EP1869209A2 - Traçabilite des anomalies du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et la neurodegenerescence. - Google Patents

Traçabilite des anomalies du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et la neurodegenerescence.

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EP1869209A2
EP1869209A2 EP06726042A EP06726042A EP1869209A2 EP 1869209 A2 EP1869209 A2 EP 1869209A2 EP 06726042 A EP06726042 A EP 06726042A EP 06726042 A EP06726042 A EP 06726042A EP 1869209 A2 EP1869209 A2 EP 1869209A2
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EP
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liv21
protein
expression
gene
cells
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Laurence Faure
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Faure Laurence
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    • G01N2333/91205—Phosphotransferases in general

Definitions

  • the present invention relates to the field of medicine and biology. It concerns a new screening test and therapeutic monitoring in oncology. More particularly, it relates to diagnostic and / or therapeutic tests in oncology and neurodegenerative diseases.
  • Age-related neurodegenerative diseases and cancers both involve a change in the physiological process of programmed cell death or apoptosis. Neuronal death is abnormally accelerated during neurodegenerative diseases such as Alzheimer 's, Huntington' s, Parkinson 's etc. In contrast, the process of cancerization corresponds to a blockage of apoptosis leading to an uncontrolled multiplication of cells. The link between these two processes has now become a major field of research in aging research.
  • Cancer is one of the leading causes of death worldwide. While over the last generation the percentage of deaths related to heart disease, cardiovascular disease and many other diseases have been declining, the number of deaths related to various forms of cancer is on the rise. Despite the rapid advancement of our understanding of different forms of cancer, low survival rates are generally attributable to inadequate diagnosis and treatment. Most tumors can only be detected when they reach a size of about 1 cm. Since there is a relatively short period of time for the continuous development of a tumor to a stage that becomes incompatible with survival, this leaves little time for therapeutic intervention. So, early diagnosis becomes the key to success for cancer treatment.
  • skin cancer is the most common cancer in Canada. In 1992 alone, 50,300 new cases of skin cancer were reported, compared to 19,300 cases of lung cancer, 16,200 cases of colorectal cancer and 15,700 cases of breast cancer. In other words, skin cancer is as common as the top 3 types of cancers combined. Its incidence continues to grow with its 64,200 new cases in 1997, an increase of 14,000 cases annually in 5 years. In particular, the incidence of malignant melanoma is growing at a rate of 2% per year. Early diagnosis remains the key to effective treatment. A malignant tumor is easily accessible and can be removed with minor surgery. In fact, the cure is 100% if skin cancer is detected early enough. However, early diagnosis of skin cancer remains difficult.
  • a definitive diagnosis of skin cancer requires biopsy and histological analysis. However, the decision to send a biopsy for analysis (or even if a patient needs to be referred to a dermatologist) becomes very subjective. There are several biopsies that are not taken when they should have been.
  • Colon cancer is the third leading cause of cancer-related mortality among men and women in North America (16,200 cases per year). Early detection, leading to early intervention, has shown that treatment success and survival can be improved. For example, the 5-year survival rate is 92% for a patient whose disease has been detected at an early stage, while the rate drops to about 60% in patients with localized cancer, and to about 6% in those with metastases. However, only one-third of colon cancers are detected at an early stage. One of the reasons for this delay in diagnosis is the lack of a sensitive screening test, inexpensive and non-invasive.
  • cyclin D1 one of the proteins constituting the regulatory subunits of the kinases of the cell cycle, essential for the progression of the cell cycle. This protein is also expressed during apoptosis in various cell types (Han et al, 1996, Pardo et al, 1996).
  • the present invention relates to a new cell cycle reinduction screening test targeting oncology. This is a diagnostic test and a prognostic test for different cancers (cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, glioblastoma, sarcoma, leukemia, etc.). More particularly, the invention relates to the use of the protein LIV21 as well as their derivatives as markers diagnostics and prognosis of cancers. The invention thus relates to the detection of the LFV21 protein with a kit comprising antibodies specific for LIV21.
  • a first objective of the present invention is to demonstrate a method for detecting and prognosing cancer and its metastatic potential.
  • the cancer is selected from cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, sarcoma, leukemia and glioblastoma, without being limited to these.
  • LIV21 as a prognostic indicator of cancer. Indeed, when LIV21 is located in the cytoplasm, the cancer cells in the tissues are aggressive. Conversely, when the product of the expression of the LIV21 gene is preferentially localized in the cell nucleus, this is a prognostic indicator that the cells of the tissue are differentiated and quiescent and therefore non-invasive. The effectiveness of a cancer treatment can also be followed by the traceability of this protein, its derivatives and ratios with the associated proteins.
  • PKC ⁇ protein kinase C epsilon
  • the detection of E2F1 and / or E2F4 proteins is of interest.
  • the LIV21 protein forms a complex with E2F4 which is capable of inhibiting the expression of the E2F1 gene in the nucleus, the expression of the E2F1 gene being a sign of cell proliferation.
  • a decrease in the association of LIV21 with the E2F4 protein is indicative of the presence of cancer cells.
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the present invention relates to a method for the detection (in vitro or ex vivo) of cancer cells in a biological tissue sample (for example, breast, ovary, endometrium, bladder, melanoma, prostate, glioblastoma, etc.) of patients, which method comprises detecting the product of the expression of the LIV21 gene in the nucleus and / or the cytoplasm of the cells in the tissue biological sample of said patient, a location of said product of the expression of the LIV21 gene in the cytoplasm being indicative of the presence of cancer cells and a location of said LIV21 gene expression product in the nucleus being indicative of the presence of non-cancerous cells.
  • a location of said product of LIV21 gene expression in the cytoplasm is indicative of the presence of invasive and / or metastatic cancer cells.
  • the method according to the present invention further comprises the detection of the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKC ⁇ ) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene. .
  • the method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes.
  • at least one of the LIV21 / PKC ⁇ , LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 ratios can be determined in the present method. This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus. Preferably, these ratios are determined in the nucleus. Preferably, these ratios are compared to those obtained in a healthy cell.
  • the HDAC family plays a key role in the regulation of gene expression. When they are overexpressed, they result in the silencing of tumor suppressor genes hence the interest of using HDAC inhibitors in therapy associated with other inhibitors regulating the metabolic cascade involving the protein complex that contains LIV21.
  • the level of expression of each enzyme or polypeptide of the complex SUMO / Rb / HDAC or for certain cell types of the PML / SUMO / Rb / HDAC complex is an additional indicator of the proliferation state of the cell.
  • the method according to the present invention further comprises detecting the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of SUMO, Rb, HDAC and PML.
  • the methods according to the present invention also consists in using the detection of the LIV21 protein in combination with all the markers of proliferations and transcription factors which play a role in the cancerization and neurodegeneration process.
  • the method therefore further comprises detecting the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb, PML, plO7, ⁇ 130 of the pocket protein family.
  • the invention lies in the manufacture and use of antibody diagnostic chips comprising an antibody specific for LIV21 and antibodies of the various proteins of the complex associated with LIV21 according to the phases of the cell cycle, that is to say without restriction to those there, antibodies specific for RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb, PML, pi07, p130 of the pocket protein family (FIG. 1).
  • the diagnostic chips according to the present invention may comprise antibodies specific for NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, and CAF1.
  • Ki67 and CAFl are nuclear markers that sign the proliferation state of many cancers.
  • the protein chips will be used to study the expression of proteins, protein interactions and post-translational modifications, more particularly the phosphorylations and methylations of certain proteins, which signify a characteristic state of the diseased cell.
  • the state of expression and silencing of certain genes is different in diseased cells and in healthy cells.
  • the protein interactions and the metabolism of the diseased cell are different from those of the healthy cell.
  • the other aspect of the present invention is the use of the proteins mentioned above as markers of the invasiveness and metastatic aggressiveness of the cells. cancerous prostate, colon, bladder, melanoma, ovary, endometrium, cervix and cancers in neurology etc.
  • the gene expression product is detected at the protein level.
  • the protein is detected using a specific antibody.
  • the protein can be detected by Western blot analysis. In a preferred embodiment, it is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry, radiography or peroxidase labeling.
  • a significant increase in PKC ⁇ is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method may also comprise the determination of the LIV21 / PKC ⁇ ratio in the nucleus and / or the cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell. An increase in the LIV21 / PKC ⁇ ratio in the cytoplasmic fraction is indicative of cancer cells.
  • the method comprises the detection of the combination of LFV21 with the E2F4 protein, and a decrease of this association in the cell nucleus being indicative. of the presence of cancer cells.
  • the method may also include determining the LIV21 / E2F4 ratio in the nucleus and / or the cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method may also include determining the LIV21 / E2F1 ratio in the nucleus and / or the cytoplasm. This ratio can be compared to that observed in a healthy cell.
  • the method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences.
  • a second aspect of the invention relates to the human LIV21 protein as well as fragments thereof. More particularly, the present invention relates to isolated, purified or recombinant human LIV21 protein. It relates in particular to an isolated polypeptide having an apparent molecular weight of about 50-51 kD by Western Blot analysis and about 60 kD when it is sumoyled and / or a polypeptide having an isoelectric point of 5.6 in its form.
  • polypeptide comprises the two peptide sequences SEQ ID Nos. 1 and 2.
  • polypeptide comprises a third peptide sequence SEQ ID No. 3 and / or a fourth peptide sequence SEQ ID. No.
  • LIV21 further comprises a sequence selected from SEQ ID Nos. 5-55 or a sequence having 70, 80 or 90% identity therewith.
  • the LIV21 protein comprises a leucine zipper motif, a basic domain characteristic of the DNA binding domains, and a nucleation sequence. Trypsin digestion of the LIV21 protein yields more than 54 peptides corresponding to the monoisotopic peaks among all the peptides as specified in Figures 3-6; Figure 7 or 9 (Table); Figure 8 (SDS PAGE gel).
  • a third aspect of the invention relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention. More particularly, the antibody can specifically bind to a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1-55, preferably from SEQ ID NOs: 1-5 or a sequence having 70, 80 or 90% identity with those -this.
  • the present invention relates in particular to an anti-LIV21 serum manufactured by immunizing an animal or a human with a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide. comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos. 1-55, preferably from SEQ ID NOs: 1-5 or a sequence having 70, 80 or 90% identity therewith.
  • a fourth aspect of the invention relates to a kit for detecting cancer cells in a biological sample of a patient, the kit comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LFV21. according to the present invention and an anti-LIV21 serum according to the present invention.
  • the kit further comprises means for detecting the product of the expression of a gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKC ⁇ ) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene.
  • the detection means is an antibody specific for the protein in question.
  • the kit also comprises a means for detecting the product of the expression of a gene selected from the group consisting of RBP2, SUMO, HDAC, PML, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb 5 PL07, pl30, NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67 and CAFL.
  • the kit comprises an antibody chip comprising an antibody specific for LIV21.
  • the chip further comprises an antibody specific for a protein selected from PKC ⁇ , E2F1 and E2F4.
  • the chip may comprise an antibody specific for a protein selected from RBP2, SUMO, HDAC1, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb, PML, pI07, p130 of the pocket protein family.
  • the chip may also comprise an antibody specific for a protein selected from NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, and CAF1.
  • the invention relates to the use of an antibody specific for human LIV21 for the diagnosis of cancer and / or of one or more antibodies specific for a protein complex containing LIV21, for example antibodies specific for RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb, PML, p107, p130 of the pocket protein family.
  • the diagnosis is made ex vivo on samples of a patient.
  • FIG. 1 Antibody chip.
  • Figure 2 diagram of nuclear protein interactions and consequences on the study of therapeutics.
  • Figure 3 Profile of the LJV21 protein by mass spectrometry (Maldi) M (H +) for the one-dimensional gel band corresponding to the protein doublet migrating at 50kD.
  • the peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% of TFA (trifluoroacetic acid).
  • a saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnamic acid matrix is made in the same solvent.
  • the same volume of the two solutions is taken, mixed and 1 microliter is deposited on the Maldi plate for analysis.
  • the spectrum was made on a Voyager with a software type Waters.
  • Figure 4 is a zoomed profile of the chromatogram of the 49 KD band without smoothing.
  • Figure 5 is the second chromatogram corresponding to the 12% one-dimensional acrylamide gel band migrating at 49 KD and revealed by coumassie blue and LIV21 antibody. The spectrum was made on a Brucker.
  • Figure 6 is the third chromatogram corresponding to the one-dimensional acrylamide gel band migrating at 53 kD and revealed by coumassie blue and LIV21 antibody. The spectrum was also performed on a Brucker.
  • Figure 7 a table of monoisotopic peaks with a value M H +. The masses are given with three digits behind the comma by the proteomic platforms because they consider that it is the limit of the acquisition accuracy of MALDI TOF machines.
  • Figure 8 shows a 2D SDS PAGE gel separating the twelve polypeptides hooked by the LI V21 antibody.
  • Figure 9 depicts Nano LC-ESI MS characterized peptides including LIV21a and LIV21b.LIV21c, LIV21d, LIV21e.
  • the table describes an experiment of NanoLC-ESI MS.
  • NanoLC allows the separation of peptides derived from the tryptic hydrolysis of the protein. The eluted peptide fragments are ionized by electrospray, the formed ions detected by mass spectrometry (Q-TOF analyzer). These ions characterize for each a peptide specific for the protein.
  • Caption BEGIN IONS: Starting Ions.
  • PEPMASS Peptide mass.
  • the corresponding MSMS spectrum is defined by the column of numbers between Begin ions and End ions which corresponds to an amino acid sequence (each Amino Acid having a specific mass except Leucine and Isoleucine which have the same molecular weight).
  • the first column with a 4 decimal number corresponds to the mass of the "son” ions.
  • the second column (1:45) corresponds to the intensity of these "son” ions.
  • Figure 9 describes the analyzes in MSMS giving a set of polypeptides assignable to the protein LIV21 and its complex or contaminants according to the different observers of the different platforms of proteomics sub-contractors.
  • Figure 10 describes the MALDI TOF assays giving a set of polypeptide sequences assignable to LIV21. and its complex and sometimes different contaminants according to the observers of the different platforms of proteomics subcontractors.
  • the Mascot research parameters are: trypsin enzyme, variable modifications: carbamethylation and oxidation of methionines, no limit of molecular weight, without restriction of isoelectric point. Mass type: monoisotopic. Mass error (MS): depending on the observer 50 ppm or 100 ppm.
  • Non-tryptic cut 1 The masses entered are M (H +) / real masses. For chromatogram 1 the cysteines are blocked by iodoacetamide. The possibility of digestion of Proméga bovine trypsin may be incomplete with missed cut.
  • Gallus Gallus gi 50732569
  • mouse Syntaxin Histatin-3-2 variant (P15516-00-01-00)
  • ZN575-Human G6 P translocase
  • HSP60 chaperonine arginine deiminase
  • ferredoxin-NADP (+) reductase pseudomonas polyribonucleotidyl transferase
  • dehydrolipoamide dehydrogenase common sequences with Gallus Gallus (gi 50732569), mouse Syntaxin, Histatin-3-2 variant (P15516-00-01-00), ZN575-Human, G6 P translocase, HSP60 chaperonine
  • arginine deiminase ferredoxin-NADP (+) reductase
  • pseudomonas polyribonucleotidyl transferase pseudomonas polyribonucleotidyl transferase
  • Figure 11 Alignments between histatin-3-2 variant, PATF and Q7TCL4 (Turnip mosaic virus) AAN08045.2.
  • Figure 14 is the morphology of MCF7 cells treated or not treated with 25 nM TPA.
  • Figure 15 is a FACS analysis; representation for each phase of the cell cycle of the percentage of cells as a function of processing time: Figure 15 A. Phase S, Figure 15B. Phase G2 / M, Figure 15C. phase G0 / G1. The scale of the abscissa is not proportional to the duration of treatment.
  • Figure 16 is a Western Blot comparing total extracts (ET) and nuclear extracts (EN) and showing TPA inhibition of expression of LIV21 phosphorylation.
  • Figure 16 A as a function of treatment time with 25 nM TPA;
  • Figure 16B compared to LIV21 in protein extracts, at 12h treatment with 25 nM TPA.
  • Figure 17 is a study of the nuclear translocation of LIV21 by immunocytochemistry with an anti-LIV21 primary antibody (in green) in cultures treated or not treated with 25 nM TPA.
  • the nuclei are stained red with propidium iodide.
  • the nuclei are mostly stained yellow at 12H until 24H because the primary anti-LIV21 antibody (in green) is nuclear while it is predominantly cytoplasmic at 72H (red nuclei and green cytoplasm).
  • Figure 18 shows the expression as a function of the 25nM TPA processing time of the PKC ⁇ and PKC ⁇ proteins in total extracts.
  • P ⁇ -tubulin expression serves as a control of the amount of total protein deposited in the wells.
  • Figure 19 shows the comparative expression of PKC ⁇ and LIV21 in immunocytochemistry on cultures of MCF-7 cells treated and untreated by TPA at 25 nM for 12h, performed with anti-LIV21 and anti-PKC ⁇ antibodies in green, and propidium iodide staining the DNA in red.
  • LIV21 is translocated into the nucleus by specific inhibition of PKC ⁇ .
  • PKC ⁇ is weakly expressed at 12h in the presence of TPA. Indeed, we observe the red nuclei and little green color in the cytoplasm.
  • the expression of LIV21 is strong in the nuclei which are stained yellow (merge) by both the anti-LIV21 antibody (green) and the propidium iodide specific for the nuclei.
  • Figure 20 shows the effect of the PKC ⁇ inhibitory peptide on the expression pattern of LIV21 by immunocytochemistry on control cultures or treated with 1 ⁇ M peptide, 2 ⁇ M peptide, or 25 nM TPA. The treatments last 12 hours. The cells are labeled with anti-LIV21 (green) and propidium iodide (red).
  • Figure 21 shows the effect of the PKC ⁇ inhibitory peptide on the expression pattern of LIV21 in cytoplasmic (C) and nuclear (N) cell fractions, after a 12h treatment with TPA (25 nM) or by the peptide (2 ⁇ M).
  • FIG. 22 shows by immunoprecipitation (IP) the coexistence between PML / SUMO and LIV21: a yellow fluorescence (merge) corresponding to the co-localization of PML / SUMO and LIV21 in the cell nuclei is observed.
  • FIGS. 23 and 24 show by immunocytochemistry the coexistence between PML / SUMO and LIV21.
  • the co-labeling (by fluorescent immunostaining) of LIV21 (green) and SUMO-I (red) in the nuclei of cells treated or not treated with TPA for 24h and 72h show that 24h LIV21 is translocated in the nucleus where SUMO coexists.
  • PML Merge: yellow nuclei
  • at 72H, LIV21 (green) is cytoplasmic.
  • the nuclear bodies containing the SUMO1 protein are called PML bodies.
  • Figure 25 shows that from a chip of 60 biopsies including 50 of skin cancer and 9 of normal tissue and a control T; the nuclear expression of LIV21 in healthy tissue biopsies and the expression of cytoplasmic LIV21 in biopsies of metastatic cancers.
  • Figure 43 T2N0M0, poorly differentiated skin cancer
  • image 58 healthy tissue from the same subject with mildly differentiated skin cancer (cell nuclei stained yellow)
  • image 40 metastatic carcinoma 10 cm
  • image 17 metastatic carcinoma of 3.5cm.
  • the cell nuclei are stained red.
  • Figure 26 is, as in Figure 25, a second example of nuclear localization of LIV21 in the control and healthy tissue (# 52) (the cells nuclei are stained yellow), the sick subject # 7 of a carcinoma of squamous pharynx cells (moderately differentiated T4N0M0) In images # 7 of cancerous tissue the cell nuclei are stained red.
  • Figure 27 is a sample of advanced bladder cancer on cystectomy (urothelial grade III carcinoma infiltrating the chorion and muscularis) versus healthy bladder tissue of the same patient with internal control (PI): preimmune PI serum before the rabbit is immunized against LIV21, red marking of nuclei with propidium iodide.
  • PI internal control
  • the invention relates to the identification of antigens in cell lysates by immunoprecipitation.
  • the analysis of the physical interaction of different proteins associated with E2F4 and E2F1 was studied by co-immunoprecipitation of protein complexes. This analysis has highlighted a new marker with a diagnostic and prognostic utility for cancer.
  • a marker of PATF proliferation associated with the E2F family had been demonstrated (Crisanti) by the characterization of exons without the gene being cloned in humans, or a corresponding protein found in humans.
  • this new molecule LTV21 could have diagnostic value for the following reasons.
  • the inventor was able to observe that, in all the proliferating tumor cells, this protein is cytoplasmic instead of nuclear. It is therefore not in the good cell compartment to be active on stopping the multiplication of cells.
  • LIV21 has thus been observed in mammals.
  • the expression panel of LTV21 as a function of cell state was studied on tissues from different mammals. Protein analyzes on the different tissue samples confirmed that expression of this transcription factor appears to be associated with progression to a quiescent cell state (mitosis arrest and differentiation initiation).
  • LIV21 is present in actively proliferating tumor cell lines and its expression is essentially cytoplasmic. The same results are obtained on human mammary adenocarcinoma.
  • the present invention relates to a new screening test for abnormalities of reinduction of the cell cycle.
  • This diagnostic test is based on the study of the mechanism of action of the new gene, coding for a new potential transcription factor called LIV21, which negatively regulates proliferation.
  • LIV21 is involved in stopping cell proliferation.
  • LFV21 is cytoplasmic when cells proliferate as it becomes nuclear when cells become shedding.
  • E2F4 The latter is known to negatively regulate the cell cycle in association with the P 130 protein or pocket protein of the RB family.
  • LIV21 in tumor cells (cytoplasmic localization) and in physiological cells (nuclear localization) suggests in any case that its functioning is disrupted when cellular development becomes anarchic.
  • this ubiquitous transcription factor has an expression and a location regulated according to the cellular state: stronger expression and nuclear localization for the cells leaving the mitotic cycles, weak expression and cytoplasmic localization for actively proliferating cells such as human tumor cells.
  • LIV21 appears as a key molecule to stabilize another transcription factor (E2F4) in the cell nucleus and thus induce cell proliferation arrest.
  • LIV21 in the cytoplasmic compartment is regulated by PKC ⁇ . Indeed, when LIV21 is phosphorylated by PKC ⁇ , LIV21 is located in the cytoplasmic compartment. Conversely, when the phosphorylation of LIV21 by PKC ⁇ is inhibited, LIV21 is located in the nuclear compartment.
  • the present invention thus relates to the LIV21 protein as well as derivatives and fragments thereof.
  • the LIV21 protein is a human protein of about 300 amino acids. However, depending on the alternative splicing it undergoes, it occurs in at least three different size forms ( Figure 8). Moreover, it can be phosphorylated or sumoylated. It has an apparent molecular weight between 50 kD and 51 kD in Western Blot analyzes. This apparent molecular weight is 60 kD when LIV21 is sumoylated. In its 51 kD form, phosphorylated or otherwise, its isoelectric point is 5.6 and its intensity is 13632. This protein has been characterized by mass spectrometry (Maldi) (Example 1, Figures 3-13 3).
  • RTLLLPAVSRQ (SEQ ID NO: 6)
  • LGFMEEWDVGEIMLR (SEQ ID NO: 7)
  • FYAWMIEQAPFSSLAQEGK (SEQ ID NO: 9)
  • NLYTEIVYTPISTPDGTLVK (SEQ ID NO: 10)
  • RTVRPLNIEVGVLPKT (SEQ ID NO: 14)
  • RRSVQAMLPGADVFPYTIRV (SEQ ID NO: 15)
  • GDLWFMSHQGHK (SEQ ID NO: 41)
  • YAFDFYEMTSR (SEQ ID NO: 42)
  • FVFALILALMLSMCG (SEQ ID NO: 51)
  • TLQIFNIEMKSK (SEQ ID NO: 52)
  • a preferred LIV21 protein comprises at least one sequence chosen from SEQ ID Nos: 1-55 or a sequence exhibiting 70%; 80% or, preferably, 90% homology therewith.
  • the LIV21 protein comprises a leucine zipper motif, a basic domain characteristic of DNA binding domains, and a nucleation sequence.
  • the present invention relates to an isolated, purified or recombinant human polypeptide having a sequence comprising the sequence SEQ ID No. 1 and / or SEQ ID No. 2.
  • the polypeptide comprises the sequences SEQ ID Nos. 1 and 2.
  • the polypeptide comprises (in addition) a sequence selected from SEQ ID Nos. 3-55, preferably from SEQ ID NOs 3-5, or a sequence having 70, 80 or 90% identity therewith.
  • it comprises a sequence selected from one of the peptide sequences obtained by MALDI (FIG.
  • the invention also relates to the two peptides LIV21a (SEQ ID No. 1) ) and LIV21b (SEQ ID No. 2).
  • the invention also relates to a peptide having a sequence selected from SEQ ID Nos. 3-55, preferably from SEQ ID NOs 3-5, or a sequence having 70, 80 or 90% identity therewith. It also relates to peptides comprising at least 10 consecutive amino acids of human LIV21, preferably at least 20, 30 or 50 consecutive amino acids of LIV21.
  • the invention further relates to derivatives of interest of LIV21 which are for example fusion proteins in which LIV21 is fused to marker proteins such as GFP.
  • LTV21 protein can be labeled by any means known to those skilled in the art.
  • the present invention also relates to an antibody that specifically binds to a polypeptide according to the present invention, preferably human LIV21, a fragment or a derivative thereof.
  • the antibody specifically binds to a LIV21a or LIV21b peptide.
  • the antibody specifically binds to a polypeptide comprising a sequence selected from SEQ ID Nos. 1-55, preferably from SEQ ID NOs 1-5, or a sequence having 70, 80 or 90% of identity with these.
  • the antibodies may be polyclonal or monoclonal. It may also be fragments and derivatives of antibodies having substantially the same antigenic specificity, in particular antibody fragments (eg Fab, Fab'2, CDRs), humanized, polyfunctional, single-stranded antibodies ( ScFv), etc.
  • Antibodies the invention may be produced using conventional methods, including immunizing an animal and recovering its serum (polyclonal) or spleen cells (so as to produce hybridomas by fusion with appropriate cell lines) .
  • Said antibodies can be obtained directly from human serum or from serum of animals immunized with the proteins or peptides according to the present invention.
  • Methods for producing polyclonal antibodies from a variety of animal species including rodents (mice, rats, etc.), primates, horses, pigs, sheep, rabbits, poultry, etc. are described for example in Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al., 1971).
  • the antigen is combined with an adjuvant (eg, Freud's adjuvant) and administered to an animal, typically by subcutaneous injection. Repeated injections can be performed. Blood samples (immune serum) are collected and immunoglobulins are separated.
  • the present invention relates to an anti-LIV21 serum manufactured by immunizing an animal with the polypeptide according to the present invention.
  • the animal has been immunized with the peptide LIV21a and / or LIV21b.
  • the animal is immunized with these two peptides.
  • the present invention also relates to an anti-LIV21 serum manufactured by immunizing an animal or a human with a polypeptide according to the present invention, in particular a polypeptide comprising a peptide sequence selected from SEQ ID Nos 1-55, preferably from SEQ ID NOs 1- 5, or a sequence having 70, 80 or 90% identity therewith.
  • the peptides may be coupled to a carrier protein such as hemocyanin, and then injected into an animal, for example a rabbit, for immunization.
  • a carrier protein such as hemocyanin
  • Polyclonal antibodies were obtained from these two peptides by immunizing two rabbits and blowing a rabbit to have a preimmune serum.
  • the subject of the invention is also the use of the antibodies according to the invention for the detection and / or purification of the human LIV21 protein.
  • antibodies specific for LIV21 can be used for the detection of these proteins in a biological sample. They thus constitute a means of immunocytochemical or immunohistochemical analysis of LIV21 expression on tissue sections.
  • the antibodies used are labeled to be detectable.
  • the antibodies can be labeled indirectly.
  • the antibodies are labeled.
  • Markers include radiolabels, enzymes, fluorescent, luminescent, chemical, magnetic particle markers, gold tagging, biotin / avidin labeling, peroxidase, etc.
  • the subject of the invention is also a method for detecting the LIV21 protein in a biological sample, comprising a step of suitable treatment of the cells by any appropriate means making it possible to make the intracellular medium accessible, a step of bringing the said intracellular medium into contact as well as obtained with an antibody specific for the human LIV21 protein and a step of detection by any appropriate means of the LIV21 complex-formed antibody.
  • the cytoplasmic and / or nuclear extracts are prepared, and these extracts are contacted with the human LIV21 protein specific antibody.
  • the present invention teaches the development of the diagnostic test also for monitoring the evolution of a cell proliferation.
  • the present invention makes it possible to monitor the evolution of cell proliferation on fresh cells or tissues, on frozen cells or tissues and on tissues treated, inter alia, with paraffin.
  • the applications can be the diagnosis of cancer as well as the follow-up of the evolution of a cellular proliferation.
  • the cancer is selected from cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, sarcoma, leukemia and glioblastoma, without being limited to these.
  • the predominantly cytoplasmic state of this protein in cancer cases compared to its nuclear situation in healthy cells is a geographical and structural difference which makes it possible, without the need for a fluorescent marker, to differentiate spectral profiles of the functional pattern of the tissue. cancerous versus healthy tissue and thus to make the diagnosis.
  • the cytoplasmic localization of LIV21 is an indicator of the aggressiveness and metastatic potential of cancer.
  • the detection of LIV21 expression indicates the presence of cancer cells, more particularly invasive, aggressive and / or metastatic cancer cells.
  • the nuclear localization of LIV21 is an indicator of healthy quiescent cells or well differentiated tissues.
  • the invention further provides cancer diagnostic or prognostic methods for detecting the cytoplasmic localization of a nuclear localized transcription factor in healthy cells.
  • the present invention relates to a method for the detection of cancer cells in a biological sample of a patient comprising detecting the product of the expression of the LIV21 gene in the nucleus and / or the cytoplasm of the cells in the biological sample of said patient, a location of said LIV21 gene expression product in the cytoplasm being indicative of the presence of cancer cells and a location of said product of LIV21 gene expression in the nucleus being indicative of the presence of non-cancerous cells.
  • a location of said product of LIV21 gene expression in the cytoplasm is indicative of the presence of invasive and / or metastatic cancer cells.
  • the method preferably comprises a prior step of suitably treating the cells contained in the sample by any suitable means for making the intracellular medium accessible.
  • the method optionally includes a step of comparing with a biological sample that does not contain cancer cells.
  • the method according to the present invention further comprises the detection of the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKC ⁇ ) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene.
  • the method may include the detection of the product of the expression of two of these genes or three genes.
  • LIV21 / E2F4 and LIV21 / E2F1 can be determined in the present method. This ratio can be determined in the cytoplasm and / or in the nucleus. Preferably, these ratios are determined in the nucleus. Preferably, these ratios are compared to those obtained in a healthy cell.
  • the method may also include detecting the product of expression of at least one gene selected from the group consisting of RBP2, E2F4, E2F1, SUMO,
  • the method may further comprise the detection of the product of expression at least one gene selected from the group consisting of NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, ⁇ 161, and CAF1.
  • the method may include detecting an interaction between some of these proteins and / or detecting a post-translational modification of one of these proteins.
  • the gene expression product is detected at the level of the protein.
  • the protein is detected using a specific antibody.
  • the method comprises a step of contacting the cells of the biological sample with an anti-human LIV21 antibody.
  • the antibodies can be monoclonal or polyclonal.
  • the anti-LIV21 antibody may for example be an anti-LIV21 serum.
  • the method can use antibodies specific for the PKC ⁇ , E2F1 and E2F4 proteins, respectively.
  • the polyclonal and monoclonal antibodies directed against PKC ⁇ , E2F1 and E2F4 are commercially available.
  • PKC ⁇ of a polyclonal rabbit antibody (Santa Cruz Technology, sc-214), for E2F1, a polyclonal rabbit antibody (Santa Cruz Technology, sc-860), and for E2F4, a polyclonal rabbit antibody (Santa Cruz Technology, sc-866).
  • the antibodies are labeled directly or via a secondary antibody. Antibody labeling techniques are well known to those skilled in the art.
  • the protein can be detected by Western blot analysis.
  • Western blot analysis can be performed on nuclear and / or cytoplasmic extracts of the cells contained in the patient's sample. Briefly, the proteins are migrated in a gel and then transferred to a membrane. Then, this membrane is incubated in the presence of antibodies and antibody binding is eventually revealed using labeled secondary antibodies.
  • the protein is detected by immunohistochemistry, immunocytochemistry or immunoradiography. These techniques are well known to those skilled in the art. Immunocytochemistry analysis may be performed on whole cells from the sample or derived therefrom, for example by culture cellular. It can also be performed on isolated nuclei. Immunohistochemistry analysis can be done on sections of breast tissue.
  • an immunocytochemical analysis may comprise the following steps. However, it is understood that other preparatory modes can be implemented. Cells from the biological sample are cultured, preferably on slides (Lab Tek, Nunc, Germany), then washed with buffer and fixed with paraformaldehyde (eg 4%). A saturation step is preferably performed by incubating the cells with S buffer (PBS-Triton X100 0.1% - 10% FCS). The cells are then incubated with the primary antibody and then washed and incubated with a fluorescent secondary antibody, if necessary. The nuclei can be labeled with propidium iodide (Sigma). The slides are moviol mounted for observation by fluorescence microscopy.
  • isolated nuclei removed during nuclear extraction can be fixed with paraformaldehyde (eg 4%).
  • the suspensions of nuclei are deposited between lamella and lamella and the observation is made by fluorescence microscopy and confocal microscopy.
  • the primary antibodies are, for example, rabbit antibodies and the secondary antibodies are labeled antibodies directed against rabbit IgG.
  • the present invention also relates to the use of a protein chip for detecting the expression of one or more of these proteins, and / or an interaction between two or more of these proteins, and / or post-translational modification. one or more of these proteins.
  • a polypeptide according to the present invention in particular LIV21 or a fragment thereof, or an antibody specific thereto, a fragment or a derivative thereof retaining the binding specificity, may advantageously be immobilized on a support, preferably a protein chip.
  • a protein chip is an object of the invention.
  • This chip may also contain at least one polypeptide selected from the group consisting of protein kinase C epsilon (PKC ⁇ ), RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDAC1, cycE / cdk2, cdk1, CREB1, p300, Rb, PML, p107, p130 of the pocket protein family or at least one antibody specific for one of these polypeptides, a fragment or a derivative thereof that retains the binding specificity.
  • the chip may further comprise other polypeptides well known to those skilled in the art as being of interest for the detection and / or prognosis of cancer, or antibodies specific thereto. These polypeptides may for example be selected from the following list: NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, and CAF1.
  • the protein chips according to the present invention can be prepared according to the techniques well known to those skilled in the art. In practice, it is possible to synthesize the polypeptides attached directly to the protein chip, or to carry out an ex situ synthesis followed by a step of fixing the polypeptide synthesized on said chip.
  • polypeptides or antibodies to be fixed can be purified from a cell.
  • Supports include smooth supports (eg, metal, glass, plastic, silicon, and ceramic surfaces) as well as textured and porous materials.
  • Such carriers also include, but are not limited to, gels, rubbers, polymers, and other soft materials. The supports do not need to be flat.
  • the proteins or antibodies of the chip may be attached directly to the support or attached via a spacer or link.
  • an antibody specific for LIV21, a fragment or a derivative thereof retaining the binding specificity is immobilized on the solid support.
  • this chip provides a convenient way to measure the LIV21 expression product.
  • the chip comprises at least one antibody specific for a polypeptide selected from the group consisting of PKC ⁇ , RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, CycE / cdk2, cdkl, CREBl, p300, Rb 5 PML 5 plO7, pl30 of the pocket protein family, preferably PKC ⁇ , E2F1, and E2F4.
  • the chip further comprises at least one antibody specific for a polypeptide known to those skilled in the art as being of interest for the detection and / or prognosis of a cancer, for example NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, ⁇ 65, Ki67, and CAF1.
  • the chip may comprise an antibody or a fragment or derivative thereof having the same specificity.
  • the protein chips according to the invention are also extremely useful for proteomic experiments, which studies the interactions between different proteins.
  • peptides representing the various proteins on a support are fixed. Then, said support is brought into contact with labeled proteins, and after an optional rinsing step, interactions between said labeled proteins and the peptides attached to the protein chip are detected.
  • protein chip is intended to mean a support on which are fixed polypeptides or antibodies, each of which can be identified by its geographical location. These chips differ mainly in size, support material, and possibly the number of polypeptides attached thereto.
  • Protein chips may also be useful for screening test compounds.
  • the present invention also relates to a method for the detection of cancer cells in a biological sample of a patient comprising detecting the product of the expression of the LIV21 gene in the nucleus and / or the cytoplasm of the cells in a sample of cells in the biological sample of said patient, which method is characterized in that it comprises at least: (a) bringing said biological sample into contact with a protein chip as defined above, and (b) revealing by any suitable means of the antigen-antibody complexes formed in (a), for example by EIA, ELISA, RIA, or immunofluorescence.
  • Other detection methods are described in detail in the following documents: US2004152212.
  • the protein chips can be manufactured using conventional methods described (Lubman David M 5 QIAO Tiecheng Alex Mathew J ABY etc ..) or new hybridization automation tools like reading US2004152212 and Yu Xinglong US 2005019828 and novel carriers that cleave Klages Claus Peter polypeptides and (example, Figure 2).
  • the biological samples come from a patient potentially suffering from cancer or cancer in a proven way.
  • biological sample is meant in particular a sample of the biological fluid type, living tissue, tissue fragment, slime, organ or organ fragment, or any culture supernatant obtained using a sample.
  • the method according to the present invention may comprise a step of taking a biological sample from the patient.
  • the detection step can be performed directly on a section of tissue of the sample, on a culture of cells from the sample, on total cell extracts, nuclear and / or cytoplasmic extracts.
  • the patient's specimen may come from a puncture, a biopsy, a crushed cell, a bronchial aspiration, a blood sample or a urine sample.
  • a significant increase in PKC ⁇ is indicative of the presence of cancer cells. More specifically, the amount of PKC ⁇ in healthy cells is compared with the amount of PKC ⁇ in the cells of the sample and the significant increase is determined by this comparison.
  • the method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the LIV21 / PKC ⁇ rate. This LIV21 / PKC ⁇ ratio increases in the cytoplasmic fraction of cancer cells compared to healthy cells.
  • the method comprises detecting the association of LIV21 with the E2F4 protein, and a decrease in this association being indicative. of the presence of cancer cells. Detection of the association of LIV21 with the E2F4 protein can be achieved by concomitant detection of LIV21 and E2F4 and / or concomitant HDAC1 measurement.
  • the method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the E2F4 / LIV21 level. This ratio E2F4 / LIV21 decreases in the nucleus of cancer cells compared to healthy cells.
  • the presence of the E2F1 protein in the nucleus is indicative of the presence of cancer cells.
  • the method according to the present invention may optionally comprise the measurement of the E2F1 / LIV21 level. This ratio E2F1 / LIV21 increases in the nuclear fraction of cancer cells compared to healthy cells.
  • the method according to the present invention allows in particular the detection of metastasized cancer, therapeutic monitoring and / or treatment recurrences and to determine the degree of invasiveness of a cancer.
  • the specificity of the detection can be linked to the crossings of the information obtained by the existence and the topography of LIV21 by all the means of imaging and spectroscopy and obtained by the association with other known oncological indicators via protein chips or proteins. microarrays.
  • detection based on LIV21 may be associated with the detection of other markers of cancer, in particular breast cancer, known to those skilled in the art.
  • the present invention relates to a method of therapeutic follow-up of an anti-cancer treatment in a patient suffering from a cancer comprising administering the anti-cancer treatment to said patient and detecting cancer cells in a biological sample. of the patient according to the method of the present invention. A decrease in cancer cells will be indicative of the effectiveness of the treatment.
  • the detection of cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention may be carried out once or several times during the anti-cancer treatment or after the anticancer treatment.
  • the biological sample is from the tissue affected by the treated cancer.
  • the present invention also relates to a method for detecting recurrence following anti-cancer treatment of cancer in a patient comprising detecting cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention.
  • the detection of cancer cells in a biological sample of the patient according to the method of the present invention can be carried out once or several times after the anti-cancer treatment.
  • the detection of cancer cells is indicative of recurrence.
  • the biological sample is from the tissue affected by the treated cancer.
  • the present invention also describes a kit for implementing a method according to the invention. More particularly, the invention relates to a kit for the detection of cancer cells in a biological sample of a patient comprising one or more members selected from the group consisting of an antibody that specifically binds to human LIV21 according to the present invention. and an anti-LIV21 serum according to the present invention.
  • the kit comprises antibodies that specifically bind to human LIV21.
  • the kit according to the present invention may comprise reagents allowing the detection of a LIV21 complex-an antibody produced during an immunological reaction.
  • the kit according to the present invention further comprises means for detecting the product of the expression of at least one gene selected from the group consisting of the protein kinase C epsilon (PKC ⁇ ) gene, the E2F1 gene and the E2F4 gene.
  • PLC ⁇ protein kinase C epsilon
  • the present invention also relates to a diagnostic composition comprising one or more elements selected from the group consisting of an antibody according to the present invention and a serum according to the present invention.
  • Anti-cancer Therapy In the context of anti-cancer therapy, one can consider increasing the amount of LIV21 present in the nucleus. For that, we could favor the nuclear localization of LIV21, for example by decreasing PKC ⁇ activity in cancer cells and using HDAC inhibitors.
  • PKC ⁇ in cancer cells it is possible to reduce the activity of PKC ⁇ in cancer cells.
  • This decrease in activity can be achieved by decreasing the activity of the PKC ⁇ protein or by decreasing its expression.
  • a decrease in PKC ⁇ protein activity can be achieved by administering cancer inhibitors to the cancer cells.
  • Inhibitors of the PKC ⁇ protein are well known to those skilled in the art.
  • a decrease in the expression of the PKC ⁇ protein can be obtained by using antisense or siRNA specific for the PKC ⁇ gene. Kits are commercially available.
  • the techniques concerning inhibitions by antisense or siRNA are well known to those skilled in the art. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A 2004, Platinum 1998, Hughes 1987)
  • the present invention therefore relates to a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKC ⁇ protein. It also relates to the use of a pharmaceutical composition comprising an inhibitor of the PKC ⁇ protein as a medicament, in particular for the preparation of a medicament for treating a cancer. Finally, it relates to a method of treating cancer in a patient comprising administering to the cancer cells an inhibitor of the PKC ⁇ protein, the inhibitor of the PKC ⁇ protein making it possible to reduce or abolish the cancerous phenotype of the treated cells.
  • the inhibitor of the PKC ⁇ protein decreases the activity of the PKC ⁇ protein.
  • the inhibitor of the PKC ⁇ protein decreases the expression of the PKC ⁇ protein.
  • the cancer is selected from cancers of the breast, bladder, ovary, lung, skin, prostate, colon, liver, sarcoma, leukemia and glioblastoma, without being limited to these.
  • the cells affected by the neurodegenerative disease are usually neurons, motor neurons, etc.
  • the neurodegenerative disease is selected from Alzheimer's disease, Huntington's disease, Parkinson's disease and amyotrophic lateral sclerosis (ALS).
  • ALS amyotrophic lateral sclerosis
  • An increase in the activity of the PKC ⁇ protein can be obtained by administering to the cells affected by the neurodegenerative disease activators of the PKC ⁇ protein.
  • Activators of the PKC ⁇ protein are well known to those skilled in the art (Toma O (2004), Activation of PKC by DAG, PUFA: oleic acid, linoleic acid, arachidonic acid, etc. Activation and proteolysis of PKCs in gonadotropic cells: Communication 2004 by Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille).
  • An increase in the expression of the PKC ⁇ protein can be obtained by using expression vectors coding for the PKC ⁇ protein and allowing it to be overexpressed in the cells affected by the neurodegenerative disease.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition comprising an activator of the PKC ⁇ protein or an expression vector encoding the PKC ⁇ protein. It also relates to the use of an activator of the PKC ⁇ protein or of an expression vector encoding the PKC ⁇ protein for the preparation of a medicament for the treatment of a neurodegenerative disease.
  • the invention relates to methods for the selection, identification, characterization or optimization of cell-depleting active compounds based on the measurement of the nuclear or cytoplasmic localization of LIV21, or the binding of LIV21 protein to the E2F4 protein.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the nuclear or cytoplasmic localization of the cell.
  • LIV21 expression product An increase in Nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. A decrease in the nuclear localization of LIV21 indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the PKC ⁇ protein. A decrease in PKC ⁇ expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. An increase in PKC ⁇ expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of complex
  • LIV21 / E2F4 An increase in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. A decrease in the level of LIV21 / E2F4 complex indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the selection, identification, characterization or optimization of active compounds of therapeutic interest comprises contacting a candidate compound with a cell and determining the level of expression of the gene. encoding the E2F1 protein. A decrease in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to decrease or abolish cell proliferation. An increase in E2F1 expression indicates that the candidate compound is active to treat or prevent a neurodegenerative disease.
  • the subject of the invention is also a method for screening a compound capable of interacting in vitro, directly or indirectly, with LIV21, characterized in that: in a first step, the candidate compound is contacted with LIV21 and, in a second step, the complex formed between said candidate compound and LI V21 is detected by any suitable means.
  • the subject of the present invention is also a method for screening a compound capable of modulating (activating or inhibiting) the activity of the LIV21 protein, characterized in that: in a first step, cells of a biological sample expressing the LIV21 protein with a candidate compound, in a second step, the effect of said candidate compound on the activity of said LIV21 protein is measured by any appropriate means, and in a third step candidate compounds capable of modulating said activity.
  • the activity of LIV21 can for example be estimated through the evaluation of the ability of the cell to divide, by measuring the expression of the E2F1 gene, or by the cytoplasmic and / or nuclear localization of LIV21. .
  • the candidate compound can be a protein, a peptide, a nucleic acid (DNA or RNA), a lipid, an organic or inorganic compound.
  • the candidate compound could be an antibody, an antisense, a ribozyme or a siRNA.
  • EXAMPLE 1 The inventor has carried out mass spectrometry (MALDI) for the LIV21 protein from a one-dimensional acrylamide gel.
  • LIV21 protein was digested with trypsin.
  • the peptides resulting from the digestion are solubilized in a solvent: acetonitrile / water (1/1) containing 0.1% TFA (trifluoroacetic acid).
  • a saturated solution of the alpha cyano-4-hydroxycinnamic matrix was prepared in the same solvent. The same volume of the two solutions was taken, 1 ⁇ l was mixed and deposited on the MALDI plate for analysis.
  • Mass spectrometry showed that the trypsin-digested LIV21 protein showed 54 peptides (see Figures 3-4).
  • the LIV21 protein was characterized by a molecular weight of 50 kD, highlighted by Western Blot, the first MALDI results are not probands, the inventor has made a two-dimensional gel SDS PAGE ( Figure 8) more than ten proteins were revealed by staining with silver nitrate but the very small amount of material did not allow testing of samples from this MALDI gel or MSMS.
  • the inventor carried out a third MALDI analysis which yielded interesting results, especially on the 49KD gel band on gallus gallus and a variant of histatin (figure, the inventor then looked at the sequence alignments which allowed confirm homologies between gallugallus, PATF, Q7TCL4 and the histatin and gallus gallus polypeptides (Figure 10-13).
  • the LIV21a peptide is located between an interaction site with the Rb / p107 / ⁇ 130 protein (ITCCE) and an SUMO1 sumoylation site.
  • the sequence of this peptide is the following: PeptideLIV21a RVYGPLTNPKPQ SEQ ID No. I
  • the LIV21b peptide is located between a sumoylation site (PKPG) and a phospholipase C (YVKI) site followed by (KKKRK) NLS.
  • the sequence of this peptide is the following: PeptideLIV21b CYRSILHTKV SEQ ID No 2
  • PKCs Protein Kinase C
  • the cell line MCF-7 The cell line MCF-7
  • the MCF-7 line is a non-clonal human breast adenocarcinoma cell line. During their differentiation induced by exogenous factors, these cells develop hypertrophy, membrane protrusions and a tendency to dissociate from each other. They acquire a secretory phenotype characterized by the appearance of numerous granules and secretory canaliculi.
  • PLCs protein kinases C
  • TNF for induction of apoptosis
  • TPA (12-O-tetradecanoyl phorbol-13- SUMOate) for the induction of differentiation and thus for the study of the exit of the cell cycle.
  • TPA cytosolic protein kinase C
  • TPA increases the capacity for migration of MCF-7 cells in vitro and a short treatment of these cells by TPA induces cell expansion and microtubule organization characteristic of their differentiation.
  • the inventor verified the expression of LIV21 in these cells at the protein level.
  • the inventor has discussed the study of the expression of the protein LIV21 by the technique of the western blot, with an anti-LIV21 antibody, in the MCF-7 cells compared to the mammary tissues.
  • the anti-LIV21 antibodies were obtained by the method described below.
  • LIV21 is expressed as well in mammary tissues as in MCF-7 cells, in the form of a doublet migrating at an apparent molecular weight of 50 kDa.
  • the specific peptide sequences are sequences No. 1 and No. 2 These peptides were injected into rabbits (NZ W ESD 75 female 2.3kg at day 0) In accordance with standard immunization procedures, such as:
  • the reactivity of the serum obtained was tested to bind peptide sequences # let 2. At J60 the serum showed good reactivity with each sequence.
  • the serum produced is not related to any member of the E2F family.
  • TPA induces proliferation arrest and differentiation of tumor cells of the MCF-7 line.
  • the cell growth was previously followed over three days of culture in the presence or absence of TPA at a concentration of 25 nM (FIG. 13).
  • Cell counts show variation in growth kinetics between untreated and TPA treated cultures. Indeed, from the second day of culture, the number of cells between the two treatment conditions is significantly different, the TPA already inducing cell proliferation arrest. After 3 days of treatment, the control cultures have twice as many cells as the treated cultures. TPA at a concentration of 25 nM therefore inhibits proliferation well in our culture conditions.
  • TPA-treated cells rapidly acquire characteristics of differentiated mammary gland cells (FIG. 14): hypertrophy, membrane profusions and the tendency to dissociate from each other.
  • FOG. 14 characteristics of differentiated mammary gland cells
  • Phase S The FACS study shows that the number of cells in S phase decreases to reach a limit value between 12h and 24h of treatment with TPA (Figure 15A). But, without new addition of TPA, the number of cells in phase S increases again to return to the initial state at 72 hours of treatment.
  • Phase G2 / M The number of cells in G2 / M phase increases from the beginning of treatment with a maximum observed at 12 hours (Figure 15B).
  • Phase G0 / G1 The number of cells in G0 / G1 phase is minimal at 6 hours and maximum at 24 hours (Figure 15C).
  • PKC ⁇ is weakly expressed at 12h, at which time we observe the least number of cells in S phase and the maximum of nuclear translocation of LIV21.
  • EXAMPLE 4 Study of the Specific Role of PKC ⁇ on the Nuclear Translocation of LIV21 Using a Peptide Inhibiting Function and the Translocation of PKC ⁇
  • cultures have were treated with a peptide, selective antagonist of the function and translocation of this PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No. 6), and the results were compared with those obtained by treatment with TPA.
  • EAVSLKPT SEQ ID No. 6
  • This peptide is recognized by the enzyme and It binds as a modified substrate at its catalytic site and is non-phosphorylatable and acts as a specific inhibitor of PKC ⁇ activity.
  • EXAMPLE 5 Western Blot Analysis This example describes the conditions used for Western Blot analysis of breast cancer cells.
  • the protein extracts are heated for 5 minutes at 80 ° C. in Laemmli buffer (pH 7.4, 0.06M Tris, 3% SDS, 10% glycerol, 1M PMSF, ⁇ -mercaptoethanol).
  • Laemmli buffer pH 7.4, 0.06M Tris, 3% SDS, 10% glycerol, 1M PMSF, ⁇ -mercaptoethanol.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. 10 to 20 ⁇ g of proteins migrate in a 12% polyacrylamide gel for 1 h under denaturing conditions (Migration buffer: 25 mM Tris base, 192 mM glycine, 1% SDS, pH 8.3).
  • the proteins are then transferred to a nitrocellulose membrane (Schleicher & Schuell) for one hour in liquid transfer, in a transfer buffer (25mM Tris, 192mM glycine, 20% methanol, pH 8.3).
  • the membranes saturated with PBS-Tween 0.1% -Triton X100 0.1% -5% skimmed milk for one hour, are contacted with the primary antibody diluted in PBS-0.1% Tween -Triton X100 0.1% -1% milk at room temperature with gentle stirring for one hour to two hours. After washing, the secondary antibody coupled to the peroxidase is incubated with the membranes.
  • the revelation is by a chemiluminescence reaction using the ECL kit according to the supplier's protocol (Amersham).
  • the primary antibodies used are:
  • the anti-LIV21 serum which was manufactured using two synthetic peptides based on the LIV21: Pe ⁇ tideLIV21a sequence (SEQ ID No. 1 and LIV21b peptide (SEQ ID No.
  • the peptides were coupled to hemocyanin before being injected into rabbits for immunization.
  • the polyclonal antibody was obtained from these two peptides by immunizing two rabbits and blowing a rabbit to have a preimmune serum (to be sure that this antibody did not already exist in this rabbit).
  • the anti-CDK2 rabbit polyclonal antibody (Santa-Cruz technology sc-163) diluted
  • the mouse anti- ⁇ 21 monoclonal antibody (DAKO 5 M7202) diluted 1/150.
  • the anti-PKC ⁇ rabbit polyclonal antibody (Santa-Cruz technology sc-214) diluted
  • Rat polyclonal anti- ⁇ tubulin antibody (Serotec, MCAP77) diluted 1/500.
  • the secondary antibodies used coupled to the peroxidase (Caltag) are:
  • the LIV21 protein has been shown to be associated with PML bodies and, during sumoylation, LIV21 to change from a molecular weight of 50kd to 60kd. Immunoprecipitation showed co-localization of LIV21 with SUMO in the PML-SUMO / LIV21 complex. ( Figure 22)
  • PML bodies In the proliferation stage, there are visualized changes in PML bodies because these PML bodies dissociate and degrade: (speekles), proteins are then available in the nucleus to ensure transcription, proliferation, immune responses and anything that requires gene transcription.
  • PML has been shown to associate with SUMO and HDAC-I (histone deacetylase 1) and that its complex acts on the expression of E2F1 and PML thus acts on the stop proliferation by blocking E2F1.
  • HDAC-I histone deacetylase 1
  • PML thus acts on the stop proliferation by blocking E2F1.
  • PML / HDAC-I complex negatively regulates the expression of E2F1.
  • PML associated with Rb binds to histone deacetylases and blocks E2F1 by binding to chromatin ( Figure 2).
  • PML In acute promyelocytic leukemias, PML is truncated and becomes a fusion protein with the retinoic acid receptor. This fusion protein (PMLRARalpha) is due to a chromosomal translocation 15/17. It has been reported in the literature a new treatment of this disease by combination of arsenic and retinoic acid to induce cancer cells in apoptosis. The PML protein regulates proliferation in cancers and lymphomas. The inventor has shown by immunoprecipitation the SUMO-PML association in which LIV21 is located.
  • LIV21 is phosphorylated by PKC ⁇ and that TPA is a PKC inhibitor.
  • MCF7 lines treated with TPA show inhibition of cancer proliferation and cell differentiation and LIV21 is translocated into the nucleus. If a PKC ⁇ -specific inhibitory peptide was used, it is the activity and not the expression of PKC ⁇ that was inhibited.
  • E2F4, p130 and LIV21 After 48 hours when proliferation begins, E2F4 has a comparable location; but at 72 h, it disappears from the core (in favor of E2Fl).
  • Figure 25 Results: image 43: poorly differentiated cancer; Image 58: healthy tissue from the same subject with cancer; Image 40: metastatic carcinoma 10 cm and image 17: metastatic carcinoma 3.5 cm.
  • FIG. 26 is like FIG. 25 a second example of nuclear localization of LIV21 in the control and healthy tissue (No. 52) of the patient No. 7 of squamous cell carcinoma of pharynx (moderately differentiated T4N0M0).
  • Figure 27 is a sample of advanced bladder cancer on cystectomy (urothelial grade III carcinoma infiltrating the chorion and muscularis) versus healthy bladder tissue of the same patient with internal control (PI): preimmune PI serum before the rabbit is immunized against LIV21 labeling nuclei with propidium iodide.
  • PI internal control
  • Figure 28 is a breast cancer sample for demonstrating the cyplasmic labeling of the LFV21 antibody in cancer cells. These results show that the cytoplasmic localization of LIV21 is an indicator of the aggressiveness and metastatic potential of cancer. The detection of LIV21 expression indicates the presence of invasive, aggressive and metastatic cancer cells. These results also show that the nuclear localization of LIV21 is an indicator of healthy quiescent cells of well differentiated tissues.
  • EXAMPLE 8 Physical Interaction of LIV21 with the Proteins of the E2F Family Co-immunoprecipitation experiments carried out using anti-LIV21, anti-E2F1 and anti-E2F4 antibodies made it possible to demonstrate that LIV21 associates at E2F4.
  • E2F1 positively controls the cell cycle by transactivating the promoter of the genes responsible for cell proliferation (DNA polymerase alpha, thymidine kinase, DHFR, etc.), whereas E2F4 is described as one of the members of the EF family that negatively controls the cell proliferation. cycle.
  • E2F1 embryonic mammary tissues
  • Antigen identification was made in cell lysates by immunoprecipitation.
  • the analysis of the physical interaction of different proteins associated with E2F4 and E2F1 was demonstrated by co-immunoprecipitation of protein complexes.
  • the study of the complex by ⁇ MACS PROTEIN to MICROBEADS (MILTENYIBIOTEC).
  • MILTENYIBIOTEC MILTENYIBIOTEC
  • S aureus lysates By addition of S aureus lysates, the A proteins interact with the Fc portion of the specific antibodies and the immune complexes become insoluble, thus recovering them by centrifugation. After breaking the bonds (heating) between AG AC and protein-rich membranes A, a western was made blot.
  • EXAMPLE 9 Functional Interaction of LIV21 with the Proteins of the E2F Family It has been demonstrated that the blocking of the expression of the LF / 21 protein is correlated with a decrease in the expression of E2F4 and an increase in the expression of E2F1. In parallel, the functional aspect of the E2F1 increase was verified by studying the transcription of two of its target genes, DHFR and ⁇ -DNA polymerase.
  • HSP27 27 kDa heat shock protein

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Abstract

La présente invention concerne un nouveau test diagnostic et/ou pronostic pour le cancer. Plus particulièrement, l'invention concerne la protéine humaine LIV21, son utilisation comme marqueurs diagnostics et pronostic du cancer. L'invention concerne également des méthodes de traitement du cancer et des maladies neurodégénératives ainsi que des compositions destinées à cet effet.

Description

Traçabilité des anomalies du cycle cellulaire ciblant l'oncologie et la neurodégénerescence.
DOMAINE DE L'INVENTION La présente invention se rapporte au domaine de la médecine et de la biologie. Elle concerne un nouveau test de dépistage et de suivi thérapeutique en oncologie. Plus particulièrement, elle se rapporte aux tests diagnostics et/ou thérapeutiques en oncologie et sur les maladies neurodégénératives.
DESCRIPTION DE L'ETAT DE L'ART
Les maladies neurodégénératives liées à l'âge et les cancers impliquent tous les deux une modification du processus physiologique de la mort cellulaire programmée ou apoptose. La mort neuronale est anormalement accélérée au cours des maladies neurodégénératives telles que les maladies d'Alzheimer, Huntington, Parkinson etc.. En revanche, le processus de cancérisation correspond à un blocage de l' apoptose conduisant à une multiplication incontrôlée des cellules. Le lien entre ces deux processus est actuellement devenu un champ d'investigation majeur de recherche sur le vieillissement.
Le contrôle de l'équilibre entre division cellulaire (mitose), différenciation et mort cellulaire programmée (apoptose), est fondamental au cours de processus physiologiques normaux, comme le développement embryonnaire, la régénération des tissus et le vieillissement. Une altération de cet équilibre peut conduire à des situations pathologiques majeures comme la formation de tumeurs ou certaines maladies neurodégénératives.
Le cancer est l'une des causes principales de mortalité à travers le monde. Alors que, au cours de la dernière génération, les pourcentages de décès reliés aux maladies cardiaques, cardiovasculaires et un bon nombre d'autres maladies sont à la baisse, le nombre de décès relié aux différentes formes de cancer est à la hausse. Malgré l'avancement rapide de notre compréhension des différentes formes de cancer, les faibles taux de survie sont généralement attribuables à un diagnostic et un traitement inadéquats. La plupart des tumeurs ne peuvent être détectées que lorsqu'elles atteignent une taille d'environ lcm. Puisqu'il y a un laps de temps relativement court du développement continue d'une tumeur jusqu'à un stade devenant incompatible avec la survie, cela laisse peu de temps pour une intervention thérapeutique. Donc, le diagnostic précoce devient la clef du succès pour le traitement du cancer.
Pour une multitude de raisons, le diagnostic précoce demeure illusoire pour la plupart des formes de cancer. Pour certaines formes de cancer, des marqueurs spécifiques de la maladie ne sont pas disponibles ou ne le sont seulement qu'à un stade avancé de la maladie, rendant le diagnostic difficile. Pour certaines autres formes de cancer, les marqueurs sont disponibles mais ne sont pas toujours spécifiques à la maladie ou ils peuvent être associés à sa forme bénigne. Dans d'autres cas encore, les techniques existent mais le coût prohibitif pour les appliquer à la population en général les rend inappropriées.
Le cancer de la peau par exemple est le cancer le plus répandu au Canada. En 1992 uniquement, 50 300 nouveaux cas de cancer de la peau ont été rapportés, comparés aux 19 300 cas de cancer du poumon, aux 16 200 cas de cancer colorectal et aux 15 700 cas de cancer du sein. En d'autres mots, le cancer de la peau est aussi fréquent que les 3 principaux types de cancers réunis. Son incidence continue de croître avec ses 64 200 nouveaux cas en 1997, soit une augmentation de 14 000 cas annuellement en 5 ans. En particulier, l'incidence du mélanome malin croît à un taux de 2% par année. Le diagnostic précoce demeure la clef d'un traitement efficace. Une tumeur maligne est facilement accessible et peut être enlevée à l'aide d'une chirurgie mineure. En fait, la guérison est de 100% si le cancer de la peau est détecté assez tôt. Le diagnostic précoce du cancer de la peau demeure toutefois difficile. Celui-ci n'est pas qu'une seule maladie mais toute une gamme de conditions reliées les unes aux autres, qui apparaissent similaires dans bien des cas à l'inspection visuelle. Un diagnostic basé sur une telle inspection est donc subjectif. Pour mieux comprendre cette subjectivité, considérons une croissance anormale de la peau. Cette croissance peut être pigmentée ou non- pigmentée. Si elle est non-pigmentée et maligne, il s'agit probablement alors d'un épithélioma basocellulaire ou un épithélioma spinocellulaire. Cependant, le développement clinique de ces 2 formes de cancer est fort différent. Un épithélioma basocellulaire se répand de façon latérale sur la surface de la peau, sans pénétrer dans les couches plus profondes de la peau. Ainsi, bien que pouvant défigurer, un épithélioma basocellulaire développe rarement des métastases et est rarement mortel. Cependant, un épithélioma spinocellulaire provoque des métastases et est souvent mortel. Il devient donc important d'être capable de distinguer ces 2 types de cancer de la peau. Un diagnostic définitif du cancer de la peau requiert une biopsie et une analyse histologique. Cependant, la décision d'envoyer une biopsie pour analyse (ou même si un patient doit être référé à un dermatologiste) devient très subjective. Il y a plusieurs biopsies qui ne sont pas prises alors qu'elles auraient dû l'être.
Le cancer du colon est la troisième cause de mortalité reliée au cancer chez les hommes et les femmes en Amérique du Nord (16 200 cas par année). La détection précoce, menant à une intervention précoce, a démontré que l'on peut améliorer le succès du traitement et le taux de survie. Par exemple, le taux de survie sur 5 ans est de 92% pour un patient dont la maladie a été détectée à un stade précoce, alors que le taux descend à environ 60% chez les patients avec un cancer localisé, et à environ 6% chez ceux présentant des métastases. Cependant, seulement le tiers des cancers du colon est détecté à un stade précoce. Une des raisons de ce délai dans le diagnostic est l'absence d'un test de dépistage sensible, peu dispendieux et non-invasif.
Le cancer du sein est un des plus communs chez la femme avec le cancer du colon. Le taux de mortalité est le plus élevé de tous les cancers affectant les femmes.
Il y a très peu de marqueurs diagnostics capables de détecter le cancer du sein et ils ont seulement une valeur prédictive de 20%. Il n'y a pas non plus de marqueurs qui puissent détecter ou déterminer l'invasivité et l'agressivité des cellules cancéreuses métastatiques. Au cours des dernières années, des progrès considérables ont été faits dans la compréhension des moyens mis en œuvre par les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs pour réguler la prolifération cellulaire et l'apoptose. L'une des cibles principales de ces régulateurs est la famille des facteurs de transcription de type E2F dans la voie de signalisation des protéines E2Fs et RB. Ces protéines jouent un rôle central dans le contrôle de la division cellulaire en couplant la régulation des gènes nécessaires à la progression du cycle cellulaire aux signaux extracellulaires (mitogènes, inhibiteurs de la prolifération). Elle se comporte comme un oncogène en stimulant la prolifération des cellules tumorales.
Parmi les gènes exprimés, on trouve :
- La sur-expression du facteur de transcription E2F4 et l'oncogène c-myc qui induisent l'apoptose des cellules post mitotiques par accumulation de réactif oxygénés (Tanaka, 2002) - le gène p53, appartenant à la famille des gènes suppresseurs de tumeur, bloque le cycle cellulaire en cas de lésion de l'ADN. Il est maintenant démontré que ce gène est aussi impliqué dans le déroulement de l'apoptose (Oren, 1994 ; Yonish-Rouach, 1996).
- la cycline Dl, une des protéines constituant les sous-unités régulatrices des kinases du cycle cellulaire, indispensable à la progression du cycle cellulaire. Cette protéine est aussi exprimée au cours de l'apoptose dans divers types cellulaires (Han et al, 1996 ; Pardo et al, 1996).
Il serait souhaitable de disposer de nouvelles méthodes diagnostic qui détecterait la présence de cancer avec plus de spécificité et qui permettrait la distinction entre les cellules cancéreuses agressives ayant une tendance à métastaser par rapport à celles plus localisées qui ont une faible probabilité de métastaser. Un marqueur qui puisse donc révéler la prolifération cellulaire serait d'une grande utilité.
RESUME DE L'INVENTION
La présente invention concerne un nouveau test de dépistage de la réinduction du cycle cellulaire ciblant l'oncologie. Il s'agit d'un test diagnostic et d'un test pronostic pour différents cancers (cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, glioblastome, sarcome, leucémie, etc.). Plus particulièrement, l'invention concerne l'utilisation de la protéine LIV21 ainsi que leurs dérivés comme marqueurs diagnostics et pronostic des cancers. L'invention concerne donc la détection de la protéine LFV21 avec un kit comprenant des anticorps spécifiques de LIV21.
Un premier objectif de la présente invention est de mettre en évidence une méthode de détection et de pronostic du cancer et de son potentiel métastatique. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Un aspect de la présente invention consiste en l'utilisation de LIV21 comme indicateur pronostic du cancer. En effet, lorsque LIV21 est localisé dans le cytoplasme, les cellules cancéreuses dans les tissus sont agressives. Inversement, lorsque le produit de l'expression du gène LIV21 est localisé préférentiellement dans le noyau cellulaire, ceci est un indicateur pronostic que les cellules du tissu sont différentiées et quiescentes et donc non invasives. L'efficacité d'un traitement du cancer peut également être suivie par la traçabilité de cette protéine, de ses dérivés et des ratios avec les protéines associées.
Par ailleurs, la détection de la protéine kinase C epsilon (PKCε) est également intéressante puisqu'il a été déterminé que PKCε phosphoryle la protéine LIV21 pour la maintenir dans le cytoplasme. Ainsi, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, le rapport LIV21/ PKCε augmente dans la fraction cytoplasmique de cellules cancéreuses.
En outre, la détection des protéines E2F1 et/ou E2F4 présente un intérêt. En effet, La protéine LIV21 forme un complexe avec E2F4 qui est capable d'inhiber l'expression du gène E2F1 dans le noyau, l'expression du gène E2F1 étant un signe de prolifération cellulaire. Ainsi, une diminution de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est indicative de la présence de cellules cancéreuses. De même, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses.
En conséquence, la présente invention concerne une méthode pour la détection (in vitro ou ex vivo) de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique de tissu (par exemple, sein, ovaire, endomètre, vessie, mélanome, prostate, glioblastome etc..) de patients, cette méthode comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique de tissu dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques.
Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCε, LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine.
II en est de même de la détection de HDACl qui a été montré comme impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1. De façon plus générale la famille des HDACs joue un rôle clé dans la régulation de l'expression des gènes. Quand elles sont surexprimées, elles entraînent le silencing des gènes suppresseurs de tumeurs d'où l'intérêt d'utiliser des inhibiteurs HDAC en thérapie associés à d'autres inhibiteurs régulant la cascade métabolique impliquant le complexe protéique qui contient LIV21. Le niveau d'expression de chaque enzyme ou polypeptide du complexe SUMO/Rb/HDAC ou pour certains types cellulaires du complexe PML/SUMO/Rb/HDAC est un indicateur supplémentaire de l'état de prolifération de la cellule. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en SUMO, Rb, HDAC et PML.
Les méthodes selon la présente invention consiste également à utiliser la détection de la protéine LIV21 en combinaison avec l'ensemble des marqueurs de proliférations et facteurs de transcription qui jouent un rôle dans le processus de cancérisation et de neurodégénerescence. La méthode comprend donc en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, plO7, ρl30 de la famille des pockets protéines. Ainsi, l'invention réside dans la fabrication et l'utilisation de puces diagnostiques à anticorps comprenant un anticorps spécifique de LIV21 et des anticorps des différentes protéines du complexe associé à LIV21 suivant les phases du cycle cellulaire , c'est-à-dire sans restriction à celles là, des anticorps spécifiques de RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, pi 07, pl30 de la famille des pockets protéines (Figure 1). En outre, les puces diagnostiques selon la présente invention peuvent comprendre des anticorps spécifiques de NFkB, cdc2A, mdm2, ρ21, ρ53, ρ65, Ki67, et CAFl. Le Ki67 et le CAFl (Amoulzy ;Institut Curie) sont des marqueurs nucléaires qui signent l'état de prolifération de nombreux cancers. Les puces à protéines permettront d'étudier l'expression des protéines, les interactions protéiques et les modifications post traductionnelles, plus particulièrement les phosphorylations et méthylations de certaines protéines, qui signent un état caractéristique de la cellule malade. L'état d'expression et de silencing de certains gènes est différent dans les cellules malades et dans les cellules saines. Par ailleurs, les interactions protéiques et le métabolisme de la cellule malade sont différents de ceux de la cellule saine.
L'autre aspect de la présente invention est l'utilisation des protéines citées ci dessus comme marqueurs de l'invasivité et de l'agressivité métastatique des cellules cancéreuses de prostate, colon, de vessie, du mélanome, ovaire, endomètre, col et cancers en neurologie etc..
Dans un mode de réalisation, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Par exemple, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot. Dans un mode de réalisation préféré, elle est détectée par immunohistochimie, immunocytochimie, radiographie ou par marquage à la peroxydase.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCε, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ PKCε dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. Une augmentation du rapport LIV21/ PKCε dans la fraction cytoplasmique est indicative de cellules cancéreuses.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LFV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association dans le noyau cellulaire étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F4 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine.
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Par ailleurs, la méthode peut également comprendre la détermination du rapport LIV21/ E2F1 dans le noyau et/ou le cytoplasme. Ce rapport peut être comparé à celui observé dans une cellule saine. La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement.
Un deuxième aspect de l'invention concerne la protéine LIV21 humaine ainsi que les fragments de celle-ci. Plus particulièrement, la présente invention concerne une protéine LIV21 humaine isolée, purifiée ou recombinante. Elle concerne notamment un polypeptide isolé présentant un poids moléculaire apparent d'environ 50-51 kD par analyse en Western Blot et d'environ 60 kD lorsqu'il est sumoylé et/ou un polypeptide présentant un point isoélectrique de 5,6 dans sa forme de 50-51 kD et/ou un polypeptide caractérisé par un des chromatogrammes des Figures 3-6 et/ou un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs: 1-5, ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci et/ou une des séquences peptidiques obtenues par MALDI (Figure 7) et NanoLC-ESI-MS (Figure 9). Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend les deux séquences peptidiques SEQ ID Nos 1 et 2. Dans un mode de réalisation encore plus préféré, le polypeptide comprend une troisième séquence peptidique SEQ ID No 3 et/ou une quatrième séquence peptidique SEQ ID No 4 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. Facultativement, LIV21 comprend en outre une séquence sélectionnée parmi les séquences SEQ ID Nos 5-55 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. De préférence, la protéine LIV21 comprend un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, et une séquence de nucléarisation. Une digestion par la trypsine de la protéine LIV21 donne plus de 54 peptides correspondant aux pics monoisotopiques parmi la totalité des peptides comme spécifiés Figures 3-6 ; Figure 7 ou 9 (Tableau) ; Figure 8 (Gel SDS PAGE).
Un troisième aspect de l'invention concerne un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention. Plus particulièrement, l'anticorps peut se lier spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs: l-5ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. La présente invention concerne notamment un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide selon la présente invention, notamment un polypeptide. comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ DD Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs: l-5ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. Un quatrième aspect de l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient, ce kit comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LFV21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention. Dans un mode particulier de l'invention, le kit comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. De préférence, le moyen de détection est un anticorps spécifique de la protéine concernée. Dans un autre mode de réalisation préféré, le kit comprend également un moyen de détection du produit de l'expression d'un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, SUMO, HDAC, PML, cycE/cdk2, cdkl, CREBl, p300, Rb5 pl07, pl30, NFkB ,cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67 et CAFl. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend une puce à anticorps comprenant un anticorps spécifique de LIV21. Dans un mode de réalisation préféré, la puce comprend en outre un anticorps spécifique d'une protéine sélectionnée parmi PKCε, E2F1 et E2F4. En outre, elle peut comprendre un anticorps spécifique d'une protéine sélectionnée parmi RBP2, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, pi 07, p 130 de la famille des pockets protéines. La puce peut également comprendre un anticorps spécifique d'une protéine sélectionnée parmi NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, et CAFl.
L'invention concerne l'utilisation d'un anticorps spécifique de LIV21 humain pour le diagnostic du cancer et/ou d'un ou plusieurs anticorps spécifiques d'un complexe protéique contenant LIV21, par exemple des anticorps spécifiques de RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, plO7, pl30 de la famille des pockets protéines. De préférence, le diagnostic est effectué ex vivo sur des échantillons d'un patient. DESCRIPTION DES FIGURES Figure 1 : puce à anticorps.
Figure 2 : schéma des interactions protéiques nucléaires et conséquences sur l'étude de la thérapeutique. Figure 3: profil de la protéine LJV21 par Spectrométrie de masse (Maldi) M (H+) pour la bande de gel monodimensionnel correspondant au doublet protéique migrant à 5OkD. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : Acetonitrile/eau (l/l)contenant 0,1% de TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice acide alpha cyano-4-hydroxycinnamique est faite dans le même solvant. On prélève un même volume des deux solutions, on mélange et on dépose 1 microlitre sur la plaque du Maldi pour analyse. Le spectre a été réalisé sur un Voyager avec un logiciel type Waters. La calibration par rapport aux pics d'autolyse et de digestion trypsinique n'est pas excellente et demande à être revue. La Figure 4 est un profil zoomé du chromatogramme de la bande à 49 KD sans lissage. La Figure 5 est le deuxième chromatogramme correspondant à la bande de gel d'acrylamide 12% monodimensionnel migrant à 49 KD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LIV21. Le spectre a été réalisé sur un Brucker. La Figure 6 est le troisième chromatogramme correspondant à la bande de gel d'acrylamide monodimensionnel migrant à 53 kD et révélée par le bleu de coumassie et l'anticorps de LIV21. Le spectre a été réalisé également sur un Brucker.
La Figure 7 un tableau des pics monoisotopiques avec une valeur M H+. Les masses sont données avec trois chiffres derrière la virgule par les plateformes protéomiques car ils estiment que c'est la limite de la précision d'acquisition des machines MALDI TOF. La Figure 8 représente un gel 2D SDS PAGE séparant les douze polypeptides accrochés par l' anticorps de LI V21.
La Figure 9 décrit des peptides caractérisés Nano LC-ESI MS dont les peptides LIV21a et LIV21b.LIV21c,LIV21d,LIV21e. Le tableau décrit une expérience de NanoLC-ESI MS. La NanoLC permet la séparation des peptides issus de l'hydrolyse trypsique de la protéine. Les fragments peptidiques élues sont ionisés par électrospray, les ions formés détectés par spectrométrie de masse (Analyseur Q-TOF). Ces ions caractérisent pour chacun, un peptide spécifique de la protéine. Légende : BEGIN IONS : Ions de départ. PEPMASS : Masse peptidique. TITLE : Titre. Elution from X to Y period : x experiment : y = Elution de X à Y période : x expérience : y. Charge not autodetermined = Charge non déterminée automatiquement.
Légende illustrée par la première page décrivant l'ion : masse moléculaire 523,25 Dalton. Titre : Elution de 29,15 à 29,23 correspond au peptide élue entre 29,19 et 29,23 minutes. Cette molécule par ionisation donne l'ion dichargé (Charge=2+) : MH22+ de masse moléculaire m/z : 523,25 Dalton d'où la masse de la molécule M : 1044,51. La séquence peptidique de cet ion est déterminé par MSMS. Le spectre MSMS correspondant est défini par la colonne de nombres entre Begin ions et End ions qui correspond à une séquence d'acides aminés (chaque Acide Aminé ayant une masse spécifique excepté la Leucine et l'Isoleucine qui ont la même masse moléculaire). La première colonne avec un nombre à 4 décimales (l'ion fils : 86.1373) correspond à la masse des ions « fils ». La seconde colonne (1 : 45) correspond à l'intensité de ces ions « fils ». La Figure 9 décrit les analyses en MSMS donnant un jeu de polypeptides assignables à la protéine LIV21 et son complexe ou des contaminants suivant les différents observateurs des différentes plateformes de protéomiques sous traitantes. Séquences communes avec gallus gallus,Le variant d' Histatine HIS3-HUMAN , la HSP60 chaperonine, l'arginine déiminase, la polyribonucléotide nucléotidyltransférase de pseudomonas, la déshydrogénase.
La Figure 10 : décrit les analyses en MALDI TOF donnant un jeu de séquences polypeptidiques assignables à LIV21. et son complexe et des contaminants parfois différents suivant les observateurs des différentes plateformes de protéomiques sous traitantes. Les paramètres de recherche Mascot sont : enzyme trypsine, modifications variables : carbaméthylation et oxydation des méthionines, sans limite de masse moléculaire, sans restriction de point isoélectrique. Type de masse : monoisotopique. Erreur de masse (MS) : suivant l'observateur 50 ppm ou lOOppm. Non coupure trypsique :1 Les masses saisies sont M (H+)/ masses réelles. Pour le chromatogramme 1 les cystéines sont bloquées par iodoacétamide. La possibilité de digestion de la trypsine bovine Proméga peut être incomplète avec oubli de coupure.
Séquences communes avec Gallus Gallus (gi 50732569), la Syntaxine de souris, Le variant d'histatin-3-2 (P15516-00-01-00), la ZN575-Human, la G6 P translocase, la HSP60 chaperonine, l'arginine déiminase, ferredoxin-NADP(+) réductase, la polyribonucléotidyl transférase de pseudomonas,la déhydrolipoamide déshydrogénase.
Figure 11 : alignements entre le variant d'histatin-3-2, PATF et Q7TCL4 (Turnip mosaic virus) AAN08045.2. Par analyse MALDI TOF type Brucker.
Figure 12 : alignements entre Gallus Gallus (gi 50732569) et PATF et séquence polypeptidique commune issue de LIV21 par analyse MALDI TOF. Figure 13 : exemple de diagramme d'interprétation de l'analyse Maldi pour l'histatin 3- 2.donnant la séquence n°5 en sélectionnant les masses :2383.2610(delta à 0 .005) ; 2539.3280 (delta :-0.02); 2511.3740 (delta à 0.02).score : 78 et expect : 0.0046.
La Figure 14 est la morphologie des cellules MCF7 traitées ou non par le TPA à 25 nM.
La Figure 15 est une analyse par FACS ; représentation pour chaque phase du cycle cellulaire du pourcentage de cellules en fonction du temps de traitement : Figure 15 A. Phase S, Figure 15B. Phase G2/M, Figure 15C. phase G0/G1. L'échelle de l'axe des abscisses n'est pas proportionnelle à la durée de traitement.
La Figure 16 est un Western Blot comparant des extraits totaux (ET) et des extraits nucléaires (EN) et montrant l'inhibition par TPA de l'expression de la phosphorylation de LIV21. Figure 16 A. en fonction du temps de traitement par le TPA à 25 nM ; Figure 16B. comparé à LIV21 dans des extraits protéiques, à 12h de traitement par TPA à 25 nM.
La Figure 17 est une étude de la translocation nucléaire de LIV21 par immunocytochimie avec un anticorps primaire anti- LIV21 (en vert) dans des cultures traitées ou non au TPA à 25 nM. Les noyaux sont colorés en rouge par l'iodure de propidium. Les noyaux sont majoritairement colorés en jaune à 12H jusqu'à 24H car l'anticorps primaire anti- LIV21 (en vert) est nucléaire alors qu'il est majoritairement cytoplasmique à 72H (noyaux rouges et cytoplasmes verts).
La Figure 18 montre l'expression en fonction du temps de traitement par TPA à 25nM des protéines PKCε et PKCζ dans des extraits totaux. L'expression de Pα-tubuline sert de contrôle de la quantité de protéines totales déposées dans les puits.
La Figure 19 montre l'expression comparée de la PKCε et de LIV21 en immunocytochimie sur des cultures de cellules MCF-7 traitées et non traitées par le TPA à 25 nM pendant 12h, réalisée avec des anticorps anti-LIV21 et anti-PKCε en vert, et l'iodure de propidium colorant l'ADN en rouge. La LIV21 est transloquée dans le noyau par inhibition spécifique de PKCε. La PKCε est faiblement exprimée à 12h en présence de TPA. En effet, on observe les noyaux rouges et peu de coloration verte dans les cytoplasmes. En revanche, l'expression de LIV21 est forte dans les noyaux qui sont colorés en jaune (merge) à la fois par l'anticorps anti-LIV21 (vert) et par le iodure de propidium spécifique des noyaux.
La Figure 20 montre l'effet du peptide inhibiteur de la PKCε sur le profil d'expression de LIV21 par immunocytochimie sur des cultures : contrôle ou traitées avec 1 μM de peptide, 2 μM de peptide, ou 25 nM de TPA. Les traitements durent 12 heures. Les cellules sont marquées par anti-LIV21 (en vert), et par l'iodure de propidium (en rouge). On observe que 2μM de peptide (image nommée 2μM) ont la même efficacité que « 25 nM de TPA 12H » : les noyaux (jaunes) sont majoritairement marqués à la fois par l'iodure de propidium et par l'anticorps anti-LIV21 (en vert) sur ces deux images alors que le contrôle et les cellules traitées avec seulement 1 μM de peptide inhibiteur de PKC montrent une coloration rouge des noyaux traduisant l'absence de translocation nucléaire de LIV21 via son anticorps anti-LIV21 (en vert).
La Figure 21 montre l'effet du peptide inhibiteur de la PKCε sur le profil d'expression de LIV21 dans des fractions cellulaires cytoplasmique (C) et nucléaire (N), après un traitement de 12h par le TPA (25 nM) ou par le peptide (2 μM).
La Figure 22 montre par immunoprécipitation (IP) la coexistence entre PML/SUMO et LIV21 : on observe une fluorescence jaune (merge) nucléaire correspondant à la co- localisation de PML/SUMO et LIV21 dans les noyaux cellulaires.. Les Figures 23 et 24 montrent par immunocytochimie la coexistence entre PML/SUMO et LIV21. Le co-marquage (par immunomarquages fluorescents) de LIV21 (vert) et de SUMO-I (rouge) dans les noyaux des cellules traitées ou non au TPA pendant 24h et 72h montrent qu'à 24h LIV21 est transloqué dans le noyau où coexiste SUMO et PML (Merge : noyaux jaunes), alors qu'à 72H, LIV21 (vert) est cytoplasmique. Les corps nucléaires contenant la protéine SUMOl sont appelés corps PML.
La Figure 25 montre qu'à partir d'une puce de 60 biopsies dont 50 de cancer de peau et 9 de tissus normaux et un témoin T ; on met en évidence l'expression nucléaire de LIV21 dans les biopsies de tissus sains et l'expression de LIV21 cytoplasmique dans les biopsies de cancers métastatiques.
Image 43 : cancer de peau peu différentié T2N0M0, image 58 : tissu sain issu du même sujet atteint d'un cancer de la peau peu différentié (les noyaux des cellules sont colorés en jaune), image 40 : carcinome métastatique 10 cm et image 17 : carcinome métastatique de 3,5cm. Les noyaux cellulaires sont colorés en rouge. La Figure 26 est, comme la Figure 25, un deuxième exemple de localisation nucléaire de LIV21 dans le tissu contrôle et sain (n°52) (les noyaux des cellules sont colorés en jaune), du sujet malade n°7 d'un carcinome de cellules squameuses de pharynx (modérément différentié T4N0M0) Dans les images n°7 de tissu cancéreux les noyaux cellulaires sont colorés en rouge.
La Figure 27 est un échantillon de cancer avancé de la vessie sur cystectomie (carcinome urothélial grade III infiltrant le chorion et la musculeuse) versus tissu sain de vessie du même patient avec un contrôle interne (PI) : sérum préimmun PI avant que le lapin ne soit immunisé contre LIV21, marquage rouge des noyaux au iodure de propidium.
La figure 28 est un échantillon
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
L'invention est relative à l'identification d'antigènes dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F1 a été étudiée par co-immunoprécipitation de complexes protéiques. Cette analyse a permis de mettre en évidence un nouveau marqueur présentant une utilité diagnostique et pronostique pour le cancer. Un marqueur de la prolifération PATF associé à la famille E2F avait été mis en évidence (Crisanti) par la charactérisation d'exons sans jamais que le gène est était clone chez l'homme, ni une protéine correspondante retrouvée chez l'homme.
La découverte de cette nouvelle molécule LTV21, pourrait avoir valeur de diagnostic pour les raisons suivantes. En procédant à un criblage de la localisation de LIV21 dans une dizaine de tumeurs humaines, l'inventeur a pu observer que, dans toutes les cellules tumorales en prolifération, cette protéine est cytoplasmique au lieu d'être nucléaire. Elle ne se trouve donc pas dans le bon compartiment cellulaire pour être active sur l'arrêt de la multiplication des cellules.
La présence de LIV21 a ainsi pu être observée chez les mammifères. Le panel d'expression de LTV21 en fonction de l'état cellulaire (cycles mitotiques, repos cellulaire, différentiation) a été étudié sur des tissus provenant de différents mammifères. Les analyses protéiques sur les différents échantillons de tissus ont confirmé que l'expression de ce facteur de transcription apparaît associée à une progression vers un état cellulaire quiescent (arrêt des mitoses et entrée en différenciation). LIV21 est présent dans des lignées cellulaires tumorales en prolifération active et son expression est essentiellement cytoplasmique. Les mêmes résultats sont obtenus sur les adénocarcinomes mammaires humains.
Ainsi, la présente invention porte sur un nouveau test de dépistage d'anomalies de la réinduction du cycle cellulaire. Ce test diagnostic se base sur l'étude du mécanisme d'action du nouveau gène, codant pour un nouveau facteur de transcription potentiel appelé LIV21, qui régule négativement la prolifération. LIV21 est impliqué dans l'arrêt de la prolifération cellulaire. LFV21 est cytoplasmique lorsque les cellules prolifèrent alors qu'elle devient nucléaire lorsque les cellules deviennent quiedcentes. La caractérisation de ce facteur suggère une nouvelle voie de régulation négative de la prolifération des cellules, de par son association avec l'un des membres de la famille des EF(s) : E2F4. Ce dernier est connu pour réguler négativement le cycle cellulaire en association avec la protéine P 130 ou protéine poche de la famille RB .
La localisation observée pour LIV21 dans les cellules tumorales (localisation cytoplasmique) et dans les cellules physiologiques (localisation nucléaire) suggère en tout état de cause que son fonctionnement est perturbé lorsque le développement cellulaire devient anarchique.
La caractérisation de cette molécule, l'étude de la chronologie et de la topologie de son expression indiquent aussi que ce facteur de transcription ubiquitaire a une expression et une localisation régulée en fonction de l'état cellulaire : expression plus forte et localisation nucléaire pour les cellules sorties des cycles mitotiques, expression faible et localisation cytoplasmique pour les cellules en prolifération active telles que les cellules tumorales humaines.
LIV21 apparaît comme une molécule clé permettant de stabiliser un autre facteur de transcription (E2F4) dans le noyau cellulaire et d'ainsi induire un arrêt de prolifération cellulaire.
De plus, il a été montré que la localisation de LIV21 dans le compartiment cytoplasmique est régulée par PKCε. En effet, lorsque LIV21 est phosphorylée par PKCε, LIV21 est localisé dans le compartiment cytoplasmique. Inversement, lorsque la phosphorylation de LIV21 par PKCε est inhibée, LIV21 est localisé dans le compartiment nucléaire.
LIV21
La présente invention concerne donc la protéine LIV21 ainsi que des dérivés et des fragments de celle-ci.
La protéine LIV21 est une protéine humaine d'environ 300 acides aminés. Cependant, suivant l'épissage alternatif qu'elle subit, elle se présente au moins sous trois formes de taille différentes (Figure 8). Par ailleurs, elle peut être phosphorylée ou sumoylée. Elle présente un poids moléculaire apparent entre 50 kD et 51 kD dans des analyses Western Blot. Ce poids moléculaire apparent est de 60 kD lorsque LIV21 est sumoylée. Dans sa forme de 51 kD, phosphorylée ou non, son point isoélectrique est de 5,6 et son intensité de 13632. Cette protéine a été caractérisée par Spectrométrie de masse (Maldi) (Exemple 1 ; Figures 3-13 3). Elle donne plus de 54 peptides suite à une digestion par la trypsine Proméga (Figure 7). Les caractéristiques de la protéine LIV21 sont également décrites dans les figures 3-13. Plusieurs peptides particuliers de LIV21 ont été caractérisés, et notamment le peptide LIV21a (SEQ ID No 1), le peptide LIV21b (SEQ ID No 2), le peptide LIV21c (SEQ ID No 3), le peptide LIV21d (SEQ ID No 4) et le peptide LIV21e (SEQ ID NO: 5). La plus longue séquence avec l'homologie de séquences la plus forte avec PATF est le peptide LIV21e KFFVFALILALMLSMTGADSHAKR (SEQ ID NO: 5).
D'autres peptides particuliers de LIV21 sont décrits ci-dessous:
RTLLLPAVSRQ (SEQ ID NO: 6)
LGFMEEWDVGEIMLR (SEQ ID NO: 7)
QIMAHFSDVAEAYIEK (SEQ ID NO: 8)
FYAWMIEQAPFSSLAQEGK (SEQ ID NO: 9) NLYTEIVYTPISTPDGTLVK (SEQ ID NO: 10)
GANNNLFGLDGNVGTTVENTER (SEQ ID NO: 11)
KFQFGQSTVTLETGRI (SEQ ID NO: 12)
KGFFPLSVHYQEKT (SEQ ID NO: 13)
RTVRPLNIEVGVLPKT (SEQ ID NO: 14) RRSVQAMLPGADVFPYTIRV (SEQ ID NO: 15)
KGITEEIMEIALGQALEARL (SEQ ID NO: 16)
RAICEETKASIDIEDDGSIKI (SEQ ID NO: 17)
KVTDILKEGQEVEVLVLDVDNRG (SEQ ID NO: 18)
KMLTGVNVLADAVKA (SEQ ID NO: 19) RAAVEEGWPGGGVALIRA (SEQ ID NO: 20)
KVÏÏVAVDWDLSKE (SEQ ID NO: 21)
KIFSPATVFFTSIEKH (SEQ ID NO: 22)
KNVWILTGFQQGQEFPKF (SEQ ID NO: 23)
RFNLFAGGSNKA (SEQ ID NO: 24) RAYSLLGTSERT (SEQ ID NO: 25)
AMAANDTGGFVK (SEQ ID NO: 26)
ASEEGIMWER (SEQ ID NO: 27)
FDWVIGAGPGGYVAAIK (SEQ ID NO: 28)
RPVTTDLLASDSGVTIDER (SEQ ID NO: 29) FYCGWDR (SEQ ID NO: 30)
DVAQEEGK (SEQ ID NO: 31)
SGIPSELR (SEQ ID NO: 32) EAHIQMK (SEQ ID NO: 33)
EGIWIPK (SEQ ID NO: 34)
YTFDSR (SEQ ID NO: 35)
LTHEIR (SEQ ID NO: 36) LYLDK (SEQ ID NO: 37)
YGLQR (SEQ ID NO: 38)
DSIIR (SEQ ID NO: 39)
LEAICAAMIESWGYDK (SEQ ID NO: 40)
GDLWFMSHQGHK (SEQ ID NO: 41) YAFDFYEMTSR (SEQ ID NO: 42)
EVNAGTSGTFSVPR (SEQ ID NO: 43)
NQDRPYMPR (SEQ ID NO: 44)
IVSILEWDR (SEQ ID NO: 45)
APYIAETALR (SEQ ID NO: 46) NMHNLLGVK (SEQ ID NO: 47)
NLTDMSLAR (SEQ ID NO: 48)
HTTEDVNR (SEQ ID NO: 49)
KFFVFAL (SEQ ID NO: 50)
FVFALILALMLSMCG (SEQ ID NO: 51) TLQIFNIEMKSK (SEQ ID NO: 52)
KDPELWAHVLEETNTSR (SEQ ID NO: 53)
KSWEVYQGVCQK (SEQ ID NO: 54)
HTSLVGCQVIHYR (SEQ ID NO: 55)
Au sens de l'invention, une protéine LIV21 préférée comprend au moins une séquence choisie parmi SEQ ID Nos: 1-55 ou une séquence présentant 70%; 80% ou, de préférence, 90% d'homologie avec celle-ci.
La protéine LIV21 comprend un motif leucine zipper, un domaine basique caractéristique des domaines de liaison à l'ADN, et une séquence de nucléarisation. La présente invention concerne un polypeptide humain isolé, purifié ou recombinant présentant une séquence comprenant la séquence SEQ ID No 1 et/ou SEQ ID No 2. De préférence, le polypeptide comprend les séquences SEQ ID Nos 1 et 2. Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide comprend (en outre) une séquence sélectionnée parmi SEQ ID Nos 3-55, de préférence parmi SEQ ID NOs 3-5, ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. Dans un mode de réalisation particulier, il comprend une séquence sélectionnée parmi une des séquences peptidiques obtenues par MALDI (Figure 7) et NanoLC-ESI-MS (Figure 9).. L'invention concerne également les deux peptides LIV21a (SEQ ID No 1) et LIV21b (SEQ ID No 2). L'invention concerne également un peptide présentant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID Nos 3-55, de préférence parmi SEQ ID NOs 3-5,ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. Elle concerne également des peptides comprenant au moins 10 acides aminés consécutifs de LIV21 humain, de préférence au moins 20, 30 ou 50 acides aminés consécutifs de LIV21.
L'invention concerne en outre des dérivés d'intérêt de LIV21 qui sont par exemple des protéines de fusion dans lesquelles LIV21 est fusionnée à des protéines marqueurs comme la GFP. Par ailleurs, la protéine LTV21 peut être marquée par tout moyen connu de l'homme du métier.
La présente invention concerne également un anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la présente invention, de préférence LIV21 humaine, un fragment ou un dérivé de celle-ci. Dans un mode de réalisation particulier, l'anticorps se lie spécifiquement à un peptide LIV21a ou LIV21b. Dans un mode de réalisation préféré, l'anticorps se lie spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs 1-5, ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci.
Les anticorps peuvent être polyclonaux ou monoclonaux. Il peut également s'agir de fragments et dérivés d'anticorps présentant substantiellement la même spécificité antigénique, en particulier des fragments d'anticorps (par ex., Fab, Fab'2, CDRs), d'anticorps humanisés, polyfonctionnels, monocaténaires (ScFv), etc. Les anticorps de l'invention peuvent être produits à l'aide de méthodes conventionnelles, comprenant l'immunisation d'un animal et la récupération de son sérum (polyclonal) ou de cellules spléniques (de manière à produire des hybridomes par fusion avec des lignées cellulaires appropriées).
Lesdits anticorps peuvent être obtenus directement à partir de sérum humain ou à partir de sérum d'animaux immunisés avec les protéines ou les peptides selon la présente invention. Des méthodes de production d'anticorps polyclonaux à partir d'espèces animales variées incluant les rongeurs (souris, rats, etc.), les primates, les chevaux, les cochons, les moutons, les lapins, la volaille, etc. sont décrites par exemple dans Vaitukaitis et al. (Vaitukaitis, Robbins et al. 1971). L'antigène est combiné avec un adjuvant (par ex., Freud's adjuvant) et administré à un animal, typiquement par injection sous-cutanée. Des injections répétées peuvent être réalisées. Les échantillons sanguins (immun sérum) sont collectés et les immunoglobulines sont séparées.
La présente invention concerne un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec le polypeptide selon la présente invention. Dans un mode de réalisation particulier, l'animal a été immunisé avec le peptide LIV21a et/ou LIV21b. Dans un mode de réalisation préféré, l'animal est immunisé avec ces deux peptides. La présente invention concerne également un sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal ou un humain avec un polypeptide selon la présente invention, notamment un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs 1-5, ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. Par exemple, les peptides peuvent être couplés à une protéine porteuse telle que l'hémocyanine, puis injectés à un animal, par exemple un lapin, pour immunisation. Des anticorps polyclonaux ont été obtenus à partir de ces deux peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum pré immun.
Des méthodes de production d'anticorps monoclonaux à partir de différentes espèces animales peuvent être trouvées par exemple dans Harlow et al. (Harlow 1988) ou dans Kohler et al. (Kohler and Milstein 1975). Ces méthodes comprennent l'immunisation d'un animal avec un antigène, suivie de la récupération des cellules spléniques qui sont ensuite fusionnées avec des cellules immortalisées, telles que des cellules de myélome. Les hybridomes résultant produisent des anticorps monoclonaux et peuvent être sélectionnés par dilutions limites de manière à isoler les clones individuels. Les anticorps peuvent également être produits par sélection de banques combinatoires d'immunoglobulines, telles que celles divulguées par exemple dans Ward et al. (Ward, Gussow et al. 1989).
L'invention a également pour objet l'utilisation des anticorps selon l'invention pour la détection et/ou la purification de la protéine LIV21 humaine. Particulièrement, les anticorps spécifiques de LIV21 peuvent être utilisés pour la détection de ces protéines dans un échantillon biologique. Ils constituent ainsi un moyen d'analyse immunocytochimique ou immunohistochimique de l'expression de LIV21 sur des coupes de tissus. Généralement pour de telles analyses, les anticorps utilisés sont marqués afin d'être détectables. En alternative, les anticorps peuvent être marqués indirectement.
Dans un mode de réalisation préféré, les anticorps sont marqués. Les marqueurs incluent les radiomarqueurs, les enzymes, les marqueurs fluorescents, luminescents, chimiques, des particules magnétiques, par marquage à l'or, par marquage de type biotine/avidine, péroxydase, etc..
L'invention a également pour objet une méthode de détection de la protéine LIV21 dans un échantillon biologique, comprenant une étape de traitement convenable des cellules par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire, une étape de mise en contact dudit milieu intracellulaire ainsi obtenu avec un anticorps spécifique de la protéine LIV21 humaine et une étape de mise en évidence par tout moyen approprié du complexe LIV21 -anticorps formé. Dans des modes de réalisation particuliers, les extraits cytoplasmiques et/ou nucléaires sont préparés, et ces extraits sont mis en contact avec l'anticorps spécifique de la protéine LIV21 humaine. Diagnostic
La présente invention enseigne la mise au point du test diagnostic permettant aussi le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire. En particulier, la présente invention permet le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire sur des cellules ou des tissus frais, sur des cellules ou des tissus congelés et sur des tissus traités entre autre avec de la paraffine. Les applications peuvent être le diagnostic du cancer ainsi le suivi de l'évolution d'une prolifération cellulaire. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Quatre de ces propriétés peuvent être utilisées: son passage du compartiment cytoplasmique cellulaire au compartiment nucléaire, la propriété de s'associer au facteur de transcription E2F4 afin de former un complexe inhibant l'expression du facteur E2F1 et la capacité de LIV21 à se transloquer dans le noyau par inhibition spécifique de PKCε, la sumoylation de LIV21 quand celui-ci est nucléaire et intégrée dans les corps PML et son interaction avec HDAC.
L'état majoritairement cytoplasmique de cette protéine dans les cas de cancer par rapport à sa situation nucléaire dans les cellules saines est une différence géographique et structurelle qui permet, sans nécessité d'un marqueur fluorescent, de différencier des profils spectraux du pattern fonctionnel du tissu cancéreux versus du tissu sain et ainsi de faire le diagnostic.
Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses, plus particulièrement de cellules cancéreuses invasives, agressives et/ou métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines ou de tissus bien différentiés. L'invention concerne par ailleurs des méthodes de diagnostic ou de pronostique du cancer mettant en oeuvre la détection de la localisation cytoplasmique d'un facteur de transcription localisé dans le noyau dans des cellules saines.
La présente invention concerne une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans l'échantillon biologique dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses. De préférence, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques. La méthode comprend de préférence une étape préalable de traitement convenable des cellules contenues dans l'échantillon par tout moyen approprié permettant de rendre accessible le milieu intracellulaire. La méthode comprend facultativement une étape de comparaison avec un échantillon biologique ne contenant pas de cellules cancéreuses.
Facultativement, la méthode selon la présente invention comprend en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. La méthode peut notamment comprendre la détection du produit de l'expression de deux de ces gènes ou des trois gènes. Par ailleurs, au moins un des rapports LIV21 / PKCε,
LIV21 / E2F4 et LIV21 / E2F1 peut être déterminé dans la présente méthode. Ce rapport peut être déterminé dans le cytoplasme et/ou dans le noyau. De préférence, ces rapports sont déterminés dans le noyau. De préférence, ces rapports sont comparés à ceux obtenus dans une cellule saine.
La méthode peut également comprendre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, E2F4, E2F1, SUMO,
HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, pi 07, ρl30 de la famille des pockets protéines. Elle peut comprendre en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en NFkB, cdc2A, mdm2, p21, ρ53, p65, ¥161, et CAFl. La méthode peut comprendre la détection d'une interaction entre certaines de ces protéines et/ou la détection d'une modification post- traductionnelle d'une de ces protéines. Dans un mode de réalisation préféré, le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. De préférence, la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique. Ainsi, la méthode comprend une étape de mise en contact des cellules de l'échantillon biologique avec un anticorps anti-LIV21 humaine. Les anticorps, peuvent être monoclonaux ou polyclonaux. L'anticorps anti-LIV21 peut par exemple être un sérum anti-LIV21.
Lorsque le produit de l'expression d'un des gènes PKCε, E2F1 et E2F4 doit être détecté, la méthode peut utiliser des anticorps spécifiques des protéines PKCε, E2F1 et E2F4, respectivement. Les anticorps polyclonaux et monoclonaux dirigés contre PKCε, E2F1 et E2F4 sont disponibles commercialement. A titre d'exemple, on peut citer, pour PKCε, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-214), pour E2F1, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-860), et pour E2F4, un anticorps polyclonal de lapin (Santa Cruz Technology, sc-866). De préférence, les anticorps sont marqués, directement ou par l'intermédiaire d'un anticorps secondaire. Les techniques de marquage des anticorps sont bien connues de l'homme du métier.
Dans un mode de réalisation particulier, la protéine peut être détectée par une analyse Western blot. L'analyse Western blot peut être réalisée sur des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques des cellules contenues dans l'échantillon de la patiente. Brièvement, les protéines sont mises à migrer dans un gel puis transférer sur une membrane. Ensuite, cette membrane est incubée en présence des anticorps et la fixation des anticorps est éventuellement révélée à l'aide d'anticorps secondaires marqués.
Dans un autre mode de réalisation, la protéine est détectée par immunohistochimie, immunocytochimie ou immunoradiographie. Ces techniques sont bien connues de l'homme du métier. L'analyse d'immunocytochimie peut être effectué sur des cellules entières provenant de l'échantillon ou étant dérivées de celui-ci, par exemple par culture cellulaire. Elle peut également être réalisée sur des noyaux isolés. L'analyse d'immunohistochimie peut être faite sur des coupes de tissu mammaire.
A titre d'illustration, une analyse par immunocytochimie peut comprendre les étapes suivantes. Cependant, il est entendu que d'autres modes préparatoires peuvent être mis en oeuvre. Des cellules provenant de l'échantillon biologique sont cultivées, de préférence sur des lames (Lab Tek,Nunc, Allemagne), puis lavées avec du tampon et fixées avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Une étape de saturation est de préférence réalisée en incubant les cellules avec du tampon S (PBS-Triton XlOO 0,1% - SVF 10%). Les cellules sont ensuite incubées avec l'anticorps primaire et sont ensuite lavées et incubées avec un anticorps secondaire fluorescent, si nécessaire. Les noyaux peuvent être marqués à l'iodure de propidium (Sigma). Les lames sont montées au moviol pour l'observation en microscopie à fluorescence. Par ailleurs, des noyaux isolées prélevés au cours d'une extraction nucléaire peuvent être fixés avec du paraformaldéhyde (par ex. 4%). Les suspensions de noyaux sont déposées entre lame et lamelle et l'observation est faite en microscopie à fluorescence et en microscopie confocale. Les anticorps primaires sont par exemple des anticorps de lapin et les anticorps secondaires sont des anticorps marqués dirigés contre les IgG de lapin.
La présente invention concerne également l'utilisation d'une puce à protéines permettant de détecter l'expression d'une ou plusieurs de ces protéines, et/ou une interaction entre deux ou plus de ces protéines, et/ou la modification post- traductionnelle d'une ou plusieurs de ces protéines.
Dans un mode de réalisation préféré, la détection du produit de l'expression d'un ou plusieurs gènes ou de l'interaction entre plusieurs protéines est réalisée à l'aide d'une puces à protéines. Ainsi, un polypeptide selon la présente invention, en particulier LIV21 ou un fragment de celui-ci, ou un anticorps spécifique de celui-ci, un fragment ou un dérivé de celle-ci conservant la spécificité de liaison, peut avantageusement être immobilisé sur un support, de préférence une puce à protéines. Une telle puce à protéines est un objet de l'invention. Cette puce peut également contenir au moins un polypeptide sélectionné parmi le groupe consistant en la protéine kinase C epsilon (PKCε), RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, plO7, pl30 de la famille des pockets protéines ou au moins un anticorps spécifique d'un de ces polypeptides, un fragment ou un dérivé de celle-ci conservant la spécificité de liaison. La puce peut en outre comprendre également d'autres polypeptides bien connus de l'homme du métier comme présentant un intérêt pour la détection et/ou le pronostic d'un cancer, ou des anticorps spécifiques de ceux-ci. Ces polypeptides peuvent par exemple être sélectionnés dans la liste suivante : NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, ρ65, Ki67, et CAFl .
Les puces à protéines selon la présenté invention peuvent être préparées selon les techniques bien connus de l'homme du métier. En pratique, on peut effectuer la synthèse des polypeptides fixés directement sur la puce à protéines, ou effectuer une synthèse ex situ suivie d'une étape de fixation du polypeptide synthétisé sur ladite puce.
Par ailleurs, les polypeptides ou anticorps à fixer peuvent être purifiés à partir d'une cellule. Les supports incluent les supports lisses (par exemple, métal, verre, plastique, silicium, et surfaces en céramique) aussi bien que les matériaux texturisés et poreux. De tels supports incluent également, mais ne sont pas limités à, des gels, des caoutchoucs, des polymères, et d'autres matériaux souples. Les supports n'ont pas besoin d'être plats. Les protéines ou anticorps de la puce peuvent être fixés directement sur le support ou être attachés par l'intermédiaire d'un espaceur ou d'un lien.
Dans un mode de réalisation particulier, un anticorps spécifique de LIV21, un fragment ou un dérivé de celle-ci conservant la spécificité de liaison est immobilisé sur le support solide. Ainsi, cette puce fournie un moyen pratique pour mesurer le produit d'expression de LIV21. De préférence, la puce comprend au moins un anticorps spécifique d'un polypeptide sélectionné parmi le groupe consistant en PKCε, RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb5 PML5 plO7, pl30 de la famille des pockets protéines, de préférence PKCε, E2F1, et E2F4. La puce comprend en outre au moins un anticorps spécifique d'un polypeptide connus de l'homme du métier comme présentant un intérêt pour la détection et/ou le pronostic d'un cancer, par exemple NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, ρ65, Ki67, et CAFl. La puce peut comprendre un anticorps ou un fragment ou dérivé de celui-ci présentant la même spécificité.
Les puces à protéines selon l'invention sont également extrêmement utiles pour les expériences de protéomique, qui étudie les interactions entre les différentes protéines. De façon simplifiée, on fixe des peptides représentatifs des différentes protéines sur un support. Puis, on met ledit support en contact avec des protéines marquées, et après une étape optionnelle de rinçage, on détecte des interactions entre lesdites protéines marquées et les peptides fixés sur la puce à protéines.
On entend désigner par puce à protéines, un support sur lequel sont fixées des polypeptides ou anticorps, chacun d'entre eux pouvant être repéré par sa localisation géographique. Ces puces diffèrent principalement par leur taille, le matériau du support, et éventuellement le nombre de polypeptides qui y sont fixés.
Les puces à protéines peuvent également être utiles pour le criblage de composés tests.
La présente invention a également pour objet une méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans un échantillon de cellules dans l'échantillon biologique dudit patiente, laquelle méthode est caractérisée en ce qu'elle comprend au moins : (a) la mise en contact dudit échantillon biologique avec une puce à protéines tels que définis ci-dessus, et (b) la révélation par tout moyen approprié des complexes antigène- anticorps formés en (a), par exemple par EIA, ELISA, RIA, ou par immunofiuorescence. D'autres méthodes de détection sont décrites en détail dans les documents suivants : US2004152212.
Des méthodes applicables pour la synthèse de puce à protéines sont décrites par exemple dans les brevets suivants : WO2004/063719, WO2005/016515, US2005019828, WO03018773, US2002187464, US 5,143,854, US 5,242,974, US 5,252,743, US 5,324,633, US 5,384,261, US2006035387, US2005100947, US2005233473, WO0198458, WO0172458, WO0004382, WO0004389, WO9015070, WO9210092, WO9310161, WO9512808, WO9601836, le contenu de ces brevets étant incorporé par référence dans la présente demande. Par exemple, ces puces à protéines peuvent être fabriquées selon les méthodes classiques décrites (Lubman David M5QIAO TIECHENG Alex,Mathew ABY J etc..) ou de nouveaux outils d'automatisation d'hybridation comme de lecture US2004152212 et Yu Xinglong US 2005019828 et de nouveaux supports accrochant les polypeptides Klages Claus Peter et (exemple figure 2).
Les échantillons biologiques proviennent d'un patient potentiellement atteint de cancer ou atteint de cancer de manière avérée. Par "échantillon biologique", on entend notamment un prélèvement du type fluide biologique, tissu vivant, fragment de tissu, mucosité, organe ou fragment d'organe, ou tout surnageant de culture obtenu à l'aide d'un prélèvement. La méthode selon la présente invention peut comprendre une étape de prélèvement d'un échantillon biologique du patient. L'étape de détection peut être effectuée directement sur une coupe de tissu de l'échantillon, sur une culture de cellules provenant de l'échantillon, sur des extraits cellulaires totaux, des extraits nucléaires et/ou cytoplasmiques. L'échantillon du patient peut provenir d'une ponction, d'une biopsie, du broyât cellulaire, d'une aspiration bronchique, d'un prélèvement sanguin ou d'un prélèvement d'urine.
Dans un mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène PKCε, une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses. Plus précisément, la quantité de PKCε dans des cellules saines est comparée à la quantité de PKCε dans les cellules de l'échantillon et l'augmentation significative est déterminée par cette comparaison. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux LIV21 / PKCε. Ce rapport LIV21 / PKCε augmente dans la fraction cytoplasmique des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.
Dans un autre mode de réalisation particulier de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F4, la méthode comprend la détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4, et une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses. La détection de l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 peut être réalisée par une détection concomitante de LIV21 et de E2F4 et/ou par la mesure concomitante d'HDACl. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F4 / LIV21. Ce rapport E2F4 / LIV21 diminue dans le noyau des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines..
Dans un mode de réalisation supplémentaire de la méthode comprenant la détection du produit d'expression du gène E2F1, la présence de la protéine E2F1 dans le noyau est indicative de la présence de cellules cancéreuses. La méthode selon la présente invention peut éventuellement comprendre la mesure du taux E2F1 / LIV21. Ce rapport E2F1 / LIV21 augmente dans la fraction nucléaire des cellules cancéreuses par rapport à des cellules saines.
La méthode selon la présente invention permet notamment la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement et de déterminer le degré d'invasivité d'un cancer. La spécificité de la détection peut être liée aux croisements des informations obtenues par l'existence et la topographie de LIV21 par tous les moyens d'imagerie et de spectroscopie et obtenues par l'association aux autres indicateurs cancérologiques connus via des puces à protéines ou des microarrays. Ainsi, la détection basée sur LIV21 peut être associée à la détection d'autres marqueurs du cancer, en particulier du cancer du sein, connus de l'homme du métier.
En effet, la présente invention concerne une méthode de suivi thérapeutique d'un traitement anti-cancéreux chez un patient souffrant d'un cancer comprenant, l'administration du traitement anti-cancéreux au dit patient et la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. Une diminution des cellules cancéreuses sera indicative de l'efficacité du traitement. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois au cours du traitement anti-cancéreux ou après le traitement anticancéreux. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité. Par ailleurs, la présente invention concerne également une méthode de détection des récidives suite à un traitement anti-cancéreux d'un cancer chez un patient comprenant, la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention. La détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique du patient selon la méthode de la présente invention peut être effectuée une fois ou plusieurs fois après le traitement anti-cancéreux. La détection de cellules cancéreuses est indicative de récidives. De préférence, l'échantillon biologique provient du tissu touché par le cancer traité.
La présente invention décrit également un kit pour la mise en œuvre d'une méthode selon l'invention. Plus particulièrement, l'invention concerne un kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps qui se lie spécifiquement à LIV21 humaine selon la présente invention et un sérum anti-LIV21 selon la présente invention. Dans un mode de réalisation préféré, le kit comprend des anticorps qui se lient spécifiquement à LIV21 humaine. Le kit selon la présente invention peut comprendre des réactifs permettant la détection d'un complexe LIV21 -anticorps produit lors d'une réaction immunologique. Facultativement, le kit selon la présente invention comprend en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4. Ces moyens de détection peuvent être des anticorps spécifiques de la protéine.
La présente invention concerne également une composition diagnostique comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps selon la présente invention et un sérum selon la présente invention.
Thérapie Anti-cancéreuse Dans le contexte d'une thérapie anti-cancéreuses, on peut envisager d'augmenter la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Pour cela, on pourrait favoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en diminuant l'activité de PKCε dans les cellules cancéreuses et en utilisant les inhibiteurs d'HDAC.
Dans un autre mode particulier de thérapie anti-cancéreuse, on peut envisager de diminuer l'activité de PKCε dans les cellules cancéreuses. Cette diminution d'activité peut être réalisée en diminuant l'activité de la protéine PKCε ou en diminuant son expression. Une diminution de l'activité de la protéine PKCε peut être obtenue en administrant aux cellules cancéreuses des inhibiteurs de . la protéine PKCε. Les inhibiteurs de la protéine PKCε sont bien connus de l'homme du métier. Une diminution de l'expression de la protéine PKCε peut être obtenue en utilisant des antisens ou des siRNA spécifiques du gène PKCε. Des kits sont commercialement disponibles. Par ailleurs, les techniques concernant les inhibitions par anti-sens ou siRNA sont bien connues de l'homme du métier. (Arya R 2004, Lee W 2004, Sen A 2004, PlatetN 1998, Hughes 1987)
La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCε. Elle concerne également l'utilisation d'une composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCε comme médicament, en particulier pour la préparation d'un médicament destiné à traiter un cancer. Elle concerne enfin une méthode de traitement du cancer chez un patient comprenant l'administration aux cellules cancéreuses d'un inhibiteur de la protéine PKCε, l'inhibiteur de la protéine PKCε permettant de réduire ou d'abolir le phénotype cancéreux des cellules traitées. Dans un premier mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCε diminue l'activité de la protéine PKCε. Dans un deuxième mode de réalisation, l'inhibiteur de la protéine PKCε diminue l'expression de la protéine PKCε. De préférence, le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome, sans être limité à ceux-ci.
Dans le contexte d'une thérapie d'une maladie neurodégénérative, on peut envisager de diminuer la quantité de LIV21 présente dans le noyau. Les cellules touchées par la maladie neurodégénérative sont généralement des neurones, des motoneurones, etc.. Dans un mode de réalisation préféré, la maladie neurodégénérative est choisie parmi la maladie d'Alzheimer, de Huntington, de Parkinson et la sclérose latérale amyotrophique (ALS). Pour cela, on pourrait également défavoriser la localisation nucléaire de LIV21, par exemple en augmentant l'activité de PKCε dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative. Cette augmentation d'activité peut être réalisée en augmentant l'activité de la protéine PKCε ou en augmentant son expression. Une augmentation de l'activité de la protéine PKCε peut être obtenue en administrant aux cellules touchées par la maladie neurodégénérative des activateurs de la protéine PKCε. Les activateurs de la protéine PKCε sont bien connus de l'homme du métier (Toma O (2004), Activation des PKC par DAG, AGPI : acide oléique, linoléique, arachidonique etc ... Activation et protéolyse des PKC dans les cellules gonadotropes : Communication 2004 de Macciano H, Junoy B, Mas JL Drouva SV UMR6544 Marseille). Une augmentation de l'expression de la protéine PKCε peut être obtenue en utilisant des vecteurs d'expression codant pour la protéine PKCε et permettant de la surexprimer dans les cellules touchées par la maladie neurodégénérative.
Ainsi, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant un activateur de la protéine PKCε ou un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCε. Elle concerne en outre l'utilisation d'un activateur de la protéine PKCε ou d'un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCε pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neurodégénérative.
Méthode de criblage
L'invention concerne des méthodes pour la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs diminuant la prolifération cellulaire, basées sur la mesure de la localisation nucléaire versus cytoplasmique de LIV21, ou de la liaison de la protéine LIV21 à la protéine E2F4.
Dans un premier mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination de la localisation nucléaire versus cytoplasmique du produit d'expression de LIV21. Une augmentation de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou abolir la prolifération cellulaire. Une diminution de la localisation nucléaire de LIV21 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un deuxième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine PKCε. Une diminution de l'expression de PKCε indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de PKCε indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un troisième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau de complexe
LIV21/E2F4. Une augmentation du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une diminution du niveau de complexe LIV21/E2F4 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
Dans un quatrième mode de réalisation, la sélection, l'identification, la caractérisation ou l'optimisation de composés actifs d'intérêt thérapeutique comprend la mise en contact d'un composé candidat avec une cellule et la détermination du niveau d'expression du gène codant pour la protéine E2F1. Une diminution de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour diminuer ou d'abolir la prolifération cellulaire. Une augmentation de l'expression de E2F1 indique que le composé candidat est actif pour traiter ou prévenir une maladie neurodégénérative.
L'invention a encore pour objet une méthode de criblage d'un composé capable d'interagir in vitro, directement ou indirectement, avec LIV21 caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact le composé candidat et LIV21 et, dans une deuxième étape, on détecte par tout moyen approprié le complexe formé entre ledit composé candidat et LI V21.
La présente invention a également pour objet une méthode de criblage d'un composé capable de moduler (activer ou inhiber) l'activité de la protéine LIV21, caractérisée en ce que: dans une première étape, on met en contact des cellules d'un échantillon biologique exprimant la protéine LIV21 avec un composé candidat, dans une deuxième étape, on mesure par tout moyen approprié l'effet dudit composé candidat sur l'activité de ladite protéine LIV21, et dans une troisième étape on sélectionne des composés candidats capables de moduler ladite activité. L'activité de LIV21 peut par exemple être estimée par l'intermédiaire de l'évaluation de la capacité de la cellule à se diviser, par la mesure de l'expression du gène E2F1, ou par la localisation cytoplasmique et/ou nucléaire de LIV21.
Le composé candidat peut être une protéine, un peptide, un acide nucléique (ADN ou ARN), un lipide, un composé organique ou inorganique. Notamment, le composé candidat pourrait être un anticorps, un anti-sens, un ribozyme ou un siRNA.
D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront dans les exemples et les figures qui suivent, donnés à titre non limitatif.
EXEMPLES EXEMPLE 1 L'inventeur a fait réaliser une spectrométrie de masse (MALDI) pour la protéine LIV21 à partir d'un gel d'acrylamide monodimensionnel. La protéine LIV21 a été digérée par la trypsine. Les peptides issus de la digestion sont solubilisés dans un solvant : acétonitrile/eau (1/1) contenant 0,1 % TFA (acide trifluoro acétique). Une solution saturée de la matrice alpha cyano-4-hydroxycinnamique a été préparée dans le même solvant. On a prélevé un même volume des deux solutions, on a mélangé et déposé 1 μl sur la plaque de MALDI pour analyse. La spectrométrie de masse a montré que la protéine LIV21 digérée par la trypsine met en évidence 54 peptides (cf. Figures 3-4). La protéine LIV21 a été caractérisée par un poids moléculaire de 50 kD, mise en évidence par Western Blot , les premiers résultats MALDI n'étant pas probands, l'inventeur a fait réaliser un gel bidimensionnel SDS PAGE (Figure 8) plus de dix protéines ont été révèles par coloration au noitrate d'argent mais la quantité très faible de matériel n'a pas permis de tester des échantillons issus de ce gel en MALDI ni MSMS.
Lorsqu'elle change de compartiment cellulaire et qu'elle est sumoylée, elle a un poids moléculaire de 6OkD environ. Lorsqu'elle est phosphorylée dans le cytoplasme, elle présente deux formes différant de quelques kilobases. On observe alors un doublon.
L'inventeur a fait réaliser une troisième analyse MALDI qui a donné des résultats intéressants surtout sur la bande de gel de 49KD sur gallus gallus et un variant de l'histatine (figure, l'inventeur a alors regardé les alignements de séquences qui permettaient de confirmer des homologies entre gallugallus, PATF, Q7TCL4 et les polypeptides de l'histatine et de gallus gallus (Figure 10 à 13).
Deux peptides seulement caractérisent en commun PATF et LIV21 :
- Le peptide LIV21a est localisé entre un site d'interaction avec la protéine Rb/pl07/ρl30 (ITCCE) et un site de sumoylation par SUMOl. La séquence de ce peptide est la suivante : PeptideLIV21a RVYGPLTNPKPQ SEQ ID No I
- Le peptide LIV21b est localisé entre un site de sumoylation (PKPG) et un site (YVKI) phospholipase C suivi de (KKKRK) NLS. La séquence de ce peptide est la suivante : PeptideLIV21b CYRSILHTKV SEQ ID No 2
- Le peptide LIV21 c SYMSMFLLLMAISCVLAK SEQ ID No 3
- Le peptide LIV21d PLMIIHHLDDCPHSQALK SEQ ID No 4
D'autres peptides sont fournis dans les séquences SEQ ID NOs: 5-55. EXEMPLE 2 : Etude de la translocation nucléaire de LIV21 dans les cellules MCF-7 L'étude de la distribution sub-cellulaire de LIV21 dans différentes lignées tumorales d'origines diverses a montré une localisation exclusivement cytoplasmique de cette protéine. Il a été montré par quel(s) mécanisme(s) LIV21 pouvait être transloquée dans le noyau pour agir sur le cycle cellulaire.
La présence de sites putatifs de phosphorylation par les Protéines Kinases C (PKCs) pour l'homologie possible que PATF aurait avec la séquence de LIV21 a orienté l'étude de l'inventeur vers une éventuelle implication de ces protéines sur sa translocation nucléaire. L'inventeur a donc choisi d'étudier la lignée MCF-7 traitée par le TPA, dont on sait qu'il module les PKCs.
Parallèlement à ce travail, l'inventeur a également étudié l'expression et la localisation de protéines du cycle cellulaire impliquées dans la voie de signalisation dans laquelle pourrait agir LIV21.
La lignée des cellules MCF-7
La lignée MCF-7 est une lignée humaine non clonale de cellules d'adénocarcinome du sein. Lors de leur différenciation induite par des facteurs exogènes, ces cellules développent une hypertrophie, des protrusions membranaires et une tendance à se dissocier les unes des autres. Elles acquièrent un phénotype sécrétoire se caractérisant par l'apparition de nombreux granules et de canalicules sécrétoires.
In vivo, ces cellules sont peu métastasiques et cette invasivité réduite serait due à une faible activité constitutive des protéines kinases C (PKCs) et à un taux peu élevé de l'expression de la protéine kinase C alpha.
Cette lignée est utilisée dans de nombreuses études sur la prolifération, la différenciation et l'apoptose. Ces études utilisent des drogues appropriées comme le
TNF pour l'induction de l'apoptose, ou le TPA (12 -O -tetradecanoyl phorbol-13 - SUMOate) pour l'induction de la différenciation et donc pour l'étude de la sortie du cycle cellulaire.
L'effet du TPA sur la lignée MCF-7 Le TPA est un activateur connu des PKCs. Il active la croissance des cellules normales du sein, ne modifie pas la prolifération des cellules de tumeurs bénignes de ce même tissu, mais il inhibe de manière drastique la prolifération des cellules de lignées de tumeurs mammaires humaines telles que la lignée MCF-7. Il réduit la croissance cellulaire de cette lignée en contrôlant positivement le récepteur c-erb-2 et en contrôlant négativement le récepteurα de l'acide rétinoïque, qui sont tous deux exprimés de manière particulièrement importante dans ces cellules. Le TPA inhibe fortement et rapidement l'expression et la fonction des récepteurs aux œstrogènes (ER) et il induit la translocation, temps- et dose-dépendante, des protéines kinase C (PKCs) du cytosol vers les membranes.
D'autre part, le TPA augmente la capacité de migration des cellules MCF-7 in vitro et un court traitement de ces cellules par le TPA induit une expansion cellulaire et une organisation des microtubules caractéristiques de leur différenciation.
Expression de LIV21 dans les cellules MCF-7
Dans un premier temps, l'inventeur a vérifié l'expression de LIV21 dans ces cellules au niveau protéique.
L'inventeur a abordé l'étude de l'expression de la protéine LIV21 par la technique du western blot, avec un anticorps anti-LIV21, dans les cellules MCF-7 par rapport aux tissus mammaires. Les anticorps anti-LIV21 ont été obtenues par la méthode décrite ci- dessous. Dans cette lignée, LIV21 s'exprime aussi bien dans les tissus mammaires que dans les cellules MCF-7, sous la forme d'un doublet migrant à un poids moléculaire apparent de 50 kDa.
Production du sérum purifié anti-LIV21
Les séquences peptidiques spécifiques sont les séquences n°l et n°2 Ces peptides ont été injectés aux lapins (NZ W ESD 75 femelle 2,3kg au jour 0) En accord avec les procédures d'immunisation standard, tels que :
La réactivité du sérum obtenu a été testée pour lier les séquences peptidiques n°let 2. A J60 le sérum montre une bonne réactivité avec chaque séquence. Le sérum produit n'est lié à aucun membre de la famille E2F.
L'effet du TPA dans les cellules MCF-7
II a été décrit dans la littérature que le TPA induit l'arrêt de prolifération et la différenciation des cellules tumorales de la lignée MCF-7. Pour valider les conditions de culture, la croissance cellulaire (par comptages) a été préalablement suivie sur trois jours de culture en présence ou en absence de TPA à une concentration de 25 nM (Figure 13). Les comptages cellulaires mettent en évidence une variation de la cinétique de croissance entre les cultures non traitées et les cultures traitées au TPA. En effet, dès le deuxième jour de culture, le nombre de cellules entre les deux conditions de traitement est significativement différent, le TPA induisant déjà l'arrêt de prolifération cellulaire. Au bout de 3 jours de traitement, les cultures contrôles présentent deux fois plus de cellules que les cultures traitées. Le TPA à la concentration de 25 nM inhibe donc bien la prolifération dans nos conditions de culture.
Parallèlement, l'inventeur a pu observer que les cellules traitées au TPA acquièrent rapidement des caractéristiques de cellules différenciées de glande mammaire (Figure 14) : hypertrophie, profusions membranaires et tendance à se dissocier les unes des autres. Cependant, dans le laps de temps où les cellules ont été étudiées, le phénotype sécrétoire (apparitions de granules et de canalicules sécrétoires) n'a pas été observé.
Analyse par FACS de l'effet du TPA
Ces études préliminaires de l'effet du TPA ont montré en:
Phase S : L'étude par FACS montre que le nombre de cellules en phase S diminue pour atteindre une valeur limite entre 12h et 24h de traitement au TPA (Figure 15A). Mais, sans nouvel ajout de TPA, le nombre de cellules en phase S augmente de nouveau pour revenir à l'état initial à 72h de traitement.
Phase G2/M : Le nombre de cellules en phase G2/M augmente dès le début du traitement avec un maximum observé à 12 heures (Figure 15B).
Phase G0/G1 : Le nombre de cellules en phase G0/G1 est minimal à 6 heures et maximal à 24 heures (Figure 15C).
On observe donc un maximum de cellules en phase S dans les temps précoces de la cinétique (Oh à 6h), en phase G2/M à 12h et enfin en phase G0/G1 à 24h. Au final, sans nouvel ajout de TPA, les cellules repartent en phase S à 72h.
En conclusion, ces résultats montrent donc que le TPA agit rapidement sur l' arrêt de prolifération cellulaire et son effet sur la réduction du nombre de cellules en phase S est optimal à 12h. Au bout de 72h après l'unique ajout de TPA, les cellules ré-initient le cycle cellulaire.
L'effet du TPA sur la localisation nucléaire de LIV21 Les résultats obtenus par la cytométrie de flux ont conduit l'inventeur à étudier en parallèle l'expression de LIV21 dans des extraits nucléaires effectués après 12h, 24h, 48h, et 72h de traitement par le TPA (Figure 16A). Lors de cette cinétique, un maximum d'immunoréactivité anti-LIV21 a été observé dès 12h, qui se maintient jusqu'à 48h et retrouve son intensité initiale après 72h de traitement. Ces données sont à rapprocher de celles obtenues par FACS. L'immunoréactivité de LIV21 augmente significativement à 12h, temps où le nombre de cellules en phase S est minimal. Elle perdure jusqu'à la reprise du cycle cellulaire observée à 72h.
De plus, on peut remarquer que cette immunoréactivité est détectée sous la forme d'une bande unique à un poids moléculaire apparent de 50 kDa, alors qu'elle s'exprimait majoritairement sous la forme d'un doublet dans les extraits totaux. Pour savoir à quelle forme de LIV21 correspond cette bande unique, il a été comparé sur un même western blot un extrait total et un extrait nucléaire à 12h de traitement (Figure 16B). Les résultats obtenus montrent que la forme nucléaire de LIV21 correspond à la bande inférieure du doublet. Ces données suggèrent que la protéine LIV21 pourrait se trouver dans un état de phosphorylation différent selon le compartiment cellulaire.
Les résultats de l'étude immunocytochimique réalisée à l'aide de l'anticorps anti-LIV21 montrent que la translocation nucléaire de LIV21 est maximale à 12h (Figure 17) et la localisation de LIV21 est majoritairement cytoplasmique à 72h, ce qui est en accord avec les observations en western blot. Cependant, il est intéressant de noter que l'expression de LIV21 débute déjà dès Ih de traitement dans certaines cellules, car elles ne sont pas synchrones.
L'ensemble de ces observations montre que la translocation nucléaire de LIV21 est concomitante à la diminution du nombre de cellules en phase S. EXEMPLE 3 : Etude de l'influence des PKC sur la translocation nucléaire de LIV21 Effet du TPA sur l'expression de PKCε
Étude en Western Blot : Étant donné que la séquence protéique de LIV21 possède des sites putatifs de phosphorylation par les PKCs dont deux spécifiques de la PKCε (, l'inventeur a testé la variation de l'expression de cette PKC en fonction de la durée de traitement par le TPA. Il a été observé que le TPA agit très rapidement sur l'expression de PKCe51 qui diminue dès 30 min (Figure 18). L'expression de la PKCzeta (PKCζ) est utilisée en tant que contrôle interne car elle n'est pas sensible au TPA.
Immunocytochimie : Parallèlement, des expériences d'immunofluorescence sur des cultures traitées ou non ont permis de mettre en évidence cette diminution de la PKCε concomitante à la translocation nucléaire de LIV21 (Figure 19). On peut observer que PKCε disparait du cytoplasme lorsque les cellules sont traitées au TPA et que LIV21 est détectée dans le noyau.
Pour conclure, il est intéressant de noter que la PKCε est faiblement exprimée à 12h, temps où on observe le moins de cellules en phase S et le maximum de translocation nucléaire de LIV21.
EXEMPLE 4 : Etude du rôle spécifique de PKCε sur la translocation nucléaire de LIV21 à l'aide d'un peptide inhibiteur de la fonction et de la translocation de PKCε Pour déterminer l'action spécifique de PKCε sur la translocation de LIV21, les cultures ont été traitées avec un peptide, antagoniste sélectif de la fonction et de la translocation de cette PKC (EAVSLKPT (SEQ ID No 6), et les résultats ont été comparés avec ceux obtenus par traitement au TPA. Ce peptide est reconnu par l'enzyme et se lie en tant que substrat modifié au niveau de son site catalytique. Non phosphorylable, il agit en tant qu'inhibiteur spécifique de l'activité de PKCε.
L'effet de l'inhibition sélective de l'activité de la PKCε sur la translocation nucléaire de LIV21 a été étudié par immunocytochimie. Ces expériences ont été réalisées sur des cultures traitées ou non pendant 12h, avec du TPA à 25 nM ou avec le peptide à deux concentrations différentes, 1 et 2 μM (Figure 20). Le peptide utilisé à la concentration de 2 μM a un effet identique à celui du TPA sur la translocation nucléaire de LIV21.
Ces résultats ont été confortés par des expériences de fractionnement cellulaire sur des cultures traitées par le peptide inhibiteur de PKCε à 2 μM comparées à des cultures traitées par le TPA (Figure 21). Le même profil d'expression de LIV21 a été observé sous la forme d'un doublet dans le cytoplasme et d'une bande unique dans la fraction nucléaire.
L'inhibition spécifique de la PKCε induit une translocation nucléaire de LIV21, ce qui suggère que LIV21 pourrait être la cible de la PKCε, qui le maintiendrait dans le cytoplasme sous une forme phosphorylée.
EXEMPLE 5 : Analyse par Western Blot Cet exemple décrit les conditions utilisées pour une analyse par Western Blot de cellules cancéreuses du sein.
Les extraits protéiques sont chauffés 5 minutes à 80°C dans le tampon Laemmli (pH 7.4, Tris 0,06M, SDS 3%, glycerol 10%, PMSF ImM, β-mercaptoéthanol). La migration est effectuée en SDS-PAGE (Sodium dodécyl sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophorèsis). 10 à 20 μg de protéines migrent dans un gel de polyacrylamide 12% pendant Ih dans des conditions dénaturantes (Tampon de migration : Tris base 25mM, glycine 192mM, SDS 1%, pH 8.3). Les protéines sont ensuite transférées sur membrane de nitrocellulose (Schleicher & Schuell) pendant une heure en transfert liquide, dans un tampon de transfert (Tris 25mM, glycine 192mM, méthanol 20%, pH 8.3). Les membranes, saturées dans du PBS-Tween 0,1% -Triton X100 0,1%-lait écrémé 5% pendant une heure sont mises en contact avec l'anticorps primaire dilué dans du PBS- Tween 0,1% -Triton XlOO 0,1%-lait 1% à température ambiante sous agitation douce pendant une heure à deux heures. Après lavage, l'anticorps secondaire couplé à la péroxydase est incubé Ih avec les membranes. La révélation se fait par une réaction de chimioluminescence grâce au kit ECL selon le protocole du fournisseur (Amersham). Les anticorps primaires utilisés sont :
Le sérum anti-LIV21 qui a été fabriqué en utilisant deux peptides synthétiques basés sur la séquence de LIV21 : PeρtideLIV21a (SEQ ID No 1 et le peptide LIV21b (SEQ ID
No 2). Les peptides ont été couplés à l'hémocyanine avant d'être injectés à des lapins pour l'immunisation. L'anticorps polyclonal a été obtenu à partir de ces deux peptides en ayant immunisé deux lapins et en ayant saigné un lapin pour avoir un sérum préimmun (afin d'être sûr que cet anticorps n'existait pas déjà chez ce lapin).
L'anticorps polyclonal anti-CDK2 de lapin (Santa-Cruz technology sc-163) dilué au
1/200. L'anticorps monoclonal anti-ρ21 de Souris ( DAKO5 M7202) dilué au 1/150.
L'anticorps monoclonal anti-p27 de souris (Santa-Cruz technology sc-1641) dilué au
1/100.
L'anticorps polyclonal anti- PKCε de lapin (Santa-Cruz technology sc-214) dilué au
1/200. L'anticorps polyclonal anti-PKCδ de lapin (Santa-Cruz technology sc-216) dilué au
1/200.
L'anticorps polyclonal anti-α tubuline de rat (Serotec, MCAP77) dilué au 1/500.
Les anticorps secondaires utilisés couplés à la péroxydase (Caltag) sont :
L'anticorps de chèvre F(ab')2 anti-lapin IgG(H+L) dilué au 1/2000. L'anticorps de chèvre F(ab')2 anti-souris IgG(H+L) dilué au 1/2000.
EXEMPLE 6 :
II a été démontré que la protéine LIV21 est associée aux corps PML et que, lors de la sumoylation, LIV21 passe d'un poids moléculaire de 50kd à 60kd. Par immunoprécipitation, il a été montré une co-localisation de LIV21 avec SUMO dans le complexe PML - SUMO/LIV21. (Figure 22)
Rôle antitumoral des corps PML : Au stade de prolifération, il y a dans les corps PML des modifications visualisées car ces corps PML se dissocient et se dégradent :(speekles), des protéines se mettent alors à disposition dans le noyau pour assurer la transcription, la prolifération, les réactions immunitaires et tout ce qui nécessite la transcription de gènes. Il a été démontré que PML s'associe à SUMO et à HDAC-I (histone déacétylase 1) et que son complexe agit sur l'expression d'E2Fl et PML agit ainsi sur l'arrêt de la prolifération en bloquant E2F1. Ainsi le complexe PML/ HDAC-I régule négativement l'expression d'E2Fl. PML associé à Rb (pi 30) se fixe aux histones désacétylases et bloque E2F1 en se fixant sur la chromatine (figure 2).
Dans les leucémies promyélocytaires aiguës, PML est tronquée et devient une protéine de fusion avec le récepteur de l'acide rétinoïque. Cette protéine de fusion (PMLRARalpha) est due à une translocation chromosomique 15/17. Il a été rapporté dans la littérature un nouveau traitement de cette maladie par association d'arsenic et d'acide rétinoique pour induire les cellules cancéreuses en apoptose. La protéine PML régulerait la prolifération dans les cancers et les lymphomes. L'inventeur a montré par immunoprécipitation l'association SUMO-PML dans lequel est localisé LIV21.
Dans les exemples précédents, il a été montré que LIV21 est phosphorylée par PKCε et que le TPA est un inhibiteur des PKC. Les lignées MCF7 traitées par TPA montrent une inhibition de la prolifération cancéreuse et une différentiation cellulaire et LIV21 est transloquée dans le noyau. Si on a utilisé un peptide inhibiteur spécifique de PKCε, c'est l'activité et non pas l'expression de PKCε qui a été inhibée.
Lors de ce traitement par TPA (25 nM), lorsque l'on a étudié E2F4, pl30 et LIV21
(fluorescence verte) dans les noyaux marqués (ADN) au iodure de propidium
(fluorescence rouge) (Figure 23 et 24), on a observé :
Au bout de 12h des signaux de fluorescence verte intranucléaire de même pattern pour
E2F4, pl30 et LIV21 ; Au bout de 48 h quand la prolifération commence, E2F4 a une localisation comparable ; mais à 72 h, il disparaît du noyau (au profit d'E2Fl).
En observant la co-localisation par double marquage de PML et de LIV21 à 24 h de traitement par TPA (cf. merge : fluorescence jaune), on a observé qu'ils sont colocalisés dans les noyaux. A 48h, la co-localisation est aussi constatée entre LIV21 et SUMO (cf. Figure 23. L'hypothèse est que SUMO, qui se fixe sur LIV21, adresse en fait LIV21 dans les corps PML et que LIV21 est impliqué dans les complexes PML/SUMO/Rb/HDAC-1. Deux approches différentes ont été faites pour démontrer que LIV21 est physiquement associé à PML et SUMO dans les corps nucléaires, par immunoprécipitation (Figure 22) et par co-localisation en immunocytochimie (Figure 23 et 24) (Rb, pl30 et plO7 sont des protéines poches (pocket proteins) qui ont le même site de fixation). Les protéines Rb répriment la croissance cellulaire (Fabbro, Regazzi R Bioch BiophysResComm 1986 Feb 2 ;135 (1) :65-73).
Quand on ne rajoute qu'une seule fois du TPA, son action s'épuise au bout de 72 h, la
: prolifération reprend et à ce moment là, les corps PML se dissocient, s'éclatent et . deviennent des speckles laissant ainsi les protéines assurer la transcription, prolifération etc.. LIV21 n'est plus localisé dans le noyau car il est alors rephosphorylé par PKCε et reste ainsi localisé dans le cytoplasme.
EXEMPLE 7 : Etude de l'expression de LIV21 dans les biopsies de cancer du sein et de cancer de peau
Pour déterminer si les observations obtenues précédemment sont applicables aux tissus humains, un grand nombre de biopsies de cancer de peau obtenues de patients ont été étudié par réaction d'immunohistochimie avec des anticorps spécifiques de LIV21. La détermination immunohistochimique de l'expression de la protéine LIV21 a porté sur 60 biopsies de patients (9 patients ayant une biopsie de tissu normal versus une biopsie de tissu cancéreux), les autres biopsies correspondant à des cancers plus ou moins avancés et pour certains métastatiques. (Cf. Lame superbiochips Laboratories, Séoul, Corée). Par ailleurs quelques lames paraffinées de patients atteints de cancer de vessie, de sein ont aussi étaient étudiées.
Protocole d'analyse par Immunocytochimie :
Déparaffiner les lames
Réhydrater les tissus
Saturer les sites non spécifiques et perméabiliser les membranes Ajouter l'anticorps en chambre humide Révéler Fanticorps Déparaffiner les lames sous hotte
Deux bains successifs de toluène (rectapur Prolabo) 2x30' ou 2x20min ; puis déshydrater les tissus du rectapur alcool à 100% 15 min ; puis rectapur éthanol à 95% pendant 10 min ; puis rectapur 70% pendant encore lOmn. Décongeler l' anticorps pendant le même temps.
Réhydrater les tissus
Doucement dans du PBS additionné de 10% de sérum de veau foetal et 0,1% de Triton.
Saturer les sites non spécifiques (par exemple avec de l'ovalbumine) et perméabiliser les membranes. Réhydrater pendant une heure.
Déposer un ml de ce « PBS » par coupe afin de recouvrir la lame sans qu'elle sèche à aucun moment (quand il s'agit de lame avec des cellules et non pas des tissus, une demi heure suffit).
Mettre la vitre et le couvercle en inox et de l'eau en contrebas pour créer une chambre humide.
Ajouter l'anticorps en chambre humide.
Diluer au 200ème le sérum du lapin dans 4 ml de PBS triton pour continuer à perméabiliser les membranes et SVF.
Mettre ImI sur chaque lame et éviter la lumière et l'évaporation. Laisser toute la nuit ou au minimum trois heures.
Puis rincer au PBS normal IX PH 7, faire deux lavages de 5 à 10 mn pour qu'il ne reste aucune trace du premier anticorps.
Pendant qu'on prépare la sonde Alexa 488 verte (au froid à 4° à l'abri de la lumière) au
250e donc 10 μlitre dans 2,5ml de PBS avec toujours 10%SVF et 0 ,1% Triton, Reposer les lames sur la plaque. Recouvrir la coupe avec 2,5ml pour garder une chambre humide pendant une heure puis lavage au PBS IX PH 7.
Lavage au Iodure de Propidium à 0,5 microgramme par microlitre à diluer à 20 microgramme par ml puis encore au 50e mais cette fois, dilué dans du PBS seul IX ( 50 microlitre pour 2,5 ml de PBS). Egoutter en les sortant du PBS puis 2,5 ml de iodure de propidium reparti sur les quatre lames pendant une minute puis deux rinçage au PBS simple. Montage des lames au Moviol avant lecture. La totalité des résultats est résumée dans le Tableau 1, ci dessous.
Tableau 1 : Expression de la protéine LIV21 déterminée par immunohistochimie dans 50 bio sies de cancer de eau et 9 bio sies de tissus sains.
Pour exemple :
Figure 25: Résultats : image 43 : cancer peu différentié ; Image 58 : tissu sain issu du même sujet atteint d'un cancer ; Image 40 : carcinome métastatique 10 cm et image 17 : carcinome métastatique de 3,5 cm.
La Figure 26 est comme la Figure 25 un deuxième exemple de localisation nucléaire de LIV21 dans le tissu contrôle et sain (n°52) du sujet malade n°7 d'un carcinome de cellules squameuses de pharynx (modérément différentié T4N0M0). La Figure 27 est un échantillon de cancer avancé de la vessie sur cystectomie (carcinome urothélial grade III infiltrant le chorion et la musculeuse) versus tissu sain de vessie du même patient avec un contrôle interne (PI) : sérum préimmun PI avant que le lapin ne soit immunisé contre LIV21 marquage des noyaux au iodure de propidium.
La figure 28 est un échantillon de cancer du sein permettant de mettre en évidence le marquage cyplasmique de l'anticorps LFV21 dans les cellules cancéreuses. Ces résultats montrent que la localisation cytoplasmique de LIV21 est un indicateur de l'agressivité et du potentiel métastatique du cancer. La détection de l'expression de LIV21 indique la présence de cellules cancéreuses invasives, agressives et métastatiques. Ces résultats montrent également que la localisation nucléaire de LIV21 est un indicateur de cellules quiescentes saines soit de tissus bien différentiés.
EXEMPLE 8 : Interaction physique de LIV21 avec les protéines de la famille E2F Des expériences de co-immunoprécipitations réalisées à l'aide d'anticorps anti-LIV21, anti-E2Fl et anti-E2F4 ont permis de mettre en évidence que LIV21 s'associe à E2F4.
Les membres de la famille E2F sont des facteurs de transcription dont le rôle a largement été décrit dans la littérature comme étant des molécules-clés dans le contrôle positif ou négatif du cycle cellulaire (Slansky JE et Farnham PJ 1996 ; Helin K 1998 et Yamasaki L. 1998), de par leur association avec la protéine pRb (WuCL, Zukerberg LR, Lees JA 1995) ou les protéines poches. E2F1, contrôle positivement le cycle cellulaire en transactivant le promoteur des gènes responsables de la prolifération cellulaire (ADN polymérase alpha, thymidine kinase, DHFR, etc.), tandis qu'E2F4 est décrit comme un des membres de la famille des EFs contrôlant négativement le cycle. De plus, il a été montré une forte expression d'E2Fl dans les tissus mammaires embryonnaires (Espanel X, Gillet G 1998), tandis qu'elle n'est plus exprimée dans les tissus mammaires post- mitotiques au profit d'une forte augmentation de l'expression d'E2F4 (Kastner A Brun G 1998).
L'identification d'antigènes a été faites dans des lysats cellulaires par immunoprécipitation. L'analyse de l'interaction physique de différentes protéines associées à E2F4 et E2F1 a été mise en évidence par co-immunoprécipitation de complexes protéiques. L'étude du complexe par μ MACS PROTEIN à MICROBEADS ( MILTENYIBIOTEC). Par ajout de lysats de S Aureus, les protéines A interagissent avec la partie Fc des anticorps spécifiques et les immuns complexes deviennent insolubles, on les récupère donc par centrifugation. Après rupture des liaisons (chauffage) entre AG AC et membranes riches en protéines A, on a réalisé un western blot. Ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 semble jouer un rôle important dans l'établissement de la quiescence des cellules.
EXEMPLE 9 : Interaction fonctionnelle de LIV21 avec les protéines de la famille E2F. II a été mis en évidence que le blocage de l'expression de la protéine LF/21 était corrélé à une diminution de l'expression d'E2F4 et à une augmentation de l'expression d'E2Fl. Parallèlement, l'aspect fonctionnel de l'augmentation d'E2Fl a été vérifié par l'étude de la transcription de deux de ses gènes cibles, la DHFR et la ADN polymérase α.
En conclusion, ces résultats suggèrent que le complexe LIV21/E2F4 agit comme un complexe inhibiteur de l'expression du gène E2F1. Ce complexe pourrait correspondre à un nouveau point de contrôle dans l'arrêt de prolifération cellulaire.
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Claims

REVENDICATIONS
1- Méthode pour la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient, comprenant la détection du produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau et/ou le cytoplasme des cellules dans un échantillon de cellules dans l'échantillon biologique dudit patient, une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme étant indicative de la présence de cellules cancéreuses et une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le noyau étant indicative de la présence de cellules non-cancéreuses.
2- Méthode selon la revendication 1, dans laquelle une localisation dudit produit de l'expression du gène LIV21 dans le cytoplasme est indicative de la présence de cellules cancéreuses invasives et/ou métastatiques.
3- Méthode selon la revendication 1 ou 2, comprenant en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4.
4- Méthode selon la revendication 3, dans laquelle au moins un des rapports LIV21 / PKCε, LIV21 / E2F4 et LTV21 / E2F1 est déterminé.
5- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, ρ300, Rb, PML, plO7, pl30 de la famille des pockets protéines. 6- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre la détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, et CAFl.
7- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le produit d'expression des gènes est détecté au niveau de la protéine. 8- Méthode selon la revendication 7, dans laquelle la protéine est détectée à l'aide d'un anticorps spécifique.
9- Méthode selon la revendication 8, dans laquelle la protéine est détectée par une analyse Western blot, par immunohistochimie, par immunocytochimie, par immunoradiographie ou par marquage à la péroxydase.
10- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la détection des produits d'expression des gènes est faite à l'aide d'une puce à protéine.
11- Méthode- selon l'une quelconque des revendications 3-10, dans laquelle une augmentation significative de PKCε est indicative de la présence de cellules cancéreuses.
12- Méthode selon l'une quelconque des revendications 3-10, dans laquelle l'association de LIV21 avec la protéine E2F4 est détectée, une diminution de cette association étant indicative de la présence de cellules cancéreuses.
13- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour la détection de cancer métastasé, le suivi thérapeutique et/ou les récidives de traitement.
14- Méthode selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle le produit de l'expression du gène LIV21 est un polypeptide présentant un poids moléculaire apparent d'environ 50-51 kD par analyse en Western Blot et d'environ 60 kD lorsqu'il est sumoylé et/ou un polypeptide présentant un point isoélectrique de 5,6 dans sa forme de 50-51 kD et/ou un polypeptide caractérisé par un des chromatogrammes des Figures 3-6 et/ou un polypeptide comprenant une séquence peptidique sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55 ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci. 15- Méthode selon la revendication 8, dans laquelle l'anticorps se lie spécifiquement à un polypeptide comprenant une séquence peptidiqùe sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1- 55, de préférence parmi SEQ ID NOs: 1-5.
16- Méthode selon la revendication 15, dans laquelle l'anticorps est un sérum anti- LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec un polypeptide comprenant une séquence peptidiqùe sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs: 1-5.
17- Polypeptide isolé humain caractérisé en ce que le polypeptide présente un poids moléculaire apparent d'environ 50-51 kD par analyse en Western Blot et d'environ 60 kD lorsqu'il est sumoylé et/ou présente un point isoélectrique de 5,6 dans sa forme de 50-51 kD et/ou est caractérisé par un des chromatogrammes des Figures 3-6 et/ou comprend une séquence peptidiqùe sélectionnée parmi SEQ ID Nos 1-55, de préférence parmi SEQ ID NOs: 1-5, ou une séquence présentant 70, 80 ou 90 % d'identité avec celles-ci.
18- Anticorps qui se lie spécifiquement à un polypeptide selon la revendication 17.
19- Sérum anti-LIV21 fabriqué en immunisant un animal avec le polypeptide selon la revendication 17.
20- Kit permettant la détection de cellules cancéreuses dans un échantillon biologique d'un patient comprenant un ou des éléments sélectionné(s) parmi le groupe consistant en un anticorps selon la revendication 18 et un sérum selon la revendication 19.
21- Kit selon la revendication 20, comprenant en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène sélectionné parmi le groupe consistant en le gène de la protéine kinase C epsilon (PKCε), le gène E2F1 et le gène E2F4.
22- Kit selon la revendication 20 ou 21, comprenant en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, plO7, pl30 de la famille des pockets protéines.
23- Kit selon la revendication 20 à 22, comprenant en outre des moyens de détection du produit de l'expression d'un gène sélectionné parmi le groupe consistant en NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, et CAFl.
24- Méthode selon l'une des revendications 1 à 16, dans laquelle le cancer est sélectionné parmi les cancers du sein, de la vessie, de l'ovaire, du poumon, de la peau, de la prostate, du colon, du foie, un sarcome, une leucémie et le glioblastome.
25- Utilisation d'un anticorps selon la revendication 18, ou d'un sérum selon la revendication 19 pour le diagnostic du cancer.
26- Puce diagnostic comprenant un moyen de détection du produit de l'expression du gène LIV21.
27- Puce diagnostic selon la revendication 26, comprenant un moyen de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en RBP2, E2F4, E2F1, SUMO, HDACl, cycE/cdk2 ,cdkl, CREBl, p300, Rb, PML, plO7, pi 30 de la famille des pockets protéines.
28- Puce diagnostic selon la revendication 26 ou 27, comprenant un moyen de détection du produit de l'expression d'au moins un gène sélectionné parmi le groupe consistant en NFkB, cdc2A, mdm2, p21, p53, p65, Ki67, et CAFl .
29- Composition pharmaceutique comprenant un inhibiteur de la protéine PKCε.
30- Utilisation d'une composition selon la revendication 29 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement du cancer. 31- Composition pharmaceutique comprenant un activateur de la protéine PKCε ou un vecteur d'expression codant pour la protéine PKCε.
32- Utilisation d'une composition selon la revendication 31 pour la préparation d'un médicament destiné au traitement d'une maladie neurodégénérative.
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