JPH10503365A - チロシンリン酸化ｃｒｋｌタンパク質を発現する癌の診断および処置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞（例えば、フィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を有する細胞）に起因する癌の診断のための方法およびキットに関する。このような癌には、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）が挙げられ、リン酸化ＣＲＫＬタンパク質のレベルの上昇の検出により、またはＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質、遺伝子コピー若しくはｍＲＮＡ発現の上昇により、診断する。本発明はまたそのような癌を処置する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する癌の診断および処置 Ｉ．技術分野 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞（例えば、フ ィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を有する細胞）に起因する癌の診断のための方法 およびキットに関する。このような癌には、慢性骨髄性白血病（chronic myelog enous leukemia: ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblasti c leukemia: ＡＬＬ）が挙げられ、リン酸化ＣＲＫＬタンパク質若しくはリン酸 化ＣＲＫＬ結合タンパク質のレベルの上昇の検出により、またはＣＲＫＬ若しく はＣＲＫＬ結合タンパク質、遺伝子コピー若しくはｍＲＮＡ発現の上昇により、 診断する。本発明はまた、そのような癌の処置方法に関する。さらに、本発明は 、白血病研究用の動物モデルに関する。 II．発明の背景 慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）およびＰｈ陽性急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ ）は、特定の染色体の転座、すなわち、ｔ（９；２２）がフィラデルフィア（Ｐ ｈ）染色体の形成に至ること、によって特徴づけられる。第９染色体のＡＢＬプ ロトオンコジーンは、この転座によって第２２染色体のＢＣＲ遺伝子に並列する 。このキメラＢＣＲ／ＡＢＬ遺伝子は、Ｐ２１０またはＰ１９０融合タンパク質 を産生する（１〜３、２９、３０に概説）。このＡＢＬタンパク質は、非レセプ タータイプのチロシン特異的プロテインキナーゼであり、そのチロシンキナーゼ 活性は、ＢＣＲ部分の付着の結果、ＢＣＲ／ＡＢＬでは調節解除（deregulate） される（３１、３２）。特に、ＡＢＬはＰ１４５非レセプタータンパク質チロシ ンキナーゼ（ＰＴＫ）をコードし、いくつかの他の機能的ドメイン （ＳＨ３、ＳＨ２およびＦ−アクチン結合ドメインを含む）を有する（４に概説 ）。同様に、このＢＣＲタンパク質は、多機能性である：ＢＣＲエクソン−１に よってコードされるドメインはセリン／スレオニンキナーゼ活性を有し、二量体 化することができて、非ホスホチロシン依存性の様式でＡＢＬのＳＨ２ドメイン に結合する（１、５）；この分子の中央部分にはＧＴＰ交換因子との相同性があ る（６）；そしてそのカルボキシ末端には、小さなｐ２１^ras様分子（ｐ２１^ras を含む）に対するＧＴＰアーゼ活性化タンパク質（ＧＡＰ）活性がある（７）。 したがって、ＢＣＲもＡＢＬもどちらもシグナル変換に関連している。このＢＣ Ｒ／ＡＢＬ ｐ２１０はＢＣＲのエクソン−１がコードするドメイン、交換因子 相同ドメイン、および大部分のＡＢＬタンパク質を含み、そしてＢＣＲ／ＡＢＬ の腫瘍形成性効果は、正常なＢＣＲおよび／またはＡＢＬシグナル伝達経路の混 乱に関係しているに違いない。 ＥＧＦレセプター、すなわちレセプタータンパク質チロシンキナーゼ、の関与 するシグナル伝達カスケードの側面が、最近解明されてきた。リガンド結合に関 しては、このＥＧＦレセブターは、チロシン上で自動的にリン酸化され、それに よってＧＲＢ２の結合部位を提供する。ＧＲＢ２は、２つのＳＨ３ドメインに近 接された１つのＳＨ２ドメインからなり、そのＳＨ２ドメインを介してチロシン リン酸化タンパク質に会合し、そしてそのＳＨ３ドメインを介してＲＡＳグアニ ジンヌクレオチド交換因子であるｍＳＯＳ１に会合している（８、および９に概 説）。したがって、原形質膜に加えると、ｍＳＯＳ１はｐ２１^rasを活性化でき る。最近、ＧＲＢ２もまたＢＣＲ／ＡＢＬに、Ｙ¹⁷⁷すなわちＢＣＲのエクソン −１によってコードされ、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現細胞において唯一リン酸化されて いるチロシン残基、を介して結合することが示された（１０、 １１）。 実験動物モデルの使用を通じて、このＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質が白血病を引 き起こす能力があることが示された（３０−３５）。現在、この白血病が起きる メカニズムは大部分未知である。ＢＣＲ／ＡＢＬは、数が増大しつつある多くの タンパク質に関連して見いだされてきた。ｐｈ−Ｐ５３と呼ばれるタンパク質は 、ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２においてＢＣＲ／ＡＢＬと複合体を形成する（３６−３ ７）。このＢＣＲタンパク質自身はリン酸化され、そしてＫ５６２およびトラン スフェクションされたＣＯＳ細胞内でＢＣＲ／ＡＢＬと複合体を形成している（ ３７−３９）。チロシンリン酸化ｒａｓＧＡＰ、その関連するタンパク質である ｐ１９０およびｐ６２、ならびにアダプタータンパク質ＧＲＢ−２およびＳＨＣ もまた、ＢＣＲ／ＡＢＬと一緒に同時に沈殿する（１０、１１、４０、４１）。 ＧＲＢ−２は、ｐ２１^rasヌクレオチド交換因子ＳＯＳとそのＳＨ３ドメインを 介して構造的に関連しており、したがって、ＢＣＲ／ＡＢＬは、ｐ２１^ras活性 をアップレギュレートすることにより正常な細胞性シグナル伝達に介在し得る（ １０、４３）。造血細胞系(lineage)特異的チロシンキナーゼであるｐ９３^c-fes の増大したチロシンリン酸化も報告されている（４４）。 いくつかの他の「アダプタータンパク質」が今日までに同定されている（１２ ）。ＣＲＫは最初、ガン遺伝子ｖ−ｃｒｋとして発見された（１３）。ＣＲＫは 、アミノ末端のＳＨ２ドメインと２つの直列のＳＨ３ドメインからなる。カルボ キシ末端のＳＨ３ドメインの欠失は、細胞性ホスホチロシンの増加を伴う形質転 換につながる（１４、１５、２８）。遺伝子ＣＲＫＬは、ＣＲＫに全体で６０％ の相同性を有するタンパク質をコードし、最近単離された（１６、２８）。この ＣＲＫＬ遺伝子は、その 位置がヒトの第２２染色体上のＢＣＲ遺伝子に対してセントロメリックであるこ とにより思いがけず単離された（２６）。ＣＲＫＬは、ＳＨ２ドメインと２つの 直列のＳＨ３ドメインのみからなり、触媒ドメインはない（１６）。 現在、ＣＭＬ患者およびＡＬＬ患者は従来の治療法および放射線照射により化 学療法的に処置されている。このような処置は、周知の副作用に悩まされ、しば しば効果が限られる。これらの白血病に対して有効な他の処置は知られていない 。したがって、このようなガンを処置するための他の組成物および方法が探索さ れている。 当該分野には、白血病を処置するかまたはそれがヒト患者に与える影響を緩和 するための効果的な治療用組成物および方法、ならびに可能性のある治療薬に対 する白血病細胞の応答を研究するために有用な動物モデルの必要性が残っている 。 III．発明の要旨 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質若しくはチロシンリン酸化Ｃ ＲＫＬ結合タンパク質を発現する細胞に起因する癌を診断するための方法および キットに関する。このような細胞にはフィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を有する 細胞が挙げられ、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞および急性リンパ芽球性白血 病（ＡＬＬ）細胞が挙げられる。診断は、増加したレベルのリン酸化ＣＲＫＬタ ンパク質若しくはリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質を検出することにより、また は、増加したＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質、遺伝子コピー若しくは ｍＲＮＡ発現の検出により達成される。本発明はまた、そのような癌を処置する 方法およびそのような処置のための組成物に関する。 本発明の１つの局面は、増加したレベルのＣＲＫＬを発現しているこ とが疑われる細胞内のリン酸化ＣＲＫＬタンパク質および非リン酸化ＣＲＫＬタ ンパク質の量を測定し、非リン酸化ＣＲＫＬに対するリン酸化ＣＲＫＬの割合を 決定することを包含する。この方法では、増加したレベルのＣＲＫＬを発現して いることが疑われる細胞のみがテストされる場合、バックグラウンドを越えるど のような割合も癌の指標とみなすことができる。通常、非リン酸化ＣＲＫＬに対 するリン酸化ＣＲＫＬの割合が約５％若しくはそれを越える場合は癌の存在に関 連する。正常細胞をコントロールとして用いる場合、非リン酸化ＣＲＫＬに対す るリン酸化ＣＲＫＬの割合は、癌の存在に関連する細胞では上昇しているが、正 常細胞では上昇しない。正常細胞は別の個体から得てもよいし、あるいは試験さ れる個体から得た非新生物細胞とわかっている細胞であってもよい。 本発明のもう１つの局面は、哺乳動物、特にヒトにおいてチロシンリン酸化Ｃ ＲＫＬタンパク質を発現している細胞に起因する癌の処置を包含する。 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現している細胞に起因す る癌を診断する方法を提供する。本発明の方法は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタ ンパク質を発現していることが疑われる細胞のサンプルを得る工程、そして正常 コントロール細胞に対するチロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質のパーセント増 加を測定する工程を包含する。コントロールに対するリン酸化ＣＲＫＬタンパク 質の発現の増加は癌の存在に関連する。 本発明の方法は、フィラデルフィア染色体に起因する癌の診断に特に有用であ る。そのような癌には慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性白血 病（ＡＬＬ）が挙げられる。 種々の方法を用いてチロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を検出することがで きる。本発明の１つの実施態様によれば、このＣＲＫＬタンパク質は免疫学的に 、例えば、抗ホスホチロシン抗体を用いて検出される。ＣＲＫＬタンパク質に特 異的なこの抗体の結合は、比色定量法およびラジオイムノアッセイを含む種々の 方法を用いて検出することができる。 本発明のもう１つの実施態様は、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現細胞内で発現されている ことにより特徴づけられる、単離された１１０〜約１３０kDaのタンパク質であ る；このタンパク質は、種々の程度にリン酸化（チロシンリン酸化を含む）され ており；そしてＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２融合タンパク質に特異的に結合する。 本発明のもう１つの実施態様は、ＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬフラグメントに関 連した特定の１１０−１３０kDaチロシンリン酸化タンパク質の存在を検出する ことによって癌を診断する方法である。このタンパク質は、正常な細胞では単離 されておらず、したがって癌性細胞の特異的マーカーとして有用である。 本発明はまた、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質、および／または特定の １１０−１３０kDaチロシンリン酸化ＣＲＫＬ関連タンパク質を発現している細 胞に起因する癌を診断するためのキットを提供する。このようなキットはチロシ ンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質に特異的に結合し得る試薬を含む。もう１つの実 施態様においては、このキットは、１１０−１３０kDaチロシンリン酸化ＣＲＫ Ｌ関連タンパク質に特異的に結合し得る試薬を含む。次いで、これらの試薬のい ずれの結合も、この試薬がそれ自身検出可能なマーカーによってラベルされてい るか、検出可能なマーカーを含む第２の試薬と反応するかに応じて直接的に若し くは間接的に検出され得る。このキットはさらに、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタ ンパク質 または特定の１１０−１３０kDaタンパク質の存在を検出するためのアッセイに おいてその試薬を用いるための指示書およびこれらのタンパク質のいずれかの存 在と癌を相関させるための指示書を含む。他の形態のキットはさらに、このＣＲ ＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質を検出するために必要なアッセ イを行うための緩衝液試薬、および反応容器を含むことができる。キットの中に 存在してもよいもう１つの成分は、非新生物細胞から入手したＣＲＫＬタンパク 質を含むコントロール試薬である。このコントロール試薬は、チロシンリン酸化 ＣＲＫＬタンパク質のパーセント増加を測定するための対照標準として用いるこ とができる。チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質への特異的結合のための試薬 は、好ましくは、抗体を含む。ＣＲＫＬ特異的タンパク質を検出することができ る二次抗体もまたこのキットの成分であり得る。この二次抗体は、酵素、ラジオ アイソトープ、蛍光物質若しくは生物発光物質のような検出可能なマーカーでラ ベルすることができる。本発明の好ましい実施態様においては、この酵素は西洋 ワサビペルオキシダーゼである。本発明のキットは特にウェスタンブロット分析 と一緒に用いるのに適合させるのに好都合である。 本発明のもう１つの実施態様は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質若しく は特定の１１０−１３０kDaタンパク質を発現する細胞に起因する癌を有する個 体を処置する方法である。本発明の方法は、ＣＲＫＬタンパク質若しくは上記１ １０−１３０ＣＲＫＬ結合タンパク質の合成若しくは活性を阻害する治療的に効 果量の少なくとも１つの組成物を投与することを包含する。これらのタンパク質 のいずれかの合成の阻害は、転写、翻訳、若しくはタンパク質活性の阻害を含む 種々の方法により達成することができる。転写の阻害は、オリゴヌクレオチドの 使用による三重らせんの 形成を引き起こすことにより達成する事ができる。そのような方法には相補的ア ンチセンスＲＮＡ若しくはＤＮＡによりｍＲＮＡ翻訳を阻害することが挙げられ る。リボザイムと結合したアンチセンスＲＮＡによるｍＲＮＡの破壊もまたＣＲ ＫＬ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質の合成を妨げるために用いることができる 。ＣＲＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質の合成はまた、重要な調 節配列を表すｍＲＮＡの一部に類似したＲＮＡ配列を用いて、ｍＲＮＡに干渉す ることにより阻害することができる。 ＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質の合成の阻害に有用なＲＮＡ若しく はＤＮＡは、ガン細胞に感染し得るベクター（例えばウイルスベクター）による 感染を含む種々の方法を用いるか、またはリポソーム、脂質ベースの担体および 脂質複合体を含む１以上のタイプの担体の使用を介した処置によって個体に投与 することができる。 ＣＲＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質の新生物活性を阻害する もう１つの方法は、タンパク質それ自体の作用を阻害することである。したがっ て、本発明は、ＣＲＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質のリン酸化 を阻害することにより個体を処置する方法を包含する。リン酸化の阻害は、タン パク質の酵素によるリン酸化を阻害する方法、若しくはリン酸化反応においてそ のタンパク質と競合する方法により達成することができる。本発明の１つの実施 態様において、リン酸化に関してＣＲＫＬタンパク質と競合するアミノ酸配列を 含むポリペプチドが個体に投与される。もう１つの実施態様においては、リン酸 化に関して１１０−１３０ＣＲＫＬ結合タンパク質と競合するアミノ酸配列を用 いることができる。好ましい実施態様においては、これらのポリペプチドはＣＲ ＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質のフラグメントであ る。特に好ましい実施態様においては、このフラグメントは、ＣＲＫＬタンパク 質の１９３−２１０番目のアミノ酸の領域を含む。理論に拘束されることなく、 この領域の２つのチロシン残基の１つ以上が特にリン酸化ＣＲＫＬタンパク質の 新生物活性に関連していると考えられている。特に、配列ＡＹＡ内のチロシンの リン酸化が、とりわけその新生物活性に関連しているようである。 本発明はまた、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現している細胞に起 因する癌を有する個体を処置するための医薬組成物を包含する。このような組成 物は、ＣＲＫＬタンパク質若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質の活性の合成を阻害 する少なくとも１つの成分、および薬学的に受容可能な担体を含む。このような 担体は、生理学的に受容可能な緩衝液、例えば、生理食塩水若しくはリン酸緩衝 生理食塩水を含むことができる。この医薬組成物は、ＣＲＫＬタンパク質、ＣＲ ＫＬ結合タンパク質の合成および／またはそれらの活性を阻害する１以上の成分 を含むことができる。そのような成分は、リン酸化ＣＲＫＬタンパク質に起因す る癌を有するヒトを処置する方法にとって有用な上記の成分と同じであり得る。 本発明のもう１つの局面は、単離されたマウスＣＲＫＬタンパク質、マウスＣ ＲＫＬタンパク質をコードする核酸配列およびこのＣＲＫＬ遺伝子を含む細胞を 包含する癌の細胞モデルである。 前述の一般的な記載および以下の詳細な説明はどちらも例示および説明にすぎ ず、請求項に係る発明を制限しないことが理解される。付属の図面は、明細書に 組み込まれて明細書の一部を構成し、本発明の実施態様をその説明と一緒に例証 し、本発明の原理を説明するものである。 IV．図面の簡単な説明 図１．ＣＲＫＬ発現のノーザンブロット分析。ヒトＲＮＡは、細胞系 Ａ４９８（腎臓腫瘍）由来でレーン１；Ｋ５６２（骨髄性白血病）がレーン２； ＣＨＡＧＯ（気管支原性腫瘍）がレーン３；Ａ１７２膠芽腫（glioblastoma）が レーン４；そしてＨｅｐＧ２（肝腫瘍）がレーン５である。パネルＡは、全コー ド領域を含むヒトＣＲＫＬのｃＤＮＡとハイブリダイズさせたものである。パネ ルＢではエチジウムで染色したゲルをローディングコントロールとして供した。 図２．ＣＲＫＬタンパク質の同定。パネルＡは、ＣＲＫＬのセグメントを示し 、抗血清はこれに対して生じた。ＳＨ２ドメインとＳＨ３ドメインの相対的な位 置を示す。パネルＢは、ＣＲＫＬ発現のウエスタンブロット分析を示す。細胞抽 出物は、ヒト骨髄性白血病細胞系Ｋ５６２（Ｋ）；ヒト腎臓腫瘍細胞系Ａ４９８ （Ａ）；ＣＯＳ−１細胞（−）、およびＣＲＫＬでトランスフェクションしたＣ ＯＳ−１細胞（＋）の細胞抽出物を含む。４３kDaおよび２９kDaの標準物の位置 を左に示す。矢印は、Ｐ３８タンパク質の群の位置を示す。用いた抗血清は各パ ネルの下部に示す。 図３．ＣＲＫＬを、ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬを発現している細胞内のチロ シンでリン酸化する。パネルＡは、ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２の分析を示す。免疫沈 降に用いた抗血清をレーンの上部に示し、ウエスタンブロット分析に用いた抗血 清を各パネルの下部に示す。レーン１は、全細胞抽出物を含む。ＮＲＳは、関連 のないウサギ血清である。５０kDa付近の顕著なバンドは免疫グロブリンである 。パネルＢ。ＣＯＳ−１細胞内へのＣＲＫＬ、ＢＣＲ／ＡＢＬおよびＡＢＬによ る同時トランスフェクションのウエスタンブロット分析。用いた抗血清を左に示 す。抽出物は、Ｋ５６２の抽出物（レーン１）およびＣＯＳ−１細胞の抽出物（ レーン２）；ならびにＣＲＫＬ、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０＋ＣＲＫＬ、 ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０、ＣＲＫＬ＋ＡＢＬ、およびＡＢＬによってトランス フェクションしたＣＯＳ−１細胞の抽出物（それぞれレーン３〜７）を含む。Ｂ ＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０、ＡＢＬ Ｐ１４５およびＣＲＫＬ Ｐ３８の位置を右 に示す。パネルＣ。Ｐ３８は、接近して移動する形態からなる。レーン１および ２は、それぞれＣＨ１５およびＣＨ１６を用いてＫ５６２抽出物をプローブした 。レーン３および４は、ＣＲＫＬ＋ＡＢＬおよびＣＲＫＬ単独でトランスフェク ションしたＣＯＳ−１細胞の抽出物をＣＨ１６でプローブした。レーン５および ６は、Ｋ５６２およびＣＲＫＬ＋ＡＢＬ抽出物（レーン２および３）をα−ｐ− Ｔｙｒ（ＯＳＩ）体で再プローブした。 図４．トランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞からＣＨ１５およびＣＨ１６ で免疫沈降したもののウエスタンブロット分析。Ａ−Ｃ。ＣＲＫＬ抗血清による ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬの同時免疫沈降。左に示した抗血清による同じウエ スタンブロットを続いて用いた。用いたトランスフェクションされたＣＯＳ−１ 細胞抽出物を、図の最上部に示す。レーン１、３、５および７は、全細胞抽出物 を含む；レーン２、４、６および８はＣＨ１５による免疫沈降物；レーン９は、 ＣＨ１６による免疫沈降物；レーン１０は、ＣＨ１５免疫前（pre-immune）血清 による免疫沈降物を含む（パネルＡおよびＢのみ）。免疫沈降物を含むレーンは ５０kDa付近の顕著な免疫グロブリンバンドによって特徴づけられる。Ｐ１４５ 、Ｐ２１０およびＰ３８の位置を右に示す。Ｄ。チロシンキナーゼＦＥＲは、Ｃ ＲＫＬによって同時免疫沈降しない。ＣＲＫＬ＋ＦＥＲによって同時トランスフ ェクションしたＣＯＳ−１細胞の抽出物を、直接（左のレーン）若しくはＣＨ１ ５による免疫沈降の後（右のレーン）に負荷した。ウエスタンブロットに用いた 抗血清を各パネルの下部に示す。Ｐ９４^fer およびｐ３８^crklは示したとおりである。 図５．ＣＲＫＬの細胞タンパク質への結合。Ａ。ＧＳＴ−ＣＲＫＬを用いるウ エスタンブロット結合アッセイ。ＡＢＬでトランスフェクションしたＣＯＳ−１ 細胞の抽出物を含むウエスタンブロットを、各レーンの下部に示したように、Ｇ ＳＴ、ＧＳＴ−ＣＲＫＬ融合タンパク質、またはα−ＡＢＬ若しくはα−ＳＯＳ −１抗体とともにインキュベーションした。Ｂ。Ｋ５６２抽出物からのＣＲＫＬ およびＰ１７０^sosの同時免疫沈降。レーン１は全細胞抽出物を含む。レーン２ および３は、指示した免疫沈降物を含む。メンブランの上部はα−ＳＯＳ抗体と ともに、下部はＣＨ１６抗血清とともにインキュベーションした。 図６．ＣＭＬ患者サンプルにおけるＰ２１０発現レベルのウエスタンブロット 分析。サンプルの識別番号をパネルの上に示す。ポジティブコントロールおよび ネガティブコントロールは、それぞれ細胞系Ｋ５６２およびヒト骨髄細胞系ＫＧ −１を含む。このブロットは、α−ＡＢＬ抗体を用いてプローブした。ＢＣＲ／ ＡＢＬ Ｐ２１０およびＡＢＬ Ｐ１４５の位置を示す。 図７．ＣＲＫＬは、Ｐ２１０を発現しているＣＭＬ患者サンプルにおいて特異 的にチロシンリン酸化される。上のパネル：ＣＲＫＬ抗血清ＣＨ１６を用いるＣ ＲＫＬタンパク質の免疫検出。ＣＲＫＬタンパク質の位置を右に示す。白い矢印 は、非リン酸化形態を示し、黒い矢印は、チロシンリン酸化形態を示す。下のパ ネル：α−ｐ−Ｔｙｒ抗体（ＯＳＩ）を用いるチロシンリン酸化ＣＲＫＬの検出 。４３kDaのマーカーの位置を左に示す。リン酸化された形態のＣＲＫＬの位置 を右に示す。サンプルは、緩解ＣＭＬサンプル２２１６および２２２５、並びに 慢性期のＣＭＬサンプル２２２２、２２３０、２２３４、および２２４０（表Ｉ も参照）を含 む。 図８．ＢＣＲ／ＡＢＬの存在は、ＣＲＫＬリン酸化と相関する。パネルＡ、Ｐ ｈ陰性ＡＬＬ患者およびＰｈ陽性ＡＬＬ患者、ならびに２人のＣＭＬ急性転化患 者のサンプル。パネルＢ、正常コントロール（Ｓ１５）、ＡＭＬ（Ｓ７２）、散 在性大細胞型リンパ腫（diffuselarge cell lymphoma）（Ｓ７３、Ｓ７４）、骨 髄増殖性症候群（Ｓ９０）、ダウン症（Ｓ２３２）、ＣＬＬ（Ｓ２４６）および ＣＭＭＬ（Ｓ３３６）を含むＰｈ陰性患者の末梢血液サンプル。ブロットは、Ｃ ＲＫＬ抗血清ＣＨ１６を用いてプローブした。 図９．ＢＣＲ／ＡＢＬを発現している細胞においてＣＲＫＬに結合しているタ ンパク質の分析。免疫学的プローブを各パネルの下に示す。Ｋ５６２、Ｐｈ−Ｐ ＢＣ、Ｐｈ⁺ＰＢＣ、３Ｔ３および３Ｔ３−Ｆ細胞の同一の細胞抽出物を各パネ ルに負荷した。大きな矢印は、活性なＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質を含む破砕物中 でＣＲＫＬ−ＳＨ２を用いて特異的に検出されるＰ１１０／１３０を示す。Ｋ５ ６２は、ＣＭＬ細胞系である；Ｐｈ−ＰＢＣは、Ｐｈ陰性患者の末梢血液細胞を 示す；Ｐｈ⁺ＰＢＣは、Ｐｈ陽性患者の末梢血液細胞を示す；３Ｔ３および３Ｔ ３−Ｆ細胞は、コントロール細胞およびＢＣＲ／ＡＢＬで形質転換されたＮＩＨ ３Ｔ３細胞を示す。 図１０．マウスＣＲＫＬｃＤＮＡのヌクレオチド配列と推定アミノ酸配列（Ａ ）およびヒトとマウスのタンパク質配列の比較（Ｂ）。ＳＨ２ドメインおよびＳ Ｈ３ドメインの位置を示す。 図１１．成体マウス組織におけるＣＲＫＬの発現。ウエスタンブロットは、抗 ＣＲＫＬ抗体（Ａ）若しくは抗ＣｒｋＩＩ抗体（Ｂ）のいずれかを用いてプロー ブした。組織は示したとおりである。各レーンには２０μg のタンパク質を含む。Ａにおいて、矢印は、チロシンリン酸化ｃｒｋｌタンパク 質（ＣＲＫＬ^p）および非チロシンリン酸化ｃｒｋｌタンパク質（ＣＲＫＬ）を 指している。同様に、リン酸化および非チロシンリン酸化ｃｒｋをパネルＢに示 す（それぞれＣＲＫ^pおよびＣＲＫ）。４３kDおよび２９kDの分子量マーカーの 位置は示したとおりである。 図１２．発生の間のＣＲＫＬ発現。試験したサンプルは、頭（Ｈ）、胴体（Ｔ ｒ）、全胚（Ｗ）、脚および尾部（Ｌ＋Ｔ）、胎盤（Ｐｌ）、肝臓（Ｌｉ）、肺 （Ｌｕ）、脳（Ｂｒ）、心臓（Ｈｅ）、腎臓（Ｋｉ）、および胸腺（Ｔｈ）を含 む。１レーンあたり２０μgの破砕物タンパク質を分析した。アフィニティー精 製した抗Ｃｒｋｌ ＣＨ−１６抗体（ten Hoeveら、１９９４ａ）を、イムノブ ロッティングに用いた；d.p.c.＝交尾後の日数。 図１３．ＢＣＲ／ＡＢＬトランスジェニックマウスの白血病組織におけるチロ シンリン酸化ＣＲＫＬの発現。ホスホチロシンを欠くＣＲＫＬタンパク質または チロシンでリン酸化されたＣＲＫＬタンパク質の位置をそれぞれＣＲＫＬおよび ＣＲＫＬ^pと表して表示する。分子量マーカーの位置を左に示す。（Ａ）ＢＣＲ ／ＡＢＬトランスジェニックマウスおよびコントロールの非トランスジェニック 脾臓の指定の組織から、および発生１２．５日目のマウス全胚［Ｅ１２．５］か ら全破砕物を調製した。破砕物タンパク質(１レーンあたり２０μg)を抗Ｃｒｋ ｌ抗体を用いたイムノブロッティングにより分析した（ｃｒｋ−Ｌ、Santa Cruz ）。（Ｂ）Ｋ５６２（ＣＭＬ細胞系）、正常な脾臓およびＰ２１０^Bcr/Ablトラ ンスジェニック脾臓、ならびにＥ１２．５初期胚の抽出物を抗ＣＲＫＬ抗体によ る免疫沈降を行った。結合したタンパク質を抗ホスホチロシン抗体を用いてプロ ーブしたウエスタンブロットで分析した。 Ｖ．発明の詳細な説明 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌 を診断および処置するための方法およびキットに関する。このような細胞は、フ ィラデルフィア（Ｐｈ）染色体を有する細胞を含み、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ ）細胞および急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）細胞を含む。診断は、増加した レベルのリン酸化ＣＲＫＬタンパク質の検出によって、または増加したＣＲＫＬ 遺伝子コピー若しくはｍＲＮＡの発現の検出によって達成される。もう１つの実 施態様においては、本発明は、単離された１１０−１３０タンパク質に関し、こ のタンパク質は、種々の程度にリン酸化されていてもよく、リン酸化されている 場合には、ガン細胞の検出可能なマーカーとして有用である。したがって、本発 明はまた、癌特異的１１０−１３０kDaチロシンリン酸化、ＣＲＫＬ関連タンパ ク質を発現している細胞に起因する癌を診断するための方法およびキットに関す る。本発明はまた、そのような癌の処置方法に関する。さらに別の実施態様にお いては、本発明は、ＣＲＫＬをコードするマウス核酸配列、マウスＣＲＫＬ遺伝 子から推定されるアミノ酸配列を有する単離されたタンパク質、およびＣＲＫＬ 遺伝子を表すトランスジェニック動物若しくはトランスフェクションされた細胞 を含む癌の細胞モデルに関する。 以下の実施例１は、ＣＲＫＬタンパク質産生物が、種々の細胞タイプで発現さ れている３８kDaタンパク質であることを示す。提示するデータは、Ｐ３８が、 ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬによってチロシンでリン酸化されていることを示し 、そしてＰ３８がインビボで、ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬの両方と複合体を形 成することを立証する。さらに、ＣＲＫＬは、ｍＳＯＳ１に結合することができ る。これらのデータは、ＣＲＫＬが、ＡＢＬを含むシグナル変換経路の一部であ るという証拠を提 供し、そしてＢＣＲ／ＡＢＬがそれによってその腫瘍形成効果を及ぼし得る１つ のメカニズムを示す。 本発明者らは、最近、アダプタータンパク質ＣＲＫＬが、ＡＢＬおよびＢＣＲ ／ＡＢＬよってリン酸化されること、およびＣＲＫＬが、ＡＢＬおよびＢＣＲ／ ＡＢＬを過剰に発現しているＣＯＳ−１細胞においてこれらと特定の複合体を形 成することができることを立証した。ＣＲＫＬがインビボでＢＣＲ／ＡＢＬの基 質として機能するであろうという仮説は、ＣＲＫＬが、ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２に おいて顕著にチロシンリン酸化されるという発見により強められた（４５）。こ のことは、ＣＲＫＬが、ＣＭＬにおいて活性化されたＢＣＲ／ＡＢＬ腫瘍タンパ ク質のシグナルを仲介することにある役割を果たし得ることを示唆する。インビ トロ技術および細胞系を用いることによってＢＣＲ／ＡＢＬのシグナル変換にす でに関わっている異なるタンパク質の数が増大しているので、実施例２に説明さ れる実験は、ＣＲＫＬがＣＭＬの発達に関与し得るかどうかを、より直接的な方 法で確立するために行われた。その実験において、データは、ＣＲＫＬは明らか に、ＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質を発現しているＣＭＬ患者およびＰｈ陽性ＡＬＬ 患者の末梢血液細胞中でチロシンリン酸化されているが、ＢＣＲ／ＡＢＬ陰性末 梢血液細胞ではリン酸化されていないことを立証する。ＣＲＫＬリン酸化のレベ ルはＢＣＲ／ＡＢＬ発現レベルとよく相関している。これらのデータは、ＣＲＫ Ｌのチロシンリン酸化が、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現の直接的な結果であることを立証 する。したがって、ＣＲＫＬのリン酸化は、Ｐｈ陽性白血病におけるＢＣＲ／Ａ ＢＬ活性の診断の指標として用いることができる。 本発明のもう１つの実施態様は、癌性細胞のマーカーとして有用な、単離され た癌特異的リン酸化１１０−１３０kDaタンパク質である。本発明 者らは、ＣＲＫＬが、この癌特異的な約１１０−１３０kDaのチロシンリン酸化 タンパク質と関連していることを発見した。同時免疫沈降に続いて抗ホスホチロ シン抗体を用いる免疫沈降物のウエスタンブロット分析を用いると、この１１０ −１３０kDaタンパク質がＣＲＫＬと複合体を形成した状態で検出される。この １１０−１３０kDaタンパク質は、強くリン酸化されておりブロードなバンドと して移動する。このことは、このタンパク質が１以上のチロシンリン酸化部位を 含むこと、およびこのタンパク質が種々の程度にリン酸化された状態で存在する ことを示唆する。本発明者らは、いかなる非癌性細胞においてもこのタンパク質 を検出していないが、ＢＣＲ／ＡＢＬによってトランスフェクションされたＣＯ Ｓ細胞、リンパ腫およびＢＣＲ／ＡＢＬ トランスジェニックマウスの骨髄、な らびにＣＭＬ患者の白血病細胞においてこのタンパク質を検出した。したがって 、本発明者らは、このタンパク質が癌性細胞の特異的なマーカーとして有用であ ると考える。 本発明のこの特異的ＣＲＫＬ結合タンパク質は、１）チロシンリン酸化され得 る；２）約１１０〜約１３０kDaの分子量を有する；および３）ＧＳＴ−ＣＲＫ Ｌ−ＳＨ２融合タンパク質に特異的に結合する。このタンパク質は、細胞破砕物 に存在する他のタンパク質から、ゲル電気泳動によって、またはＣＲＫＬタンパ ク質若しくはその部分（例えば、ＳＨ２領域）への特異的な吸着によって単離す ることができる。 このタンパク質は、当業者に公知の方法、例えば、Sambrookら（編）（1989） のMolecular Cloning A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Plain view，New York、およびAusbelら（編）のCurrent Protocols in Molecular Bio logy (1987)，John Wiley and Sons，New York，New Yorkに記載されたような方 法によりクローン化することができ る。簡潔に述べると、λｇｔ１１発現ライブラリーを当業者に公知の方法に従っ てｃＤＮＡを用いて作成することができる。次いで、このライブラリーを用いて 宿主細胞に感染させ、この細胞は、バクテリオファージにクローン化されたＤＮ Ａの発現を提供する。このタンパク質は、ファージの成長の間に発現され、次に 細胞を破砕して陽性クローンの同定のためニトロセルロースのようなメンブラン に移される。次いで、この陽性クローンを、リン酸化１１０−１３０タンパク質 に特異的な抗体により、あるいはＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２タンパク質を用いて メンブランをスクリーニングすることにより同定することができる。次に、同定 したクローンはプラーク精製により単離することができ、そして挿入したＤＮＡ を取り出して配列決定することができる。この癌特異的タンパク質をコードする ＤＮＡは、次に、種々の細菌系(例えば、特にE ．coli)、哺乳動物系、昆虫系（ 例えば、バキュロウイルスベクターを用いて）若しくは酵母発現系において発現 させることができる。これらの発現系は当業者に周知である。 本発明は、チロシンリン酸化ＣＲＫＬ若しくは癌特異的１１０−１３０kDa Ｃ ＲＫＬ関連タンパク質を発現する細胞に起因する癌（例えば、癌であるＣＭＬお よびＡＬＬ）の診断を、約４０kDaまたは１１０−１３０kDaのタンパク質を直接 測定することにより、可能にするという点で従来技術に勝る利点を示す。ＣＲＫ Ｌタンパク質若しくはこの１１０−１３０kDaのタンパク質を測定することは、 相対的に小さなＣＲＫＬタンパク質または１１０−１３０kDaタンパク質が比較 的安定でプロテアーゼ耐性であるため、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０またはＰ１９ ０融合タンパク質を測定することとは全く違って有利であり、相対的に大きく不 安定なＰ２１０またはＰ１９０融合タンパク質と全く対照的である。ＣＲＫＬの 核酸配列 およびアミノ酸配列は、ten Hoeveら、Oncogene，8:2469-2474(1993)に記載され 、それは本明細書中に参考として援用される。 リン酸化ＣＲＫＬを発現している細胞に起因する癌を診断する方法は、癌患者 若しくは癌が疑われる患者の細胞におけるリン酸化ＣＲＫＬの存在を検出するこ とに基づいている。約４０ｋＤＡのリン酸化ＣＲＫＬの存在は、３８ｋＤＡの非 リン酸化ＣＲＫＬと比較すると一般に癌の存在と関連している。特異的にＧＳＴ −ＣＲＫＬ−ＳＨ２タンパク質に結合するリン酸化１１０−１３０kDaタンパク 質の同定もまた、ガン細胞の存在を指示する。 本発明の第１の実施態様は、正常細胞には検出可能なチロシンリン酸化ＣＲＫ Ｌが全くあるいはほとんどない（一般に２〜４％未満）という本発明者らによる 発見に基づいている。したがって、本発明の第１の実施態様は、患者の細胞が上 昇したレベルのチロシンリン酸化ＣＲＫＬを有しているかどうかを決定すること により癌を診断することを含む。上昇したレベルのチロシンリン酸化ＣＲＫＬの 存在は、その患者に癌があることを示す。 本発明のこの実施態様においては、細胞内の非リン酸化ＣＲＫＬおよびリン酸 化ＣＲＫＬを検出する適切な方法が用いられなければならない。細胞内のこれら のタンパク質を測定し得るいかなる方法も用いることができる。その例はウエス タンブロットまたはいかなるタイプであってもよい免疫アッセイを含む。後者の 例は種々のタイプのラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）若しくは酵素免疫吸着測定 法（ＥＬＩＳＡ）を含む。ウエスタンブロット若しくは他の同様のアッセイが用 いられる場合、ただ１つの抗体を用いて３８ｋＤＡの非リン酸化ＣＲＫＬおよび ４０ｋＤＡのリン酸化ＣＲＫＬを検出することができ、そしてそれらの相対量を 比較すること ができる。ウエスタンブロット若しくは免疫アッセイが用いられる場合、一次抗 体を用いてＣＲＫＬがリン酸化されているか否かを検出することができ、そして 二次抗体を用いてリン酸化ＣＲＫＬ上のホスホチロシン残基のみを検出すること ができる。 もう１つの実施態様においては、ガン細胞は、癌特異的１１０−１３０kDaチ ロシンリン酸化ＣＲＫＬ関連タンパク質の存在を測定することにより検出するこ とができる。他のタンパク質と異なり、この１１０−１３０タンパク質の存在も そのＣＲＫＬとの関連もどちらもガン細胞に特異的である。したがって、ＣＲＫ Ｌの存在を上記のようにアッセイすることによって癌を診断する方法は、リン酸 化ＣＲＫＬを検出する代わりに、あるいはそれに加えて１１０−１３０kDaタン パク質を検出することに基づくようにすることもできる。 リン酸化ＣＲＫＬを発現している細胞に起因する癌の処置方法は、ＣＲＫＬタ ンパク質若しくは１１０−１３０kDaのＣＲＫＬ結合タンパク質の量を減少させ る方法、およびそれらのリン酸化をブロックする方法を含む。これらのタンパク 質の量を減少させる方法は、アンチセンスヌクレオチド若しくはリボザイムを、 ＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質ｍＲＮＡの転写若しくは翻訳を減少さ せるかまたは妨害するために用いることを含む。例えば、ＣＲＫＬをコードする ｍＲＮＡに対して特異的、すなわち相補的なアンチセンスヌクレオチド若しくは リボザイムは、そのｍＲＮＡのタンパク質への翻訳を減少若しくは妨害する。三 重らせんを形成するヌクレオチドもまた本発明の方法に有用であることは、上記 から明らかであろう。 このアンチセンスヌクレオチドおよびリボザイムは、オリゴヌクレオチド構築 物の形態であってもよいし、またはそれらはレトロウイルスベク ターのようなヌクレオチド構築物によってコードされていてもよい。Reddyらの 米国特許第５，２４６，９２１号（本明細書中で参考として援用する）は、ｂｃ ｒ−ａｂｌ ｍＲＮＡを切断するリボザイムの使用を記載しており、したがって 、ＣＲＫＬ ｍＲＮＡ若しくはＣＲＫＬ結合タンパク質ｍＲＮＡを切断するよう にされていてもよい。このアンチセンスヌクレオチド若しくはリボザイム、また はこれらをコードするＤＮＡは、適切な方法、例えば、リポソームで、脂質ベー スの担体で、あるいは脂質ベースの複合体で、細胞に送達することができる。そ れらはまたタンパク質に関連していてもよい。この送達は、インビトロで若しく はインビボで細胞に対して行うことができる。核酸を細胞内へ移送するための脂 質担体を記載したEpandらの米国特許第５，２８３，１８５号に記載された方法 を用いることができ、本明細書中に参考として援用する。 ＣＲＫＬのリン酸化をブロックする方法は、リン酸化されるＣＲＫＬの領域と 競合する合成ペプチドの使用を含む。好ましくは、この合成ペプチドがＣＲＫＬ のその領域と同じ領域を含む場合には、その合成ペプチドは、通常ならばリン酸 化ＣＲＫＬによって伝達されるシグナル伝達に必要な領域を含まないであろう。 理論に拘束されることなく、残基１９３〜２１０と一致するＣＲＫＬアミノ酸配 列の部分は、新生物形成活性を有するリン酸化された形態のＣＲＫＬを与えるこ とに関連する１以上のチロシン残基を含むと考えられる。特に、配列ＳＹＧおよ びＡＹＡ、特にＡＹＡ内のチロシン残基がＣＲＫＬの増殖活性に関与しているこ とが考えられる。ＣＲＫＬに関しては、１１０−１３０kDaのＣＲＫＬ結合タン パク質のリン酸化をブロックする合成ペプチドもまた、上記のように用いること ができる。 したがって、別の変更は、このペプチドがＣＲＫＬ若しくはＣＲＫＬ結 合タンパク質の領域に類似した領域で変更され、その領域内でチロシンがリン酸 化されているということである。 この合成ペプチドは、適切な方法、例えば、リポソームで、脂質ベースの担体 で、あるいは脂質ベースの複合体で、細胞に送達することができる。あるいは、 このペプチドは、レトロウイルスベクターのようなヌクレオチド構築物によって コードされていてもよい。この送達は、インビトロ若しくはインビボで細胞に対 して行うことができる。 本発明はまた、マウスＣＲＫＬをコードする単離され精製された図１０の核酸 配列にも関する。この配列は、わずか１０アミノ酸の置換を有するだけのヒト遺 伝子に顕著に相同であることが見いだされた。マウスＤＮＡとヒトＤＮＡの間の 相同性の程度が高いことに基づくと、他の種の相当するタンパク質もまた非常に 似ていて、マウス若しくはヒトＣＲＫＬまたはマウスの配列およびヒトの配列の 保存された領域をもとにしたオリゴヌクレオチドプローブのいずれかを用いて同 定することができる。 マウス若しくは他の種由来のＣＲＫＬをコードする核酸配列を用いて、細胞を トランスフェクションするか若しくはトランスジェニック動物を創生して、種々 の癌の処置の効果の評価に有用なモデルを作成することができる。トランスジェ ニック動物を作成する方法は、米国特許第５，１７５，３８３号、同第５，１７ １，３８４号および同第５，１７１，３８５号に記載され、これらを本明細書中 に参考として援用する。トランスジェニック動物を作成するために、ＣＲＫＬを コードしているゲノムＤＮＡは、ｃＤＮＡ若しくはその部分をプローブとして用 いてゲノムＤＮＡライブラリーをスクリーニングして得ることができる。ＢＣＲ ／ＡＢＬ遺伝子によるＣＯＳ細胞のトランスフェクション（実施例１、後出）と 同様に、ＣＯＳ細胞はまたＣＲＫＬ遺伝子によってトランス フェクションすることができる。 以下の実施例は、本発明の特定の実施態様を例示するが、いかなる方法によっ てもその範囲を制限するように解釈されるべきではない。特定の改変および変化 は、前述の開示および以下の実施例から当業者には明らかであり、これらは、本 発明の趣旨および範囲によって包含されることが意図される。 実施例１ 材料と方法 抗血清 ＣＲＫＬタンパク質の２つの重複する領域を含むＧＳＴ融合タンパク質に対す る抗血清を調製した。ＣＨ１５抗血清については、ＲｓａＩ−ＲｓａＩ ＣＲＫ ＬのｃＤＮＡフラグメント（アミノ酸残基１２８−２４７をコードする）をｐＧ ＥＸ−２Ｔ(Pharmacia)内に挿入し、ＣＨ１６抗血清については、より小さいＳ ａｕ３Ａ−ＲｓａＩ ＣＲＫＬのｃＤＮＡフラグメント（アミノ酸残基１８４− ２４７をコードする）を使用した。グルタチオン−セファロースカラム(Pharmac ia)上で、得られたＧＳＴ融合タンパク質を精製し、これを用いてウサギを免疫 化した。抗−ｐ−Ｔｙｒ（Ａｂ−２）、αＢＣＲ（ＢＣＲ Ａｂ−２）およびα −ＡＢＬ（ＡＢＬ Ａｂ−３）モノクローナル抗体は、Oncogene Science，Inc ．(OSI)からのものであり、α−ＳＯＳポリクローナルウサギ抗血清はＵＢＩか らであった。ＲＣ−２０α−ｐ−Ｔｙｒ抗体はTransduction Laboratoriesから のものであった。チロシンキナーゼＦＥＲ（ＣＨ６）に対して向けられたウサギ ボリクローナル抗血清については以前に記載されているものである（１７）。 ＣＯＳ−１細胞内での発現 ＣＯＳ−１細胞中での一時的な発現のためのＦＥＲ、ＡＢＬ、ＢＣＲ、ＢＣＲ ／ＡＢＬ Ｐ２１０およびＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ１９０構築物は、修飾されたＳＶ ４０ベースの哺乳動物発現ベクターｐＣＤＸ（１８）の中に挿入された完全ｃＤ ＮＡで構成されていた。ＣＲＫＬコード領域全体を、真核生物発現ベクターｐＳ Ｇ５（Stratagene）内に挿入した。基本的に記述されているとおり（１９）のＤ ＥＡＥ−デキストラン方法を用いてＣＯＳ−１細胞内に構築体を導入した。 抽出物の調製および免疫沈降 ０．５mlの氷冷溶菌緩衝液（２５mMのリン酸ナトリウム、pH７．２、１５０mM のＮａＣｌ、１％のTriton Ｘ−１００、５mMのＥＤＴＡ、５０mMのＮａＦ、２ mMのＰＭＳＦ、２mMのＮａ₃ＶＯ₄、２０μg/mlのロイペプチン、２０μg/mlのア プロチニン）中に細胞を懸濁させ、１５〜４５分間氷上に放置した。細胞を１８ ｇおよび２５ｇの針に通すことによってさらに破壊し、核および破片をペレット 化した（１２，０００×ｇで３０分、４℃）。それぞれ２５０μgまたは５００ μgのタンパク質を含むＣＯＳ−１細胞抽出物またはＫ５６２細胞抽出物を、５ μlの抗血清と一緒に４℃で９０分間インキュベートした。５μlのプロテインＡ アガロースビーズ（ＢＲＬ）と一緒にさらに３０分間インキュベーションした後 、免疫複合体を収集し、溶菌緩衝液で４回洗浄し、ゲル電気泳動に先立ち１×Ｓ ＤＳのサンプル緩衝液内で煮沸した。 ウエスタンブロッティングと免疫検出 小型トランス−ブロット装置（Biorad）を用いてHybond-ECL(Amersham)にタン パク質を移した。メンブランをＴＢＳＴ(２０mMのTris−ＨＣｌ、pH８．０、１ ５０mMのＮａＣｌ、０．１％のTween)＋５％の脱脂乳（Biorad）の中で４℃で一 晩ブロックし、抗血清とともに室温で２時間 インキュベーションした；ＨＲＰでラベルした二次抗体（Biorad）で、結合した 抗体を検出した。α−ｐ−Ｔｙｒ抗体とともに使用すべきメンブランを、ＴＢＳ Ｔ＋２％のＢＳＡ＋１％のオボアルブミン中でブロックした。メーカーの推奨事 項にしたがってＲＣ−２０を使用した。ＥＣＬ試薬（Amersham）を用いてブロッ トを発色させ、Hyperfilm-ECL(Amersham)に曝露した。 ２％のＳＤＳ、１００mMのβ−メルカプトエタノール、６２．５mMのTris−Ｈ Ｃｌ、pH６．８中、５５℃で３０分間ブロットをストリップした。 ウエスタンブロット結合アッセイにおいては、精製したＧＳＴおよびＧＳＴ− ＣＲＫＬ融合タンパク質を使用した。このＧＳＴ−ＣＲＫＬ融合タンパク質は、 Ｎ末端の最初の６個のアミノ酸のみが欠如した全ＣＲＫＬコード領域を含んでい る。ウエスタンブロットをＰＢＳ＋０．１％Tween＋５％ミルクの中で１時間ブ ロックし、結合緩衝液（２５mMのリン酸ナトリウム緩衝液pH７．２、１５０mMの ＮａＣｌ、０．１％のTween７０、２．５mMのＥＤＴＡ、２０mMのＮａＦ、１％ の脱脂乳、１mMのＤＴＴ、１０μg/mlのロイペプチンおよび１０μg/mlのアプロ チニン）中でＧＳＴまたはＧＳＴ−ＣＲＫＬタンパク質（それぞれ１または２μ g/ml）とともに室温で２時間インキュベーションした。結合緩衝液中でＣＨ１５ （これも又ＧＳＴエピトープに対する抗体を含んでいる）およびＨＲＰでラベル した二次抗体を用いたその後のインキュベーションによって、結合したＧＳＴタ ンパク質を検出し、上述のとおり発色させた。 ノーザンブロット分析 グアニジンイソチオシアネートを用いて、ＲＮＡを単離した（１９）。全ＲＮ Ａ１５μgをホルムアルデヒド／アガロースゲルに流し、ニトロセ ルロースにブロットした（２０）。ハイブリダイゼーション後の洗浄を６５℃で ０．３×ＳＳＣ中で行った。 結果 ＣＲＫＬの発現 異なるマウスの組織から単離したＲＮＡについてのノーザンブロット分析は、 ニワトリ中のｃ−ｃｒｋ（１５）に類似したマウスのｃｒｋｌが、テストされた すべての組織中で６kbのｍＲＮＡとして偏在的に発現されるということを示した （図示せず）。ヒト細胞系の中でも、ＣＲＫＬは、ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２の中で 比較的豊富に発現され（図１、パネルＡ、レーン２）、肝腫瘍細胞系ＨｅｐＧ２ 内ではそれより低いレベルで発現されている（レーン５）。これとは対照的に、 ＣＲＫｍＲＮＡ発現は、Ｋ５６２内よりもＨｅｐＧ２内でより高かった（図示せ ず）。 ＣＲＫＬの中央ドメイン内の２つの重複する領域は、細菌中でＧＳＴ融合タン パク質として発現され、抗血清を生じさせるのに用いられた。ＣＨ１５はＮ末端 ＳＨ３ドメインおよびそのＳＨ３ドメイン間の領域に対して向けられ、一方ＣＨ １６は、後者の結合（junction）領域のみに対して発生させられる（図２Ａ）。 この６４アミノ酸残基の結合領域ポリペプチドは、ＣＲＫとＣＲＫＬとではかな り異なっている（１６）。 両方の抗血清ともに、全長ＣＲＫＬを発現する構築物で一時的にトランスフェ クションしたＣＯＳ−１細胞（図２Ｂ、レーン＋）内およびＫ５６２細胞（図２ Ｂ、レーンＫ）内で、約３８−kDa（Ｐ３８）のタンパク質を特異的に検出した 。ＣＯＳ−１細胞は同様に実質的な量の内因性Ｐ３８タンパク質をも含んでいた （図２Ｂ、レーン−）。同じブロットをストリップして、抗ホスホチロシン（α −ｐ−Ｔｙｒ）モノクローナル抗体と反応させた場合、見かけ上類似した分子質 量のバンドがＫ５６２、 ＣＲＫＬでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞内で検出され、Ａ４９８お よびトランスフェクションしていないＣＯＳ−１細胞中では実質的にこれより弱 いバンドが検出された（図示せず）。 ＣＲＫＬは、ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬによってチロシン上でリン酸化され る。 α−ｐ−Ｔｙｒ抗体により検出された３８−kDaのタンパク質は、その細胞系 内で検出された、最も際立ったｐ−Ｔｙｒ含有タンパク質の１つであった。その 同一性を確認するため、Ｋ５６２の細胞抽出物をＣＲＫＬ抗血清とともにインキ ュベーションし、免疫沈降物を２回流した。ＣＨ１６抗血清と反応させたウエス タンブロットは、Ｐ３８の特異的免疫沈降を示した；α−ｐ−Ｔｙｒモノクロー ナルと反応させた複製フィルターは、ＣＲＫＬがまさにＫ５６２内の際立ったｐ −Ｔｙｒ含有Ｐ３８であることを実証した（図３Ａ）。 ＣＲＫＬがＢＣＲ／ＡＢＬのための基質として作用できるか否かを調査するた め、ＣＲＫＬ、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ１９０およびＡ ＢＬのＣＯＳ−１細胞内への同時トランスフェクションを行った。抗−ＡＢＬモ ノクローナル抗体およびＣＨ１６を用いて、Ｐ２１０ ＢＣＲ／ＡＢＬ、Ｐ１４ ５ ＡＢＬおよびＰ３８ ＣＲＫＬの存在について確認した（図３Ｂ）。チロシ ン−リン酸化Ｐ３８はＫ５６２（図３Ｂ、レーン１）内およびＣＲＫＬ＋ＢＣＲ ／ＡＢＬ Ｐ２１０（レーン４）、ＣＲＫＬ＋ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ１９０（図示 せず）およびＣＲＫＬ＋ＡＢＬ（レーン６）でトランスフェクションされた細胞 （図４も参照のこと）の中で明らかに見ることができた。 ＣＲＫＬのリン酸化は、結果として移動度シフトをもたらした。さらに 高い分解度をもつゲル上で、Ｋ５６２中のＰ３８バンドは、ＣＨ１６により検出 される２つの接近して移動する形態ＩおよびIIへと分解された（図３Ｃ、レーン ２）。ＣＨ１５は、形態ＩおよびII、ならびに第３のタンパク質産物III（図３ Ｃ、レーン１）を検出した。形態IIは、ＣＲＫＬでトランスフェクションしたＣ ＯＳ−１細胞内に存在し、形態Ｉは、ＣＲＫＬ＋ＡＢＬで同時トランスフェクシ ョンした細胞の中に現われた（それぞれ図３Ｃ、レーン４および３）。形態Ｉは 、ホスホチロシンを含有していた（図３Ｃ、レーン５および６）。このことは、 ＩおよびIIが１つのタンパク質ＣＲＫＬがリン酸化により区別された形態である ことを示唆している。 Ｐ３８はＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬと特異的複合体を形成する。 ＢＣＲ／ＡＢＬおよびＡＢＬの過剰発現細胞内のチロシン上でのＣＲＫＬのリ ン酸化は、これらが直接相互反応し得ることを示唆していた。このことを確認す るために、本発明者らは、ＡＢＬおよび／またはＢＣＲ／ＡＢＬが、ＣＲＫＬ抗 血清とのＰ３８の免疫複合体の中に存在するか否かを決定した。ＣＨ１５および ＣＨ１６抗血清はＡＢＬまたはＢＣＲ／ＡＢＬのいずれとも直接反応しなかった （図４Ａおよび４Ｂ、レーン３、５、７を比較すること）。ＣＨ１５の免疫沈降 およびそれに続くＡＢＬ抗体でのウエスタンブロット分析は、ＡＢＬ Ｐ１４５ がＣＲＫＬおよびＣＲＫＬ＋ＡＢＬを発現するＣＯＳ−１細胞の免疫沈降物の中 に存在することを示した（図４Ｂ、レーン２および８）。ＣＨ１６抗血清は同様 に、ＣＲＫＬ＋ＡＢＬを発現する細胞の中でＡＢＬ Ｐ１４５を同時免疫沈降し た（図４Ｂ、レーン９）。同様にして、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０＋ＣＲＫＬお よびＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０発現細胞からのＣＨ１５およびＣＨ１６免疫沈降 物の中 で、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０を回収した（図４Ｂ、レーン４および６；結果示 さず）。抗ｐ−Ｔｙｒ抗体は、ＣＨ１５およびＣＨ１６免疫沈降物内に存在する Ｐ２１０、Ｐ１４５およびＰ３８がチロシン上でリン酸化されることを示した（ 図４Ｃ、レーン４、６、８、９）。これらのタンパク質の同一性を、予め免疫沈 降させることなく、同じ抽出物を同時電気泳動することによって確認した（図４ Ｂ、レーン１、３、５、７）。対照の免疫前血清はＣＲＫＬまたはＡＢＬを沈降 させなかった（図４Ａおよび４Ｂ、レーン１０）。 ＢＣＲ／ＡＢＬおよびＡＢＬとＣＲＫＬとの相互反応は特異的であるようであ る。非レセプタ−チロシンキナーゼＦＥＲはＡＢＬと関係をもち、ＡＢＬと同様 に、細胞質内および核内の両方に位置している（１７、２１、２２）。ＣＲＫＬ ＋ＦＥＲでトランスフェクションしたＣＯＳ−１細胞のＣＨ１５免疫沈降物は、 検出可能な量のＰ９４^ferを含有していなかった（図４Ｄ）。 ＣＲＫＬ−結合タンパク質の同定 ＡＢＬ−発現ＣＯＳ−１細胞の全細胞抽出物をウエスタンブロットに付し、Ｇ ＳＴまたはＧＳＴ−ＣＲＫＬ融合タンパク質と一緒にインキュベーションしてそ の他のタンパク質へのＣＲＫＬの結合能力を試験した。ＧＳＴ単独では、非常に わずかなタンパク質しか結合せず（図５Ａ、レーン１）、一方ＧＳＴ−ＣＲＫＬ は、１００kDaより大きい４つのタンパク質に結合した（図５Ａ、レーン２）。 これらのうち最も際立ったものは、移動に関し、過剰発現されたＰ１４５^ablに 一致していた（図５Ａ、レーン３）。類似の実験において、ＧＳＴ−ＣＲＫＬは ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０にも結合した（図示せず）。ＧＳＴ−ＣＲＫＬと比較 的強い反応を示す第２のタンパク質は、α−ＳＯＳ抗体により同じメンブラ ン上で検出されたＰ１７０^sosと類似した移動度を有していた（図５Ａ、レーン ２および４を比較すること）。ヌクレオチド交換因子ｍＳＯＳ１のＳＨ３結合ド メインは、最近になって、インビトロでＧＢＲ２に結合するのみならずＣＲＫ ＳＨ３ドメインにも結合するということが立証された（２３）。全細胞中のＣＲ ＫＬとｍＳＯＳ１の潜在的相互作用を確認するため、Ｋ５６２の細胞抽出物をＣ Ｈ１５またはコントロールの免疫前抗血清とインキュベーションし、ウエスタン ブロットに付し、ＣＨ１６またはα−ＳＯＳ抗体でプローブした。α−ＳＯＳ抗 体と免疫反応性のＰ１７０タンパク質がＣＨ１５免疫沈降物の中に存在していた （図５Ｂ）。 本発明者らの結果は、ＣＲＫＬがインビボでＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬに結 合することを立証している。興味深いことに、ＣＲＫとＡＢＬとの間の相互作用 も実証された（H．Hanafusa，pers．comm.）。ＢＣＲ／ＡＢＬまたはＡＢＬとＣ ＲＫＬの結合がもたらす１つの結果は、チロシン上でのＣＲＫＬのリン酸化であ る。ＡＢＬまたはＢＣＲ／ＡＢＬを過剰発現していない少量の内因性ＣＲＫＬも またホスホチロシンを含有していることから、本発明者らは、ＡＢＬによるＣＲ ＫＬのチロシンリン酸化が正常な細胞プロセスでありうるということと考える。 ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０はＣＲＫＬと複合体を形成するＡＢＬの能力を保持 しているので、Ｐｈ陽性白血病において、ＢＣＲ／ＡＢＬの調節解除された(der egulated)キナーゼ活性がチロシン上でのＣＲＫＬの過剰なリン酸化をひき起こ すということはもっともらしい。驚くべきことに、ＢＣＲ／ＡＢＬ ｐ２１０を 発現しているＣＭＬ細胞系Ｋ５６２においては、ｐ３８ ＣＲＫＬの大部分がチ ロシン−リン酸化されていることがわかった。他の研究者達により免疫ブロッテ ィングおよび抗ホスホチロシン抗体を用いて、Ｋ５６２内の際立ったチロシン− リン酸化ｐ３６− ｐ４１タンパク質の存在もまた示された（２４、２５）。このタンパク質は、Ｃ ＭＬ細胞系内で特異的にチロシン上でリン酸化されるが、匹敵する(matched)細 胞系コントロール内ではリン酸化されない（２４）。本発明者らのデータは、こ れらの研究者により同定されたｐ３６−ｐ４１がＣＲＫＬであることを強く示唆 している。 白血病における第２の考えられるＣＲＫＬおよびＣＲＫの関与メカニズムは、 遺伝子用量によるものである。Ｐｈ染色体の重複が、急性化期のＣＭＬにおいて 頻繁に見られ、そしてｉ（１７ｑ）（１７ｐの欠失および１７ｑの重複が関与す る）がＣＭＬの急性期にある患者の２０％前後において検出される。どちらの異 常も、ＣＲＫＬまたはＣＲＫのいずれかの遺伝子コピー数を改変する（２６、２ ７）。このような状況下では、Ｋ５６２は、ＣＲＫに比べＣＲＫＬの増大したコ ピー数およびｍＲＮＡ発現を有するＣＭＬ細胞系の１つの例である。 ＧＲＢ２およびＣＲＫＬは両方とも、見かけ上異なるメカニズムを通してでは あるが、ＢＣＲ／ＡＢＬと相互作用する。すなわちＧＲＢ２はタンパク質のＢＣ Ｒ部分内のリン酸化されたチロシン残基Ｙ¹⁷⁷を介してＢＣＲ／ＡＢＬに結合し （１０、１１）、一方ＣＲＫＬはＢＣＲ／ＡＢＬのＡＢＬ部分に結合するらしい 。ＧＲＢ２（１１、１２）およびＣＲＫＬ（本研究）は、両方ともｍＳＯＳ１と 複合体を形成することができる。レセプターチロシンキナーゼの活性化の際に、 ＧＲＢ２／ＳＯＳ複合体は、ＲＡＳが位置している原形質膜へと動員され、こう してＲＡＳ経路を活性化させる。調節解除されたＢＣＲ／ＡＢＬキナーゼもまた ＧＲＢ２／ＳＯＳを介してＲＡＳ経路を活性化させるようである（１０、１１） 。ＣＲＫＬとｍＳＯＳ１の会合という本発明の発見事実は、ＣＲＫＬもまたＲＡ Ｓ経路を調節し得るということを示唆している。これとは無関係に、 ＣＲＫＬがＢＣＲ／ＡＢＬに結合することができ、この相互作用の結果としてチ ロシン上でリン酸化された状態となる、ということは明白である。 実施例２ 材料と方法 細胞および患者のサンプル 記述されたとおりに（４６）、患者の細胞破砕物を調製した。National Cance r Institute(国立ガン研究所)によって後援されたプログラムプロジェクト研究 の一部としての患者から血液サンプルを得た。全ての患者は、適切なインフォー ムドコンセント書式に署名を行った。ＡＬＬ細胞系ｓｕｐ−Ｂ１５およびＢＣＲ ／ＡＢＬ−陰性骨髄性細胞系ＫＧ−１は、以前に記載されたものである（４７、 ４８）。ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２は、ＡＴＣＣから入手した。 抗血清およびウエスタンブロッティング ＣＲＫＬのアミノ酸残基１８４−２４７を含有する、細菌により発現されたＣ ＲＫＬ−グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質に対 して、ＣＲＫＬ−特異的ＣＨ１６抗血清を生じさせた。ＣＲＫＬおよびＣＲＫの 間で相違している（diverged）この領域（参考文献１６）を、Ｓａｕ３Ａ−Ｅｃ ｏＲＩ＋ＥｃｏＲＩ−ＲｓａＩフラグメントとしてｐＧＥＸ−２Ｔ内に挿入した 。ｐＧＥＸ構築物を発現している細菌培養物を０．２５mMのＩＰＴＧで誘発し、 音波処理によって溶菌させた。ＧＳＴ−ＣＲＫＬ融合タンパク質をグルタチオン −セファロースカラムで精製し、ウサギの免疫化のためにこれを用いた。抗−ｐ −Ｔｙｒ（Ａｂ−２）モノクローナル抗体は、Oncogene Science，Inc．(OSI)か らのものであった。このモノクローナル抗−Ａｂｌ抗体８Ｅ９は別に記載さ れている（４６）。 ウエスタンブロッティングおよびＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０の検出は、以前に 記載されたとおりであった（４６）。ＣＲＫＬの検出のためには、４×１０⁶の 末梢血細胞または１×１０⁶のＫ５６２細胞の破砕物を１２％のＳＤＳ−ＰＡＧ Ｅゲル上で分離し、Hybond-ECL(Amersham)に移した。ＴＢＳＴ(２０mMのTris-Ｈ Ｃｌ、pH８．０、１５０mMのＮａＣｌ、０．１％のTween)に５％の脱脂乳（Bior ad）を加えたものの中で４℃で一晩、メンブレンをブロックし、その後、ＴＢＳ Ｔ＋２％のミルクの中で１：１，０００に希釈したＣＨ１６抗血清とともに、室 温で２時間インキュベーションした。結合した抗体を、西洋ワサビペルオキシダ ーゼでラベルした二次抗体（Biorad；ＴＢＳＴ＋２％のミルク中、１：３，００ ０）を用いて検出した。抗ｐ−Ｔｙｒ免疫ブロットをＴＢＳＴ＋２％のＢＳＡ＋ １％のオボアルブミンの中で４℃で一晩ブロックし、次に、ＴＢＳＴ＋１％の魚 ゼラチン＋０．１％のＢＳＡの中で１μg/mlのα−ｐ−Ｔｙｒモノクローナル抗 体とともにインキュベーションした。ＥＣＬ試薬（Amersham）を用いてブロット を発色させ、Hyperfilm-ECL(Amersham)に曝露した。 結果 患者の末梢血リンパ球内のＢＣＲ／ＡＢＬの存在を検査するために、ウエスタ ンブロット分析手順が以前に開発されていた。ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２およびＣＭ Ｌ患者の末梢血サンプルの中で、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０を容易に検出するこ とができた（図６）。Ａｂｌ抗体により、より低い分子量のタンパク質も通常検 出され、Ｐ２１０の分解産物であると思われるか、あるいはＢＣＲ／ＡＢＬタン パク質のいくつかの変性形態を表す可能性もある（４６）。ＢＣＲ／ＡＢＬは、 急性骨髄性白血 病細胞系ＫＧ−１の中または緩解を達成したＣＭＬ患者のサンプル中では検出さ れなかった（図６、サンプル２２１６および２２２５）。 全ての末梢血リンパ球サンプルは、明らかに検出可能なレベルのＰ３８ ＣＲ ＫＬを含有していた。ＣＲＫＬタンパク質は、緩解サンプル２２１６および２２ ２５（図７、上のパネル）およびＫＧ−１（図８）中で単一のバンドとして移動 した。しかしながら、細胞系Ｋ５６２中およびＰ２１０ ＢＣＲ／ＡＢＬタンパ ク質を発現した慢性期（図７、上のパネル）または急性化（図８Ａ、サンプルＣ １３１６およびＣ１７９７）にあるＣＭＬ患者のサンプル中には、２つの全く異 なるものの接近して移動するＣＲＫＬバンドが存在した：これらのサンプル中に 存在するＣＲＫＬの合計量の一部分が、移動度シフトを受けていた。 移動度シフトは、二次修飾によってひき起こされる可能性があり、リン酸化の 結果として起こることが周知である。抗ホスホチロシン（α−ｐ−Ｔｙｒ）抗体 での重複ウエスタンブロットのプロービングにより、Ｐ２１０発現サンプル内に 存在するより緩慢に移動するバンドがホスホチロシンを含有するということが明 らかにされた（図７、下のパネル）。全ての末梢血サンプルは、このサイズ範囲 内でさらに増えているチロシン−リン酸化タンパク質を含有していた。しかしな がら、この未同定のタンパク質のリン酸化は一定であり、ＢＣＲ／ＡＢＬの存在 と相関関係はなかった。 一定の割合のＰｈ陽性ＡＬＬ患者が、Ｐ１９０すなわちエクソン１によりコー ドされるＢＣＲアミノ酸のみならずＰ２１０と同じＡＢＬ部分も含むＢＣＲ／Ａ ＢＬ融合タンパク質を発現する（参考文献３、２９、３０）。ここで検査された Ｐ１９０を発現するＡＬＬサンプルの全てが、リン酸化形態および非リン酸化形 態のＣＲＫＬの存在に特徴的なＰ３８ ダブレットを示した（図８Ａ、サンプルＡ０００７、Ａ００４１、Ａ００５５お よびＢ１５；表Ｉ）。実際、より緩慢に移動する形態は、ホスホチロシンを含有 していた（図示せず）。これとは対照的に、Ｐｈ陰性のＡＬＬ患者のサンプルは 、非リン酸化ＣＲＫＬのみを含んでいた（図３Ａ、サンプルＡ０００３およびＡ ００１８；結果は示さず）。検査したその他のＰｈ陰性サンプルは、正常なコン トロールおよび急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、散在性大細胞型リンパ腫、骨髄増 殖性症候群（ＭＰＳ）、ダウン症候群、慢性リンパ性白血症（ＣＬＬ）および慢 性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）を患う患者の末梢血リンパ球が挙げられる。そ のうちいずれのサンプルも、チロシン−リン酸化形態のＣＲＫＬを含んでいなか った（図８Ｂ；データ示さず）。 ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０またはＰ１９０の相対的発現レベルおよびＣＲＫＬ リン酸化の度合（移動度シフトを受けたＣＲＫＬタンパク質の百分率によって決 定される）を比較すると、ＢＣＲ／ＡＢＬ発現レベルとＣＲＫＬリン酸化の度合 の間には直接的な相関関係が存在すると思われる（表Ｉ）。 ＢＣＲ／ＡＢＬにより表示された調節解除されたチロシンキナーゼ活性は、新 しいホスホチロシン含有タンパク質について、ＣＭＬ細胞系またはＰ２１０でト ランスフェクションした細胞系を試験するよう多くの研究者達を促すことになっ た。１９９２年に、FreedおよびHunter²⁹は細胞系Ｋ５６２中の最も際立ったホ スホチロシン含有タンパク質の１つとして４１−ｋＤａタンパク質を報告した。 さらに、ｐｐ４１は、他の２つのＣＭＬ細胞系およびＣＭＬ患者から樹立された Ｐｈ陽性Ｂ細胞系の中に見い出されたが、同じ患者から樹立されたＰｈ陰性Ｂ細 胞系内では発見されなかった。ｐｐ４１はＰ２１０^BCR/ABLを含有する細胞内の 非常に際立った基質なので、この特定のタンパク質のリン酸化がＣＭＬの病因に 関係し ている可能性があるということが報告された（４９）。理論に拘束されることは なく、ｐｐ４１は、Ｋ５６２内で本発明者らが検出した最も際立ったホスホチロ シン含有タンパク質であり、ＣＲＫＬのＢＣＲ／ＡＢＬ依存性リン酸化が、Ｐｈ 陽性およびＰｈ−陰性のヒト造血細胞系の中でのｐｐ４１検出（４９）の記述さ れたプロフィールと合致することから、ＣＲＫＬがｐｐ４１と同一であるという ことと本発明者らのデータには一貫性がある。 本発明者らは、Ｐ３８ ＣＲＫＬがヒト末梢血細胞内で明らかに検出可能なレ ベルで発現されること、そしてＣＲＫＬがこれらの細胞内で非チロシンリン酸化 形態で存在していることを発見した。しかしながら、ＣＲＫＬは、ＢＣＲ／ＡＢ Ｌ Ｐ２１０またはＰ１９０を発現する末梢血細胞内でチロシン上でリン酸化さ れた状態となり、ＣＲＫＬリン酸化レベルはウエスタンブロッティングによって 検出されたＢＣＲ／ＡＢＬの量とよく相関していることがわかった。このことは 、単一のＢＣＲ／ＡＢＬ分子が制限された数のＣＲＫＬ分子のみをリン酸化する ことができるということ、あるいは、ＣＲＫＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬ形態が比較 的永久的なまたは安定した複合体を形成すること、を示唆している。 ＣＲＫＬは、ＣＯＳ−１細胞内で同時発現された時点でＡＢＬおよびＢＣＲ− ＡＢＬと複合体を形成することができる。さらに、細菌により発現されたＣＲＫ Ｌは、ウエスタンブロット結合アッセイにおいて過剰発現されたＡＢＬおよびＢ ＣＲ／ＡＢＬの両方と結合することができる（４５）。したがって、ＢＣＲ／Ａ ＢＬに対するＣＲＫＬの結合には、分子のＡＢＬ部分が関与すると思われる。Ｃ ＯＳ−１細胞の中では、ＣＲＫＬは、ＡＢＬおよびＢＣＲ／ＡＢＬの両方によっ てリン酸化され得る。それでも、末梢血細胞内では、ＣＲＫＬはＢＣＲ／ＡＢＬ により検出 可能なレベルまでリン酸化されるだけであり、比較的豊富なＡＢＬタンパク質に よってはリン酸化されない（図６参照）。したがって本発明者らは、Ｐｈ陽性細 胞内のＣＲＫＬリン酸化の高い度合を異常なものとみなすことができると推断す る。 ＣＲＫＬは、アダプタータンパク質ＣＲＫと相同であり、これもまた１つのＳ Ｈ２ドメインと２つのＳＨ３ドメインだけで構成されている（１５、２８）。Ｈ ｅＬａ細胞内では、ＣＲＫは、おそらくは急速な翻訳後修飾のためチロシン−リ ン酸化された形態でのみ存在するようである（５０）。ＣＲＫはｐ１４５ ＡＢ Ｌによりチロシン残基Ｙ²²¹上でリン酸化され、ホスホチロシン依存性の形式で その他のＣＲＫ分子に結合する。チロシンリン酸化Ｙ²²¹がＣＲＫのＳＨ２ドメ インのための結合部位となり、それにより分子内結合を可能にするということが 提案されてきた。その結果、ＡＢＬおよびその他のＳＨ３結合分子の結合は完全 に破壊されることになる。したがって、ＳＲＣとの類似において、ＣＲＫのチロ シン−リン酸化、それに続くそれ自身のＳＨ２ドメインに対する分子内結合の結 果、シグナル伝達に参与できない「不活性」ＣＲＫ分子が生成されることになる （５０）。 本発明者らの結果から、造血細胞においてＣＲＫＬがリン酸化されていない形 でのみ存在することが明らかである。この形態がその他の分子相互作用に関与す ることができないかどうか、またはチロシン−リン酸化形態が「不活性である」 かについては、今後見極めるべきである。ＣＲＫＬのリン酸化がその他の細胞タ ンパク質との相互作用を誘発する場合、これはあるシグナル変換経路を活性化し 、骨髄前駆細胞のさらなる最終分化を潜在的に損なう可能性がある。あるいは、 チロシン−リン酸化がＣＲＫＬを不活性化する場合、ＢＣＲ／ＡＢＬの発現はＣ ＲＫＬの機能喪失を結果と してもたらすことになり、その程度は存在するＢＣＲ／ＡＢＬの量と相関する。 この仮定された機能喪失は、最も成熟した増殖骨髄細胞区画(compartment)の 拡張によって特徴づけられるＣＭＬの病理生物学についての現行の考え方と相容 れるものである（５１）。ＣＭＬ始原細胞は、１回以上のさらなる分割を受け、 増大した寿命を示し、成熟区画内で正常な前駆体よりも長い通過時間を有する可 能性がより高い（概説は、５２を参照のこと）。ＣＲＫＬが関与するシグナル変 換経路が、結局は最終分化を導くことになるシグナルを送る場合、ＣＲＫＬ機能 が部分的になくなることは、骨髄前駆体のプールの拡大をゆっくりともたらす可 能性がある。最終分化において考えられるＣＲＫＬの役割の裏付けは、ラットの クロム親和性細胞腫細胞系ＰＣ１２内への関係するＣＲＫタンパク質のマイクロ インジェクションが神経分化を誘発するという発見事実に由来する（５３）。現 在本発明者らは、ＣＲＫＬ活性化についてのこれらの仮説がいずれであるか区別 することができないでいるが、両方とも実験的調査に基づいて吟味できるもので ある。ＣＲＫＬリン酸化の影響とは無関係に、ＣＲＫＬのリン酸化は、本発明者 らが診断および治療目的で有用であるものとして開示するＰｈ陽性白血病の明ら かな特徴である。 実施例３ １１０〜１３０kDaのタンパク質の同定 ＣＲＫＬおよびそのサブドメインの細胞タンパク質に対する結合を調査するた めに、ファーウエスタンブロッティングを使用した。細菌により発現されたＧＳ Ｔ−ＣＲＫＬ（実施例１および２を参照）およびＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２（図 １０Ａに示したように、ＣＲＫＬのＳＨ２領域と融合した実施例１および２に記 載したＧＳＴタンパク質（すなわちアミノ 酸残基１４〜６４））融合タンパク質を、ファーウエスタンブロッティングのた めのプローブとして用いた。このＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２融合タンパク質は、 ＢＣＲ／ＡＢＬでトランスフェクションした細胞、ＢＣＲ／ＡＢＬトランスジェ ニックマウスの白血病組織およびＣＭＬ Ｐｈ陽性患者サンプルにおいて、約１ １０〜１３０kDaの分子量のリン酸化されたタンパク質を検出した。このファー ウエスタンブロットは、記載されたとおり（４５）に行った。 図９に示すように、細胞破砕物内でこれらのプローブを用いて、特異的タンパ ク質を検出した。ＣＲＫＬ−ＳＨ２は、ＢＣＲ／ＡＢＬで安定にトランスフェク ションしたＮＩＨ３Ｔ３細胞内で１８０kDaおよび１１０／１３０kDaの２つのタ ンパク質に特異的に結合するが、コントロールのＮＩＨ３Ｔ３細胞内では結合し ない（図９、右のパネル）。この１１０／１３０kDaのタンパク質はまた、Ｐｈ 陽性のＣＭＬ患者のサンプル中でも特異的に検出されるが、Ｐｈ陰性の患者の細 胞内には検出されない（図９、中央のパネル）。全ＣＲＫＬタンパク質によって 検出されたさらなるタンパク質（図９、中央のパネル）は、そのＮ末端ＳＨ３ド メインを介して結合する（図示せず）。 １１０／１３０タンパク質の存在または不存在は、Ｐｈ陽性およびＰｈ陰性サ ンプルＡ００１８、Ｃ１７９７、Ａ００５５、Ｃ２２０６、Ｃ２２８３およびＣ １３１６を含むヒトの患者のサンプルの拡張されたパネル（図示せず）の中で検 査された（図８および表Ｉ参照）。ＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２ドメインは、活性 ＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質およびリン酸化ＣＲＫＬを含有するような患者のサン プル中で約１１０〜１３０kDaのタンパク質を検出しただけであった。抗ホスホ チロシン抗体を用いると、活性ＢＣＲ／ＡＢＬ、リン酸化ＣＲＫＬを含有する同 じサンプル内で 同一サイズのタンパク質が専ら検出され、それはＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ２と反 応した（図示せず）。 本発明者らはまた、白血病／リンパ腫を発生させた異なるトランスジェニック Ｐ１９０ ＢＣＲ／ＡＢＬマウスからの抽出物のパネルも試験した。抽出物は、 リンパ腫および／または多数の悪性リンパ芽球を含有する関連する脾臓を含んで いた。コントロールとして、非トランスジェニック動物の脾臓を含んだ。ＧＳＴ −ＣＲＫＬ−ＳＨ２ドメインは、関与する組織内で１１０／１３０タンパク質の バンドを特異的に検出したが、非トランスジェニック（非白血病性）脾臓の中で は検出しなかった。 これらの結果は、活性ＢＣＲ／ＡＢＬを発現している細胞においてのみ見られ るＣＲＫＬ−ＳＨ２−結合タンパク質の存在を明確に実証している。このタンパ ク質は、変動するリン酸化の量の結果として、最も高い可能性として約１１０〜 約１３０kDaの分子量範囲を有している。ＢＣＲ／ＡＢＬでトランスフェンクシ ョンした細胞、トランスジェニックＢＣＲ／ＡＢＬマウスの白血球細胞およびＰ ｈ陽性の白血病患者の白血病性細胞内における本発明者らの結果は、この１１０ 〜１３０kDaのリン酸化されたタンパク質は、さまざまな量のリン酸化を伴い、 活性ＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質をも発現している細胞の中で唯一ＧＳＴ−ＣＲＫ Ｌ−ＳＨ２と結合することができる（またはこの細胞の中でのみ存在する）とい う結論を裏付けるものである。 同時免疫沈降 ＣＲＫＬおよび１１０／１３０タンパク質がインビボで会合するか否かを決定 するため、本発明者らは、同時免疫沈降実験を行った。５０mMのTris-ＨＣｌ、p H８．０、１５０mMのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、０．５ＮａＤＯＣ、０．１ ％のＳＤＳ、２．５mMのＥＤＴＡ、１０mMの ＮａＦ、１mMのＰＭＳＦ、１mMのＮａ₃ＰＯ₄、１０μg/mlのアプロチニン、およ び１０μg/mlのロイペプチン中で、組織または細胞系から破砕物を調製した。破 砕物を１８ゲージの針を引いて通過させ、１２，０００rpm(Sorvall ＳＳ−３４ ；２０−３０分)で遠心分離した。この破砕物を氷上に保ち、タンパク質濃度を 決定した。適当な点で、この破砕物を上述の緩衝液中で希釈した。５００μg(Ｋ ５６２)または１mg（組織抽出物）のタンパク質を伴う１mlの容量を、抗血清(抗 血清に応じて１〜２０μg)とともに、４℃で２時間、インキュベーションした。 プロテインＡまたはプロテインＧアガロースの３０％懸濁液を、緩衝液中でビー ズを洗浄することによって調製し、その３０％懸濁液５０μlを添加し、サンプ ルをさらに６０分間、４℃でインキュベーションした。沈降物を１mlの氷冷抽出 緩衝液で３回洗浄し、ＳＤＳ−ＰＡＡゲルに流した。 ＣＭＬ細胞系Ｋ５６２から調製した破砕物をアフィニティー精製した抗体（Ｃ Ｈ１６）またはＣＲＫ−Ｌ抗血清（Santa Cruz Biotech）で免疫沈降させ、ブロ ットを抗ホスホチロシン抗血清と反応させると、いくつかのホスホプロテインが 、ＣＲＫＬと再現性ある形で同時免疫沈降した。これには、ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ ２１０および際立った１１０−１３０kDa群のタンパク質が含まれていた。コン トロールの免疫前ＣＨ−１６抗血清はいかなるタンパク質も沈降させなかった。 同様にして、ＣＲＫＬ抗血清は両方とも、白血病性ＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ１９０ト ランスジェニックマウスのリンパ腫からのＰ１９０ ＢＣＲ／ＡＢＬおよび１１ ０〜約１３０kDaのタンパク質を同時に免疫沈降させた。 これらの実験は、活性ＢＣＲ／ＡＢＬタンパク質を発現している細胞の中では 、ＣＲＫＬが実際にインビボで１１０〜１３０のタンパク質と会合し、安定に結 合するということを実証している。この特異的な複合体形成 は、ＢＣＲ／ＡＢＬを介して開始された形質転換シグナルの伝達における１１０ 〜１３０タンパク質の役割と一貫性あるものである。 実施例４ ヒトおよびマウスのＣＲＫＬは高レベルで保存されている。 マウスとヒトとの間のＣＲＫＬ ｃＤＮＡおよびエクソン１を包含するゲノム ＤＮＡの保存度を測定した。マウスＣＲＫＬは、長さがヒトＣＲＫＬと同一であ り、３０３アミノ酸残基を含む（図１０Ａ）。これはまた、ＳＨ２−ＳＨ３−Ｓ Ｈ３構造（図１０Ｂ；ｔｅｎ（１６））からなる；マウスＣＲＫＬの５′の非翻 訳領域でさえヒト配列に対して高度の相同性を有する（図示せず）。マウスのＣ ＲＫＬは、系統発生的に充分保存されている。すなわち、ヒトとわずか１０個の アミノ酸の差しか見られなかった。これらの（保存的）置換のうちの２つは、Ｓ Ｈ２およびＮ末端ＳＨ３ドメイン（図１０Ｂ）内の、ＳＨ２およびＳＨ３ドメイ ンの構造または機能にとってさほど重要性をもたないと思われる位置にある（６ ２、５３）。２つのＳＨ３ドメインの間の領域は、２つの種の間の大部分の相違 点を含んでいる。特に、全てのチロシン残基がマウスと人間の間で保存されてい る（図１０Ｂ）。これらのデータはまた、ヒトＣＲＫＬに対して生じさせた前述 の抗血清（４５）がマウスのＣＲＫＬを認識するはずであるということも示した 。 材料と方法 トランスジェニックＢＣＲ／ＡＢＬマウス トランスジェニックＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ１９０マウスについては以前に記載さ れ特徴づけられている（３５、６６、６７）。メタロチオネインプロモータの制 御下でＢＣＲ／ＡＢＬ Ｐ２１０をコードする構築物に関してトランスジェニッ クであるマウスを、基本的に記載とおり（３５、 ５７）に発生させた。明らかに病気となった時点でマウスを屠殺した。この研究 で用いたマウスは、巨脾腫症であった。ウエスタンブロット分析のために用いた 白血病組織には、脾臓、リンパ腫および胸腺腫が含まれていた。 マウスＣＲＫＬ ＳＨ２ドメインを含有するヒト２８２ｂｐ ＴａｑＩプローブを用いて、マウ スのp.c（交尾後）１７．５日目のｃＤＮＡライブラリーから、部分的ＣＲＫＬ ｃＤＮＡを分離した（２６）。このマウスｃＤＮＡには、ＳＨ３ドメイン、３ ′非翻訳領域およびＳＨ２ドメインの一部分が含まれていた。３′配列について の確証的な証拠は、プライマー５′−ＧＧＧＴＴＧＧＧＡＴＧＡＴＴＣＣＴＧＴ Ｃ−３′および５′−−ＣＣＡＴＴＣＡＣＣＴＣＧＣＣＴＴＣＣＣＡＴ−３′を 用いたＲＴ／ＰＣＲクローニングによって得た。付加的な５′配列およびプロモ ーターは、ヒトの２８２ｂｐのＴａｑＩプローブを用いてマウスゲノムライブラ リーから単離した。Sequenase 2.0(United States Biochemicals)を用いて両方 の鎖について配列分析を行った。 細胞抽出物およびウエスタンブロッティング 切開したマウスの器官および組織を切り刻み、その後、垂直壁組織粉砕機（st raight-wall tissue grinder）を用いてジチオトレイトールを含まない２×ＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液（４％のＳＤＳ、１２０mMのTris−ＨＣｌ、pH６． ８、２０％のグリセロール）の中でこれを粉砕した。１８ｇおよび２２ｇの針の 中に破砕物を強制的に通すことによって染色体ＤＮＡをせん断し、この破砕物を 煮沸した。ＢＣＡ方法（Pierce）を用いてタンパク質濃度を測定した。この破砕 物に、最終濃度２００mMとなるまでジチオトレイトールを添加した。 破砕物タンパク質を、１２％のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳 動によって分離し、Hybond−ＥＣＬメンブラン（Amersham）へ移した。フィルタ ーを一晩４℃で、５％の脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ（２０mMのTris−ＨＣｌ、pH８ ．０、１５０mMのＮａＣｌ、０．１％のTween）（Biorad）の中でブロックした 。その後の工程は全て室温で行った。数回ＴＢＳＴで洗浄した後、一次抗体を２ ％の脱脂粉乳を含むＴＢＳＴ中で１．５時間適用した。緩衝液を数回交換しなが ら、ＴＢＳＴでフィルターを２時間洗浄した。フィルターを、２％の脱脂粉乳を 含むＴＢＳＴの中で１：３，０００に希釈したＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇ抗体 （Biorad）と一緒に１．５時間インキュベートした。２時間ＴＢＳＴで洗浄した 後、ＥＣＬ試薬（Amersham）により、結合した抗体を検出した。 ４％のＢＳＡ、１％のオボアルブミンを含むＴＢＳＴ内でブロックしたフィル ター上で２％のＢＳＡ、１％のオボアルブミンを含むＴＢＳＴ中で１μg/mlの希 釈で、抗ｐ−Ｔｙｒモノクローナル抗体（Ａｂ−２；Oncogene Science，Inc.） をインキュベートした。ポリクローナルウサギα−Ｃｒｋ（ＣＲＫII）およびα −ＣＲＫＬ（ＣＲＫ−Ｌ）抗体をSanta Cruzから購入し、１：５０００の希釈で 使用した。２つのＳＨ３ドメインの間の配列を含むペプチドに対して、抗−ＣＲ ＫＬ抗血清ＣＨ−１６を生成した(ten Hoeve et al.，1994a)。これらの抗−Ｃ ＲＫＬ抗体を標準的な方法を用いてアフィニティー精製した（５６）。このアフ ィニティーカラムは、製造者の説明（Biorad）によると、Affigel-１０にカップ リングさせた、細菌により発現されたＣＲＫＬから調製した。 チロシン−リン酸化ＣＲＫＬの発現は、正常な成熟マウスの組織に制限される 。 マウスのＣＲＫＬ発現を調査するため、本発明者らは、一次配列および 構造においてＣＲＫＬと関係のあるタンパク質であるＣＲＫと交差反応しないＣ ＲＫＬ−特異的抗血清を使用した（１６）。１３の異なる成熟マウス組織からの 抽出物のウエスタンブロッティングは、異なるレベルでではあるが全てにおいて ＣＲＫＬの発現を示した（図１１Ａ）。骨髄、胸腺および脾臓のような造血組織 においては、ＣＲＫＬは、例えば胃に比べて、かなり豊富であった。これとは対 照的に、関係するＣＲＫのレベルは、脳におけるｃｒｋ発現に比べると、相対的 に低い（胸腺および脾臓）かまたはほぼ不在（骨髄）であった（図１１Ｂ）。 いくつかの組織では、ＣＲＫＬはダブレットとして現われ、そのうちより緩慢 に移動するバンドはホスホチロシンを含有していた（例えば、発生１２．５日目 の胚、図１３Ａ＋Ｂを参照のこと）。脳、胸腺、脾臓、腸および精巣の中には、 非常に低いものの検出可能な量のチロシン−リン酸化ＣＲＫＬ（ＣＲＫＬ^p）が 存在していた。図１１Ａに示したブロットのより短い曝露が、脾臓および胸腺に おいてきわめて低いレベルのチロシン−リン酸化ＣＲＫＬを示した。しかしなが ら、合計ＣＲＫＬの約５０％がチロシン−リン酸化されていた肺の組織内での著 しく高いレベルのＣＲＫＬ^pに比べると、これらの量はわずかなものであった。 類似したレベルのチロシンリン酸化が、ＢＣＲ／ＡＢＬ−発現腫瘍材料の中でも 見られた（図１１Ａ参照、左のレーン「腫瘍ＴＧ−Ｐ１９０」をレーン「肺」と 比較すること）。マウスの骨髄は、検出可能なチロシン−リン酸化ＣＲＫＬを全 く含有していなかった（図１１Ａ）。 胚形成の間に高レベルのチロシン−リン酸化ＣＲＫＬが発現される。 発生の間のＣＲＫＬ発現を試験するため、交尾後（p.c.）１０．５日目、１２ ．５日目、１４．５日目および１６．５日目の胚から、ならびに生まれたての動 物から、体節または器官を単離し、ＳＤＳ−サンプル緩衝 液中で直接溶解させた。 発生１０．５日目の全胚では、ＣＲＫＬ^pの相対量は、非チロシンリン酸化Ｃ ＲＫＬとほぼ等しかったが、これは発生の間に徐々に減少した（図１２、レーン Ｌｉおよび図１１Ａ）。肺は、交尾後１６．５日目というサンプル採取されたき わめて早い時点で比較的大量のＣＲＫＬ^pを含有しており（図１２、レーンＬｕ ）、これは成熟した肺でも維持されていた（図１１Ａと比較）。 ＣＲＫＬは、ＢＣＲ／ＡＢＬトランスジェニックマウスの白血病組織内でチロ シンリン酸化されている。 ｐ１９０^Bcr/Ablタンパク質を発現している末期疾患のトランスジェニックマ ウスは、巨脾腫症および大部分は悪性リンパ芽球からなるリンパ芽球性リンパ腫 を典型的に示す（３５、３６）。ｐ２１０^Bcr/Ablトランスジェニックマウスは さらに胸腺腫を含むその他の造血腫瘍を発達させる。Ｐ１９０とＰ２１０に関連 する白血病誘発の間のＣＲＫＬ発現およびリン酸化を試験するため、このような 組織から全タンパク質を抽出し、免疫ブロットアッセイを用いて分析した。 図１３Ａに示したように、マウスのＣＲＫＬは、テストした白血病性組織の中 で明らかに検出可能であった。この曝露レベルにおいては、非トランスジェニッ クマウスの脾臓の中では単一のバンドしか見えなかった（図１３Ａ；ｗｔ脾臓） 。しかしながらＰ１９０およびＰ２１０の動物からの脾臓およびＰ２１０の胸腺 腫を含む３つの異なる罹患組織からの抽出物では、胚抽出物の中にも存在したＣ ＲＫＬダブレットが分離した（図１３Ａ、１２．５日目の胚；図１２も参照のこ と）。より緩慢におよび急速に移動するバンドの強度はほぼ同じであった。 正常なおよびＰ１９０の脾臓抽出物からＣＲＫＬを免疫沈降させてその ホスホチロシン含有量を試験した。これらの沈降物のウエスタンブロッティング および抗ホスホチロシン抗体ブロットとの反応は、ＣＲＫＬのより緩慢に移動す る形態がホスホチロシンを含有し、高レベルのＢｃｒ／Ａｂｌを発現する慢性骨 髄性白血病細胞系であるＫ５６２からのチロシン−リン酸化ＣＲＫＬタンパク質 に移動の面で匹敵した、ということを明らかにした（図１３Ｂ）。これらの白血 病マウス組織内のＣＲＫＬのチロシン−リン酸化は、その他のヒト細胞系および 患者のサンプルの中の発見事実と一貫性をもっている（４５、５９、６０、６５ ）。 ＢＣＲ／ＡＢＬは抗−ＣＲＫＬ抗体を用いてＣＲＫＬと一緒に免疫沈降し、こ れにより、以前にヒトＣＲＫＬについて立証されたとおり（４５）、これらのマ ウス白血病組織内でＢＣＲ／ＡＢＬとＣＲＫＬが複合体を形成しているというこ とがわかった。本発明者らは、ＣＭＬ細胞系およびＰｈ陽性患者におけるヒトＣ ＲＫＬと同様に、マウスのＣＲＫＬが、トランスジェニックマウスからのＢＣＲ ／ＡＢＬにより誘発された白血病および腫瘍においては、チロシン上で異常にリ ン酸化される、と推断する。 シグナル変換に関与する多くのタンパク質と同様に、ＣＲＫＬは、系統発生的 によく保存されている。ヒトおよびマウスのＣＲＫＬは、全てのチロシン残基を 共有し、したがって相同な部位でチロシン−リン酸化され得る。ヒトおよびマウ スのＣＲＫＬが類似の正常な細胞機能を共有すると仮定することは理にかなった ことである。 異なる成熟および胚性マウス組織の試験は、器官によってチロシン−リン酸化 が卓越しているものもあれば検出不可能であるものもあるということを示した。 例えば、肝臓は、分析したいずれのサンプル中にも検出可能なＣＲＫＬ^pを全く 含有しておらず、一方肺は高い割合のものを一貫して 含有していた。リン酸化レベルは、同じ組織から異なる時点で独立して単離した 抽出物の間で異ならず、このことは、細胞ホスファターゼが本発明者らの実験に おいて回収したＣＲＫＬ^pの量に影響を及ぼすとは思われないということを示し ている。本発明者らの結論は、ＣＲＫＬ^pの構造的な存在が、いくつかの組織に おいては正常であるものの、その他の組織においてはそうでない、と推断する。 特定の組織内のＣＲＫＬ^pが全体的に高いレベルにあるということは、それを 大量に産生するような特別の細胞が存在することを表している可能性がある。そ の他の組織内に見られる非チロシンリン酸化ＣＲＫＬの高いレベルは、適切な刺 激の後でのみＣＲＫＬが一時的にチロシンリン酸化された状態となるということ を示している。この状況では、本発明者らは、正常なマウスの骨髄ではＣＲＫＬ^p を全く検出できなかったということに注目することが重要である。同様に、人 間においては、ＣＲＫＬは好中球内でチロシン−リン酸化されない（５９、６０ 、６５）。どのシグナルが骨髄細胞内でＣＲＫＬチロシン−リン酸化をひき起こ すかを識別することが重要となるだろう。なぜなら、このような方法で活性化さ れると推定されているシグナル変換経路が、Ｐｈ陽性白血病においても影響を受 けやすいと考えられるからである。しかしながら、ＣＲＫＬチロシン−リン酸化 はＧＭ−ＣＳＦまたはＴＰＡで活性化された正常な好中球の中では誘発可能でな かったことから（５９）、このような経路は、成熟度がより低い造血細胞の中で 作動的であるかもしれない。 ＣＲＫＬの構造および／または機能に対するチロシン−リン酸化の効果はまだ 解明されていないが、同様に修飾されている関連するＣＲＫタンパク質との類似 点が存在するかもしれない。ｃｒｋ内のチロシン−リン酸化の標的は、ＳＨ３ド メインの間の残基２２１に位置する（５０）。ＮＭＲ 実験は、リン酸化されたＹ²²¹がＣＲＫ ＳＨ２ドメインの結合部位の一部分で あること、そして分子内結合が起こることを示した（６４）。ＣＲＫの分子内折 り畳みが、ＳＨ２およびＮ末端ＳＨ３ドメインと相互作用するその他のタンパク 質に対するＣＲＫの結合に影響を及ぼす可能性が高いと考えられている（５５） 。ＣＲＫＬが同様の影響を受けることも可能である。 内因性マウスＣＲＫＬが、ＢＣＲ／ＡＢＬのＰ１９０およびＰ２１０トランス ジェニック動物のリンパ腫において異常にチロシン−リン酸化されるという発見 は、この修飾が種とは無関係の白血病誘発と関連し、Ｐｈ陽性白血病の真の特徴 であることを示している。したがって、Ｐｈ陽性白血病においてＢｃｒ／Ａｂｌ により影響されるシグナル変換経路を解明するためには、インビボでマウスおよ びヒト起源の正常な細胞および白血病の造血細胞の中でチロシン−リン酸化され たＣＲＫＬと特異的に相互作用するタンパク質を同定することが重要となるだろ う。 本発明を実施するための上記の態様の改変は、遺伝子工学、タンパク質化学、 医薬および関連分野の当業者には明らかであり、以下の請求の範囲内にあること を意図する。 前記に引用した全ての参考文献はその全体を本明細書により参考として援用す る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 ＡＤＵ 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 9358−4Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/64 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ヘイステルカンプ，ノラ・セー アメリカ合衆国、カリフォルニア 90027、 ロサンジェルス、チーズルハースト・ドラ イブ 2490 (72)発明者 テン・フーフェ，ヨハンナ アメリカ合衆国、カリフォルニア 90039、 ロサンジェルス、アームストロング・アベ ニュー 2430 １／２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌の診断方 法であって、 ａ）チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現していることが疑われる細胞の サンプルを入手する工程； ｂ）チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質の正常コントロール細胞に対するパー セント増加を検出する工程であって、ここで、コントロールに対する該リン酸化 ＣＲＫＬタンパク質の発現の増加が癌の存在に関係している工程、 を包含する方法。 ２．診断され得る前記癌が、フィラデルフィア染色体を含む細胞に起因する、請 求項１記載の方法。 ３．前記癌が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性白血病（Ａ ＬＬ）である、請求項２記載の方法。 ４．前記リン酸化ＣＲＫＬタンパク質の発現が、免疫学的に検出される、請求項 １記載の方法。 ５．前記リン酸化ＣＲＫＬタンパク質が、抗ホスホチロシン抗体によって検出さ れる、請求項４記載の方法。 ６．ＣＲＫＬタンパク質が、ウエスタンブロットでダブレットとして検出され、 そしてより遅く移動するバンドが前記リン酸化ＣＲＫＬタンパク質である、請求 項４記載の方法。 ７．診断される前記癌が、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）および急性リンパ芽球性 白血病（ＡＬＬ）である、請求項６記載の方法。 ８．前記リン酸化ＣＲＫＬタンパク質の発現が、比色定量法若しくはラジオイム ノアッセイを用いて検出される、請求項４記載の方法。 ９．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌の診断用 キットであって、 ａ）チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質に特異的に結合することができる試薬 であって、直接的若しくは間接的に検出され得る試薬； ｂ）チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質の存在を検出するアッセイにおいて該 試薬を用いるための使用説明書、 を包含するキット。 １０．前記アッセイを行うための緩衝液試薬および反応容器をさらに包含する、 請求項９記載のキット。 １１．非新生物細胞から入手したＣＲＫＬタンパク質を含むコントロール試薬を さらに含み、そしてそのコントロール試薬がチロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク 質のパーセント増加を検出するための対照標準として用いられる、請求項１０記 載のキット。 １２．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質に特異的に結合することができる前 記試薬が抗体を含む、請求項１１記載のキット。 １３．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質に特異的に結合することができる前 記抗体を検出することができる二次抗体をさらに含む、請求項１２記載のキット 。 １４．前記二次抗体が、酵素、ラジオアイソトープ、若しくは蛍光物質でラベル されている、請求項１２記載のキット。 １５．前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼである、請求項１４記載のキット 。 １６．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌を有す る個体を処置する方法であって、該ＣＲＫＬタンパク質の合成若しくは活性を阻 害する少なくとも１つの組成物を治療的効果量で投与するこ とを包含する方法。 １７．前記組成物がＣＲＫＬタンパク質の合成を阻害し、そしてアンチセンスオ リゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択される、請求項１６記載 の方法。 １８．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムが、前記ガン細 胞に感染することができるウイルスベクターとして投与される、請求項１７記載 の方法。 １９．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムが、リポソーム 若しくは脂質ベースの担体および脂質ベースの複合体からなる群から選択される 担体と一緒になって投与される、請求項１７記載の方法。 ２０．前記組成物がＣＲＫＬタンパク質の活性を阻害することができる、請求項 １６記載の方法。 ２１．前記組成物がＣＲＫＬタンパク質のリン酸化を阻害する、請求項２０記載 の方法。 ２２．前記組成物が、リン酸化に関してＣＲＫＬタンパク質と競合するアミノ酸 配列を含むポリペプチドを含む、請求項２１記載の方法。 ２３．前記ポリペプチドが、ＣＲＫＬタンパク質のフラグメントである、請求項 ２２記載の方法。 ２４．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌を有す る個体を処置するための医薬組成物であって、該ＣＲＫＬタンパク質の合成若し くは活性を阻害する少なくとも１つの成分、および薬学的に受容可能な担体を含 む医薬組成物。 ２５．前記組成物が、前記ＣＲＫＬタンパク質の合成を阻害し、そしてアンチセ ンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群から選択され る、請求項２４記載の医薬組成物。 ２６．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムがリポソームと 一緒になっている、請求項２５記載の組成物。 ２７．前記組成物がＣＲＫＬタンパク質の活性を阻害することができる、請求項 ２４記載の組成物。 ２８．前記組成物が、ＣＲＫＬタンパク質のリン酸化を阻害する、請求項２７記 載の組成物。 ２９．前記組成物が、リン酸化に関してＣＲＫＬタンパク質と競合するアミノ酸 配列を含むポリペプチドを含む、請求項２８記載の組成物。 ３０．前記ポリペプチドが、ＣＲＫＬタンパク質のフラグメントである、請求項 ２９記載の組成物。 ３１．分子量約１１０〜約１３０kDaを有すること、チロシンリン酸化を特徴と し、そしてＣＲＫＬタンパク質のＳＨ２領域に特異的に結合するタンパク質を発 現する細胞に起因する癌を診断する方法であって、 ａ）チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現していることが疑われる細胞の サンプルを入手する工程；および ｂ）１１０−１３０kDaチロシンリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質の存在をアッ セイする工程、 を包含する方法。 ３２．前記１１０−１３０タンパク質のＣＲＫＬへの結合が、ＧＳＴ−ＣＲＫＬ −ＳＨ２融合タンパク質を用いてアッセイされる、請求項３１記載の方法。 ３３．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質および１１０−１３０kDaチロシン リン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質を発現する細胞に起因する癌の診断用キットで あって、 ａ）該１１０−約１３０チロシンリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質に特異的に結 合することができる試薬であって、直接的若しくは間接的に検出され得る試薬； ｂ）該１１０−１３０チロシンリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質の存在を検出す るアッセイにおいて該試薬を用いるための使用説明書、 を包含するキット。 ３４．前記１１０−約１３０kDaチロシンリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質に特 異的に結合することができる前記試薬がＣＲＫＬである、請求項３３記載のキッ ト。 ３５．前記１１０−約１３０kDaチロシンリン酸化ＣＲＫＬ結合タンパク質に特 異的に結合することができる前記試薬が、ＧＳＴ−ＣＲＫＬ−ＳＨ融合タンパク 質である、請求項３３記載のキット。 ３６．マウスＣＲＫＬタンパク質をコードする単離され精製された核酸配列であ って、図１０Ａの核酸配列を含む、核酸配列。 ３７．マウスＣＲＫＬタンパク質をコードする単離され精製されたアミノ酸配列 であって、図１０Ａのアミノ酸配列を含む、アミノ酸配列。 ３８．癌の化学療法剤の効力を評価するためのモデルであって、マウスＣＲＫＬ をコードする核酸配列でトランスフェクションされた細胞を含む、モデル。 ３９．前記核酸配列が、図１０Ａのコード配列を含む、請求項３８記載のモデル 。 ４０．体細胞および生殖細胞が、マウスＣＲＫＬをコードする遺伝子の追加のコ ピーを含む、トランスジェニックマウス。 ４１．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌を有す る個体を処置する方法であって、１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合 タンパク質の合成若しくは活性を阻害する少なくとも１つの組成物を治療的効果 量で投与することを包含する方法。 ４２．前記組成物が１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパク質の合成を阻害し 、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群より選択 される、請求項４１記載の方法。 ４３．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムが、前記ガン細 胞に感染することができるウイルスベクターとして投与される、請求項４２記載 の方法。 ４４．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムが、リポソーム 若しくは脂質ベースの担体および脂質ベースの複合体からなる群から選択される 担体と一緒になって投与される、請求項４３記載の方法。 ４５．前記組成物が前記１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパク質の活性を阻 害することができる、請求項４１記載の方法。 ４６．前記組成物が前記１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパク質のリン酸化 を阻害する、請求項４５記載の方法。 ４７．前記組成物が、リン酸化に関して前記１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タ ンパク質と競合するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項４６記載の 方法。 ４８．前記ポリペプチドが、前記１１０−１３０ＣＲＫＬ結合タンパク質のフラ グメントである、請求項４７記載の方法。 ４９．チロシンリン酸化ＣＲＫＬタンパク質を発現する細胞に起因する癌を有す る個体を処置するための医薬組成物であって、１１０−１３０ＣＲＫＬ結合タン パク質の合成若しくは活性を阻害する少なくとも１つの成分、および薬学的に受 容可能な担体を含む医薬組成物。 ５０．前記組成物が、前記１１０−１３０ＣＲＫＬ結合タンパク質の合成 を阻害し、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムからなる群 から選択される、請求項４９記載の医薬組成物。 ５１．前記アンチセンスオリゴヌクレオチド若しくはリボザイムがリポソームと 一緒になっている、請求項５０記載の組成物。 ５２．前記組成物が前記１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパク質の活性を阻 害することができる、請求項４９記載の組成物。 ５３．前記組成物が、前記１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパク質のリン酸 化を阻害する、請求項５２記載の組成物。 ５４．前記組成物が、リン酸化に関して１１０−１３０kDa ＣＲＫＬ結合タンパ ク質と競合するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項５３記載の組成 物。 ５５．前記ポリペプチドが、前記１１０−１３０ＣＲＫＬ結合タンパク質のフラ グメントである、請求項５４記載の組成物。