FR2882754A1 - Methodes diagnostics et pronostics du cancer du sein utilisant liv21 - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne un nouveau test diagnostic et/ou pronostic pour le cancer du sein. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gène ou de la protéine LIV21 ainsi que leurs dérivés comme marqueurs diagnostics et pronostic du cancer du sein.

Description

METHODES DIAGNOSTICS ET PRONOSTICS DU CANCER DU SEIN UTILISANT LIV21.

DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte à un test diagnostic et pronostic pour le cancer du sein.

DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART

Le cancer du sein est un des plus communs chez la femme avec le cancer du colon. Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les femmes.

Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter le cancer du sein et ils ont seulement une valeur prédictive de 20%. Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques.

La glande mammaire est un de ces rares organes qui présentent des changements fonctionnels et morphologiques pendant la vie adulte, particulièrement pendant la grossesse, la lactation et l'involution. Quand les cellules épithéliales normales du sein se transforment, un nombre d'altérations génétiques peuvent entraîner une tumorigénèse et des métastases. Ces altérations affectent le contrôle de la croissance, la maintenance d'états différentiés et l'invasion. Identifier les gènes impliqués dans ces processus est essentiel pour comprendre comment le cancer du sein se développe et pour décliner les meilleures méthodes de pronostic et de traitement. Lors de chaque cycle menstruel, et spécialement pendant la grossesse, l'allaitement et l'involution, les cellules mammaires épithéliales traversent des cycles de prolifération, d'invasion, de différentiation et d'apoptose et de mort cellulaire. Les mécanismes qui régulent ces phénotypes cellulaires complexes sont peu connus. Récemment quelques progrès ont été faits pour élucider les mécanismes qui régulent l'expression génique spécifique de la glande mammaire et la transformation maligne des cellules épithéliales mammaires.

Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en oeuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles principales de ces régulateurs est la famille des facteurs de transcription de type EF. Ces protéines jouent un rôle central dans le contrôle de la division cellulaire en couplant la régulation des gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire aux signaux extracellulaires (mitogènes, inhibiteurs de la prolifération). Elle se comporte comme un oncogène en stimulant la prolifération des cellules tumorales.

Parmi les gènes exprimés, on trouve: - La sur-expression du facteur de transcription E4F1 et l'oncogène c-myc qui induisent 10 l'apoptose des cellules post mitotiques par accumulation de réactif oxygénés (Tanaka, 2002) - le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, bloque le cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994; Yonish-Rouach, 1996).

- la cycline Dl, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996; Pardo et al, 1996).

Il serait souhaitable de disposer de nouvelles méthodes diagnostic qui détecterait la présence de cancer avec plus de spécificité et qui permettrait la distinction entre les cellules cancéreuses agressives ayant une tendance à métastaser par rapport à celles plus localisées qui ont une faible probabilité de métastaser. Un marqueur qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité.

RESUME DE L'INVENTION La présente invention concerne un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie. Il s'agit d'un test diagnostic et d'un test pronostic pour le cancer du sein. Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation du gène ou de la protéine LIV21 ainsi que leurs dérivés comme marqueurs diagnostics et pronostics du cancer du sein. L'invention concerne donc la détection du produit ou du gène LIV21 avec un kit de diagnostic et de pronostic du cancer du sein comprenant des anticorps ou des sondes spécifiques de LIV21.

Un premier objectif de la présente invention est une méthode de détection et de pronostic du cancer du sein et de son potentiel métastatique.

Un aspect de la présente invention consiste en l'utilisation de LIV21 comme indicateur pronostic du cancer du sein. En effet, lorsque LIV21 est localisé dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène L1V21 est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du sein sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. L'efficacité d'un traitement du cancer du sein peut également être suivi par la tracabilité de cette protéine, de ses dérivés et des ratios avec les protéines associées.

Par ailleurs, la détection de la protéine kinase C epsilon (PKCs) est également intéressante puisqu'il a été déterminé que PKCs phosphoryle la protéine LIV21 pour la maintenir dans le cytoplasme. Ainsi, une augmentation significative de PKCs est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, le rapport LIV21 / PKCe augmente dans la fraction cytoplasmique de cellules cancéreuses.

En outre, la détection des protéines E2F1 et/ou E2F4 présente un intérêt. En effet, La protéine LIV21 forme un complexe avec E2F4 qui est capable d'inhiber l'expression du gène E2F1 dans le noyau, l'expression du gène E2F1 étant un signe de prolifération cellulaire. Ainsi, une diminution de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est indicative de la présence de cellules cancéreuses. De même, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses.

En conséquence, la présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de sein d'une patiente, cette méthode comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de sein de ladite patiente, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques.

Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCE), le gène E2F 1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCE, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine.

L'autre aspect de la présente invention est l'utilisation des protéines citées ci dessus 15 comme marqueurs de l'invasivité et de l'agressivité métastatique des cellules cancéreuses de sein.

Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm. L'ARNm peut être détecté par une analyse RT- PCR. Il peut également être 20 détecté par une analyse NoRthern blot.

Dans un mode de réalisation alternatif, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Par exemple, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot, par immunohistochimie, immunocytochimie, par radiographie ou par marquage à la péroxydase.

Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCE, une augmentation significative de PKCE est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ PKCE dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Une augmentation du rapport LIV21/ PKCE dans la fraction cytoplasmique est indicative de cellules cancéreuses.

Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans le noyau cellulaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F4 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine.

Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F 1 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine.

La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement.

Dans un mode de réalisation préféré, le produit d'expression du gène LIV21 est un polypeptide d'origine humaine comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2 ou de façon plus générale parmi les séquences peptidiques le caractérisant obtenues par NanoLC-ESI- MS (Figure 1E). Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend les deux séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2. De préférence, la protéine LIV21 a une séquence qui correspond à un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, et une séquence de nucléarisation. Elle présente un poids moléculaire apparent d'environ 50-51 kD par analyse en Western Blot (60 kD lorsqu'elle est sumoylée). Le polypeptide présente un point isoélectrique de 5,6 dans sa forme de 50-51 kD. Une digestion par la trypsine de la protéine LIV21 donne 54 peptides correspondant aux pics monoisotopiques parmi la totalité des peptides comme spécifiés Figure 1: Figure lA (analyse MALDI) ; Figure 1B (spectre sans lissage) ; Figure 1C (Tableau) ; Figure ID (Gel SDS PAGE).

Dans un mode de réalisation particulier, la méthode utilise un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide LIV21 humain. Plus particulièrement, l'anticorps peut se lier spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2. Par exemple, l'anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide LIV21 peut être un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide LIV21 humain, notamment un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2.

L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps spécifique de LIV21 pour le diagnostic du cancer du sein. De même, l'invention concerne l'utilisation d'une paire d'amorces ou d'une sonde spécifiques de LIV21 pour le diagnostic du cancer du sein. De préférence, le diagnostic est effectué ex vivo sur des échantillons d'un patient.

DESCRIPTION DES FIGURES

La Figure lA est le profil de la protéine LIV21 par Spectrométrie de masse (Maldi). La Figure 1B est le profil sans lissage. Figure 1C est un tableau. Figure ID représente un gel SDS PAGE.

Figure 1 E décrit la totalité des peptides caractérisés par Nano LC-ESI MS dont les peptides LIV21a et LIV21b. Le tableau décrit une expérience de NanoLC-ESI MS. La NanoLC permet la séparation des peptides issus de l'hydrolyse trypsique de la protéine. Les fragments peptidiques élués sont ionisés par électrospray, les ions formés détectés par spectrométrie de masse (Analyseur Q-TOF). Ces ions caractérisent pour chacun, un peptide spécifique de la protéine. Légende: BEGIN IONS: Ions de départ. PEPMASS: Masse peptidique. TITLE: Titre. Elution from X to Y period: x experiment: y = Elution de X à y période: x expérience: y. Charge not autodetermined = Charge non déterminée automatiquement.

Légende illustrée par la première page décrivant l'ion: masse moléculaire 523,25 Dalton. Titre: Elution de 29,15 à 29,23 correspond. au peptide élué entre 29,19 et 29,23 minutes. Cette molécule par ionisation donne l'ion dichargé (Charge=2+) : MH22+ de masse moléculaire m/z: 523,25 Dalton d'où la masse de la molécule M: 1044,51. La séquence peptidique de cet ion est déterminé par MSMS. Le spectre MSMS correspondant est défini par la colonne de nombres entre Begin ions et End ions qui correspond à une séquence d'acides aminés (chaque Acide Aminé ayant une masse spécifique excepté la Leucine et l'Isoleucine qui ont la même masse moléculaire). La première colonne avec un nombre à 4 décimales (l'ion fils: 86.1373) correspond à la masse des ions fils . La seconde colonne (I: 45) correspond à l'intensité de ces ions fils .

Figure 2: Expression de LIV21: Figure 2A. L'ARNm de LIV21 dans les tissus mammaires et dans les cellules MCF-7 mis en évidence par RT-PCR. Figure 2B. La protéine LIV21 montrée en western blot sur des extraits totaux de tissus mammaires et de cellules MCF-7.

La Figure 3 est l'étude de la croissance cellulaire par comptage sur cultures de cellules MCF7 traitées ou non par du TPA à 25 nM, aux temps 0, 2 et 3 jours. Le temps 0 jour correspond au début du traitement. Le nombre de cellules par cm2 est: pour les contrôles de 11 734 2 439 au temps 0, de 31 683 4 479 à 2 jours, et de 48 405 5 462 à 3 jours; pour les cellules traitées au TPA de 11 734 2 439 au temps 0, de 22 802 3 561 au bout de 2 jours, et de 24 484 3 962 à 3 jours. 6 comptages ont été réalisés sur 6 expériences, à chaque temps.

La Figure 4 est la morphologie des cellules MCF7 traitées ou non par le TPA à 25 nM. La Figure 5 est une analyse par FACS; représentation pour chaque phase du cycle cellulaire du pourcentage de cellules en fonction du temps de traitement: Figure 5A.

Phase S, Figure 5B. Phase G2/M, Figure 5C. phase GO/G1. L'échelle de l'axe des abscisses n'est pas proportionnelle à la durée de traitement.

La Figure 6 est un Western Blot comparant des extraits totaux (ET) et des extraits nucléaires (EN) et montrant l'inhibition par TPA de l'expression de la phosphorylation de LIV21. Figure 6A. en fonction du temps de traitement par le TPA à 25 nM; Figure 6B. comparé à LIV21 dans des extraits protéiques, à 12h de traitement par TPA à 25 nM.

La Figure 7 est une étude de la translocation nucléaire de LIV21 par immunocytochimie avec un anticorps primaire anti- LIV21 (en vert) dans des cultures traitées ou non au TPA à 25 nM. Les noyaux sont colorés en rouge par l'iodure de propidium. Les noyaux sont majoritairement colorés en jaune à 12H jusqu'à 24H car l'anticorps primaire anti- LIV21 (en vert) est nucléaire alors qu'il est majoritairement cytoplasmique à 72H (noyaux rouges et cytoplasmes verts).

La Figure 8 montre l'expression en fonction du temps de traitement par TPA à 25nM des protéines PKCs et PKCÇ dans des extraits totaux. L'expression de l'a-tubuline sert de contrôle de la quantité de protéines totales déposées dans les puits. . La Figure 9 montre l'expression comparée de la PKCs et de LIV21 en immunocytochimie sur des cultures de cellules MCF-7 traitées et non traitées par le TPA à 25 nM pendant 12h, réalisée avec des anticorps anti-LIV21 et anti-PKCs en vert, et l'iodure de propidium colorant l'ADN en rouge. La LIV21 est transloquée dans le noyau par inhibition spécifique de PKCc. La PKCE est faiblement exprimée à 12h en présence de TPA. En effet, on observe les noyaux rouges et peu de coloration verte dans les cytoplasmes. En revanche, l'expression de LIV21 est forte dans les noyaux qui sont colorés en jaune (merge) à la fois par l'anticorps anti-LIV21 (vert) et par le iodure de propidium spécifique des noyaux.

La Figure 10 montre l'effet du peptide inhibiteur de la PKCs sur le profil d'expression de LIV21 par immunocytochimie sur des cultures: contrôle ou traitées avec 1 M de peptide, 2 M de peptide, ou 25 nM de TPA. Les traitements durent 12 heures. Les cellules sont marquées par anti-LIV21 (en vert), et par l'iodure de propidium (en rouge). On observe que 2 M de peptide (image nommée 21,tM) ont la même efficacité que 25 nM de TPA 12H : les noyaux (jaunes) sont majoritairement marqués à la fois par l'iodure de propidium et par l'anticorps anti-LIV21 (en vert) sur ces deux images alors que le contrôle et les cellules traitées avec seulement 11..tM de peptide inhibiteur de PKC montrent une coloration rouge des noyaux traduisant l'absence de translocation nucléaire de LIV21 via son anticorps anti-LIV21 (en vert).

La Figure 11 montre l'effet du peptide inhibiteur de la PKCE sur le profil d'expression de LIV21 dans des fractions cellulaires cytoplasmique (C) et nucléaire (N), après un 25 traitement de 12h par le TPA (25 nM) ou par le peptide (2 M).

La Figure 12 montre par immunoprécipitation (IP) la coexistence entre PML/SUMO et LIV21: on observe une fluorescence jaune (merge) nucléaire correspondant à la colocalisation de PML/SUMO et LIV21 dans les noyaux cellulaires.

Les Figures 13 et 14 montrent par immunocytochimie la coexistence entre corps PML/SUMO et LIV21. Le co-marquage (par immunomarquages fluorescents) de LIV21 (vert) et de SUMO-1 (rouge) dans les noyaux des cellules traitées ou non au TPA pendant 24h et 72h montrent qu'à 24h LIV21 est transloqué dans le noyau où coexiste SUMO et PML (Merge: noyaux jaunes), alors qu'à 72H, LIV21 (vert) est cytoplasmique. Les corps nucléaires contenant la protéine SUMO1 sont appelés corps PML.

La Figure 15 montre un exemple de localisation nucléaire de LIV21 dans le tissu contrôle et sain du sujet malade d'un carcinome du sein (couleur jaune: (merge) correspondant au iodure de propidium des noyaux et à l'alexa vert qui marque LIV21) et dans le tissu cancéreux du sujet malade (alexa 488 vert marquant LIV21:couleur verte majoritaire dans le cytoplasme des cellules).

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

L'invention est relative à l'identification d'antigènes dans des lysats cellulaires par immunoprecipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F 1 a été étudiée par coimmunoprécipitation de complexes protéiques. Cette analyse a permis de mettre en évidence un nouveau marqueur présentant une utilité diagnostique et pronostique pour le cancer du sein.

La découverte de cette nouvelle molécule LIV21, pourrait avoir une valeur de diagnostic pour les raisons suivantes. En procédant à un criblage de la localisation de LIV21 dans une dizaine de tumeurs humaines, l'inventeur a pu observer que, dans toutes les cellules tumorales en prolifération, cette protéine est majoritairement cytoplasmique au lieu d'être nucléaire. Elle ne se trouve donc pas dans le bon compartiment cellulaire pour être active sur l'arrêt de la multiplication des cellules.

La présence de LIV21 a ainsi pu être observée chez les mammifères. Le panel d'expression de LIV21 en fonction de l'état cellulaire (cycles mitotiques, repos cellulaire, différentiation) a été étudié sur des tissus provenant de différents mammifères. Les analyses protéiques sur les différents échantillons de tissus ont confirmé que l'expression de ce facteur de transcription apparaît associé à une progression vers un état cellulaire quiescent (arrêt des mitoses et entrée en différenciation). LIV21 est présent dans des lignées cellulaires tumorales en prolifération active et son expression est essentiellement cytoplasmique. Les mêmes résultats sont obtenus sur les adénocarcinomes mammaires humains.

Ainsi, la présente invention porte sur un nouveau test de dépistage d'anomalies de la réinduction du cycle cellulaire. Ce test diagnostic se base sur l'étude du mécanisme d'action du nouveau gène, codant pour un nouveau facteur de transcription potentiel appelé LIV21, qui régule négativement la prolifération. LIV21 est impliqué dans l'arrêt de la prolifération cellulaire. L'ADNc isolé code pour une protéine contenant un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, ainsi qu'une séquence de nucléarisation. LIV21 est cytoplasmique lorsque les cellules prolifèrent alors qu'elle devient nucléaire lorsque les cellules deviennent quiescentes. La caractérisation de ce facteur suggère une nouvelle voie de régulation négative de la prolifération des cellules, de par son association avec l'un des membres de la famille des EF(s) : E2F4. Ce dernier est connu pour réguler négativement le cycle cellulaire en association avec la protéine P130 ou protéine poche de la famille RB. Il a été montré par stratégie anti-sens que le complexe LIV21 / E2F4 semble réguler négativement l'expression de la protéine E2F1 dont il a été précisé précédemment qu'elle pouvait induire la prolifération au cours du développement ou l'apoptose dans les cellules post - mitotiques.

La localisation observée pour LIV21 dans les cellules tumorales (localisation cytoplasmique) et dans les cellules physiologiques (localisation nucléaire) suggère en tout état de cause que son fonctionnement est perturbé lorsque le développement cellulaire devient anarchique.

La caractérisation de cette molécule, l'étude de la chronologie et de la topologie de son expression indiquent aussi que ce facteur de transcription ubiquitaire a une expression et une localisation régulée en fonction de l'état cellulaire: expression plus forte et localisation nucléaire pour les cellules sorties des cycles mitotiques, expression faible et localisation cytoplasmique pour les cellules en prolifération active telles que les cellules tumorales humaines.

LIV21 apparaît comme une molécule clé permettant de stabiliser un autre facteur de transcription (E2F4) dans le noyau cellulaire et d'ainsi induire un arrêt de prolifération cellulaire.

De plus, il a été montré que la localisation de LIV21 dans le compartiment cytoplasmique est régulée par PKCE. En effet, lorsque LIV21 est phosphorylée par PKCE, LIV21 est localisé dans le compartiment cytoplasmique. Inversement, lorsque la phosphorylation de LIV21 par PKCE est inhibée, LIV21 est localisé dans le compartiment nucléaire.

La présente invention enseigne la mise au point du test diagnostic du cancer du sein (adénocarcinome mammaire humain) permettant aussi le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire. En particulier, la présente invention permet le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire sur des cellules ou des tissus frais, sur des cellules ou des tissus congelés et sur des tissus traités entre autre avec de la paraffine.

Quatre de ces propriétés peuvent être utilisées: son passage du compartiment cytoplasmique cellulaire au compartiment nucléaire, la propriété de s'associer au facteur de transcription E2F4 afin de former un complexe inhibant l'expression du facteur E2F 1 et la capacité de LIV21 à se transloquer dans le noyau par inhibition spécifique de PKCE, la sumoylation de LIV21 quand celui-ci est nucléaire et intégrée dans les corps PML.

Ces différentes propriétés de LIV21 peuvent être exploitables par tous les moyens d'imagerie optique, sonique et de spectroscopie actuels. Attendu que l'état majoritairement cytoplasmique de cette protéine dans les cas de cancer par rapport à sa situation nucléaire dans les cellules saines est une différence géographique et structurelle qui permet, sans nécessité d'un marqueur fluorescent, de différencier des profils spectraux du pattern fonctionnel du tissu cancéreux versus du tissu sain et ainsi de faire le diagnostic.

Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses, plus particulièrement de cellules cancéreuses invasives, agressives et/ou métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines ou de tissus bien différentiés.

L'invention concerne par ailleurs des méthodes de diagnostic ou de pronostique du cancer du sein mettant en oeuvre la détection de la localisation cytoplasmique d'un facteur de transcription localisé dans le noyau dans des cellules saines.

La présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de sein d'une patiente comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de sein de ladite patiente, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules noncancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques. La méthode comprend, de préférence, une étape préalable de traitement convenable des cellules contenu dans l'échantillon par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire. La méthode comprend facultativement une étape de comparaison avec un échantillon biologique ne contenant pas de cellules cancéreuses ou avec des cellules non-cancéreuses de l'échantillon.

Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCE), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCE, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine.

La protéine LIV21 est un protéine humaine d'environ 300 acides aminés. Cependant, suivant l'épissage alternatif qu'elle subit, elle se presente au moins sous trois formes de taille differentes (Figure 1 D). Par ailleurs, elle peut être phosphorylée ou sumoylée. Elle présente un poids moléculaire apparent entre 50 kD et 51 kD dans des analyses Western Blot. Ce poids moléculaire apparent est de 60 kD lorsque LIV21 est sumoylée. Cette protéine a été caractérisée par Spectrométrie de masse (Maldi)(Exemple 1; Figure 1A).

Elle donne 54 peptides suite à une digestion par la trypsine (Figure 1A et 1B). Les caractéristiques de la protéine LIV21 sont également decrites dans les figures 1C et 1 D. Deux peptides particuliers de LIV21 sont décrits: LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV2lb (SEQ ID No 2).

La protéine LIV21 comprend un motif leucine zipper, un domaine basique 5 caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, et une séquence de nucléarisation.

Dans sa forme de 51 kD, phosphorylée ou non, son point isoélectrique est de 5,6 et son intensité de 13632.

Dans un mode de réalisation particulier des méthodes de la présente invention, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. Plus particulièrement, la méthode selon la présente invention concerne la détection d'un polypeptide présentant une séquence comprenant la séquence LIV21a et/ou LIV21b dans un échantillon biologique de sein d'une patiente. De préférence, le polypeptide comprend les séquences de LIV21a et de LIV2lb. Elle concerne également la détection de peptides comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de LIV21, de préférence au moins 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de LIV21. (Figure 1) De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Ainsi, la 20 méthode comprend une étape de mise en contact des cellules de l'échantillon biologique avec l'anticorps anti-LIV21.

La méthode selon la présente invention utilise de préférence un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide LIV21, un fragment ou un dérivé de celui-ci. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps se lie spécifiquement à un peptide LIV21a ou LIV21b.

Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (par ex., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps de l'invention peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).

Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec la protéine LIV21 ou des fragments immunogènes de celle-ci. Dans un mode de réalisation préfére, les fragments immunogènes de la protéine LIV21 comprennent ou consistent en une séquence polypeptidique LIV21 a et/ou LIV21b. Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces animales variées incluant les rongeurs (souris, rats, etc.), les primates, les chevaux, les cochons, les moutons, les lapins, la volaille, etc. sont décrites par exemple dans Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971). L'antigène est combiné avec un adjuvant (par ex., Freud's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous- cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins (immun sérum) sont collectés et les immunoglobulines sont séparées.

La méthode selon la présente invention peut par exemple utiliser un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec la protéine LIV21 ou des fragments immunogènes de celle-ci. Dans un mode de réalisation préféré, les fragments immunogènes de la protéine LIV21 comprennent ou consistent en une séquence polypeptidique LIV21a et/ou LIV21b. Dans un mode de réalisation particulier, l'animal a été immunisé avec le peptide LIV21a et/ou LIV21b. Par exemple, les peptides peuvent être couplés à une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, puis injectés à un animal, par exemple un lapin, pour immunisation. Des anticorps polyclonaux ont été obtenus à partir de ces deux peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun.

Des méthodes de production d'anticorps monoclonaux à partir de différentes espèces animales peuvent être trouvées par exemple dans Harlow et al. (Harlow 1988) ou dans Kohler et al. (Kohler and Milstein 1975). Ces méthodes comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome.

Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les anticorps peuvent également être produits par sélection de banques combinatoires d'immunoglobulines, telles que celles divulguées par exemple dans Ward et al. (Ward, Gussow et al. 1989).

Particulièrement, les anticorps spécifiques de LIV21 peuvent être utilisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique du sein. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohitochimique de l'expression de LIV21 sur des coupes de tissus du sein. Généralement pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détectables. En alternative, les anticorps peuvent être marqués indirectement.

Dans un mode de réalisation préféré, les anticorps sont marqués. Les marqueurs incluent les radiomarqueurs, les enzymes, les marqueurs fluorescents, luminescents, chimiques, des particules magnétiques, par marquage à l'or, par marquage de type biotine/avidine, péroxydase, etc..

L'invention a également pour objet une méthode de détection de la protéine LIV21 dans un échantillon biologique de sein, comprenant une étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps spécifique de la protéine LIV21 humaine et une étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe LIV21-anticorps formé. Dans des modes de réalisation particuliers, les extraits cytoplasmiques et/ou nucléaires sont préparés, et ces extraits sont mis en contact avec l'anticorps spécifique de la protéine LIV humaine.

Lorsque le produit de l'expression d'un des gènes PKCE, E2F1 et E2F4 doit être détecté, la méthode peut utiliser des anticorps spécifiques des protéines PKCE, E2F1 et E2F4, respectivement. Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre PKCE, E2F1 et E2F4 sont disponibles commercialement. A titre d'exemple, on peut citer, pour PKCE, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-214), pour E2F1, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-860), et pour E2F4, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-866). De préférence, les anticorps sont marqués, directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire. Les techniques de marquage des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulier, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot. L'analyse Western blot peut être réalisée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Brièvement, les protéines sont mises à migrer dans un gel puis transférer sur une membrane. Ensuite, cette membrane est incubée en présence des anticorps et la fixation des anticorps est éventuellement révélée à l'aide d'anticorps secondaires marqués.

Dans un autre mode de réalisation, la protéine est détectée par immunohytochimie, immunocytochimie ou immunoradiographie. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'analyse d'immunocytochimie peut être effectuée sur des cellules entières provenant de l'échantillon ou étant dérivées de celui-ci, par exemple par culture cellulaire. Elle peut également être réalisée sur des noyaux isolés. L'analyse d'immunohistochimie peut être faite sur des coupes de tissu mammaire.

A titre d'illustration, une analyse par immunocytochimie peut comprendre les étapes suivantes. Il est cependant entendu que d'autres modes préparatoires peuvent être mis en oeuvre. Des cellules provenant de l'échantillon biologique sont cultivées, de préférence sur des lames (Lab Tek,Nunc, Allemagne), puis lavées avec du tampon et fixées avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Une étape de saturation est de préférence réalisée en incubant les cellules avec du tampon S (PBS-Triton X100 0,1% SVF 10%). Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire et sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps secondaire fluorescent, si nécessaire. Les noyaux peuvent être marqués à l'iodure de propidium (Sigma). Les lames sont montées au moviol pour l'observation en microscopie à fluorescence. Par ailleurs, des noyaux isolées prélevés au cours d'une extraction nucléaire peuvent être fixés avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Les suspensions de noyaux sont déposées entre lame et lammelle et l'observation est faite en microscopie à fluorescence et en microscopie confocale. Les anticorps primaires sont par exemple des anticorps de lapin et les anticorps secondaires sont des anticorps marqués dirigés contre les IgG de lapin.

Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm, l'ARNm pouvant être détecté par tout moyen bien connu de l'homme du métier.

Ainsi, la méthode selon la présente invention concerne également la détection d'un polynucléotide codant pour la protéine LIV21 humaine ou un fragment de celle-ci, par exemple LIV21a et/ou LIV21b. Le polynucléotide codant pour LIV21 peut être un ARNm, un ADNc ou un ADN génomique. Les polynucléotides peuvent être isolés à partir de cellules mammaires. Ils peuvent également être obtenus par une réaction de polymérisation en chaîne (PCR) effectuée sur l'ADN total des cellules ou encore par RT-PCR effectuée sur les ARN totaux des cellules ou des ARN polyA.

L'ARNm peut être détecté par une analyse RT-PCR. Pour cela, la méthode met en oeuvre une paire d'amorces spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCE, E2F1 ou E2F4. Par paire d'amorces spécifique est entendu qu'un moins une des amorces est spécifique du produit d'expression à détecter. C'est-à-dire que cette paire d'amorces permet d'amplifier spécifiquement un fragment de l'ARNm désiré. De préférence, l'analyse par RT-PCR est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente.

Optionellement, l'analyse par RT-PCR peut être une analyse quatitative. Une paire d'amorces spécifiques de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Par exemple, la paire d'amorces peut comprendre les amorces décrites dans les séquences SEQ ID Nos 3 et 4.

Les paires d'amorce spécifiques de PKCE, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier (Caroll JS 2000; Mundle SD 2003; Stevaux 0 2002; Cheng T 2002; Opalka B 2002).

L'ARNm peut également être détecté par une analyse NoRthern blot. Pour cela, la méthode met en oeuvre une sonde spécifique du produit d'expression à détecter, notamment LIV21, PKCE, E2F1 ou E2F4. Une sonde spécifique de LIV21 peut être préparée sur la base des enseignements de la présente demande. Un exemple de sonde spécifique comprend la séquence SEQ ID No 5. De préférence, l'analyse Northern blot est effectuée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. La sonde nucléique est marquée. La technique de marquage des oligonucléotides est bien connue de l'homme du métier. Le marquage des sondes selon l'invention peut être réalisé par des éléments radioactifs ou par des molécules non radioactives Parmi les isotopes radioactifs utilisés, on peut citer le 32P, le 33P, ou le 3H. Les entités non radioactives sont sélectionnées parmi les ligands tels que la biotine, l'avidine, la streptavidine, la digoxygénine, les haptènes, les colorants, les agents luminescents tels que les agents radioluminescents, chémoluminescents, bioluminescents, fluorescents, phosphorescents. Les sondes spécifiques de PKCE, E2F1 et E2F4 sont bien connues par l'homme du métier.

Les échantillons de sein proviennent d'une patiente potentiellement atteinte du cancer du sein ou atteinte du cancer du sein de manière avérée. Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement. La méthode selon la présente invention peut comprendre une étape de prélèvement d'un échantillon de tissu du sein. L'étape de détection peut être effectuée directement sur une coupe de tissu de l'échantillon, sur une culture de cellules provenant de l'échantillon, sur des extraits cellulaires totaux, des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques.

Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCE, une augmentation significative de PKCE est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Plus précisément, la quantité de PKCE dans des cellules saines est comparée à la quantité de PKCE dans les cellules de l'échantillon et l'augmentation significative est déterminée par cette comparaison. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du rapport LIV21/ PKCE. Ce rapport LIV21/ PKCE augmente dans la fraction cytoplasmique des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.

Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans la fraction nucléaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. La détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 peut être réalisée par une détection concomitante de LIV21 et de E2F4. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du rapport E2F4 / LIV21. Ce rapport E2F4 / L1V21 diminue dans le noyau des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.

Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du rapport E2F 1 / LIV21. Ce rapport E2F1 / LIV21 augmente dans la fraction nucléaire des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.

La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement et de déterminer le degré d'invasivité d'un cancer. La spécificité de la détection peut être liée aux croisements des informations obtenues par l'existence et la topographie de LIV21 par tous les moyens d'imagerie et de spectroscopie et obtenues par l'association aux autres indicateurs cancérologiques connus via des puces à protéines ou des microarrays. Ainsi, la détection basée sur LIV21 peut être associée à la détection d'autres marqueurs du cancer, en particulier du cancer du sein, connus de l'homme du métier.

En effet, la présente invention concerne une méthode de suivi thérapeutique d'un traitement anti-cancéreux chez une patiente souffrant d'un cancer du sein comprenant, l'administration du traitement anticancéreux à ladite patiente et la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de sein d'une patiente selon la méthode de la présente invention. Une diminution des cellules cancéreuses sera indicative de l'efficacité du traitement. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de sein d'une patiente selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois au cours du traitement anti-cancéreux ou après le traitement anticancéreux.

Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de détection des récidives suite à un traitement anti-cancéreux d'un cancer du sein chez une patiente comprenant, la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de sein d'une patiente selon la méthode de la présente invention. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de sein d'une patiente selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois après le traitement anti-cancéreux. La détection de cellules cancéreuses est indicative de récidives.

La présente invention décrit également un kit pour la mise en oeuvre d'une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses de sein dans un échantillon biologique d'une patiente comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21 humaine selon la présente invention, un sérum anti-LIV21 selon la présente invention, une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21 et une paire d'amorces spécifique de l'ARNm de LIV21. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21. Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend une sonde oligonucléotidique spécifique de l'ARNm de LIV21. Il peut également comprendre une sonde spécifique d'un gène house-keeping . Le kit selon la présente invention peut comprendre des réactifs permettant la détection d'un complexe LIV21anticorps produit lors d'une réaction immunologique. Facultativement, le kit selon la présente invention comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCE), le gène E2F1 et le gène E2F4. Ces moyens de détection peuvent être des anticorps spécifiques de la protéine, des sondes oligonucléotidiques spécifiques de l'ARNm concerné et/ou une paire d'amorces spécifique de l'ARNm.

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, donnés à titre non limitatif.

EXEMPLES

EXEMPLE 1

Une spectrométrie de masse (MALDI) a été réalisée pour la protéine LIV21. La protéine LIV21 a été digérée par la trypsine. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant: acétonitrile/eau (1/1) contenant 0,1 % TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice alpha cyano-4-hydroxycinnamique a été préparée dans le même solvant. On a prélevé un même volume des deux solutions, on a mélangé et déposé 1 l sur la plaque de MALDI pour analyse. La spectrométrie de masse a montré que la protéine LIV21 digérée par la trypsine met en évidence 54 peptides (cf. Figure 1A et B). La protéine LIV21 a été caractérisée par un poids moléculaire de 50 kD, mise en évidence par Western Blot et par gel bidimensionnel SDS PAGE (Figure ID).

Lorsqu'elle change de compartiment cellulaire et qu'elle est sumoylée, elle a un poids moléculaire de 60kD environ. Lorsqu'elle est phosphorylée dans le cytoplasme, elle 10 présente deux formes différant de quelques kilobases. On observe alors un doublon.

Deux peptides la caractérisent: - Le peptide LIV21a est localisé entre un site d'interaction avec la protéine Rb/p107/p130 (ITCCE) et un site de sumoylation par SUMO 1. La séquence de ce 15 peptide est la suivante: Peptide LIV21a RVYGPLTNPKPQ SEQ ID No 1 - Le peptide LN21b est localisé entre un site de sumoylation (PKPG) et un site (YVKI) phospholipase C suivi de (KKKRK) NLS. La séquence de ce peptide est la suivante: Peptide LIV21b CYRSILHTKV SEQ ID No 2 EXEMPLE 2: Etude de la translocation nucléaire de LIV21 dans les cellules MCF-7 L'étude de la distribution subcellulaire de LIV21 dans différentes lignées tumorales d'origines diverses a montré une localisation exclusivement cytoplasmique de cette protéine. L'inventeur a étudié par quel(s) mécanisme(s) LIV21 pouvait être transloquée dans le noyau pour agir sur le cycle cellulaire.

La présence de sites putatifs de phosphorylation par les Protéines Kinases C (PKCs) dans la séquence de LIV21 a orienté l'étude de l'inventeur vers une éventuelle implication de ces protéines sur sa translocation nucléaire. L'inventeur a donc choisi d'utilisé la lignée MCF-7 traitée par le TPA, dont on sait qu'il module les PKCs.

Parallèlement à ce travail, l'inventeur a également étudié l'expression et la localisation de protéines du cycle cellulaire impliquées dans la voie de signalisation dans laquelle agit LIV21.

De plus, la réalisation d'une construction d'une protéine recombinante de LIV21 couplée à la GFP a permis de suivre la translocation nucléaire de cette protéine au cours de différents traitements par des facteurs exogènes et d'en étudier l'effet de sa sur-expression.

La lignée des cellules MCF-7 La lignée MCF-7 est une lignée humaine non clonale de cellules d'adénocarcinome du sein. Lors de leur différenciation induite par des facteurs exogènes, ces cellules développent une hypertrophie, des protrusions membranaires et une tendance à se dissocier les unes des autres. Elles acquièrent un phénotype sécrétoire se caractérisant par l'apparition de nombreux granules et de canalicules sécrétoires.

In vivo, ces cellules sont peu métastasiques et cette invasivité réduite serait due à une faible activité constitutive des protéines kinases C (PKCs) et à un taux peu élevé de l'expression de la protéine kinase C alpha.

Cette lignée est utilisée dans de nombreuses études sur la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Ces études utilisent des drogues appropriées comme le TNF pour l'induction de l'apoptose, ou le TPA (12 O -tetradecanoyl phorbol-13 SUMOate) pour l'induction de la différenciation et donc pour l'étude de la sortie du cycle cellulaire.

L'effet du TPA sur la lignée MCF-7 Le TPA est un activateur connu des PKCs. Il active la croissance des cellules normales du sein, ne modifie pas la prolifération des cellules de tumeurs bénignes de ce même tissu, mais il inhibe de manière drastique la prolifération des cellules de lignées de tumeurs mammaires humaines telles que la lignée MCF-7. Il réduit la croissance cellulaire de cette lignée en contrôlant positivement le récepteur c-erb-2 et en contrôlant négativement le récepteura de l'acide rétinoïque, qui sont tous deux exprimés de manière particulièrement importante dans ces cellules. Le TPA inhibe fortement et rapidement l'expression et la fonction des récepteurs aux oestrogènes (ER) et il induit la translocation, temps- et dose-dépendante, des protéines kinase C (PKCs) du cytosol vers les membranes.

D'autre part, le TPA augmente la capacité de migration des cellules MCF-7 in vitro et un court traitement de ces cellules par le TPA induit une expansion cellulaire et une organisation des microtubules caractéristiques de leur différenciation.

Expression de LIV21 dans les cellules MCF-7 Dans un premier temps, l'inventeur a vérifié l'expression de LIV21 dans ces cellules, au niveau transcriptionnel et au niveau protéique.

L'expression de l'ARNm de LIV21 a été mis en évidence par RT-PCR (amorce sens: CCTGACATCCCTACATCACCCAT (SEQ ID No 3) et amorce antisens: TCCTATGCTTGACTATTGC (SEQ ID No 4)) dans ces cellules comparativement aux cellules des tissus mammaires (figure 2A). Un ARNm de même taille que l'ARNm détecté dans les tissus mammaires et spécifique de LIV21 a été détecté. Cependant, le niveau d'expression de LIV21 dans les cellules MCF7 est plus faible que dans les tissus mammaires. Ce premier résultat montre que la lignée MCF-7 exprime l'ARNm LIV21.

L'inventeur a abordé l'étude de l'expression de la protéine LIV21 par la technique du western blot, avec un anticorps anti-LIV21, dans les cellules MCF-7 par rapport aux tissus mammaires. Les anticorps anti-LIV21 ont été obtenues par la méthode décrite ci-dessous. Dans cette lignée, LIV21 s'exprime aussi bien dans les tissus mammaires que dans les cellules MCF-7, sous la forme d'un doublet migrant à un poids moléculaire apparent de 50 kDa (figure 2B).

Production du sérum purifié anti-LIV21 Les séquences peptidiques spécifiques sont les séquences n 1 et n 2 Ces peptides ont été injectés aux lapins (NZ W ESD 75 femelle 2,3kg au jour 0) En accord avec les procédures d'immunisation standard, tels que: Jour ETAPES DE LA PROCEDURE Jour 0 Collection d'un sérum control (20m1) Première injection intradermique (1ml/lapin) 1 tube pour deux lapins avec lml d'antigène + lml Freund Complet Jour 14 Seconde injection en intramusculaire (1m1 par lapin) 1 tube pour 2 lapins avec 1m1 d'antigène + 1m1 Freund Incomplet Jour 28 Troisième injection intramusculaire (idem J14) Jour 39 On collecte le sérum test (5m1) et on le conserve à 4 C (sérum j39) Jour 49 Quatre injections sous cutanées (1ml) 1 tube pour deux lapins avec 1m1 d'ag +lml Freund Incomplet Jour 60 Sérum test collecté (25-30 ml) et stockage à 4 (sérum J60) Jour 77 Cinquième injection intradermique (1ml/lapin) idem J 49 Jour 88 Sérum test collecté (5m1) et stockage à 4 (sérum J88) Jour 99 Sérum test collecté (25ml) et stockage à 4 (sérum J98) Jour 102 Sérum test collecté (25m1) et stockage à 4 (sérum J102) Jour 104 Sérum test collecté (25m1) et stockage à 4 (sérum J104) Jour 106 Sérum test collecté (25m1) et stockage à 4 (sérum J106) Jour 109 Total collecté par la collection totale de sang et stockage à 4 C(sérum J109) La réactivité du sérum obtenu a été testée pour lier les séquences peptidiques n 1 et 2.

A J60 le sérum montre une bonne réactivité avec chaque séquence. Le sérum produit n'est lié à aucun membre de la famille E2F.

L'effet du TPA dans les cellules MCF-7 Il a été décrit dans la littérature que le TPA induit l'arrêt de prolifération et la différenciation des cellules tumorales de la lignée MCF-7. Pour valider les conditions de culture, la croissance cellulaire (par comptages) a été préalablement suivie sur trois jours de culture en présence ou en absence de TPA à une concentration de 25 nM (figure 3).

Les comptages cellulaires mettent en évidence une variation de la cinétique de croissance entre les cultures non traitées et les cultures traitées au TPA. En effet, dès le deuxième jour de culture, le nombre de cellules entre les deux conditions de traitement est significativement différent, le TPA induisant déjà l'arrêt de prolifération cellulaire. Au bout de 3 jours de traitement, les cultures contrôles présentent deux fois plus de cellules que les cultures traitées. Le TPA à la concentration de 25 nM inhibe donc bien la prolifération dans nos conditions de culture.

Parallèlement, l'inventeur a pu observer que les cellules traitées au TPA acquièrent rapidement des caractéristiques de cellules différenciées de glande mammaire (figure 4) : hypertrophie, protusions membranaires et tendance à se dissocier les unes des autres. Cependant, dans le laps de temps où les cellules ont été étudiées, le phénotype sécrétoire (apparitions de granules et de canalicules sécrétoires) n'a pas été observé.

Analyse par FACS de l'effet du TPA Ces études préliminaires de l'effet du TPA ont incité l'inventeur à étudier plus exhaustivement le cycle cellulaire de la lignée MCF-7 en fonction des conditions de culture. Par analyse en cytométrie de flux, l'inventeur a pu déterminer à quel tempsprécis le nombre de cellules en phase S diminue et dans quelle phase du cycle elles se trouvent (figure 5).

Phase S: L'étude par FACS montre que le nombre de cellules en phase S diminue pour atteindre une valeur limite entre 12h et 24h de traitement au TPA (figure 5A). Mais, sans nouvel ajout de TPA, le nombre de cellules en phase S augmente de nouveau pour revenir à l'état initial à 72h de traitement.

Phase G2/M: Le nombre de cellules en phase G2/M augmente dès le début du traitement avec un maximum observé à 12 heures (figure 5B).

Phase GO/G1: Le nombre de cellules en phase GO/G1 est minimal à 6 heures et 20 maximal à 24 heures (figure 5C).

On observe donc un maximum de cellules en phase S dans les temps précoces de la cinétique (0h à 6h), en phase G2/M à 12h et enfin en phase GO/G1 à 24h. Au final, sans nouvel ajout de TPA, les cellules repartent en phase S à 72h.

En conclusion, ces résultats montrent donc que le TPA agit rapidement sur l'arrêt de prolifération cellulaire et son effet sur la réduction du nombre de cellules en phase S est optimal à 12h. Au bout de 72h après l'unique ajout de TPA, les cellules ré-initient le cycle cellulaire.

L'effet du TPA sur la localisation nucléaire de LIV21 Les résultats obtenus par la cytométrie de flux ont conduit l'inventeur à étudier en parallèle l'expression de LIV21 dans des extraits nucléaires effectués après 12h, 24h, 48h, et 72h de traitement par le TPA (figure 6A) . Lors de cette cinétique, un maximum d'immunoréactivité anti-LIV21 a été observé dès 12h, qui se maintient jusqu'à 48h et retrouve son intensité initiale après 72h de traitement. Ces données sont à rapprocher de celles obtenues par FACS. L'immunoréactivité de LIV21 augmente significativement à 12h, temps où le nombre de cellules en phase S est minimal. Elle perdure jusqu'à la reprise du cycle cellulaire observée à 72h.

De plus, on peut remarquer que cette immunoréactivité est détectée sous la forme d'une bande unique à un poids moléculaire apparent de 50 kDa, alors qu'elle s'exprimait majoritairement sous la forme d'un doublet dans les extraits totaux. Pour savoir à quelle forme de LIV21 correspond cette bande unique, l'inventeur a comparé sur un même western blot un extrait total et un extrait nucléaire à 12h de traitement (figure 6B). Les résultats obtenus montrent que la forme nucléaire de LIV21 correspond à la bande inférieure du doublet. Ces données suggèrent que la protéine LIV21 pourrait se trouver dans un état de phosphorylation différent selon le compartiment cellulaire.

Les résultats de l'étude immunocytochimique réalisée à l'aide de l'anticorps anti-LIV21 montrent que la translocation nucléaire de LIV21 est maximale à 12h (figure 7) et la localisation de LIV21 est majoritairement cytoplasmique à 72h, ce qui est en accord avec les observations en western blot. Cependant, il est intéressant de noter que l'expression de LIV21 débute déjà dès 1h de traitement dans certaines cellules, car elles ne sont pas synchrônes.

L'ensemble de ces observations montre que la translocation nucléaire de LIV21 est concomitante à la diminution du nombre de cellules en phase S. EXEMPLE 3: Etude de l'influence des PKC sur la translocation nucléaire de LIV21 Effet du TPA sur l'expression de PKCs Étude en Western Blot: Étant donné que la séquence protéique de LIV21 possède des sites putatifs de phosphorylation par les PKCs dont deux spécifiques de la PKCE (figure 1), l'inventeur a testé la variation de l'expression de cette PKC en fonction de la durée de traitement par le TPA. Il a été observé que le TPA agit très rapidement sur l'expression de PKCE, qui diminue dès 30 min (figure 8). L'expression de la PKCzeta (PKC) est utilisée en tant que contrôle interne car elle n'est pas sensible au TPA.

Immunocytochimie: Parallèlement, des expériences d'immunofluorescence sur des cultures traitées ou non ont permis de mettre en évidence cette diminution de la PKCE concomitante à la translocation nucléaire de LIV21 (figure 9). On peut observer que PKCE disparait du cytoplasme lorsque les cellules sont traitées au TPA et que LIV21 est détectée dans le noyau.

Pour conclure, il est intéressant de noter que la PKCE est faiblement exprimée à 12h, temps où on observe le moins de cellules en phase S et le maximum de translocation 10 nucléaire de LIV21.

EXEMPLE 4: Etude du rôle spécifique de PKCE sur la translocation nucléaire de LIV21 à l'aide d'un peptide inhibiteur de la fonction et de la translocation de PKCE Pour déterminer l'action spécifique de PKCE sur la translocation de LIV21, les cultures ont été traitées avec un peptide, antagoniste sélectif de la fonction et de la translocation de cette PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No 6), et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par traitement au TPA. Ce peptide est reconnu par l'enzyme et se lie en tant que substrat modifié au niveau de son site catalytique. Non phosphorylable, il agit en tant qu'inhibiteur spécifique de l'activité de PKCE.

L'effet de l'inhibition sélective de l'activité de la PKCE sur la translocation nucléaire de LIV21 a été étudié par immunocytochimie. Ces expériences ont été réalisées sur des cultures traitées ou non pendant 12h, avec du TPA à 25 nM ou avec le peptide à deux concentrations différentes, 1 et 2 M (figure 10). Le peptide utilisé à la concentration de 2 a un effet identique à celui du TPA sur la translocation nucléaire de LIV21.

Ces résultats ont été confortés par des expériences de fractionnement cellulaire sur des cultures traitées par le peptide inhibiteur de PKCE à 2 TNT comparées à des cultures traitées par le TPA (figure Il). Le même profil d'expression de LIV21 a été observé sous la forme d'un doublet dans le cytoplasme et d'une bande unique dans la fraction nucléaire.

L'inhibition spécifique de la PKCc induit une translocation nucléaire de LIV21, ce qui suggère que LIV21 pourrait être la cible de la PKCE, qui le maintiendrait dans le cytoplasme sous une forme phosphorylée.

EXEMPLE 5: Analyse par Western Blot Cet exemple décrit les conditions utilisées pour une analyse par Western Blot de cellules cancéreuses du sein.

Les extraits protéiques sont chauffés 5 minutes à 80 C dans le tampon Laemmli (pH 7.4, Tris 0,06M, SDS 3%, glycerol 10%, PMSF 1mM, (3mercaptoéthanol). La migration est effectuée en SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophorèsis). 10 à 20 gg de protéines migrent dans un gel de polyacrylamide 12% pendant 1h dans des conditions dénaturantes (Tampon de migration: Tris base 25mM, glycine 192mM, SDS 1%, pH 8.3). Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) pendant une heure en transfert liquide, dans un tampon de transfert (Tris 25mM, glycine 192mM, méthanol 20%, pH 8.3). Les membranes, saturées dans du PBS-Tween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait écrémé 5% pendant une heure sont mises en contact avec l'anticorps primaire dilué dans du PBSTween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait 1% à température ambiante sous agitation douce pendant une heure à deux heures. Après lavage, l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase est incubé 1h avec les membranes. La révélation se fait par une réaction de chimioluminescence grâce au kit ECL selon le protocole du fournisseur (Amersham).

Les anticorps primaires utilisés sont: Le sérum anti-LIV21 qui a été fabriqué en utilisant deux peptides synthétiques basés sur la séquence de LIV21: PeptideLlV21a (SEQ ID No 1 et le peptide LIV21b (SEQ ID No 2). Les peptides ont été couplés à l'hémocyanine avant d'être injectés à des lapins pour l'immunisation. L'anticorps polyclonal a été obtenu à partir de ces deux peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun (afin d'être sûr que cet anticorps n'existait pas déjà chez ce lapin). L'anticorps polyclonal anti-CDK2 de lapin (Santa-Cruz technology sc-163) dilué au 1/200.

L'anticorps monoclonal anti-p21 de Souris (DAKO, M7202) dilué au 1/150.

L'anticorps monoclonal anti-p27 de souris (Santa-Cruz technology sc-1641) dilué au 1/100.

L'anticorps polyclonal anti- PKCE de lapin (Santa-Cruz technology sc-214) dilué au 1/200.

L'anticorps polyclonal anti-PKCE de lapin (Santa-Cruz technology sc-216) dilué au 1/200.

L'anticorps polyclonal anti-a tubuline de rat (Serotec, MCAP77) dilué au 1/500. Les anticorps secondaires utilisés couplés à la péroxydase (Caltag) sont: L'anticorps de chèvre F(ab')2 anti-lapin IgG(H+ L) dilué au 1/2000.

L'anticorps de chèvre F(ab')2 anti-souris IgG(H+L) dilué au 1/2000.

EXEMPLE 6:

L'inventeur a démontré que la protéine LIV21 est associée aux corps PML et que, lors de la sumoylation, LIV21 passe d'un poids moléculaire de 50kd à 60kd. Par immunoprécipitation, l'inventeur a montré une co- localisation de LIV21 avec SUMO dans le complexe PML - SUMO/LIV21. (Figure 12) Rôle antitumoral des corps PML: Au stade de prolifération, il y a dans les corps PML des modifications visualisées car ces corps PML se dissocient et se dégradent:(speekles), des protéines se mettent alors à disposition dans le noyau pour assurer la transcription, la prolifération, les réactions immunitaires et tout ce qui nécessite la transcription de gènes. Il a été démontré que PML s'associe à SUMO et à HDAC-1 (histone déacétylase 1) et que son complexe agit sur l'expression d'E2F1 et PML agit ainsi sur l'arrêt de la prolifération en bloquant E2F1. Ainsi le complexe PML/ HDAC-1 régule négativement l'expression d'E2F1. PML associé à Rb (p130) se fixe aux histones désacétylases et bloque E2F 1 en se fixant sur la chromatine.

Dans les leucémies promyélocytaires aigües, PML est tronquée et devient une protéine de fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque. Cette protéine de fusion (PMLRARalpha) est dûe à une translocation chromosomique 15/17. Il a été rapporté dans la littérature un nouveau traitement de cette maladie par association d'arsenic et d'acide rétinoique pour induire les cellules cancéreuses en apoptose. La protéine PML régulerait la prolifération dans les cancers et les lymphomes. L'inventeur a montré par immunoprécipitation l'association SUMO-PML dans lequel est localisé LIV21.

Dans les exemples précédents, il a été montré que LIV21 est phosphorylée par PKCs et que le TPA est un inhibiteur des PKC. Les lignées MCF7 traitées par TPA montrent une inhibition de la prolifération cancéreuse et une différentiation cellulaire et LIV21 est transloquée dans le noyau. Si on a utilisé un peptide inhibiteur spécifique de PKCc, c'est l'activité et non pas l'expression de PKCE qui a été inhibée.

Lors de ce traitement par TPA (25 nM), lorsque l'on a étudié E2F4, p130 et LIV21 (fluorescence verte) dans les noyaux marqués (ADN) au iodure de propidium (fluorescence rouge) (Figure 13 et 14), on a observé : Au bout de 12h des signaux de fluorescence verte intranucléaire de même pattern pour E2F4, p130 et LIV21; Au bout de 48 h quand la prolifération commence, E2F4 a une localisation comparable; mais à 72 h, il disparaît du noyau (au profit d'E2F1).

En observant la co-localisation par double marquage de PML et de LIV21 à 24 h de traitement par TPA (cf. merge: fluorescence jaune), on a observé qu'ils sont colocalisés dans les noyaux. A 48h, la co-localisation est aussi constatée entre LIV21 et SUMO (cf. figure 13. L'hypothèse est que SUMO, qui se fixe sur LIV21, adresse en fait LIV21 dans les corps PML et que LIV21 est impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1. L'inventeur a démontré, par deux approches différentes, que LIV21 est physiquement associé à PML et SUMO dans les corps nucléaires, par immunoprécipitation (figure 12) et par co-localisation en immunocytochimie (figure 13 et 14) (Rb, p130 et p107 sont des protéines poches (pocket proteins) qui ont le même site de fixation). Les protéines Rb répriment la croissance cellulaire (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2;135 (1) :6573).

Quand on ne rajoute qu'une seule fois du TPA, son action s'épuise au bout de 72 h, la prolifération reprend et à ce moment là, les corps PML se dissocient, s'éclatent et deviennent des speckles laissant ainsi les protéines assurer la transcription, prolifération etc...LIV21 n'est plus localisé dans le noyau car il est alors rephosphorylé par PKCE et reste ainsi localisé dans le cytoplasme.

EXEMPLE 7: Etude de l'expression de LIV21 dans les biopsies de cancer du sein Pour déterminer si les observations obtenues précédemment sont applicables aux tissus humains, un grand nombre de biopsies de cancer du sein obtenues de patients ont été étudié par réaction d'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques de LIV21. La détermination immunohistochimique de l'expression de la protéine LIV21 a porté sur 2 biopsies de patients (2 patients ayant une biopsie de tissu normal versus une biopsie de tissu cancéreux).

Protocole d'analyse par Immunocytochimie: 1) Déparaffiner les lames 2) Réhydrater les tissus 3) Saturer les sites non spécifiques et perméabiliser les membranes 4) Ajouter l'anticorps en chambre humide 5) Révéler l'anticorps 1) Déparaffiner les lames sous hotte Deux bains successifs de toluène (rectapur Prolabo) 2x30' ou 2x20min; puis déshydrater les tissus du rectapur alcool à 100% 15 min; puis rectapur éthanol à 95% pendant 10 min; puis rectapur 70% pendant encore 10mn.

Décongeler l'anticorps pendant le même temps.

2) Réhydrater les tissus Doucement dans du PBS additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,1% de Triton.

3) Saturer les sites non spécifiques (par exemple avec de l'ovalbumine) et perméabiliser les membranes.

Réhydrater pendant une heure.

Déposer un ml de ce PBS par coupe afin de recouvrir la lame sans qu'elle sèche à 30 aucun moment (quand il s'agit de lame avec des cellules et non pas des tissus, une demi heure suffit).

Mettre la vitre et le couvercle en inox et de l'eau en contrebas pour créer une chambre humide.

4) Ajouter l'anticorps en chambre humide.

2882754 32 Diluer au 200ème le sérum du lapin dans 4 ml de PBS triton pour continuer à perméabiliser les membranes et SVF.

Mettre lml sur chaque lame et éviter la lumière et l'évaporation. Laisser toute la nuit ou au minimum trois heures.

Puis rincer au PBS normal IX PH 7, faire deux lavages de 5 à 10 mn pour qu'il ne reste aucune trace du premier anticorps.

Pendant qu'on prépare la sonde Alexa 488 verte (au froid à 4 à l'abri de la lumière) au 250e donc 10 litre dans 2,5m1 de PBS avec toujours 10%SVF et 0,1% Triton, Reposer les lames sur la plaque. Recouvrir la coupe avec 2,5m1 pour garder une chambre humide pendant une heure puis lavage au PBS 1X PH 7.

Lavage au Iodure de Propidium à 0,5 microgramme par microlitre à diluer à 20 microgramme par ml puis encore au 50e mais cette fois, dilué dans du PBS seul IX ( 50 microlitre pour 2,5 ml de PBS). Egoutter en les sortant du PBS puis 2,5 ml de iodure de propidium reparti sur les quatre lames pendant une minute puis deux rincage au PBS simple. Montage des lames au Moviol avant lecture.

La totalité des résultats est résumée dans le Tableau 1, ci dessous.

TABLEAU 1: Expression de la protéine LIV21 déterminée par immunohistochimie 20 dans biopsies de cancer et BIOPSIES de tissus sains.

Type de tumeurs LIV21 nucléaire LIV21 mixte LIV21 Faiblement positif cytoplasmique positif Tissus sains chez les 6/9 3/9 0 mêmes patients Carcinomes 0 2/9 7/9

Pour exemple:

Figure 15: Résultats: image 1 cancer; Image 2: tissu sain issu du même sujet atteint 25 d'un cancer Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses invasives, agressives et métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines soit de tissus bien différentiés.

EXEMPLE 8: Interaction physique de LIV21 avec les protéines de la famille EF Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées à l'aide d'anticorps anti-LIV21, anti-E2F1 et anti-E2F4 ont permis de mettre en évidence que LIV21 s'associe à E2F4.

Les membres de la famille EF sont des facteurs de transcription dont le rôle a largement été décrit dans la littérature comme étant des moléculesclés dans le contrôle positif ou négatif du cycle cellulaire (Slansky JE et Farnham PJ 1996; Helin K 1998 et Yamasaki L. 1998), de par leur association avec la protéine pRb (WuCL, Zukerberg LR, Lees JA 1995) ou les protéines poches. E2F1, contrôle positivement le cycle cellulaire en transactivant le promoteur des gènes responsables de la prolifération cellulaire (ADN polymérase alpha, thymidine kinase, DHFR, etc.), tandis qu'E2F4 est décrit comme un des membres de la famille des EFs contrôlant négativement le cycle. De plus, il a été montré une forte expression d'E2F1 dans les tissus mammaires embryonnaires (Espanel X, Gillet G 1998), tandis qu'elle n'est plus exprimée dans les tissus mammaires postmitotiques au profit d'une forte augmentation de l'expression d'E2F4 (Kastner A Brun G 1998).

L'identification d'antigènes a été faites dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F1 a été mise en évidence par coimmunoprécipitation de complexes protéiques. L'étude du complexe par MACS PROTEIN à MICROBEADS ( MILTENYIBIOTEC). Par ajout de lysats de S Aureus, les protéines A interagissent avec la partie Fc des anticorps spécifiques et les immuns complexes deviennent insolubles, on les récupère donc par centrifugation. Après rupture des liaisons (chauffage) entre AG AC et membranes riches en protéines A, on a réalisé un western blot. Ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 semble jouer un rôle important dans l'établissement de la quiescence des cellules.

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Claims (18)

REVENDICATIONS

1- Méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon de sein d'une patiente comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans un échantillon de cellules du tissu du sein de ladite patiente, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses.

2- Méthode selon la revendication 1, dans laquelle une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques.

3- Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCS), le gène E2F1 et le gène E2F4.

4- Méthode selon la revendication 3, dans laquelle au moins un des rapports LIV21 / PKCc, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 est déterminé.

5- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de l'ARNm.

6- Méthode selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans laquelle le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine.

7- Méthode selon la revendication 6, dans laquelle la protéine est détectée à l'aide d'un 30 anticorps spécifique.

8- Méthode selon la revendication 7, dans laquelle la protéine est détectée par une analyse Western blot, par immunohistochimie, par immunocytochimie, par immunoradiographie ou par marquage à la péroxydase.

9- Méthode selon l'une quelconque des revendications 3-8, dans laquelle une augmentation significative de PKCs est indicative de la présence de cellules cancéreuses.

10- Méthode selon l'une quelconque des revendications 3-8, dans laquelle l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est détectée, une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses.

11- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle méthode permettant la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement.

12- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le 15 produit de l'expression du gène LIV21 est un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2.

13- Méthode selon la revendication 12, dans laquelle ledit polypeptide comprend les séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2.

14- Méthode selon la revendication 12 ou 13, dans laquelle le polypeptide présente un poids moléculaire apparent d'environ 50-51 kD par analyse en Western Blot et d'environ 60 kD lorsqu'il est sumoylé.

15- Méthode selon la revendication 14, dans laquelle ledit polypeptide présente un point isoélectrique de 5,6 dans sa forme de 50-51 kD.

16- Méthode selon l'une des revendications 12 à 15, dans laquelle une digestion par la trypsine du dit polypeptide donne 54 peptides comme spécifiés Figure 1.

17- Méthode selon la revendication 7, dans laquelle l'anticorps se lie spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2.

18- Méthode selon la revendication 17, dans laquelle l'anticorps est un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1 et 2.