JP4522855B2 - ＧＥＦ−Ｈ１ｂ：バイオマーカー，その複合体，アッセイおよび治療用途 - Google Patents

Description

関連する特許出願へのクロスリファレンス
本出願は米国特許出願６０／４６０，０５３（０４／０４／２００３出願），および６０／３９３，６００（０７／０５／２００２出願）（いずれもその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の通常出願である。

発明の分野
本発明は，新規グアニンヌクレオチド交換因子バイオマーカーのリン酸化変種アイソフォームを検出することにより，生物学的サンプルにおいて異常な細胞増殖を診断すること，および細胞成長，特に発癌性の細胞成長を阻害，低下または破壊する薬剤をスクリーニングすることに関する。

発明の背景
グアニンヌクレオチド交換因子（“ＧＥＦ”）は，ＧＴＰの加水分解生成物であるＧＤＰが，小さなＧＴＰ結合蛋白質から解離することを刺激して，新たなＧＴＰ分子の結合を促進する。これを行うにあたり，このＧＥＦにより促進されるＧＤＰとＧＴＰとの交換は，ＧＴＰ結合蛋白質の構造的変化を伴い，これはＧＴＰ結合蛋白質の他の分子との相互作用の程度に影響を及ぼす。例えば，Ｒａｓ蛋白質は，ＧＴＰが結合すると，エフェクターおよび他の分子と相互作用して，細胞増殖，分化およびアポトーシスに影響を与えることができる。

アクチン細胞骨格の変化の空間的局在化におけるＧＥＦの重要性の可能性が理解され始めている。Ｓｈａｍａｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０：１０５（２）：２３３−４４，２００１を参照。進化的な見方では，この空間的制御は，関連性の遠いＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｃｄｃ２４（Ｃｄｃ４２のＧＥＦ）が，種々のシグナルに応答して細胞の異なる空間的ドメインへの細胞骨格変化をターゲティングする上で鍵となる役割を果たすことから，納得しうるものである（Ｏ’Ｓｈｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２（３）：Ｅ３９−４１，２０００）。

すなわち，現存する手法および現在の知識は，細胞増殖を制御することができる手段として，または癌性，発癌性細胞および組織の検出および治療を開発することができる手段として，ＧＥＦ−Ｈ１と他の蛋白質との相互作用を利用しておらず，これに注意してもいない。

発明の概要
したがって，本発明は，配列番号２のＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドをコードする単離された核酸，ならびに配列番号１の配列を含む単離された核酸に関する。これに関連して，本発明はまた，配列番号２の配列を含む単離されたＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドを企図する。

別の態様においては，配列番号３のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドをコードする単離された核酸が提供される。本発明はまた，配列番号３の配列から本質的になるペプチドに関する。同様に，１つの別の態様は，配列番号４のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドをコードする単離された核酸を提供する。別の態様においては，配列番号４の配列から本質的になるペプチドも提供される。好ましい態様においては，配列番号２の残基１６２−３５４のアミノ酸領域を欠失したＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドが提供される。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１はＧＥＦ−Ｈ１Ｓである。本発明は，これらのＧＥＦ−Ｈ１ペプチド，ポリペプチドおよび蛋白質のいずれかのリン酸化された形に関する。すなわち，１つの態様においては，少なくとも１つのリン酸化されている残基を含む，配列番号２，３または４に記載される配列を含むペプチドが提供される。好ましい態様においては，リン酸化されている残基はセリンである。好ましい態様においては，セリンは，配列番号２のセリン−６７および／またはセリン−８１０である。別の態様においては，セリン−６７は，配列番号４の配列を含む３０アミノ酸より短いペプチド中に存在する。別の態様においては，配列番号４の配列を含むペプチドは２５アミノ酸未満の長さである。好ましくは，このペプチドは２０アミノ酸未満の長さである。より好ましい態様においては，配列番号４の配列を含むペプチドは１８アミノ酸の長さである。

別の態様においては，セリン−８１０は，配列番号３の配列を含む３０アミノ酸より短いペプチド中に存在する。別の態様においては，配列番号３の配列を含むペプチドは２５アミノ酸未満の長さである。好ましくは，このペプチドは２０アミノ酸未満の長さである。より好ましい態様においては，配列番号３の配列を含むペプチドは１８アミノ酸の長さである。

本発明はまた，これらのペプチド，ポリペプチドまたは蛋白質のいずれかを検出するために生成した抗体を企図する。すなわち，１つの態様においては，配列番号３に記載される配列を含むペプチドに向けられ，これに結合するＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体が提供される。別の態様においては，配列番号４に記載される配列を含むペプチドに向けられ，これに結合するＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体が提供される。本発明の抗体は標識することができる。好ましくは，標識は蛍光標識または放射性標識である。

別の態様においては，抗体は，本明細書に記載される方法を実施するために用いられる診断キットの一部である。すなわち，１つの態様においては，キットは，抗体を含む第１の容器，および抗体の結合パートナーと標識，例えば放射性同位体とのコンジュゲートを有する第２の容器を含む。別の態様においては，診断キットはまた，ＦＤＡに認可された用途の通知およびその指針を含んでいてもよい。

さらに別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドまたはポリペプチドドメインに特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞株が提供される。

さらに別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体は，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ペプチドに対して向けられ，これに結合する。すなわち，１つの態様は，リン酸化されたセリンを有する配列番号３に記載される配列を含むペプチドを具現する。好ましくは，そのペプチド中のリン酸化されたセリンは配列番号２のセリン−８１０である。別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体は，セリン−６７がリン酸化されている，配列番号４に記載される配列を含むペプチドに対して向けられ，これに結合する。配列番号３および４におけるこれらのセリンの番号付け，すなわちそれぞれセリン−８１０およびセリン−６７は，ＧＥＦ−Ｈ１，特に配列番号２のＧＥＦ−Ｈ１Ｓの全長蛋白質配列の番号付けを示す。

本発明により想定されるペプチドには，配列番号６または配列番号２０の少なくとも１つを含むペプチドが含まれる。別の態様においては，配列番号６または配列番号２０の少なくとも１つから本質的になるペプチドが提供される。さらに別の態様においては，配列番号６の配列を含む３０アミノ酸未満のペプチドが提供される。別の態様においては，配列番号６の配列を含むペプチドは２５アミノ酸未満の長さである。好ましくは，このペプチドは２０アミノ酸未満の長さである。より好ましい態様においては，配列番号６の配列を含むペプチドは１８アミノ酸の長さである。

さらに別の態様においては，配列番号２０の配列を含む３０アミノ酸未満のペプチドが提供される。別の態様においては，配列番号２０の配列を含むペプチドは，２５アミノ酸未満の長さである。好ましくは，このペプチドが２０アミノ酸未満の長さである。より好ましい態様においては，配列番号２０の配列を含むペプチドは１８アミノ酸の長さである。

本発明のＧＥＦ−Ｈ１蛋白質をコードする核酸もまた企図される。すなわち，１つの態様においては，配列番号１の配列を含むポリヌクレオチドが提供される。別の態様においては，配列番号２，３，４，６または２０のいずれかに記載されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが提供される。さらに別の態様においては，配列番号３または配列番号４に記載される配列を含むペプチドをコードする，９０ヌクレオチドの長さより短い核酸分子が提供される。好ましくは，ポリヌクレオチドは，７５ヌクレオチドの長さより短く，より好ましくは６０ヌクレオチドの長さより短く，最も好ましくは５４ヌクレオチドの長さより短い。

本発明はまた，配列番号２に記載される配列を含むＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを企図する。別の態様においては，ベクターは細胞中に存在する。別の態様においては，ベクターは，配列番号３または４の配列を含むポリヌクレオチドを含む。別の態様においては，ベクターは細胞中に存在する。

本発明の別の態様は，配列番号１のヌクレオチド配列を含む核酸を含む細胞である。さらに別の態様においては，配列番号２に記載される配列を含む蛋白質を含む細胞が提供される。別の態様においては，細胞は細菌，真菌または哺乳動物の細胞である。

本発明は，蛋白質がＧＥＦ−Ｈ１に結合して複合体を形成している，単離されたＧＥＦ−Ｈ１／蛋白質複合体を提供する。１つの態様においては，複合体中の蛋白質はキナーゼである。すなわち，本発明は，ＧＥＦ−Ｈ１−キナーゼ複合体を想定する。さらに別の態様においては，キナーゼはセリンおよび／またはトレオニンキナーゼである。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１−キナーゼ複合体のキナーゼはｐ−２１活性化キナーゼ（“ＰＡＫ”）である。より好ましい態様においては，ＰＡＫは，ＰＡＫ４，ＰＡＫ５およびＰＡＫ６からなる群より選択される。さらにより好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ複合体のＰＡＫはＰＡＫ４である。

本発明は，ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質とＰＡＫ蛋白質との間の相互作用を阻害または調節するか，または，ＰＡＫのキナーゼ活性を阻害または調節する物質，例えば，化合物，化学物質，薬剤，蛋白質または核酸を同定する方法を提供する。好ましい態様においては，同定された物質により調節または阻害されるＰＡＫ蛋白質はＰＡＫ４，ＰＡＫ５またはＰＡＫ６である。最も好ましくは，ＰＡＫはＰＡＫ４である。別の態様においては，同定された物質は，ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＰＡＫ蛋白質への結合を調節または阻害するか，またはＧＥＦ−Ｈ１遺伝子の発現レベルを調節する。

本発明の別の観点においては，サンプルにおいてＰＡＫ４活性を検出する方法（“方法１”）が提供される。この方法は，サンプル中のリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在またはレベルを検出することを含み，ここで，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１が検出されることは，サンプルが少なくとも１つの活性なＰＡＫ４をも含むことを示す。１つの態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１は配列番号２，３または４のいずれかに記載される配列を含む。別の態様においては，ＰＡＫ４は細胞のサンプルにおいて検出される。別の態様においては，サンプルは，細胞溶解物から単離された蛋白質の調製物である。別の態様においては，細胞は腫瘍細胞である。好ましい態様においては，腫瘍細胞は哺乳動物中に存在する。さらに別の態様においては，哺乳動物は，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルからなる群より選択される。最も好ましい態様においては，哺乳動物はヒトである。

さらに別の観点においては，本発明は，ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法を提供する。この方法は，（ａ）ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを候補物質に曝露して混合物を形成させ；（ｂ）混合物にＰＡＫ４酵素を導入し；そして次に（ｃ）ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを候補物質に曝露する前および後にリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量を測定する，ことを含む。１つの態様においては，候補物質に曝露した後のリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量の減少または増加は，候補物質が，ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質であることを示す。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドは，配列番号２，配列番号３または配列番号４のいずれかの配列を含む。

ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法（“方法２”）もまた本発明により提供される。この方法は，（ａ）ＰＡＫ４を候補物質に曝露して混合物を形成し；ｂ）混合物中にＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを導入し；そして次に（ｃ）リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量を測定する，ことを含み，ここで，ＰＡＫ４を候補物質に曝露していない対照と比較して，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドの量が減少または増加したことは，候補物質がＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドとの間の相互作用を調節する物質であることを示す。

好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドは配列番号２，配列番号３または配列番号４のいずれかの配列を含む。

別の態様においては，方法１または２においてＧＥＦ−Ｈ１がリン酸化されるか否かを判定する工程は，リン酸化された配列番号２のセリン−８１０またはリン酸化された配列番号２のセリン−６７の少なくとも１つを含むペプチドに対するＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を用いることにより行う。

好ましい態様においては，候補物質は，ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化の総レベルの低下を引き起こす。

別の観点においては，本発明によりＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１Ｓとの間の相互作用を調節する物質を同定する方法（“方法３”）が提供される。この方法は，（ｉ）候補物質をＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体と接触させ，次に（ｉｉ）化合物が複合体を破壊するか否かを判定することを含む。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１は配列番号２の配列を含むＧＥＦ−Ｈ１Ｓである。

本発明により，さらに別の方法（“方法４”）が提供され，この方法は，哺乳動物において候補物質がＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害するか否かを判定するために用いられる。この方法は，（ｉ）哺乳動物において配列番号２の配列を含むＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを測定し；（ｉｉ）哺乳動物を候補物質に曝露し；そして次に（ｉｉｉ）哺乳動物においてＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを測定することを含み，ここで，工程（ｉ）において測定したレベルと比較して，工程（ｉｉｉ）におけるＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルが低下することは，候補物質がＰＡＫ４キナーゼの阻害剤であることを示す。別の態様においては，候補物質の投与後にリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１蛋白質が検出されることは，その薬剤がＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害しないであろうことを示す。別の態様においては，候補物質を適用した後のＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベルに対する候補物質を適用する前のＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベルの比率は，候補物質で処理していない細胞および／または細胞溶解物におけるＧＥＦ−Ｈ１リン酸化の“バックグラウンド”レベルに対する比率を比較することにより決定する。

好ましい態様においては，哺乳動物は，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルである。最も好ましい態様においては，哺乳動物はヒトである。

本明細書に記載されるいずれかの方法により同定された候補物質は，例えば，癌を治療するために，細胞増殖を低下させるために，または足場非依存性細胞成長を低下させるために用いることができる。すなわち，本発明により，哺乳動物において癌を治療する方法（“方法５”）が想定される。この方法は，本発明の１つの方法によりＧＥＦ−Ｈ１活性を調節するか阻害するとして，またはＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１との相互作用を調節するか阻害するとして同定された物質を，哺乳動物に投与することを含む。

さらに別の観点においては，本発明は，細胞サンプルにおいて活性化ＰＡＫ４の存在を検出する方法（“方法６”）を提供する。好ましくは，細胞サンプルは腫瘍細胞サンプルである。この方法は，（ｉ）細胞サンプルから細胞溶解物を調製し；（ｉｉ）細胞溶解物調製物から蛋白質を単離および／または分離し；そして（ｉｉｉ）ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化変種の存在を検出する，ことを含む。１つの態様においては，リン酸化されたセリン−８１０またはセリン−６７を有するＧＥＦ−Ｈ１リン酸化変種が検出されることは，細胞サンプルが活性化されたＰＡＫ４を含むことを示す。

好ましい態様においては，この方法および本明細書に記載される他の方法において，ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベルは，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡアッセイにおいて全細胞を用いて決定する。

本発明の別の観点は，哺乳動物において細胞増殖，細胞運動性および／または細胞侵襲を検出する方法（“方法７”）を含む。この方法は，少なくとも２つの時点（すなわち，時点Ａおよび少なくとも１つの別の時点Ｂ）において哺乳動物から採取したサンプル中のＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化レベルをモニターすることを含み，ここで，時点間でのサンプル中のＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化レベルの増加は，細胞増殖，細胞運動性および／または細胞侵襲を示す。

好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１は配列番号２の配列を含むＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質である。

さらに別の態様においては，方法７のサンプルは，哺乳動物の皮膚，血液，または細胞から得る。１つの態様においては，細胞は腫瘍細胞である。

別の態様においては，哺乳動物は，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルからなる群より選択される。最も好ましくは，哺乳動物はヒトである。

本発明により企図される別の方法（“方法８”）においては，配列番号３または４の配列を含むペプチドを細胞または細胞溶解物調製物に投与して，内因性ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化を競合的に阻害する。１つの態様においては，これらのペプチドは過剰に，すなわちこれらが本質的にすべてのＰＡＫ４蛋白質に結合するような高い濃度で投与される。別の態様においては，配列番号３または配列番号４のいずれかを含む３０アミノ酸の長さより短いペプチドが提供される。．好ましくは，これらのペプチドは，２５アミノ酸の長さより短く，より好ましくは２０アミノ酸の長さより短く，最も好ましくは１８アミノ酸の長さである。

すなわち，本発明はまた，個体においてＧＥＦ−Ｈ１活性を阻害することを含む，個体において癌を治療する方法（“方法９”）を想定する。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１はＧＥＦ−Ｈ１Ｍ，ＧＥＦ−Ｈ１ＳまたはＧＥＦ−Ｈ１Ｕの少なくとも１つである。最も好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を含む。

別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１活性を阻害する工程は，前記ＧＥＦ−Ｈ１をコードする内因性遺伝子の発現を阻害することを含む。さらに別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１活性は，前記個体中に存在する癌性細胞の集団中またはその近くで阻害される。ＧＥＦ−Ｈ１をコードする遺伝子の発現は，当該技術分野において知られる手法，例えばアンチセンス技術およびＲＮＡ干渉により阻害またはダウンレギュレートすることができる。したがって，そのような方法にしたがって一本鎖または二本鎖の核酸（すなわち，ＤＮＡまたはＲＮＡ）を使用して，ＧＥＦ−Ｈ１遺伝子に関連するｍＲＮＡ転写産物を破壊するかその転写を終了させることができ，あるいは，ＧＥＦ−Ｈ１遺伝子それ自体の転写に影響を及ぼすことができる。

本発明の別の観点は，細胞サンプルにおいて細胞増殖および足場非依存性細胞成長を低下させる方法（“方法１０”）を提供し，この方法は，細胞サンプルにおいてＧＥＦ−Ｈ１活性を阻害することを含む。１つの態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１はＧＥＦ−Ｈ１Ｍ，ＧＥＦ−Ｈ１ＳまたはＧＥＦ−Ｈ１Ｕの少なくとも１つである。別の態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１は，好ましくは，配列番号２で記載されるアミノ酸配列を含むＧＥＦ−Ｈ１Ｓである。

本発明の１つの観点においては，配列番号２１のアミノ酸配列を含むが他のグループＩＩ ＰＡＫのアミノ酸を含まないポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドが提供される。好ましい態様においては，ポリペプチドは，グアニン−ヌクレオチド交換因子に結合することができ，これによって，グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化を防止するか，またはグアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化のレベルを低下させることができる。別の態様においては，“配列番号２１のポリペプチド”のグアニン−ヌクレオチド交換因子への結合は，グループＩＩ ＰＡＫ媒介性リン酸化によるそのポリペプチドが結合したグアニン−ヌクレオチド交換因子のリン酸化のレベルを防止または低下させる。好ましい態様においては，ポリペプチドはＧＥＦ−Ｈ１Ｓのアミノ酸７６３−９２１に結合することができる。

本発明にしたがえば，ポリペプチドは，ポリペプチドがなおＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合することができる限り，およびポリペプチドがＰＡＫ４蛋白質または他のグループＩＩ ＰＡＫアイソフォームの他のアミノ酸配列を含まない限り，配列番号２１の一部のみを含んでいてもよい。すなわち，本発明のポリペプチドは，ＰＡＫ４のアミノ酸２７６−３２４（すなわち配列番号２１），またはアミノ酸２８０−３２４，またはアミノ酸２８５−３２４，またはアミノ酸２９１−３２４，またはアミノ酸２９８−３２２（すなわち，配列番号２２）を含むことができる。

すなわち，１つの態様においては，本発明は，配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるかまたは配列番号２１の一部から本質的になるポリペプチドをコードする，単離されたポリヌクレオチドを提供する。本明細書において用いる場合，“から本質的になる”との語句は，配列番号２１以外のグループＩＩ ＰＡＫ蛋白質の他のアミノ酸がないことを示す。

別の態様においては，単離されたポリヌクレオチドは配列番号２１のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。

配列番号２１をコードするポリヌクレオチドは，ＰＡＫと無関係の第２の蛋白質またはポリペプチドをコードする第２のポリヌクレオチドに動作可能なように連結されていてもよい。すなわち，本発明は，配列番号２１および／または配列番号２２のいずれかまたは両方と，少なくとも１つの他の蛋白質またはポリペプチドとを含む融合蛋白質を発現する，配列番号２１のＤＮＡコンストラクトおよび配列番号２２のＤＮＡコンストラクトを想定する。

さらに別の態様においては，単離されたポリヌクレオチドは，配列番号２１のアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし，ここで，ポリペプチドは，グアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる。

別の態様においては，配列番号２２のアミノ酸配列を含むが他のグループＩＩ ＰＡＫアミノ酸を含まないポリペプチドをコードする，単離されたポリヌクレオチドが提供される。好ましい態様においては，ポリペプチドはグアニン−ヌクレオチド交換因子に結合して，その際，グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化を防止するかまたはそのレベルを低下させることができる。別の態様においては，そのような“配列番号２２のポリペプチド”のグアニン−ヌクレオチド交換因子への結合は，ポリペプチドが結合したグアニン−ヌクレオチド交換因子のいずれかの，グループＩＩ ＰＡＫ媒介性リン酸化を防止または低下させることができる。

別の態様においては，単離されたポリヌクレオチドは，配列番号２２のアミノ酸配列から本質的になる，または配列番号２２の一部から本質的になるポリペプチドをコードする。本明細書において用いる場合，“から本質的になる”との句は，配列番号２２以外の他のグループＩＩ ＰＡＫ蛋白質のアミノ酸がないことを示す。

さらに別の態様においては，単離されたポリヌクレオチドは，配列番号２２のアミノ酸配列からなるポリペプチドをコードする。

さらに別の態様においては，単離されたポリヌクレオチドは，配列番号２２のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードし，ここで，ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができる。

本発明の別の観点においては，配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドが提供される。１つの態様においては，ポリペプチドは標識を含む。別の態様においては，標識は，ビオチン，ＨＩＳタグ，放射性標識，蛍光団，および発色団からなる群より選択される。

本発明のさらに別の観点においては，配列番号２２のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドが提供される。１つの態様においては，ポリペプチドは標識を含む。好ましい態様においては，標識は，ビオチン，ＨＩＳタグ，放射性標識，蛍光団，および発色団からなる群より選択される。

本発明はまた，配列番号２１と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって，グアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができるポリペプチドを提供する。

さらに，配列番号２１と少なくとも７６％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドであって，グアニンヌクレオチド−交換因子と結合することができるポリペプチドが提供される。

さらに別の観点においては，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２７６−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも１つの他のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドが提供され，組換えポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７５で示されるアミノ酸配列も，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２５−９８５で示されるアミノ酸配列も含まない。さらに，組換えポリペプチドは，他のグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列のいずれも含まない。

１つの態様においては，ポリペプチドは標識を含む。好ましい態様においては，標識は，ビオチン，ＨＩＳタグ，放射性標識，蛍光団，および発色団からなる群より選択される。

すなわち，本発明のいずれのポリペプチドも，これらを検出し，容易に操作し，またはサンプルから単離することができるように標識することができる。

本発明はまた，配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドを提供し，ここで，ポリペプチドはグアニンヌクレオチド−交換因子に結合することができる。

別の観点においては，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列および少なくとも１つの別のポリペプチド配列を含む組換えポリペプチドが提供され，ここで，組換えポリペプチドはｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２９７で示されるアミノ酸配列を含まず，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２５−９８５で示されるアミノ酸配列を含まない。また，組換えポリペプチドは，他のグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列を含まない。

さらに別の態様においては，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２７６−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。１つの態様においては，このポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２７５で示されるアミノ酸配列を含まず，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２５−９８５で示されるアミノ酸配列を含まない。また，組換えポリペプチドは，他のグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列を含まない。

さらに別の態様においては，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドが提供される。１つの態様においては，ポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２９７で示されるアミノ酸配列を含まず，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２５−９８５で示されるアミノ酸配列を含まない。また，組換えポリペプチドは，他のグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列を含まない。

本発明はまた，配列番号２１またはその一部または配列番号２２のアミノ酸配列から本質的になる，またはそれからなるポリペプチドを含む医薬組成物を含む。好ましい態様においては，そのようなポリペプチドはＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合することができる。

本発明はまた，生物学的サンプル中におけるグアニンヌクレオチド−交換因子の存在を検出する方法を提供する。この方法は，
（ｉ）生物学的サンプルをｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドとともにインキュベートし，そして
（ｉｉ）ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子に結合するか否かを判定する，
ことを含み，ここで，
（ａ）ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基２９８−３２４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み，
（ｂ）ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基１−２９７で示されるアミノ酸配列を含まない，および
（ｃ）ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは，ｐ２１活性化キナーゼ４の残基３２５−９８５で示されるアミノ酸配列を含まない。

１つの態様においては，ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは標識を含む。好ましい態様においては，標識は，ビオチン，ＨＩＳタグ，放射性標識，蛍光団，および発色団からなる群より選択される。

この方法の別の態様においては，ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドのいずれかがグアニンヌクレオチド−交換因子と結合するか否かを判定する工程は，生物学的サンプルから未結合の放射性標識ｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドを除き，次にサンプル中の放射活性のレベルを測定することを含む。

本発明のさらに別の観点は，グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化を阻害する方法である。この方法は，グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露することを含み，ここで，ポリペプチドはグアニン−ヌクレオチド交換因子に結合し，その際グアニン−ヌクレオチド交換因子のＰＡＫ４媒介性リン酸化をある程度またはすべて阻害する。他のグループＩＩ ＰＡＫ蛋白質によるＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化もまたこの方法により同様に阻害されることもありうる。

１つの態様においては，グアニン−ヌクレオチド交換因子は生物学的サンプル中に，例えば組織，培養細胞，または単離された細胞中に存在する。別の態様においては，生物学的サンプルは哺乳動物から得られたものである。好ましい態様においては，哺乳動物は，ヒト，マウス，ラット，ブタ，ウシ，ウサギ，イヌ，ネコ，ウマ，ヤギ，霊長類，またはサルである。最も好ましい態様においては，哺乳動物はヒトである。

さらに別の態様においては，グアニン−ヌクレオチド交換因子をポリペプチドに曝露する工程は，ポリペプチドを含む医薬組成物を哺乳動物に投与することを含む。好ましい態様においては，ポリペプチドを含む医薬組成物は，錠剤，エアロゾル，粉体，液体，ゲル，クリーム，坐剤のいずれかである。

本発明はまた，ＰＡＫ４とグアニン−ヌクレオチド交換因子との間の相互作用を破壊する分子を同定する方法を提供する。この方法は，
（ａ） グアニン−ヌクレオチド交換因子を配列番号２１のアミノ酸配列から本質的になるポリペプチドに曝露し，ここで，ポリペプチドはグアニン−ヌクレオチド交換因子に結合して複合体を形成し；
（ｂ） １またはそれ以上の試験分子を複合体に加え；そして
（ｃ） 試験分子を複合体に加えた後にポリペプチドおよびグアニン−ヌクレオチド交換因子が互いに解離するか否かを判定する，
ことを含む。

本発明はまた，ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームのＰＡＫ４媒介性リン酸化を阻害する方法を包含する。この方法は，配列番号２１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを細胞に導入することを含み，ここで，ポリヌクレオチドはポリペプチドを産生するよう発現され，ポリペプチドは細胞中でＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合し，このことによりＰＡＫ４リン酸化を阻害する。好ましい態様においては，ベクターは他のいずれかのグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列をコードしない。

“阻害する”とはＧＩＤ含有ポリペプチドがＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合したときに，ＰＡＫ蛋白質の，特にＰＡＫ４の正常なリン酸化活性が，すべて，ほとんど，またはある程度減少することであると理解される。“ＧＩＤ”は以下に定義される。

図面の簡単な説明
図１：（出現順にそれぞれ配列番号３２−３４）
ＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４への直接結合
（ａ）ｍｙｃタグ付きＰＡＫ４アレルまたはサブドメインを過剰発現する２９３Ｔ細胞から溶解物を調製し，グルタチオンビーズに結合したＧＳＴ，ＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１（７８７−９２１）およびＧＳＴ−Ｍａｇｕｉｎ−様（ビーズ名称１，２，３，４）とともにインキュベートした；または（ｂ）ＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１を過剰発現する２９３Ｔ細胞から溶解物を調製し，ストレプトアビジンビーズに結合させたＰＡＫ４ビオチン化ペプチド（２９１−３５５）および（２７６−３２４）とともにインキュベートした。等量のビーズおよび過剰の溶解物（５００ｕｇ）を用いた。ビーズの溶出物および総溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し，ｍｙｃまたはＧＥＦ−Ｈ１抗血清を用いて免疫ブロットした；（ｃ）はＰＡＫ４遺伝子を示し，ＧＥＦ−Ｈ１相互作用ドメイン（ＧＩＤ）を同定するために用いたＰＡＫ４の領域の概略が示される；（ｄ）ＰＡＫ４の最小結合領域により規定されるＧＩＤとＰＡＫ５およびＰＡＫ６とのアラインメント。

図２：腫瘍細胞においてＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１との間の相互作用が生ずる
（ａ）Ａ５４９，ＨＣＴ１１６およびＨ１２９９からのヒト腫瘍細胞溶解物を，抗ＰＡＫ４，抗ＧＥＦ−Ｈ１および抗ＰＡＫ４免疫前血清と結合させたプロテインＧビーズで免疫沈殿した。ビーズ溶出物は，抗ＧＥＦ−Ｈ１抗血清を用いるウエスタンブロッティングにより分析した。（ｂ）Ｈ１２９９細胞の二重免疫蛍光は，ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１（赤）がシス−ゴルジ付随蛋白質β−ＣＯＰ（緑）と共局在化し，およびトランスゴルジマーカーである小麦胚芽アグルチニン（青）と部分的共局在化することを示す。

図３：（配列番号３５−３７，３７−４５および４５−４７（それぞれ表示順））
ＰＡＫ４はインビトロおよびインビボでＧＥＦ−Ｈ１をリン酸化する
（ａ）インビトロキナーゼアッセイは，精製したＧＳＴ，ＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１（７６３−９２１）およびＧＳＴ−Ｍａｇｕｉｎ様蛋白質がＰＡＫ４によりリン酸化されることを示す。ネガティブ対照の自己リン酸化反応は，基質を含まない反応混合物である。反応基質の濃度勾配は三角形で示される；
（ｂ）ファージディスプレイのヒットに対してアライメントした重み付けしたＰＡＫ４基質コンセンサス（点線の上）。アスタリスクはリン酸アクセプター部位を示す。推定リン酸化部位を有するアミノ末端ＧＥＦ−Ｈ１ペプチド（点線の下）は“＊”で示される；
（ｃ）ＰＡＫ４によるＧＥＦ−Ｈ１のインビボでのリン酸化は，共トランスフェクトした溶解物をリン酸特異的抗ＨＡ抗血清（下パネル）でプローブしたウエスタンブロットで示される。総ＧＥＦ−Ｈ１の量はＨＡ抗血清を用いて検出した（上パネル）。

図４：ＧＥＦ−Ｈ１アレルの形態学的影響
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＥＧＦＰタグ付きＧＥＦ−Ｈ１アレルでトランスフェクトした；ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（Ｉ），ＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ８１０Ａ（ＩＩ），ＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ６７Ａ（ＩＩＩ），ＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ６７，８１０Ａ（ＩＶ），ＧＥＦ−Ｈ１Ｑ３１２Ｍ，Ｒ３１３Ｇ（Ｖ）およびＥＧＦＰ（ＶＩ）。ＧＦＰ蛍光を用いてＧＥＦ−Ｈ１（左パネル）の発現を検出し，および蛍光−ファリシジンを用いて細胞骨格の再配列をモニターした（右パネル）。

図５：ＰＡＫ４はＳｅｒ８１０のリン酸化を介してラメリポディウム形成および張線維の減弱化を制御する。
（ａ）ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１Ｓアレルでトランスフェクトし，ＥＧＦＰの蛍光イメージングによりＧＥＦ−Ｈ１アレルを調べた。ＰＡＫ４コンストラクトは，ＰＡＫ４についてはＨＡ抗血清，続いて抗マウス蛍光ローダミンコンジュゲートを用いて，免疫染色により同定した。アクチンを標識するためには蛍光クマリン−ファリシジンを用いた。ａ）対照ＥＧＦＰとコトランスフェクトしたＰＡＫ４（Ｉ）および変異体ＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅ（ＩＩ）およびＰＡＫ４Ｋ３５０，３５１Ａ（ＩＩＩ）；ｂ）ａと同様に，ＧＥＦ−Ｈ１ＳをＰＡＫ４アレルと（Ｉ−ＩＩＩ），およびＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ８１０Ａ，ＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ６７ＡおよびＧＥＦ−Ｈ１ＳＱ３１２Ｍ，Ｒ３１３ＧをＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅと（ＩＶ−ＶＩ），コトランスフェクトした。矢印は，ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥとＧＥＦ−Ｈ１ＳまたはＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ６７Ａとを共発現する細胞についてのラメリポディウム誘導を示す。アスタリスクは張線維の誘導を有する細胞を示す。スケールバーは１０μｍを示す。

図６：ＰＡＫ４シグナリングはＧＥＦ−Ｈ１Ｍを介してアクチンおよびＭＴ細胞骨格に伝わる
ＮＩＨ−３Ｔ３細胞をＧＥＦ−Ｈ１およびＰＡＫ４でコトランスフェクトした。ＧＥＦ−Ｈ１およびＰＡＫ４の発現は，ＧＥＦ−Ｈ１についてはＥＧＦＰの，ＰＡＫ４についてはＰＡＫ４抗血清（＃９３３）およびその後に抗ウサギ蛍光ローダミンの蛍光イメージングにより検出した。蛍光クマリン−ファリシジンを用いてアクチン細胞骨格を調べた。抗β−チューブリン，続いて抗マウス−マリナブルーコンジュゲートを用いて，ＭＴ細胞骨格を染色した。（ａ）においては，ＧＥＦ−Ｈ１ＭはＰＡＫ４および変異体ＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅと一緒に示されている。矢印はＧＥＦ−Ｈ１Ｍと変異体ＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅをを共発現する細胞におけるアクチンの豊富なラメリポディウムを示す；（ｂ）ＧＥＦ−Ｈ１Ｍならびにベクターおよび変異体ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥおよびＰＡＫ４Ｋ３５０，３５１Ａが示される。変異体ＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅの存在下におけるＭＴ細胞骨格の分極していない部分的解離に注目されたい。スケールバーは１０μｍを表す。

図７：インビボでのＲａｃおよびＲｈｏの相反的制御のモデル
（ａ）リン酸化されていない状態のＧＥＦ−Ｈ１は，基底の構成的Ｒｈｏ活性を保持している；（ｂ）ＰＡＫ４はＧＥＦ−Ｈ１をリン酸化してＲａｃ活性化と構成的Ｒｈｏシグナリングの阻害を同時に生じさせることによりＧＥＦ−Ｈ１を制御することができる。

図８：（出現順にそれぞれ配列番号１８，３，３，３，４，４および４）
ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質およびペプチドのリン酸化スコア
（ａ）可能性のある制御領域から誘導したペプチドホスホアイソマーを用いてリン酸化部位を確認した。赤字で示される残基は予めリン酸化されており，インビトロでリン酸化をブロックする；（ｂ）ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質上のＰＡＫ４リン酸化を物理学的に位置決定するために用いられた欠失と部位特異的突然変異体との組み合わせ。

図９：（配列番号３５，４８−４９，３５および５０−５１）
ＧＥＦ−Ｈ１とＣｄｃ２４の保存
Ｃｄｃ２４との残基の保存は，ピンク色および黄色で示される。ＰＡＫ４リン酸化部位は，重み付けされたコンセンサス上のアスタリスクにより強調されており，これはＣｄｃ２４との間で保存されている推定制御領域と並列されている。

図１０はＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子の概略図であり，リン酸化されるセリン残基６７および８１０の位置を，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質の鍵となるドメイン，すなわちいわゆる“ＤＨ”ドメインおよび“ＰＨ”ドメインとの関係で示す。

好ましい態様の詳細な説明
米国特許出願６０／３９３，６００においては，種々のＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームが“ＧＥＦ−Ｈ１ａ”，“ＧＥＦ−Ｈ１ｂ”および“ＧＥＦ−Ｈ１ｃ”として示されている。本明細書においては，これらの同じアイソフォームを“ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ”，“ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ”および“ＧＥＦ−Ｈ１Ｕ”と表す。したがって，“ＧＥＦ−Ｈ１ａ”は“ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ”と同じであり；“ＧＥＦ−Ｈ１ｂ”は“ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ”と同じであり；“ＧＥＦ−Ｈ１ｃ”は“ＧＥＦ−Ｈ１Ｕ”と同じである。

これらのＧＥＦ−Ｈ１スプライシングアイソフォームのうち，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓは，ＧＥＦ−Ｈ１の残基１−９２１から本質的になり，さらに７アミノ酸の“ミニ−エクソン”を含む。ＧＥＦ−Ｈ１ＳはＮ末端ジンクフィンガードメインを含まない。これとは対照的に，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍのアミノ酸配列はジンクフィンガードメインを含み，これは微小管結合に関与している。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍの配列は，Ｋｒｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，（上掲）に記載されるＧＥＦ−Ｈ１の全長版，すなわち残基１−９８５と同一である。

すなわち，本発明は，細胞増殖のバイオマーカーであり，癌を治療するための候補薬剤のスクリーニングの標的である，新規ＧＥＦアイソフォーム“ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ”を提供する。本発明者らは，ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームのある種のリン酸化状態を検出することにより，細胞が発癌性であるか，あるいは異常な細胞成長を示すか否かを判定することができることを発見した。

ＧＥＦ−Ｈ１は，交換因子の“Ｄｂｌファミリー”に属するグアニンヌクレオチド交換因子である（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（５２）；３４９５４−６０，１９９８）。本明細書に記載される新規ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子（配列番号１）は，２７６３ヌクレオチドを含み，約１０４ｋＤの予測分子量を有する９２１アミノ酸の蛋白質（配列番号２）をコードする。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓを含むすべてのファミリーメンバーに共通するものは“ＤＨ”および“ＰＨ”ドメインである。Ｃｈａｎ， ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，９（４）：１０５７−６３，１９９４；およびＭｕｓａｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，１８（９）：３４３−８，１９９３を参照。典型的には，酵素活性はＤＨドメイン中に存在し，Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅｓのＲａｓスーパーファミリーに属する蛋白質におけるＧＤＰからＧＴＰへの交換を容易にする。ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＤＨドメイン（すなわち，配列番号２）は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質の１６２位および３５４位に位置するアミノ酸中に存在する。ＰＨドメインは，アミノ酸３９６と４９６との間に位置する。本発明はまた，ＤＨドメインを含まないが１またはそれ以上のリン酸化部位を含むＧＥＦ−Ｈ１ペプチドに関する。

以下に詳細に説明するように，ＧＥＦ−Ｈ１を過剰発現する細胞は，足場非依存性であり，異常に増殖する。さらに，そのような細胞は，無胸腺ヌードマウスに移植したとき，腫瘍を形成することができる。したがって，ＧＥＦ−Ｈ１の発現をダウンレギュレートまたは阻害することにより，そのような表現型の発生を予防または低下させることができる。

配列番号２に記載される配列を有する新規なＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質は，セリン／トレオニン−蛋白質キナーゼであるｐ−２１活性化キナーゼ４（“ＰＡＫ４”）と関連しており，これによりリン酸化される。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質中の２つの領域，すなわちセリン−８１０およびセリン−６７がＰＡＫ４によりリン酸化される。“セリン−８１０”および“セリン−６７”は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質，すなわち配列番号２のアミノ酸位置８１０および６７を表す。しかし，他のＧＥＦ−Ｈ１蛋白質もまたこれらの位置および一般的リン酸化認識部位中にセリン残基を含む。“リン酸化認識部位”とは，特定のキナーゼにより認識されるリン酸化可能なセリン／トレオニン残基のいずれかの側のアミノ酸残基の短いストレッチを表す。したがって，“セリン−８１０”および“セリン−６７”との用語は，多数のＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のいずれか１つにおけるリン酸化可能なセリン残基を表す。これらの位置（すなわち，配列番号２の８１０位および６７位）のトレオニン残基もまたキナーゼによりリン酸化されると考えられる。

すなわち，残基８０７−８２４，ＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ（配列番号３）中で，および残基５５−７２，ＲＱＳＬＬＧＳＲＲＧＲＳＳＬＳＬＡＫ（配列番号４）中で示されるセリン（太字，下線）を含む任意のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドは，ＰＡＫ４によりリン酸化される。他のＧＥＦ−Ｈ１蛋白質には，ＧＥＦ−Ｈ１ＭおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｕが含まれる。前者はＲｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７３（５２）：３４９５４−６０，１９９８；およびＫｒｅｎｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．，４（４）：２９４−３０１，２００２に記載されている。ＧＥＦ−Ｈ１Ｕは，Ｒｅｄｄｙ＆Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，４９（７）：１７６３−７，１９８９に記載されている。本発明は，配列番号３または配列番号４のいずれかを含む３０アミノ酸の長さより短いペプチドを想定する。好ましくは，これらのペプチドは２５アミノ酸の長さより短く，より好ましくは２０アミノ酸の長さより短く，最も好ましくは１８アミノ酸の長さである。したがって，本発明はまた，配列番号３または４のいずれかの配列を含むペプチドをコードするポリヌクレオチドを企図する。すなわち，本発明は，配列番号３または配列番号４に記載される配列を含むペプチドをコードする９０ヌクレオチドの長さより短いポリヌクレオチドを想定する。好ましくは，ポリヌクレオチドは，７５ヌクレオチドの長さより短く，より好ましくは６０ヌクレオチドの長さより短く，最も好ましくは５４ヌクレオチドの長さより短い。

したがって，これらのＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームのセリン−８１０およびセリン−６７は，ＰＡＫ４の存在下でリン酸化されるであろう。したがって，本発明は，ＰＡＫ４活性を指示するものとしてＧＥＦ−Ｈ１Ｓのリン酸化を測定することを企図するが，本発明はまた，ＧＥＦ−Ｈ１ＭおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｕアイソフォームのリン酸化も包含する。すなわち，“総”ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化レベルは，配列番号３または４に記載される配列のペプチドを含むＧＥＦ−Ｈ１蛋白質；すなわち，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ，ＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｕの累積的リン酸化状態を示す。

この情報から，ＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化コンセンサス配列は，Ｎ末端からＣ末端に，“ＲＢＳＺＸＧ”（配列番号６）または“ＲＢＳＺＸＬ”（配列番号２０）（式中，Ｒはアルギニンであり，Ｂは塩基性アミノ酸であり，Ｓはセリンであり，Ｚは疎水性アミノ酸であり，Ｘは任意のアミノ酸であり，Ｇはグリシンであり，Ｌはロイシンである）であるという予測が導かれる。ＧＥＦ−Ｈ１中のいくつかのリン酸化部位においては，Ｃ−末端アミノ酸残基はグリシンであるが，別の部位においては，残基はロイシンである。したがって，このコンセンサス配列構造を含むすべてのペプチドは，ＰＡＫ４によるリン酸化の標的である可能性があり，そのようなペプチドは本発明にしたがうアッセイにおいて用いることができる。さらに，ＲＢＳＺＸＧ（配列番号６）および／またはＲＢＳＺＸＬ（配列番号２０）コンセンサス配列から本質的になるすべてのペプチドは，ＰＡＫ４によるリン酸化の標的である可能性があり，そのようなペプチドは，本発明にしたがうアッセイにおいて用いることができる。

ＰＡＫ４は，ヒト腫瘍細胞株で過剰発現されており，ＰＡＫファミリーのキナーゼの他のメンバーとともに，細胞形態学および運動性の制御における関与が示唆されている。例えば，Ｃａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，４；２７７（１）：５５０−８，２００２；Ａｂｏ ｅｔ ａｌ．，ＥＭＢＯ Ｊ．，１７（２２）：６５２７−４０，１９９８；Ｇｎｅｓｕｔｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ，２７６（１７）：１４４１４−９，２００１；Ｑｕ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２１（１０）：３５２３−３３，２００１；およびＤａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（３４）：３２１１５−２１，２００１を参照。本明細書において用いられる“ＰＡＫ４”蛋白質はまた，ＷＯ９９／５３０３６および米国特許６，０１３，５００に記載されている。他のＰＡＫ酵素は，ＧＥＦ−Ｈ１等のＧＥＦ蛋白質をリン酸化することができる。ＰＡＫ５およびＰＡＫ６が，配列番号３または４のリン酸化部位を含むＧＥＦ−Ｈ１をリン酸化しうることが企図される。ＰＡＫ５は，Ｐａｎｄｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，２１（２４）：３９３９−４８，２００２およびＤａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，２２（２）：５６７−７７，２００２により記載されている。ＰＡＫ６は，Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６（１８）：１５３４５−５３，２００１において記載されている。

ＰＡＫ４の過剰発現は，局在化したアクチン重合および糸状足の形成を誘導し，したがって，細胞のアクチン細胞骨格の変化はＰＡＫ４活性が原因であると考えることができる。さらに，ＰＡＫキナーゼは，発癌性Ｒａｓにより推進される足場非依存性細胞成長および細胞生存の制御における関与が示唆されている。例えば，Ｃａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，２００２は，活性化ＰＡＫ４は細胞をトランスフォームする能力を有するが，不活性な形（“キナーゼデッド”）はＲａｓ依存性の足場非依存性細胞増殖をブロックすることを示した。一般に，腫瘍細胞は足場を必要とせず，懸濁して成長することができる。足場非依存性細胞増殖は，発癌性細胞の顕著な特徴である。したがって，ＰＡＫ４は，発癌性におけるその関与が強く示唆され，Ｒａｓトランスフォーメーションに特に重要であると考えられる。

この観点からみると，本明細書に記載される研究は，ＧＥＦ−Ｈ１がＰＡＫ４の基質であること，およびこれが活性化型のキナーゼによりリン酸化されることを明らかにする。したがって，ＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化状態を検出することにより，ＰＡＫ４が活性であるか不活性であるかを判定することができる。したがって，細胞または組織サンプルが増殖しているかまたは異常な細胞成長または形態学の徴候を示すか否かを確かめることができる。すなわち，ＧＥＦ−Ｈ１はＰＡＫ４活性の優れたバイオマーカーであり，ＰＡＫ４活性をブロックしうる薬剤および化合物をスクリーニングするのに非常に有用である。例えば，ＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化状態を変化させる薬剤は，直接的にまたは間接的に作用してＰＡＫ４キナーゼを阻害し，このことにより，細胞増殖を改善し，低下させまたは理想的には停止させる薬剤でありうる。したがって，候補薬剤の存在下および非存在下でＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化パターンをモニターすることにより，可能な癌治療を識別することができる。

この文脈においては，アッセイは，（ｉ）試験サンプルから細胞溶解物を取得し；（ｉｉ）細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および／または分離し；そして（ｉｉｉ）ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化変種，すなわち，セリン−８１０および／またはセリン−６７がリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１蛋白質の存在を検出することを含む。この点に関して，試験サンプルの細胞溶解物における全ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを対照細胞サンプルから単離された全ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化レベルと比較することにより，そのレベルが異常であるかどうかを判定することができる。対照細胞サンプルは，試験サンプルと同じ細胞タイプであるが，哺乳動物から，または健康であることが知られている起源，すなわち哺乳動物野生型細胞から単離された細胞のサンプルである。対照細胞サンプルは，試験細胞サンプルを単離した同じ個体から単離することができる。哺乳動物は，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルでありうる。

すなわち，試験サンプルと対照サンプルとの間のＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベルの比率は，（ｉ）より多い数の活性なＰＡＫ４キナーゼ，または（ｉｉ）より早い速度の触媒活性を有するＰＡＫ４キナーゼ酵素，のいずれかを有する試験サンプル中において高いことが予測される。例えば，運動性，増殖および細胞侵襲に関与する細胞は，より高いＰＡＫ４活性を，したがって，他のタイプの非運動製細胞より高いレベルのＧＥＦ−Ｈ１リン酸化を有するであろう。この点に関して，腫瘍細胞および免疫系の細胞（すなわちマクロファージ）は，運動性，増殖および細胞侵襲に関与する細胞の例である。腫瘍細胞の例には，組織の癌および造血性起源の癌からの細胞が含まれる。

上に概説した方法の工程（ｉｉｉ）は，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を用いて行うことができる。すなわち，本発明は，リン酸化された形のＧＥＦ−Ｈ１を標的とするリン酸特異的抗体を提供する。

ＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化状態を測定するためには，多数の既知のプロトコルのいずれを用いてもよい。例えば，以下の実施例９に記載されるように，ＧＥＦ−Ｈ１またはＧＥＦ−Ｈ１−ＰＡＫ複合体に結合したリン酸特異的抗体を検出することができる。ＧＥＦ−Ｈ１−ＰＡＫ複合体とは，ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質とＰＡＫ蛋白質とが，２つの蛋白質が互いに結合するように物理学的に相互作用することを表す。複合体の蛋白質は，時間の経過とともに解離してもしなくてもよい。好ましくは，ＧＥＦ−Ｈ１−ＰＡＫ複合体はＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−ＰＡＫ４複合体である。この文脈において，複合体のＧＥＦ−Ｈ１Ｓは，配列番号２に記載される配列を含む。

あるいは，ハイブリッドグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）を，配列番号３および４に示されるリン酸化されたおよびリン酸化されていない形のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドの両方に高い親和性を有する一本鎖抗体に結合させるよう加工することにより，リン酸化を測定することができる。次に，Ｄｅｏ＆Ｄａｕｎｅｒｔ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８９（１）：５２−９，２００１に記載されるように，蛍光分光光度計を用いて“蛍光クエンチング”の程度をモニターする。ＧＦＰハイブリッドはＧＥＦ−Ｈ１ペプチドのリン酸化によりコンフォメーションが変化し，このことにより異なる種類の蛍光を生じ，これは簡単かつ容易に検出および定量することができる。

同様に，配列番号３および４のリン酸化されていない形のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドから誘導されたビオチン化ペプチド基質をＧＦＰに結合させることができる。続くＰＡＫ４によるリン酸化により，上述した蛍光クエンチングが生ずると予測される。ビオチンは，蛍光を用いることができない場合に呈色および発色測定を可能とする。例えば，ＰＡＫ４活性を阻害する物質はまた基質，例えばＧＥＦ−Ｈ１ペプチドのリン酸化をも防止するため，ペプチドコンフォメーションのポジティブの変化はほとんどまたは全くなく，したがって，ＧＦＰ蛍光の変化もほとんどまたは全くない。しかし，ビオチン標識は，候補阻害剤物質の存在下で，リン酸化およびそれがないことの測定を容易にする。

ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化の程度を測定するのに有用なさらに別の方法は“蛍光共鳴エネルギー転移”（ＦＲＥＴ）である。Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２０（３）：２８７−９４，２００２を参照。この方法は，リン酸化を指示するものとして，ＰＡＫ４リン酸化認識ドメインとＧＥＦ−Ｈ１基質ペプチド（または誘導体）（例えば，配列番号３および４のもの）の間のリン酸成分の転移を測定する。

ゲルシフトアッセイは，蛋白質のリン酸化を検出することができるさらに別の方法である。Ｗｅｇｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９（３）：１８３４−４１，１９８４を参照。

本発明は，生化学に基づく細胞溶解物アッセイおよび放射性方法を用いて，ＰＡＫ４による全ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質およびＧＥＦ−Ｈ１由来ペプチドのリン酸化の変化をモニターし，記録し，検出する。以下の実施例１４および１５を参照。細胞アッセイにおいては，ＧＥＦ−Ｈ１に対するリン酸特異的抗体を用いて，細胞溶解物調製物中のリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在を検出する。ＧＥＦ−Ｈ１に特異的な抗体は，多数の手法のいずれを用いて生成してもよい。例えば，抗体はウサギで生成することができる。Ｎｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｂ Ａｎｉｍ．Ｓｃｉ．，２３（３）：３９１−６，１９７３を参照。特定の蛋白質にユニークまたは特異的であるエピトープに対する抗体を生じさせることができる。例えば，ＰＡＫ４について先に示されているようにして，ＫＬＨ−コンジュゲート化ペプチドＣＳＧＤＲＲＲＡＧＰＥＫＲＰＫＳＳ（配列番号２３）に対する抗体を生じさせることができる。Ｈａｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，５５（３）：３７５−８７，１９８２を参照。

同様に，ＧＥＦ−Ｈ１に特異的な抗体はウサギで生成してもよい。詳細には，ＰＡＫ４によりリン酸化されるＧＥＦ−Ｈ１領域，すなわちＧＥＦ−Ｈ１Ｓ領域８０７−８２４（配列番号３）および５５−７２（配列番号４）に対する抗体を生成することができる。リン酸で修飾された形のこれらのペプチドに対する抗体を生成することもできる。そのようにして，リン酸化されていないまたはリン酸化されているＧＥＦ−Ｈ１の変種のいずれかに特異的な抗体を設計することができる。

ＰＡＫ４抗体を表面，例えばビーズの表面に結合させることにより，溶解した細胞中に存在するＰＡＫ４蛋白質を捕捉することができる。したがって，細胞溶解物中に存在するＰＡＫ４蛋白質は，表面／ビーズに結合した抗体とこれらとの相互作用により，表面またはビーズに結合する。さらに，調製物中にＧＥＦ−Ｈ１も存在する場合には，同様にしてＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体を単離することができる。細胞は，既知の系統の樹立された細胞株からのものであってもよい。例えば，上でおよび実施例１４に記載されるように，腫瘍細胞株から細胞溶解物を調製し，リン酸特異的抗体で処理してもよい。

抗体は，モノクローナル抗体でもポリクローナル抗体でもよく，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチド，そのドメインまたはフラグメントに特異的結合親和性を有する抗体フラグメントであってもよい。“特異的結合親和性”とは，特定の条件下で，抗体が，他のポリペプチドに結合するより高い親和性をもって標的ポリペプチドに結合することを意味する。好ましくは，抗体は，配列番号２，３または４のいずれかに記載される配列を含むＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドに結合する。より好ましくは，抗体は，配列番号３または４に記載される配列を含むポリペプチドに結合する。ＧＥＦ−Ｈ１に対する抗体はまた，リン酸化された形のＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームのにも結合することができる。したがって，これらの抗体は，リン酸化された形の配列番号２，３および４に記載されるペプチドに結合する。このようにして，ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化されたセリン８１０および６７を含むペプチドに結合する抗体を生成することができる。

"ポリクローナル"との用語は，抗原または抗原性を有するその機能的誘導体で免疫した動物の血清から誘導される，抗体分子の異成分集団である抗体を表す。ポリクローナル抗体の製造のためには，種々の宿主動物に抗原を注射することにより免疫することができる。宿主の種により，種々のアジュバントを用いて免疫学的応答を増加させることができる。

"モノクローナル抗体"は，特定の抗原に対する抗体の実質的に均一な集団である。モノクローナル抗体は，培養連続細胞株による抗体分子の生成を与える任意の技術により得ることができる。モノクローナル抗体は，当業者に知られる方法により得ることができる（Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５−４９７，１９７５，および米国特許４，３７６，１１０）。

本発明の抗体には，"ヒト化"モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体が含まれる。ヒト化抗体は，抗体の非ヒト（典型的にはネズミ）相補性決定領域が非ヒト（例えばネズミ）免疫グロブリンの重および軽可変鎖からヒト可変ドメイン中に移され，次にネズミ対応物のフレームワーク領域中のいくつかのヒト残基が置き換えられている組換え蛋白質である。本発明にしたがうヒト化抗体は，治療方法において用いるのに適している。ネズミ免疫グロブリン可変ドメインをクローニングする一般的手法は，例えば刊行物（Ｏｒｌａｎｄｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：３８３３（１９８９））に記載されている。ヒト化モノクローナル抗体を製造する手法は，例えば，Ｊｏｎｅｓら（Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２（１９８６）），Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら（Ｎａｔｕｒｅ ３３２：３２３（１９８８）），Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３９：１５３４（１９８８）），Ｃａｒｔｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５（１９９２）），Ｓａｎｄｈｕ（Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１２：４３７（１９９２）），およびＳｉｎｇｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎ．１５０：２８４４（１９９３））に記載されている。

"抗体フラグメント"との用語は，特定の分子に対して特異的結合親和性を表示する抗体の一部，しばしば超可変領域および周囲の重鎖および軽鎖の一部を表す。超可変領域は，ポリペプチド標的に物理的に結合する抗体の部分である。

本発明の抗体フラグメントには，"一本鎖抗体"が含まれる。この記載において用いられる語句は，特異性をもって抗原と結合し，抗体の重鎖および軽鎖からの可変または超可変領域を含む線状ポリペプチドを示す。そのような一本鎖抗体は，一般的な方法論により製造することができる。ＦｖフラグメントのＶｈおよびＶｌ領域を共有結合させ，ジスルフィド結合を導入することにより安定化させる。Ｇｌｏｃｋｓｈｕｂｅｒら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １３６２（１９９０））を参照。あるいは，ペプチドリンカーを挿入することによりＶｈおよびＶｌ領域を結合させることができる。Ｖｈ，Ｖｌおよびペプチドリンカー配列をコードする遺伝子は，組換え発現ベクターを用いて構築し発現させることができる。Ｃｏｌｃｈｅｒら（Ｊ．Ｎａｔ’ｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１９１（１９９０））を参照。ＶｈおよびＶｌ抗体鎖からの超可変領域を含むアミノ酸配列もまた，ジスルフィド結合またはペプチドリンカーを用いて構築することができる。

本発明の抗体は，例えば，蛍光標識または放射性標識を用いて標識することができる。

本発明のＧＥＦ−Ｈ１または誘導体ペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，（ｉ）サンプルを標的−抗体免疫複合体の形成に適した条件下で抗体で探索し，そして（ｉｉ）所望のポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，サンプル中のそのポリペプチドの存在および／または量を検出する方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，標的に特異的な抗体または抗体フラグメント，ならびに抗体の結合パートナーまたは抗体それ自体のコンジュゲートを含むように構築することができる。

ＧＥＦ−Ｈ１の“誘導体ペプチド”とは，より大きい完全なＧＥＦ−Ｈ１蛋白質の一部のアミノ酸配列を含むペプチドである。例えば，配列番号３および４に記載される配列を含むペプチドはＧＥＦ−Ｈ１蛋白質の“誘導体ペプチド”である。

本発明のＧＥＦ−Ｈ１またはＰＡＫ４ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体または抗体フラグメントは，原核生物または真核生物から単離，濃縮，または精製することができる。当業者に知られる日常的な方法により，原核生物および真核生物のいずれにおいても，抗体または抗体フラグメントを製造することができる。ポリペプチド分子である抗体の精製，濃縮および単離は，上に記載される。

本発明の標的ポリペプチドに対して特異的結合親和性を有する抗体は，免疫複合体が形成するような条件下でサンプルを抗体と接触させ，標的ポリペプチドに結合した抗体の存在および／または量を検出することにより，サンプル中の標的ポリペプチドの存在および／または量を検出するための方法において用いることができる。そのような方法を実施するための診断キットは，抗体を含む第１の容器，および抗体の結合パートナーおよび標識（例えば放射性同位体）を含む第２の容器を含むように構築することができる。診断キットはまた，ＦＤＡに認可された使用の通知およびその指針を含んでいてもよい。

別の観点においては，本発明は，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドまたはポリペプチドドメインに対して特異的結合親和性を有する抗体を産生するハイブリドーマを特徴とし，ここで，ポリペプチドは，配列番号２に記載されるアミノ酸配列を有する群より選択される。"ハイブリドーマ"とは，抗体，例えばＧＥＦ−Ｈ１に対する抗体を分泌しうる不死化細胞株を意味する。好ましい態様においては，ＧＥＦ−Ｈ１に対する抗体は，本発明のＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドに特異的に結合することができるアミノ酸の配列を含む。

別の観点においては，本発明はまた，上述したいずれかの核酸分子によりコードされるポリペプチドに結合する抗体，およびネガティブ対照抗体を含むキットに関する。

"ネガティブ対照抗体"との用語は，特異的結合親和性を有する抗体と類似の起源に由来するが，本発明のポリペプチドに対して結合親和性を示さない抗体を表す。

また，単離したＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体のウエスタンブロット分析を調製し，上述したリン酸特異的ＧＥＦ−Ｈ１抗体でプローブして，これらの蛋白質のリン酸化状態を判定することができる。あるいは，予め特異的ＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体を分離することなく，細胞溶解物を直接ウエスタンブロットに供し，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を適用してもよい。

いずれにしても，細胞サンプルにおけるリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の同定は，上述の戦略にしたがって容易にかつ日常的に行うことができる。

また，細胞サンプルを候補物質，例えば薬剤，化学物質，化合物，蛋白質，または核酸で処理して，ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化による下流の効果のモニターすることにより，その物質がＰＡＫ４の活性に及ぼす影響を判定することができる。候補物質は，ＰＡＫ４活性，またはＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１との相互作用を“調節”するかもしれない。“調節する”とは，候補物質がＰＡＫ４のキナーゼ活性またはＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１とが相互作用する程度に影響を及ぼしうることを意味する。したがって，候補物質による“調節”の１つの影響は，所定のサンプル中の全ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを低下させることである。候補物質がＰＡＫ４キナーゼ活性を増大させるか，またはＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４相互作用を促進することも考えられる。反対に，物質に曝露した後に総ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルが上昇するかもしれない。したがって，候補物質は，その影響がＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化パターンと相関するように，ＰＡＫ４，ＧＥＦ−Ｈ１またはＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４複合体を調節することができる。

ＰＡＫ４活性またはＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４相互作用を調節する物質をスクリーニングするためのアッセイにおいては，配列番号２に示される全長ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質配列，またはより短いフラグメント，例えば，ＰＡＫ４によりリン酸化されるペプチド（すなわち，配列番号３および４に示されるもの）を用いることができる。あるいは，触媒的ＤＨドメインを含まないＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドもまた，ＰＡＫ４活性および／またはＧＥＦ−Ｈ１／ＰＡＫ４相互作用を調節する物質をスクリーニングするために用いることができる。したがって，本発明は，残基１６２と３５４との間のアミノ酸領域を欠失したＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドを企図する。

この文脈においては，薬剤スクリーニングアッセイは，以下の工程を含む：（ｉ）（好ましくは発癌性細胞株から）細胞溶解物を取得し；（ｉｉ）溶解物に候補物質を適用し；（ｉｉｉ）細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および／または分離し；そして（ｉｖ）ＧＥＦ−Ｈ１リン酸化変種の存在を検出する。候補物質を細胞または細胞溶解物に適用する前と後との総ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質のリン酸化のレベルを比較することにより，ＰＡＫ４活性に及ぼす候補物質の影響を判定することが可能である。すなわち，そのような比率での総ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質リン酸化のレベルは，候補物質がＰＡＫ４キナーゼ活性を阻害するのに有効である場合には低下すると予測される。さらに，この比率（候補物質を適用する前のＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベル対候補物質を適用した後のＧＥＦ−Ｈ１リン酸化のレベル）はまた，候補物質で処理していない細胞および／または細胞溶解物におけるＧＥＦ−Ｈ１リン酸化の“バックグラウンド”レベルと比較することができる。候補物質は，細胞を溶解する前に適用してもよい。

候補物質は，配列番号３および４のＧＥＦ−Ｈ１配列を含むペプチドでありうる。したがって，細胞に高濃度で，すなわち内因性ＧＥＦ−Ｈ１の量が過剰となるように適用すると，ＧＥＦ−Ｈ１ペプチドは競合して内因性ＰＡＫ４に結合し，このことにより内因性ＧＥＦ−Ｈ１の結合およびリン酸化を阻害するはずである。当業者には，ペプチドを細胞または細胞溶解物に“過剰に”加えるために，どの程度の量の競合的ペプチド阻害剤を加えるべきかがわかるであろう。候補物質はまた，ＰＡＫ４の発現を調節するかまたは阻害する核酸であってもよい。すなわち，アンチセンスおよびＲＮＡ干渉手法にしたがって，アンチセンスポリヌクレオチドまたは二本鎖ＲＮＡ分子を用いてＰＡＫ４遺伝子発現をノックアウトまたはダウンレギュレートすることができる。

好結果の候補物質はＰＡＫ４を阻害し，このことにより，過剰発現したＰＡＫ４に伴う細胞の異常を軽減するものである。したがって，好結果の候補物質は，癌性組織において認められるような細胞増殖を遅らせるか阻害するものである。

すなわち，そのような調節または阻害的効果を示す物質は，（ｉ）増殖する，（ｉｉ）足場非依存性成長を有する，または（ｉｉｉ）不死化している，細胞を調節または阻害するのに有用である。したがって，これらの物質の１またはそれ以上をこれらの特性を示す細胞に投与することにより，特定の細胞サンプルに伴う増殖，足場非依存性成長または細胞運動性を阻害することができる。すなわち，同定された物質の１またはそれ以上を純粋な形でまたは医薬処方の形で投与することにより，これらの種類の細胞タイプの集団を有する個体を治療することが可能である。このような理論的根拠にしたがえば，本発明にしたがって，癌性組織または細胞に伴う１またはそれ以上の細胞表現型を調節または阻害する同定された物質を含む医薬組成物を投与することにより，癌，または発癌性の細胞成長を有する個体を治療することが可能である。

本発明はまた，以下のＰＡＫ４アミノ酸配列をｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドとして使用することに関し，これは以下に記載されるように機能する。
配列番号２１：
276-CTPAAPAVPAVPGPPGPRSPQREPQRVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLDNF-324
配列番号２２：
298-RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD-322

すなわち，本発明は，ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質アイソフォームに結合しうるグループＩＩｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドを包含する。そのようなポリペプチドは，ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質に結合することにより，全長の，例えば内因性ＰＡＫ４および他のグループＩＩ ＰＡＫファミリーメンバーが，本発明のポリペプチドが結合しているＧＥＦ−Ｈ１蛋白質にドッキングまたは結合することを防止またはじゃますることができると考えられる。グループＩＩｐ２１活性化キナーゼの例は，ＰＡＫ４，ＰＡＫ５，およびＰＡＫ６である。

本発明の驚くべき発見は，ＰＡＫ４の残基２７６−３２４（配列番号２１で表される）のみを含むポリペプチドが，ＧＥＦ−Ｈ１ファミリーのメンバーに優先的に結合することができることである。この新規な結合領域は，ＰＡＫ４のアミノ酸２７６−３２４にわたっており，さらにグループＩＩ ＰＡＫ蛋白質の間で高度に保存されている残基２９８−３２２（配列番号２２）のアミノ酸の配列を含む。この保存されたドメインは，本明細書において“ＧＥＦ−Ｈ１相互作用ドメイン”（“ＧＩＤ”）と称される。例えば，ＰＡＫ５のアミノ酸３９９−４５４は，配列番号２１と７６％の配列同一性を有するが，配列番号２２に示されるＧＩＤドメインと８８％の配列同一性を有する。したがって，グループＩＩ ＰＡＫ蛋白質間でＧＩＤ領域にわたって高程度の保存が認められることは，ＰＡＫ４，ＰＡＫ５，およびＰＡＫ６のこの領域が種々のＧＥＦ−Ｈ１ファミリーメンバー，例えば，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ，およびＧＥＦ−Ｈ１Ｕに結合しうることを意味するであろう。

本発明は，ＧＩＤ領域を含む，配列番号２１のアミノ酸２７６−３２４のストレッチ中の，ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合する能力をなお保持している任意のＰＡＫ４ポリペプチドを包含する。すなわち，本発明は，そのポリペプチドがＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合することができ，他のいずれのＰＡＫ４または他のグループＩＩ ＰＡＫ蛋白質配列を含まない限り，配列番号２１に示される配列の一部のアミノ酸配列のみを含むポリペプチドを包含する。すなわち，本発明にしたがえば，そのようなポリペプチドは，他のＰＡＫ４アミノ酸配列を含まず，ポリペプチドは他のグループＩＩ ＰＡＫポリペプチド配列を含まない。例えば，ポリペプチドが配列番号２１の残基２９８−３２４を含む場合，そのポリペプチドはＰＡＫ４のアミノ酸配列１−２９７または３２５−９８５を含まないであろう。しかし，本発明のｐ２１活性化キナーゼ由来ポリペプチドは，融合蛋白質の一部であってもよく，グループＩＩ ＰＡＫではないポリペプチドまたは蛋白質と組み合わせてもよい。

本発明はまた，配列番号２１の残基２８０−３２４，配列番号２１の残基２８５−３２４，配列番号２１の残基２９１−３２４，ならびにこれに由来する他の変種を含むポリペプチドを包含する。“変種”とは，その配列が少なくとも１つのＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームに結合しうる限り，配列番号２１で表されるアミノ酸配列中の任意の配列を本発明に記載されるように用いることができることを意味する。

本明細書において説明するように，ＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４リン酸化は，張線維形成を減少させるかまたは阻害し，ラメリポディウム，細胞増殖，および細胞運動性を促進する。すなわち，ＰＡＫ４リン酸化の阻害剤，例えば，配列番号２１のアミノ酸配列またはその一部から本質的になるポリペプチドを投与することにより，張線維形成が増加して，処理した細胞の運動性がより低下し，侵襲性が低下し，細胞アポトーシスを誘導するプロセスに対してより感受性になるであろう。例えば，配列番号２１および２２に規定されるＧＩＤドメインを含むポリペプチドの投与は，微小管結合ＧＥＦ−Ｈ１Ｍのリン酸化を防止または減少させることにより，細胞運動性を破壊することができる。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍのリン酸化により，これは微小管ネットワークから解離する。したがって，ＧＩＤドメイン−ポリペプチドを用いてＰＡＫ４に対するＧＥＦ−Ｈ１Ｍ活性を変化させ，このことにより細胞アクチン基礎構造および細胞運動性を破壊することができる。

ファージディスプレイスクリーニングを用いて，ＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）に融合させたＰＡＫ４のキナーゼドメイン（アミノ酸２９１−５９１）を’おとり’として用いて，ＰＡＫ４の生理学的標的を同定した。スクリーニングにおいて同定されたファージディスプレイのヒットは，いくつかの別々の遺伝子に由来するインフレーム融合体に対応していた。１つのフラグメントはＭａｇｕｉｎ−２−様遺伝子に由来するものであった。２つの別のヒットはＧＥＦ−Ｈ１のＧＥＦ−Ｈ１Ｓスプライシング変種に由来するものであった。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍとは異なり，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓは微小管結合に必要であることが示されているジンクフィンガー領域を欠失している。

ＧＥＦ−Ｈ１ＳとＰＡＫ４とのインビトロ相互作用を確認するため，ファージディスプレイにより単離されたＧＥＦ−Ｈ１Ｓのアミノ酸７６３−９２１またはＭａｇｕｉｎ−２−様蛋白質のアミノ酸３８５−５５５のいずれかをコードする配列と同一の配列を有するＧＳＴ融合蛋白質を細菌で発現させた。これらの融合蛋白質は，グルタチオンビーズに結合させ，外因性ＰＡＫ４を発現する２９３Ｔ溶解物を用いる結合アッセイにおいて用いた。ＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（ａａ７６３−９２１）は，全長ｍｙｃタグ付きＰＡＫ４蛋白質およびキナーゼドメイン（アミノ酸２９１−５９１）の両方に強く結合することができたが，ＧＳＴもＭａｇｕｉｎ−２−様フラグメントもできなかった。これに対し，ＰＡＫ４のアミノ末端制御ドメインのみ（アミノ酸１−３０９）はＧＥＦ−Ｈ１Ｓと安定に相互作用しなかった。これらの結果は，相互作用がＰＡＫ４キナーゼドメインのＮ末端の短い領域またはキナーゼドメインそれ自体のいずれかにより媒介されることを示唆する。

ＰＡＫ４配列のＮ末端領域に由来するビオチン化ペプチドを用いて，さらにＧＥＦ−Ｈ１結合部位のマッピングを行った。アミノ酸２７６−３２４から構成されるペプチドはＧＥＦ−Ｈ１Ｓと強い相互作用を示したが，よりＣ末端側の領域のアミノ酸２９１−３５５をカバーする別のペプチドは示さなかった。これらの結果を合わせると，ＧＥＦ−Ｈ１相互作用ドメイン（ＧＩＤ）はＰＡＫ４のアミノ酸２７６と３２４の間，例えば，ＰＡＫ４のアミノ酸２９１から始まりアミノ酸３２２で終わる領域に存在することが示される。ＰＡＫ４ＧＩＤと他のＰＡＫの対応するドメインとの配列アラインメントは，グループ−ＩＩ ＰＡＫファミリーのメンバー（ＰＡＫ４，ＰＡＫ５，およびＰＡＫ６）の間のこの領域における有意なホモロジーを明らかにした。ＰＡＫ４のＧＩＤ中のホモロジーに基づけば，ＰＡＫ５およびＰＡＫ６もまたＧＥＦ−Ｈ１または関連する蛋白質と相互作用する可能性がある。

内因性ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１は，インビボで安定に会合して，ゴルジ膜に局在化する。ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１との間のインビトロ相互作用が生理学的に意味のあるものであることを確認するために，示されるようにＰＡＫ４，ＧＥＦ−Ｈ１のいずれかに対する抗体または免疫前血清を用いて，Ａ５４９，ＨＣＴ１１６およびＨ１２９９細胞からの溶解物について免疫沈殿実験を行った。次に，ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体を用いてウエスタンブロッティングにより蛋白質を分析した。ＰＡＫ４またはＧＥＦ−Ｈ１抗体のいずれかで免疫沈殿した複合体において内因性ＧＥＦ−Ｈ１蛋白質が検出されたが，免疫前血清からは検出されなかった。ＧＥＦ−Ｈ１の種々のアイソフォームがインビボでＰＡＫ４と相互作用するが，Ｈ１２９９細胞の場合には，ＰＡＫ４は小さい方のＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームとより強く相互作用し，ＨＣＴ１１６細胞においてはそのような優先性は見られなかった。

ＰＡＫ４の先の研究は，活性化Ｃｄｃ４２の存在下でこれがゴルジ装置に局在化し，糸状足が誘導されることを示している。したがって，本発明において，内因性ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１がインビボで共に局在化するか否かを決定した。Ｈ１２９９細胞は，ＰＡＫ４またはＧＥＦ−Ｈ１に対する抗体で，β−ＣＯＰ抗体またはトランスゴルジマーカーである小麦胚芽アグルチニンとともに染色した。蛍光顕微鏡により観察したところ，ＰＡＫ４，ＧＥＦ−Ｈ１およびβ−ＣＯＰはすべて同じ亜細胞領域に局在化する。したがって，ＧＥＦ−Ｈ１は，ＰＡＫ４と同様に，ゴルジ膜結合性である。ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１抗血清の両方で見られる核染色は，内因性蛋白質の検出に必要な長時間曝露によるものであり，非特異的である。より高い解像度の実験では，ゴルジネットワーク内での局在化にいくぶんかの相違が見られた。例えば，ＰＡＫ４は，トランスゴルジネットワークより，シスゴルジ膜およびこれに付随するＭＴにより多く局在する。

ＰＡＫ４はインビトロおよびインビボでＧＥＦ−Ｈ１Ｓをセリン８１０でリン酸化する
次に，ＧＥＦ−Ｈ１がＰＡＫ４の基質であるか否かを調べた。インビトロキナーゼアッセイは，ＧＥＦ−Ｈ１ＧＳＴ融合蛋白質，Ｍａｇｕｉｎ−２−様ＧＳＴ融合蛋白質およびＧＳＴ対照蛋白質を，ＰＡＫ４によるリン酸化の基質として用いて行った。これらのアッセイにおいては，ＧＥＦ−Ｈ１ポリペプチドがＰＡＫ４の高親和性基質であることが見出され，Ｋｍは１−５ｕＭの範囲内であった。ＰＡＫ４はＧＳＴ対照をリン酸化せず，ＧＳＴ−Ｍａｇｕｉｎ−２−様融合蛋白質を弱くリン酸化した。

これまでに，ＰＡＫ４の活性化ループ配列に由来するペプチドがＰＡＫ４の高親和性基質であることが見出されている。ＰＡＫ４がその活性化ループに高度に関連する一連のペプチドをリン酸化する能力を調べることにより，ＰＡＫ４のおおまかな基質コンセンサスを推理することができた（ＲＲＸＳＬ（Ｘ）ｎＧ（配列番号２４），ｎ＝１または２）。このことから，ＰＡＫ４による高親和性基質認識にはリン酸アクセプター部位を挟む塩基性残基および疎水性残基の両方が重要であることが示唆された。ＰＡＫ４の基質選択性をさらに調べるために，ＰＡＫ４キナーゼドメインスクリーニングにおいて濃縮されたファージディスプレイクローンの配列を推定ＰＡＫ４基質コンセンサスと比較した。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓを含むほとんどの配列は高親和性ＰＡＫ４基質と非常に類似する領域を含む。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓアミノ酸７６３−９２１に対応するＧＥＦ−Ｈ１ファージディスプレイヒットの中で，潜在的ＰＡＫ４リン酸化部位はＧＥＦ−Ｈ１ＳのＳｅｒ８１０であると同定された。この部位を囲む配列に由来するペプチド（アミノ酸８０７−８２４）もまた，ＰＡＫ４の高親和性基質であり，ＰＡＫ４に対してＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１（７９３−９２１）融合蛋白質と同様のＫｍを有する。

すなわち，本発明において，ＰＡＫ４媒介性リン酸化の基質コンセンサスモチーフはＲＲＸＳＬ（Ｘ）_nＧ（配列番号２４）（ｎは“１”または“２”個のＸ残基であり，“Ｘ”は任意のアミノ酸である）であると同定される。

このペプチドから誘導された種々のホスホアイソマーを合成し，ＰＡＫ４によりリン酸化される能力を調べた。８１０位のセリンを有するペプチドはもはやＰＡＫ４の基質ではなかった。さらに，変異により，ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＳｅｒ８１０が真にインビトロでのＰＡＫ４のリン酸化部位であることが確認された。Ｓｅｒ８１０の変異によりＧＥＦ−Ｈ１ＳのＣ末端フラグメントのＰＡＫ４リン酸化はなくなったが，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのアミノ末端フラグメント（アミノ酸１−３８６）はさらに別のＰＡＫ４リン酸化部位（単数または複数）を含んでいた。ＰＡＫ４基質コンセンサス配列との配列比較は，セリン残基５７，６６，および６７が可能性のある他のＰＡＫ４リン酸化部位であることを示した。推定ＰＡＫ４リン酸化部位のホスホアイソマーに対応するペプチドを合成することにより，Ｓｅｒ６７がおそらくＧＥＦ−Ｈ１のアミノ末端中のインビトロＰＡＫ４リン酸化部位であることが決定された。興味深いことに，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ中のＰＡＫ４リン酸化部位はＣｄｃ２４（ＰＡＫ様キナーゼＣｌａ４により制御されている酵母Ｃｄｃ４２ＧＥＦ）中のトレオニンまたはグルタミン酸である部位とともに保存されている可能性があり，このことは，これらの部位が重要であることを示唆する。アラインメントデータは，Ｎ末端のグルタミン酸８９およびＣ末端のトレオニン７３７が，それぞれヒトＧＥＦ−Ｈ１ＳのＳｅｒ６７および８１０に対応することを示す。

ＰＡＫ４によるＧＥＦ−Ｈ１Ｓリン酸化がインビボでこれらの部位で生ずるか否かを確認するために，コトランスフェクションアッセイを行って，ホスホセリン８１０に対するホスホ特異的抗体を用いてＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化を分析した。この抗体は，Ｓｅｒ８１０でリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１に特異的である。哺乳動物細胞においてＳｅｒ８１０がリン酸化され，Ｃｄｃ４２と共発現させたときに活性化ＰＡＫ４ならびに野生型ＰＡＫ４の存在下でＳｅｒ８１０におけるＧＥＦ−Ｈ１Ｓのこのリン酸化が増強されるが，キナーゼデッド変異体およびベクターの存在下ではそうではないことがわかった。キナーゼデッドＰＡＫ４の発現はまた，内因性ＰＡＫ４によるＧＥＦ−Ｈ１ＳのＳｅｒ８１０の基底リン酸化を阻害することができる。同様に，ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＳｅｒ６７に対するリン酸特異的抗体を生成し，哺乳動物細胞においてＳｅｒ６７がリン酸化されるのみならず，活性化ＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１ＳとのコトランスフェクションがＳｅｒ６７のリン酸化を刺激することが見出された。

ＧＥＦ−Ｈ１アレルにより媒介される形態学的変化
Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅファミリーのヌクレオチド交換因子は細胞骨格構造および細胞形態学の制御に関与する。保存されたＤｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインおよびプレクストリンホモロジー（ＰＨ）ドメインは，これらの交換因子の機能に重要である。ＧＥＦは，Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ基質の交換を刺激する能力について，インビトロで，または過剰発現によりインビボで分析されている。ＧＥＦ−Ｈ１の場合，種々のグループがＲａｃおよびＲｈｏに対する触媒活性を示している。Ｃｏｓ−７細胞におけるＧＥＦ−Ｈ１の過渡的発現および単離されたＧＥＦ−Ｈ１ＤＨ−ＰＨドメインの発現は，それぞれインビボおよびインビトロでＲａｃに対する活性を示す。Ｃｏｓ−１およびＨｅＬａ細胞におけるインビトロおよびインビボアッセイによる分析は，ＧＥＦ−Ｈ１がＲｈｏに対して測定可能な活性を有することを示し，これは先の研究と一致する。

表１は線維芽細胞形態学に及ぼすＧＥＦ−Ｈ１変異体の影響を示し，表２は線維芽細胞形態学に及ぼすＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４制御の影響を示す。

ＧＥＦ−Ｈ１が線維芽細胞における細胞形態学に及ぼす影響を分析するために，ＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓ中のＰＡＫ４リン酸化部位の一連の変異体アレルのＥＧＦＰ（増強グリーン蛍光蛋白質）融合コンストラクトをＮＩＨ３Ｔ３細胞に導入した。ＧＥＦ−Ｈ１のＤＨドメインを変異させた優性ネガティブアレルＧＥＦ−Ｈ−ＱＲ３１２，３１３ＭＧも作製した。ｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）アッセイにおいては，ＮＩＨ−３Ｔ３細胞において，この優性ネガティブアレルはＲａｃ−ＧＴＰの蓄積を阻害したが，Ｃｄｃ４２−ＧＴＰは阻害しなかった。アクチン細胞骨格をクマリン−ファリシジンで染色して，ＥＧＦＰ蛍光細胞のＦ−アクチン構造を顕微鏡により対比させた。

野生型ＧＥＦ−Ｈ１Ｓは，典型的には核周囲領域に局在し，細胞は長く延びているように見え，時々張線維が存在する。これに対し，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８１０Ａを単独で過剰発現させると，トランスフェクトしていない細胞と比較して，張線維の蓄積および無秩序なアレイが生じた。野生型ＧＥＦ−Ｈ１ＳまたはＰＡＫ４アレルのいずれかを単独で発現させるとアクチン細胞骨格への影響は比較的小さいため，張線維の誘導は印象的である。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａを発現する細胞の形態は，優性ネガティブＧＥＦ−Ｈ１ＳＤＨ変異体を発現する細胞の形態と同様であった。ＤＨドメイン変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−ＱＲ３１２，３１３ＭＧの発現は，広く分布した細胞質拡大の痕跡を生ずる。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８１０Ａの場合における張線維の誘導は，Ｒｈｏ活性化を暗示しており，一方，ＧＥＦ−Ｈ１−Ｑ３１２Ｒ，Ｍ３１３ＧおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａについて見られた無秩序な細胞質拡大は，おそらくはＲｈｏ阻害による退縮していない細胞の痕跡の残余であろう。局在化およびアクチン細胞骨格の変化は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−（Ｓ６７Ａ−Ｓ８１０Ａ）の二重変異体において特に顕著である。ＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（Ｓ６７Ａ−Ｓ８１０Ａ）を発現する細胞において，Ｆ−アクチンの細胞質凝集，ならびにＦ−アクチンを欠失した広い弧状のラメラが認められた。リン酸化部位変異体蛋白質の再分布および細胞質Ｆ−アクチンの不適切な蓄積は，ＧＥＦ−Ｈ１が張線維を刺激する能力には局在化が重要であるという考えを支持する。

活性化ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１ＳはＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてラメリポディウム形成を誘導する
線維芽細胞におけるＦ−アクチン構造の誘導，すなわち糸状足，ラメリポディウム，および張線維の形成は，それぞれ活性な形のＣｄｃ４２，Ｒａｃ，およびＲｈｏによるシグナリングによるものである。ＰＡＫ蛋白質および特にＰＡＫ４は，Ｆ−アクチンに基づく形態学的構造の制御に役割を果たすため，細胞形態学におけるＰＡＫ４により誘導された変化がＧＥＦ−Ｈ１Ｓの制御により媒介されるか否かを決定するための実験を工夫した。また，ＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１コンストラクトを種々のＨＡエピトープタグ付きＰＡＫ４アレルとともにＮＩＨ−３Ｔ３細胞で共発現させた。外因性ＰＡＫ４は抗ＨＡ抗体（赤）で検出し，アクチン細胞骨格はクマリン−ファリシジン（青）で染色した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は低いが検出可能なレベルの内因性ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１を有するが，この実験の条件下ではこれらは活性化されなかった。

ＰＡＫ４の種々のアレルを用いることにより，いずれの形態学的影響がＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４リン酸化により推進されたものであるか否かを確認することが可能であった。ＥＧＦＰ対照と共発現させたＰＡＫ４アレルは，ＮｌＨ３Ｔ３細胞においてＦ−アクチンに基づく構造の形成に対して比較的小さい影響を与えた。野生型ＰＡＫ４と野生型ＧＥＦ−Ｈ１Ｓとを共発現する細胞においては，ＰＡＫ４またはＧＥＦ−Ｈ１Ｓのいずれかを単独で発現する細胞と比較して，糸状足が顕著に増加していることが認められた。糸状足構造は，いずれかの蛋白質が細胞で単独で発現された場合，またはベクターをコトランスフェクトした対照では認められなかったため，より低い活性の野生型ＰＡＫ４アレルおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓとの相互作用に依存するようであった。活性化ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥとＧＥＦ−Ｈ１Ｓとを共発現する細胞においては，これらの構造は前縁において糸状足からラメリポディウムに移行した。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓをキナーゼ不活性なＰＡＫ４Ｋ３５０，３５１Ａとともにトランスフェクトしたときには糸状足もラメリポディウムも認められなかったが，このとき張線維は豊富に存在した。このことは，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ中のＰＡＫ４リン酸化部位変異の分析と合わせて，ラメリポディウム形成への移行はＰＡＫ４キナーゼ活性によるものであることを示唆する。

これらの構造の形成が，ＰＡＫ４がＧＥＦ−Ｈ１Ｓをリン酸化する能力に依存することを確認するために，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのリン酸化部位変異体を用いた。変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８１０ＡアレルをＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅと一緒にコトランスフェクションすると，豊富な張線維が見られる。このことは，キナーゼデッドアレルからの結果と合わせて，線維芽細胞におけるラメリポディウム形成および張線維形成の阻害につながるシグナルは両方ともＳｅｒ８１０のリン酸化によるものであることを示唆する。さらに，ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥおよびＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ８１０Ａはアクチン張線維の核形成点として作用する細胞接着部位を暗示する別々の周辺部位に局在化する。ＧＥＦ−Ｈ１のこのタイプの局在化はＨｅＬａ細胞においても見られる。Ｓ８１０の変異により見られた効果とは対照的に，変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａと活性化ＰＡＫ４−Ｓ４７４Ｅとを共発現させることにより，ラメリポディウムがＧＥＦ−Ｈ１依存的に形成され，一方張線維形成は防止される。この実験では，非変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓと変異体ＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ６７Ａに由来するラメリポディウムの間の量的相違は調べていない。

ＧＥＦ−Ｈ１の交換活性は，Ｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインと不活性な状態のＲａｃまたはＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓとの相互作用により活性化される。ＰＡＫ４リン酸化により推進されるＧＥＦ−Ｈ１Ｓ媒介性の効果がＧＥＦ−Ｈ１Ｓ交換活性に依存するか否かを判定するために，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ優性ネガティブＤＨ変異体（Ｑ３Ｉ２Ｍ，Ｒ３Ｉ３Ｇ）とＰＡＫ４の種々のアレルとを共発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を調べた。アクチンを欠失した広く弧状に広がるラメラが観察され，これは活性なアレルのＧＥＦ−Ｈ１Ｓおよび活性化ＰＡＫ４の存在下で形成されるアクチンの豊富なラメリポディウムまたは張線維と対照的である。この結果により，ＰＡＫ４シグナルがＧＥＦ−Ｈ１の交換活性を介して直接リレーされていることが確認される。ＧＥＦ−Ｈ１の先の研究は，Ｃｏｓ−７細胞においてＧＥＦ−Ｈ１の過剰発現により構成的なラメリポディウム誘導を示している。したがって，活性化ＰＡＫ４／ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ複合体を加えることにより，ＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてこの効果を際構築することが可能であることが示された。

ＰＡＫ４がＧＥＦ−Ｈ１Ｍを介して細胞形態学に及ぼす影響
ＰＡＫ４によりリン酸化されるＧＥＦ−Ｈ１Ｓの残基は，ＭＴ（“微小管”）結合型のＧＥＦ−Ｈ１である“ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ”において保存されている。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍはそのアミノ末端に微小管への結合を可能とするジンクフィンガードメインを含む。ＰＡＫ４がＧＥＦ−Ｈ１Ｍ活性を制御する能力を決定する上での微小管結合の役割を調べた。ＧＥＦ−Ｈ１ＭでＭＴ（インビボでのＭＴのＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｍラベリングにより）およびアクチン細胞骨格（クマリン−ファリシジンのＦ−アクチン染色により）の両方を同時に調べる実験を行った。また，β−チューブリン抗体で共染色することによりＭＴ細胞骨格における変化も調べた。

Ｆ−アクチンに基づく形態学的変化の場合，ＧＥＦ−Ｈ１のスプライシングアイソフォームは，その効果にある程度の差異を示す。時々分布する張線維を与えるＧＥＦ−Ｈ１Ｓとは異なり，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍを過剰発現する細胞は，しばしば細胞周囲にＦ−アクチンの織られたハロの外観を与える張線維を示し，このことは，ある種のＲｈｏ刺激活性がＭＴ末端に局所的に制限されているかもしれないことを示唆する。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍを野生型ＨＡタグ付きＰＡＫ４と共発現させたときに，糸状足の誘導がないことは，ＧＥＦ−Ｈ１ＭとＧＥＦ−Ｈ１Ｓとの識別しうる別の相違点であった。この場合には糸状足は見られない。しかし，活性化ＰＡＫ４−Ｓ４７４Ｅと共発現させた場合には，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓと同様に，ラメリポディウムへの移行が認められた。

文献の報告と一致して，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ様ＬＦＣ（ネズミＧＥＦ−Ｈ１）は微小管と安定に結合していた。ＧＥＦ−Ｈ１の過剰発現は，インビボで微小管を安定化させることが知られている。ＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｍを単独で，または野生型またはキナーゼデッドＰＡＫ４のいずれかと共発現する細胞において見られるように，ＭＴの安定化はその放射状の整列により明らかである。しかし，活性化ＰＡＫ４をＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｍと共発現させると，ＭＴが不安定化され，ＧＥＦ−Ｈ１ＭがＭＴから細胞質に顕著に再分布する。ＧＥＦ−Ｈ１ＭをＰＡＫ４の種々のアレルと共発現する細胞においては，ＭＴの極性も明らかに変化していた。これらの結果は，本発明の知見と合わせると，ＰＡＫ４がアクチン細胞骨格とＭＴネットワークとの間のＧＥＦ−Ｈ１により媒介されるクロストークを制御しうることを示す。

配列番号 1
atgcctgtaacaagagcatcacagccaaggaagccctcatctgcccaacaacagaaagcggccctgctgaagaacaacaccgccttgcagtccgtttctcttcgaagtaagacaaccatccgggagcggccaagctcggccatctacccctccgacagcttccggcagtccctcctgggctcccgccgtggccgctcctccttgtctttagccaagagtgtttctaccaccaacattgctggacatttcaatgatgagtctcccctggggctgcgccggatcctctcacagtccacagactccctcaacatgcggaaccgaaccctatccgtggaatccctcattgacgaagcagaggtaatctacagtgagctgatgagtgactttgagatggatgagaaggactttgcagctgactcttggagtcttgctgtggacagcagcttcctgcagcagcataaaaaggaggtgatgaagcagcaagatgtcatctatgagctaatccagacagagctgcaccatgtgaggacactgaagatcatgacccgcctcttccgcacggggatgctggaagagctacacttggagccaggagtggtccagggcctgttcccctgcgtggacgagctcagtgacatccatacacgcttcctcagccagctattagaacgccgacgccaggccctgtgccctggcagcacccggaactttgtcatccatcgcttgggtgatctgctcatcagccagttctcaggtcctagtgcggagcagatgtgtaagacctactcggagttctgcagccgccacagcaaggccttaaagctctataaggagctgtacgcccgagacaaacgcttccagcaattcatccggaaagtgacccgccccgccgtgctcaagcggcacggggtacaggagtgcatcctgctggtgactcagcgcatcaccaagtacccgttactcatcagccgcatcctgcagcattcccacgggatcgaggaggagcgccaggacctgaccacagcactggggctagtgaaggagctgctgtccaatgtggacgagggtatttatcagctggagaaaggggcccgtctgcaggagatctacaaccgcatggaccctcgggcccaaaccccagtgcctggcaagggcccctttggccgagaggaacttctgaggcgcaaactcatccacgatggctgcctgctctggaagacagcgacggggcgcttcaaagatgtgttagtgctgctgatgacagatgtactggtgtttctccaggaaaaggaccagaagtacatctttcctaccctggacaagccttcagtggtatcgctgcagaatctaatcgtacgagacattgccaaccaggagaaagggatgtttctgatcagcgcagccccacctgagatgtacgaggtgcacacagcatcccgggatgaccggagcacctggatccgggtcattcagcagagcgtgcgcacatgcccatccagggaggacttccccctgattgagacagaggatgaggcttacctgcggcgaattaagatggagttgcagcagaaggaccgggcactggtggagctgctgcgagagaaggtcgggctgtttgctgagatgacccatttccaggccgaagaggatggtggcagtgggatggccctgcccaccctgcccaggggccttttccgctctgagtcccttgagtcccctcgtggcgagcggctgctgcaggatgccatccgtgaggtggagggtctgaaagacctgctggtggggccaggagtggaactgctcttgacaccccgagagccagccctgcccttggaaccagacagcggtggtaacacgagtcctggggtcactgccaatggtgaggccagaaccttcaatggctccattgaactctgcagagctgactcagactctagccagagggatcgaaatggaaatcagctgagatcaccgcaagaggaggcgttacagcgattggtcaatctctatggacttctacatggcctacaggcagctgtggcccagcaggacactctgatggaagcccggttccctgagggccctgagcggcgggagaagctgtgccgagccaactctcgggatggggaggctggcagggctggggctgcccctgtggcccctgaaaagcaggccacggaactggcattactgcagcggcaacatgcgctgctgcaggaggagctacggcgctgccggcggctaggtgaagaacgggcaaccgaagctggcagcctggaggcccggctccgggagagtgagcaggcccgggcactgctggagcgtgaggccgaagaggctcgaaggcagctggccgccctgggccagaccgagccactcccagctgaggccccctgggcccgcagacctgtggatcctcggcggcgcagcctccccgcaggcgatgccctgtacttgagtttcaaccccccacagcccagccgaggcactgaccgcctggatctacctgtcactactcgctctgtccatcgaaactttgaggaccgagagaggcaggaactggggagccccgaagagcggctgcaagacagcagtgaccctgacactggcagcgaggaggaaggtagcagccgtctgtctccgccccacagtccacgaggtgagaccctggcggagacatggaccagagactttaccagaatgcaggacatcccggaggagacggagagccgcgacggggaggctgtagcctccgagagctaa
配列番号 2
MPVTRASQPRKPSSAQQQKAALLKNNTALQSVSLRSKTTIRERPSSAIYPSDSFRQSLLGSRRGRSSLSLAKSVSTTNIAGHFNDESPLGLRRILSQSTDSLNMRNRTLSVESLIDEAEVIYSELMSDFEMDEKDFAADSWSLAVDSSFLQQHKKEVMKQQDVIYELIQTELHHVRTLKIMTRLFRTGMLEELHLEPGVVQGLFPCVDELSDIHTRFLSQLLERRRQALCPGSTRNFVIHRLGDLLISQFSGPSAEQMCKTYSEFCSRHSKALKLYKELYARDKRFQQFIRKVTRPAVLKRHGVQECILLVTQRITKYPLLISRILQHSHGIEEERQDLTTALGLVKELLSNVDEGIYQLEKGARLQEIYNRMDPRAQTPVPGKGPFGREELLRRKLIHDGCLLWKTATGRFKDVLVLLMTDVLVFLQEKDQKYIFPTLDKPSVVSLQNLIVRDIANQEKGMFLISAAPPEMYEVHTASRDDRSTWIRVIQQSVRTCPSREDFPLIETEDEAYLRRIKMELQQKDRALVELLREKVGLFAEMTHFQAEEDGGSGMALPTLPRGLFRSESLESPRGERLLQDAIREVEGLKDLLVGPGVELLLTPREPALPLEPDSGGNTSPGVTANGEARTFNGSIELCRADSDSSQRDRNGNQLRSPQEEALQRLVNLYGLLHGLQAAVAQQDTLMEARFPEGPERREKLCRANSRDGEAGRAGAAPVAPEKQATELALLQRQHALLQEELRRCRRLGEERATEAGSLEARLRESEQARALLEREAEEARRQLAALGQTEPLPAEAPWARRPVDPRRRSLPAGDALYLSFNPPQPSRGTDRLDLPVTTRSVHRNFEDRERQELGSPEERLQDSSDPDTGSEEEGSSRLSPPHSPRGETLAETWTRDFTRMQDIPEETESRDGEAVASES
配列番号 3
RRRSLPAGDALYLSFNPP
配列番号 4
RQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 5
RGETLAETWT
配列番号 6
RBSZXG
配列番号 7
CPRRRSLPAGDALYLSFNPP
配列番号 8
CRQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 9
CRQSLLGSRRGRSSLSLAK
配列番号 10
TGTAGATCCTCGGCGGCGCGCTCTCCCCGCA
配列番号 11
GGTGATGCCCATGGTCTCCAGCAGGAT
配列番号 12
ATCCTGCTGGTGACCATGGGCATCACCA
配列番号 13
GCCGTGGCCGCTCCGCCTTGTCTTTA
配列番号 14
TAAAGACAAGGCGGAGCGGCCACGGC
配列番号 15
QRITKY
配列番号 16
GCAGAATTCTGTAACAAGAGCATCACA
配列番号 17
GCGCTCGAGTTAGCTCTCGGAGGCTACAGCCT
配列番号 18
RRKSLVGTPYWMAPE
配列番号 19
ビオチン-LC-LC-RRKSLVG(pT)PYWMAPE
配列番号 20
RBSZXL
配列番号 21
CTPAAPAVPAVPGPPGPRSPQREPQRVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLDNF
配列番号 22
RVSHEQFRAALQLVVDPGDPRSYLD

実施例１
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのクローニング
ＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，ＵＳＡ）に寄託された受託番号ＫＩＡＡ０６５１から設計したプライマーＭＣ１ ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡ（配列番号１６）およびＭＣ３ｂ ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号１７）をポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において用いて，ヒト全脳プラスミドｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ＃ＨＬ９００２ＣＣ）からＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子を増幅した。ＥＸＰＡＮＤポリメラーゼ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，ＵＳＡ Ｃａｔ＃１６８１８３４）を用いて２０ラウンドのＰＣＲを行った。プライマーＭＣ１は，５’位にＥｃｏＲ１制限酵素部位を導入し，ＭＣ３ｂは３’位にＸｈｏ１制限酵素部位を含む。制限酵素部位の配列は天然のＧＥＦＨ−１ｂ配列の一部ではない。得られたＰＣＲ産物を，ＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１制限酵素で消化したプラスミドベクター（ｐｃＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃａｔ＃ Ｖ７９０−２０）の骨格，改変したマルチクローニング部位を有する）に挿入した。制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａ１を用いてＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子を切り出し，同様に制限酵素消化した発現ベクターｐＲＳＶ／Ｒｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＵＳＡ）中に挿入した。

実施例２
発現および足場非依存性増殖
マウス線維芽細胞細胞株ＮＩＨ−３Ｔ３においてＧＥＦ−Ｈ１Ｓを含む，安定に発現するクローン１９２．５８を樹立した。ｐＲＳＶ／Ｒｃをサブクローニングしたベクターは組織培養細胞中でＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質を発現する。

ＧＥＦ−Ｈ１Ｓクローンは，接着を防止する組織培養容器に播種した。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓを過剰発現する細胞は足場非依存性である。発現ベクターｐｃＤＮＡのみを有するＮＩＨ３Ｔ３細胞は，足場形成が妨害されている場合には自発的にトランスフォームしなかった。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子を有するクローンのみが生存し増殖することが示された。したがって，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの発現によりＮＩＨ−３Ｔ３細胞の足場非依存性生存および増殖が可能となる。細胞が増殖する能力は，培養物中で代謝的に活性な細胞のみを測定するテトラゾリウム塩ＸＴＴに基づくアッセイ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ Ｃａｔ＃１４６５０１５）を用いて測定した。測定は経時的に行った。

実施例３
マウス腫瘍モデルに及ぼすＧＥＦ−Ｈ１Ｓの影響
１９２．５８細胞は，無胸腺ヌードマウス中にトランスフェクトしたときに腫瘍を形成した。１群あたり８匹のマウスに，対照ｐｃＤＮＡ発現ベクターまたはＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子を発現するｐｃＤＮＡ発現ベクターを有するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を皮下注射した。１９２．５８細胞で処置したマウスで認知可能な腫瘍を経時的に測定した。ｐｃＤＮＡ発現ベクターを有する細胞を移植したマウスでは触知しうる腫瘍は検出されなかった。

実施例４
ＧＥＦ−Ｈ１ＳはＰＡＫ４の基質である
第１のＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドの回収に特に用いた試薬は，アミノ酸２９１−５９１で示されるＰＡＫ４の触媒ドメインのポリペプチドを有する発現プラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃２７−４５８１−０１）であった。この発現ベクターは，適切に挿入された遺伝子を融合蛋白質として生成および発現させることができる。ここで，融合パートナーは，ＳＪ２６遺伝子グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）の蛋白質産物である。融合パートナーであるＧＳＴにより，グルタチオンセファロース４Ｂマトリクス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃１７−０７５６−０１）（グルタチオンビーズとしても知られる）にアフィニティー固定化することができる。これらのビーズに固定化したＰＡＫ４ポリペプチドを，ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ，ＵＳＡから入手可能な乳癌組織培養細胞）ｃＤＮＡに由来するペプチドのライブラリを発現するファージ粒子を含む溶解物とともにインキュベートした。Ｚｏｚｕｌｙａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７（１２）：ｐ．１１９３−８，１９９９を参照。このスクリーニングで得られた候補の多くの配列を決定して，１３−８と名付けたクローンからＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドを発見した。シークエンシングは，ＡＢＩプリズム装置で，製造元（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）により提供される標準的な方法を用いて行った。

実施例５
ＰＡＫ４はインビトロでＧＥＦ−Ｈ１Ｓをリン酸化することができる
ファージディスプレイスクリーニングで得られたＧＥＦ−Ｈ１ＳをコードするｃＤＮＡを切り出し，ｐＧＥＸ−４Ｔ発現ベクター中にサブクローニングして，インビトロ実験用に蛋白質を組換え生成させた。次に，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質をＰＡＫ４キナーゼと混合し，ＰＡＫ４がＧＥＦ−Ｈ１Ｓをリン酸化するようインキュベートした。このキナーゼ反応物の一部をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し，オートラジオグラフィーによりリン酸化の程度を可視化した。オートラジオグラフにより，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドはリン酸化され，融合パートナーであるＧＳＴはリン酸化されていないことが示された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは，万能の蛋白質分離および可視化手法であり，Ｌａｅｍｍｌｉ，Ｎａｔｕｒｅ，２２７（２５９）：６８０−５，１９７０に記載されている。

実施例６
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのセリン８１０およびセリン６７がインビトロでＰＡＫ４によりリン酸化される
上述のリン酸化実験から，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの２つのペプチドがＰＡＫ４誘導性リン酸化の標的であるとして同定された。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの標的残基は，ＰＡＫ４活性化ループペプチドをＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチド配列のアミノ酸７６２−９２１とアラインメントすることにより同定した。次に，インビトロキナーゼアッセイにより，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓペプチド ＰＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ（配列番号４５）およびＲＱＳＬＬＧＳＲＲＧＲＳＳＬＳＬＡＫ（配列番号４）がＰＡＫ４によりリン酸化されることが明らかとなった。

これらのペプチド基質のリン酸化の程度を，オートラジオグラフィーにより目視で比較し，リン酸化された基質のコンセンサスを経験的に決定した。コンセンサス配列は，例えば，ＲＢＳＺＸ［Ｇ／Ｌ］（配列番号２５）（式中，Ｒはアミノ酸アルギニンであり；Ｂは任意の塩基性アミノ酸であり；Ｓはアミノ酸セリンであり；Ｚは任意の疎水性アミノ酸であり；Ｘは任意のアミノ酸であり，Ｇはグリシンであり，Ｌはロイシンである）であると予測することができた。アミノ酸残基の同定は，酵素としてＰＡＫ４を用い，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの予測される基質領域のアイソマーを用いるキナーゼアッセイにより行った。

以下のホスホアイソマー（リン酸修飾ＧＥＦ−Ｈ１Ｓペプチド）をＰＡＫ４キナーゼアッセイにおいて用いて，いずれの残基が特異的にリン酸化されるかを決定した。ある種の残基はリン酸成分を含むよう修飾したため（下記の下線の残基），これらはＰＡＫ４によりリン酸化することができなかった。これらの結果から，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのセリン８１０および６７がＰＡＫ４のリン酸化部位であることが明らかとなった。

実施例７
ＧＥＦ−Ｈ１ＳはＰＡＫ４と相互作用する
ＧＥＦ−Ｈ１ＳがＰＡＫ４の基質であることの追加の証拠は，上述のＧＳＴ固定化手法を用いてＧＳＴ固定化ＧＥＦ−Ｈ１Ｓと２９３Ｔ細胞で発現される異なるアレルのＰＡＫ４との相互作用を示すことにより得られた。蛋白質アフィニティーおよび抗原抗体媒介性免疫沈殿の両方についての免疫沈殿手法は，Ｌｅｗ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１３６（２）：２１１−９，１９９１；およびＡｎｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９６：１１１−２０，１９８３に記載されている。

ＧＳＴ固定化ＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドを用いて，２９３Ｔ細胞抽出物からの免疫沈殿を行った。得られたビーズ上の蛋白質複合体をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，次にウエスタンブロッティングにより同定して，存在する蛋白質を同定した。ウエスタンブロット手法（Ｒｅｎａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１０４：４５５−６０，１９８４）は，抗体等の特異的免疫試薬を用いて蛋白質を同定するために万能的に用いられる。ＰＡＫ４蛋白質をこのｍｙｃアフィニティータグに融合させ（Ｃｒａｖｃｈｉｋ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ，１３７（１）：１３９−４３，１９９３），ｍｙｃアフィニティータグに特異的なモノクローナル抗体を用いて，ＰＡＫ４アレルが存在することが示された。ＧＳＴビーズ上に固定化されたＧＥＦ−Ｈ１Ｓを用いる免疫沈殿後のＰＡＫ４の検出は，細胞蛋白質の溶液中におけるこれらの２つの蛋白質の間の物理学的相互作用を示した。固定化融合パートナーＧＳＴで免疫沈殿した後にはＰＡＫ４は存在しなかった。この相互作用は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの存在または非存在によって制限された。

実施例８
腫瘍におけるＰＡＫ４キナーゼ活性のメカニズムに基づくバイオマーカーとしてのＧＥＦ−Ｈ１Ｓ
ＫＬＨコンジュゲート化ペプチドＣＳＧＤＲＲＲＡＧＰＥＫＲＰＫＳＳ（配列番号２３）（ＫＬＨにコンジュゲートしたＰＡＫ４蛋白質の一部）でウサギを免疫することにより，ＰＡＫ４に特異的な抗体をウサギで生成した。Ｎｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９７３．２３（３）：３９１−６；およびＨａｓｈｉｍｕｒａ ｅｔ ａｌ，１９８２を参照。また，アミノ酸７６２−９２１を含むＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｓポリペプチドで免疫することにより，ウサギでＧＥＦ−Ｈ１に特異的な抗体を生成させた。

ＰＡＫ４抗体血清をプロテインＧビーズ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ，ＵＳＡ Ｃａｔ＃１２４３２３３）に結合させた（ＩｇＧアイソタイプのイムノグロブリンのＦｃ部分とＳ．ＡｕｒｅｕｓのプロテインＧとの相互作用により）。ＰＡＫ４抗体を有するビーズを３つのヒト腫瘍細胞株，Ａ５４９，ＨＣＴ１１６およびＨ１２９９（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）の細胞溶解物と混合した。得られた免疫沈殿物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し，ウエスタンブロットを行った。ＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体は内因性ＧＥＦ−Ｈ１を免疫沈殿させることが示された。この結果から，３つの腫瘍細胞溶解物中にＧＥＦ−Ｈ１Ｓが存在することが確認される。内因性ＰＡＫ４の相互作用は，ウエスタンブロットにおいてＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体でプローブしたときに内因性ＧＥＦ−Ｈ１が検出されたことにより示された。相互作用はＰＡＫ４の存在および非存在によって制限される。

実施例９
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓリン酸特異的抗体は腫瘍におけるＰＡＫ４キナーゼ活性をモニターするためのツールである
ＫＬＨコンジュゲート化ペプチドＣＰＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ（配列番号７），ＣＲＱＳＬＬＧＳＲＲＧＲＳＳＬＳＬＡＫ（配列番号８）およびＣＲＱＳＬＬＧＳＲＲＧＲＳＳＬＳＬＡＫ（配列番号９）を用いて，ウサギで抗体を生成した。下線を付した太字のセリン残基“Ｓ”は，リン酸で修飾された残基を表す。“抗１００９”は配列番号７のセリン−８１０でリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１蛋白質を検出する抗体である。配列番号８および９に記載される配列を含むペプチドに対して生じさせた抗体は，セリン−６７がリン酸化された形のＧＥＦ−Ｈ１ペプチドを認識する。

抗血清がセリン−８１０がリン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質を認識する能力は，２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ，ＵＳＡ）をＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＰＡＫ４の種々のアレルを同時に発現するよう過渡的にトランスフェクトした実験において示された。

この実験においては，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ発現ベクターはｐＲＳＶ／Ｒｃであり，ＰＡＫ４発現ベクターはｐｃＤＮＡであった。トランスフェクトした２９３Ｔ細胞から溶解物を調製し，抗１００９試薬を用いてウエスタンブロットにより分析した。結果は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓが野生型ＰＡＫ４（１−５９１）およびＰＡＫ４変異体Ｓ４７４Ｅの存在下で，基底リン酸化（すなわち，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの一部が内因性キナーゼによりすでにリン酸化されている）より顕著に多くリン酸化されており，ＰＡＫ４キナーゼデッドＫ３５０，３５１Ａの存在下でリン酸化のレベルが顕著に低下していることを示す。これらのリン酸特異的抗体を用いて，ＧＥＦ−Ｈ１の特異的リン酸化により，腫瘍におけるＰＡＫ４活性を検出することができる。

実施例１０
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓアレルの構築
以下の一覧は，本発明において構築された野生型，Ｓ８１０ＡおよびＱＲ３１２，３１３ＭＧ変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓアレルであるアレルを表す。後者のアレルについては，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質のグルタミン３１２およびアルギニン３１３がそれぞれメチオニンおよびグリシンに変異しており，このため“ＱＲ３１２，３１３ＭＧ”と表される。同様に，“Ｓ８１０Ａ”は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ蛋白質のアミノ酸位置８１０のセリン残基がアラニンに変異していることを示す。突然変異誘発は，ＰＣＲ反応または部位特異的突然変異誘発のいずれかにより行った。

突然変異誘発において用いたオリゴヌクレオチド：
ＭＣ２７ ＴＧＴＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡ（配列番号１０）。太字の“ＧＣＴ”残基はＸｈｏＩＩ部位を示し，これは，Ｓｅｒ８１０のコドンをアラニンに変化させる。これをＭＣ３ｂと対で用いてＰＣＲ反応を行い，ＸｈｏＩＩおよびＸｈｏＩで切断したときにアミノ酸３８６−９２１をコードするｃＤＮＡ配列を含むプラスミド中の野生型ｃＤＮＡフラグメント（ＢａｍＨ１およびＸｈｏＩで切断）と交換しうるフラグメントを作製した。得られた新たに構築したプラスミドはＧＥＦ−Ｈ１Ｓの８１０位にアラニンを含んでいた。この変異体ポリペプチドをＢｃｌ１およびＸｈｏ１で切り出し，遺伝子の残りを構成するＥｃｏＲ１−Ｂｃｌ１フラグメントに連結して全長とした。

ＭＣ４０ ＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号１１）をＭＣ１およびＭＣ４１と対で，ＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡ（配列番号１２）をＭＣ３ｂと対で，別々の反応において用いて，ＥｃｏＲ１，Ｎｃｏ１およびＸｈｏ１で制限酵素処理することにより連結しうる重複するフラグメントを作製した。ＭＣ４０およびＭＣ４１はＱＲ３１２，３１３ＭＧ変異体アレルを生ずるコドンを含む。

ＭＣ５７ ＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＡ（配列番号１３）およびＭＣ５８ ＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号１４）を用いて部位特異的突然変異誘発反応（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃａｔ＃２００５１９，ＵＳＡ）を行い，６７位にアラニンを配置したプラスミドを得た。この反応はポリペプチド１−３８６をコードするフラグメントを含むｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴベクターで行った。この断片を，制限酵素ＥｃｏＲ１，Ｓａｃ１およびＸｈｏ１によりＧＥＦ−Ｈ１アレル（野生型，Ｓ８１０Ａ，ＱＲ３１２，３１３ＭＧ）の残りに連結した。

実施例１１
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓアレルの分析
ＲｈｏファミリーのＧＴＰａｓｅｓが関与するシグナル伝達は，広範な細胞応答，例えば，アクチン細胞骨格の再編成，遺伝子発現，アポトーシス，膜横断事象，有糸分裂促進シグナリングおよび悪性トランスフォーメーションに関与する。典型的には，ＤＨドメインの高度に保存された“ＱＲＩＴＫＹ”（配列番号１５）モチーフ中の変異により，蛋白質はＲｈｏ ＧＴＰａｓｅ蛋白質に結合することができなくなり，したがって酵素的に不活性となる。

Ｃｌａｒｋら（Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２２５：３９５−４１２，１９９５）の方法にしたがうインビトロトランスフォーメーションアッセイは，野生型ＧＥＦ−Ｈ１ＳがＮＩＨ３Ｔ３細胞においてフォーカスを誘導しうることを示した。活性化ＲａｓとＧＥＦ−Ｈ１Ｓ野生型およびＧＥＦ−Ｈ１ＳＱＲ３１２，ＭＧ３１３との間のコトランスフォーメーションアッセイは，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓは活性化Ｒａｓと相乗的に作用するが，ＧＥＦ−Ｈ１ＳＱＲ３１２，ＭＧ３１３は活性化Ｒａｓにより形成されるフォーカスを阻害することを示した。

実施例１２
局在化および形態学的変化
ＧＥＦ−Ｈ１ＳアレルをＮＩＨ３Ｔ３細胞内で過渡的に発現させるかまたはＰＡＫ４アレルと同時に発現させた。ＧＥＦ−Ｈ１ＳアレルはｐｃＤＮＡベクターからＥｃｏＲ１およびＸｈｏ１消化により回収し，ＥｃｏＲ１およびＳａｌ１で消化したｐＥＧＦＰ−Ｃ１（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ Ｃａｔ＃６０８２−１）に挿入した。得られた蛋白質は，明るい蛍光蛋白質であるグリーン蛍光蛋白質（ＧＦＰ）のハイブリッドであった。細胞形態学に及ぼす影響は，Ｆ−アクチンをクマリンファラシジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，ＵＳＡ，Ｃａｔ．＃Ｃ−６０６）で染色することにより追跡した。ＰＡＫ４との共局在化を示す実験のためには，ＰＡＫ４をｍｙｃまたはＨＡアフィニティータグのいずれかを有するｐｃＤＮＡ発現ベクター中に挿入し，ローダミンと結合させたヤギ抗マウス（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＵＳＡ）とサンドイッチしたモノクローナル抗体“９Ｅ１０”または“ＨＡ７”で検出した。これは赤色の蛍光を示す。野生型ＧＥＦ−Ｈ１Ｓはゴルジ装置の核周囲領域に局在化した。．Ｃａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，２００２を参照。活性化ＰＡＫ４もまたゴルジ装置に局在するため，この知見はＧＥＦ−Ｈ１ＳがＰＡＫ４の基質であることと一致する。

しかし，リン酸化変異体Ｓ８１０Ａは細胞質に局在し，このことは，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの局在化にはＳ８１０のリン酸化が重要であることを示す。ＤＨ変異体ＱＲ３１２，ＭＧ３１３もまた細胞質に局在することが認められ，細胞質凝集の染色パターンを示した。ＧＦＰそれ自体は同様の細胞コンパートメントのいずれにも局在化しなかったため，これらの知見はＧＥＦ−Ｈ１Ｓアレルに特異的である。

ＮＩＨ３Ｔ３細胞においてＰＡＫ４野生型アレルをＧＥＦ−Ｈ１Ｓ野生型アレルと同時に発現させると，Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅ Ｃｄｃ４２の過剰発現によるものと同様に，末梢アクチンマイクロスパイクの形成が誘導される。このことは，これらの構造の形成にはＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１Ｓの両方が重要な役割を有することを示唆する。活性化ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥとＧＥＦ−Ｈ１Ｓとの同時発現によりラメリポディウムが形成され，このことはＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１ＳがＲｈｏ ＧＴＰａｓｅシグナリングに関与する蛋白質の複合体であることをさらに示唆する。Ｎｏｂｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ．，２３（３）：４５６−９，１９９５を参照。不活性なキナーゼを野生型ＧＥＦ−Ｈ１とともに発現させた場合にはアクチンに基づく構造が存在しなかったため，これらのアクチンに基づく形態学は，ＰＡＫ４キナーゼとＧＥＦ−Ｈ１交換活性との組み合わせに特異的である。同様に，ＰＡＫ４と交換因子が不活性な変異体との組み合わせは，アクチンに基づく構造の形成を妨害した。

実施例１３
この実施例は，本明細書に記載される方法に関する追加の情報を含む。
ＧＥＦ−Ｈ１のクローニング
蛋白質相互作用物質のファージディスプレイスクリーニングにおいて，ＰＡＫ４の触媒ドメイン（アミノ酸２９１−５９１）のポリペプチドを発現するプラスミドｐＧＥＸ−４Ｔ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃａｔ＃２７−４５８１−０１）をおとりとして用いた。ファージディスプレイライブラリは乳癌細胞株ＭＣＦ−７から誘導した。ファージプラスミドからの配列をクエリーとして用いて，ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＣＢＩ）のデータベースでＢａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）を用いた。ｃＤＮＡのうち２つがＫＩＡＡ０６５１（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号：ＡＢ０１４５５１）と称されるｃＤＮＡおよびいくつかの重複発現配列タグ（ＥＳＴ）と９９％より高い同一性でマッチした。ＧＥＦ−Ｈ１のクローニングの間に，この遺伝子が３つの主要なスプライシングアイソフォームである，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍ，ＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｕを有することが見出された。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（アミノ酸１−９２１）アイソフォームは，７アミノ酸のミニエクソンならびにＮ末端ジンクフィンガードメインをコードするエクソンの欠失の点で，ＧＥＦ−Ｈ１Ｍスプライシング型とは異なる。ＧＥＦ−Ｈ１Ｍと称されるスプライシング型は，微小管結合に関与するジンクフィンガー領域を含み，ＧＥＦ−Ｈ１と称される全長型（ａａ１−９８５）と同一である。インフレーム配列をｐＧＥＸ−４Ｔにサブクローニングして基質分析に用いた。

ＤＮＡプラスミドおよびコンストラクト
ＧＥＦ−Ｈ１Ｓを得るために，配列ＫＩＡＡ０６５１に由来するオリゴヌクレオチドＭＣ１ ＧＣＡＧＡＡＴＴＣＴＧＴＡＡＣＡＡＧＡＧＣＡＴＣＡＣＡ（配列番号１６）およびＭＣ３ｂ ＧＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＴＡＣＡＧＣＣＴ（配列番号１７）を用いて，２０ラウンドのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って，ヒト全脳プラスミドｃＤＮＡライブラリ（ＣＬＯＮＴＥＣＨ ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｃａｔ＃ＨＬ９００２ＣＣ）からの遺伝子を増幅した。約３０００ｂｐのフラグメントが得られ，これをサブクローニングして３つのクローンをシークエンスし，同一の結果が得られた。ＥｃｏＲ１−Ｘｈｏ１を用いて，ＭＣＳの５’側のＨＡエピトープを含むｐｃＤＮＡベクター中にインフレームでサブクローニングした。ｐｃＤＮＡクローンからのＥｃｏＲ１−Ｘｈｏ１フラグメントを用いて，すべてのＧＥＦ−Ｈ１アレルをそれぞれＥｃｏ−Ｒ１−Ｓａｌ１で消化したｐＥＧＦＰＣ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にインフレームでシャトルした。

変異体Ｓ８１０ＡはオリゴＭＣ２７ ＴＧＴＡＧＡＴＣＣＴＣＧＧＣＧＧＣＧＣＧＣＴＣＴＣＣＣＣＧＣＡ（配列番号１０）およびＭＣ３ｂを用いるＰＣＲ反応により導入した。変異体挿入物をヌクレオチド１１００−２７６１にわたるＧＥＦ−Ｈ１Ｓの欠失変異体に導入し，野生型のＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１フラグメントを変異体ＸｈｏＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントで置き換えた。オリゴヌクレオチドＭＣ４０ ＧＧＴＧＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＴＣＴＣＣＡＧＣＡＧＧＡＴ（配列番号１１），ＭＣ１，ＭＣ４１ ＡＴＣＣＴＧＣＴＧＧＴＧＡＣＣＡＴＧＧＧＣＡＴＣＡＣＣＡ（配列番号１２）およびＭＣ３ｂを用いて，重複するＥｃｏＲ１−Ｎｃｏ１およびＮｃｏ１−Ｘｈｏ１フラグメントを作製して，ＤＨドメインの高度に保存されているＱＲＩＴＹモチーフ中のＱＲ残基をＭＧに変換した。Ｓ６７Ａは，オリゴＭＣ５７ ＧＣＣＧＴＧＧＣＣＧＣＴＣＣＧＣＣＴＴＧＴＣＴＴＴＡ（配列番号１３）およびＭＣ５８ ＴＡＡＡＧＡＣＡＡＧＧＣＧＧＡＧＣＧＧＣＣＡＣＧＧＣ（配列番号１４）を用い，および１−６２６にわたるｐＢｌｕｅｓｃｉｐｔ ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を部位特異的突然変異誘発反応の骨格として用いて作製した。この変異体フラグメントをＥｃｏＲ１−Ｓａｃ１で消化し，Ｓａｃ−Ｘｈｏ１で消化した残りの遺伝子と連結して，変異体および野生型アレルからのフラグメントを作製した。ＧＥＦ−Ｈ１ＭおよびＳ蛋白質はアミノ末端においてのみ異なるため，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓに由来する変異体および野生型配列を連結させることによりハイブリッドとして作製した。ユニークな５’配列は，オリゴヌクレオチドＭＣ６１ＧＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧＴＣＴＣＧＧＡＴＣＧＡＡＴＣＣＣＴＣＡ（配列番号２６）およびＭＣ６２ＧＴＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＣＧＣＡＧＧＧＧＡ（配列番号２７）を用いて，ＩＭＡＧＥクローン４１５７７７５（Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｇｅｎｅｔｉｃｓ）をテンプレートとして用いるＰＣＲ反応により作製した。

組換え蛋白質の製造，ペプチドのシークエンスおよびキナーゼアッセイ
グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ＰＡＫ４（残基２９１−５９１），ＧＥＦ−Ｈ１アミノ酸７６３−９２１（ファージクローン１３．８配列より，ＫＩＡＡ０６５１とマッチする）およびＭａｇｕｉｎ２−様（ファージクローン１３．３２より，受託＃ＸＰ−０８７８３１と配列がマッチする）を，標準的であり先に記載されている方法（３１）により精製した。ＧＥＦ−Ｈ１ｂ８０７−８２４にまたがるペプチドのアミノ酸配列，すなわち＃１００８（ＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬｐＳＦＮＰＰ）（配列番号２８），＃１００９（ＲＲＲｐＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ）（配列番号２９），＃１０１０（ＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬｐＹＬＳＦＮＰＰ）（配列番号３０）および＃９３４（ＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ）（配列番号３）をインビトロキナーゼアッセイにおいて用いた。インビトロキナーゼ反応は先に記載されるようにして行った（３１）。

抗体および免疫試薬
８１０位にリン酸化されたセリンを有するＫＬＨ連結ペプチド（＃１００９）ＣＲＲＲＳＬＰＡＧＤＡＬＹＬＳＦＮＰＰ（配列番号５２）（残基８０７−８２４）および（＃１０４）ＧＳＴ−ＧＥＦ−Ｈ１（残基７６２−９２１）を抗原として用いて，ウサギで抗血清を生成した。ＰＡＫ４抗体は，抗原（＃９３３）ＣＡＴＴＡＲＧＧＰＧＫＡＧＳＲＧＲＦＡＧＨＳＥＡ（配列番号３１）（残基１２２−１４４）および（＃８０）ＣＳＧＤＲＲＲＡＧＰＥＫＲＰＫＳＳ（配列番号２３）（残基１４８−１６３）から誘導した。特異性は，先に記載されるようにして分析した。ヤギ抗マウスおよび抗ウサギＩｇＧ西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートは，Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒから入手した。蛍光団ＦＩＴＣまたはローダミンに結合させたヤギ抗マウスおよび抗ウサギはＳａｎｔａ Ｃｒｕｚｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから，マウス抗−β−チューブリンはＺｙｍｅｄから入手した。クマリン−ファリシジンおよびファロイジンＦＩＴＣはＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓから入手した。マウス抗カスケードブルーおよび蛍光色素；テキサスレッド，ＦＩＴＣまたはマリナブルーを入手し，製造元の指針にしたがって抗体とコンジュゲート化させた。架橋試薬の溶液は，Ｇ２５ ｓｅｐｈａｄｅｘを通して脱塩することによりクエンチし，塩化アンモニウムと混合物して最終濃度５０ｍＭとした。

細胞のトランスフェクションおよび免疫蛍光
ＮＩＨ−３Ｔ３，２９３Ｔ，Ａ５４９，ＨＣＴ１１６およびＨ１２９９細胞は１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ），ペニシリンおよびストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））中で維持した。トランスフェクションのためには，細胞を，特に記載しないかぎり，ＮＩＨ−３Ｔ３については１０⁵細胞／ｍｌで，２９３ＴおよびＨ１２９９については１０⁴細胞／ｍｌで播種した。トランスフェクション試薬であるＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）を３μｇ ／μｇプラスミドＤＮＡで用いた。免疫ブロッティング用の細胞抽出物は，溶解バッファ中で調製した。免疫沈殿実験のためには，溶解物を，適当な抗体と結合させたプロテインＧビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），適当なＧＳＴ融合蛋白質を有するグルタチオンセファロースビーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ），および適当なビオチン化ペプチドに結合させたストレプトアビジンビーズ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともにインキュベートした。免疫蛍光のためには，カバースリップを２４ウエル細胞培養容器に置き，上述の密度で播種した。１６時間後にトランスフェクションを行い，特に記載しないかぎり，固定するまで，０．２％ＦＢＳを含むＯｐｔｉｍｅｍまたはＤＭＥＭ中で２４時間維持した。顕微鏡観察は，ＮｉｋｏｎＥ８００顕微鏡で６０Ｘ対物（１．５ＮＡ）を用いて行った。画像はＣＣＤ ＳＰＯＴカメラで捕獲し，ＳＰＯＴイメージングソフトウエア（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて擬似着色した。

実施例１４
ＥＬＩＳＡを用いる全細胞中のＰＡＫ４キナーゼ活性の測定
ＧＥＦ−Ｈ１ＳのＰＡＫ４依存性リン酸化のレベルは，以下のプロトコルにしたがって，リン酸特異的抗体のＧＥＦ−Ｈ１Ｓへの結合をモニターすることにより決定することができる。ＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ，９６ウエルプレート，Ｃａｔ．＃２５８０５−９６）をＰＢＳ中５μｇ／ｍｌの抗ＨＡモノクローナル抗体でウエルあたり１００μｌの最終容量を用いて予めコーティングし，４℃で一晩保存した。次に，コーティングバッファを除去し，ブロッキングバッファ（２％ＢＳＡ，ＴＢＳＴ中）で置き換え，次にプレート全体を室温で６０分間振盪した。

次に，組織培養プレートをポリ−Ｌ−リジンでウエルあたり５０μｌを用いてコーティングし，次に３７℃で３０分間インキュベートした。次にプレートをＰＢＳですすぎ，過剰の液体を吸引し，使用前に完全に乾燥させた。乾燥したのち，ＴＲ−２９３−ＫＤＧ細胞を，各ウエルに１００μｌ容量のＤＭＥＭおよび１０％Ｃｌｏｎｔｅｃｈ認可ＦＢＳ中で２ｘ１０⁺⁴細胞／ウエルで播種し，室温で少なくとも２時間インキュベートした。この時点で，培地を除去し，１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを補充した１００μｌの低血清培地（ＤＭＥＭ，０．２％ＢＳＡおよび１％Ｃｌｏｎｔｅｃｈ認可ＦＢＳ）で置き換えた。ネガティブ対照ウエルはドキシサイクリンで処理しなかった。

翌日，候補物質を０．２％ＢＳＡ，１０ｍＭ ＨＥＰＥＳおよび１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを含む溶液中で必要に応じて希釈した。候補物質は，まず１００％ＤＭＳＯ中に物質の１０ｍＭ保存溶液を調製することにより希釈した。次にこの溶液５μｌを１５μｌのＤＭＳＯに加えて，２．５ｍＭ（５０Ｘ濃度）溶液を調製した。次に，この最終溶液の６μｌをポリプロピレンプレートのウエルに移し，これに３００μｌの培地を加えた。次に，細胞を覆う培地を除去することにより，ウエル中の１００μｌの溶液を細胞を含む各ウエルに加え，候補物質の希釈物を含む溶液を穏やかに加えた。

次に，１錠の“コンプリートミニ”プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を１０ｍｌの水，２００μｌの−グリセロリン酸（最終濃度，１Ｍ），１００μｌのＮａＦ（最終濃度，１Ｍ），および１０μｌのＮａ₃ＶＯ₄（最終濃度，１Ｍ）に加えることによりＨＮＴＧ^plus溶液を新たに調製し，氷上に保存した。希釈した候補物質とともに細胞を３時間インキュベートした後，培地を除去し，プレートを氷上に移した。次に細胞を含む各ウエルに１００μｌの新たなＨＮＴＧ^plus溶液を加え，冷室で１０分間振盪した。この間，ＥＬＩＳＡプレートからＢＳＡをピペットで除き，ＴＢＳＴで２回洗浄した。

次に組織培養プレートから５０μｌの細胞溶解物をＥＬＩＳＡプレートの洗浄したウエルに移し，室温で６０分間振盪した。次に，細胞溶解物を除去し，ＥＬＩＳＡプレートのウエルをＴＢＳＴで３回洗浄した。次に，１００μｌの新たに希釈した抗ｐＧＥＦ抗体（１：５０００）をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに移し，室温で６０分間振盪した。抗体溶液を除去し，ウエルをＴＢＳＴで４回洗浄した。次に，１００μｌの新たに希釈したＨＲＰ−ＧａＲ（１：１０，０００）をＥＬＩＳＡプレートの各ウエルに加え，室温で４５分間振盪した。次にこの溶液を除去し，ウエルをＴＢＳＴで４回，次にＰＢＳで１回洗浄した。次に，ＡＢＴＳ溶液をプレートに１００μｌ／ウエルで加えた。次に，ＥＬＩＳＡプレートを室温でインキュベートし，１０−２０分間振盪した。

その後，ＥＬＩＳＡプレートをＴｅｃａｎ Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダー上に置き，測定フィルタ４０５ｎｍ，参照フィルタ６２０ｎｍを用いて測定値を記録した。

実施例１５
シンチレーションプロキシミティーアッセイを用いるヒトＰＡＫ４のインビトロキナーゼ活性の測定
シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）を用いて，ＰＡＫ４の蛋白質セリン／トレオニンキナーゼ活性をインビトロで分析した。用いたプロトコルは，１０μｌの阻害剤溶液をフレキシプレート（Ｗａｌｌａｃ９６ウエルポリエチレンテレフタレート（“フレキシ”）プレート，Ｃａｔ．＃１４５０−４０１）の各ウエルに加えることを含み，ポジティブおよびネガティブ対照については１０μｌの５％ＤＭＳＯを用いた。

ＰＡＫ４酵素を経験的に決定した濃度でフレキシプレートのウエルに加えた。ＰＡＫ４酵素はＢＬ２１細胞から精製した。この実験のとき，ウエルに加えたＰＡＫ４キナーゼ酵素の濃度は２０μｌの容量中，０．１μｇ／ウエルであった。濃度は酵素調製物によって様々であろう。したがって，当業者には，特定のキナーゼ調製物について，酵素調製物を滴定し，直線的なキナーゼ活性の経時変化を決定する方法がわかるであろう。ネガティブ対照ウエルには２０μｌの０．５Ｍ ＥＤＴＡをを加えた。基質はＰＡＫ酵素によりリン酸化されることが知られているＰＡＫ４ペプチドであり，以下の構造からなるものであった：
ビオチン−ＬＣ−ＬＣ−ＲＲＫＳＬＶＧ（ｐＴ）ＰＹＷＭＡＰＥ（配列番号１９）
ＰＡＫ４ペプチドの８番目のアミノ酸であるトレオニンはホスホトレオニンであり，全ペプチドを最終濃度５ｍｇ／ｍｌで水に溶解し，１００μｌのアリコートで必要となるまで−８０℃で保存した。しかし，本発明においては，基質としてＰＡＫキナーゼ（例えばＰＡＫ４）によりリン酸化されるか，またはリン酸化されると考えられるすべてのペプチドをＰＡＫ４ペプチドの代わりに使用しうることが企図される。例えば，配列番号３および４で表されるＧＥＦ−Ｈ１ＳペプチドをＰＡＫ４基質として用いることができる。

ＰＡＫ４キナーゼ活性用には２．５Ｘキナーゼバッファを用いた。これは，ウエルあたり５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，３７５ｍＭ ＫＣｌおよび２．５ｍＭ ＮａＦの作業濃度を含んでいた。典型的には，約４．５枚のプレートの反応には１０ｍｌのキナーゼバッファで十分である。候補物質およびＡＴＰを加えた後のこれらの成分の最終濃度は，２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．４），５ｍＭ ＭｇＣｌ₂，１５０ｍＭ ＫＣｌおよび１．０ｍＭ ＮａＦであった。

キナーゼ反応を開始させるためには，２０μｌのＰＡＫ４ビオチン化ペプチド／ＡＴＰ溶液をプレートのウエルに加え，室温で３０分間振盪せずにインキュベートし，反応遮蔽の後に置いた。ペプチド／ＡＴＰ溶液は，１．４μＭの作業濃度（すなわちウエルあたりの濃度）のコールド（すなわち放射活性を有しない）ＡＴＰ，０．１μｇ／ウエルのＰａｋｔｉｄｅおよび０．３３μＣｉ／ウエルの放射性標識γ³³Ｐ−ＡＴＰ（ＮＥＮ Ｅａｓｙ−Ｔｉｄｅ，Ｃａｔ．＃ＮＥＧ６０２Ｈ）を含む。３０分後，２００μｌの停止溶液を各ウエルに加え，プレートを少なくとも１５分間放置した。“停止”溶液は，ウエルあたり，ＰＢＳバッファ溶液中の５０μＭ ＡＴＰ（未標識），５ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００および０．５ｍｇのＳＰＡビーズの作業濃度を含んでいた。マグネシウムまたはカルシウムを含まないＰＢＳ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ Ｓａｌｉｎｅ）は，Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ（Ｃａｔ．＃１４１９０−１４４）から入手した。ビーズはＡｍｅｒｓｈａｍ（Ａｍｅｒｓｈａｍストレプトアビジン被覆ポリビニルトルエンＳＰＡビーズ，Ｃａｔ．＃ＮＩＦ１０７７）から入手した。ビーズをマグネシウムまたはカルシウムを含まないＰＢＳ中で２０ｍｇ／ｍｌの保存濃度で再構成し，４℃で保存した。

次にプレートを２３００ｒｐｍで１０−１５分間遠心分離し，次にＴｒｉｌｕｘプレートリーダーに移し，放射性カウントを記録した。

実施例１６
血清応答要素の誘導
血清応答要素（ＳＲＥ）に集束する転写因子の活性化は，５０％ものヒト結腸癌において観察されるＲａｓ活性化に起因するかもしれない。Ｇａｕｔｈｉｅｒ−Ｒｏｕｖｉｅｒｅ ｅｔ ａｌ．，ＥｍｂｏＪ．，９（１）：１７１−８０，１９９０を参照。

ｐＳＲＥ−ＳＥＡＰベクター系（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＵＳＡ）を用いて，ｒａｓおよびｒｈｏ蛋白質の下流のＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＰＡＫ４活性によるＳＲＥへのシグナリングを測定した。このアッセイは，ＮＩＨ３Ｔ３細胞において標準的なトランスフェクション方法を用いて行った。不活性なＧＥＦ−Ｈ１ＳアレルであるＱＲ３１２，３１３ＭＧは，刺激された細胞において活性化ｒａｃ Ｒｈｏ ＧＴＰａｓｅのレベルを低下させた。Ｔａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３３３：３３３−４２，２００１を参照。

さらに，不活性な変異体アレルＧＥＦ−Ｈ１ＳＱＲ３１２，３１３ＭＧおよびリン酸化変異体Ｓ８１０Ａの過渡的発現により，ＳＲＥへのシグナリングはほぼ基底レベルにまで減少する。

実施例１７
ＧＥＦ−Ｈ１アレルにより媒介される形態学的変化
線維芽細胞においてＧＥＦ−Ｈ１が細胞形態学に及ぼす影響を分析するために，ＧＥＦ−Ｈ１ＳおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓ中のＰＡＫ４リン酸化部位の一連の変異体アレルのＥＧＦＰ（増強グリーン蛍光蛋白質）融合コンストラクトをＮｌＨ３Ｔ３細胞にトランスフェクトした。ＧＥＦ−Ｈ１のＤＨドメインを変異させることにより作成した，変異体ＧＥＦ−Ｈ−ＱＲ３ｌ２，３１３ＭＧを生成する優性ネガティブアレルのコンストラクトも作成した。ｐ２１結合ドメイン（ＰＢＤ）アッセイにおいては，この優性ネガティブアレルはＮｌＨ−３Ｔ３細胞においてＲａｃ−ＧＴＰの蓄積を阻害するがＣｄｃ４２−ＧＴＰは阻害しない。アクチン細胞骨格をクマリン−ファリシジンで染色して，顕微鏡によりＥＧＦＰ蛍光（ｆｌｕｏｒｅｓｃｉｎｇ）細胞のＦ−アクチン構造を対比した。

野生型ＧＥＦ−Ｈ１Ｓが典型的には核周囲領域に局在化し，細胞は細長く見え，時々張線維を有することが認められた。これに対し，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８ｌ０Ａ単独の過剰発現は，トランスフェクトしていない細胞と比較して，張線維の蓄積した無秩序なアレイを生じた。野生型ＧＥＦ−Ｈ１ＳまたはＰＡＫ４アレルいずれかを単独で発現させたときのアクチン細胞骨格への影響は比較的小さいため，張線維の誘導は印象的である。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａを発現する細胞の形態学は，優性ネガティブＧＥＦ−Ｈ１ＳＤＨ変異体を発現する細胞の形態学と同様であった。

ＤＨドメイン変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−ＱＲ３１２，３１３ＭＧの発現は，広く分布した細胞質拡大の痕跡を生じた。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８１０Ａの場合における張線維の誘導は，Ｒｈｏ活性化を暗示しており，一方，ＧＥＦ−Ｈ１−Ｑ３１２Ｒ，Ｍ３１３ＧおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａについて見られた無秩序な細胞質拡大は，おそらくはＲｈｏ阻害による退縮していない細胞の痕跡の残余であろう。

局在化およびアクチン細胞骨格の変化は，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−（Ｓ６７Ａ−Ｓ８１０Ａ）の二重変異体において特に顕著である。ＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ（Ｓ６７Ａ−Ｓ８１０Ａ）を発現する細胞においてＦ−アクチンの細胞質凝集，ならびにＦ−アクチンを欠失した広い弧状のラメラが認められた。リン酸化部位変異体蛋白質の再分布および細胞質Ｆ−アクチンの不適切な蓄積は，ＧＥＦ−Ｈ１が張線維を刺激する能力には局在化が重要であるという考えを支持する。

実施例１８
活性化ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１ＳはＮＩＨ−３Ｔ３細胞においてラメリポディウム形成を誘導する
線維芽細胞におけるＦ−アクチン構造の誘導，すなわち，糸状足，ラメリポディウム，および張線維の形成は，それぞれ活性な形のＣｄｃ４２，Ｒａｃ，およびＲｈｏによるシグナリングにより生ずる。ＰＡＫ蛋白質，特にＰＡＫ４は，Ｆ−アクチンに基づく形態学的構造の制御に役割を果たす。したがって，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓの制御により媒介される，ＰＡＫ４により誘導される細胞形態学の変化を調べた。ＮｌＨ３Ｔ３細胞においてＥＧＦＰ−ＧＥＦ−Ｈ１コンストラクトを種々のＨＡエピトープタグ付きＰＡＫ４アレルと共発現させた。外因性ＰＡＫ４は抗ＨＡ抗体で検出し，アクチン細胞骨格はクマリンファリシジンで染色した。ＮＩＨ−３Ｔ３細胞は低いが検出可能なレベルの内因性ＰＡＫ４およびＧＥＦ−Ｈ１を有するが，これらはこの実験の条件下では活性化されなかった。

種々のアレルのＰＡＫ４を用いることにより，いずれの形態学的影響がＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４リン酸化により生じたものであるかを確認することが可能であった。ＥＧＦＰ対照と共発現させたＰＡＫ４アレルは，ＮｌＨ３Ｔ３細胞においてＦ−アクチンに基づく構造の形成に対して比較的小さい影響を与えた。野生型ＰＡＫ４と野生型ＧＥＦ−Ｈ１Ｓとを共発現する細胞においては，ＰＡＫ４またはＧＥＦ−Ｈ１Ｓのいずれかを単独で発現する細胞と比較して，糸状足が顕著に増加していることが認められた。糸状足構造は，いずれかの蛋白質が細胞で単独で発現された場合，またはベクターをコトランスフェクトした対照では認められなかったため，より低い活性の野生型ＰＡＫ４アレルおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓとの相互作用に依存するようであった。活性化ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥおよびＧＥＦ−Ｈ１Ｓを共発現する細胞においては，これらの構造は，前縁において糸状足からラメリポディウムに移行した。ＧＥＦ−Ｈ１Ｓをキナーゼ不活性ＰＡＫ４Ｋ３５０，３５１Ａとともにトランスフェクトした場合には糸状足およびラメリポディウムのいずれも観察されなかったが，今回は張線維は豊富に存在した。これは，ＧＥＦ−Ｈ１ＳにおけるＰＡＫ４リン酸化部位変異の分析と合わせて，ＰＡＫ４キナーゼ活性がラメリポディウム形成への移行を担うことを示唆する。

これらの構造の形成が，ＰＡＫ４がＧＥＦ−Ｈ１Ｓをリン酸化する能力に依存することを確認するために，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓのリン酸化部位変異体を利用した。変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ８１０ＡアレルをＰＡＫ４Ｓ４７４Ｅとともにコトランスフェクションすると，多量の張線維を示す。このことは，キナーゼデッドアレルからの結果と合わせて，Ｓｅｒ８１０のリン酸化がラメリポディウム形成につながるシグナル，および線維芽細胞における張線維形成の阻害の両方を担うという仮説を促した。さらに，ＰＡＫ４Ｓ４７４ＥおよびＧＥＦ−Ｈ１ＳＳ８１０Ａは，アクチン張線維が凝集する点として働く細胞接着部位を暗示する別々の周縁部位に局在した。ＧＥＦ−Ｈ１のこのタイプの局在化はＨｅＬａ細胞においても認められている。５８１０の変異により観察された効果とは対照的に，変異体ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ−Ｓ６７Ａと活性化ＰＡＫ４−Ｓ４７４Ｅとの共発現により，張線維形成を防止しながらラメリポディウムのＧＥＦ−Ｈ１依存性形成が生じた。

ＧＥＦ−Ｈ１の交換活性は，Ｄｂｌホモロジー（ＤＨ）ドメインと不活性状態のＲａｃまたはＲｈｏ ＧＴＰａｓｅｓとの相互作用を介して達成される。ＰＡＫ４リン酸化により推進されるＧＥＦ−Ｈ１Ｓ媒介性の効果がＧＥＦ−Ｈ１Ｓ交換活性に依存するか否かを判定するために，ＧＥＦ−Ｈ１Ｓ優性ネガティブＤＨ変異体（Ｑ３Ｉ２Ｍ，Ｒ３Ｉ３Ｇ）とＰＡＫ４の種々のアレルとを共発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を調べた。その結果，アクチンを欠失した広い弧状のラメラが観察され，これは活性なアレルのＧＥＦ−Ｈ１Ｓおよび活性化ＰＡＫ４の存在下で形成されるアクチンの豊富なラメリポディウムまたは張線維と対照的である。この結果により，ＰＡＫ４シグナルがＧＥＦ−Ｈ１の交換活性を介して直接リレーされていることが確認される。ＧＥＦ−Ｈ１の先の研究は，Ｃｏｓ−７細胞においてＧＥＦ−Ｈ１の過剰発現により構成的なラメリポディウム誘導を示している（１４）。

図１は，ＧＥＦ−Ｈ１のＰＡＫ４への直接結合を示す。 図２は腫瘍細胞におけるＰＡＫ４とＧＥＦ−Ｈ１との間の相互作用を示す。 図３は，ＰＡＫ４がインビトロおよびインビボでＧＥＦ−Ｈ１をリン酸化することを示す。 図４はＧＥＦ−Ｈ１アレルの形態学的影響を示す。 図５ａはＰＡＫ４によるラメリポディウム形成および張線維の減弱化を示す。 図５ｂはＰＡＫ４によるラメリポディウム形成および張線維の減弱化を示す。 図６ａはＰＡＫ４シグナリングを示す。 図６ｂはＰＡＫ４シグナリングを示す。 図７はインビボでのＲａｃおよびＲｈｏの相反的制御のモデルを示す。 図８はＧＥＦ−Ｈ１蛋白質およびペプチドのリン酸化スコアを示す。 図９はＧＥＦ−Ｈ１とＣｄｃ２４の保存を示す。 図１０はＧＥＦ−Ｈ１Ｓ遺伝子の概略図を示す。

Claims (9)

1. サンプルにおいてＰＡＫ４活性を検出する方法であって，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在またはレベルを検出することを含み，ここで、当該ＧＥＦ−Ｈ１は、ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームであるＧＥＦ−Ｈ１ａ、ＧＥＦ−Ｈ１ｂおよびＧＥＦ−Ｈ１ｃからなり、ＧＥＦ−Ｈ１のリン酸化された部位は、配列番号２のセリン−８１０に対応する部位であり、ここで，リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の検出は少なくとも１つの活性なＰＡＫ４の存在を示すことを特徴とする方法。
2. 前記ＧＥＦ−Ｈ１が，配列番号２，３または４のいずれかに記載される配列を含む，請求項１記載の方法。
3. 前記ＰＡＫ４が細胞中に存在する，請求項１記載の方法。
4. 前記細胞が腫瘍細胞である，請求項３記載の方法。
5. 前記腫瘍細胞が哺乳動物中に存在する，請求項４記載の方法。
6. 前記哺乳動物が，ヒト，ラット，マウス，イヌ，ウサギ，ブタ，ヒツジ，ウシ，ウマ，ネコ，霊長類，ヤギ，またはサルからなる群より選択される，請求項５記載の方法。
7. 配列番号３に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体であって，前記ペプチドはリン酸化されたセリン−８１０を含むＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
8. 配列番号４に記載される配列を含むペプチドに向けられたＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体であって，前記ペプチドはリン酸化されたセリン−６７を含むＧＥＦ−Ｈ１特異的抗体。
9. 細胞サンプルにおける活性化ＰＡＫ４の存在を判定する方法であって，（ｉ）細胞サンプルから細胞溶解物を取得し；（ｉｉ）細胞溶解物の調製物から蛋白質を単離および／または分離し，そして（ｉｉｉ）リン酸化されたＧＥＦ−Ｈ１の存在を検出することを含み，ここで、当該ＧＥＦ−Ｈ１は、ＧＥＦ−Ｈ１アイソフォームであるＧＥＦ−Ｈ１ａ、ＧＥＦ−Ｈ１ｂおよびＧＥＦ−Ｈ１ｃからなり、ここで，配列番号２のセリン−８１０に対応する部位がリン酸化されていることが検出されることは前記細胞サンプルが活性化ＰＡＫ４を含むことを示すことを特徴とする方法。

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