, se han descrito combinaciones específicas de tejido de factores de transcripción y/o cofactores de transcripción en las que los factores de transcripción, que pueden no ser específicos de tejido en términos de su propia expresión, regulan la expresión génica específica de tejido a través del control del factor de transcripción combinatorio que es específico de tejido. Por tanto, la unión de dos o más factores o cofactores de transcripción, cuya expresión individual puede no ser específica de tejido, puede de hecho regular la expresión de un gen específico de tejido, cuando la expresión del gen requiere la presencia de ambos o múltiples factores o cofactores de transcripción. Por lo tanto, las referencias a factores y cofactores de transcripción "específicos de tejido" incluyen combinaciones de factores y/o cofactores de transcripción que trabajan en conjunto para lograr la especificidad del tejido, es decir, en una realización, los aspectos descritos en el presente documento comprenden detectar una combinación de factores y/o cofactores de transcripción que son específicos de tejido.

El término "biomarcador" significa un indicador biológico u obtenido biológicamente distintivo de un proceso, acontecimiento o condición. Los biomarcadores pueden usarse en métodos de diagnóstico diferencial de cáncer, por ejemplo, la evaluación del pronóstico y en el seguimiento de los resultados de la terapia, identificando a los pacientes con más probabilidades de responder a un tratamiento terapéutico particular, la detección y el desarrollo de fármacos. Los biomarcadores y sus usos son valiosos para la identificación de nuevos tratamientos farmacológicos y para el descubrimiento de nuevas dianas para el tratamiento farmacológico.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona el uso de un aducto de factor de transcripción-nucleosoma o cofactor de transcripción-nucleosoma específicos de tejido como un biomarcador en sangre para la identificación o diagnóstico del sitio de un cáncer primario que se detectó en un sujeto sin conocimiento del sitio de ese cáncer. En una realización, se sospecha la presencia de un cáncer en un sujeto por razones sintomáticas (es decir, basándose en los síntomas del paciente) y la invención se usa para confirmar la presencia y/o el sitio, la posición o la ubicación del órgano del cáncer.

La presente invención tiene como objetivo la detección de factores o cofactores de transcripción específicos de tejido que están unidos a nucleosomas en un fluido corporal. Esto se puede hacer tomando una muestra de un fluido corporal de un sujeto y realizando un ensayo ELISA de doble anticuerpo en la que un anticuerpo se dirige a unirse a nucleosomas y el otro se dirige a unirse al factor o cofactor de transcripción específico de tejido unido o aducido a un nucleosoma. Sin embargo, el anticuerpo dirigido a unirse al nucleosoma no necesita dirigirse al complejo de nucleosoma completo, sino que puede dirigirse a una parte componente del nucleosoma. En esta realización de la invención, el anticuerpo empleado para unirse al nucleosoma puede dirigirse para unirse a cualquier parte componente de un nucleosoma, incluyendo, por ejemplo, a una histona particular, una modificación de histona, una variante o una isoforma de histona o al ADN o a un nucleótido particular, como la 5-metilcitosina. De manera similar, el anticuerpo empleado para unirse al factor de transcripción específico de tejido puede dirigirse para unirse a cualquier parte componente o dominio del factor de transcripción. Cuando el factor de transcripción es un complejo de proteínas que consta de múltiples proteínas, cualquiera de estas puede ser la diana del anticuerpo de manera similar.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos, o un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma;

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma cuando el primer agente de unión se une al nucleosoma o un componente del mismo, o dicho segundo agente de unión se une a un nucleosoma o componente del mismo cuando el primer agente de unión se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido, nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra;

en el que la presencia o el nivel del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma se usa como indicador de la presencia y/o sitio de desarrollo de dicho cáncer.

Según un aspecto de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos;

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido en la muestra;

en el que la presencia o nivel del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma se usa como indicador de la presencia y/o sitio de desarrollo de dicho cáncer.

Será evidente para los expertos en la técnica que el agente de unión de detección puede seleccionarse para que se dirija a unirse al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido o al nucleosoma o una parte componente del nucleosoma.

Por lo tanto, según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

(i) poner en contacto una muestra biológica obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma;

(ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a los nucleosomas o un componente de los mismos; y

(iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión a nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra;

en el que la presencia o nivel del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma se usa como indicador de la presencia y/o sitio de desarrollo de dicho cáncer.

Los métodos de la presente invención también se pueden usar en un sujeto que ha sido diagnosticado previamente con cáncer.

Como se señaló anteriormente, puede conferirse especificidad de tejido a los factores de transcripción mediante la unión cooperativa con uno o varios otros factores o cofactores de transcripción, y estos múltiples cofactores pueden tener una ubicación conjunta en un sitio en el genoma (por ejemplo, ver Zhang y Glass, 2013; y Yu et al., 2006). Esto significa que la digestión de la cromatina tras la muerte celular dará lugar a fragmentos de cromatina que contienen múltiples factores de transcripción. Dichos fragmentos de cromatina pueden incluir múltiples factores de transcripción en presencia o ausencia de un nucleosoma. Los fragmentos de cromatina que incluyen múltiples factores de transcripción pueden usarse en aspectos adicionales de la invención.

Si bien la ubicación conjunta de factores de transcripción y cofactores a menudo ocurre debido a la ubicación conjunta de sus respectivos sitios de unión al ADN en el genoma, la ubicación conjunta de factores y cofactores de transcripción cuyos sitios de unión están más separados también puede ocurrir debido a la formación de bucles en el ADN, cuando los sitios más distales se unen para la regulación génica. Será evidente para los expertos en la técnica que los fragmentos de cromatina también pueden contener combinaciones específicas de tejido de factores y cofactores de transcripción resultantes de tales bucles.

La expresión "fragmento de cromatina", como se usa en el presente documento, se refiere a un complejo de proteínas y ácido nucleico cuyo origen se encuentra en el cromosoma de una célula. Un fragmento de cromatina puede contener un nucleosoma y/o ADN asociado y/o cualquiera de una gran variedad de proteínas asociadas a cromatina que no son histonas en un complejo de múltiples proteínas y ácido nucleico. Algunos ejemplos de proteínas asociadas a cromatina que no son histonas incluyen factores de transcripción, cofactores, coactivadores, correpresores, restos de ARN polimerasa, factores de alargamiento, factores de remodelación de cromatina, mediadores, restos STAT, factor de unión cadena arriba (“upstream binding factor”, UBF) y otros.

Se entenderá que los fragmentos de cromatina que incluyen un factor o cofactor de transcripción (específico de tejido) que confiere especificidad de tejido son, en sí mismos, específicos de tejido. De manera similar, los fragmentos de cromatina que incluyen una combinación específica de tejido de dos o más factores o cofactores de transcripción que confieren especificidad al tejido son, en sí mismos, específicos del tejido. Por lo tanto, la expresión "fragmento de cromatina específico de tejido" como se describe en el presente documento se refiere a un fragmento de cromatina que incluye un factor o cofactor de transcripción específico de tejido, o incluye una combinación específica de tejido de dos o más factores o cofactores de transcripción.

La unión simultánea de dos o más factores de transcripción o cofactores a un solo gen o locus de promotor génico puede ser específica para un solo tejido o para un número limitado de tejidos. Cuando se produce dicha unión simultánea específica de tejido de factores y/o cofactores de transcripción, los motivos de unión suelen estar muy próximos y separados por menos de 200 pares de bases.

Tales factores colaboradores pueden conferir especificidad de tejido a las acciones de muchos factores de transcripción dependientes de señales que, en sí mismos, son expresados ampliamente. Los ejemplos incluyen miembros de diversas familias de factores de transcripción que son activados por señales extracelulares a través de receptores de la superficie celular que incluyen, sin limitación, receptores de hormonas nucleares, factores de transcripción STAT, miembros de la familia NF-^k B, CREB y otros. Por tanto, los receptores de la superficie celular ampliamente expresados pueden regular una variedad de genes diferentes en diferentes tejidos, cada uno de una manera específica de tejido. Los ejemplos informados incluyen la regulación del receptor de andrógenos de la transcripción de genes específicos de la próstata en colaboración con el factor de transcripción FoxA1, la transcripción de genes específicos del riñón en colaboración con el factor de transcripción Hnf4a y la transcripción de genes específicos del epidídimo en colaboración con el factor de transcripción AP-2a (Pihlajamaa , 2014). Se han informado ejemplos similares para otros receptores de hormonas nucleares en Levy etal., 2007; Zhao etal., 2010; y Zhang y Glass, 2013;

Se conoce un gran número de combinaciones específicas de tejidos de factores y cofactores de transcripción adecuados para su uso en la invención y se pueden encontrar en bases de datos disponibles públicamente que incluyen, por ejemplo, la base de datos de expresión y regulación génica específica de tejidos (TiGER) desarrollada por el Laboratorio de Bioinformática en el Wilmer Eye Institute de la Universidad Johns Hopkins. A continuación, se muestran tres pares de ejemplo de factores o cofactores de transcripción, cada uno con especificidad de tejido para una variedad de tejidos (incluido el sistema nervioso periférico (SNP) y la glándula mamaria (mamaria)):

Resultará claro para los expertos en la técnica que los factores y/o cofactores de transcripción libres de células específicos de tejido, y combinaciones de los mismos, en fluidos biológicos pueden considerarse biomarcadores específicos de tejido de origen celular o cromatínico, estén o no unidos al nucleosoma o al ADN. Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un biomarcador de factor o cofactor de transcripción libre de células específico de tejido, o un panel de dichos biomarcadores, en un fluido biológico. En este aspecto de la invención, se puede emplear cualquier método para detectar un factor o cofactor de transcripción libre de células, incluidos, entre otros, métodos de inmunoensayo de un solo anticuerpo (u otro ligante), métodos de inmunoensayo de anticuerpo doble (u otro ligante), métodos de espectrofotometría de masas, métodos de ChIP o cualquier otro método analítico adecuado. La presencia o el nivel del factor/cofactor de transcripción, o un panel del mismo, en el fluido biológico se usa para indicar la presencia o el nivel de un cáncer y/o su sitio de desarrollo.

Será evidente para los expertos en la técnica que puede usarse una amplia variedad de métodos de análisis inmunoquímicos y de otro tipo para medir fragmentos de cromatina específicos de tejido, incluidos aductos de factor de transcripción-nucleosoma y/o cofactor de transcripción-nucleosoma junto con la presente invención. También son adecuados una variedad de métodos de biología molecular para su uso junto con la presente invención, que incluyen, por ejemplo, sin limitación, métodos basados en la inmunoprecipitación de la cromatina (ChIP) u otros métodos para el análisis de material de cromatina. Los métodos no inmunoquímicos incluyen cualquier método cromatográfico o de espectrometría de masas y cualquier método que implique la disociación de un aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido y la medición del factor de transcripción específico de tejido disociado por medios inmunoquímicos, cromatográficos, espectrofotométricos de masas u otros medios. Los métodos para disociar complejos o aductos de proteínas y complejos o aductos de proteína-ácido nucleico son bien conocidos en la técnica, por ejemplo, sin limitación; exponiendo dichos aductos a medios de pH ácido o básico o a altas concentraciones de sal, o por métodos mecánicos o de sonicación o por digestión biológica u otros métodos basados en enzimas.

Los factores de transcripción que se unen directamente a su ADN nucleosómico diana se denominan en la técnica factores de transcripción pioneros. Sin embargo, muchos factores de transcripción se unen a su secuencia de ADN diana solo en presencia de cofactores colaboradores que modulan la unión y también pueden conferir mayor especificidad de tejido. Por ejemplo; FoxA1 es un cofactor necesario para la unión del receptor de andrógenos (AR) al elemento de respuesta de andrógenos (ARE) en el tejido prostático y para la unión del receptor de estrógeno (AR) al elemento de respuesta de estrógenos (ERE) en el cáncer de mama. Por tanto, en una realización de la invención, se mide un cofactor (de un factor de transcripción) unido a un nucleosoma libre de células y se usa para identificar el sitio de desarrollo de un cáncer. El factor de transcripción también puede, o no, estar unido al nucleosoma con el cofactor. El cofactor unido al nucleosoma libre de células puede medirse en presencia o ausencia del factor de transcripción.

En una realización, el cofactor específico de tejido es FoxA1. Si el cofactor es FoxA1, el sitio de desarrollo de un cáncer puede seleccionarse entre: mama y próstata.

En una realización preferida, el factor de transcripción específico de tejido se selecciona de: GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 (TP63) o P40. La tabla 1 enumera los tumores asociados con estos factores de transcripción en el tejido canceroso.

Tabla 1: Ejemplos de factores de transcripción específicos de tejido y sus tumores asociados en tejido canceroso

Los ejemplos de la tabla 1 no son exhaustivos. La especificidad de tejido de los niveles de aductos del factor de transcripción del nucleosoma detectados en los fluidos corporales mediante los métodos de la invención puede a veces diferir de los niveles de expresión del factor de transcripción en el tejido canceroso.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es GATA 3 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: mama, glándula salival, carcinomas de células de transición y tumores anexiales de la piel.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es CDX2 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: carcinomas colorrectales y gástricos.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es TTF-1 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: adenocarcinoma de pulmón, carcinoma colorrectal, carcinomas de tiroides y neuroendocrinos.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es PAX8 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: Carcinoma de células ginecológico, tiroideo y renal.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es WT1 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: ovario y mesotelioma.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es NKX3.1 y el sitio de desarrollo de un cáncer es la próstata.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es P63 (TP63) y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: carcinomas de células escamosas, carcinomas de células de transición, timoma, glándulas salivales y tumores trofoblásticos.

En una realización, dicho factor de transcripción específico de tejido es P40 y el sitio de desarrollo de un cáncer se selecciona de: carcinomas de células escamosas, carcinomas de células de transición, timoma, glándulas salivales y tumores trofoblásticos.

El método se puede realizar usando un anticuerpo dirigido al nucleosoma mismo en combinación con un anticuerpo dirigido a unirse al factor de transcripción específico de tejido aducido al nucleosoma o usando un anticuerpo dirigido a un componente de un nucleosoma, nuevamente en combinación con un anticuerpo dirigido para unirse al factor de transcripción específico de tejido aducido al nucleosoma.

En una realización, el agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos, está dirigido a unirse a una histona particular, una modificación de histona, una variante o una isoforma de histona, o un nucleótido particular.

La expresión "agente de unión" se refiere a ligandos o ligantes, tales como compuestos naturales o sintetizados químicamente, capaces de unirse específicamente a un biomarcador (es decir, un nucleosoma o factor de transcripción específico de tejido aducido al nucleosoma). Un ligando o ligante según la invención puede comprender un péptido, un anticuerpo o un fragmento del mismo, o un ligando sintético, tal como un anticuerpo plástico, o un aptámero u oligonucleótido, capaz de unirse específicamente al biomarcador. El anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal o un fragmento del mismo capaz de unirse específicamente a la diana. Un ligando o ligante según la invención puede marcarse con un marcador detectable, tal como un marcador luminiscente, fluorescente, enzimático o radiactivo; como alternativa, o adicionalmente, un ligando según la invención puede marcarse con un marcador de afinidad, por ejemplo, un marcador de biotina, avidina, estreptavidina o His (por ejemplo, hexa-His). En una realización, el agente de unión se selecciona de: un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un aptámero. En una realización adicional, el agente de unión utilizado es un anticuerpo. Los términos "anticuerpo", "agente de unión" o "aglutinante" se usan indistintamente en el presente documento.

En una realización, la muestra es un fluido biológico (que se usa indistintamente con la expresión "fluido corporal" en el presente documento). La muestra de líquido puede ser cualquier muestra de líquido biológico obtenida de un sujeto que incluye, sin limitación, líquido cefalorraquídeo (LCR), sangre completa, suero sanguíneo, plasma, sangre menstrual, líquido endometrial, orina, saliva u otro líquido corporal (heces, lágrimas, líquido sinovial, esputo), aliento, por ejemplo, como aliento condensado, o un extracto o purificación del mismo, o dilución del mismo. Las muestras biológicas también incluyen muestras obtenidas de un sujeto vivo o tomadas post mortem. Las muestras pueden prepararse, por ejemplo, cuando sea apropiado, diluirse o concentrarse, y almacenarse de la manera habitual. En una realización adicional, la muestra de fluido biológico se selecciona de: sangre o suero o plasma. Será evidente para los expertos en la técnica que la detección de aductos de nucleosomas en un fluido corporal tiene la ventaja de ser un método mínimamente invasivo que no requiere biopsia.

En una realización, el sujeto es un sujeto mamífero. En una realización adicional, el sujeto se selecciona de un sujeto humano o animal (tal como un ratón).

En una realización, el nucleosoma es un mononucleosoma u oligonucleosoma libre de células.

Se entenderá que los usos y métodos de la invención pueden realizarse in vitro y/o ex vivo.

En una realización de la invención, la presencia o el nivel de uno o más factores de transcripción específicos de tejido en un fragmento de cromatina o aducidos a un nucleosoma en una muestra se usa para determinar el régimen de tratamiento óptimo para un sujeto que necesita tal tratamiento. Una persona experta en la técnica entenderá que el fragmento de cromatina o el aducto del factor de transcripción-nucleosoma específico de tejido se puede usar para identificar el sitio, la posición y/o la ubicación del órgano del cáncer que se puede usar para determinar el tratamiento óptimo, es decir, basado en el origen/ubicación del cáncer.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para evaluar la idoneidad de un sujeto animal o humano para un tratamiento médico que comprende las etapas de:

(i) detectar o medir uno o más factores o cofactores de transcripción específicos de tejido en un fragmento de cromatina o aducidos a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto; y

(ii) usar el tipo de factor o cofactor de transcripción específico de tejido en un fragmento de cromatina o aducido al nucleosoma detectado para determinar un tratamiento adecuado para el sujeto.

Según un aspecto adicional de la invención, se proporciona un método para controlar un tratamiento de un sujeto animal o humano que comprende las etapas de:

(i) detectar o medir uno o más factores o cofactores de transcripción específicos de tejido en un fragmento de cromatina o aducidos a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto;

(ii) repetir la detección o medición de uno o más factores o cofactores de transcripción específicos de tejido en un fragmento de cromatina o aducidos a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto en una o más ocasiones; y

(iii) usar cualquier cambio en el nivel de uno o más factores o cofactores de transcripción específicos de tejido en un fragmento de cromatina o aducido a un nucleosoma detectado como un parámetro para cualquier cambio en la condición del sujeto.

Un cambio en el nivel del fragmento de cromatina o aducto de nucleosoma- factor o cofactor de transcripción específico de tejido en la muestra de ensayo en relación con el nivel en una muestra de ensayo anterior tomada anteriormente del mismo sujeto de ensayo puede ser indicativo de un efecto beneficioso, por ejemplo, estabilización o mejora de dicha terapia sobre el trastorno o sospecha de trastorno. Además, una vez que se ha completado el tratamiento, el método de la invención puede repetirse periódicamente para controlar la recurrencia de una enfermedad.

En una realización, el fragmento de cromatina o el aducto del nucleosoma del factor de transcripción específico de tejido se detecta o mide como una de un panel de mediciones. Por ejemplo, el aducto del nucleosoma del factor de transcripción específico de tejido podría detectarse con otros biomarcadores que son específicos para el mismo tejido, por ejemplo, en combinación con los marcadores específicos de tejido descritos en Kandalaft y Gown, 2015.

En una realización adicional de la invención, se proporciona un método para detectar o diagnosticar el tipo de enfermedad cancerosa para evaluar el tipo de cáncer óptimo al que debe dirigirse un fármaco u otra opción de tratamiento, que comprende ensayar una muestra tomada de un sujeto en el que se ha diagnosticado un cáncer para detectar la presencia o el nivel de un factor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma como parte de un panel de ensayos.

Por tanto, tal panel de ensayos puede consistir, por ejemplo, en dos o más o múltiples mediciones de aductos de nucleosomas que contienen diferentes factores de transcripción específicos de tejido.

El diagnóstico diferencial eficiente de los tipos de cáncer y los métodos de seguimiento brindan "soluciones para el paciente" muy poderosas con el potencial de mejorar el pronóstico, al establecer el diagnóstico correcto, lo que permite una rápida identificación del tratamiento más apropiado (disminuyendo así la exposición innecesaria a los efectos secundarios dañinos de los medicamentos), y reducir las tasas de recaída.

Se entenderá que la identificación y/o cuantificación se puede realizar mediante cualquier método adecuado para identificar la presencia y/o cantidad de una proteína específica en una muestra biológica de un paciente o una purificación o extracto de una muestra biológica o una dilución de la misma. En los métodos de la invención, la cuantificación se puede realizar midiendo la concentración del biomarcador en la muestra o muestras. Las muestras biológicas que pueden ensayarse en un método de la invención incluyen las definidas anteriormente en el presente documento. Las muestras pueden prepararse, por ejemplo y cuando sea apropiado, diluirse o concentrarse, y almacenarse de la manera habitual.

La identificación y/o cuantificación de biomarcadores se puede realizar mediante la detección del biomarcador o de un fragmento del mismo, por ejemplo, un fragmento con truncamiento C-terminal, o con truncamiento N-terminal. Los fragmentos tienen adecuadamente más de 4 aminoácidos de longitud, por ejemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 aminoácidos de longitud.

El biomarcador puede detectarse directamente, por ejemplo, mediante SELDI o MALDI-TOF. Como alternativa, el biomarcador puede detectarse directa o indirectamente mediante la interacción con un ligando o ligandos, tales como un anticuerpo o un fragmento de unión a biomarcador del mismo, u otro péptido o ligando, por ejemplo, aptámero, u oligonucleótido, capaz de unirse específicamente al biomarcador. El ligando o ligante puede poseer un marcador detectable, tal como un marcador luminiscente, fluorescente o radiactivo y/o un marcador de afinidad.

Por ejemplo, la detección y/o cuantificación se puede realizar mediante uno o más métodos seleccionados del grupo que consiste en: SELDI (-TOF), MALDI (-TOF), un análisis basado en gel unidimensional, un análisis basado en gel bidimensional, espectrometría de masas (MS), LC en fase inversa (“reverse phase”, RP), permeación por tamaño (filtración en gel), intercambio iónico, afinidad, HPLC, UPLC y otras técnicas basadas en LC o LC MS. Las técnicas de Lc -MS apropiadas incluyen ICAT® (Applied Biosystems, CA, EE. UU.) o iTRAQ® (Applied Biosystems, CA, EE. UU.). También se podría utilizar cromatografía líquida (por ejemplo, cromatografía líquida de alta presión (HPLC) o cromatografía líquida de baja presión (LPLC)), cromatografía en capa fina, espectroscopia de RMN (resonancia magnética nuclear).

Los métodos de diagnóstico diferencial de cáncer o de control según la invención pueden comprender analizar una muestra mediante SELDI TOF o MALDI TOF para detectar la presencia o el nivel del biomarcador. Estos métodos también son adecuados para el pronóstico, el control de los resultados de la terapia, la identificación de los pacientes con mayor probabilidad de responder a un tratamiento terapéutico particular, la detección y el desarrollo de fármacos, y la identificación de nuevas dianas para el tratamiento con fármacos.

La identificación y/o cuantificación de los biomarcadores de analitos se puede realizar usando un método inmunológico, que implica un anticuerpo o un fragmento del mismo capaz de unirse específicamente al biomarcador. Los métodos inmunológicos adecuados incluyen inmunoensayos en sándwich, tales como ELISA en sándwich, en los que la detección de los biomarcadores de analitos se realiza utilizando dos anticuerpos que reconocen diferentes epítopos en un biomarcador de analito; radioinmunoensayos (RIA), ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) directos, indirectos o competitivos, inmunoensayos enzimáticos (EIA), inmunoensayos de fluorescencia (FIA), transferencia Western, inmunoprecipitación y cualquier inmunoensayo basado en partículas (por ejemplo, utilizando partículas de oro, plata o látex , partículas magnéticas o puntos Q). Los métodos inmunológicos se pueden realizar, por ejemplo, en placa de microtitulación o en formato de tira.

Los inmunoensayos de la invención incluyen ensayos inmunométricos que emplean métodos de detección de enzimas (por ejemplo ELISA), ensayos inmunométricos marcados con fluorescencia, ensayos inmunométricos marcados con fluorescencia de resolución temporal, ensayos inmunométricos quimioluminiscentes, ensayos inmunoturbidimétricos, ensayos inmunométricos marcados con partículas y ensayos inmunorradiométricos y métodos de inmunoensayo competitivo que incluyen métodos de inmunoensayo competitivo de antígeno marcado y de anticuerpo marcado con una variedad de tipos de marcadores, incluidos marcadores radiactivos, enzimáticos, fluorescentes, fluorescentes de resolución temporal y de partículas. Algunos inmunoensayos emplean métodos para detectar la unión de anticuerpos directamente sin el uso de restos marcados. Todos dichos métodos de inmunoensayo son bien conocidos en la técnica, véanse, por ejemplo, Salgame et al., 1997 y van Nieuwenhuijze et al., 2003.

También se describe en el presente documento un kit para la detección de un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma que comprende un ligando o ligante específico para el factor de transcripción específico de tejido y otro ligando o ligante específico para un nucleosoma o parte componente del mismo, junto con instrucciones de uso del kit según los métodos descritos en el presente documento.

Se describe además un kit para la detección de un fragmento de cromatina específico de tejido que comprende un ligando o ligante específico para un primer factor o cofactor de transcripción y otro ligando o ligante específico para un segundo factor o cofactor de transcripción, junto con instrucciones de uso del kit. de acuerdo con los métodos descritos en el presente documento.

Los inventores usaron un anticuerpo anti-histona como anticuerpo de detección para los ensayos descritos en el presente documento, en combinación con un anticuerpo anti-factor de transcripción específico de tejido específico apropiado como anticuerpo de captura. Los inventores utilizaron los ensayos para demostrar que los aductos de nucleosomas que contienen factores de transcripción específicos de tejido específicos pueden medirse en muestras de sangre tomadas de sujetos con cáncer y son discriminantes para su uso como biomarcadores no invasivos o mínimamente invasivos.

Será evidente para los expertos en la técnica que los usos y métodos de la presente invención pueden usarse para detectar o medir cualquier factor o cofactor de transcripción específico de tejido que pueda estar unido a nucleosomas.

Los inventores concluyeron que el método de la presente invención es un método exitoso para la detección y medición de fragmentos de cromatina específicos de tejido y aductos de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido, y que este método es un método mejor para la detección no invasiva de un cáncer en un sujeto y/o para la identificación de un tumor primario detectado por otro método de detección de cáncer (por ejemplo, por métodos de secuencia de ADNtc) o en CUP.

La invención se describirá ahora con más detalle con referencia a los siguientes ejemplos no limitantes.

Ejemplo 1

Se tomaron muestras de suero de 1 sujeto sano, 2 sujetos con cáncer de mama y 2 sujetos con cáncer de vejiga urotelial urinario (un cáncer de células de transición que se sabe que da resultados positivos en los ensayos de expresión en tejido canceroso de GATA 3). Se adquirió un kit ELISA de 96 pocillos disponible en el mercado para uso exclusivo en investigación para GATA 3 que incluía un anticuerpo en fase sólida para el factor de transcripción GATA 3 que reviste los pocillos de microtitulación. GATA 3 es un factor de transcripción específico de tejido expresado en todas o la mayoría de las muestras de material de biopsia tomadas de cánceres de mama, que también es positivo en carcinomas de células de transición y tumores anexiales de piel, pero no en la mayoría de las muestras de otros cánceres. Se usó el anticuerpo de GATA 3 en fase sólida junto con un anticuerpo antinucleosoma biotinilado, en un ELISA de doble anticuerpo para GATA 3 unido a nucleosomas libres de células de la siguiente manera: la muestra de suero (50 gl) y el tampón de ensayo (50 gl) se agregaron a un pocillo revestido con anticuerpo anti-GATA 3 y se incubaron a temperatura ambiente (aproximadamente 20 °C) con agitación durante 2,5 horas. A continuación, se retiró la muestra y se añadió anticuerpo antinucleosoma biotinilado (100 gl) y se incubó durante 1,5 horas. Se retiró la disolución de anticuerpo biotinilado y se lavó el pocillo 3 veces con tampón de lavado (200 gl). Se añadió al pocillo una disolución de conjugado de estreptavidina-HRP y se incubó durante 30 minutos. El pocillo se lavó 3 veces más y se añadió disolución de sustrato de HRP (100 gl de disolución de sal de diamonio de 2,2'-azinobis[ácido 3-etilbenzotiazolin-6-sulfónico]) y se incubó durante 20 minutos. Se añadió una disolución STOP (50 gl) y se determinó la densidad óptica (DO) del pocillo a 405 nm.

Se observó una señal de ELISA mayor, y un nivel mayor de aducto de nucleosoma libre de células circulante-GATA 3 en muestras tomadas de 2 de los 3 sujetos con cáncer de mama que en el sujeto sano o el control negativo. Uno de los dos sujetos con un cáncer de células de transición también presentó un nivel de DO elevado frente al sujeto sano. Los resultados se muestran en la figura 1 e ilustran que un ensayo de aducto de GATA 3-nucleosoma en suero puede usarse para detectar un cáncer y/o para identificar un cáncer de sitio primario de desarrollo desconocido cuando es un cáncer de mama, y que el aducto de nucleosoma-GATA 3 se puede utilizar como biomarcador para este propósito.

Ejemplo 2

Se tomaron muestras o suero de 2 sujetos con cáncer de tiroides, 3 sujetos con cáncer de pulmón y 1 sujeto sano. Se adquirió un kit ELISA de 96 pocillos disponible en el mercado para uso exclusivo en investigación para TTF-1 que incluía un anticuerpo en fase sólida para TTF-1 (factor de transcripción tiroideo 1) que reviste los pocillos de microtitulación. TTF-1 es un factor de transcripción específico de tejido expresado en todas o la mayoría de las muestras de material de biopsia tomadas de cánceres de tiroides y pulmón, pero no en la mayoría de las muestras de otros cánceres. Se utilizó el anticuerpo de TTF-1 en fase sólida junto con un anticuerpo antinucleosoma biotinilado en un ELISA de doble anticuerpo para TTF-1 unido a nucleosomas libres de células como se describe en el ejemplo 1.

Se observó una señal de ELISA mayor, y un nivel mayor de aducto de TTF-1-nucleosoma libre de células circulante en muestras tomadas de pacientes con cáncer de tiroides que en el sujeto sano o el control negativo. El nivel de aducto de TTF-1-nucleosoma libre de células circulante en la sangre de pacientes con cáncer de pulmón era ligeramente elevado. Los resultados se muestran en la figura 2.

En un experimento posterior, se analizaron muestras de suero de 3 sujetos sanos, así como muestras de sujetos diagnosticados con cáncer de tiroides, pulmón, páncreas, recto, colon y mama para determinar el nivel de aducto de TTF-1-nucleosoma libre de células circulante para determinar la especificidad de tejido del ensayo. El resultado para el único paciente con cáncer de tiroides analizado fue muy positivo. Los niveles en los 4 pacientes con cáncer de pulmón, los 3 pacientes con cáncer de páncreas y 2 de 3 pacientes con cáncer de mama fueron bajos. Asombrosamente, se descubrieron niveles elevados en los 6 pacientes con cáncer colorrectal, lo que indica que los niveles de aductos de TTF-1-nucleosoma libre de células circulante pueden usarse para identificar cánceres de sitio primario desconocido, como cánceres primarios colorrectales. Esto indica que la especificidad de tejido de los niveles de aducto de nucleosoma-factor de transcripción libre de células circulante en la sangre puede no ser necesariamente la misma que la especificidad de los niveles de expresión del factor de transcripción en los tejidos cancerosos extraídos en la biopsia. Los resultados se muestran en la figura 3.

Quedará claro para los expertos en la técnica que se puede usar un ensayo de aducto de nucleosoma-TTF-1 para detectar un cáncer o para identificar un cáncer de sitio primario de desarrollo desconocido cuando es un cáncer de tiroides o colorrectal y que el aducto de nucleosoma-TTF-1 se puede utilizar como biomarcador para este propósito.

Ejemplo 3

Se tomaron muestras de suero de 3 sujetos sanos, 1 sujeto diagnosticado con cáncer de tiroides, 3 sujetos con cáncer de pulmón, 3 sujetos con cáncer de páncreas, 6 sujetos con cáncer colorrectal (3 con cáncer de colon y 3 con cáncer rectal) y 3 sujetos con cáncer de mama. Se adquirió un kit ELISA de 96 pocillos disponible en el mercado para uso exclusivo en investigación para CDX2 que incluía un anticuerpo en fase sólida para CDX2 (factor de transcripción homeobox 2 de tipo caudal) que reviste los pocillos de microtitulación. CDX2 es un factor de transcripción específico de tejido expresado en todas o la mayoría de las muestras de material de biopsia tomadas de cánceres colorrectales, pero no en la mayoría de las muestras de otros cánceres. Se usó el anticuerpo CDX2 en fase sólida junto con un anticuerpo antinucleosoma biotinilado, en un ELISA de doble anticuerpo para CDX2 unido a nucleosomas libres de células como se describe en el ejemplo 1.

Se observó una señal de ELISA mayor y un nivel mayor de aducto de CDX2-nucleosoma libre de células circulante en muestras tomadas de pacientes con cáncer colorrectal que en sujetos sanos o en sujetos con otros cánceres o el control negativo. Un sujeto sano y un sujeto con cáncer de mama también presentaban niveles elevados que pueden ser resultados falsos positivos. Los resultados se muestran en la figura 4 e indican que los niveles de aductos de CDX2-nucleosoma libre de células circulante pueden usarse para detectar un cáncer o para identificar un cáncer de sitio primario de desarrollo desconocido cuando es un cáncer colorrectal, y que el aducto de nucleosoma-CDX2 puede utilizarse como biomarcador para este fin.

Los inventores desarrollaron con éxito tres prototipos de ensayos de aductos de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido libre de células y los tres exhibieron utilidad clínica para identificar el cáncer de sitio primario desconocido cuando un sujeto ya había sido diagnosticado con cáncer. Es evidente que se trata de un efecto general y que se pueden desarrollar ensayos similares de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido para identificar una amplia gama de enfermedades de cáncer primario en las que se diagnostica o detecta cáncer, pero se desconoce el sitio de desarrollo del cáncer primario. Se sabe que se produce una expresión de factor de transcripción específico de tejido similar en muestras de tejido canceroso extraídas mediante cirugía o biopsia para muchos otros cánceres (Kandalaft y Gown, 2015). Será evidente para los expertos en la técnica que se pueden realizar ensayos análogos de aductos de nucleosomas libres de células basados en sangre u otros fluidos corporales similares a los descritos en los ejemplos 1-3 para fragmentos de cromatina específicos de tejido o aductos de nucleosoma-factor o cofactor de transcripción específico de tejido apropiados para detectar un cáncer o para identificar el cáncer de sitio primario desconocido para la amplia gama de cánceres para los que dichos factores de transcripción ya han sido identificados y/o cualquier cáncer en el que dicho factor de transcripción específico de tejido, cofactor de transcripción específico de tejido o combinación de expresión de factor y/o cofactor de transcripción específico de tejido pueda identificarse.

Se entenderá que las realizaciones descritas en el presente documento se pueden aplicar a todos los aspectos de la invención.

Referencias

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Claims (15)

1. REIVINDICACIONES

   1 Uso in vitro de un aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido o un aducto de nucleosomacofactor de transcripción específico de tejido como biomarcador en un fluido biológico para la detección o diagnóstico de un cáncer en un sujeto.
2. 2. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1, en el que el aducto de nucleosoma-factor de transcripción específico de tejido o el aducto de nucleosoma-cofactor de transcripción específico de tejido se usa para identificar el sitio de desarrollo del cáncer en el sujeto.
3. 3. - Un método para detectar un cáncer y/o determinar el sitio de desarrollo de un cáncer en un sujeto que comprende las etapas de:

   (i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos, o un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma;

   (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma cuando el primer agente de unión se une al nucleosoma o un componente del mismo, o dicho segundo agente de unión se une a un nucleosoma o componente del mismo cuando el primer agente de unión se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

   (iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido, nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra;

   en el que la presencia o el nivel del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma se usa como indicador del sitio de desarrollo de dicho cáncer.
4. 4. - El método como se define en la reivindicación 3, que comprende las etapas de:

   (i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos;

   (ii) poner en contacto los nucleosomas o la muestra con un segundo agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma; y

   (iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión al factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido en la muestra.
5. 5. - El método como se define en la reivindicación 3, que comprende las etapas de:

   (i) poner en contacto una muestra de fluido biológico obtenida del sujeto con un primer agente de unión que se une a un factor o cofactor de transcripción específico de tejido;

   (ii) poner en contacto la muestra con un segundo agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos; y

   (iii) detectar o cuantificar la unión de dicho segundo agente de unión a nucleosomas o un componente de los mismos en la muestra.
6. 6. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que el cáncer es un cáncer primario.
7. 7. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 6, en el que el sujeto es un sujeto con cáncer metastásico de un cáncer de origen primario desconocido.
8. 8. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, o el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en el que el sujeto ha sido diagnosticado previamente con cáncer.
9. 9. - El uso in vitro o método según se define en la reivindicación 8, en el que el sujeto ha sido diagnosticado previamente con cáncer usando ADN tumoral circulante (ADNtc) como biomarcador.
10. 10. - El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 9, en el que el agente de unión es un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo o un aptámero.
11. 11. - El método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 10, en el que el agente de unión que se une a nucleosomas o un componente de los mismos, se dirige a unirse a una histona, una modificación de histona, una variante o isoforma de histona particular, o al ADN o un componente del mismo.
12. 12. - Un método para evaluar la idoneidad de un sujeto humano o animal para un tratamiento médico que comprende las etapas de:

    (i) detectar o medir un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto como se define en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11; y

    (ii) usar el tipo de factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma detectado para determinar un tratamiento adecuado para el sujeto.
13. 13. - Un método para controlar un tratamiento de un sujeto humano o animal que comprende las etapas de:

    (i) detectar o medir un factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto como se define en el método de una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 11;

    (ii) repetir la detección o medición del factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma en un fluido biológico del sujeto en una o más ocasiones; y

    (iii) usar cualquier cambio en el nivel de factor o cofactor de transcripción específico de tejido aducido a un nucleosoma detectado como un parámetro para cualquier cambio en la condición del sujeto.
14. 14. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, o el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 13, en el que el factor de transcripción específico de tejido se selecciona de: GATA 3, CDX2, TTF-1, PAX8, WT1, NKX3.1, P63 o P40.
15. 15. - El uso in vitro como se define en la reivindicación 1 o reivindicación 2, o el método como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 14, en el que el fluido biológico se selecciona de: sangre, suero o plasma.