JP2005532062A - GEF−H1b:バイオマーカー,その複合体,アッセイおよび治療用途 - Google Patents
GEF−H1b:バイオマーカー,その複合体,アッセイおよび治療用途 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2005532062A JP2005532062A JP2004519732A JP2004519732A JP2005532062A JP 2005532062 A JP2005532062 A JP 2005532062A JP 2004519732 A JP2004519732 A JP 2004519732A JP 2004519732 A JP2004519732 A JP 2004519732A JP 2005532062 A JP2005532062 A JP 2005532062A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- gef
- polypeptide
- seq
- pak4
- amino acid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
- C12N9/1205—Phosphotransferases with an alcohol group as acceptor (2.7.1), e.g. protein kinases
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/82—Translation products from oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/40—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Description
本出願は米国特許出願60/460,053(04/04/2003出願),および60/393,600(07/05/2002出願)(いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する)の通常出願である。
本発明は,新規グアニンヌクレオチド交換因子バイオマーカーのリン酸化変種アイソフォームを検出することにより,生物学的サンプルにおいて異常な細胞増殖を診断すること,および細胞成長,特に発癌性の細胞成長を阻害,低下または破壊する薬剤をスクリーニングすることに関する。
グアニンヌクレオチド交換因子(“GEF”)は,GTPの加水分解生成物であるGDPが,小さなGTP結合蛋白質から解離することを刺激して,新たなGTP分子の結合を促進する。これを行うにあたり,このGEFにより促進されるGDPとGTPとの交換は,GTP結合蛋白質の構造的変化を伴い,これはGTP結合蛋白質の他の分子との相互作用の程度に影響を及ぼす。例えば,Ras蛋白質は,GTPが結合すると,エフェクターおよび他の分子と相互作用して,細胞増殖,分化およびアポトーシスに影響を与えることができる。
したがって,本発明は,配列番号2のGEF−H1Sポリペプチドをコードする単離された核酸,ならびに配列番号1の配列を含む単離された核酸に関する。これに関連して,本発明はまた,配列番号2の配列を含む単離されたGEF−H1Sポリペプチドを企図する。
(i)生物学的サンプルをp21活性化キナーゼ由来ポリペプチドとともにインキュベートし,そして
(ii)p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定する,
ことを含み,ここで,
(a)p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドは,p21活性化キナーゼ4の残基298−324で示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み,
(b)p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドは,p21活性化キナーゼ4の残基1−297で示されるアミノ酸配列を含まない,および
(c)p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドは,p21活性化キナーゼ4の残基325−985で示されるアミノ酸配列を含まない。
(a) グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露し,ここで,ポリペプチドはグアニン−ヌクレオチド交換因子に結合して複合体を形成し;
(b) 1またはそれ以上の試験分子を複合体に加え;そして
(c) 試験分子を複合体に加えた後にポリペプチドおよびグアニン−ヌクレオチド交換因子が互いに解離するか否かを判定する,
ことを含む。
図1:(出現順にそれぞれ配列番号32−34)
GEF−H1のPAK4への直接結合
(a)mycタグ付きPAK4アレルまたはサブドメインを過剰発現する293T細胞から溶解物を調製し,グルタチオンビーズに結合したGST,GST−GEF−H1(787−921)およびGST−Maguin−様(ビーズ名称1,2,3,4)とともにインキュベートした;または(b)GFP−GEF−H1を過剰発現する293T細胞から溶解物を調製し,ストレプトアビジンビーズに結合させたPAK4ビオチン化ペプチド(291−355)および(276−324)とともにインキュベートした。等量のビーズおよび過剰の溶解物(500ug)を用いた。ビーズの溶出物および総溶解物をSDS−PAGEで分析し,mycまたはGEF−H1抗血清を用いて免疫ブロットした;(c)はPAK4遺伝子を示し,GEF−H1相互作用ドメイン(GID)を同定するために用いたPAK4の領域の概略が示される;(d)PAK4の最小結合領域により規定されるGIDとPAK5およびPAK6とのアラインメント。
(a)A549,HCT116およびH1299からのヒト腫瘍細胞溶解物を,抗PAK4,抗GEF−H1および抗PAK4免疫前血清と結合させたプロテインGビーズで免疫沈殿した。ビーズ溶出物は,抗GEF−H1抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。(b)H1299細胞の二重免疫蛍光は,PAK4およびGEF−H1(赤)がシス−ゴルジ付随蛋白質β−COP(緑)と共局在化し,およびトランスゴルジマーカーである小麦胚芽アグルチニン(青)と部分的共局在化することを示す。
PAK4はインビトロおよびインビボでGEF−H1をリン酸化する
(a)インビトロキナーゼアッセイは,精製したGST,GST−GEF−H1(763−921)およびGST−Maguin様蛋白質がPAK4によりリン酸化されることを示す。ネガティブ対照の自己リン酸化反応は,基質を含まない反応混合物である。反応基質の濃度勾配は三角形で示される;
(b)ファージディスプレイのヒットに対してアライメントした重み付けしたPAK4基質コンセンサス(点線の上)。アスタリスクはリン酸アクセプター部位を示す。推定リン酸化部位を有するアミノ末端GEF−H1ペプチド(点線の下)は“*”で示される;
(c)PAK4によるGEF−H1のインビボでのリン酸化は,共トランスフェクトした溶解物をリン酸特異的抗HA抗血清(下パネル)でプローブしたウエスタンブロットで示される。総GEF−H1の量はHA抗血清を用いて検出した(上パネル)。
NIH−3T3細胞をEGFPタグ付きGEF−H1アレルでトランスフェクトした;GEF−H1S(I),GEF−H1SS810A(II),GEF−H1SS67A(III),GEF−H1SS67,810A(IV),GEF−H1Q312M,R313G(V)およびEGFP(VI)。GFP蛍光を用いてGEF−H1(左パネル)の発現を検出し,および蛍光−ファリシジンを用いて細胞骨格の再配列をモニターした(右パネル)。
(a)NIH−3T3細胞をPAK4およびGEF−H1Sアレルでトランスフェクトし,EGFPの蛍光イメージングによりGEF−H1アレルを調べた。PAK4コンストラクトは,PAK4についてはHA抗血清,続いて抗マウス蛍光ローダミンコンジュゲートを用いて,免疫染色により同定した。アクチンを標識するためには蛍光クマリン−ファリシジンを用いた。a)対照EGFPとコトランスフェクトしたPAK4(I)および変異体PAK4S474E(II)およびPAK4K350,351A(III);b)aと同様に,GEF−H1SをPAK4アレルと(I−III),およびGEF−H1SS810A,GEF−H1SS67AおよびGEF−H1SQ312M,R313GをPAK4S474Eと(IV−VI),コトランスフェクトした。矢印は,PAK4S474EとGEF−H1SまたはGEF−H1SS67Aとを共発現する細胞についてのラメリポディウム誘導を示す。アスタリスクは張線維の誘導を有する細胞を示す。スケールバーは10μmを示す。
NIH−3T3細胞をGEF−H1およびPAK4でコトランスフェクトした。GEF−H1およびPAK4の発現は,GEF−H1についてはEGFPの,PAK4についてはPAK4抗血清(#933)およびその後に抗ウサギ蛍光ローダミンの蛍光イメージングにより検出した。蛍光クマリン−ファリシジンを用いてアクチン細胞骨格を調べた。抗β−チューブリン,続いて抗マウス−マリナブルーコンジュゲートを用いて,MT細胞骨格を染色した。(a)においては,GEF−H1MはPAK4および変異体PAK4S474Eと一緒に示されている。矢印はGEF−H1Mと変異体PAK4S474Eをを共発現する細胞におけるアクチンの豊富なラメリポディウムを示す;(b)GEF−H1Mならびにベクターおよび変異体PAK4S474EおよびPAK4K350,351Aが示される。変異体PAK4S474Eの存在下におけるMT細胞骨格の分極していない部分的解離に注目されたい。スケールバーは10μmを表す。
(a)リン酸化されていない状態のGEF−H1は,基底の構成的Rho活性を保持している;(b)PAK4はGEF−H1をリン酸化してRac活性化と構成的Rhoシグナリングの阻害を同時に生じさせることによりGEF−H1を制御することができる。
GEF−H1蛋白質およびペプチドのリン酸化スコア
(a)可能性のある制御領域から誘導したペプチドホスホアイソマーを用いてリン酸化部位を確認した。赤字で示される残基は予めリン酸化されており,インビトロでリン酸化をブロックする;(b)GEF−H1蛋白質上のPAK4リン酸化を物理学的に位置決定するために用いられた欠失と部位特異的突然変異体との組み合わせ。
GEF−H1とCdc24の保存
Cdc24との残基の保存は,ピンク色および黄色で示される。PAK4リン酸化部位は,重み付けされたコンセンサス上のアスタリスクにより強調されており,これはCdc24との間で保存されている推定制御領域と並列されている。
米国特許出願60/393,600においては,種々のGEF−H1アイソフォームが“GEF−H1a”,“GEF−H1b”および“GEF−H1c”として示されている。本明細書においては,これらの同じアイソフォームを“GEF−H1M”,“GEF−H1S”および“GEF−H1U”と表す。したがって,“GEF−H1a”は“GEF−H1M”と同じであり;“GEF−H1b”は“GEF−H1S”と同じであり;“GEF−H1c”は“GEF−H1U”と同じである。
配列番号21:
276-CTPAAPAVPAVPGPPGPRSPQREPQRVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLDNF-324
配列番号22:
298-RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD-322
次に,GEF−H1がPAK4の基質であるか否かを調べた。インビトロキナーゼアッセイは,GEF−H1GST融合蛋白質,Maguin−2−様GST融合蛋白質およびGST対照蛋白質を,PAK4によるリン酸化の基質として用いて行った。これらのアッセイにおいては,GEF−H1ポリペプチドがPAK4の高親和性基質であることが見出され,Kmは1−5uMの範囲内であった。PAK4はGST対照をリン酸化せず,GST−Maguin−2−様融合蛋白質を弱くリン酸化した。
Rho GTPaseファミリーのヌクレオチド交換因子は細胞骨格構造および細胞形態学の制御に関与する。保存されたDblホモロジー(DH)ドメインおよびプレクストリンホモロジー(PH)ドメインは,これらの交換因子の機能に重要である。GEFは,Rho GTPase基質の交換を刺激する能力について,インビトロで,または過剰発現によりインビボで分析されている。GEF−H1の場合,種々のグループがRacおよびRhoに対する触媒活性を示している。Cos−7細胞におけるGEF−H1の過渡的発現および単離されたGEF−H1DH−PHドメインの発現は,それぞれインビボおよびインビトロでRacに対する活性を示す。Cos−1およびHeLa細胞におけるインビトロおよびインビボアッセイによる分析は,GEF−H1がRhoに対して測定可能な活性を有することを示し,これは先の研究と一致する。
線維芽細胞におけるF−アクチン構造の誘導,すなわち糸状足,ラメリポディウム,および張線維の形成は,それぞれ活性な形のCdc42,Rac,およびRhoによるシグナリングによるものである。PAK蛋白質および特にPAK4は,F−アクチンに基づく形態学的構造の制御に役割を果たすため,細胞形態学におけるPAK4により誘導された変化がGEF−H1Sの制御により媒介されるか否かを決定するための実験を工夫した。また,EGFP−GEF−H1コンストラクトを種々のHAエピトープタグ付きPAK4アレルとともにNIH−3T3細胞で共発現させた。外因性PAK4は抗HA抗体(赤)で検出し,アクチン細胞骨格はクマリン−ファリシジン(青)で染色した。NIH−3T3細胞は低いが検出可能なレベルの内因性PAK4およびGEF−H1を有するが,この実験の条件下ではこれらは活性化されなかった。
PAK4によりリン酸化されるGEF−H1Sの残基は,MT(“微小管”)結合型のGEF−H1である“GEF−H1M”において保存されている。GEF−H1Mはそのアミノ末端に微小管への結合を可能とするジンクフィンガードメインを含む。PAK4がGEF−H1M活性を制御する能力を決定する上での微小管結合の役割を調べた。GEF−H1MでMT(インビボでのMTのEGFP−GEF−H1Mラベリングにより)およびアクチン細胞骨格(クマリン−ファリシジンのF−アクチン染色により)の両方を同時に調べる実験を行った。また,β−チューブリン抗体で共染色することによりMT細胞骨格における変化も調べた。
atgcctgtaacaagagcatcacagccaaggaagccctcatctgcccaacaacagaaagcggccctgctgaagaacaacaccgccttgcagtccgtttctcttcgaagtaagacaaccatccgggagcggccaagctcggccatctacccctccgacagcttccggcagtccctcctgggctcccgccgtggccgctcctccttgtctttagccaagagtgtttctaccaccaacattgctggacatttcaatgatgagtctcccctggggctgcgccggatcctctcacagtccacagactccctcaacatgcggaaccgaaccctatccgtggaatccctcattgacgaagcagaggtaatctacagtgagctgatgagtgactttgagatggatgagaaggactttgcagctgactcttggagtcttgctgtggacagcagcttcctgcagcagcataaaaaggaggtgatgaagcagcaagatgtcatctatgagctaatccagacagagctgcaccatgtgaggacactgaagatcatgacccgcctcttccgcacggggatgctggaagagctacacttggagccaggagtggtccagggcctgttcccctgcgtggacgagctcagtgacatccatacacgcttcctcagccagctattagaacgccgacgccaggccctgtgccctggcagcacccggaactttgtcatccatcgcttgggtgatctgctcatcagccagttctcaggtcctagtgcggagcagatgtgtaagacctactcggagttctgcagccgccacagcaaggccttaaagctctataaggagctgtacgcccgagacaaacgcttccagcaattcatccggaaagtgacccgccccgccgtgctcaagcggcacggggtacaggagtgcatcctgctggtgactcagcgcatcaccaagtacccgttactcatcagccgcatcctgcagcattcccacgggatcgaggaggagcgccaggacctgaccacagcactggggctagtgaaggagctgctgtccaatgtggacgagggtatttatcagctggagaaaggggcccgtctgcaggagatctacaaccgcatggaccctcgggcccaaaccccagtgcctggcaagggcccctttggccgagaggaacttctgaggcgcaaactcatccacgatggctgcctgctctggaagacagcgacggggcgcttcaaagatgtgttagtgctgctgatgacagatgtactggtgtttctccaggaaaaggaccagaagtacatctttcctaccctggacaagccttcagtggtatcgctgcagaatctaatcgtacgagacattgccaaccaggagaaagggatgtttctgatcagcgcagccccacctgagatgtacgaggtgcacacagcatcccgggatgaccggagcacctggatccgggtcattcagcagagcgtgcgcacatgcccatccagggaggacttccccctgattgagacagaggatgaggcttacctgcggcgaattaagatggagttgcagcagaaggaccgggcactggtggagctgctgcgagagaaggtcgggctgtttgctgagatgacccatttccaggccgaagaggatggtggcagtgggatggccctgcccaccctgcccaggggccttttccgctctgagtcccttgagtcccctcgtggcgagcggctgctgcaggatgccatccgtgaggtggagggtctgaaagacctgctggtggggccaggagtggaactgctcttgacaccccgagagccagccctgcccttggaaccagacagcggtggtaacacgagtcctggggtcactgccaatggtgaggccagaaccttcaatggctccattgaactctgcagagctgactcagactctagccagagggatcgaaatggaaatcagctgagatcaccgcaagaggaggcgttacagcgattggtcaatctctatggacttctacatggcctacaggcagctgtggcccagcaggacactctgatggaagcccggttccctgagggccctgagcggcgggagaagctgtgccgagccaactctcgggatggggaggctggcagggctggggctgcccctgtggcccctgaaaagcaggccacggaactggcattactgcagcggcaacatgcgctgctgcaggaggagctacggcgctgccggcggctaggtgaagaacgggcaaccgaagctggcagcctggaggcccggctccgggagagtgagcaggcccgggcactgctggagcgtgaggccgaagaggctcgaaggcagctggccgccctgggccagaccgagccactcccagctgaggccccctgggcccgcagacctgtggatcctcggcggcgcagcctccccgcaggcgatgccctgtacttgagtttcaaccccccacagcccagccgaggcactgaccgcctggatctacctgtcactactcgctctgtccatcgaaactttgaggaccgagagaggcaggaactggggagccccgaagagcggctgcaagacagcagtgaccctgacactggcagcgaggaggaaggtagcagccgtctgtctccgccccacagtccacgaggtgagaccctggcggagacatggaccagagactttaccagaatgcaggacatcccggaggagacggagagccgcgacggggaggctgtagcctccgagagctaa
配列番号 2
MPVTRASQPRKPSSAQQQKAALLKNNTALQSVSLRSKTTIRERPSSAIYPSDSFRQSLLGSRRGRSSLSLAKSVSTTNIAGHFNDESPLGLRRILSQSTDSLNMRNRTLSVESLIDEAEVIYSELMSDFEMDEKDFAADSWSLAVDSSFLQQHKKEVMKQQDVIYELIQTELHHVRTLKIMTRLFRTGMLEELHLEPGVVQGLFPCVDELSDIHTRFLSQLLERRRQALCPGSTRNFVIHRLGDLLISQFSGPSAEQMCKTYSEFCSRHSKALKLYKELYARDKRFQQFIRKVTRPAVLKRHGVQECILLVTQRITKYPLLISRILQHSHGIEEERQDLTTALGLVKELLSNVDEGIYQLEKGARLQEIYNRMDPRAQTPVPGKGPFGREELLRRKLIHDGCLLWKTATGRFKDVLVLLMTDVLVFLQEKDQKYIFPTLDKPSVVSLQNLIVRDIANQEKGMFLISAAPPEMYEVHTASRDDRSTWIRVIQQSVRTCPSREDFPLIETEDEAYLRRIKMELQQKDRALVELLREKVGLFAEMTHFQAEEDGGSGMALPTLPRGLFRSESLESPRGERLLQDAIREVEGLKDLLVGPGVELLLTPREPALPLEPDSGGNTSPGVTANGEARTFNGSIELCRADSDSSQRDRNGNQLRSPQEEALQRLVNLYGLLHGLQAAVAQQDTLMEARFPEGPERREKLCRANSRDGEAGRAGAAPVAPEKQATELALLQRQHALLQEELRRCRRLGEERATEAGSLEARLRESEQARALLEREAEEARRQLAALGQTEPLPAEAPWARRPVDPRRRSLPAGDALYLSFNPPQPSRGTDRLDLPVTTRSVHRNFEDRERQELGSPEERLQDSSDPDTGSEEEGSSRLSPPHSPRGETLAETWTRDFTRMQDIPEETESRDGEAVASES
配列番号 3
RRRSLPAGDALYLSFNPP
配列番号 4
RQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 5
RGETLAETWT
配列番号 6
RBSZXG
配列番号 7
CPRRRSLPAGDALYLSFNPP
配列番号 8
CRQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 9
CRQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 10
TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA
配列番号 11
GGTGATGCCCATGGTCTCCAGCAGGAT
配列番号 12
ATCCTGCTGGTGACCATGGGCATCACCA
配列番号 13
GCCGTGGCCGCTCCGCCTTGTCTTTA
配列番号 14
TAAAGACAAGGCGGAGCGGCCACGGC
配列番号 15
QRITKY
配列番号 16
GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA
配列番号 17
GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT
配列番号 18
RRKSLVGTPYWMAPE
配列番号 19
ビオチン-LC-LC-RRKSLVG(pT)PYWMAPE
配列番号 20
RBSZXL
配列番号 21
CTPAAPAVPAVPGPPGPRSPQREPQRVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLDNF
配列番号 22
RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD
GEF−H1Sのクローニング
NCBI(National Center for Biotechnology Information,USA)に寄託された受託番号KIAA0651から設計したプライマーMC1 GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA(配列番号16)およびMC3b GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT(配列番号17)をポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において用いて,ヒト全脳プラスミドcDNAライブラリ(Clontech laboratories Cat#HL9002CC)からGEF−H1S遺伝子を増幅した。EXPANDポリメラーゼ(Roche Molecular,USA Cat#1681834)を用いて20ラウンドのPCRを行った。プライマーMC1は,5’位にEcoR1制限酵素部位を導入し,MC3bは3’位にXho1制限酵素部位を含む。制限酵素部位の配列は天然のGEFH−1b配列の一部ではない。得られたPCR産物を,EcoR1およびXho1制限酵素で消化したプラスミドベクター(pcDNA(Invitrogen Cat# V790−20)の骨格,改変したマルチクローニング部位を有する)に挿入した。制限酵素HindIIIおよびXba1を用いてGEF−H1S遺伝子を切り出し,同様に制限酵素消化した発現ベクターpRSV/Rc(Promega,USA)中に挿入した。
発現および足場非依存性増殖
マウス線維芽細胞細胞株NIH−3T3においてGEF−H1Sを含む,安定に発現するクローン192.58を樹立した。pRSV/Rcをサブクローニングしたベクターは組織培養細胞中でGEF−H1S蛋白質を発現する。
マウス腫瘍モデルに及ぼすGEF−H1Sの影響
192.58細胞は,無胸腺ヌードマウス中にトランスフェクトしたときに腫瘍を形成した。1群あたり8匹のマウスに,対照pcDNA発現ベクターまたはGEF−H1S遺伝子を発現するpcDNA発現ベクターを有するNIH−3T3細胞を皮下注射した。192.58細胞で処置したマウスで認知可能な腫瘍を経時的に測定した。pcDNA発現ベクターを有する細胞を移植したマウスでは触知しうる腫瘍は検出されなかった。
GEF−H1SはPAK4の基質である
第1のGEF−H1Sポリペプチドの回収に特に用いた試薬は,アミノ酸291−591で示されるPAK4の触媒ドメインのポリペプチドを有する発現プラスミドpGEX−4T(Amersham Biosciences Cat#27−4581−01)であった。この発現ベクターは,適切に挿入された遺伝子を融合蛋白質として生成および発現させることができる。ここで,融合パートナーは,SJ26遺伝子グルタチオン−s−トランスフェラーゼ(GST)の蛋白質産物である。融合パートナーであるGSTにより,グルタチオンセファロース4Bマトリクス(Amersham Biosciences Cat#17−0756−01)(グルタチオンビーズとしても知られる)にアフィニティー固定化することができる。これらのビーズに固定化したPAK4ポリペプチドを,MCF7(ATCC,USAから入手可能な乳癌組織培養細胞)cDNAに由来するペプチドのライブラリを発現するファージ粒子を含む溶解物とともにインキュベートした。Zozulya et al.,Nat.Biotechnol.,17(12):p.1193−8,1999を参照。このスクリーニングで得られた候補の多くの配列を決定して,13−8と名付けたクローンからGEF−H1Sポリペプチドを発見した。シークエンシングは,ABIプリズム装置で,製造元(Applied Biosystems,USA)により提供される標準的な方法を用いて行った。
PAK4はインビトロでGEF−H1Sをリン酸化することができる
ファージディスプレイスクリーニングで得られたGEF−H1SをコードするcDNAを切り出し,pGEX−4T発現ベクター中にサブクローニングして,インビトロ実験用に蛋白質を組換え生成させた。次に,GEF−H1S蛋白質をPAK4キナーゼと混合し,PAK4がGEF−H1Sをリン酸化するようインキュベートした。このキナーゼ反応物の一部をSDS−PAGEにより分離し,オートラジオグラフィーによりリン酸化の程度を可視化した。オートラジオグラフにより,GEF−H1Sポリペプチドはリン酸化され,融合パートナーであるGSTはリン酸化されていないことが示された。SDS−PAGEは,万能の蛋白質分離および可視化手法であり,Laemmli,Nature,227(259):680−5,1970に記載されている。
GEF−H1Sのセリン810およびセリン67がインビトロでPAK4によりリン酸化される
上述のリン酸化実験から,GEF−H1Sの2つのペプチドがPAK4誘導性リン酸化の標的であるとして同定された。GEF−H1Sの標的残基は,PAK4活性化ループペプチドをGEF−H1Sポリペプチド配列のアミノ酸762−921とアラインメントすることにより同定した。次に,インビトロキナーゼアッセイにより,GEF−H1Sペプチド PRRRSLPAGDALYLSFNPP(配列番号45)およびRQSLLGSRRGRSSLSLAK(配列番号4)がPAK4によりリン酸化されることが明らかとなった。
GEF−H1SはPAK4と相互作用する
GEF−H1SがPAK4の基質であることの追加の証拠は,上述のGST固定化手法を用いてGST固定化GEF−H1Sと293T細胞で発現される異なるアレルのPAK4との相互作用を示すことにより得られた。蛋白質アフィニティーおよび抗原抗体媒介性免疫沈殿の両方についての免疫沈殿手法は,Lew et al.,J.Immunol.Methods,136(2):211−9,1991;およびAnderson et al.,Methods Enzymol.,96:111−20,1983に記載されている。
腫瘍におけるPAK4キナーゼ活性のメカニズムに基づくバイオマーカーとしてのGEF−H1S
KLHコンジュゲート化ペプチドCSGDRRRAGPEKRPKSS(配列番号23)(KLHにコンジュゲートしたPAK4蛋白質の一部)でウサギを免疫することにより,PAK4に特異的な抗体をウサギで生成した。Nims et al.,1973.23(3):391−6;およびHashimura et al,1982を参照。また,アミノ酸762−921を含むGST−GEF−H1Sポリペプチドで免疫することにより,ウサギでGEF−H1に特異的な抗体を生成させた。
GEF−H1Sリン酸特異的抗体は腫瘍におけるPAK4キナーゼ活性をモニターするためのツールである
KLHコンジュゲート化ペプチドCPRRRSLPAGDALYLSFNPP(配列番号7),CRQSLLGSRRGRSSLSLAK(配列番号8)およびCRQSLLGSRRGRSSLSLAK(配列番号9)を用いて,ウサギで抗体を生成した。下線を付した太字のセリン残基“S”は,リン酸で修飾された残基を表す。“抗1009”は配列番号7のセリン−810でリン酸化されたGEF−H1蛋白質を検出する抗体である。配列番号8および9に記載される配列を含むペプチドに対して生じさせた抗体は,セリン−67がリン酸化された形のGEF−H1ペプチドを認識する。
GEF−H1Sアレルの構築
以下の一覧は,本発明において構築された野生型,S810AおよびQR312,313MG変異体GEF−H1Sアレルであるアレルを表す。後者のアレルについては,GEF−H1S蛋白質のグルタミン312およびアルギニン313がそれぞれメチオニンおよびグリシンに変異しており,このため“QR312,313MG”と表される。同様に,“S810A”は,GEF−H1S蛋白質のアミノ酸位置810のセリン残基がアラニンに変異していることを示す。突然変異誘発は,PCR反応または部位特異的突然変異誘発のいずれかにより行った。
MC27 TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA(配列番号10)。太字の“GCT”残基はXhoII部位を示し,これは,Ser810のコドンをアラニンに変化させる。これをMC3bと対で用いてPCR反応を行い,XhoIIおよびXhoIで切断したときにアミノ酸386−921をコードするcDNA配列を含むプラスミド中の野生型cDNAフラグメント(BamH1およびXhoIで切断)と交換しうるフラグメントを作製した。得られた新たに構築したプラスミドはGEF−H1Sの810位にアラニンを含んでいた。この変異体ポリペプチドをBcl1およびXho1で切り出し,遺伝子の残りを構成するEcoR1−Bcl1フラグメントに連結して全長とした。
GEF−H1Sアレルの分析
RhoファミリーのGTPasesが関与するシグナル伝達は,広範な細胞応答,例えば,アクチン細胞骨格の再編成,遺伝子発現,アポトーシス,膜横断事象,有糸分裂促進シグナリングおよび悪性トランスフォーメーションに関与する。典型的には,DHドメインの高度に保存された“QRITKY”(配列番号15)モチーフ中の変異により,蛋白質はRho GTPase蛋白質に結合することができなくなり,したがって酵素的に不活性となる。
局在化および形態学的変化
GEF−H1SアレルをNIH3T3細胞内で過渡的に発現させるかまたはPAK4アレルと同時に発現させた。GEF−H1SアレルはpcDNAベクターからEcoR1およびXho1消化により回収し,EcoR1およびSal1で消化したpEGFP−C1(Clontech,USA Cat#6082−1)に挿入した。得られた蛋白質は,明るい蛍光蛋白質であるグリーン蛍光蛋白質(GFP)のハイブリッドであった。細胞形態学に及ぼす影響は,F−アクチンをクマリンファラシジン(Molecular Probes,USA,Cat.#C−606)で染色することにより追跡した。PAK4との共局在化を示す実験のためには,PAK4をmycまたはHAアフィニティータグのいずれかを有するpcDNA発現ベクター中に挿入し,ローダミンと結合させたヤギ抗マウス(Santa Cruz,USA)とサンドイッチしたモノクローナル抗体“9E10”または“HA7”で検出した。これは赤色の蛍光を示す。野生型GEF−H1Sはゴルジ装置の核周囲領域に局在化した。.Callow et al.,2002を参照。活性化PAK4もまたゴルジ装置に局在するため,この知見はGEF−H1SがPAK4の基質であることと一致する。
この実施例は,本明細書に記載される方法に関する追加の情報を含む。
GEF−H1のクローニング
蛋白質相互作用物質のファージディスプレイスクリーニングにおいて,PAK4の触媒ドメイン(アミノ酸291−591)のポリペプチドを発現するプラスミドpGEX−4T(Amersham Biosciences Cat#27−4581−01)をおとりとして用いた。ファージディスプレイライブラリは乳癌細胞株MCF−7から誘導した。ファージプラスミドからの配列をクエリーとして用いて,the National Centre for Biotechnology(NCBI)のデータベースでBasic Local Alignment Search Tool(BLAST)を用いた。cDNAのうち2つがKIAA0651(Genbank受託番号:AB014551)と称されるcDNAおよびいくつかの重複発現配列タグ(EST)と99%より高い同一性でマッチした。GEF−H1のクローニングの間に,この遺伝子が3つの主要なスプライシングアイソフォームである,GEF−H1M,GEF−H1SおよびGEF−H1Uを有することが見出された。GEF−H1S(アミノ酸1−921)アイソフォームは,7アミノ酸のミニエクソンならびにN末端ジンクフィンガードメインをコードするエクソンの欠失の点で,GEF−H1Mスプライシング型とは異なる。GEF−H1Mと称されるスプライシング型は,微小管結合に関与するジンクフィンガー領域を含み,GEF−H1と称される全長型(aa1−985)と同一である。インフレーム配列をpGEX−4Tにサブクローニングして基質分析に用いた。
GEF−H1Sを得るために,配列KIAA0651に由来するオリゴヌクレオチドMC1 GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA(配列番号16)およびMC3b GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT(配列番号17)を用いて,20ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行って,ヒト全脳プラスミドcDNAライブラリ(CLONTECH laboratories Cat#HL9002CC)からの遺伝子を増幅した。約3000bpのフラグメントが得られ,これをサブクローニングして3つのクローンをシークエンスし,同一の結果が得られた。EcoR1−Xho1を用いて,MCSの5’側のHAエピトープを含むpcDNAベクター中にインフレームでサブクローニングした。pcDNAクローンからのEcoR1−Xho1フラグメントを用いて,すべてのGEF−H1アレルをそれぞれEco−R1−Sal1で消化したpEGFPC(Clontech)にインフレームでシャトルした。
グルタチオン−s−トランスフェラーゼ(GST)融合PAK4(残基291−591),GEF−H1アミノ酸763−921(ファージクローン13.8配列より,KIAA0651とマッチする)およびMaguin2−様(ファージクローン13.32より,受託#XP−087831と配列がマッチする)を,標準的であり先に記載されている方法(31)により精製した。GEF−H1b807−824にまたがるペプチドのアミノ酸配列,すなわち#1008(RRRSLPAGDALYLpSFNPP)(配列番号28),#1009(RRRpSLPAGDALYLSFNPP)(配列番号29),#1010(RRRSLPAGDALpYLSFNPP)(配列番号30)および#934(RRRSLPAGDALYLSFNPP)(配列番号3)をインビトロキナーゼアッセイにおいて用いた。インビトロキナーゼ反応は先に記載されるようにして行った(31)。
810位にリン酸化されたセリンを有するKLH連結ペプチド(#1009)CRRRSLPAGDALYLSFNPP(配列番号52)(残基807−824)および(#104)GST−GEF−H1(残基762−921)を抗原として用いて,ウサギで抗血清を生成した。PAK4抗体は,抗原(#933)CATTARGGPGKAGSRGRFAGHSEA(配列番号31)(残基122−144)および(#80)CSGDRRRAGPEKRPKSS(配列番号23)(残基148−163)から誘導した。特異性は,先に記載されるようにして分析した。ヤギ抗マウスおよび抗ウサギIgG西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートは,Roche Molecularから入手した。蛍光団FITCまたはローダミンに結合させたヤギ抗マウスおよび抗ウサギはSanta Cruzbiotechnologyから,マウス抗−β−チューブリンはZymedから入手した。クマリン−ファリシジンおよびファロイジンFITCはMolecular Probesから入手した。マウス抗カスケードブルーおよび蛍光色素;テキサスレッド,FITCまたはマリナブルーを入手し,製造元の指針にしたがって抗体とコンジュゲート化させた。架橋試薬の溶液は,G25 sephadexを通して脱塩することによりクエンチし,塩化アンモニウムと混合物して最終濃度50mMとした。
NIH−3T3,293T,A549,HCT116およびH1299細胞は10%ウシ胎児血清(FBS),ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Invitrogen(Carlsbad,CA))中で維持した。トランスフェクションのためには,細胞を,特に記載しないかぎり,NIH−3T3については105細胞/mlで,293TおよびH1299については104細胞/mlで播種した。トランスフェクション試薬であるLipofectamine 2000(Invitrogen)またはFugene(Roche Molecular)を3μg /μgプラスミドDNAで用いた。免疫ブロッティング用の細胞抽出物は,溶解バッファ中で調製した。免疫沈殿実験のためには,溶解物を,適当な抗体と結合させたプロテインGビーズ(Pharmacia),適当なGST融合蛋白質を有するグルタチオンセファロースビーズ(Pharmacia),および適当なビオチン化ペプチドに結合させたストレプトアビジンビーズ(Pierce)とともにインキュベートした。免疫蛍光のためには,カバースリップを24ウエル細胞培養容器に置き,上述の密度で播種した。16時間後にトランスフェクションを行い,特に記載しないかぎり,固定するまで,0.2%FBSを含むOptimemまたはDMEM中で24時間維持した。顕微鏡観察は,NikonE800顕微鏡で60X対物(1.5NA)を用いて行った。画像はCCD SPOTカメラで捕獲し,SPOTイメージングソフトウエア(Diagnostic instruments)を用いて擬似着色した。
ELISAを用いる全細胞中のPAK4キナーゼ活性の測定
GEF−H1SのPAK4依存性リン酸化のレベルは,以下のプロトコルにしたがって,リン酸特異的抗体のGEF−H1Sへの結合をモニターすることにより決定することができる。ELISAプレート(Corning,96ウエルプレート,Cat.#25805−96)をPBS中5μg/mlの抗HAモノクローナル抗体でウエルあたり100μlの最終容量を用いて予めコーティングし,4℃で一晩保存した。次に,コーティングバッファを除去し,ブロッキングバッファ(2%BSA,TBST中)で置き換え,次にプレート全体を室温で60分間振盪した。
シンチレーションプロキシミティーアッセイを用いるヒトPAK4のインビトロキナーゼ活性の測定
シンチレーションプロキシミティーアッセイ(SPA)を用いて,PAK4の蛋白質セリン/トレオニンキナーゼ活性をインビトロで分析した。用いたプロトコルは,10μlの阻害剤溶液をフレキシプレート(Wallac96ウエルポリエチレンテレフタレート(“フレキシ”)プレート,Cat.#1450−401)の各ウエルに加えることを含み,ポジティブおよびネガティブ対照については10μlの5%DMSOを用いた。
ビオチン−LC−LC−RRKSLVG(pT)PYWMAPE(配列番号19)
PAK4ペプチドの8番目のアミノ酸であるトレオニンはホスホトレオニンであり,全ペプチドを最終濃度5mg/mlで水に溶解し,100μlのアリコートで必要となるまで−80℃で保存した。しかし,本発明においては,基質としてPAKキナーゼ(例えばPAK4)によりリン酸化されるか,またはリン酸化されると考えられるすべてのペプチドをPAK4ペプチドの代わりに使用しうることが企図される。例えば,配列番号3および4で表されるGEF−H1SペプチドをPAK4基質として用いることができる。
血清応答要素の誘導
血清応答要素(SRE)に集束する転写因子の活性化は,50%ものヒト結腸癌において観察されるRas活性化に起因するかもしれない。Gauthier−Rouviere et al.,EmboJ.,9(1):171−80,1990を参照。
GEF−H1アレルにより媒介される形態学的変化
線維芽細胞においてGEF−H1が細胞形態学に及ぼす影響を分析するために,GEF−H1SおよびGEF−H1S中のPAK4リン酸化部位の一連の変異体アレルのEGFP(増強グリーン蛍光蛋白質)融合コンストラクトをNlH3T3細胞にトランスフェクトした。GEF−H1のDHドメインを変異させることにより作成した,変異体GEF−H−QR3l2,313MGを生成する優性ネガティブアレルのコンストラクトも作成した。p21結合ドメイン(PBD)アッセイにおいては,この優性ネガティブアレルはNlH−3T3細胞においてRac−GTPの蓄積を阻害するがCdc42−GTPは阻害しない。アクチン細胞骨格をクマリン−ファリシジンで染色して,顕微鏡によりEGFP蛍光(fluorescing)細胞のF−アクチン構造を対比した。
活性化PAK4およびGEF−H1SはNIH−3T3細胞においてラメリポディウム形成を誘導する
線維芽細胞におけるF−アクチン構造の誘導,すなわち,糸状足,ラメリポディウム,および張線維の形成は,それぞれ活性な形のCdc42,Rac,およびRhoによるシグナリングにより生ずる。PAK蛋白質,特にPAK4は,F−アクチンに基づく形態学的構造の制御に役割を果たす。したがって,GEF−H1Sの制御により媒介される,PAK4により誘導される細胞形態学の変化を調べた。NlH3T3細胞においてEGFP−GEF−H1コンストラクトを種々のHAエピトープタグ付きPAK4アレルと共発現させた。外因性PAK4は抗HA抗体で検出し,アクチン細胞骨格はクマリンファリシジンで染色した。NIH−3T3細胞は低いが検出可能なレベルの内因性PAK4およびGEF−H1を有するが,これらはこの実験の条件下では活性化されなかった。
Claims (103)
- 配列番号2のGEF−H1bポリペプチドをコードする単離された核酸。
- 配列番号1の配列を含む単離された核酸。
- 配列番号2の配列を含む単離されたGEF−H1bポリペプチド。
- 単離されたGEF−H1/PAK4複合体。
- 前記GEF−H1がGEF−H1bである,請求項4記載の単離されたGEF−H1/PAK4複合体。
- 前記GEF−H1bが配列番号2の配列を含む,請求項5記載の単離されたGEF−H1/PAK4複合体。
- 配列番号3のGEF−H1ペプチドをコードする単離された核酸。
- 配列番号3の配列から本質的になるペプチド。
- 配列番号4のGEF−H1ペプチドをコードする単離された核酸。
- 配列番号4の配列から本質的になるペプチド。
- 配列番号2のアミノ酸残基162−354が欠失している,請求項3記載の単離されたGEF−H1bポリペプチド。
- 少なくとも1つのリン酸化されたアミノ酸を含む,請求項3,8,または10のいずれかに記載のペプチド。
- サンプルにおいてPAK4活性を検出する方法であって,リン酸化されたGEF−H1の存在またはレベルを検出することを含み,ここで,リン酸化されたGEF−H1の検出は少なくとも1つの活性なPAK4の存在を示すことを特徴とする方法。
- 前記GEF−H1が,配列番号2,3または4のいずれかに記載される配列を含む,請求項13記載の方法。
- 前記PAK4が細胞中に存在する,請求項13記載の方法。
- 前記細胞が腫瘍細胞である,請求項15記載の方法。
- 前記腫瘍細胞が哺乳動物中に存在する,請求項16記載の方法。
- 前記哺乳動物が,ヒト,ラット,マウス,イヌ,ウサギ,ブタ,ヒツジ,ウシ,ウマ,ネコ,霊長類,ヤギ,またはサルからなる群より選択される,請求項17記載の方法。
- PAK4とGEF−H1ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって,(a)GEF−H1ポリペプチドを候補物質に曝露して混合物を形成させ,次に(b)前記混合物にPAK4酵素を導入し;そして(c)前記GEF−H1ポリペプチドを前記候補物質に曝露する前および後に,リン酸化されたGEF−H1ポリペプチドの量を測定する,の各工程を含み,前記候補物質への曝露の後のリン酸化されたGEF−H1ポリペプチドの量の減少または増加が,前記候補物質がPAK4とGEF−H1ポリペプチドとの相互作用を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
- 前記GEF−H1ポリペプチドが配列番号2,配列番号3または配列番号4のいずれかの配列を有する,請求項18記載の方法。
- 配列番号3に記載される配列を含むペプチドに向けられたGEF−H1特異的抗体。
- 配列番号4に記載される配列を含むペプチドに向けられたGEF−H1特異的抗体。
- 配列番号3に記載される配列を含むペプチドに向けられたGEF−H1特異的抗体であって,前記ペプチドはリン酸化されたセリンを含むGEF−H1特異的抗体。
- 前記セリンがセリン−810である,請求項23記載のGEF−H1特異的抗体。
- 配列番号4に記載される配列を含むペプチドに向けられたGEF−H1特異的抗体であって,前記ペプチドはリン酸化されたセリンを含むGEF−H1特異的抗体。
- 前記セリンがセリン−67である,請求項25記載のGEF−H1特異的抗体。
- PAK4とGEF−H1ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって,(a)PAK4を候補物質に曝露して混合物を形成し,そして次に(b)前記混合物にGEF−H1ポリペプチドを導入し;そして(c)リン酸化されたGEF−H1ポリペプチドの量を測定することを含み,ここで,リン酸化されたGEF−H1ポリペプチドの量がPAK4が前記候補物質に曝露されていない対照と比較して減少または増加することは,前記候補物質がPAK4とGEF−H1ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質であることを示すことを特徴とする方法。
- 前記GEF−H1ポリペプチドが,配列番号2,配列番号3または配列番号4のいずれかの配列を有する,請求項27記載の方法。
- 工程(c)においてGEF−H1がリン酸化されているか否かを判定する工程が,リン酸化された配列番号2のセリン−810またはリン酸化された配列番号2のセリン−67の少なくとも1つを含むペプチドに対するGEF−H1特異的抗体を用いてリン酸化されたGEF−H1bを検出することにより行われる,請求項19または27に記載の方法。
- 前記候補物質が,総GEF−H1リン酸化の減少を引き起こす,請求項19または27に記載の方法。
- PAK4とGEF−H1bとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法であって,(i)候補物質をGEF−H1b−PAK4複合体と接触させ,そして次に(ii)前記化合物が前記複合体を破壊するか否かを判定することを含む方法。
- 候補物質が哺乳動物においてPAK4キナーゼ活性を阻害するか否かを判定する方法であって,(i)哺乳動物において配列番号2の配列を含むGEF−H1蛋白質のリン酸化のレベルを測定し;(ii)前記哺乳動物を候補物質に曝露し;そして次に(iii)哺乳動物において前記GEF−H1蛋白質のリン酸化のレベルを測定することを含み,ここで,工程(i)で測定されたレベルに対して工程(iii)における前記GEF−H1蛋白質のリン酸化のレベルが減少していることは前記候補物質がPAK4のキナーゼ阻害剤であることを示すことを特徴とする方法。
- 前記哺乳動物が,ヒト,ラット,マウス,イヌ,ウサギ,ブタ,ヒツジ,ウシ,ウマ,ネコ,霊長類,ヤギ,またはサルである,請求項32記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである,請求項32記載の方法。
- 哺乳動物において癌を治療する方法であって,請求項19,27,30または32のいずれかに記載の方法により同定された物質を前記哺乳動物に投与することを含む方法。
- 細胞サンプルにおける活性化PAK4の存在を判定する方法であって,(i)細胞サンプルから細胞溶解物を取得し;(ii)細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および/または分離し,そして(iii)GEF−H1bのリン酸化変種の存在を検出することを含み,ここで,セリン−810またはセリン−67がリン酸化されていることが検出されることは前記細胞サンプルが活性化PAK4を含むことを示すことを特徴とする方法。
- PAK4キナーゼ活性を阻害する薬剤をスクリーニングする方法であって,(i)細胞サンプルから細胞溶解物を取得し,(ii)前記溶解物に候補薬剤を適用し;(iii)前記細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および/または分離し;そして(iv)GEF−H1bのリン酸化変種の存在を検出する,ことを含み,ここで,セリン−810またはセリン−67がリン酸化されていることが検出されることは前記薬剤がPAK4キナーゼ活性を阻害しないことを示すことを特徴とする方法。
- 前記細胞サンプルが腫瘍細胞サンプルである,請求項36または37に記載の方法。
- 配列番号6または配列番号20の少なくとも1つを含むペプチド。
- 配列番号6または配列番号20の少なくとも1つから本質的になるペプチド。
- 配列番号6の配列を含む20アミノ酸未満のペプチド。
- 配列番号6の配列を含む25アミノ酸未満のペプチド。
- 配列番号6の配列を含む30アミノ酸未満のペプチド。
- 配列番号20の配列を含む20アミノ酸未満のペプチド。
- 配列番号20の配列を含む25アミノ酸未満のペプチド。
- 配列番号20の配列を含む30アミノ酸未満のペプチド。
- 哺乳動物において細胞増殖,細胞運動性および/または細胞侵襲を検出する方法であって,時点Aおよび少なくとも1つの他の時点Bで前記哺乳動物から採取したサンプル中のGEF−H1のリン酸化レベルをモニターすることを含み,ここで,前記時点間の前記サンプルにおけるGEF−H1のリン酸化レベルの増加が,細胞増殖,細胞運動性および/または細胞侵襲を示すことを特徴とする方法。
- 前記GEF−H1が,配列番号2の配列を含むGEF−H1b蛋白質である,請求項47記載の方法。
- 前記サンプルが,前記哺乳動物の皮膚,血液,または細胞のサンプルである,請求項47記載の方法。
- 前記細胞が腫瘍細胞である,請求項49記載の方法。
- 前記哺乳動物が,ヒト,ラット,マウス,イヌ,ウサギ,ブタ,ヒツジ,ウシ,ウマ,ネコ,霊長類,ヤギ,またはサルからなる群より選択される,請求項47記載の方法。
- 配列番号1の配列を含むポリヌクレオチド。
- 配列番号2,3または4のいずれかに記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項52または53に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
- 請求項54記載のベクターを含む細胞。
- 個体において癌を治療する方法であって,前記個体においてGEF−H1活性を阻害することを含む方法。
- 前記GEF−H1が,GEF−H1a,GEF−H1bまたはGEF−H1cの少なくとも1つである,請求項56記載の方法。
- 前記GEF−H1bが配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む,請求項57記載の方法。
- GEF−H1活性を阻害する前記工程が,前記GEF−H1をコードする内因性遺伝子の発現を阻害することを含む,請求項56記載の方法。
- GEF−H1活性が,前記個体に存在する癌性細胞の集団においてまたはその近傍で阻害される,請求項56記載の方法。
- 細胞サンプルにおいて細胞増殖および足場非依存性細胞成長を減少させる方法であって,前記細胞サンプルにおけるGEF−H1活性を阻害することを含む方法。
- 前記GEF−H1が,GEF−H1a,GEF−H1bまたはGEF−H1cの少なくとも1つである,請求項61記載の方法。
- 前記GEF−H1bが配列番号2に記載されるアミノ酸配列を含む,請求項61記載の方法。
- 配列番号21のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって,前記ポリペプチドは,グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合することができ,その際,前記ポリペプチドの前記グアニン−ヌクレオチド交換因子への結合が,PAK4によるグアニン−ヌクレオチド交換因子のリン酸化を防止または減少させることを特徴とするポリヌクレオチド。
- 前記ポリペプチドがGEF−H1Sのアミノ酸763−921に結合する,請求項64記載の単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号21のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号21のアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって,前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリヌクレオチド。
- 配列番号22のアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号22のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号22のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチド。
- 配列番号22のアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドであって,前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができる前記ポリヌクレオチド。
- 配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが標識を含む,請求項73記載のポリペプチド。
- 前記標識が,ビオチン,HISタグ,および放射性標識からなる群より選択される,請求項74記載のポリペプチド。
- 配列番号22のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが標識を含む,請求項76記載のポリペプチド。
- 前記標識が,ビオチン,HISタグ,および放射性標識からなる群より選択される,請求項77記載のポリペプチド。
- 配列番号21と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって,前記ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができる前記ポリペプチド。
- 配列番号21と少なくとも76%の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって,グアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリペプチド。
- p21活性化キナーゼ4の残基276−324で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも1つの他のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドであって,p21活性化キナーゼ4の残基1−276で示されるアミノ酸配列も,p21活性化キナーゼ4の残基324−985で示されるアミノ酸配列も含まない,前記組換えポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが標識を含む,請求項80記載のポリペプチド。
- 前記標識が,ビオチン,HISタグ,および放射性標識からなる群より選択される,請求項82記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが標識を含む,請求項81記載のポリペプチド。
- 前記標識が,ビオチン,HISタグ,および放射性標識からなる群より選択される,請求項84記載のポリペプチド。
- 配列番号22と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって,グアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる前記ポリペプチド。
- p21活性化キナーゼ4の残基298−324で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも1つの他のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドであって,p21活性化キナーゼ4の残基1−276で示されるアミノ酸配列も,p21活性化キナーゼ4の残基324−985で示されるアミノ酸配列も含まない,前記組換えポリペプチド。
- p21活性化キナーゼ4の残基276−324で示されるアミノ酸配列と少なくとも70%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって,p21活性化キナーゼ4の残基1−276で示されるアミノ酸配列も,p21活性化キナーゼ4の残基324−985で示されるアミノ酸配列も含まない,前記ポリペプチド。
- p21活性化キナーゼ4の残基298−324により示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドであって,p21活性化キナーゼ4の残基1−276により示されるアミノ酸配列を含まず,かつp21活性化キナーゼ4の残基324−985により示されるアミノ酸配列を含まない,前記ポリペプチド。
- 生物学的サンプル中においてグアニンヌクレオチド−交換因子の存在を検出する方法であって,
(i)生物学的サンプルをp21活性化キナーゼ由来ポリペプチドとともにインキュベートし,そして
(ii)前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定し,
ここで,
(a)前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドは,p21活性化キナーゼ4の残基298−324により示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み,
(b)前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドは,p21活性化キナーゼ4の残基1−276により示されるアミノ酸配列を含まず,かつ
(c)前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドはp21活性化キナーゼ4の残基324−985により示されるアミノ酸配列を含まない
ことを特徴とする方法。 - 前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドが標識を含む,請求項90記載のポリペプチド。
- 前記標識が,ビオチン,HISタグ,および放射性標識からなる群より選択される,請求項91記載のポリペプチド。
- 前記p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定する工程が,未結合の放射性標識p21活性化キナーゼ由来ポリペプチドを前記生物学的サンプルから除去し,そして次に前記サンプル中の放射活性のレベルを測定することを含む,請求項92記載の方法。
- 配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを含む医薬組成物。
- グアニン−ヌクレオチド交換因子のPAK4媒介性リン酸化を阻害する方法であって,グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露することを含み,ここで,前記ポリペプチドは,前記グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合し,その際前記グアニン−ヌクレオチド交換因子のPAK4リン酸化を阻害することを特徴とする方法。
- 前記グアニン−ヌクレオチド交換因子が生物学的サンプル中に存在する,請求項95記載の方法。
- 前記生物学的サンプルが哺乳動物から得られたものである,請求項96記載の方法。
- 前記哺乳動物が,ヒト,マウス,ラット,ブタ,ウシ,イヌ,ネコ,ウマ,またはサルである,請求項97記載の方法。
- 前記哺乳動物がヒトである,請求項98記載の方法。
- 前記グアニン−ヌクレオチド交換因子を前記ポリペプチドに曝露する工程が,哺乳動物に前記ポリペプチドを含む医薬組成物を投与することを含む,請求項95記載の方法。
- 前記ポリペプチドを含む前記医薬組成物が,錠剤,エアロゾル,粉体,液体,ゲル,クリーム,坐剤のいずれかである,請求項100記載の方法。
- PAK4とグアニン−ヌクレオチド交換因子との間の相互作用を破壊する分子を同定する方法であって,
(a)グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号21のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露し,ここで前記ポリペプチドは前記グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合して複合体を形成し;
(b)1またはそれ以上の試験分子を前記複合体に加え;そして
(c)前記試験分子を前記複合体に加えた後に前記ポリペプチドと前記グアニン−ヌクレオチド交換因子とが互いに解離するか否かを判定することを含む方法。 - GEF−H1アイソフォームのPAK4リン酸化を阻害する方法であって,配列番号21のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞内に導入することを含み,ここで,前記ポリヌクレオチドは前記ポリペプチドを産生するよう発現され,および前記ポリペプチドは前記細胞中のGEF−H1アイソフォームに結合し,このことによりPAK4リン酸化を阻害する,ことを特徴とする方法。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US39360002P | 2002-07-05 | 2002-07-05 | |
US46005303P | 2003-04-04 | 2003-04-04 | |
PCT/US2003/020743 WO2004005529A2 (en) | 2002-07-05 | 2003-07-02 | GEF-H1b: BIOMARKERS, COMPLEXES, ASSAYS AND THERAPEUTIC USES THEREOF |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2005532062A true JP2005532062A (ja) | 2005-10-27 |
JP2005532062A5 JP2005532062A5 (ja) | 2006-07-20 |
JP4522855B2 JP4522855B2 (ja) | 2010-08-11 |
Family
ID=30118381
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2004519732A Expired - Fee Related JP4522855B2 (ja) | 2002-07-05 | 2003-07-02 | GEF−H1b:バイオマーカー,その複合体,アッセイおよび治療用途 |
Country Status (9)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US7439329B2 (ja) |
EP (1) | EP1539956B1 (ja) |
JP (1) | JP4522855B2 (ja) |
AT (1) | ATE497002T1 (ja) |
AU (1) | AU2003256356A1 (ja) |
DE (1) | DE60335883D1 (ja) |
DK (1) | DK1539956T3 (ja) |
PT (1) | PT1539956E (ja) |
WO (1) | WO2004005529A2 (ja) |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6861442B1 (en) * | 1998-12-30 | 2005-03-01 | Sugen, Inc. | PYK2 and inflammation |
US20110294782A1 (en) | 2006-11-10 | 2011-12-01 | Massachusetts Institute Of Technology | Small molecule pak inhibitors |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988006598A1 (en) * | 1987-02-26 | 1988-09-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associ | Vasoactive intestinal peptide analogs |
EP0680973A1 (de) * | 1994-04-08 | 1995-11-08 | SCHRAMM, Wolfgang | Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
WO1999053036A2 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Sugen, Inc. | Ste20-related protein kinases |
WO1999063073A1 (en) * | 1998-05-21 | 1999-12-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pak4, a novel gene encoding a serine/threonine kinase |
WO2001032687A1 (en) * | 1999-10-29 | 2001-05-10 | Human Genome Sciences, Inc. | 10 human secreted proteins |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5863532A (en) * | 1996-03-14 | 1999-01-26 | The Regents Of The University Of California | Compositions and methods comprising cytostatic protein kinase |
US20050100554A1 (en) * | 2002-02-14 | 2005-05-12 | Amanda Jackson | Complexes and methods of using same |
-
2003
- 2003-07-02 EP EP03763085A patent/EP1539956B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2003-07-02 WO PCT/US2003/020743 patent/WO2004005529A2/en active Application Filing
- 2003-07-02 PT PT03763085T patent/PT1539956E/pt unknown
- 2003-07-02 AU AU2003256356A patent/AU2003256356A1/en not_active Abandoned
- 2003-07-02 DK DK03763085.2T patent/DK1539956T3/da active
- 2003-07-02 US US10/611,671 patent/US7439329B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-02 JP JP2004519732A patent/JP4522855B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2003-07-02 AT AT03763085T patent/ATE497002T1/de active
- 2003-07-02 DE DE60335883T patent/DE60335883D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-09-11 US US12/232,134 patent/US7871786B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2010
- 2010-11-30 US US12/957,212 patent/US20110159532A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1988006598A1 (en) * | 1987-02-26 | 1988-09-07 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associ | Vasoactive intestinal peptide analogs |
EP0680973A1 (de) * | 1994-04-08 | 1995-11-08 | SCHRAMM, Wolfgang | Peptide, Verfahren zu ihrer Herstellung und ihre Verwendung |
WO1999053036A2 (en) * | 1998-04-14 | 1999-10-21 | Sugen, Inc. | Ste20-related protein kinases |
WO1999063073A1 (en) * | 1998-05-21 | 1999-12-09 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Pak4, a novel gene encoding a serine/threonine kinase |
WO2001032687A1 (en) * | 1999-10-29 | 2001-05-10 | Human Genome Sciences, Inc. | 10 human secreted proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP4522855B2 (ja) | 2010-08-11 |
AU2003256356A1 (en) | 2004-01-23 |
US20040091907A1 (en) | 2004-05-13 |
EP1539956B1 (en) | 2011-01-26 |
PT1539956E (pt) | 2011-03-16 |
WO2004005529A3 (en) | 2004-07-22 |
EP1539956A2 (en) | 2005-06-15 |
ATE497002T1 (de) | 2011-02-15 |
AU2003256356A8 (en) | 2004-01-23 |
WO2004005529A2 (en) | 2004-01-15 |
US20090130695A1 (en) | 2009-05-21 |
DE60335883D1 (de) | 2011-03-10 |
EP1539956A4 (en) | 2006-09-06 |
US20110159532A1 (en) | 2011-06-30 |
US7871786B2 (en) | 2011-01-18 |
DK1539956T3 (da) | 2011-03-28 |
US7439329B2 (en) | 2008-10-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP3561268B2 (ja) | レセプターチロシンキナーゼ標的タンパク質のcDNAクローニング方法及びhGRBタンパク質 | |
JPH09509304A (ja) | Bcl‐2会合タンパク質 | |
US6207452B1 (en) | Antibody of the anti-proliferation domain of human Bcl-2 | |
US20100286362A1 (en) | Mammalian MDM2 Binding Proteins and Uses Thereof | |
Takano et al. | Identification and characterization of molecular interactions between glucose-regulated proteins (GRPs) mortalin/GRP75/peptide-binding protein 74 (PBP74) and GRP94 | |
US7396920B2 (en) | Tumour suppressor and uses thereof | |
JP2002508961A (ja) | 内皮細胞の形態および細胞骨格編成に影響を与える、ヒトリンパ節由来のgtpアーゼ | |
US5972674A (en) | Stimulus-inducible protein kinase complex and methods of use therefor | |
US7871786B2 (en) | GEF-H1b: biomarkers, complexes, assays and therapeutic uses thereof | |
US7087386B2 (en) | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereto | |
Szymkiewicz et al. | SH3P2 in complex with Cbl and Src | |
US20060094013A1 (en) | Salt-inducible kinases 2 and use thereof | |
US5677421A (en) | Target proteins for eukaryotic tyrosine kinases | |
EP1489177A1 (en) | Cdc7-ask kinase complex, substrate of the kinase complex, antibody specific to the substrate, and method of screening compound capable of inhibiting cdc7-ask kinase using the same | |
ES2357833T3 (es) | Gef-h1b: biomarcadores, complejos, ensayos y usos terapéuticos de los mismos. | |
KR101083852B1 (ko) | 유전자 전사 조절제 및 히스톤 탈아세틸화효소 저해 화합물의 스크리닝 방법 | |
Lukas et al. | Immunochemical analysis of the D-type cyclin-dependent kinases CDK4 and CDK6, using a series of monoclonal antibodies | |
JP2003505064A (ja) | キナーゼ遮断ポリペプチド及びその使用 | |
US6617427B1 (en) | Nucleic acid molecule encoding an ankyrin repeat TVL-1 protein and methods of use thereof | |
CA2489214A1 (fr) | Anticorps monoclonal anti-aurora-a, son procede d'obtention, et ses utilisations dans le diagnostic et le traitement des cancers | |
US7041783B2 (en) | Survivin-binding proteins, encoding nucleic acids, and methods of use | |
US6867292B1 (en) | Characterization of novel gene cbl-SL | |
Occurring | Cloning and Characterization of SCHIP-1 | |
JP2000515725A (ja) | 転移関連抗原およびそれに対する抗体 | |
WO1998001551A1 (en) | Tyrosine kinase associated protein-1 (tka-1), nucleotide and amino acid sequences and their use in diagnosis and treatment of tka-1 related disorders |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060530 |
|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20060530 |
|
RD02 | Notification of acceptance of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422 Effective date: 20071130 |
|
RD04 | Notification of resignation of power of attorney |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424 Effective date: 20071130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20090511 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090623 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090630 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20090908 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20090915 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20091007 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20091015 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20091110 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20091207 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20100216 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20100223 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20100406 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20100510 |
|
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20100526 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20130604 Year of fee payment: 3 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |