PT1539956E - Gef-h1b: biomarcadores, complexos, ensaios e utilizações terapêuticas dos mesmos - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "GEF-Hlb: BIOMARCADORES, COMPLEXOS, ENSAIOS E UTILIZAÇÕES TERAPÊUTICAS DOS MESMOS"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao diagnóstico da proliferação anormal de células em amostras biológicas e a selecção de fármacos que inibem, reduzem ou suprimem o crescimento celular, especialmente o crescimento celular tumorigénico, detectando uma isoforma fosfovariante de um novo biomarcador do factor de troca do nucleótido guanina.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Os factores de troca do nucleótido guanina ("GEF") estimulam a dissociação do produto hidrolítico de GTP, GDP, de pequenas proteínas de ligação ao GTP para promover a ligação de uma nova molécula de GTP. Como resultado, esta troca facilitada por GEF de GDP por GTP está associada a mudanças estruturais na proteína de ligação ao GTP que influenciam o nível de interacção da proteína de ligação a GTP com outras moléculas. Se o GTP está ligado, por exemplo, as proteínas Ras podem interagir com efectores e outras moléculas para afectar a proliferação, diferenciação e apoptose celulares.

Está-se a começar a compreender a possível importância de GEF na localização espacial de mudanças no citoesqueleto de actina. Veja-se Shamah et al., Cell, 20:105(2):233-44, 2001. Numa perspectiva evolucionista, este controlo espacial é satisfeito porque o parente distante Cdc24 de S. cerevisiae, um GEF para Cdc42, desempenha uma função chave na escolha como alvo de mudanças citoesqueléticas para diferentes domínios espaciais da célula em resposta a diferentes sinais, 0'Shea et al.r Nature Cell Biol., 2(3) :E39—41, 2000. 2

Ren et al. (J. Biol. Chem (1998), 273(52), 34954-34960) descrevem a clonagem e a caracterização de GEF-Hl. O documento wo 99/63073A revela a clonagem e a caracterização de PAK4. Callow, Marinella G et al. (J. Biol. Chem (2001), 277(1), 550-558) sugerem que a actividade de PAK4 é requerida para o crescimento independente de ancoragem de linhas de células de cancro humanas.

Portanto, as técnicas existentes e o conhecimento actual não utilizaram nem trataram as interacções de GEF-Hl com outras proteínas como meio pelo qual possa ser controlada a proliferação celular ou desenvolver a detecção e o tratamento de células e tecidos cancerosos tumorigénicos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a presente invenção prevê um ácido nucleico isolado que codifica o polipéptido GEF-Hlb da SEQ ID NO. 2, além de um ácido nucleico isolado que compreende a sequência da SEQ ID NO. 1. Neste contexto, a invenção também contempla um polipéptido GEF-Hlb isolado que compreende a sequência da SEQ ID NO. 2.

Em outra forma de realização proporciona-se um ácido nucleico isolado que codifica o péptido GEF-Hl da SEQ ID NO. 3. A invenção também prevê um péptido que consiste essencialmente na sequência da SEQ ID NO. 3. Num modo similar, outra forma de realização proporciona um ácido nucleico isolado que codifica o péptido GEF-Hl da SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização também proporciona-se um péptido que consiste essencialmente na sequência da SEQ ID NO. 4. Numa forma de realização preferida proporciona-se um polipéptido GEF-Hl que não possuía região de aminoácidos entre os resíduos 162 e 354 da SEQ ID NO. 2. Numa forma de realização preferida, o GEF-Hl é GEF-Hlb. A presente invenção prevê formas fosforiladas de qualquer um destes péptidos, polipéptidos e proteínas GEF-Hl. Portanto, numa 3 forma de realização proporcionam-se péptidos que compreendem as sequências descritas na SEQ ID NO. 2, 3 ou 4 que contêm pelo menos um resíduo fosforilado. Numa forma de realização preferida, o resíduo fosforilado é uma serina. Numa forma de realização preferida, a serina é serina-67 e/ou serina-810 da SEQ ID NO. 2. Em outra forma de realização, a serina-67 está presente num péptido de menos de 30 aminoácidos que compreende a sequência da SEQ ID NO. 4. Em outra forma de realização, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 4 tem menos de 25 aminoácidos de comprimento. Preferentemente, este péptido tem menos de 20 aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização mais preferida, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 4 tem 18 aminoácidos de comprimento.

Em outra forma de realização, a serina-810 está presente num péptido de menos de 30 aminoácidos que compreende a sequência da SEQ ID NO. 3. Em outra forma de realização, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 3 tem menos de 25 aminoácidos de comprimento. Preferentemente, este péptido tem menos de 20 aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização mais preferida, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 3 tem 18 aminoácidos de comprimento. A presente invenção também contempla anticorpos produzidos para detectar qualquer um destes péptidos, polipéptidos ou proteínas. Portanto, numa forma de realização proporciona-se um anticorpo específico para GEF-Hl que é produzido contra e se liga a um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 3. Em outra forma de realização proporciona-se um anticorpo específico para GEF-Hl que está dirigido contra e se liga a um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 4. Os anticorpos da presente invenção podem ser marcados. Preferentemente, o marcador é um marcador fluorescente ou um marcador radioactivo. 4

Em outra forma de realização, o anticorpo é uma parte de um kit de diagnóstico usado para realizar os métodos inventivos descritos no presente documento. Portanto, numa forma de realização, o kit inclui um primeiro recipiente que contém o anticorpo e um segundo recipiente que tem um conjugado de um componente de ligação do anticorpo e um marcador tal como, por exemplo, um radioisótopo. Em outra forma de realização, o kit de diagnóstico também pode incluir a notificação de uma utilização aprovada pela FDA e instruções para o mesmo.

Em ainda outra forma de realização proporciona-se uma linha celular de hibridoma que produz um anticorpo que tem afinidade de ligação especifica para um polipéptido GEF-Hl ou um dominio de polipéptido.

Em ainda outra forma de realização, um anticorpo especifico para GEF-Hl é dirigido contra e liga-se a péptidos GEF-Hl fosforilados. Portanto, uma forma de realização compreende um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 3 que possui uma serina fosforilada. Preferentemente, a serina fosforilada nesse péptido é serina-810 da SEQ ID NO. 2. Em outra forma de realização, o anticorpo especifico para GEF-Hl é dirigido contra e liga-se a um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 4 em que a serina-67 está fosforilada. A numeração destas serinas nas SEQ ID NO. 3 e 4 como serina-810 e serina-67 respectivamente indica a numeração da sequência de proteínas de comprimento completo de GEF-Hl, especificamente GEF-HlS da SEQ ID NO. 2.

Outros péptidos descritos no presente documento incluem um péptido que compreende pelo menos um da SEQ ID NO. 6 ou da SEQ ID NO. 20. Em outra forma de realização proporciona-se um péptido que consiste essencialmente em pelo menos um da SEQ ID NO. 6 ou da SEQ ID NO. 20. Em ainda outra forma de realização proporciona-se um péptido de menos de 30 aminoácidos que compreende a sequência da SEQ 5 ID NO. 6. Em outra forma de realização, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 6 tem menos de 25 aminoácidos de comprimento. Preferentemente, este péptido tem menos de 20 aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização mais preferida, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 6 tem 18 aminoácidos de comprimento.

No presente documento também é descrito um péptido de menos de 30 aminoácidos que compreende a sequência da SEQ ID NO. 20. Em outra forma de realização, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 20 tem menos de 25 aminoácidos de comprimento. Preferentemente, este péptido tem menos de 20 aminoácidos de comprimento. Numa forma de realização mais preferida, o péptido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 20 tem 18 aminoácidos de comprimento.

Também são contemplados ácidos nucleicos que codificam proteínas GEF-Hl da presente invenção. Portanto, numa forma de realização proporciona-se um polinucleótido que compreende a sequência da SEQ ID NO. 1. Em outra forma de realização proporciona-se um polinucleótido que codifica o polipéptido descrito em qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3, 4, 6 ou 20. Em ainda outra forma de realização proporciona-se uma molécula de ácido nucleico que tem menos de 90 nucleótidos de comprimento e que codifica um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 3 ou na SEQ ID NO. 4. Preferentemente, o polinucleótido tem menos de 75 nucleótidos de comprimento, mais preferentemente menos de 60 nucleótidos de comprimento e mais preferentemente 54 nucleótidos de comprimento. A presente invenção também contempla um vector que compreende o polinucleótido que codifica uma proteína GEF-Hlb que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 2. Em outra forma de realização, o vector está presente numa célula. Em outra forma de realização, o vector compreende 6 um polinucleótido que compreende uma sequência da SEQ ID NO. 3 ou da 4. Em outra forma de realização, o vector está presente numa célula.

Outra forma de realização da invenção é uma célula que compreende um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleótidos de SEQ ID NO. 1. Em ainda outra forma de realização proporciona-se uma célula que contém uma proteína que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 2. Em outra forma de realização, a célula é uma célula bacteriana, fúngica ou de mamífero. A presente invenção proporciona um complexo de GEF-Hl/proteína isolado, em que uma proteína liga-se a GEF-Hl para formar o complexo. Numa forma de realização, a proteína no complexo é uma quinase activada por p21 ("PAK"). Numa forma de realização mais preferida, a PAK é PAK4, PAK5 e PAK6 também são descritas no presente documento. A presente invenção proporciona métodos para identificar substâncias tais como compostos, produtos químicos, fármacos, proteínas ou ácidos nucleicos que inibem ou modulam a interacção entre proteínas de GEF-Hl e PAK4, ou que inibem ou modulam a actividade de quinase de PAK4. Em outra forma de realização, uma substância identificada modula ou inibe que GEF-Hlb se ligue a PAK4, ou modula os níveis de expressão do gene GEF-Hl.

Em outro aspecto da invenção proporciona-se um método ("método 1") para detectar a actividade de PAK4 numa amostra. Este método compreende detectar a presença ou o nível de GEF-Hlb fosforilado na amostra, em que a detecção de GEF-Hlb fosforilado indica que a amostra também contém pelo menos uma PAK4 activa. Numa forma de realização, GEF-Hlb compreende a sequência descrita em qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3 ou 4. Em outra forma de realização, a PAK4 é detectada numa amostra de células. Em outra forma de realização, a amostra é uma preparação de proteínas isolada 7 de um lisado celular. Em outra forma de realização, as células são células tumorais. Numa forma de realização preferida, a célula tumoral está num mamífero. Em ainda outra forma de realização, o mamífero é seleccionado do grupo que consiste num ser humano, rato, ratinho, cão, coelho, porco, ovelha, vaca, cavalo, gato, primata, cabra ou macaco. Numa forma de realização muito preferida, o mamífero é um ser humano.

Em ainda outro aspecto, pela presente invenção proporciona-se um método de identificação de uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-Hlb. Este método compreende (a) expor o polipéptido GEF-Hlb a uma substância candidata para formar uma mistura; (b) introduzir na mistura uma enzima PAK4; e então (c) medir a quantidade de polipéptido GEF-Hlb fosforilado antes e depois de expor o polipéptido GEF-Hlb à substância candidata. Numa forma de realização, uma diminuição ou um aumento na quantidade de polipéptido GEF-Hlb fosforilado depois da exposição à substância candidata indica que a substância candidata é uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-Hlb. Numa forma de realização preferida, o polipéptido GEF-Hlb compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 ou SEQ ID NO. 4.

No presente documento também é descrito um método ("método 2") de identificação de uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-H1. Este método compreende (a) expor a PAK4 a uma substância candidata para formar uma mistura; b) introduzir na mistura um polipéptido GEF-Hl; e então (c) medir a quantidade de polipéptido GEF-Hl fosforilado, em que uma diminuição ou um aumento na quantidade de polipéptido GEF-Hl fosforilado em comparação com um controlo em que a PAK4 não é exposta à substância candidata indica que a substância candidata é 8 uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-Hl.

Numa forma de realização preferida, o polipéptido GEF-Hl compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 OU SEQ ID NO. 4.

Em outra forma de realização, a etapa de determinar se GEF-Hl é fosforilada nos métodos 1 ou 2 é realizada utilizando um anticorpo especifico para GEF-Hl dirigido contra um péptido que compreende pelo menos uma de serina-810 fosforilada da SEQ ID NO. 2 ou serina-67 fosforilada da SEQ ID NO. 2.

Numa forma de realização preferida, a substância candidata produz uma diminuição nos níveis totais de fosforilação de GEF-Hl.

Em outro aspecto, pela presente invenção proporciona-se um método ("método 3") para identificar uma substância que modula a interacção entre PAK4 e GEF-Hlb. Este método compreende (i) colocar em contacto uma substância candidata com um complexo de GEF-H1/PAK4 e então (ii) determinar se o composto causa a disrupção do complexo. Numa forma de realização preferida, GEF-Hlb compreende a sequência da SEQ ID NO. 2.

Usa-se ainda outro método ("método 4") descrito no presente documento para determinar se uma substância candidata inibe a actividade da quinase PAK4 num mamífero. Este método compreende (i) medir num mamífero o nível de fosforilação de uma proteína GEF-Hl que compreende a sequência da SEQ ID NO. 2; (ii) expor o mamífero a uma substância candidata; e então (iii) medir no mamífero o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl, em que uma diminuição no nível de fosforilação da proteína GEF-Hl na etapa (iii) com respeito ao nível medido na etapa (i) indica que a substância candidata é um inibidor da quinase PAK4. Em outra forma de realização, a detecção de proteínas de GEF-Hl fosforilado depois da administração da substância 9 candidata indica que o fármaco pode não inibir a actividade da quinase PAK4. Em outra forma de realização, a relação do nível de fosforilação de GEF-Hl antes da aplicação da substância candidata com respeito ao nível da fosforilação de GEF-Hl depois da aplicação da substância candidata também é determinada comparando a relação com um nível de "fundo" de células de fosforilação de GEF-Hl e/ou lisados celulares que não foram tratados com a substância candidata.

Numa forma de realização preferida, o mamífero é um ser humano, rato, ratinho, cão, coelho, porco, ovelha, vaca, cavalo, gato, primata, cabra ou macaco. Numa forma de realização muito preferida, o mamífero é um ser humano. A substância candidata identificada por qualquer um dos métodos descritos no presente documento pode ser utilizada, por exemplo, para tratar o cancro, reduzir a proliferação celular ou reduzir o crescimento celular independente de ancoragem. Portanto, descreve-se no presente documento um método ("método 5") para tratar o cancro num mamífero que compreende administrar ao mamífero uma substância identificada por um dos presentes métodos como moduladora ou inibidora da actividade de GEF-Hl ou moduladora ou inibidora da interacção de PAK4 e GEF-Hl.

Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um método ("método 6") para determinar a presença de PAK4 activada numa amostra de células. Preferentemente, a amostra de células é uma amostra de células tumorais. Este método compreende (i) obter um lisado celular de uma amostra de células; (ii) isolar e/ou separar as proteínas da preparação de lisado celular; e (iii) detectar a presença de fosfovariantes de GEF-Hl. Numa forma de realização, a detecção de fosfovariantes de GEF-Hl que têm a serina-810 ou serina-67 fosforilada indica que a amostra de células compreende a PAK4 activada. 10

Numa forma de realização preferida, o nível de fosforilação de GEF-Hl neste e em outros métodos descritos no presente documento é determinado utilizando células completas num ensaio de ELISA utilizando anticorpos específicos para GEF-Hl.

Outro aspecto da presente invenção implica num método in vitro ("método 1") para detectar a proliferação celular, a mobilidade celular e/ou a invasão celular num mamífero. Este método compreende monitorizar o nível de fosforilação de GEF-Hl em pelo menos dois pontos de tempo (isto é, o ponto de tempo A e pelo menos outro ponto de tempo B) numa amostra tomada do mamífero, em que um aumento no nível de fosforilação de GEF-Hl na amostra entre os pontos de tempo é indicativo de proliferação celular, mobilidade celular e/ou invasão celular

Numa forma de realização preferida, o GEF-Hl é uma proteína GEF-Hlb que compreende a sequência da SEQ ID NO. 2 .

Em ainda outra forma de realização, a amostra do método 7 é obtida da pele, sanque ou células de mamífero. Numa forma de realização, as células são células tumorais.

Em outra forma de realização, o mamífero é seleccionado do grupo que consiste num ser humano, rato, ratinho, cão, coelho, porco, ovelha, vaca, cavalo, gato, primata, cabra ou macaco. Mais preferentemente, o mamífero é um ser humano.

Em outro método ("método 8") descrito no presente documento, os péptidos que compreendem a sequência da SEQ ID NO. 3 ou 4 são administrados a células ou preparações de lisado celular para inibir competitivamente a fosforilação de proteínas de GEF-Hl endógenas. Numa forma de realização, estes péptidos são administrados em excesso, isto é, a uma alta concentração tal que se liguem essencialmente a todas as proteínas PAK4. Em outra forma de realização proporcionam-se péptidos de menos de 30 aminoácidos de 11 comprimento que compreendem tanto SEQ ID NO. 3 como SEQ ID NO. 4. Preferentemente, estes péptidos têm menos de 25 aminoácidos de comprimento, mais preferentemente menos de 20 aminoácidos de comprimento e mais preferentemente têm 18 aminoácidos de comprimento.

Portanto, no presente documento também é descrito um método ("método 9") para tratar o cancro num indivíduo que compreende inibir a actividade de GEF-Hl no indivíduo. Numa forma de realização preferida, o GEF-Hl é pelo menos um de GEF-Hla (GEF-HlM), GEF-Hlb (GEF-HlS) OU GEF-Hlc (GEF-HlU). Numa forma de realização muito preferida, o GEF-Hlb compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO. 2 .

Em outra forma de realização, a etapa de inibir a actividade de GEF-Hl compreende inibir a expressão de um gene endógeno que codifica o dito GEF-Hl. Em ainda outra forma de realização, a actividade de GEF-Hl é inibida em ou próxima a uma população de células cancerosas presentes no dito indivíduo. A expressão de um gene que codifica GEF-Hl pode ser inibida ou ser regulada negativamente por técnicas conhecidas na técnica tais como tecnologia de anti-sense e interferência de ARN. Por conseguinte, podem ser utilizados ácidos nucleicos de cadeia única ou dupla (isto é, ADN ou ARN) de acordo com tais métodos para provocar a perturbação, ou para terminar a tradução do transcrito de ARN associado a um gene GEF-Hl, ou afectar a transcrição do próprio gene GEF-Hl.

No presente documento também é descrito um método ("método 10") para reduzir a proliferação celular e o crescimento celular independente de ancoragem numa amostra de células que compreende inibir a actividade de GEF-Hl na amostra de células. Numa forma de realização, o GEF-Hl é pelo menos um de GEF-Hla (GEF-hlM) GEF-Hlb (GEF-HlS) ou GEF-Hlc (GEF-HlU). Em outra forma de realização, o GEF-Hl é 12 preferentemente GEF-Hlb que compreende a sequência de aminoácidos descrita na SEQ ID NO. 2.

Num aspecto da presente invenção proporciona-se um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 21, mas não outros aminoácidos de PAK do grupo II. Numa forma de realização preferida, o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina, com o que se evita a fosforilação mediada por PAK4 do factor de troca do nucleótido guanina ou é reduzido o nível de fosforilação mediada por PAK4 do factor de troca do nucleótido guanina. Em outra forma de realização, a ligação do "polipéptido da SEQ ID NO. 21" a um factor de troca do nucleótido guanina evita ou reduz o nível de fosforilação por quaisquer da fosforilação mediada por PAK do grupo II do factor de troca do nucleótido guanina à que está ligado o polipéptido. Numa forma de realização preferida, o polipéptido pode ser ligado aos aminoácidos 763-921 de GEF-Hlb (GEF-H1S).

De acordo com a presente invenção, um polipéptido pode compreender somente partes da SEQ ID NO. 21 na medida que o polipéptido ainda possa ser ligado a isoformas de GEF-Hl, e na medida que o polipéptido não compreenda nenhuma outra sequência de aminoácidos da proteína PAK4 ou de qualquer outra isoforma de PAK do grupo II. Portanto, um polipéptido da presente invenção pode compreender os aminoácidos 27 6-324 de PAK4 (isto é, SEQ ID NO. 21), ou os aminoácidos 280-324, ou os aminoácidos 285-324, ou os aminoácidos 291-324, ou os aminoácidos 298-322 (isto é, SEQ ID NO. 22).

Portanto, numa forma de realização, a presente invenção proporciona um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, ou que consiste essencialmente numa parte de SEQ ID NO. 21. Como é utilizado no presente documento, a frase "que consiste 13 essencialmente em" exclui outros aminoácidos de proteínas PAK do grupo II, excepto aqueles da SEQ ID NO. 21.

Em outra forma de realização, o polinucleótido isolado codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21.

Um polinucleótido que codifica SEQ ID NO. 21 pode se ligar operativamente a um segundo polinucleótido que codifica uma segunda proteína ou polipéptido sem relacionar com PAK. Portanto, a presente invenção prevê construções de ADN da SEQ ID NO. 21 e da SEQ ID NO. 22 que expressam proteínas de fusão que compreendem tanto a SEQ ID NO. 21 como a SEQ ID NO. 22 ou ambas, e pelo menos outra proteína ou polipéptido.

Em ainda outra forma de realização, o polinucleótido isolado codifica um polipéptido que tem pelo menos 70% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, e em que o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina.

No presente documento também é descrito um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22, mas não outros aminoácidos de PAK do grupo II. Numa forma de realização preferida, o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina, com o que é evitado ou é reduzido o nível de fosforilação mediada por PAK4 do factor de troca do nucleótido guanina. Em outra forma de realização, a ligação de tal "polipéptido da SEQ ID NO. 2" a um factor de troca do nucleótido guanina evita ou reduz qualquer fosforilação mediada por PAK do grupo II do factor de troca do nucleótido guanina à que está ligada o polipéptido.

No presente documento também é descrito um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22, ou que consiste essencialmente numa parte da SEQ 14 ID NO. 22. Como é utilizado no presente documento, a frase "que consiste essencialmente em" exclui outros aminoácidos de proteínas pak do grupo li, excepto aqueles da SEQ ID NO. 22 .

No presente documento também é descrito um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22.

No presente documento também é descrito um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que tem pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22, e em que o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina.

Em outro aspecto da presente invenção proporciona-se um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21. Numa forma de realização, o polipéptido compreende um marcador. Em outra forma de realização, o marcador é seleccionado do grupo que consiste em biotina, cauda de His, radiomarcação, fluoróforos e cromóforos.

No presente documento é descrito um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22. Numa forma de realização, o polipéptido compreende um marcador. Numa forma de realização preferida, o marcador é seleccionado do grupo que consiste em biotina, cauda de His, radiomarcação, fluoróforos e cromóforos. A presente invenção também proporciona um polipéptido que consiste essencialmente numa sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequências com a SEQ ID NO. 21, em que o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina.

Além disso, proporciona-se um polipéptido que consiste essencialmente numa sequência de aminoácidos que tem pelo menos 76% de identidade de sequências com a SEQ ID NO. 21, em que o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina. 15

Em ainda outro aspecto proporciona-se um polipéptido recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 7 0% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos denotada pelos residuos 276-324 da quinase 4 activada por p21, e pelo menos outra sequência de polipéptidos em que o polipéptido recombinante não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos residuos 1-275 da quinase 4 activada por p21 nem a sequência de aminoácidos denotada pelos residuos 325-985 da quinase 4 activada por p21. O polipéptido recombinante não compreende nenhuma outra sequência de polipéptidos de PAK do grupo II.

Numa forma de realização, o polipéptido compreende um marcador. Numa forma de realização preferida, o marcador é seleccionado do grupo que consiste em biotina, cauda de His, radiomarcação, fluoróforos e cromóforos.

Portanto, quaisquer dos polipéptidos da presente invenção podem ser marcados de maneira que possam ser detectados, ser manipulados facilmente ou ser isolados de uma amostra.

No presente documento é descrito um polipéptido que consiste essencialmente numa sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequências com a SEQ ID NO. 22 em que o polipéptido pode ser ligado a um factor de troca do nucleótido guanina.

No presente documento é descrito um polipéptido recombinante que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 298-324 da quinase 4 activada por p21, e pelo menos outra sequência de polipéptidos em que o polipéptido recombinante não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 1-297 da quinase 4 activada por p21, nem a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 325-985 da quinase 4 activada por p21. O polipéptido recombinante não 16 compreende nenhuma outra sequência de polipéptidos de PAK do grupo II.

No presente documento é descrito um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 70% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 276-324 da quinase 4 activada por p21. Numa forma de realização, este polipéptido não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 1-275 da quinase 4 activada por p21, e não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 325-985 da quinase 4 activada por p21. O polipéptido recombinante não compreende nenhuma outra sequência de polipéptidos de PAK do grupo II.

No presente documento é descrito um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 298-324 da quinase 4 activada por p21. Numa forma de realização, o polipéptido não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 1-297 da quinase 4 activada por p21, e não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 325-985 da quinase 4 activada por p21. O polipéptido recombinante não compreende nenhuma outra sequência de polipéptidos de PAK do grupo II. A presente invenção também prevê uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido que consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, ou parte da mesma. Numa forma de realização preferida, um polipéptido tal pode ser ligado a uma isoforma de GEF-H1. No presente documento também é descrita uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido que consiste essencialmente em ou consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 22. 17

No presente documento é descrito um método para detectar a presença de um factor de troca do nucleótido guanina numa amostra biológica. 0 método compreende: (i) incubar uma amostra biológica com um polipéptido derivado da quinase activada por p21, e (ii) determinar se algum dos polipéptidos derivados da quinase activada por p21 está ligado a um factor de troca do nucleótido guanina, em que (a) o polipéptido derivado da quinase activada por p21 compreende uma sequência de aminoácidos que tem pelo menos 90% de identidade de sequências com a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 298-324 da quinase 4 activada por p21, (b) o polipéptido derivado da quinase activada por p21 não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 1-297 da quinase 4 activada por p21, e (c) o polipéptido derivado da quinase activada por p21 não compreende a sequência de aminoácidos denotada pelos resíduos 325-985 da quinase 4 activada por p21.

Numa forma de realização, o polipéptido derivado da quinase activada por p21 compreende um marcador. Numa forma de realização preferida, o marcador é seleccionado do grupo que consiste em biotina, cauda de His, radiornarcação, fluoróforos e cromóforos.

Em outra forma de realização do método, a etapa de determinar se algum dos polipéptidos derivados da quinase activada por p21 está ligado a um factor de troca do nucleótido guanina compreende extrair polipéptido derivado da quinase activada por p21 radiomarcado não ligado da amostra biológica, e então medir o nível de radioactividade na amostra.

No presente documento é descrito um método para inibir a fosforilação mediada por PAK4 de um factor de troca do nucleótido guanina. Este método compreende expor um factor de troca do nucleótido guanina a um polipéptido que 18 consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, em que o polipéptido se liga ao factor de troca do nucleótido guanina, sendo inibida portanto, alguma ou toda a fosforilação mediada por PAK4 do factor de troca do nucleótido guanina. É possível que a fosforilação de GEF-Hl por outras proteínas PAK do grupo II também possa ser inibida similarmente por este método.

Numa forma de realização, o factor de troca do nucleótido guanina está numa amostra biológica tal como num tecido, células cultivadas ou células isoladas. Em outra forma de realização, a amostra biológica é obtida de um mamífero. Numa forma de realização preferida, o mamífero é um ser humano, ratinho, rato, porco, vaca, coelho, cão, gato, cavalo, cabra, primata ou macaco. Numa forma de realização muito preferida, o mamífero é um ser humano.

Em outra forma de realização, a etapa de expor o factor de troca do nucleótido guanina ao polipéptido compreende administrar a um mamífero uma composição farmacêutica que compreende o polipéptido. Numa forma de realização preferida, a composição farmacêutica que compreende o polipéptido é qualquer uma de um comprimido, aerossol, pó, líquido, gel, creme, supositório. A presente invenção também proporciona um método para identificar uma molécula que rompe uma interacção entre PAK 4 e um factor de troca do nucleótido guanina. Este método compreende (a) expor um factor de troca do nucleótido guanina a um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, em que o polipéptido se liga ao factor de troca do nucleótido guanina para formar um complexo; (b) adicionar uma ou mais moléculas de teste ao complexo; e (c) determinar se o polipéptido e o factor de troca do nucleótido guanina são dissociados um do outro depois de adicionar a(s) molécula(s) de teste ao complexo. 19

No presente documento também é descrito um método para inibir a fosforilação mediada por PAK4 de uma isoforma de GEF-Hl que compreende introduzir numa célula um vector que compreende um polinucleótido que codifica o polipéptido de SEQ ID NO. 21, em que o polinucleótido é expresso para produzir o polipéptido, e em que o polipéptido se liga a uma isoforma de GEF-Hl na célula, deste modo inibindo a fosforilação de PAK4. Numa forma de realização preferida, o vector não codifica nenhuma outra sequência de polipéptidos de pak do grupo ii.

Por "inibir" é entendido que toda, a maioria ou algo da actividade de fosforilação normal de uma proteína PKA, especialmente a de PAK4, é reduzida quando um polipéptido que contém GID está ligado a uma isoforma de GEF-Hl. "GID" é definido a seguir.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Figura 1: Ligação directa de GEF-Hl a PAK4. Foram preparados lisados a partir de células 293T que expressam em excesso (a) alelos ou subdomínios de PAK4 marcados com myc e foram incubados com GST, GST-GEF-Hl (787-921) e GST-similar a Maguin ligado a pérolas de glutationa (designação de pérolas 1,2,3,4) ou (b) GFP-GEF-H1 e foi incubado com péptidos biotinilados com PAK4 (291-355) e (276-324) ligados a pérolas de estreptavidina. Foi utilizada uma quantidade equivalente de pérolas e lisados em excesso (500 ug) . Os eluatos de pérolas e os lisados totais foram analisados por SDS-PAGE e foram imunotransferidas com myc ou anti-soro GEF-Hl; (c) representa um gene PAK4 que explica esquematicamente as regiões de PAK4 utilizadas para identificar o domínio de interacção de GEF-Hl (GID). d, alinhamento do GID definido pela região de ligação mínima de PAK4 com PAK5 e PAK6.

Figura 2: A interacção entre PAK4 e GEF-Hl é produzida em células tumorais. (a) Lisados de células tumorais 20 humanas de A54 9, HCT116 e H1299 foram imunoprecipitadas com pérolas de proteína G ligada a soros pré-imunitários anti-PAK4, anti-GEF-Hl e anti-PAK4. Os eluatos de pérolas foram analisados por transferência Western utilizando anti-soro anti-GEF-Hl. (b) Dupla imunofluorescência de células H 1299 que mostram a co-localização de PAK4 e GEF-Hl (vermelho) com a proteína β-COP associada a cis-golgi (verde) e co-localização parcial com o marcador de trans-Golgi, aglutinina de germe de trigo (azul).

Figura 3: PAK4 fosforila GEF-Hl in vitro e in vivo. (a) O ensaio de quinase in vitro mostra que GST, GST-GEF-Hl (763-921) e GST-proteína similar a Maguin purificadas estão fosforiladas por PAK4. A reacção de autofosforilação de controlo negativo é a mistura de reacção sem substrato. Um gradiente de concentração do substrato de reacção está indicado pelos triângulos; (b) Um consenso de substrato de PAK4 ponderado foi alinhado com os acertos de expressão em fago (em cima da linha descontinua) . 0 asterisco indica o sítio aceitador de fósforo (phospho-acceptor) . Um péptido GEF-Hl do extremidade amino (debaixo da linha descontinua) com um sítio de fosforilação predito está marcado com (c) A fosforilação in vivo de GEF-Hl por PAK4 é demonstrada numa transferência Western de lisados co-transfectados que foram sondados com anti-soros anti-HA fosfoespecificos (painel inferior) . A quantidade de GEF-Hl total foi detectada com anti-soro HA (painel superior).

Figura 4: Efeitos morfológicos de alelos de GEF-Hl. As células NIH-3T3 foram transfectadas com alelos de GEF-Hl marcados com EGFP; GEF-H1S (I), GEF-H1SS810A (II), GEF-H1S S67A (III), GEF-H1S S67,810A (IV), GEF-Hl Q312M,R313G (V) e o vector EGFP (VI). Foi utilizada a fluorescência de GFP para detectar a expressão de GEF-Hl (painéis esquerdos) e foi utilizada faloidina fluorescente para monitorizar as transposições citoesqueléticas (painéis direitos). 21

Figura 5: PAK4 regula a formação de lamelipódios e a atenuação de fibras de stress por meio da fosforilação de Ser810. (a) Foram transfectadas células NIH-3T3 com alelos de PAK4 e de GEF-H1S e foram examinadas por obtenção de imagens de fluorescência de EGFP para os alelos de GEF-Hl, foram identificadas construções de PAK4 por imunocoloração utilizando anti-soro HA, seguido de conjugado de rodamina fluorescente anti-ratinho para PAK4 e cumarina-faloidina fluorescente para marcar actina. a, PAK4 (I) e os mutantes PAK4 S474E (II) e PAK4 K350,351 A (III) foram co-transfectados com a EGFP de controlo, b, GEF-H1S foi co-transfectada com alelos de PAK4 como para a, (I-III). GEF-HlS S810A, GEF-H1S S67A e GEF-H1S Q312M,R313G junto com PAK4 S474E (iv-vi). As setas destacam a indução de lamelipódios para células que co-expressam PAK4S474E e GEF-HlS ou GEF-H1S S67A. Os asteriscos marcam células com indução de fibras de stress. A barra de escala representa 10 pm.

Figura 6: Sinalização de PAK4 através de GEF-H1M para os citoesqueletos de actina e MT. As células NIH-3T3 foram co-transfectadas com GEF-Hl e PAK4. A expressão de GEF-Hl e PAK4 foi detectada por obtenção de imagens de fluorescência de EGFP para o anti-soro de GEF-Hl e PAK4 (n° 933), seguido de rodamina fluorescente anticoelho para PAK4. Foi utilizada cumarina-faloidina fluorescente para examinar o citoesqueleto de actina. Foi utilizada anti-p-tubulina seguido de conjugado de azul marinho anti-ratinho para corar o citoesqueleto de MT. Em (a) são mostrados GEF-HlM junto com PAK4 e o mutante PAK4 S474E. As setas marcam os lamelipódios ricos em actina em células que co-expressam GEF-HlM e o mutante PAK4 S474E; (b) São mostrados GEF-HlM junto com o vector e os mutantes PAK4 S474E e PAK4 K350,351 A. Observe-se a dissolução parcial não polarizada do citoesqueleto de MT em presença do mutante PAK4 S474E. A barra de escala representa 10 pm. 22

Figura 7: Modelo para a regulação recíproca de Rac e Rho in vivo. (a) GEF-Hl num estado não fosforilado retém a actividade de Rho constitutiva basal; (b) PAK4 pode regular GEF-Hl por meio da fosforilação conduzindo à activação e à inibição simultânea de Rac da sinalização de Rho constitutiva.

Figura 8. Pontuações de fosforilação de proteínas e péptidos GEF-Hl. (a) Foram utilizados fosfoisómeros de péptidos derivados de possíveis regiões reguladoras para confirmar os sítios de fosforilação. Os resíduos impressos em vermelho estão pré-fosforilados e bloqueiam a fosforilação in vitro; (b) Foi utilizada uma combinação de mutantes de deleção e dirigidos a sítios utilizados para a fosforilação de PAK4 fisicamente localizada na proteína GEF-Hl .

Figura 9. Conservação de GEF-Hl com Cdc24. A conservação de resíduos com Cdc24 está sombreada em rosa e amarelo. Os sítios de fosforilação de PAK4 estão marcados com asteriscos no consenso ponderado que está alinhado com as regiões reguladoras putativas conservadas com Cdc24. A Figura 10 é um esquema do gene GEF-H1S que ilustra as posições dos resíduos de serina 67 e 810 fosforilados em relação com domínios chave da proteína GEF-H1S; o chamado domínio "DH" e o domínio "PH".

DESCRIÇÃO DETALHADA DAS FORMAS DE REALIZAÇÃO PREFERIDAS

No documento U.S. 60/393.600, diversas isoformas de GEF-Hl foram denotadas "GEF-Hla", "GEF-Hlb" e "GEF-Hlc". Essas mesmas isoformas também são denotadas agora no presente documento "GEF-H1M", "GEF-H1S" e "GEF-H1U". Por conseguinte, "GEF-Hla" é a mesma que "GEF-H1M"; "GEF-Hlb" é a mesma que "GEF-HlS"; e "GEF-Hlc" é a mesma que "GEF-Hlu".

Destas isoformas de splice de GEF-Hl, GEF-HlS (GEF-Hlb) consiste essencialmente nos resíduos 1-921 de GEF-Hl, e também contém um "mini-exão" de 7 aminoácidos. GEF-HlS 23 (GEF-Hlb) não compreende um domínio de dedo de zinco no N terminal. Pelo contrário, a sequência de aminoácidos de GEF-HlM (GEF-Hla) contém um domínio de dedo de zinco que participa na ligação a microtúbulos. A sequência de GEF-HlM (GEF-Hla) é idêntica à versão de comprimento completo de GEF-Hl, isto é, os resíduos 1-985 descritos em Krendel et al., anteriormente.

Portanto, a presente invenção proporciona uma nova isoforma de GEF, "GEF-H1S (GEF-Hlb)", que é um biomarcador de proliferação celular e um alvo para seleccionar fármacos candidatos para tratar o cancro. Os inventores descobriram que detectando um certo estado de fosforilação de isoformas de GEF-Hl podiam determinar se uma célula é tumorigénica ou não ou mostra crescimento celular anormal. 0 GEF-Hl é um factor de troca do nucleótido guanina que pertence à "família Dbl" de factores de troca (Ren et al., J. Biol. Chem., 273(52); 34954-60, 1998). Um novo gene GEF-H1S (SEQ ID NO. 1) descrito no presente documento compreende 2763 nucleótidos e codifica uma proteína (SEQ ID NO. 2) de 921 aminoácidos que tem um peso molecular predito de aproximadamente 104 kD. Todos os membros da família, incluindo GEF-H1S (GEF-Hlb), têm em comum os domínios "DH" e "PH". Vejam-se, Chan, et al., Oncogene, 9(4):1057-63, 1994; e Musacchio et al., Trends Biochem. Sei., 18(9):343-8, 1993. Normalmente, a actividade enzimática reside no domínio DH que facilita a troca de GDP por GTP em proteínas que pertencem à superfamília Ras de Rho GTPases. O domínio DH de GEF-H1S (GEF-Hlb) (isto é, SEQ ID NO. 2) está localizado dentro dos aminoácidos que residem nas posições 162 e 354 da proteína GEF-H1S (GEF-Hlb). O domínio PH está localizado entre os aminoácidos 396 e 496. A presente invenção também refere-se a péptidos GEF-Hl que não compreendem o domínio DH, mas compreendem um ou mais sítios de fosforilação. 24

Como é descrito em detalhe a seguir, as células que expressam em excesso GEF-Hl são independentes da ancoragem e proliferam anormalmente. Além disso, tais células podem formar tumores quando são implantadas em ratinhos sem pêlo atimicos. Por conseguinte, pode ser evitada ou ser reduzida a incidência de um fenótipo tal regulando negativamente ou inibindo a expressão de GEF-Hl. A nova proteína GEF-H1S (GEF-Hlb) que tem a sequência descrita na SEQ ID NO. 2 está associada a, e fosforilada por, a serina/treonina-proteína quinase, quinase 4 activada por ρ21 ("PAK4"). Duas regiões na proteína GEF-H1S (GEF-Hlb) estão fosforiladas por PAK4, concretamente a serina-810 e a serina-67. "Serina-810" e "serina-67" referem-se a aminoácidos nas posições 810 e 67 da proteína GEF-HlS (GEF-Hlb) , isto é, da SEQ ID NO. 2. No entanto, outras proteínas GEF-Hl também compreendem resíduos de serina nessas posições e dentro do sítio de reconhecimento da fosforilação geral. O "sítio de reconhecimento da fosforilação" refere-se a curto estiramento de resíduos de aminoácidos em qualquer lado do resíduo de serina/treonina fosforilável que é reconhecido por uma quinase particular. Por conseguinte, os termos "serina-810" e "serina-67" referem-se a resíduos de serina fosforiláveis em qualquer uma de várias proteínas de GEF-Hl. É concebível que um resíduo de treonina nessas posições (isto é, nas posições 810 e 67 de SEQ ID NO. 2) também estaria fosforilado por uma quinase.

Portanto, qualquer péptido GEF-Hl que compreenda as serinas denotadas (em negrito, sublinhadas) nos resíduos 807-824, RRRSLPAGDALILSFNPP (SEQ ID NO. 3) e nos resíduos 55-72, RQSLLGSRRGRSSLSLAK (SEQ ID NO. 4) está fosforilado por PAK4. Outras proteínas de GEF-Hl incluem GEF-HlM e GEF-HlU. O anterior é descrito em Ren et al.r J. Biol. Chem., 273(52): 34954-60, 1998; e Krendel et al., Nat. Cell Biol., 4(4):-294-301, 2002. GEF-HlU é descrito em Reddy & 25

Chatterjee, Câncer Res., 49(7): 1763-7, 1989. A presente invenção prevê péptidos de menos de 30 aminoácidos de comprimento que compreendem tanto SEQ ID NO. 3 como SEQ ID NO. 4. Preferentemente, estes péptidos têm menos de 25 aminoácidos de comprimento, mais preferentemente menos de 20 aminoácidos de comprimento e mais preferentemente têm 18 aminoácidos de comprimento. Por conseguinte, a presente invenção também contempla polinucleótidos que codificam péptidos que compreendem a sequência de tanto a SEQ ID NO. 3 como a 4. isto é, a presente invenção prevê polinucleótidos de menos de 90 nucleótidos de comprimento que codificam um péptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 3 ou na SEQ ID NO. 4. Preferentemente, o polinucleótido tem menos de 75 nucleótidos de comprimento, mais preferentemente menos de 60 nucleótidos de comprimento e mais preferentemente 54 nucleótidos de comprimento.

Por conseguinte, a serina-810 e a serina-67 destas isoformas de GEF-Hl estarão fosforiladas em presença de PAK4. Portanto, enquanto a presente invenção contempla a medição da fosforilação de GEF-HlS (GEF-Hlb) como um indicador da actividade de PAK4, a invenção também engloba a fosforilação de isoformas de GEF-H1M (GEF-Hla) e GEF-H1U (GEF-Hlc). Portanto, o nivel de fosforilação "total" de GEF-Hl é indicativo dos estados de fosforilação acumulados de proteínas de GEF-Hl que compreendem uma sequência de péptidos descrita na SEQ ID NO. 3 ou na 4; isto é, GEF-Hl M, GEF-HlS e GEF-H1U.

Esta informação conduz à predição de que uma sequência consenso de fosforilação para GEF-Hl é, desde o N terminal até o C terminal, "RBSZXG" (SEQ ID NO. 6) ou "RBSZXL", (SEQ ID NO. 20), nas que R é arginina, B é um aminoácido básico, S é serina, Z é um aminoácido hidrófobo, X é qualquer aminoácido, G é glicina e L é leucina. Em alguns sítios de fosforilação em GEF-Hl, o resíduo de aminoácido do C 26 terminal é uma glicina, enquanto em outros sítios o resíduo é uma leucina. Por conseguinte, qualquer péptido que compreenda esta estrutura de sequência consenso é possivelmente um alvo para a fosforilação por PAK4, e tais péptidos podem ser utilizados em ensaios de acordo com a presente invenção. Além disso, qualquer péptido que consista essencialmente nas sequências consenso RBSZXG e/ou RBSZXL é possivelmente um alvo para a fosforilação por PAK4, e tais péptidos podem ser utilizados em ensaios de acordo com a presente invenção. PAK4 é expressado em excesso em linhas de células tumorais humanas e, junto com outros membros da família PAK de quinases, participa na requlação da morfologia e a mobilidade celular. Vejam-se, por exemplo, Callow et al., J. Biol. Chem., 4; 277 (1) : 550-8, 2002; Abo et al., EMB J., 17(22):6527-40, 1998; Gnesutta et al., J. Biol. Chem, 276(17):14414-9, 2001; Qu et al., Mol. Cell Biol., 21 (10):3523-33, 2001; e Dan et al., J. Biol. Chem., 276(34):32115-21, 2001. A proteína "PAK4" denominada no presente documento também é descrita no documento WO 99/53036 e na patente dos e.u.a. n° 6.013.500. Outras enzimas PAK podem fosforilar proteínas de GEF tais como GEF-Hl. Contempla-se que PAK5 e PAK6 possam fosforilar um GEF-Hl que compreende os sítios de fosforilação da SEQ ID NO. 3 ou da 4. A PAK5 foi descrita por Pandey et al., Oncogene, 21 (24): 3939-48, 2002 e Dan et al., Mol. Cell

Biol., 22(2): 567-77, 2002. PAK6 é descrito em Yang et al., J. Biol. Chem., 276(18): 15345-53, 2001. A expressão em excesso de PAK4 induz a polimerização de actina localizada e a formação de filopódios, e por conseguinte, as mudanças no citoesqueleto de actina da célula podem ser atribuídas à actividade de PAK4. Além disso, as quinases PAK participam no crescimento celular independente de ancoragem oncogénica activada por Ras e na regulação da sobrevivência celular. Callow et al., 2002, 27 por exemplo, demonstraram que uma PAK4 activada tem a capacidade de transformar células, mas que a forma inactiva ("sem actividade de quinase") bloqueia a proliferação celular independente de ancoragem dependente de Ras. Em geral, as células tumorais não requerem ancoragem e podem crescer em suspensão. A proliferação celular independente de ancoragem é um distintivo de células tumorigénicas. Por conseguinte, a PAK4 está fortemente implicada em tumorigénese e pode ser particularmente importante para a transformação de Ras.

Desde esse ponto de vista, os estudos descritos no presente documento revelam que GEF-Hl é um substrato para PAK4, e que está fosforilado pela forma activada da quinase. Por conseguinte, por meio da detecção do estado de fosforilação de GEF-Hl pode ser determinado se PAK4 é activa ou inactiva. Portanto, pode ser determinado se uma célula ou amostra de tecido está proliferando ou mostrando sinais de crescimento ou morfologia celular anormal. Portanto, o GEF-Hl é um excelente biomarcador de actividade de PAK4 e é extremamente útil para seleccionar fármacos e compostos que podem bloquear a actividade de PAK4. Por exemplo, um fármaco que altera o estado de fosforilação de GEF-Hl pode ser um que age directa ou indirectamente para inibir a quinase PAK4 e assim melhorar, reduzir ou idealmente suprimir a proliferação celular. Portanto, por meio da monitorização do padrão de fosforilação de GEF-Hl em presença e ausência de fármacos candidatos podem ser identificados possíveis terapêuticas contra o cancro.

Um ensaio neste contexto implica (i) obter um lisado celular de uma amostra de teste; (ii) isolar e/ou separar proteínas da preparação de lisado celular; e (iii) detectar a presença de fosfovariantes de GEF-Hl, isto é, proteínas de GEF-Hl fosforilado com serina-810 e/ou serina-67. A este respeito podia ser determinado se o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl total no lisado celular da amostra de 28 teste é anormal comparando esse nível com o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl total isolada de uma amostra de células de controlo. Uma amostra de células de controlo é uma amostra de células que são do mesmo tipo de células que a amostra de teste, mas que são isoladas de um mamífero ou de uma fonte que é conhecida por ser saudável, isto é, de células naturais de mamífero. A amostra de células de controlo pode ser isolada do mesmo indivíduo do qual é isolada a amostra de células de teste. 0 mamífero pode ser um ser humano, rato, ratinho, cão, coelho, porco, ovelha, vaca, cavalo, gato, primata, cabra ou macaco.

Portanto, espera-se que a relação do nível de fosforilação de GEF-Hl entre as amostras de teste e de controlo seja maior em amostras de teste que possuem tanto (i) um maior número de quinases PAK4 activas como (ii) que possuem enzimas quinase PAK4 com uma taxa mais rápida de actividade catalítica. É provável que as células que participam na mobilidade, proliferação e invasão celular tenham, por exemplo, maior actividade de PAK4 e, Portanto, um maior nivel de fosforilação de GEF-Hl que outros tipos de células imóveis. A este respeito, células tumorais e células do sistema imunitário (isto é, macrófagos) são exemplos de células que participam na mobilidade, proliferação e invasão celular. Exemplos de células tumorais incluem aquelas de cancros de tecidos e cancros de origem hematopoiética.

As etapas (iii) do método explicadas resumidamente no parágrafo precedente podem ser conseguidas utilizando anticorpos específicos para GEF-Hl. Portanto, a presente invenção proporciona anticorpos fosfoespecíficos que seleccionam como alvo a forma fosforilada de GEF-Hl.

Para medir o estado de fosforilação de GEF-Hl pode ser empregado qualquer um de vários protocolos conhecidos. Por exemplo, podem ser detectados anticorpos fosfoespecíficos que se ligam a GEF-Hl ou complexos de GEF-Hl-ΡΑΚ como são 29 descritos no Exemplo 9 a seguir. Um complexo de GEF-Hl-PAK refere-se a uma interacção fisica entre a proteína GEF-Hl e uma proteína pka de forma que as duas proteínas estejam ligadas entre si. As proteínas do complexo podem ou podem não ser dissociadas uma da outra durante um período de tempo. Preferentemente, o complexo de GEF-Hl-PAK é um complexo de GEF-H1S-PAK4. Neste contexto, o GEF-H1S (GEF-Hlb) do complexo compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 2.

Alternativamente, a fosforilação pode ser medida manipulando uma proteína verde fluorescente (GFP) híbrida para ser ligada a um anticorpo de cadeia única que tem alta afinidade para as formas fosforiladas e não fosforiladas de péptidos GEF-Hl representados pelas SEQ ID NO. 3 e 4. Então seria monitorizado o grau de ""extinção da fluorescência" utilizando espectroscopia de fluorescência como é descrito por Deo e Daunert, Anal. Biochem., 289(1): 52-9, 2001. O híbrido de GFP sofre uma mudança conformacional após a fosforilação do péptido GEF-Hl, produzindo desse modo um tipo diferente de fluorescência que é facilmente e imediatamente detectada e quantificada.

Na mesma linha, um substrato de péptidos biotinilados derivado das formas sem fosforilar de péptidos GEF-Hl da SEQ ID NO. 3 e da 4 pode se ligar a GFP. Espera-se que a posterior fosforilação por PAK4 produza a extinção da fluorescência como foi mencionado anteriormente. A biotina permite medições colorimétricas e de luminescência em que não se pode usar fluorescência. Por exemplo, como as substâncias que inibem a actividade de PAK4 também evitam a fosforilação do substrato, tais como os péptidos GEF-Hl, existirá pouca ou nenhuma mudança na conformação dos péptidos e, por conseguinte, pouca ou nenhuma mudança na fluorescência de GFP. No entanto, um marcador de biotina facilita a medição de fosforilação, e a ausência da mesma, em presença de substâncias inibidoras candidatas. 30

Ainda outro método útil para medir o grau de fosforilação de GEF-Hl é a "transferência de energia por ressonância de fluorescência" (fret). Veja-se Sato et al., Nat. Biotechnol., 20(3): 287-94, 2002. Este método mede a transferência de grupos fosfato entre o domínio de reconhecimento da fosforilação de PAK4 e os péptidos substrato GEF-Hl (ou derivados) (tais como aqueles de SEQ ID NO. 3 e 4) como indicador da fosforilação. O ensaio de deslocamento de gel é ainda outra forma na que pode ser detectado a fosforilação de uma proteína. Veja-se Wegener et al., J. Biol. Chem., 259(3): 1834-41, 1984 . A presente invenção usa um ensaio de lisado celular baseado em bioquímica e um método radioactivo para monitorizar, registar e detectar mudanças na fosforilação da proteína GEF-Hl total e péptidos derivados de GEF-Hl por PAK4. Vejam-se os Exemplos 14 e 15 a seguir. No ensaio celular são utilizados anticorpos fosfoespecíficos para GEF-Hl para detectar a presença de GEF-Hl fosforilado em preparações de lisado celular. Os anticorpos que são específicos para GEF-Hl podem ser gerados por qualquer uma de várias técnicas. Por exemplo, os anticorpos podem ser produzidos em coelhos. Veja-se Nims et al., Lab Anim. Sei., 23(3):391-6, 1973. Os anticorpos podem ser produzidos contra epítopos que são únicos ou específicos para uma proteína particular. Por exemplo, podem ser produzidos anticorpos contra o péptido conjugado com KLH C S GD RRRAGP E KRP KS S como foi demonstrado previamente para PAK4. Veja-se, Hashimura et al., J. Immunol. Methods, 55(3) :375-87, 1982 .

Similarmente, também podem ser gerados anticorpos específicos para GEF-Hl em coelhos. Especificamente, podem ser produzidos anticorpos contra as regiões de GEF-Hl fosforiladas por PAK4; isto é, para regiões de GEF-H1S 807-824 (SEQ ID NO. 3) e 55-72 (SEQ ID NO. 4). Os anticorpos 31 também podem ser produzidos para as versões modificadas de fosfato destes péptidos. Num modo tal, podem ser desenhados anticorpos que são específicos para variantes tanto não fosforiladas como fosforiladas de GEF-Hl.

Por meio da ligação de um anticorpo para PAK4 a uma superfície, tal como à superfície de pérolas, podem ser capturadas proteínas PAK4 presentes em células lisadas. Por conseguinte, qualquer proteína PAK4 presente no lisado celular será ligada à superfície ou pérolas em virtude da sua interacção com o anticorpo ligado à superfície/pérola. Além disso, se GEF-Hl também está presente na preparação, os complexos de GEF-H1/PAK4 podem ser isolados do mesmo modo. As células podem ser aquelas de linhas celulares estabelecidas de linhagem conhecida. Por exemplo, podem ser preparados lisados celulares a partir de linhas celulares tumorais e serem submetidas a tratamento com anticorpos fosfoespecíficos como foi descrito anteriormente e no Exemplo 14.

Um anticorpo pode ser um anticorpo monoclonal ou policlonal, ou fragmento de anticorpo que tem afinidade de ligação específica para um polipéptido GEF-Hl, domínio ou fragmento do mesmo. "Afinidade de ligação específica" significa que o anticorpo se liga a um polipéptido alvo com maior afinidade que se liga a outros polipéptidos sob condições específicas. Preferentemente, o anticorpo liga-se a um polipéptido GEF-Hl que compreende a sequência descrita em qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3 ou 4. Mais preferentemente, o anticorpo liga-se a um polipéptido que compreende a sequência descrita na SEQ ID NO. 3 ou na 4. Os anticorpos para GEF-Hl também podem ser ligados a variantes fosforiladas de isoformas de GEF-Hl. Por conseguinte, estes anticorpos ligam-se a versões fosforiladas dos péptidos descritos em SEQ ID NO. 2, 3 e 4. Num modo tal, podem ser produzidos anticorpos que se ligam a péptidos que 32 compreendem serinas fosforiladas, 810 e 67, das proteínas de GEF-H1. O termo "policlonal" refere-se a anticorpos que são populações heterogéneas de moléculas de anticorpos derivadas dos soros de animais imunizados com um antigénio ou um derivado funcional antigénico das mesmas. Para a produção de anticorpos policlonais podem ser imunizados diversos animais hospedeiros por meio de injecção com o antigénio. Podem ser utilizados diversos adjuvantes para aumentar a resposta imunológica, dependendo das espécies de hospedeiras.

Os "anticorpos monoclonais" são populações substancialmente homogéneas de anticorpos para um antigénio particular. Podem ser obtidos por qualquer técnica que proporcione a produção de moléculas de anticorpos por meio de linhas celulares contínuas em cultura. Os anticorpos monoclonais podem ser obtidos por meio de método conhecidos para aqueles peritos na especialidade. Vejam-se Kohler et al., Nature, 256:495-497, 1975, e a patente dos E.U.A. n° 4.376.110.

Um anticorpo da presente invenção inclui anticorpos monoclonais e policlonais "humanizados". Os anticorpos humanizados são proteínas recombinantes em que as regiões determinantes da complementaridade não humanas (normalmente murinas) de um anticorpo foram transferidas das cadeias variáveis pesadas e leves da imunoglobulina não humana (por exemplo, murina) a um domínio variável humano, seguido da substituição de alguns resíduos humanos nas regiões estruturais de seus homólogos murinos. Os anticorpos humanizados de acordo com a presente invenção são adequados para utilização em métodos terapêuticos. As técnicas gerais para clonar domínios variáveis de imunoglobulinas murinas são descritas, por exemplo, pela publicação de Orlandi et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 86: 3833, 1989. As técnicas para produzir anticorpos monoclonais humanizados são 33 descritas, por exemplo, por Jones et ai., Nature 321:522, 1986; Riechmann et al., Nature 332:323, 1988; Verhoeyen et al., Science 239:1534, 1988; Cárter et al., Proc. Nat'1 Acad. Sei. USA 89:4285, 1992; Sandhu, Crit. Rev. Biotech. 12:437, 1992; e Singer et al., J. Immun. 150:2844 1993. O termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma parte de um anticorpo, frequentemente a região hipervariável e porções das cadeias pesadas e leves de ao redor, que amostra afinidade de ligação especifica para uma molécula particular. Uma região hipervariável é uma parte de um anticorpo que se liga fisicamente ao alvo de polipéptido.

Um fragmento de anticorpo da presente invenção inclui um "anticorpo de cadeia única", um termo usado nesta descrição para denotar um polipéptido linear que se liga a antigénio com especificidade e que compreende regiões variáveis ou hipervariáveis das cadeias pesadas e leves de um anticorpo. Tais anticorpos de cadeia única podem ser produzidos por metodologia convencional. As regiões Vh e VI do fragmento Fv podem ser ligadas covalentemente e ser estabilizadas por meio da inserção de uma ligação dissulfeto. veja-se Glockshuber, et al., Biochemistry 1362, 1990. Alternativamente, as regiões Vh e VI podem ser ligadas por meio da inserção de um ligante (linker) peptidico. Um gene que codifica as sequências de Vh, VI e o ligante peptidico podem ser construídos e expressos utilizando um vector de expressão recombinante. Veja-se Colcher, et al., J. Nat'1 Câncer Inst. 82: 1191, 1990. Também podem ser construídas sequências de aminoácidos que compreendem regiões hipervariáveis das cadeias de anticorpos Vh e VI utilizando ligações dissulfeto ou ligantes de péptidos.

Os anticorpos da presente invenção podem ser marcados utilizando, por exemplo, marcadores fluorescentes ou marcadores radioactivas. 34

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpos que têm afinidade de ligação especifica para um GEF-Hl ou péptido derivado da invenção podem ser utilizados em método para detectar a presença e/ou a quantidade desse polipéptido numa amostra (i) sondando a amostra com o anticorpo em condições adequadas para a formação do imunocomplexo alvo-anticorpo e (ii) detectando a presença e/ou a quantidade do anticorpo conjugado com o polipéptido desejado. Os kits de diagnóstico para realizar tais métodos podem ser construídos para incluir anticorpos ou fragmentos de anticorpos específicos para o alvo, além de um conjugado de um componente de ligação dos anticorpos ou os próprios anticorpos.

Um "péptido derivado" de GEF-Hl é um péptido que compreende uma sequência de aminoácidos que é parte da proteína GEF-Hl completa maior. Por exemplo, os péptidos que compreendem as sequências descritas na SEQ ID NO. 3 e na 4 são "péptidos derivados" da proteína GEF-Hl.

Um anticorpo ou fragmento de anticorpo com afinidade de ligação específica para um polipéptido GEF-Hl ou PAK4 da invenção pode ser isolado, enriquecido ou purificado a partir de um organismo procariota ou eucariota. Os métodos rotineiros conhecidos para aqueles peritos na especialidade permitem a produção de anticorpos ou fragmentos de anticorpos em organismos tanto procariotas como eucariotas. A purificação, o enriquecimento e o isolamento de anticorpos, que são moléculas de polipéptidos, são descritos acima.

Os anticorpos que têm afinidade de ligação específica para um polipéptido alvo da invenção podem ser utilizados em método para detectar a presença e/ou a quantidade de polipéptido alvo numa amostra contactando a amostra com o anticorpo em condições tais que seja formado um imunocomplexo e detectar a presença e/ou a quantidade do anticorpo conjugado com o polipéptido alvo. Os kits de 35 diagnóstico para realizar tais métodos podem ser construídos para incluir um primeiro recipiente que contém o anticorpo e um segundo recipiente que tem um conjugado de um componente de ligação do anticorpo e um marcador tal como, por exemplo, um radioisótopo. 0 kit de diagnóstico também pode incluir a notificação de uma utilização aprovada pela FDA e instruções para o mesmo.

Em outro aspecto, a invenção mostra um hibridoma que produz um anticorpo que tem afinidade de ligação especifica para um polipéptido GEF-Hl ou um domínio de polipéptido, em que o polipéptido é seleccionado do grupo que tem uma sequência de aminoácidos SEQ ID NO. 2. Por "hibridoma" pretende-se dizer uma linha celular imortalizada que pode secretar um anticorpo, por exemplo, um anticorpo para GEF-Hl. Em formas de realização preferidas, o anticorpo para GEF-Hl compreende uma sequência de aminoácidos que pode ser ligado especificamente a um polipéptido GEF-Hl da invenção.

Em outro aspecto, a presente invenção também refere-se a kits que compreendem anticorpos que se ligam a um polipéptido codificado por quaisquer das moléculas de ácidos nucleicos descritas anteriormente, e um anticorpo de controlo negativo. 0 termo "anticorpo de controlo negativo" refere-se a um anticorpo derivado de uma fonte similar à do anticorpo que tem afinidade de ligação específica, mas em que não mostra afinidade de ligação para um polipéptido da invenção.

Também, análises de transferência Western de complexos de GEF-H1/PAK4 isolados podem ser preparadas e então sondadas com os anticorpos para GEF-Hl fosfoespecíficos anteriormente mencionados para determinar o estado de fosforilação daquelas proteínas. Alternativamente, o lisado celular pode ser submetido directamente a uma transferência Western e os anticorpos específicos para GEF-Hl serem 36 aplicados sem separação prévia de um complexo de GEF-H1/PAK4 específico.

Em qualquer caso, a identificação de um GEF-Hl fosforilado numa amostra de células pode ser conseguida facilmente e rotineiramente de acordo com a estratégia anteriormente descrita.

Uma amostra celular também pode ser tratada com uma substância candidata tal como um fármaco, produto químico, composto, proteína ou ácido nucleico para determinar os efeitos dessa substância sobre a actividade de PAK4 monitorizando os efeitos na direcção 3' sobre a fosforilação de GEF-Hl. Uma substância candidata pode "modular" a actividade de PAK4, ou a interacção entre PAK4 e GEF-Hl. Por "modular" pretende-se dizer que a substância candidata pode afectar a actividade de quinase de PAK4 ou o grau ao que interagem PAK4 e GEF-Hl. Por conseguinte, um efeito da "modulação" por uma substância candidata é diminuir o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl total numa amostra dada. Também é concebível que a substância candidata aumente a actividade da quinase PAK4 ou facilite a interacção de GEF-H1/PAK4. Contrariamente, o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl total pode então ser aumentado depois da exposição à substância. Portanto, uma substância candidata pode modular PAK4, GEF-Hl ou um complexo de GEF-H1/PAK4 de forma que seu(s) efeito(s) estabeleça(m) uma correlação com o padrão de fosforilação da proteína GEF-Hl.

Nos ensaios para seleccionar substâncias que modulam a actividade de PAK4 ou a interacção de GEF-H1/PAK4 pode ser utilizada a sequência da proteína GEF-H1S de comprimento completo como representada na SEQ ID NO. 2, ou um fragmento mais curto tal como os péptidos que estão fosforilados por PAK4 (isto é, aqueles representados por SEQ ID NO. 3 e 4) . Alternativamente, também pode ser utilizado um polipéptido GEF-Hl que não compreende o domínio DH catalítico para 37 seleccionar as substâncias que modulam a actividade de PAK4 e/ou interacção de GEF-H1/PAK4. Por conseguinte, a presente invenção contempla um polipéptido GEF-Hl que não possui região de aminoácidos entre os resíduos 162 e 354.

Um ensaio de selecção de fármacos neste contexto implica (i) obter um lisado celular, preferentemente de uma linha celular tumorigénica; (ii) aplicar ao lisado uma substância candidata; (iii) isolar e/ou separar proteínas da preparação de lisado celular; e (iv) detectar a presença de fosfovariantes de GEF-Hl. Por meio da comparação do nível de fosforilação de proteínas de GEF-Hl totais antes e depois de aplicar a substância candidata a uma célula ou ao lisado celular é possível determinar o efeito da substância candidata sobre a actividade de PAK4. Portanto, espera-se que o nível de fosforilação da proteína GEF-Hl total numa relação tal caia se a substância candidata é eficaz em inibir a actividade da quinase PAK4. Além disso, esta relação (nível de fosforilação de GEF-Hl antes da aplicação da substância candidata com respeito ao nível de fosforilação de GEF-Hl depois da aplicação da substância candidata) também pode ser comparado com um nível de "fundo" de fosforilação de GEF-Hl em células e/ou lisados celulares que não foram tratadas com a substância candidata. A substância candidata pode ser aplicada antes de lisar as células.

Uma substância candidata pode ser péptidos que compreendem as sequências de GEF-Hl da SEQ ID NO. 3 e da 4. Por conseguinte, quando são aplicadas células a altas concentrações, isto é, superiores à quantidade de GEF-Hl endógeno, os péptidos GEF-Hl deverão competir e ser ligados à PAK4 endógena, deste modo inibindo a ligação e a fosforilação de GEF-Hl endógeno. 0 perito na especialidade saberia quanto adicionar de um inibidor de péptidos competitivos com o propósito de que o péptido seja adicionado a células ou lisados celulares "em excesso". A 38 substância candidata também pode ser um ácido nucleico que modula ou inibe a expressão de PAK4. Portanto, podem ser utilizados polinucleótidos anti-sense ou moléculas de ARN de cadeia dupla de acordo com técnicas anti-sense e de interferência de ARN para inactivar ou regular por diminuição a expressão génica de PAK4.

Uma substância candidata satisfatória é uma que inibe a PAK4 e, como resultado, alivia as anomalias celulares associadas à expressão em excesso de PAK4. Por conseguinte, uma substância candidata satisfatória é uma que retarda ou inibe a proliferação celular, tal como a que é observada em tecidos cancerosos.

Portanto, as substâncias que exercem tais efeitos moduladores ou inibidores são úteis na modulação ou inibição de células que (i) proliferam, (ii) possuem crescimento independente de ancoragem ou (iii) são móveis. Por conseguinte, por meio da administração de uma ou mais destas substâncias a células que apresentam estas propriedades pode ser inibida a proliferação, crescimento independente de ancoragem ou mobilidade celular associados a uma amostra de células particular. Portanto, é possível tratar um indivíduo que tem populações destes tipos de tipos de células administrando uma ou mais das substâncias identificadas em formas puras ou farmaceuticamente formuladas. De acordo com tais fundamentos é possível de acordo com a presente invenção tratar um indivíduo que tem cancro ou crescimento celular tumorigénico administrando uma composição farmacêutica que compreende a substância identificada que modula ou inibe um ou mais fenótipos de células associados a tecidos ou células cancerosas. A presente invenção também utiliza as seguintes sequências de aminoácidos de PAK4 como polipéptidos derivados da quinase activada por p21 que funcionam do modo recomendado a seguir. SEQ ID NO, 21: 39 2 7 6-CTPAAPAVPGPPGPRSPQREPQRVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLDNF- 324 SEQ ID NO. 22: 298-RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD-322

Portanto, a presente invenção engloba um polipéptido derivado da quinase activada por p21 do grupo II que pode ser ligado a uma isoforma da proteína GEF-Hl. É possível que por meio da ligação à proteína GEF-Hl tais polipéptidos possam prevenir ou impedir o acoplamento ou a ligação de comprimento completo, por exemplo, de PAK4 endógena e outros membros da família PAK do grupo II à proteína GEF-Hl à que está ligada o polipéptido inventivo. Exemplos de quinases activadas por p21 do grupo II são PAK4, PAK5 e PAK6.

Um surpreendente descobrimento da presente invenção é que um polipéptido que compreende somente os resíduos 276 a 324 de PAK4 (denotados por SEQ ID NO. 21) possa ser ligado preferencialmente a membros da família GEF-Hl. Esta nova região de ligação que engloba os aminoácidos 27 6 a 324 de PAK4 também compreende uma sequência de aminoácidos dos resíduos 298-322 (SEQ ID NO. 22), isto é, altamente conservada entre as proteínas PAK do grupo II. Esse domínio conservado é denominado no presente documento o "domínio de interacção com GEF-Hl" ("GID"). Os aminoácidos 399 a 454 de PAK5, por exemplo, têm 76% de identidade de sequências com SEQ ID NO. 21, mas têm 88% de identidade de sequências com o domínio GID representado em SEQ ID NO. 22. Por conseguinte, o alto grau de conservação entre a proteína PAK do grupo II com respeito à região GID significa provavelmente que esta região de PAK4, PAK5 e PAK6 pode ser ligado a diversos membros da família de GEF-Hl tais como GEF-H1S (GEF-Hlb), GEF-HlM (GEF-Hla) e GEF-HlU (GEF-Hlc) A presente invenção engloba qualquer polipéptido de PAK4 dentro da extensão 276-324 de aminoácidos em SEQ ID NO. 21 que contém a região GID e que ainda conserva a 40 capacidade a ser ligado a uma isoforma de GEF-Hl. Portanto, a presente invenção engloba um polipéptido que compreende uma sequência de aminoácidos que é somente parte da sequência representada em SEQ ID NO. 21, enquanto esse polipéptido pode ser ligado a isoformas de GEF-Hl, e não contém nenhuma outra PAK4 ou outra sequência de proteínas PAK do grupo II. Portanto, de acordo com a presente invenção, um polipéptido tal não compreende nenhuma outra sequência de aminoácidos de PAK4, nem o polipéptido também não compreende nenhuma outra sequência de polipéptidos de PAK do grupo II. Por exemplo, no caso em que um polipéptido compreenda os resíduos 298-324 de SEQ ID NO. 21, esse polipéptido não compreenderia as sequências de aminoácidos 1-297 ou 325-985 de PAK4. No entanto, os polipéptidos derivados da quinase activada por p21 da presente invenção podem ser uma parte de uma proteína de fusão e associar-se a um polipéptido ou proteína PAK distinto do grupo II. A presente invenção também engloba um polipéptido que compreende os resíduos 280-324 de SEQ ID NO. 21, os resíduos 285-324 de SEQ ID NO. 21, os resíduos 291-324 de SEQ ID NO. 21, além de outras variantes dos mesmos. Por "variantes" se quer dizer que qualquer sequência dentro da sequência de aminoácidos representada na SEQ ID NO. 21 pode ser utilizada como é recomendado pela presente invenção, enquanto essa sequência possa ser ligada a pelo menos uma isoforma de GEF-Hl.

Como foi explicado no presente documento, a fosforilação de PAK4 de GEF-Hl reduz ou inibe a formação de fibras de stress e promove lamelipódios, proliferação celular e mobilidade celular. Portanto, é provável que a administração de um inibidor de fosforilação de PAK4 tal como um polipéptido que consiste essencialmente na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO. 21, ou parte da mesma, aumente a formação de fibras de stress, fazendo com que as células tratadas sejam menos móveis, menos invasivas 41 e mais susceptíveis aos método que induzem apoptose celular. Por exemplo, administrar um polipéptido que compreende o domínio GID identificado nas SEQ ID NO. 21 e 22 poderia interromper a mobilidade celular, prevenindo ou reduzindo a fosforilação de GEF-H1M ligado a microtúbulos. A fosforilação de GEF-H1M produz sua dissociação da rede de microtúbulos. Por conseguinte, o polipéptido de domínio GID poderia ser utilizado para alterar a actividade de PAK4 em GEF-H1M, interrompendo assim a infra-estrutura de actina celular e a mobilidade celular.

Foi utilizada uma selecção de expressão em fago (phage display) para identificar alvos fisiológicos para PAK4 utilizando o domínio de quinase de PAK4 (aminoácidos 2 91-591) fundindo a GST (glutationa-S-transferasa) como 'isca'. Os acertos de expressão em fago isolados no rastreio corresponderam a fusões in frame derivadas de vários genes distintos. Um fragmento foi derivado do gene similar a Maguin-2. Outros dois acertos foram derivados da variante de splice de GEF-H1S (GEF-Hlb) de GEF-H1. Ao contrário de GEF-HlM (GEF-Hla), GEF-Hl (GEF-Hlb) não possui uma região de dedo de zinco que foi demonstrado que era necessária para a ligação a microtúbulos.

Para confirmar a interacção in vitro de GEF-H1S (GEF-Hlb) com PAK4 foram geradas proteínas de fusão de GST expressas em bactérias com as sequências idênticas isoladas por expressão em fago que codificam tanto os aminoácidos 763-921 de GEF-H1S (GEF-Hlb) como os aminoácidos 385-555 da proteína similar a Maguin-2. Estas proteínas de fusão foram ligadas a pérolas de glutationa e foram utilizadas em ensaios de ligação com lisados de 2 93T que expressam PAK4 exógena. GST-GEF-HlS (aa 763-921), mas não GST, nem o fragmento similar a Maguin-2, pôde ser ligado fortemente à proteína PAK4 marcada com myc de comprimento completo nem ao domínio de quinase (aminoácidos 291-591). Ao contrário, o domínio regulador amino-terminal de PAK4 sozinho 42 (aminoácidos 1-309) não interagiu estavelmente com GEF-H1S (GEF-Hlb). Estes resultados sugerem que a interacção está mediada por ambas, uma região curta N terminal para o dominio da quinase PAK4e pelo próprio domínio de quinase.

Foram utilizados péptidos biotinilados derivados da região do N terminal da sequência de PAK4 para mapear adicionalmente o sítio de ligação a GEF-Hl. Um péptido que consiste nos aminoácidos 276-324 mostrou uma forte interacção com GEF-H1S, mas não outro péptido que cobria mais da região do C terminal, os aminoácidos 291-355. Os resultados demonstram juntos que o domínio de interacção de GEF-Hl (GID) está localizado entre os aminoácidos 276 e 324 de PAK4, tal como a região que começa no aminoácido 2 91 e que termina no aminoácido 322 de PAK4. O alinhamento de sequências de GID de PAK4 com os domínios correspondentes das outras PAK revelou homologia significativa entre os membros da família de PAK do grupo II (PAK4, PAK5 e PAK6) nesta região. Baseando-se na homologia dentro do GID de PAK4 é possível que PAK5 e PAK6 também interajam com GEF-Hl ou proteínas relacionadas. PAK4 e GEF-Hl endógenos associam-se e localizam-se estavelmente na membrana de Golgi in vivo. Para confirmar que a interacção in vitro entre PAK 4 e GEF-Hl é fisiologicamente relevante foram realizados experiências de co-imunoprecipitação com lisados de células A549, HCT116 e H1299 com anticorpos dirigidos contra tanto PAK4, GEF-Hl como soro pré-imunitário como foi indicado. Então, as proteínas foram analisadas por meio de transferência Western utilizando anticorpos específicos para GEF-Hl. A proteína GEF-Hl endógena foi detectada em complexos imunoprecipitados com tanto anticorpos para PAK4 como para GEF-Hl, mas não o soro pré-imunitário. Embora as diferentes isoformas de GEF-Hl interagem com PAK4 in vivo, no caso de células Hl 299 PAK4 interage mais fortemente com a isoforma 43 de GEF-Hl mais pequena, enquanto em células HCT116 não é observado esta preferência.

Estudos anteriores de PAK4 demonstraram que sua localização com respeito ao aparelho de Golgi em presença de Cdc42 activada produziu a indução de filopódios. Por conseguinte, no presente documento foi determinado se PAK4 e GEF-Hl endógenos foram co-localizados ou não in vivo. Foram coradas células H1299 com anticorpos para PAK4 ou GEF-Hl junto com anticorpos para β-COP ou o marcador de trans-Golgi, aglutinina de germe de trigo. PAK4; GEF-Hl e β-COP todos estão localizados na mesma região subcelular que visualiza-se por microscopia de fluorescência. Portanto, GEF-Hl, como PAK4, estão associados à membrana de Golgi. A coloração nuclear observada tanto com os anti-soros de PAK4 como de GEF-Hl é devido às prolongadas exposições requeridas para a detecção das proteínas endógenas e não é específica. Estudos de maior resolução mostram algumas diferenças de localização dentro da rede de Golgi. Por exemplo, PAK4 está localizado mais em direcção à membrana cis de Golgi e seus MT associados que a rede trans de Golgi. ΡΆΚ4 fosforila GEF-HlS (GEF-Hlb) em serina 810 in vitro e in vivo. O seguinte que se examinou foi se GEF-Hl é um substrato de PAK4 ou não. Os ensaios de quinase in vitro foram realizados utilizando uma proteína de fusão de GEF-Hl GST, uma proteína de fusão de similar a Maguin-2-GST e proteína de controlo de GST como substratos para a fosforilação por PAK4. Nestes ensaios encontrou-se que o polipéptido GEF-Hl é um substrato de alta afinidade para PAK4 com uma Km que está no intervalo de 1 a 5 uM. PAK4 fracassa ao fosforilar o controlo de GST, e fosforilou fracamente a proteína de fusão GST-similar a Maguin-2.

Encontrou-se previamente que os péptidos derivados da sequência da ansa de activação de PAK4 são substratos de 44 alta afinidade de PAK4. Examinando a capacidade de PAK4 para fosforilar uma série de péptidos altamente relacionados com sua ansa de activação foi possível deduzir um consenso de substrato aproximado para PAK4 (RRXSL(X)nG en que η = 1 ou 2) que sugeriu que tanto os resíduos básicos como os resíduos hidrófobos que flanqueiam o sítio de fosfoaceptor são importantes para o reconhecimento de substratos de alta afinidade por PAK4. Para explorar adicionalmente a selectividade do substrato de PAK4, as sequências dos clones de expressão em fago enriquecidas na selecção do domínio de quinase PAK4 foram comparadas com o consenso de substrato de PAK4 putativo dos inventores. A maioria das sequências, que incluem GEF-HlS (GEF-Hlb), contém uma região com alta similitude a um substrato de PAK4 de alta afinidade. Dentro do acerto de expressão em fago de GEF-Hl que se corresponde com os aminoácidos 7 63-921 de GEF-HlS (GEF-Hlb), um possível sítio de fosforilação de PAK4 foi identificado em Ser 810 de GEF-HlS. Um péptido derivado da sequência que rodeia este sítio (aminoácidos 807-824) também é um substrato de alta afinidade para PAK4 com uma Km similar para PAK4 à da proteína de fusão de GST-GEF-H1 (793-921).

Portanto, um motivo de consenso do substrato para a fosforilação mediada por PAK4 se identifica no presente documento como RRXSL(X)nG na que n é "1" ou "2", X resíduos e "X" é qualquer aminoácido.

Foram sintetizados diversos fosfoisómeros derivados deste péptido e foram provados para sua capacidade para ser fosforilados por PAK4. Os péptidos com fosfo-serina na posição 810 não foram mais substratos para PAK4. Além disso, foi confirmado por mutagénese que Ser 810 de GEF-HlS (GEF-Hlb) é o sítio de fosforilação autêntico para PAK4 in vitro.

Enquanto a mutação de Ser 810 anulou a fosforilação de PAK4 de fragmentos do C terminal de GEF-HlS (GEF-Hlb), um 45 fragmento da extremidade amino (aminoácidos 1-386) de GEF-HlS (GEF-Hlb) continha o(s) sitio (s) de fosforilação de pak 4 adicional(is). A comparação de sequências com a sequência consenso do substrato de PAK4 sinalizou aos resíduos de serina 57, 66 e 67 como outros possíveis sítios de fosforilação de PAK4. Sintetizando péptidos correspondentes a fosfoisómeros dos sítios de fosforilação de PAK4 putativos foi determinado que Ser 67 é provavelmente o sítio de fosforilação de PAK4 in vitro dentro do extremidade amino de GEF-Hl. De maneira interessante, os sítios de fosforilação de PAK4 dentro de GEF-H1S (GEF-Hlb) são conservados possivelmente, sendo os sítios tanto uma treonina como um ácido glutámico em Cdc24, a GEF de Cdc42 de levedura que está regulada pela quinase similar a PAK Cla4, sugerindo a possível importância destes sítios. Os dados de alinhamento indicam então que o ácido glutámico 89 do N terminal e a treonina 737 do C terminal correspondem-se com Ser 67 e 810, respectivamente, em GEF-H1S (GEF-Hlb) humano.

Para confirmar que a fosforilação de GEF-HlS (GEF-Hlb) por pak4 é produzido nestes sítios in vivo foram realizados ensaios de co-transfecção e foi analisada a fosforilação de GEF-Hl utilizando um anticorpo fosfo-específico dirigido contra fosfo-serina 810. Este anticorpo é específico para GEF-Hl que está fosforilado em Ser 810. Encontrou-se que Ser 810 está fosforilada em células de mamífero e que a fosforilação de GEF-HlS em Ser 810 está potenciada em presença de PAK4 activada, além de PAK4 natural quando é co-expressada com Cdc42, mas não em presença do mutante sem actividade de quinase e o vector. A expressão da PAK4 sem actividade de quinase também pode inibir a fosforilação basal de PAK4 endógena de GEF-HlS (GEF-Hlb) em Ser 810. Similarmente foram desenvolvidos anticorpos fosfo-específicos contra Ser 67 em GEF-Hl (GEF-Hlb) e encontrou-se que não somente está a Ser 67 fosforilada em células de 46 mamífero, sino que a co-transfecção de PAK4 activada com GEF-HlS (GEF-Hlb) também estimulou a fosforilação de Ser 67 .

Mudanças morfológicas mediadas por alelos de GEF-Hl

Os factores de troca de nucleótidos da família de Rho GTPase participam na regulação de estruturas citoesqueléticas e a morfologia celular. Os domínios de homologia conservados de Dbl (DH) e de pleckstrina (PH) são críticos para o funcionamento destes factores de troca. Foram analisados os GEF para sua capacidade para estimular a troca sobre substratos de Rho GTPase in vitro ou por sua expressão em excesso in vivo. No caso de GEF-Hl, diversos grupos mostraram actividade catalítica em Rac e Rho. A expressão transitória de GEF-Hl em células Cos-7 e a expressão isolada dos domínios DH-PH de GEF-Hl mostram actividade em direcção a Rac in vivo e in vitro, respectivamente. A análise por ensaios in vitro e in vivo em células Cos-1 e HeLa mostrou actividades mensuráveis em Rho para GEF-Hl que estavam de acordo com um estudo prévio. 0 quadro 1 mostra o efeito de mutantes de GEF-Hl sobre a morfologia de fibroblastos; e o Quadro 2 amostra o efeito da regulação de PAK4 de GEF-Hl na morfologia de fibroblastos.

Para analisar o efeito de GEF-Hl sobre a morfologia celular em EGFP de fibroblasto (proteína verde fluorescente potenciada), as construções de fusão de GEF-HlS (GEF-Hlb) e uma série de alelos mutantes dos sítios de fosforilação de PAK4 em GEF-HlS (GEF-Hlb) foram introduzidos em células NIH-3T3. Também foi construído um alelo negativo dominante mutando o domínio DH de GEF-Hl produzindo GEF-H-QR312,313MG. Num ensaio do domínio de ligação a p21 (PBD), este alelo negativo dominante inibiu a acumulação de Rac-GTP, mas não de Cdc42-GTP em células NIH-3T3. 0 citoesqueleto de actina foi corado com cumarina-faloidina 47 para contrastar estruturas de F-actina de células fluorescentes EGFP por microscopia. 0 GEF-HlS de tipo selvagem (GEF-Hlb) localizou-se normalmente na região perinuclear e as células apareceram alongadas com fibras de stress ocasionais. Pelo contrário, a expressão em excesso de GEF-H1S-S810A sozinho conduz a uma acumulação e a matriz desorganizada de fibras de stress em comparação com células não transfectadas. A indução de fibras de stress é surpreendente em vista dos efeitos relativamente modestos sobre o citoesqueleto de actina após a expressão de qualquer alelo de GEF-HlS natural (GEF-Hlb) ou de PAK4 sozinho. A morfologia de GEF-H1S-S67A que expressa o mutante DH de GEF-HlS (GEF-Hlb) negativo dominante. A expressão do mutante do domínio DH GEF-H1S-QR312,313MG cria uma cauda de extensões citoplásmicas naturalmente distribuídas. A indução de fibras de stress no caso de GEF-H1S-S810A é reminiscente da activação de Rho, enquanto as extensões citoplásmicas desorganizadas observadas com GEF-H1-Q312R,M313G e GEF-H1S-S67A poderiam ser restos de caudas de células não retraídas que poderiam ser devido à inibição de Rho. As mudanças na localização e o citoesqueleto de actina são especialmente espectaculares no mutante duplo de GEF-HlS-(S67A-S810A). Os agregados citoplásmicos de F-actina encontraram-se em EGFP-GEF-HlS (S67A-S810A) que expressa células, além de lamelas de arco largo carentes de F-actina. A redistribuição das proteínas mutantes do sítio de fosforilação e a acumulação inapropriada de F-actina citoplásmica suporta a ideia de que a localização é crítica para a capacidade de GEF-Hl para estimular fibras de stress. PAK4 activada e GEF-HlS (GEF-Hlb) induzem a formação de lamelipódios em células NIH-3T3 A indução de estruturas de F-actina em fibroblastos, concretamente a formação de filopódios, lamelipódios e fibras de stress, é devido à sinalização pelas formas 48 activas de Cdc42, Rac e Rho, respectivamente. Devido a que as proteínas PAK, e especificamente PAK4, desempenham uma função na regulação de estruturas morfológicas baseadas em F-actina foram criadas experiências para determinar se as mudanças induzidas por PAK4 na morfologia celular estavam mediadas pela regulação de GEF-HlS (GEF-Hlb). Também foram co-expressas construções de EGFP-GEF-H1 com diversos alelos de PAK4 marcados com o epítopo HA em células NIH-3T3. Foi detectada PAK4 exógena com um anticorpo anti-HA (vermelho) e o citoesqueleto de actina foi corado com cumarina-faloidina (azul). Embora as células NIH-3T3 tenham níveis baixos, mas detectáveis de PAK4 e GEF-H1 endógenos, estes não foram activados nas condições da experiência.

Empregando diversos alelos de PAK4 foi possível confirmar quais efeitos morfológicos foram accionados por meio da fosforilação de PAK4 de GEF-H1. Co-expressando os alelos de PAK4 com o controlo de EGFP foram produzidos efeitos relativamente modestos sobre a formação de estruturas baseadas em F-actina em células NIH-3T3. Em células que co-expressam ΡΆΚ4 natural junto com GEF-HlS natural (GEF-Hlb) foi observado um espectacular aumento em filopódios, ao contrário de tanto PAK4 como GEF-HlS (GEF-Hlb) expressos sozinhos. As estruturas de filopódios pareceram ser dependentes da menor actividade do alelo de PAK4 natural e da interacção com GEF-HlS (GEF-Hlb) já que não foi observado quando se expressou tanto proteína em células sozinhas como em controlos co-transfectados com vector. Em células que co-expressam PAK4 S474E activada e GEF-HlS (GEF-Hlb), estas estruturas produziram a transição de filopódios a lamelipódios no borde de ataque. Não foram observados nem filopódios nem lamelipódios quando GEF-HlS (GEF-Hlb) foi transfectada junto com a quinase inactiva PAK4 K350,351 A. No entanto, as fibras de stress estavam agora abundantemente presentes. Em consideração conjunta com as análises dos inventores dos mutantes de sítios de 49 fosforilação de PAK4 em GEF-H1S (GEF-Hlb), isto sugere que a actividade da quinase PAK4 é responsável pela transição à formação de lamelipódios.

Para confirmar se a formação destas estruturas depende ou não da capacidade de PAK4 para fosforilar GEF-H1S (GEF-Hlb) foram utilizados mutantes de sítios de fosforilação de GEF-H1S (GEF-Hlb). A co-transfecção de um alelo de GEF-H1S-S810A mutante junto com PAK4 S474E mostra uma profusão de fibras de stress. Isto, junto com o resultado do alelo sem actividade de quinase, sugere que a fosforilação de Ser 810 é responsável por ambos os sinais que conduzem à formação de lamelipódios e pela inibição da formação de fibras de stress em fibroblastos. Adicionalmente, PAK4 S474E e GEF-H1S-S810A estão localizados em distintos sítios periféricos reminiscente dos sítios de ligação de adesão a células que servem de pontos de nucleação para fibras de stress de actina. Este tipo de localização de GEF-Hl também foi observado em células HeLa.

Ao contrário dos efeitos observados pela mutação de S810, a co-expressão de GEF-H1S-S67A mutante com PAK4-S474E activada permite a formação dependente de GEF-Hl de lamelipódios, ao mesmo tempo que é evitada a formação de fibras de stress. As experiências dos inventores não tratam a diferença qualitativa entre os derivados de lamelipódios dos GEF-HlS não mutantes e GEF-H1S-S67A mutante. A actividade de troca de GEF-Hl é conseguida por meio da interacção do domínio de homologia de Dbl (DH) com as Rac ou Rho GTPases em seu estado inactivo. Para determinar se os efeitos mediados por GEF-HlS (GEF-Hlb) accionados pela fosforilação de PAK4 são dependentes ou não da actividade de troca de GEF-HlS (GEF-Hlb) foram examinadas células NIH-3T3 que co-expressam o mutante de DH negativo dominante de GEF-HlS (GEF-Hlb) (Q312M,R313G) com diversos alelos de PAK4. Observaram-se lamelas de arco largo que careciam de actina, que está em contraste com os 50 lamelipódios ricos em actina ou fibras de stress formadas em presença de alelos activos de GEF-HlS (GEF-Hlb) e PAK4 activada. O resultado confirma que os sinais de PAK4 são retransmitidos directamente pelas actividades de troca de GEF-Hl. Um estudo prévio de GEF-Hl mostrou a indução de lamelipódios constitutivos em células Cos-7 por meio da expressão em excesso de GEF-Hl. Portanto, mostrou-se que por meio da adição de um complexo de PAK4 activada/GEF-HlS (GEF-Hlb) foi possivel reconstituir este efeito em células NIH-3T3.

Efeitos de PAK4 por meio de GEF-HlM sobre a morfologia celular

Os resíduos fosforilados por PAK4 em GEF-HlS (GEF-Hlb) são conservados na forma ligada a MT ("microtúbulos") de GEF-Hl, "GEF-HlM". GEF-HlM contém um domínio de dedo de zinco em sua extremidade amino que permite que se ligue a microtúbulos. Investigou-se a função da ligação a microtúbulos na determinação da capacidade de PAK4 para controlar a actividade de GEF-HlM. Foram realizados estudos com GEF-HlM que permitiram o exame simultâneo de tanto MT (por meio de marcado de EGFP-GEF-HlM de MT in vivo) como do citoesqueleto de actina (por meio da coloração de F-actina com cumarina-faloidina). Também foram estudados as mudanças no citoesqueleto de MT co-corando com anticorpos de β-tubulina.

No caso de mudanças morfológicas baseadas em F-actina, as isoformas de splice de GEF-Hl mostram algumas diferenças em seus efeitos. Ao contrário de GEF-HlS, que deu fibras de stress ocasionalmente distribuídas, as células que expressam em excesso GEF-HlM mostraram frequentemente fibras de stress na periferia da célula que deram o aspecto de um halo tecido de F-actina, sugerindo que algo da actividade que estimula Rho pode ser limitada localmente aos extremos de MT. A ausência de indução de filopódios foi outra diferença apreciável entre GEF-HlM e GEF-HlS quando 51 foram co-expressadas GEF-H1M com PAK4 marcada com HA de tipo selvagem. Neste caso não foram observados filopódios. No entanto, similar a GEF-HlS, observou-se a transição a lamelipódios quando foram co-expressadas com PAK4-S474E activada.

De acordo com os relatórios na bibliografia, o GEF-HlM, ao igual que LFC (GEF-Hl murino), estava estavelmente associado a microtúbulos. Sabe-se que a expressão em excesso de GEF-Hl estabiliza microtúbulos in vivo. A estabilização de MT é evidente por seu alinhamento radial como é observado em células que expressam EGFP-GEF-H1M sozinhas ou quando são co-expressas com tanto PAK4 de tipo selvagem como sem actividade de quinase. No entanto, a co-expressão de PAK4 activada com EGFP-GEF-HlM produz a desestabilização de MT e a notável redistribuição de GEF-HlM de MT ao citoplasma. A polaridade de MT também é alterada claramente em células que co-expressam GEF-HlM com os diferentes alelos de PAK4. Estes resultados considerados em conjunto com os descobrimentos da presente invenção mostram que PAK4 pode controlar a interferência mediada por GEF-Hl entre o citoesqueleto de actina e a rede de MT. 52 SEQ ID NO. 1 atgcctgtaacaagagcatcacagccaaggaagccctcatctgcccaacaacagaaagcggccctgctg aagaacaacaccgccttgcagtccgtttctcttcgaagtaagacaaccatcegggagcggccaagctcg gccatctacccctccgacagcttccggcagtccctcctgggotcccgccgtggccgctcctccttgtct ttagccaagagtgtttctaccaccaacattgctggacatttcaatgatgagtctcccctggggctgcgc cggatcctctcacagtccacagactccctcaacatgcggaaccgaaccctatccgtggaatccctcatt gacgaagcagaggtaatctaeagtgagctgatgagtgaetttgagatggatgagaaggactttgcagct gactettggagtcttgctgtggacagcagcttcctgcagcagcataaaaâggaggtgatgaagcagcaa gatgtcatctatgagctaatccagacagagctgeaccatgtgaggacactgaagatcatgacccgcctc ttccgcacggggatgctggaagagctacacttggagccaggagtggtccagggcctgttcccctgcgtg gacgagctcagtgacatccatacacgcttcctcagccagctattagaacgccgacgccaggccctgtgc cctggcagcacccggaactttgtcatccatcgcttgggtgatctgctcafcagccagttctcaggtcct agtgcggagcagatgtgtaagacctactcggagttctgcagccgccacagcaaggccttaaagctctat aaggagctgtacgcccgagacaaacgcttccagcaattcatccggaaagtgacccgccccgccgtgctc aagcggcacggggtacaggagtgcatcctgctggtgactcagcgcatcaccaagtacccgttactcatc agccgcatcctgcagcattcccacgggatcgaggaggagcgccaggacctgaccacagcactggggcta gtgaaggagctgctgtccaatgtggacgagggtatttatcagctggagaaaggggcccgtetgcaggag atctacaaccgcatggaccçtcgggcccaaaccccagtgcctggcaagggcccctttggccgagaggaa cttctgaggcgcaaactcatccacgatggctgcctgctctggaagacagcgacggggcgcttcaaagat gtgttagtgctgctgatgacagatgtactggtgtttetccaggaaaaggaccagaagtacatctttcct accctggacaagccttcagtggtatcgctgcagaatctaatcgtacgagacattgccaaccaggagaaa gggatgtttctgatcagcgcagccccacetgagatgtacgaggtgcacacagcatcccgggatgaccgg agcacctggatccgggtcattcagcagagcgtgcgcacatgcccatccagggaggacttccccctgatt gagacagaggatgaggcttacctgcggcgaattaagatggagttgcagcagaaggaccgggcactggtg gagctgctgcgagagaaggtcgggctgttfcgctgagatgacecatttccaggccgaagaggatggtggc agtgggatggccctgcccaccctgcccaggggccttttccgctctgagtcccttgagtcccctcgtggc gagcggctgctgcaggatgçcatccgtgaggtggagggtctgaaagacctgetggtggggccaggagtg gaactgctcttgacaccccgagagccagccctgcccttggaaccagacagcggtggtaacacgagtcct ggggtcactgccaatgçfcgaggccagaaccttcaatggctccattgaactcfcgcagagctgactcagac tctagccagagggatcgaaatggaaatcagctgagatcaccgcaagaggaggcgttacagcgattggtc aatctctatggacttctacatggcctacaggcagctgtggcccagcaggacactctgatggaagcccgg ttccctgagggccctgagcggcgggagaagctgtgecgagccaactetcgggatggggaggctggcagg gctggggctgcccctgtggcccctgaaaagcaggccacggaactggcattactgcagcggcaacatgcg ctgctgcaggaggagctacggcgctgccggcggctaggtgaagaaegggcaaccgaagctggçagcctg gaggcccggctccgggagagtgagcaggcccgggcactgçtggagcgtgaggccgaagaggctcgaagg cagctggccgccctgggccagaccgagccactcccagctgaggccccctgggcccgcagacctgtggat cctcggcggcgcagcctccccgcaggcgatgccctgtacttgagtttcaaccccccacagcccagccga 53 ggcactgaccgcctggatctacctgtcactactcgctctgtccatcgaaactttgaggaccgagagagg caggaactggggagccccgaagagcggctgcaagacagcagtgaccctgacactggcagcgaggaggaa ggtagcagccgtctgtctccgccccacagtccacgaggtçagaccctggcggagacatggaccagagac tttaccagaatgcaggacatcccggaggagacggagagccgcgacggggaggctgtagcctccgagagc taa SBQ IP KO. 2

MPVTRASQPRKPSSAQQQKAALLKNNTALQSVSLRSKTTIRERPSSAIYPSDSFRQSLIGSRRGRSSLS

XAKSVSTTNXAGHFNDESPLGLRRILSQSTDSLNMRNRTLSVESLIDEAEVIYSEEMSDFEMDEKDFAA

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FPEGPERREKLCRANSRDGEAGRAGAAPVAPEKQATE1ALLQRQHALLQEELRRCRRLGEERATEAGSL

EARLRESEQARALLEREAEEARRQLAALGQTEPLPAEAPWARRPVDPRRRSLFAGDALYLSFNPPQPSR gtdrldlpvttrsvhrhfedrerqelgspeerlqdssdpdtgseeegssrlspphsprgetlaetwtrd ftrmqdipeetesrdgeavases SEQ ID NO. 3

RRRSLPAGDALYLSFNPP SEQ ID NO, 4

RQSLLGSRRGRSSLSLAK SEQ ID NO. 5

RGETLAETWT SEQ ID NO, 6

RBSZXG SEQ ID NO. 7 CPRRRSLPAGDALYLSFNPP SEQ ID NO, 8 CRQSLLGSRRGRSSLSLAK SEQ ID NO. 9

CRQSLLGSRRGRSSLSLAK 54 SEQ ID NO. 10 TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA SEQ ID NO, 11 GGTGATGCCCATGGTCTCCAGCAGGAT SEQ ID NO. 12 ATCCTGCTGGTGACCATGGGCATCACCA SEQ ID NO. 13 GCCGTGGCCGCTCCGCCTTGTCTTTA SEQ ID NO. 14 TAAAGACAAGGCGGAGCGGCCACGGC SEQ ID NO. 15

QRITKY SEQ ID NO. 16 GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA SEQ ID NO. 17 GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT SEQ ID NO, 18 RRKSLVGTPYWMAPE SEQ ID NO. 19 biotina-LC-LC-RRKELVG(pT) PYWMAPE SEQ ID NO. 20

RBSZXL SEQ ID NO. 21

CTPAAPAVPGPPGPRSPQREFQRVSHEQFRAALQLWDPGDPRSYLDNF SEQ ID NO. 22

RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD

EXEMPLOS

Exemplo 1

Clonaqem de GEF-HlS (GEF-Hlb)

Foram utilizados os iniciadores MCI GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA (SEQ ID NO. 16) e MC3b GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT (SEQ ID NO. 17) desenhados a partir do n° de registo KIAA0651 depositado no NCBI (Centro nacional de informação biotecnológica, E.U.A.) numa reacção em cadeia da polimerase (PCR) para amplificar o 55 gene GEF-H1S de um ADNc de plasmídeo de cérebro completo humano (n° de cat. de Clontech Laboratories HL9002CC). Foram realizados vinte séries de PCR utilizando a polimerase EXPAND (Roche Molecular, E.U.A. n° de cat. 1681834). 0 iniciador MCI foi introduzido num sitio da enzima de restrição EcoRI na posição 5' e MC3b contém um sitio de enzima de restrição Xhol na posição 3'. As sequências dos sitios de enzimas de restrição não são parte da sequência de GEF-Hlb nativa. 0 produto de PCR resultante foi inserido num vector de plasmídeo digerido com restrição de EcoRI e Xhol, o esqueleto de pcDNA (n° de cat. de Invitrogen V790-20) com um sítio de clonagem múltiplo modificado. Então, o gene GEF-HlS foi clivado utilizando as enzimas de restrição Hindlll e Xbal e foi inserido num vector de expressão similarmente restringido, pRSV/Rc (Promega, E.U.A.).

Exemplo 2

Expressão e proliferação independente de ancoragem

Um clone que é expresso estavelmente designado como 192.58 que contém o GEF-HlS foi estabelecido na linha celular de fibroblasto de ratinho, NIH-3T3. 0 vector subclonado pRSV/Rc expressa a proteína GEF-HlS em células de cultura de tecido.

Os clones de GEF-HlS foram semeados em recipientes de cultura de tecido que evitam a aderência. As células que expressam em excesso GEF-HlS são independentes de ancoragem. As células NIH-3T3 que somente albergam o vector de expressão vector pcDNA não foram transformadas espontaneamente quando a ancoragem foi prevenida. Somente foi mostrado que os clones que albergam o gene GEF-HlS sobreviviam e proliferavam. Portanto, a expressão de GEF-HlS permite a sobrevivência independente de ancoragem e a proliferação de células NIH-3T3. A capacidade das células para proliferar foi medida utilizando o ensaio baseado no sal de tetrazólio XTT (n° de cat. de Roche Molecular 56

Biochemicals 1465015) que somente mediu células metabolicamente activas em cultura. As medições foram feitas durante um período de tempo.

Exemplo 3

Efeito de GEF-H1S (GEF-Hlb) num modelo de tumor de ratinho

As células 192.58 formaram tumores quando foram transferidas a ratinhos sem pêlo atímicos. Oito ratinhos por grupo foram injectados subcutaneamente com células NIH-3T3 que albergavam tanto um vector de expressão pcDNA de controlo como o vector de expressão pcDNA que expressava o gene GEF-H1S. Foram medidos tumores palpáveis em ratinhos tratados com as células 192.58 durante um período de tempo. Não foram detectados tumores palpáveis em ratinhos implantados com células que albergavam o vector de expressão pcDNA.

Exemplo 4 GEF-H1S (GEF-Hlb) é um substrato para PAK4

Os reactivos utilizados especificamente para a recuperação do primeiro polipéptido GEF-H1S foi um plasmideo de expressão pGEX-4T (n° de cat. de Amersham Biosciences 27-4581-01) que albergava um polipéptido do domínio catalítico de PAK4 que representa os aminoácidos 291 a 591. Este vector de expressão permitiu a produção e a expressão de um gene apropriadamente inserido como uma proteína de fusão em que o componente de fusão é o produto de proteínas do gene SJ26 glutationa-S-transferase (GST). O componente de fusão de GST permite a imobilização por afinidade na matriz de glutationa-Sepharose 4B (n° de cat. de Amersham Biosciences 17-0756-01) também conhecida como pérolas de glutationa. O polipéptido de PAK4 imobilizado a estas pérolas foi incubado com um lisado que continha partículas de fago que expressavam uma biblioteca de péptidos derivados de ADNc de MCF7 (células de cultura de tecido de carcinoma de mama disponíveis de ATCC, E.U.A.). Veja-se Zozulya et al., Nat. Biotechnol., 17(12): pág. 57 1193-8, 1999. Após a sequenciamento de muitos dos candidatos obtidos nesta selecção descobriu-se o polipéptido GEF-H1S no clone designado 13-8. 0 sequenciamento foi realizado numa máquina ABI prism utilizando métodos convencionais proporcionados pelo fabricante (Applied Biosystems, E.U.A.).

Exemplo 5 PAK4 pode fosforilar GEF-H1S (GEF-Hlb) in vitro 0 ADNc que codifica GEF-H1S obtido na selecção de expressão em fago foi clivado e subclonado no vector de expressão pGEX-4T para permitir a produção de proteína recombinante para experiências in vitro. Então, a proteína GEF-HlS foi misturada com a quinase PAK4 e foi incubada de forma que a PAK4 fosforilou o GEF-HlS. Uma parte desta reacção de quinase foi separada por SDS-PAGE e foi auto-radiografada para visualizar o grau de fosforilação. A auto-radiografia mostrou a fosforilação do polipéptido GEF-HlS e a não fosforilação do componente de fusão de GST. A SDS-PAGE é uma separação universal de proteínas e a técnica de visualização que é descrito em Laemmli, Nature, 227(259):680-5, 1970.

Exemplo 6 A serina 810 e a serina 67 de GEF-HlS (GEF-Hlb) são fosforiladas por PAK4 in vitro

Das experiências de fosforilação descritas anteriormente, dois péptidos GEF-HlS foram identificados como alvo para a fosforilação induzida por PAK4. Os resíduos alvo de GEF-HlS foram identificados alinhando o péptido da ansa de activação de PAK4 com os aminoácidos 762 a 921 da sequência de polipéptidos GEF-HlS. Os ensaios de quinase in vitro mostraram posteriormente que os péptidos GEF-HlS PRRRSLPAGDALYLSFNPP (SEQ ID NO. 3) e RQSLLGSRRGRSSLSLAK (SEQ ID NO. 4) estão fosforilados por PAK4 . 58 0 grau de fosforilação destes substratos de péptidos foi comparado visualmente por auto-radiografia e empiricamente foi determinado um consenso de fosforilação do substrato. Pode ser predita uma sequência consenso que era, por exemplo, RBS2X[G/L] em que R é o aminoácido arginina; B é qualquer aminoácido básico; S é o aminoácido serina; Z é qualquer aminoácido hidrófobo; X é qualquer aminoácido, G é glicina e L é leucina. A identificação do residuo de aminoácidos foi realizada pelo ensaio de quinase utilizando PAK4 como enzima e isómeros de regiões de substrato preditas de GEF-H1S.

Os seguintes fosfoisómeros (péptidos GEF-H1S modificados com fosfato) foram utilizados no ensaio da quinase PAK4 para determinar quais resíduos estavam especificamente fosforilados. Devido a que certos resíduos foram modificados para que compreendessem uma fracção fosfato (os seguintes resíduos sublinhados), não puderam ser fosforilados por PAK4. Estes resultados revelaram que as serinas 810 e 67 de GEF-H1S são sítios de fosforilação para PAK4.

Identificador Sequência de Região de _péptidos_proteína_ 681 (SEQ ID NO. RRKSLVGTPYWMAPE Ansa C 18) actividade c PAK4 1008 (SEQ ID NO. RRRSLPAGDALYLSENPP GEF-H1 (807-824) 3) 1009 (SEQ ID NO. RRRSLPAGDALYLSFNPP GEF-H1 (807-824) 3) 1010 (SEQ ID NO. RRRSLPAGDALYSENPP GEF-Hl (807-824) 3) 1412 (SEQ ID NO. RQSLLGSRRGRSSLSLAK GEF-H1 (55-72) 4) 1413 (SEQ ID NO. RQSLLGSRRGRSSLSLAK GEF-Hl (55-72) 4) 59 1414 (SEQ ID NO. RQSLIGSRRGRSSLSLAK GEF-Hl (55-72) 4)

Exemplo 7 GEF-HlS (GEF-Hlb) interage com PAK4 A prova adicional de que GEF-H1S é um substrato para PAK4 foi obtida utilizando a técnica de imobilização sobre GST descrita anteriormente para mostrar a interacção de GEF-H1S imobilizada sobre GST com diferentes alelos de PAK4 expressos em células 293T. As técnicas de imunoprecipitação tanto para a afinidade de proteínas como a imunoprecipitação mediada por antigénio-anticorpo são descritos em Lew et al., J. Immunol. Methods, 136(2):211-9, 1991; e Anderson et al., Methods Enzymol., 96:111-20, 1983. O polipéptido GEF-HlS imobilizado sobre GST foi utilizado para realizar a imunoprecipitação dos extractos de células 293T. Os complexos de proteínas resultantes sobre as pérolas foram identificados por meio da separação em SDS-PAGE seguido de transferência Western para identificar proteínas que estão presentes. A técnica de transferência Western (Renart et al., Methods Enzymol., 104:455-60, 1984) é utilizada universalmente para identificar proteínas utilizando imunoreagentes específicos como anticorpos. A proteína PAK4 foi fundida com este marcador de afinidade myc, Cravchik et al., Gene, 137(1):139-43, 1993, e mostrou-se que os alelos de PAK4 estavam presentes utilizando o anticorpo monoclonal específico para o marcador de afinidade myc. A detecção de PAK4 depois da imunoprecipitação com GEF-HlS imobilizado sobre as pérolas GST mostrou uma interacção física entre estas duas proteínas numa dissolução de proteínas celulares. PAK4 não esteve presente depois da imunoprecipitação com o componente de fusão imobilizado GST. Esta interacção foi limitada pela presença ou ausência de GEF-HlS.

Exemplo 8 60 GEF-H1S (GEF-Hlb) como biomarcador baseado em mecanismo para a actividade da quinase PAK4 em tumores

Os anticorpos específicos para PAK4 foram gerados em coelhos imunizando coelhos com o péptido conjugado a KLH CSGDRRRAGPEKRPKSS, que é parte da proteína PAK4, conjugado com KLH. Veja-se, Nims et al., 1973. 2 3(3):3 91—6; e Hashimura et al., 1982. Os anticorpos específicos para GEF-Hl também foram gerados em coelhos imunizando com o polipéptido de GST-GEF-H1S que compreende os aminoácidos 762 a 921. O soro do anticorpo para PAK4 estava ligado (por interacção da porção Fc da imunoglobulina do isotipo IgG à proteína G de S. Aureus) a pérolas de proteína G (Roche molecular, E.U.A., n° de cat. 124 3233). As pérolas carregadas com anticorpo para PAK4 foram misturadas com lisados celulares de três linhas de células tumorais humanas A549, HCT116 e H1299 (ATCC, E.U.A.). O imunoprecipitado resultante foi separado em SDS-PAGE e foi submetido a transferência Western. Mostrou-se que o anticorpo específico para GEF-Hl imunoprecipitou o GEF-Hl endógeno. Este resultado confirma a presença de GEF-HlS nos três lisados de células tumorais. A interacção de PAK4 endógena foi demonstrada pela detecção de GEF-Hl endógeno na transferência Western quando foi sondada com o anticorpo específico para GEF-Hl. A interacção está limitada pela presença e a ausência de PAK4.

Exemplo 9

Os anticorpos fosfoespecíficos para GEF-HlS (GEF-Hlb) são uma ferramenta para monitorizar a actividade da quinase PAK4 em tumores

Foram utilizados os péptidos conjugados com KLH CPRRRSLPAGDALYLSFNPP (SEQ ID NO. 7), CRQSLLGSRRGRSSLSLAK (SEQ ID NO. 8) Θ CRQSLLGSRRGRSSLSLAK (SEQ ID NO. 9) para gerar anticorpos em coelhos. Os resíduos de serina sublinhados em negrito, "S", denotam resíduos modificados 61 por fosfato. "Anti-1009" é um anticorpo que detecta proteína GEF-Hl fosforilada na serina-810 de SEQ ID NO. 7. Os anticorpos que são produzidos contra péptidos que compreendem as sequências descritas nas SEQ ID NO. 8 e 9 reconhecem as formas fosforiladas de serina-67 dos péptidos GEF-Hl. A capacidade dos anti-soros para reconhecer a proteína GEF-H1S fosforilada em serina-810 foi demonstrada numa experiência em que as células 293T (ATCC, E.U.A.) foram transfectadas transitoriamente para expressar simultaneamente GEF-H1S e diferentes alelos de PAK4.

Nesta experiência, o vector de expressão GEF-H1S foi pRSV/Rc e o vector de expressão de PAK4 foi pcDNA. Os lisados foram preparados a partir das células 293T transfectadas e foram analisados por transferência Western utilizando o reagente anti-1009. Os resultados demonstram um aumento marcado em GEF-HlS fosforilado acima da fosforilação basal (significa que uma parte de GEF-HlS já está fosforilado pela quinase endógena) em presença de PAK4 natural (1-591) e mutante de PAK4, S474E, e uma marcada diminuição no nível de fosforilação em presença de K350,351 A sem actividade da quinase PAK4. Estes anticorpos fosfoespecíficos podem ser utilizados para detectar a actividade de PAK4 em tumores em virtude de sua fosforilação específica de GEF-Hl.

Exemplo 10

Construção de alelos de GEF-HlS (GEF-Hlb)

A seguinte lista refere-se a alelos que reapresentam alelos de GEF-HlS de tipo selvagem, de mutantes de S810A e de QR312,313MG construídos na presente invenção. Com respeito ao último alelo, a glutamina 312 e a arginina a 313 da proteína GEF-HlS foram mutadas por metionina e glicina, respectivamente, por isso a designação, "QR312,313MG". Similarmente, "S810A" indica que o resíduo de serina na posição de aminoácido 810 da proteína GEF-HlS 62 foi mutado por uma alanina. A mutagénese foi realizada por ambas a reacção de PCR e a mutagénese dirigida a sítio. Aminoácidos Alelos 1-921 tipo S67A selvagem, S81 1-386 tipo selvagem 386-921 tipo selvagem 123-921 tipo selvagem, S810A 51-921 tipo selvagem, S810A 94-486 tipo selvagem QR312,313MG,

Oligonucleótidos utilizados em mutagénese: MC27 TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA (SEQ ID NO. 10). Os resíduos em negrito "GCT" denotam um sítio xholi que muda o codão Ser810 por alanina. Este estava emparelhado com MC3b e foi utilizado numa reacção de PCR criando um fragmento que quando foi restringido com Xholi e Xhol pode ser substituído com fragmento de ADNc de tipo selvagem no plasmídeo que continha a sequência de ADNc que codifica os aminoácidos 386-921 (restringida com BamHI e Xhol). O plasmídeo resultante recentemente construído continha uma alanina na posição 810 de GEF-H1S. Este polipéptido mutante foi clivado com Bell e Xhol e se uniu a um fragmento Bell de EcoRI que constitui a fraeção do gene que o torna de comprimento completo.

Foram utilizados MC40 GGTGATGCCCATGGTCTCCAGGAGGAT (SEQ ID NO. 11) emparelhado com MCI e MC41 ATCCTGCTGGTGACCATGGGCATCACCA (SEQ ID NO. 12) emparelhado com MC3b em reacções separadas para criar fragmentos de sobreposição que poderiam ser ligados restringindo com EcoRI, Ncol e Xhol. MC40 e MC41 contêm codões que produzem o alelo mutante de QR312,313MG.

Foram utilizados MC57 GCCGTGGCCGCTCCGCCTTGTCTTTA (SEQ ID NO. 13) e MC58 TAAAGACAAGGCGGAGCGGCCACGGC (SEQ ID NO. 14) numa reacção de mutagénese dirigida a sitio (n° de cat. de Stratagene 200519, E.u.A.) que produziu plasmídeo em que 63 uma alanina foi colocada na posição 67. Esta reacção foi realizada no vector pBLUESCRlPT que contém o fragmento que codifica o polipéptido 1-386. Esta peça foi unida à fracção dos alelos de GEF-H1 (natural, S810A, QR312,313MG) por restrição com EcoRI, Saci e Xhol.

Exemplo 11

Análise de alelos de GEF-HlS (GEF-Hlb) A transdução de sinais que envolve a família Rho de GTPases participa num amplo intervalo de respostas celulares tais como reorganização do citoesqueleto de actina, expressão génica, apoptose, eventos de tráfego na membrana, sinalização mitogénica e transformação maligna. Normalmente, as mutações dentro do motivo "QRITKY" (SEQ ID NO. 15) altamente conservado do domínio DH fazem com que a proteína seja incapaz de ser ligada à proteína Rho GTPase e, portanto, enzimaticamente inactiva.

Os ensaios de transformação in vitro de acordo com o método de Clark et al., Methods Enzymol., 225:395-412, 1995, mostraram que GEF-HlS de tipo selvagem pode induzir focos em células NIH-3T3. Os ensaios de co-transformação entre Ras activada com valorações de GEF-HlS de tipo selvagem e GEF-HlS QR312,MG313 mostraram que GEF-HlS tem efeito sinérgico com a Ras activada, no entanto GEF-HlS QR312,MG313 inibe focos formados pela Ras activada.

Exemplo 12

Localização e mudanças morfológicas

Os alelos de GEF-HlS foram expressos transitoriamente em células NIH-3T3 ou foram expressos simultaneamente com alelos de PAK4. Os alelos de GEF-HlS foram recuperados do vector pcDNA por restrição com EcoRI e Xhol e foram inseridos em pEGFP-Cl (Clontech, E.U.A., n° de cat. 6082-1) restringido com EcoRI e Sall. A proteína resultante foi um híbrido da proteína brilhantemente fluorescente, proteína verde fluorescente (GFP). Os efeitos sobre a morfologia celular foram marcados com coloração de F-actina com 64 cumarina-faloidina (Molecular Probes, E.U.A., n° de cat. C-606) . Para as experiências que demonstram a co-localização com PAK4, PAK4 esteve no vector de expressão pcDNA com tanto um marcador de afinidade myc como HA e é detectada pelo anticorpo monoclonal, "9E10" ou "HA7", intercalado com anti-ratinho de cabra ligado a rodamina (Santa Cruz, E.U.A.) que fluoresce vermelho. GEF-H1S de tipo selvagem está localizado na região perinuclear do aparelho de Golgi. Veja-se Callow et ai., 2002. Este descobrimento esteve de acordo com que GEF-HlS é um substrato para PAK4 porque PAK4 activada também está localizada no aparelho de Golgi.

No entanto, o mutante de fosforilação S810A foi localizado no citoplasma, indicando que a fosforilação de S810 é importante para a localização de GEF-HlS. Também encontrou-se que o mutante de DH QR312,MG313 estava localizado no citoplasma e mostrou um padrão de coloração de agregados citoplásmicos. Estas observações foram especificas para alelos de GEF-HlS já que a própria GFP não foi localizada em nenhum compartimento celular similar. A expressão do alelo natural de PAK4 simultaneamente com o alelo natural de GEF-HlS em células NIH-3T3 induziu a formação de microespículas de actina periféricas similares a aquelas atribuídas à expressão em excesso da Rho GTPase Cdc42. Isto sugere uma função importante para tanto PAK4 como GEF-HlS na formação destas estruturas. A expressão simultânea de PAK4 S474E activada e GEF-HlS produziu a formação de lamelipódios que envolvem adicionalmente PAK4 e GEF-HlS como complexo de proteínas que participam na sinalização de Rho GTPase. Veja-se Nobes et ai., Biochem Soc Trans., 23(3):456-9, 1995. Estas morfologias baseadas em actina foram específicas para a quinase PAK4 combinada e a actividade de troca de GEF-Hl devido a que não houve estruturas baseadas em actina quando a quinase inactiva foi expressa com GEF-Hl de tipo selvagem. Similarmente, a 65 combinação de PAK4 e o factor de troca do mutante inactivo evitaram a formação de estruturas baseadas em actina. Exemplo 13

Este exemplo contém informação adicional sobre certos métodos descritos no presente documento.

Clonagem de GEF-Hl 0 plasmideo pGEX-4T (n° de cat. de Amersham

Biosciences 27-4581-01) que expressa um polipéptido do domínio catalítico de PAK4 (aminoácidos 291-591) foi utilizado como isca numa selecção de expressão em fago para interactores de proteína. A biblioteca de expressão em fago foi derivada da linha de tumor de mama MCF-7. As sequências dos plasmídeos de fago foram utilizadas para buscar na base de dados no Centro Nacional de Informação Biotecnológica (NCBI) utilizando a ferramenta de busca Basic Local

Alignment (BLAST). Dois dos ADNc corresponderam-se com > 99% de identidade com o ADNc denotado KIAA0651 (número de registo de Genbank: AB014551) e várias sobreposições expressaram marcadores de sequências (EST). Durante a clonagem de GEF-Hl encontrou-se que o gene tinha três isoformas de splice principais, GEF-H1M, GEF-H1S e GEF-H1U. A isoforma GEF-H1S (aminoácidos 1-921) se diferencia das formas de splice GEF-HlM devido a um mini-exão de 7 aminoácidos, além da falta do exão que codifica o domínio de dedo de zinco do N terminal. A forma de splice denominada a seguir GEF-HlM contém a região de dedo de zinco que participa na ligação a microtúbulos e é idêntica à versão de comprimento completo (aa 1-985) denominada a seguir GEF-Hl. As sequências in frame foram subclonadas em pGEX-4T para a análise do substrato.

Plasmídeos e construções de ADN

Para obter GEF-HlS, os oligonucleótidos MCI GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA e MC3b GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT derivados da sequência KIAA0651 foram utilizados em 20 séries da reacção em cadeia 66 da polimerase (PCR) para amplificar o gene de uma biblioteca de ADNc de plasmideo de cérebro completo humano (n° de cat. de CLONTECH Laboratories HL9002CC). Foi obtido um fragmento de 3000 pb, foi subclonado e foram sequenciados três clones dando resultados idênticos. Foi utilizada uma EcoRI- Xhol para subclonar em quadro num vector pcDNA que alojava o epítopo 5' de HA para MCS. O fragmento de EcoRI - Xhol de clones de pcDNA foi utilizado para o lançamento de todos os alelos de GEF-H1 para a pEGFPC digerida por EcoRl-Sall em quadro (Clontech), respectivamente. A S810A mutante foi introduzida por reacção de PCR com os oligonucleótidos MC27 TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA e MC3b. O inserto mutante foi introduzido num mutante de deleção de GEF-H1S que englobava os nucleótidos 1100 - 2761 e o fragmento BamHI -Xhol de tipo selvagem foi substituído com o fragmento de XholI e Xhol mutante. Os oligonucleótidos MC40 GGTGATGCCCATGGTCTCCAGCAGGAT, MCI, MC41 ATCCTGCTGGTGACCATGGGCATCACCA e MC3b foram utilizados para criar a sobreposição de fragmentos de EcoRI-Ncol e Ncol-Xhol para converter resíduos de QR em MG no motivo QRITY altamente conservado do domínio DH. S67A foi criado utilizando os oligonucleótidos MC57 GCCGTGGCCGCTCCGCCTTGTCTTTA e MC58 TAAAGACAAGGCGGAGCGGCCACGGC e GEF-HlS com pBluescipt que englobava 1-626 como esqueleto numa reacção de mutagénese dirigida a sítio (Stratagene). Este fragmento mutante foi digerido com EcoRI - Saci e foi unido à fracção do gene com um fragmento Sac-Xhol gerado a partir de alelos mutantes e de tipo selvagem. Como as proteínas de GEF-H1M e S somente são diferenciadas em suas extremidades amino foram geradas como um híbrido unindo sequências mutantes e de tipo selvagem derivadas de GEF- -H1S. A única sequência em 5' foi gerada com os oligonucleótidos MC 61 GCGGAATTCATGTCTCGGATCGAATCCCTCA e MC62 67 GTCACTGAGCTCGTCCACGCAGGGGA numa reacção de PCR utilizando o clone 4157775 IMAGE (Research genetics) como molde. Preparação de proteínas recombinantes, sequência de péptidos e ensaios de quinase PAK4 (resíduos 291-591) fundia com glutationa-S-transferase (GST), os aminoácidos 763-921 de GEF-Hl (do clone de fago 13.8, emparelhamentos de sequência KIAA0651) e similar a Maguin 2 (do clone de fago 13.32, n° de registo de emparelhamentos de sequência XP-087831) foram purificadas por métodos convencionais e como foi descrito previamente 31. Foi utilizada a sequência de aminoácidos de péptidos que engloba 807-824 de GEF-Hlb n° 1008 (RRRSLPAGDALYLpSFNPP), n° 1009 (RRRpSLPAGDALYLSFNPP), n° 1010 (RRRSLPAGDALpYLSFNPP) e n° 934 (RRRSLPAGDALYLSFNPP) para os ensaios de quinase in vitro. As reacções de quinase in vitro foram executadas como foi descrito previamente 31. Anticorpos e imunoreagentes O péptido ligado a KLH (n° 1009) CRRRSLPAGDALYLSFNPP (resíduos 807-824) com uma serina fosforilada na posição 810 e GST-GEF-Hl (n° 104) (resíduos 762-921) foram utilizados como antigénios para produzir anti-soro em coelhos. Os anticorpos para PAK4 foram derivados dos antigénios (n° 933) CATTARGGPGKAGSRGRFAGHSEA (resíduos 122 - 144) e (n° 80) CSGDRRRAGPEKRPKSS (resíduos 148 - 163) . A especificidade foi analisada como foi descrito previamente. Os conjugados de peroxidase de rábano picante de cabra dirigidos contra IgG de ratinho e de coelho foram de Roche molecular. A IgG de cabra dirigida contra ratinho e coelho ligada a fluoróforos FITC ou rodamina foram de Santa Cruz Biotechnology e a IgG de ratinho dirigida contra β-tubulina foi de Zymed. A cumarina-faloidina e a faloidina-FITC foram de Molecular Probes. Anti-cascade Blue de ratinho e os corantes fluorescentes; Texas red, FITC ou azul-marinho foram obtidos e foram conjugados com anticorpos de acordo com o fabricante. As soluções de reagente de reticulação 68 foram inactivados dessalgando por meio de G25-Sephadex e misturando com cloreto de amónio a uma concentração final de 50 mM.

Transfecções de células e imunofluorescência

Foram mantidas células NIH-3T3, 293T, A549, HCT116 e H1299 em meio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM), soro bovino fetal a 10% (SBF), penicilina e estreptomicina de Invitrogen (Carlsbad, CA) . Para a transfecção, as células foram semeadas a 105 células ml-1 para células NIH-3T3 e 104 ml”1 para tanto 293T como H1299, a menos que fosse indicado de outro modo. Os reagentes de transfecção Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ou Fugene (Roche Molecular) foram utilizados a 3 pg pg”1 de ADN de plasmideo. Os extractos celulares para a imunotransferência foram preparados em tampão de lise. Para as experiências de imunoprecipitação, os lisados foram incubados com pérolas de proteína G (Pharmacia) ligadas a anticorpo apropriado, pérolas de glutationa-Sepharose (Pharmacia) com proteína de fusão de GST apropriada e pérolas de estreptavidina (Pierce) ligadas a péptidos biotinilados apropriados. Para a imunofluorescência foram colocados lâminas em recipientes de cultura celular de 24 poços e foram semeados nas densidades anteriores. As transfecções ocorreram depois de 16 h e, a menos que se indicasse de outro modo, foram mantidas em Optimem ou dmem com SBF a 0,2% durante 24 h até a fixação. A microscopia foi realizada num microscópio Nikon E800 com objectiva de 60X (1,5 NA). As imagens foram capturadas com uma câmara CCD SPOT e foram pseudo-coradas com o software de imagens SPOT (Diagnostic Instruments). Exemplo 14

Medição da actividade da quinase PAK4 em células completas utilizando ELISA O nível de fosforilação de GEF-H1S dependente de PAK4 pode ser determinado monitorizando a ligação de um anticorpo fosfoespecífico para GEF-HlS de acordo com o 69 seguinte protocolo. Foram recobertas previamente placas de ELISA (Corning, placas de 96 poços, n° de cat. 25805-96) com anticorpo monoclonal anti-HA a 5 pg/ml em PBS utilizando 100 μΐ de volume final por poço e foram armazenadas durante a noite a 4°C. Então, o tampão de recobrimento foi retirado e foi substituído por tampão de bloqueio (BSA a 2% em TBST) e então a placa inteira foi agitada a temperatura ambiente durante 60 minutos.

Então, as placas de cultura de tecido foram recobertas com poli-L-lisina utilizando 50 μΐ por poço e então foram incubadas a 37°C durante 30 minutos. Então, as placas foram enxaguadas com PBS, o líquido adicional foi retirado por aspiração e permitiu-se que se secassem completamente antes de utilização. Quando se secaram foram semeadas células tr-293-KDG em cada poço a 2 x 10+4 células por poço num volume de 100 μΐ de DMEM e SBF a 10% aprovado por Clontech, e foram deixadas para que incubassem a temperatura ambiente durante pelo menos 2 horas. Nesse momento, o meio foi retirado e foi substituído por 100 μΐ de meio de baixo soro (DMEM, BSA a 0,2% e SBF a 1% aprovado por Clontech), que foi complementado com 1 pg/ml de doxiciclina. Os poços de controlo negativo não foram tratados com doxiciclina.

No dia seguinte, as substâncias candidatas foram diluídas conforme foi necessário numa dissolução que continha BSA a 0,2%, HEPES 10 mM e 1 pg/ml de doxiciclina. Uma substância candidata foi diluída preparando primeiro uma solução mãe 10 mM da substância em DMSO a 100%. Então, 5 μΐ dessa dissolução foram adicionadas a 15 μΐ de DMSO para preparar uma dissolução 2,5 mM (50X concentração). Então, 6 μΐ desta solução final foram transferidos a um poço de uma placa de polipropileno à que foram adicionados 300 μΐ de meio. Então, 100 μΐ da solução no poço foram adicionados a cada poço que continha células, eliminando o meio que recobria as células, e foi adicionada 70 cuidadosamente a solução que continha as diluições da substância candidata.

Então foi preparada solução HNTGplus fresca adicionando 1 comprimido da mistura de inibidores de protease "complete mini" (Roche) a 10 ml de água, 200 μΐ de β-glicerofosfato (concentração final, 1 M), 100 μΐ de NaF (concentração final, 1 M) e 10 μΐ de Na3VC>4 (concentração final, 1 M) e foi mantida sobre gelo. Depois de incubar as células durante 3 horas com a substância candidata diluída, o meio foi retirado e a placa foi transferida a gelo. Então foram adicionados 100 μΐ de solução HNTGplus fresca a cada poço que continha células e foram agitados num quarto frio durante 10 minutos. Durante este tempo, o BSA das placas de ELISA foi separado com pipeta e foi lavado duas vezes com TBST.

Então, 50 μΐ do lisado celular foram transferidos da placa de cultura de tecido a um poço lavado da placa de ELISA e foram agitados a temperatura ambiente durante 60 minutos. Então, o lisado celular foi retirado e os poços da placa de ELISA foram lavados três vezes com TBST. Então, 100 μΐ de anticorpo anti-PGEF recentemente diluídos (1:5000) foram transferidos a cada poço da placa de ELISA e foram agitados a temperatura ambiente durante 60 minutos. A solução de anticorpo foi retirada e os poços foram lavados quatro vezes com TBST. Então, 100 μΐ de HRP-GaR recentemente diluídos (1:10.000) foram adicionados a cada poço da placa de ELISA e foram agitados a temperatura ambiente durante 45 minutos. Então, esta solução foi retirada e os poços foram lavados quatro vezes com TBST, seguido de uma lavagem com PBS. Então foi adicionada solução de ABTS à placa a 100 μΐ por poço. Então, a placa de ELISA foi incubada a temperatura ambiente e foi agitada durante entre 10 e 20 minutos.

Depois deste tempo, a placa de ELISA foi colocada sobre um leitor de placas Tecan Sunrise e as medições foram 71 registadas utilizando um filtro de medição a 405 nm com um filtro de referência de 620 nm.

Exemplo 15

Medição da actividade de quinase in vitro de PAK4 humana utilizando um ensaio de proximidade de cintilação O ensaio de proximidade de cintilação (SPA) é utilizado para analisar a actividade da proteína serina/treonina quinase PAK4 in vitro. O protocolo envolveu adicionar 10 μΐ de solução de inibidor a cada poço de uma placa Flexi (placa ("flexi") de poli(tereftalato de etileno) de 96 poços de Wallac, n° de cat. 1450-401) utilizando 10 μΐ de DMSO a 5% para controlos positivos e negativos. A enzima PAK4 foi adicionada aos poços da placa flexi a concentrações que foram determinadas empiricamente. A enzima PAK4 foi purificada a partir de células BL21. No momento desta experiência, a concentração da enzima quinase PAK4 adicionada aos poços foi 0,1 pg por poço num volume de 20 μΐ. A concentração variará com diversas preparações de enzima. Por conseguinte, o perito na especialidade saberia como titular a preparação de enzima e determinaria um período de tempo de actividade da quinase linear para preparações particulares da quinase. São adicionados 20 μΐ de EDTA 0,5 M aos poços de controlo negativo. O substrato foi um péptido de PAK4 que sabe-se que está fosforilado pela enzima PAK que consiste na estrutura biotina-LC-LC-RRKSLVG(pT)PYWMAPE (SEQ ID NO. 19)

O oitavo aminoácido do péptido de PAK4, treonina, era uma fosfotreonina, e o péptido completo foi dissolvido em água a uma concentração final de 5 mg/ml e foi armazenado a -80°C em alíquotas de 100 μΐ até que fosse necessário. No entanto, a invenção contempla que como substrato pode ser utilizado qualquer péptido que acredita-se que está ou que está fosforilado por quinase PAK (por exemplo, PAK4) em lugar do péptido de PAK4. Por exemplo, os péptidos GEF-H1S 72 representados por SEQ ID NO. 3 e 4 podem ser utilizados como substrato de PAK4.

Foi utilizado 2,5 x tampão quinase para facilitar a actividade da quinase PAK4 e continha concentrações de trabalho por poço de HEPES 50 mM (pH 7,4), 12,5 mM de

MgCl2, KC1 375 mM e NaF 2,5 mM. Normalmente, 10 ml de tampão quinase são suficientes para aproximadamente 4,5 placas de reacções. As concentrações finais destes constituintes, após as adições de substância candidata e ATP, São HEPES 20 mM (pH 7,4), MgCl2 5 mM, KC1 150 mM e NaF 1,0 mM.

Para começar a reacção de quinase foram adicionados 20 μΐ de solução de péptido biotinilado de PAK4/ATP aos poços da placa e foram incubados a temperatura ambiente durante 30 minutos, sem agitação, e foram colocados detrás de um escudo reactivo. A solução de péptido/ATP que continha concentrações de trabalho (isto é, concentrações por poço) de ATP frio 1,4 μΜ (isto é, não radioactivo), 0,1 pg por poço de Paktide e 0,33 pCi por poço de γ33Ρ-ΑΤΡ radiomarcado (NEN Easy-Tide, n° de cat. NEG602H). Depois de 30 minutos foram adicionados 200 μΐ de solução stop, para interrupção da reacção, a cada poço e a placa deixou-se em repouso durante pelo menos 15 minutos. A solução "stop" continha concentrações de trabalho por poço de ATP 50 μΜ (não marcado), EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,1% e 0,5 mg de pérolas SPA, preparado em solução tampão PBS. A PBS (solução salina tamponada com fosfato Dulbecco) sem magnésio nem cálcio foi obtida de Gibco BRL (n° de cat. 14190-144). As pérolas foram obtidas de Amersham (pérolas SPA de poliviniltolueno recobertas com estreptavidina de Amersham, n° de cat. NSI 1077). As pérolas foram reconstituídas em PBS sem magnésio nem cálcio a uma concentração de solução mãe de 20 mg/ml e foram armazenadas a 40 C. 73 A seguir, a placa foi centrifugada/submetida a rotação a 2300 rpm durante entre 10 e 15 minutos e depois foi transferida para um leitor de placas Trilux e as contagens de radioactividade foram registadas consequentemente. Exemplo 17

Indução do elemento de resposta a soro A activação dos factores de transcrição que convergem no elemento de resposta a soro (SRE) pode ser atribuída à activação de Ras que é observada em até 50% dos carcinomas de cólon humanos. Veja-se Gauthier-Rouviere et ai., Embo J., 9(1):171-80, 1990. A sinalização de SRE por GEF-H1S e a actividade de PAK4 na direcção 3' de proteínas Ras e Rho foi determinada utilizando um sistema de vector pSRE-SEAP (Clontech, E.U.A.). Este ensaio foi realizado em células NIH-3T3 utilizando métodos de transfecção convencionais. O alelo de GEF-HlS inactivo, QR312,313MG, reduziu os níveis de Rac Rho GTPase activada em células estimuladas. Veja-se Taylor et al., Methods Enzymol., 333:333-42, 2001.

Além disso, a sinalização de SRE é reduzido quase até níveis basais pela expressão transitória do alelo mutante inactivo GEF-HlS QR312,313MG e o mutante de fosforilação S810A.

Exemplo 18

Mudanças morfológicos mediados por alelos de GEF-Hl

Para analisar o efeito de GEF-Hl sobre a morfologia celular em fibroblastos, as construções de fusão de EGFP (proteína verde fluorescente potenciada) de GEF-HlS e uma série de alelos mutantes dos sítios de fosforilação de PAK4 em GEF-HlS foram transfectados em células NIH-3T3. Também foi construído um alelo negativo dominante preparado mutando o domínio DH de GEF-Hl que produziu o mutante, GEF-H-QR312,313MG. Num ensaio de domínio de ligação a p21 (PBD), este alelo negativo dominante inibiu a acumulação de Rac-GTP, mas não de Cdc42-GTP em células NIH-3T3. O 74 citoesqueleto de actina foi corado com cumarina-faloidina para contrastar estruturas de F-actina de células fluorescentes por EGFP por microscopia.

Encontrou-se que GEF-H1S de tipo selvagem foi localizado normalmente na região perinuclear e as células apareceram alongadas com fibras de stress ocasionais. Pelo contrário, a expressão em excesso de GEF-H1S-S810A sozinho conduz a uma acumulação e matriz desorganizada de fibras de stress em comparação com células não transfectadas. A indução de fibras de stress é surpreendente dados os efeitos relativamente modestos sobre o citoesqueleto de actina após a expressão de alelos de GEF-H1S ou PAK4 naturais solos. A morfologia de GEF-H1S-S67A que expressa células foi similar à morfologia de células que expressam o mutante de DH de GEF-H1S negativo dominante. A expressão do mutante do domínio DH GEF-H1S-QR312,313MG cria uma cauda de extensões citoplásmicas naturalmente distribuídas. A indução de fibras de stress no caso de GEF-H1S-S810A é reminiscente à activação de Rho, enquanto as extensões citoplásmicas desorganizadas observadas com GEF-H1-Q312R,M313G e GEF-H1S-S67A poderiam ser restos de caudas de células não retraídas que podem ser devido à inibição de Rho.

Os mudanças na localização e o citoesqueleto de actina são especialmente espectaculares no mutante dupla de GEF-H1S-(S67A-S810A). Os agregados citoplásmicos de F-actina foram encontrados em células que expressam EGFP-GEF-H1S (S67AS810A), além de lamelas de arco largo carentes de F-actina. A redistribuição das proteínas mutantes do sítio de fosforilação e a acumulação inapropriada de F-actina citoplásmica apoia a ideia de que a localização é crítica para a capacidade de GEF-Hl para estimular fibras de stress.

Exemplo 19 75 ΡΑΚ4 activada e GEF-HlS (GEF-Hlb) induzem a formação de lamelipódios em células NIH-3T3 A indução de estruturas de F-actina em fibroblastos, concretamente a formação de filopódios, lamelipódios e fibras de stress, é devido a uma sinalização pelas formas activas de Cdc42, Rac e Rho, respectivamente. As proteínas PAK, especialmente PAK4, desempenham uma função na regulação das estruturas morfológicas baseadas em F-actina. Por conseguinte, foram investigadas as mudanças induzidas por pak4 na morfologia celular mediados pela regulação de GEF-H1S. As construções de EGFP-GEF-Hl foram co-expressadas com diversos alelos de PAK4 marcados com o epítopo HA em células NIH-3T3. A PAK4 exógena foi detectada com um anticorpo anti-HA e o citoesqueleto de actina foi corado com cumarina-faloidina. Embora as células NIH-3T3 tenham níveis de PAK4 e GEF-Hl endógenos baixos, mas detectáveis, estes não foram activados nas condições da experiência.

Por meio do emprego de diversos alelos de PAK4 foi possível confirmar quais efeitos morfológicos foram accionados pela fosforilação de PAK 4 de GEF-Hl. A co-expressão dos alelos de PAK4 com o controlo de egfp produziu efeitos relativamente modestos sobre a formação de estruturas baseadas em F-actina em células NIH-3T3. Em células que co-expressam ΡΑΚ4 de tipo selvagem junto com GEF-HlS de tipo selvagem os inventores observaram um espectacular aumento em filopódios ao contrário de tanto PAK4 como GEF-HlS expressos sozinhos. Pareceu que as estruturas de filopódios eram dependentes da menor actividade do alelo de PAK4 de tipo selvagem e a interacção com GEF-HlS já que não se observaram quando a proteína foi expressa tanto em células sozinhas como em controlos co-transfectados por vectores. Em células que co-expressam a PAK4 S474E activada e GEF-HlS, estas estruturas produziram a transição de filopódios a lamelipódios na margem principal. Não se observaram nem filopódios nem 76 lamelipódios quando GEF-H1S (GEF-Hlb) foi transfectada junto com a quinase inactiva PAK4 K350,351 A. No entanto, as fibras de stress estavam agora abundantemente presentes. Considerado junto com a análise dos mutantes de sítios de fosforilação de PAK4 em GEF-H1S, isto sugere que a actividade da quinase PAK4 é responsável pela transição para a formação de lamelipódios.

Para confirmar se a formação destas estruturas depende ou não da capacidade de PAK4 para fosforilar GEF-H1S foram utilizados mutantes de sítios de fosforilação de GEF-H1S. A co-transfecção de um alelo de GEF-H1S-S810A mutante junto com PAK4 S474E mostra uma profusão de tensão. Isto, junto com o resultado do alelo sem actividade de quinase, motivou a hipótese de que a fosforilação de Ser 810 é responsável por ambos os sinais que conduzem à formação de lamelipódios e inibição da formação de fibras de stress em fibroblastos. Adicionalmente, PAK4 S474E e GEF-H1S-S810A estavam localizados em distintos sítios periféricos que são reminiscentes dos sítios de ligação de adesão a células que servem de pontos de nucleação para fibras de stress de actina. Este tipo de localização de GEF-Hl também foi observado em células HeLa. Ao contrário dos efeitos observados pela mutação de S810, a co-expressão de GEF-H1S-S67 A mutante com PAK4-S474E activada permite a formação dependente de GEF-Hl de lamelipódios, ao mesmo tempo que é evitada a formação de fibras de stress. A actividade de troca de GEF-Hl é conseguida por meio da interacção do domínio de homologia de Dbl (DH) com as Rac ou Rho GTPases em seu estado inactivo. Para determinar se os efeitos mediados por GEF-H1S accionados pela fosforilação de PAK4 são dependentes ou não da actividade de troca de GEF-HlS foram examinadas células NIH-3T3 que co-expressam o mutante de DH negativo dominante de GEF-HlS (Q312M,R313G) com diversos alelos de PAK4. Por conseguinte, observaram-se lamelas de arco largo que careciam de actina, 77 que é uma diferença dos lamelipódios ricos em actina ou fibras de stress formadas em presença de alelos activos de GEF-HlS e PAK4 activada. 0 resultado confirma que os sinais de PAK4 são retransmitidos directamente pelas actividades de troca de GEF-Hl. Um estudo prévio de GEF-Hl mostrou a indução de lamelipódios constitutivos em células Cos-7 por meio da expressão em excesso de GEF-H114. QUADRO 1

Alelo de GEF-Hl Tipo Morfologia celular F-actina Microtúbulo GEF-HlS Tipo selvagem (não possui DC*) polarizada fibras de stress ocasionais matriz radial GEF-H1S810A fosforilação não polarizada profusão de fibras de stress desorganizado GEF-HlS Q312M.R313G mutante de troca não polarizada protuberâncias citoplásmicas / sem estruturas de actina / caudas sem retrair desorganizado GEF-HlS S67A fosforilação não polarizada protuberâncias citoplásmicas / sem estruturas de actina matriz concêntrica / perinuclear GEF-HlS S67.810A fosforilação polarizada agregados citoplásmicos matriz radial GEF-H1M Tipo selvagem polarizada halo de fibras de stress radial/membrana concêntrica 78 Descrição de morfologias para cada alelo de GEF-Hl observado na maioria de células transfectadas. DC* = dedo de zinco. 79 QUADRO 2

Alelo de GEF-Hl Alelo de PAK4 Morfologi a celular F-actina Microtúbulo GEF-H1S PAK4 contraída filopódios extremos matriz radial GEF-HlS PAK4 S474E polarizad a lamelipódio s periféricos desorganizad 0 GEF-H1S PAK4 K350,351 A alargada fibras de stress matriz radial GFF- PAK4S474 não fibras de desorganizad H1S310A E polarizada stress 0 GEF-H1S67A PAK4 S474E não polarizad a lamelipódio s distribuído s matriz concêntrica / perinuclear GEF-HlS PAK4 não lamela de desorganizad Q312M,R313 G S474E polarizad cL arco largo que carece de actina 0 GEF-HlM PAK4 polarizad 6. fibras de stress ocasionais radial GEF-H1M PAK4 S474E não polarizad a lamelipódio s periféricos desorganizad 0 GEF-HlM* PAK4 X350,351 A polarizad a fibras de stress radial Morfologias de células *dados não típicas que são produzidas a partir da maioria que são co-expressas mostrados 80

DOCUMENTOS REFERIDOS NA DESCRIÇÃO

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Documentos de patente referidos na descrição • WO 9963073 A [0003] • US 60393600 B [0087] • WO 9953036 A [0096] • US 6013500 A [0096] • US 4376110 A [0112]

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Claims (24)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Um polinucleótido que codifica o polipéptido indicado em qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3 ou 4. 2. 0 polinucleótido de acordo com a reivindicação 1, em que o polinucleótido compreende a sequência indicada na SEQ ID NO. 1.

3. Um polipéptido GEF-Hlb isolado que compreende a sequência da SEQ ID NO. 2. 4. 0 polipéptido de acordo com a reivindicação 3, em que o polipéptido não possui os resíduos de aminoácidos entre 162 e 354 da SEQ ID NO. 2.

5. Um péptido que consiste na sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 3 ou 4. 6. 0 polipéptido ou péptido de acordo com a reivindicação 3 ou 5, em que o polipéptido ou péptido compreende pelo menos um aminoácido fosforilado.

7. Um complexo de GEF-Hlb/PAK4 isolado, em que o GEF-Hlb compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 2.

8. Um método para detectar a actividade de PAK4 numa amostra que compreende detectar a presença ou o nível de GEF-Hlb fosforilado, em que a detecção de GEF-Hlb fosforilado indica a presença de pelo menos uma PAK4 activa, e em que o dito GEF-Hlb compreende a sequência indicada em qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3 ou 4. 2 9. 0 método de acordo com a reivindicação 8, em que a dita PAK4 está numa célula.

10. O método de acordo com a reivindicação 9, em que a dita célula é uma célula tumoral.

11. Um método de identificação de uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-Hlb que compreende: (a) expor o polipéptido GEF-Hlb a uma substância candidata para formar uma mistura e então (b) introduzir na dita mistura uma enzima PAK4; e (c) medir a quantidade de polipéptido GEF-Hlb fosforilado antes e depois de expor o dito polipéptido GEF-Hlb à dita substância candidata, em que uma diminuição ou um aumento na quantidade de polipéptido GEF-Hlb fosforilado depois da exposição à dita substância candidata indica que a dita substância candidata é uma substância que modula a interacção entre a PAK4 e o polipéptido GEF-Hlb, em que o dito polipéptido GEF-Hlb compreende a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO. 2, 3 ou 4.

12. O método de acordo com a reivindicação 11, em que em (a) PAK4 é exposta a uma substância candidata e em (b) um polipéptido GEF-Hlb é introduzido na mistura.

13. O método de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que o dito polipéptido GEF-Hlb tem a sequência de qualquer uma de SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 OU SEQ ID NO. 4.

14. O método de qualquer uma das reivindicações 11 a 13, em que a etapa de determinar se o GEF-Hlb é fosforilado na etapa (c) é realizada utilizando um anticorpo especifico para GEF-Hlb dirigido contra um péptido que compreende pelo menos uma de serina-810 fosforilada da SEQ ID NO. 2 ou 3 serina-67 fosforilada da SEQ ID NO. 2 para detectar GEF-Hl fosforilado.

15. O método de qualquer uma das reivindicações 11 a 14, em que a dita substância candidata produz uma diminuição na fosforilação total de GEF-Hlb.

16. Um anticorpo específico para GEF-Hlb dirigido contra a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 3 ou na SEQ ID NO. 4. 17. 0 anticorpo específico para GEF-Hlb de acordo com a reivindicação 16, em que a dita sequência de aminoácidos compreende uma serina fosforilada. 18. 0 anticorpo específico para GEF-Hlb de acordo com a reivindicação 17, em que a dita serina fosforilada é serina-810 ou serina-67 de GEF-Hlb de comprimento completo indicada na SEQ ID NO. 2.

19. Um método para identificar uma substância que modula a interacção entre PAK4 e GEF-Hlb que compreende (i) colocar em contacto uma substância candidata com um complexo de GEF-Hlb-PAK4 e então (ii) determinar se a dita substância causa a disrupção do dito complexo, em que o dito GEF-Hlb compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 2.

20. Um método para determinar a presença de PAK4 activada numa amostra de células que compreende (i) obter um lisado celular de uma amostra de células; (ii) isolar e/ou separar proteínas da preparação de lisado celular; e (iii) detectar a presença de fosfovariantes de GEF-Hlb, em que GEF-Hlb compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 2, e em que a detecção de que a serina-810 ou a serina- 4 67 de GEF-Hlb está fosforilada indica que a dita amostra de células compreende PAK4 activada.

21. Um método para seleccionar um fármaco que inibe a actividade da quinase PAK4 que compreende (i) obter um lisado celular de uma amostra de células, (ii) aplicar ao dito lisado a um fármaco candidato; (iii) isolar e/ou separar proteínas da dita preparação de lisado celular; e (iv) detectar a presença de fosfovariantes de GEF-Hlb, em que o GEF-Hlb compreende a sequência de aminoácidos indicada na SEQ ID NO. 2, e em que a detecção de que a serina-810 ou a serina-67 de GEF-Hlb está fosforilada indica que o dito fármaco não inibe a actividade da quinase PAK4 . 22. 0 método da reivindicação 20 ou 21, em que a dita amostra de células é uma amostra de células tumorais.

23. Um método in vitro para detectar a proliferação celular, a mobilidade celular e/ou a invasão celular num mamífero que compreende monitorizar no ponto de tempo A e pelo menos um outro ponto de tempo B o nível de fosforilação de GEF-Hlb numa amostra colhida no dito mamífero, em que um aumento no nível de fosforilação de GEF-Hlb na dita amostra entre os ditos pontos de tempo é indicativo de proliferação celular, mobilidade celular e/ou invasão celular, em que o dito GEF-Hlb compreende a sequência da SEQ ID NO. 2.

24. O método de acordo com a reivindicação 23, em que a dita amostra é uma amostra da pele, sangue ou células do dito mamífero.

25. O método de acordo com a reivindicação 24, em que as ditas células são células tumorais. 5 26. 0 método de qualquer uma das reivindicações 23-25, em que o dito mamífero é seleccionado do grupo que consiste num ser humano, rato, ratinho, cão, coelho, porco, ovelha, vaca, cavalo, gato, primata, cabra ou macaco.

27. Um vector que compreende o polinucleótido da reivindicação 1 ou 2.

28. Uma célula que compreende o vector de acordo com a reivindicação 27.

29. Um polinucleótido isolado que codifica um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ id NO. 21.

30. Um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ id NO. 21.

31. Uma composição farmacêutica que compreende um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21.

32. Um método para identificar uma molécula que causa a disrupção da interacção entre PAK4 e GEF-Hlb que compreende: (a) expor GEF-Hlb a um polipéptido que consiste na sequência de aminoácidos da SEQ ID NO. 21, em que o dito polipéptido se liga ao dito GEF-Hlb para formar um complexo; (b) adicionar uma ou mais moléculas de teste ao dito complexo; e (c) determinar se o dito polipéptido e o dito GEF-Hlb são dissociados um do outro depois de adicionar a(s) dita(s) molécula (s) de teste ao dito complexo. 1/12 MOJ CftCB * í j coco T— T“ C II3 LLU. 5» UJUJ «J (D0S VOOO Ο) W5 T« φ LU 'Φ 09 pij-.j-.S

1 234 TITS U34 1 234 1 334 Eluatos de pérola 12 3 4 pérola GEF-H1 natural Lisados de entrada PAK4 G!D OOMlMiG DE cínasa; JSláSÍL g 8¾ 522|86 a *r -"t· 15¾¾ « < ÍXI 0- CL ' ÍÍ-30SJ **(33t-3S5J* {276-324} GlD (GEF domínio de interaçção)

324 PAK4 454 PAK5 412 PAX6 276 C.....tPAA|AVÍG|pGPR|?Q: 399 3Υΐ|^ά|993τϊ|Ρ@εκΓ 359 I3τ|ν|υ1- -iQDlTV^gALAGEOrG’ Fig 1. Associação in vitro de GEF-Hl a alelos e subdomínios de PAK4 a 2/12 «tf tf* * & < < CL Dl t-· 2* ti 0) 2 X μ. a> 2 £ tU a c § 1 .i Ui a c =5 E á 1 c s '£ W 1 c 1 S «3 18 o. flj α * < a. χ tis* ! 0 c 3 ε 1 α 148- 98*

A549 HCrUô H1299 ant!-GEF-Hl b trans-golgi Fusão α-GEF-Hl α-ΡΑΚ4

β-COP associada a cis-Golgi

Fig 2. PAK4 e GEF-H1 co-associados 3/12 C' ΟControlo <3EF-H1 Maguin o tí0 GST (763-921) Similar g

Amj-HA-GÊF-Hl

|SE<3KFXGLW<3 FNPP JFNPP YSVET Consenso de aa' PAX4 13,25 13,24 13,3 13,-30 13,31, 13.23 13,41 13,45a 13 ,451) GSF-H1 GEF-K1 Maguín-2 similar GEF-Hl-íf Anti-fosfo-G£F-Hl

Fig 3. PAK4 fosforila GEF-Hl in vitro e in vivo 4/12 GEF-HlS EGFP GEF-H1SS531QA

r-W? * v tu GEF-HlS S67A 4. GEF*H15 «wúa *

GEF-HtS QâimHSlW

EGFP

F-actina

Fig 4. Efeitos morfológicos de alelos de GEF-hl 5/12 EGFP <x-HA Actína Fusão pÊGFP-O PAK4oío3Sia

a pEGFP-C2 PAX4 p£<ãrP-C2 PAK4 UME Fig 5a. Efeitos de pak4 sobre o citoesqueleto de actina b 6/12 E6FP HA-PAK4 F-actína Fusão 6EF-H15saieA PAK4U74S

GEF-H1S PAK4 GEF-HlS PAK4 GEF-HlS PAK4&so,35ia

fig. 5b pak4 regula a formação de lamelipoidia através da fosforilação de S810 7/12 ÊGFP α-HA Actina Fusão GEF-H1.M PAK4 GEF-H1M PAK4 54M£

a GÉF-H1M Fig 6a. Sinalização de PAK4 através de GEF-HlM para o citoesqueleto de actina Fig 6b. A actividade de pak4 desestabiliza a associação de gef-hlm a mt 8/12

Fig 6b. A actividade de pak4 desestabiliza a associação de GEF-H1M a mt 9/12

Fig 7. Modelo para a regulação recíproca de Rac e Rho in vi vo Fig 8. Pontuações de fosforilação de proteínas e péptidos GEF-H1 a. PÉPTÍDÕ 681 RRKSLVGTPYWMAPE 1008 RRR.S1PAGDALYL S FNPP 1009 RRRS LPAGDALY1S FNP P 1010 RRRSLPAGDALYLS FNPP 1412 'RQSLLGSRRGRS SLSLAK 1413 RQSLLGSÉRGR S S LSLAK 1414 RQSLLGSRRGRS SLSLAK PAK4 act loop GEFH1(807-824) GEFB1(807-824) GEFH1(807-824) . GEFH1(55-72) GEFS1(55-72) GEFH1 (55-72)·. FOSFORILAÇÃO '+++++· +++Ή-+++++ T++++ POLIPÉPTIDO FOSFORILAÇÃO 1-386 ++++ 386-921 H· 763-921 ++++ 51-921smía Ή-Η· 386-921 úioa - 807.824 t > 11- TT Tf 55-72 ++ 11/12 Fig 9. Regiões reguladoras de GEF-H! são conservadas com Cdc2 4

Consenso Cdc24(62-99) GEF-H1M e S .....FF§QIiAYç|s SLRSKTTI REReÉÍaI Consenso

-PR-RXSLXG.

SSN Cdc2-i (712-752) 'FNPPQFSRGTO GEF-H1M e S 12/12 SEQ tD N°: