ES2397637T3 - Inhibidores de PAK para uso en el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico - Google Patents

Abstract

Al menos un inhibidor de quinasa activada por p21 (PAK) para uso en el tratamiento de un trastorno deldesarrollo neurológico.

Description

Inhibidores de PAK para uso en el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico.

Financiación del gobierno de EE.UU.

Antecedentes de la invención

El síndrome del cromosoma X frágil (FXS) es la forma más comúnmente heredada de retraso mental, con síntomas de hiperactividad, estereotipia, ansiedad, convulsiones, conducta social alterada y/o retraso cognitivo. El FXS es el resultado de la pérdida de expresión del gen del retraso mental debido al cromosoma X frágil 1 (FMR1), que codifica la proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMRP). Los ratones con el gen FMR1 desactivado (FMR1 KO) y los pacientes con el FXS muestran fenotipos de conducta similares, así como anomalías similares en la morfología sináptica del cerebro (O’Donnell et al., 2002, Annu. Rev. Neurosci., 25:315). Sus cerebros tienen más espinas dendríticas y/o una proporción superior de espinas más largas y/o más delgadas en comparación con las de los individuos normales (Hinton et al., 1991, Am. J. Med. Genet., 41:289; Comery et al., 1997, Proc. Natl. Acad Sci., USA, 94:5401; e Irwin et al., 2001, Am. J. Med. Genet., 98:161). Las espinas dendríticas son protrusiones de los árboles dendríticos que sirven como sitios potsinápticos de la mayoría de las sinapsis excitadoras en mamíferos. Correlacionados con la morfología espinal alterada, los ratones FMR1 KO presentan una función sináptica anómala, que incluye mayor depresión a largo plazo (LTD) mediada por el receptor del glutamato metabotrópico en el hipocampo y/o menor potenciación a largo plazo (LTP) en la corteza, en comparación con los ratones de tipo natural (Huber et al., 2002, Neuropharmacology, 37:571; y Li et al., 2002, Mol. Cell Neurosci., 19:138). Por tanto, estos hallazgos demuestran que FMRP actúa en la regulación de la morfología espinal, la función sináptica y/o la conducta animal.

La FMRP es una proteína de unión selectiva al RNA que se asocia con los poli-ribosomas (Corbin et al., 1997, Hum. Mol. Genet., 6:1465; y Stefani et al., 2004, J. Neurosci., 24:7272) y con Argonauta2 (AGO2) y Dicer, dos miembros de RISC, un complejo que se requiere en el silenciamiento de genes mediado por RNAi (Ishizuka et al., 2002, Genes Dev., 16:2497). Se cree que FMRP regula la morfología y/o la función sináptica debido a su capacidad de reprimir la traducción de sus parejas de unión al RNA (Laggerbauer et al., 2001, Hum. Mol. Genet., 10:329; Li et al., 2001, Nucleic Acids Res., 29:2276; y Mazroui et al., 2002, Hum. Mol. Genet., 11:3007), usando quizás un mecanismo mediado por RNAi. Algunos de estos RNA codifican proteínas que está implicadas en la morfología y/o la función sináptica, tales como Racl, la proteína 1B asociada a los microtúbulos, la proteína asociada al citoesqueleto de actividad regulada y la proteína alfa-quinasa II dependiente de calcio/calmodulina (Zhang et al., 2001, Cell, 107:591; Lee et al., 2003, Development, 130:5543; y Zalfa et al., 2003, Cell, 112: 317).

Compendio de la invención

La invención es como se expone en las reivindicaciones.

La presente invención abarca el reconocimiento de que las vías de señalización mediadas por quinasa activada por p21 (PAK) y FMRP pueden antagonizarse entre sí para regular la morfología y/o la función sináptica. La presente invención abarca el reconocimiento de que las anomalías en la morfología de las espinas corticales de pacientes con FXS y ratones con el gen FNM1 desactivado son opuestas a las que encontramos en ratones transgénicos en los cuales la actividad de PAK esta inhibida por su forma negativa dominante (dnPAK). La presente invención abarca el reconocimiento de que FMRP se une a PAK.

La presente invención proporciona inhibidores de PAK para uso en el tratamiento del síndrome del cromosoma X frágil (FXS) y/o otros trastornos del desarrollo neurológico.

Se incluyen composiciones que comprenden al menos un inhibido de PAK y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, los moduladores de PAK actúan modulando las interacciones entre PAK y la proteína de retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMRP).

La presente invención proporciona métodos para identificar inhibidores de PAK útiles para el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico. En un caso, dichos métodos incluyen métodos de cribado de alta productividad. En otro caso los métodos incluyen ensayos in vitro e in cyto.

La presente invención proporciona inhibidores específicos de PAK. En algunas realizaciones, los moduladores específicos de PAK incluyen moléculas pequeñas terapéuticas. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas moduladoras de PAK incluyen emodina, OSU-03012 y/o sus combinaciones. La presente invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden emodina, OSU-03012 y/o sus combinaciones. La presente invención proporciona emodina, OSU-03012 y/o sus combinaciones para uso en el tratamiento de la FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Secuencias de aminoácidos representativas de FMR y FXR. La Figura IA muestra una alineación de

ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de FMR1 de Drosophila melanogaster (dFMR1; GenBank AAG22045), FMR1 humana (hFMR1; GenBank AAB18829), FXR1 humana (hFXR1; GenBank AAC50155) y FXR2 humana (hFXR2; GenBank AAC50292). Las partes enmarcadas en color gris oscuro señalan los aminoácidos idénticos y las partes enmarcadas en color gris claro denotan sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las inserciones se representan por un guión. Está representado el dominio de interacción FMR1/FXR. "KH1" y "KH2": dominios KH; "NES": señal de exportación nuclear; "RGG": dominio que media las interacciones proteína-proteína, unión al RNA y/o puede estar metilado. La Figura modificada procede del trabajo de Wan et al., 2000, Mol. Cell. Biol., 20:8536. La Figura IB muestra una secuencia de aminoácidos para FMR1 de ratón (GenBank NM_008031).

Figura 2. Secuencias de aminoácidos humanas representativas de PAK1, PAK2 y PAK3. Se muestra una alineación de ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de PAK1 humana (GenBank AAA65441), PAK2 humana (GenBank AAA65442) y PAK3 humana (GenBank AAC36097). Los asteriscos debajo de las secuencias marcan aminoácidos idénticos y los puntos debajo de las secuencias denotan sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las inserciones se representan por un guión. Las partes enmarcadas en negro señalan las regiones ricas en prolina que contienen supuestos restos de PXXP que se unen a SH3. Las partes no enmarcadas señalan el sitio de unión a P1X no canónico. Las partes enmarcadas en gris indican tramos de aminoácidos básicos o ácidos altamente cargados. Las líneas oscuras en la parte superior indican el dominio de homodimerización (aminoácidos 78 - 87), el resto CRIB (aminoácidos 75 - 90), el dominio de unión a p21 (PBD; aminoácidos 67 -113) y el dominio de cambio autoinhibidor (aminoácidos 83 - 139) para PAK1. Los restos de la quinasa de diagnóstico en el dominio catalítico están enmarcados y numerados por convenio. La Figura modificada procede del trabajo de Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743.

Figura 3. Secuencias de aminoácidos humanas representativas de PAK4, PAK5, PAK6 y PAK7. Se muestra una alineación de ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de PAK4 humana (GenBank NP_ 005875), PAK5 humana (GenBank CAC18720), PAK6 humana (GenBank NP_064553) y PAK7 humana (GenBank Q9P286). Los asteriscos debajo de las secuencias marcan los aminoácidos idénticos y los puntos debajo de las secuencias denotan sustituciones conservadoras de aminoácidos. Las inserciones se representan por un guión.

Figura 4. Secuencias de aminoácidos humanas representativas de PAK4, PAK5 y PAK6. Se muestra una alineación de ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de PAK4 humana (GenBank CAA09820), PAK5 humana (GenBank BAA94194) y PAK6 humana (GenBank AAF82800). Las partes enmarcadas en negro marcan aminoácidos idénticos. Las inserciones se representan por un guión. Los restos de la quinasa de diagnóstico en el dominio catalítico están enmarcados y numerados por convenio. La Figura modificada procede del trabajo de Dan et al., 2002, Mol. Cell. Biol., 22:567.

Figura 5. Secuencias de aminoácidos representativas de Caenorhabditis elegans, Drosophila melanogaster y PAK1 de rata. Se muestra una alineación de ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de PAK1 de C. elegans (CEPAK; GenBank BAA11844), D. melanogaster (DPAK; GenBank AAC47094) y rata (PAK; GenBank AAB95646). Las partes enmarcadas en negro señalan aminoácidos idénticos. Las inserciones se representan por un guión. La parte enmarcada del N-terminal señala el dominio de unión a p21 y la parte enmarcada del C-terminal denota el dominio de quinasa C-terminal. La Figura modificada procede del trabajo de Chen et al., 1996, J. Biol. Chem., 271:26362,

Figura 6. Información del producto OSU-03012 del catálogo de Cayman Chemical (Mayo 2006).

Figura 7. Estructura química de OSU-03012.

Figura 8. La PAK está implicada en múltiples vías de señalización. PAK participa aguas arriba de Raf, la proteína quinasa quinasa (MEK) activada por mitógenos, la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK) y la serina/treonina quinasa 1 que interacciona con MAPK (Mnk1) en la vía de señalización de la ERK. PAK participa aguas abajo de la quinasa 1 dependiente de fosfoinositida (PDK1), PDK2 y fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K) en la vía de señalización de la PI3K. La Figura modificada procede del trabajo de Klann and Dever (2004, Nat. Rev. Neurosci., 5:931).

Figura 9. Representación esquemática de la vía de la quinasa regulada por señales extracelulares (ERK). La cascada de proteínas quinasas activadas por mitógenos (MAP) comprende tres quinasas secuenciales: MAP quinasa quinasa quinasa (MAPKKK), MAP quinasa quinasa (MAPKK) y MAP quinasa (MAPK). Las ERK 1/2 fosforilan una variedad de dianas nucleares, citosólicas y del citoesqueleto. La vía de las quinasas de adhesión focal a integrinas (FAK), que es activada por adhesión de integrinas a moléculas específicas de la matriz extracelular (ECM), está implicada en activar la vía de las ERK. La activación de la vía de las ERK está asociada frecuentemente con la proliferación celular, la supervivencia celular y la migración celular. Se muestran inhibidores ilustrativos de la vía de las ERK. Existen varios reguladores negativos de la vía de las ERK, tales como las MAP quinasa fosfatasas (MKP/DUSP) y proteínas Sprouty. La expresión de las MKP y las proteínas Sprouty es inducida de un modo dependiente de ERK y por tanto estas proteínas participan en el circuito o bucle regulador de la retroalimentación negativa de la vía de las ERK.

Figura 10. Análisis de Golgi. Los segmentos dendríticos representativos de las neuronas piramidales de las capas II/III de ratones de tipo natural (WT; n = 20 neuronas, 2 ratones), ratones dnPAK TG (n = 30 neuronas, 3 ratones), ratones FMR1 KO (n = 20 neuronas, 2 ratones) y ratones mutantes dobles dnPAK TG; ratones FMR1 KO (dMT; n = 40 neuronas, 4 ratones). En cada rama dendrítica apical primaria se analizaron diez segmentos dendríticos consecutivos de 10 μm de largo para cuantificar la densidad espinal por cada segmento dendrítico de 10 μm de largo (Figura 11) y la densidad espinal media (Figura 12).

Figura 11. Cuantificación de la densidad espinal. En cada rama dendrítica apical primaria se analizaron diez segmentos dendríticos consecutivos de 10 μm de largo para cuantificar la densidad espinal por segmento dendrítico de 10 μm de largo. La densidad espinal en los ratones dMT fue comparable a la de los ratones de control de tipo natural en todos los segmentos dendríticos excepto los segmentos 7 y 8 (p > 0,05 en los segmentos 1 - 6, 9 y 10; p < 0,01 en los segmentos 7 y 8).

Figura 12. Cuantificación de la densidad espinal media. (A) En cada rama dendrítica apical primaria se analizaron diez segmentos dendríticos consecutivos de 10 μm de largo para cuantificar la densidad espinal media por segmento dendrítico de 10 μm de largo. La densidad espinal media en los ratones dMT (1,28 ± 0,02) fue significativamente inferior que la de los ratones FMR1 KO (1,60 ± 0,02; p < 0,001) y significativamente superior a la de los ratones dnPAK TG (1,06 ± 0,01; p < 0,001). ANOVA, p < 0,0001.***: p < 0,001.

Figura 13. Cuantificación de la longitud espinal. Las neuronas de ratones FMR1 KO (444 espinas) exhibieron un cambio significativo en la distribución global de las espinas hacia las espinas de mayor longitud comparadas con las neuronas de los ratones de tipo natural (406 espinas; ensayo de Kolmogorov Smirnov: p < 0,05), mientras que las neuronas de los ratones dnPAK TG (630 espinas) exhibieron el cambio opuesto hacia espinas más cortas (p < 0,01). En contraste, la distribución de la longitud espinal en las neuronas de los ratones dMT (785 espinas) se solapaban bien con la de las neuronas de los ratones de tipo natural y eran significativamente diferentes de la de las neuronas de ratones FMR1 KO (p < 0,01).

Figura 14. La inhibición de PAK restaura la LTP cortical reducida en ratones FMR1 KO. (A) Curvas entrada –salida (input-output) que representan los cambios en la amplitud del potencial postináptico excitador del campo (fEPSP) y su correspondiente intensidad de estímulo presináptico en ratones de tipo natural (n = 45 cortes, 16 ratones), ratones dnPAK TG (n = 30 cortes, 10 ratones ), ratones FMR1 KO (n = 57 cortes, 19 ratones ) y ratones dMT (n = 24 cortes, 8 ratones ). (B) La LTP cortical inducida por TBS estaba potenciada en ratones dnPAK TG (n = 13 cortes, 11 ratones), pero reducida en ratones FMR1 KO (n = 17 cortes, 11 ratones), respecto a los ratones de control de tipo natural (n = 17 cortes, 11 ratones; para respuestas 55 minutos después de la estimulación, ANOVA, p < 0,05; tanto para ratones dnPAK TG frente a ratones de tipo natural como para ratones FMR1 KO frente a ratones de tipo natural, p < 0,04). En contraste, la magnitud de LTP fue indistinguible entre los cortes de los ratones dMT (n = 13 cortes, 9 ratones ) y los ratones de control de tipo natural (p > 0,05 para respuestas 55 minutos después de la estimulación). Se muestra para cada genotipo una gráfica de las trazas del potencial de campo representativo tomada durante la línea base de registro y 55 minutos después de la estimulación.

Figura 15. Ensayos en campo abierto. Se sometieron ratones de diferentes genotipos al ensayo en campo abierto de acuerdo con métodos estándares. Cada ratón corrió durante 10 minutos en una cámara de monitorización de la actividad. La actividad en campo abierto se detectó por interrupciones de rayos de luz y se analizó por el programa informático VersaMax. Las actividades medidas fueron la cantidad de tiempo que el ratón pasó en el centro del campo, el número de veces que el ratón presentó conductas repetidas ("estereotipia") y la distancia total recorrida por el ratón. Los genotipos son como sigue: (1) de tipo natural (n = 10 ratones); (2) dnPAK TG (n = 10 ratones); (3) FMR1 KO (n = 11 ratones); y (4) dnPAK TG; FMR1 KO ("ratones dMT " n = 11 ratones). "n.s.": estadísticamente no diferentes. *: p < 0,05; ***: p < 0,001. (A) Los ratones FMR1 KO recorrieron una mayor distancia en comparación con la de los ratones de tipo natural (ANOVA, p < 0,01. Los de tipo natural: 15,29 ± 0,92 m; FMR1 KO: 20,99 ± 1,10 m, p < 0,001). (B) Los ratones FMR1 KO exhibieron un mayor número de conductas repetidas que los ratones de tipo natural (recuentos de estereotipia: ANOVA, p < 0,05. Los de tipo natural: 1636 ± 119; FMR1 KO: 2049 ± 125, p < 0,05). (C) Los ratones FMR1 KO permanecieron un periodo de tiempo más largo en el centro del campo abierto que los ratones de tipo natural (ANOVA, p < 0,001. Los de tipo natural: 79,8 ± 8,5 segundos; FMR1 KO: 143,1 ± 12,0 segundos, p < 0,001). En las tres conductas, los ratones dMT exhibieron prestaciones comparables a las de los ratones de control de tipo natural (p > 0,05 para todos los siguientes parámetros: distancia recorrida: 17,76 ± 0,91 m; recuentos de estereotipia: 1756 ± 102; tiempo en el centro: 108,8 ± 14,6 segundos).

Figura 16. Tarea de condicionamiento del miedo vestigial. Se sometieron ratones de diferentes genotipos (de tipo natural, n = 15 ratones; dnPAK TG, n = 12 ratones; FMR1 KO, n = 15 ratones; dMT, n = 9 ratones) a la tarea de condicionamiento del miedo vestigial de acuerdo con métodos estándares. En el día 1 ("condicionamiento") los ratones se colocaron en una cámara de entrenamiento durante 60 segundos antes del comienzo del tono de ruido blanco de 15 segundos. Otros 30 segundos más tarde los ratones recibieron una descarga eléctrica de 1 segundo (intensidad 0,7 mA). Por tanto, una prueba se compone de tono, tiempo en blanco de 30 segundos (también llamado "tiempo vestigial") y luego descarga eléctrica. Se realizaron siete pruebas con un intervalo entre pruebas (abreviadamente ITI por la expresión inglesa intertrial interval) de 210 segundos. Para examinar si los ratones recuerdan esta asociación, el día 2 ("ensayo del tono"), los ratones fueron colocados en una nueva cámara con una forma y olor diferentes de los de la primera cámara. Después de 60 segundos, se repitió un tono de 15 segundos durante siete veces con una ITI de 210 segundos. Se digitalizaron las imágenes de video y el porcentaje de tiempo de "congelación" durante cada ITI se analizó por el programa informático Image FZ. La congelación se definió como la ausencia de todo movimiento excepto el respiratorio durante un periodo de 1 segundo. En el día 1 ("condicionamiento"), los cuatro genotipos de ratones exhibieron cantidades comparables de pre-condicionamiento ("línea base") y pos-condicionamiento de congelación en todas las prueba. En el ensayo de tonos de 24 horas, los cuatro genotipos exhiben cantidades comparables de congelación pre-tono (ANOVA p > 0,05). Sin embargo, para la congelación dependiente del tono, los ratones FMR1 KO y los ratones dnPAK TG exhibieron una reducción significativa en comparación con la de los ratones de control de tipo natural (ANOVA para cada sesión de tono, p < 0,05; para FMR1 KO frente a los de tipo natural, p < 0,05 para la sesión 1 y p < 0,01 para la sesiones 2 a 7; para dnPAK TG frente a los de tipo natural, p > 0,05 para la sesión 1 y p < 0,01 para las sesiones 2 a 7). Los ratones dMT mostraron también déficits de congelación durante las primeras diversas sesiones de tonos (sesiones 1 a 4) en comparación con los ratones de control de tipo natural (p < 0,05). Sin embargo, con sesiones de tonos adicionales (sesiones 5 a 7), la congelación por ratones dMT alcanzó a la de los ratones de control de tipo natural (p > 0,05). "n.s.": estadísticamente no diferente. *: p < 0,05; **: p < 0,01; ***: p < 0,001.

Figura 17. Cuantificación de la congelación inducida por un tono medio. Congelación media para las sesiones de tonos 1 a 4: ANOVA p < 0,05. Los ratones dMT mostraron déficits de congelación en comparación con los ratones de control de tipo natural (p < 0,05), pero los déficits en ratones dMT fueron menos pronunciados en comparación con los de los ratones dnPAK TG (p < 0,01) o FMR1 KO (p < 0,01). Congelación media para las sesiones de tonos 5 a 7: ANOVA p < 0,05. El nivel de congelación en ratones dMT no fue significativamente diferente al del de los ratones de control de tipo natural (p > 0,05) y hubo tendencias en su diferencia de los ratones dnPAK TG (p = 0,12)

o FMR1 KO (p = 0,07).

Figura 18. Inmunoprecipitación. Se realizaron inmunoprecipitaciones usando suero de conejo (control negativo), a-PAK1 o a-PAK1 más un péptido de bloqueo. Se sondaron transferencias de Western para PAK1 o FMRP. La a-PAK1, pero no el suero de conejo, inmunoprecipita FMRP en este ensayo. La especificidad de la interacción se analizó incluyendo un péptido de bloqueo específico para la a-PAK1 en la reacción de inmunoprecipitación. Entrada: para una inmunoprecipitación se cargó en el gel 2% del extracto usado.

Figura 19. Ensayo desplegable con GST. La FMRP se produjo por traducción in vitro. GST y PAK1 etiquetada con GST fueron purificadas en un sistema de expresión bacteriano. Se usaron FMRP de tipo natural y los mutantes de FMRP representados en la Figura 21 en el ensayo desplegable con GST. "Entrada": muestra de FMRP traducida in vitro antes de que se llevara a cabo la reacción; "MW": peso molecular patrón.

Figura 20. Caracterización de la interacción entre PAK1 y diversas variantes de FMRP in vitro. Se incubaron las variantes de FMRP traducidas in vitro con GST o GST- PAK1 y perlas de glutatión-Sepharose. Los complejos aislados por este método fueron sometidos a SDS-PAGE y transferencia de Western para FMRP. "Entrada": se cargaron en el gel 10% de la muestra de FMRP traducida in vitro antes de que se llevara a cabo la reacción de unión.

Figura 21. Estructura de dominios de FMRP de tipo natural y mutante. La Figura 21 (adaptada del trabajo de Mazroui et al., 2003, Hum. Mol. Genet. 12:3087) muestra una estructura esquemática de FMRP, resaltando diversos dominios funcionales incluyendo tres restos de unión al RNA (RGG, KH1 y KH2) y el sitio de fosforilación (S499, representado por un asterisco blanco). Las construcciones usadas para la unión in vitro incluían la longitud completa (de tipo natural), truncada (LRGG, LS499 y LKH) o FMRP mutada (I304N). LRGG se refiere a la variante de FMRP con una deleción de la parte enmarcada RGG en los aminoácidos 526 - 555. La zona suprimida LS499 abarca los aminoácidos 443 - 527 e incluye el sitio de fosforilación, S499, así como los supuestos sitios de fosforilación. La mutación sin sentido de isoleucina a asparagina en el dominio KH2 mimetiza a la previamente descrita en un paciente humano con FXS (I304N, representado por un asterisco negro). El mutante por deleción LKH carece de ambos dominios KH en tándem correspondientes a los aminoácidos 207 - 425. La Figura es adaptada del trabajo de Mazroui et al., 2003, Hum. Mol. Genet., 12:3087; la numeración se refiere a las posiciones de los aminoácidos designadas por la entrada SwissProt Q06787.

Definiciones

Aminoácido: Tal como se utiliza en la presente memoria el término "aminoácido", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que pueda estar incorporado en una cadena polipeptídica. En algunas realizaciones, un aminoácido tiene la estructura general H2N-C(H)(R)-COOH. En algunas realizaciones, un aminoácido es un ácido de origen natural. En algunas realizaciones, un aminoácido es un aminoácido sintético; en algunas realizaciones, un aminoácido es un D-aminoácido; en algunas realizaciones, un aminoácido es un Laminoácido. "Aminoácido típico" se refiere a cualquiera de los veinte L-aminoácidos típicos que se encuentran comúnmente en péptidos de origen natural. "Aminoácido no típico" se refiere a cualquier aminoácido, distinto de los aminoácidos típicos, independientemente de si se prepara sintéticamente o se obtiene de una fuente natural. Como se usa en este documento, "aminoácido sintético" comprende aminoácidos modificados químicamente, que incluyen aunque sin limitación: sales, derivados de aminoácidos (tales como amidas) y/o sustituciones. Los aminoácidos, incluyendo los aminoácidos carboxi- y/o amino-terminales en los péptidos, pueden ser modificados por metilación, amidación, acetilación y/o sustitución por otros grupos químicos que puedan cambiar la semivida del péptido en circulación sin afectar adversamente a su actividad. Los aminoácidos pueden participar en un enlace disulfuro. El término "aminoácido" se usa indistintamente con "residuo de aminoácido" y puede referirse a un aminoácido libre y/o a un residuo de aminoácido de un péptido. Será evidente por el contexto en el que se utilice el término, si se refiere a un aminoácido libre o a un residuo de un péptido.

Animal: Como se usa en la presente memoria, el término "animales" se refiere a cualquier miembro del reino animal. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a los seres humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En algunas realizaciones, "animal" se refiere a animales no humanos, en cualquier etapa de desarrollo. En ciertas realizaciones, el animal no humano es un mamífero (por ejemplo, un roedor, un ratón, una rata, un conejo, un mono, un perro, un gato, una oveja, ganado bovino, un primate y/o un cerdo). En algunas realizaciones, los animales incluyen, aunque sin limitación: mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, insectos y/o gusanos. En algunas realizaciones, un animal puede ser un animal transgénico, un animal genéticamente modificado y/o un clon.

Anticuerpo: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "anticuerpo" se refiere a cualquier inmunoglobulina ya sea natural o total o parcialmente producida sintéticamente. También se incluyen en el término todos los derivados de los anticuerpos que mantienen la capacidad de unión específica. El término también abarca cualquier proteína que tenga un dominio de unión que sea homólogo u homólogo en gran medida a un dominio de unión de inmunoglobulina. Dichas proteínas pueden proceder de fuentes naturales, o en parte o totalmente ser producidas sintéticamente. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE. Como se usa en la presente memoria, los términos "fragmento de anticuerpo" o "porción característica de un anticuerpo" se utilizan indistintamente y se refieren a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga una longitud inferior a la completa. En general, un fragmento de anticuerpo retiene al menos una porción significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque sin limitación: los fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacuerpo dsFv y Fd. Un fragmento de anticuerpo puede ser producido por cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede ser producido enzimática

o químicamente por la fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede ser producido de forma recombinante a partir de un gen que codifique la secuencia parcial del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede ser total o parcialmente producido sintéticamente. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo de cadena sencilla. Alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que estén enlazadas entre sí, por ejemplo, por enlaces disulfuro. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional comprende típicamente al menos alrededor de 50 aminoácidos y más típicamente comprende al menos alrededor de 200 aminoácidos.

Aproximadamente: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "aproximadamente" o "alrededor de", tal como se aplica a uno o más valores de interés, se refiere a un valor que es similar a un valor de referencia establecido. En cierta realización, el término "aproximadamente" o "alrededor de" se refiere a un intervalo de valores que se encuentren dentro del 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1% o menos en cualquier dirección (mayor o menor que) del valor de referencia establecido a menos que se indique lo contrario o sea de otro modo evidente por el contexto (excepto cuando dicho número exceda del 100% de un valor posible).

Biológicamente activa: Como se usa en la presente memoria, la frase "biológicamente activa" se refiere a una característica de cualquier sustancia que tenga actividad en un sistema y/o organismo biológico. Por ejemplo, una sustancia que, cuando se administra a un organismo, tiene un efecto biológico en ese organismo, se considera que es biológicamente activa. En realizaciones particulares, cuando una proteína o polipéptido es biológicamente activo, una porción de esa proteína o polipéptido que comparta al menos una actividad biológica de la proteína o polipéptido se denomina típicamente una porción "biológicamente activa".

Sustancia candidata: Como se usa en la presente memoria, el término "sustancia candidata" se refiere a cualquier sustancia que pueda inhibir potencialmente el FXS y/o modular la actividad de PAK. Una sustancia candidata puede ser una proteína, un ácido nucleico, una molécula pequeña, un lípido, un carbohidrato, una glicoproteína, un proteoglicano, sus combinaciones y/o sus porciones características. Puede llegar a ser el caso de que las sustancias candidatas más útiles sean las sustancias que estén estructuralmente relacionadas con FMRP, PAK, sus parejas de unión, sus efectores aguas arriba y/o sus efectores aguas abajo (por ejemplo, sustancias mimetizadoras). Sin embargo, puede darse el caso de que las sustancias candidatas más útiles tengan poca o ninguna relación estructural con FMRP, PAK, sus parejas de unión, sus efectores aguas arriba y/o sus efectores aguas abajo. En algunas realizaciones, las sustancias candidatas se proporcionan como sustancias individuales. En algunas realizaciones, las sustancias candidatas se proporcionan en la forma de una quimioteca, colección y/o un conjunto de sustancias candidatas. En algunas realizaciones, las sustancias candidatas pueden ser cribadas por su capacidad para modular PAK.

Porción característica: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "una porción característica" de una sustancia, en el sentido más amplio, es una que comparte un cierto grado de secuencia y/o identidad estructural y/o al menos una característica funcional con la sustancia intacta pertinente. Por ejemplo, una "porción característica" de una proteína o polipéptido es una que contiene un tramo continuo de aminoácidos, o una colección de tramos continuos de aminoácidos, que en conjunto son característicos de una proteína o polipéptido. En algunas realizaciones, cada uno de dichos tramos continuos contendrá generalmente al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más aminoácidos. Una "porción característica" de un ácido nucleico es una que contiene un tramo continuo de nucleótidos, o una colección de tramos continuos de nucleótidos, que juntos son característicos de un ácido nucleico. En algunas realizaciones, cada uno de dichos tramos continuos contendrá generalmente al menos 2, 5, 10, 15, 20, 50 o más nucleótidos. En general, una porción característica de una sustancia (por ejemplo, de una proteína, ácido nucleico, molécula pequeña, etc.) es una que, además de la secuencia y/o identidad estructural especificadas anteriormente, comparte al menos una característica funcional con la sustancia intacta pertinente. En algunas realizaciones, una porción característica puede ser biológicamente activa.

Expresión: Como se usa en la presente memoria, "expresión" de una secuencia de ácido nucleico se refiere a uno o más de los siguientes eventos: (1) la producción de un molde de RNA a partir de una secuencia de DNA (por ejemplo, por transcripción); (2) el procesamiento de un transcrito de RNA (por ejemplo, mediante corte y empalme, edición, formación de protección en 5' y/o formación del extremo 3'); (3) la traducción de un RNA a un polipéptido o proteína; (4) la modificación posterior a la traducción de un polipéptido o proteína.

FMR1: Como se usa en la presente memoria, el gen "FMR1" se refiere a cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMRP) y/o una de sus partes características. Los ejemplos representativos de secuencias de nucleótidos de FMR1, representadas en la Figura 1, incluyen número de acceso al GenBank AF305881 y número de acceso al GenBank L29074. El gen "FXR" es homólogo al FMR1 y puede compensar la pérdida de la función de FMR1. Ejemplos representativos de secuencias de nucleótidos de FXR incluyen, aunque sin limitación: FXR1 (número de acceso al GenBank U25165) y FXR2 (número de acceso al GenBank U31501). Los genes FXR1 y FXR2, representados en la Figura 1, son homólogos a FMR1 y puede compensar la pérdida de función de FMR1. En algunas realizaciones, un gen FMR1 comprende cualquier secuencia de nucleótidos que comparta alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 95%

o mayor que 95% de identidad de secuencia con las secuencias de números de acceso al GenBank AF305881, L29074, U25165 y/o U31501.

Proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMRP): Como se usa en la presente memoria, "proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil " o "FMRP", se refiere a cualquier producto de la secuencia de nucleótidos de la proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMR1) y/o a una de sus porciones características. Los ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de FMRP, representadas en la Figura 1, incluyen, aunque sin limitación: número de acceso al GenBank AAG22045 y número de acceso al GenBank AAB18829. La proteína "FXR" es homóloga a FMRP y puede compensar la pérdida de la función de FMRP. Los ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de la FXR incluyen, aunque sin limitación: FXR (número de acceso al GenBank AAC50155) y FXR2 (número de acceso al GenBank AAC50292). En algunas realizaciones, FMRP comprende cualquier secuencia de aminoácidos que comparta alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 95%, o mayor que 95% de identidad de secuencia con las secuencias de números de acceso al GenBank AAG22045, AAB18829, AAC50155 y/o AAC50292.

Síndrome del cromosoma X frágil (FXS): Como se usa en la presente memoria, en algunas realizaciones, "síndrome del cromosoma X frágil" o "FXS", se refiere a una enfermedad, trastorno y/o estado caracterizado por uno o más de los siguientes síntomas: (1) síntomas conductuales, que incluyen aunque sin limitación: hiperactividad, estereotipia, ansiedad, convulsiones, deterioro de la conducta social y/o retraso cognitivo; (2) morfología sináptica defectuosa, tal como número, longitud y/o anchura anómalos de las espinas dendríticas y/o (3) función sináptica defectuosa, tal como un aumento de la depresión a largo plazo (LTD) y/o una reducción de la potenciación a largo plazo (LTP).

En algunas realizaciones, FXS se refiere a una enfermedad, trastorno y/o estado causados por y/o asociados con uno o más de los siguientes: (1) una mutación en el gen FMR1 (la secuencia de nucleótidos que codifica FMRP); (2) expresión defectuosa del gen FMR1; (3) aumento y/o disminución de la expresión del gen FMRP; (4) función defectuosa del gen FMRP; (5) aumento y/o disminución de la expresión de parejas de unión naturales de FMRP; (6) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para unirse a sus parejas de unión naturales; (7) disminución o ausencia de metilación de la arginina de FMRP; (8) aumento de la metilación de repeticiones de CpG de FMR1 en 5' UTR del exón 1; (9) error de localización o expresión errónea de FMRP en la célula o en el organismo; (10) modulación de la función de los factores de transcripción Sp1 y/o NRF1 de FMR1; (11) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP de asociarse con polisomas; (12) pérdida de la función de FXR1 y/o FXR2, que son homólogos a FMR1 y pueden compensar la pérdida de la función de FMR1; (13) disminución de la capacidad de FMRP para reconocer estructuras secundarias del RNA que FMRP normalmente reconoce (tal como el cuartete G intramolecular y/o el "complejo del beso" de FMRP); (14) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para interaccionar con los miRNA y/o miembros de la vía de los miRNA; (15) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para interaccionar con sus RNA diana conocidos, tales como los RNA que codifican Racl, la proteína 1B asociada a microtúbulos, la proteína asociada al citoesqueleto de actividad regulada y/o la alfa-proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina; (16) aumento y/o disminución de la capacidad de la fosfatasa PP2A para actuar sobre FMRP (se cree que la PP2A produce la actividad de represión de la traducción del gen FMRP); (17) aumento y/o disminución de la actividad de los mGluR, que se sabe disminuyen la actividad de la fosfatasa PP2A; (18) señalización exagerada en las vías de los mGluR (Bear et al., 2004, Trends Neurosci., 27:370); (19) interrupción de un dominio KH de FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK y/o (20) una mutación I304N en FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK.

Los expertos en la técnica apreciarán que las enseñanzas de la presente invención descritas en la presente memoria con respecto al FXS son de hecho aplicables a otros trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo, por ejemplo, insuficiencia ovárica prematura (POF), "síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X" (FXTAS) y/o otros trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo, aunque sin limitación: diversas formas de retraso mental y/o trastornos del espectro autista (ASD). Además, los expertos en la técnica apreciarán que las enseñanzas de la presente invención descritas en la presente memoria con respecto al FXS son aplicables a cualquier enfermedad, trastorno y/o estado causados y/o asociados con uno o más de los siguientes: (1) una mutación en el gen FMR1 (la secuencia de nucleótidos que codifica FMRP); (2) expresión defectuosa del gen FMR1; (3) aumento y/o disminución de la expresión dFMRP; (4) función defectuosa de FMRP; (5)aumento y/o disminución de la expresión de las parejas de unión naturales de FMRP; (6) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para unirse a sus parejas de unión naturales; (7) disminución o ausencia de metilación de la arginina de FMRP; (8) aumento de la metilación de las repeticiones de CpG de FMR1 en la 5 'UTR del exón 1; 9) error de localización o expresión errónea de FMRP en la célula o en el organismo; (10) modulación de la función de los factores de transcripción Sp1 y/o NRF1 de FMR1;

(11)

aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP de asociarse con polisomas; (12) pérdida de la función de FXR1 y/o FXR2, que son homólogos a FMR1 y pueden compensar la pérdida de la función de FMR1; (13) disminución de la capacidad de FMRP de reconocer estructuras secundarias del RNA que FMRP normalmente reconoce (como el cuartete G intramolecular y/o el "complejo del beso" de FMRP); (14) aumento y/o disminución de la capacidad FMRP para interaccionar con los miRNA y/o miembros de la vía de los miRNA; (15) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para interaccionar con sus RNA diana conocidos, tales como los RNA que codifican Racl, la proteína 1B asociada a microtúbulos, la proteína asociada al citoesqueleto de actividad regulada y/o la alfa-proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina; (16) aumento y/o disminución de la capacidad de la fosfatasa PP2A para actuar sobre FMRP (se cree que la PP2A produce la actividad de represión de la traducción del gen FMRP); (17) aumento y/o disminución de la actividad de los mGluR, que se sabe disminuyen la actividad de la fosfatasa PP2A; (18) señalización exagerada en las vías de los mGluR (Bear et al., 2004, Trends Neurosci., 27:370);

(19)

interrupción de un dominio KH de FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK; y/o

(20)

una mutación I304N en FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK.

Funcional: Como se usa en la presente memoria, una molécula biológica "funcional" es una molécula biológica en una forma en la que presenta una propiedad y/o actividad que la caracteriza.

Gen: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "gen" tiene su significado como se entiende en la técnica. Los expertos en la técnica apreciarán que el término "gen" puede incluir secuencias reguladoras de genes (por ejemplo, promotores, potenciadores, etc.) y/o secuencias de intrones. Además, se apreciará que las definiciones de gen incluyen referencias a los ácidos nucleicos que no codifican proteínas, pero que en su lugar codifican moléculas de RNA funcionales, tales como los tRNA, agentes inductores de los RNAi, etc. A efectos de claridad se advierte que, tal como se utiliza en la presente solicitud, el término "gen" se refiere generalmente a una porción de un ácido nucleico que codifica una proteína; el término puede comprender opcionalmente secuencias reguladoras, como quedará claro a partir del contexto para los expertos en la técnica. Esta definición no se pretende que excluya la aplicación del término "gen" a las unidades de expresión que no codifican proteínas, sino más bien para aclarar que, en la mayoría de los casos, el término tal como se usa en este documento, se refiere a un ácido nucleico que codifica una proteína.

Producto génico o producto de expresión: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "producto génico" o "producto de expresión" se refiere generalmente a un RNA transcrito del gen (pre- y/o pos-procesamiento) o un polipéptido (pre- y/o pos-modificación) codificado por un RNA transcrito del gen.

Homología: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "homología" se refiere a la relación global entre moléculas polímeras, por ejemplo, entre moléculas de ácido nucleico (por ejemplo, moléculas de DNA y/o moléculas de RNA) y/o entre moléculas de polipéptidos. En algunas realizaciones, se considera que las moléculas polímeras son "homólogas" entre sí cuando sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% idénticas. En algunas realizaciones, las moléculas polímeras se considera que son "homólogas" entre sí cuando sus secuencias son al menos 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% similares.

Identidad: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "identidad" se refiere a la relación global entre moléculas polímeras, por ejemplo, entre moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo, moléculas de DNA y/o moléculas de RNA) y/o entre moléculas de polipéptidos. El cálculo del porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, por ejemplo, se puede realizar mediante la alineación de las dos secuencias para fines de comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una o ambas de una primera y una segunda secuencias de ácidos nucleicos para alineación óptima y las secuencias no idénticas pueden no tenerse en cuenta para fines de comparación). En ciertas realizaciones, la longitud de una secuencia alineada a efectos de comparación es al menos 30%, al menos 40%, al menos 50%, al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o sustancialmente el 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Luego se comparan los nucleótidos en las correspondientes posiciones de nucleótidos. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo nucleótido que la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias pueden realizarse utilizando un algoritmo matemático. Por ejemplo, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede determinarse usando el algoritmo de Meyers y Miller (CABIOS, 1989, 4:11-17), que se ha incorporado en el programa informático ALIGN (versión 2.0) que usa una tabla de ponderación de residuos PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de nucleótidos puede, alternativamente, ser determinado usando el programa informático GAP del paquete de programas GCG que utiliza una matriz NWSgapdna.CMP.

Aislada: Como se usa en la presente memoria, el término "aislada" se refiere a una sustancia y/o una entidad que ha sido: (1) separada de al menos algunos de los componentes con los que estaba asociada cuando se produjo inicialmente (en la naturaleza y/o en un entorno experimental) y/o (2) producida, preparada y/o manufacturada. Las sustancias y/o entidades aisladas pueden ser separadas de al menos alrededor de 10%, alrededor de 20%, alrededor de 30%, alrededor de 40%, alrededor de 50%, alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, o más de los otros componentes con los que estuvieron asociadas inicialmente. En algunas realizaciones, los agentes aislados tienen una pureza mayor de alrededor de 80%, alrededor de 85%, alrededor de 90%, alrededor de 91%, alrededor de 92%, alrededor de 93%, alrededor de 94%, alrededor de 95%, alrededor de 96%, alrededor de 97%, alrededor de 98%, alrededor de 99% o más de alrededor de 99%. Como se usa en la presente memoria, una sustancia es "pura" si está sustancialmente libre de otros componentes.

Pareja de unión natural: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "pareja de unión natural" se refiere a cualquier sustancia que se una a PAK y/o FMRP. En algunas realizaciones, la sustancia se une directamente y en otras realizaciones, la sustancia se une indirectamente. Una sustancia pareja de unión natural puede ser una proteína, ácido nucleico, lípido, carbohidrato, glicoproteína, proteoglicano y/o una molécula pequeña que se una a PAK y/o a FMRP. Un cambio en la interacción entre PAK y/o FMRP y una pareja de unión natural puede manifestarse como un aumento y/o disminución en la probabilidad de que se forme la interacción. Un cambio en la interacción entre PAK y/o FMRP/pareja de unión natural se puede manifestar como un aumento y/o disminución de la concentración del complejo PAK y/o FMRP/pareja de unión natural en la célula. Esto puede dar como resultado un aumento y/o disminución de la actividad de PAK y/o de FMRP. La presente invención identifica FMRP como una nueva pareja de unión natural de PAK. Otras parejas de unión naturales de PAK incluyen sustratos de PAK y/o otras sustancias que interaccionan con PAK. Ejemplos de parejas de unión naturales de PAK incluyen, aunque sin limitación: quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK); cadena ligera reguladora de miosina (R-MLC); cadena pesada de la miosina I; cadena pesada de la miosina II; miosina VI; caldesmón; desmina; Op18/estatmina; merlina; filamina A; LIM-quinasa (LIMK); Ras; Raf; Mek; p47phox; BAD; caspasa 3; receptores de estrógenos y/o progesterona; RhoGEF; GEF-H1; NET1; Gaz; fosfoglicerato-mutasa-B; RhoGDI; prolactina; p41Arc; Aurora-A; Rac/Cdc42; CIB; esfingolípidos; G-proteína � y/o subunidades y; PIX/COOL; GIT/PKL; paxilina; Nef; NESH; proteínas que contienen SH3 (por ejemplo, Nck y/o Grb2); quinasas (por ejemplo, Akt, PDK1, PI3-quinasa/p85, Cdk5, Cdc2, Src quinasas, Abl y/o la proteína quinasa A (PKA)); y/o fosfatasas (por ejemplo, fosfatasa PP2A, POPX1 y/o POPX2) (Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743; y Hofmann et al., 2004, J. Cell Sci., 117:4343). Los efectores prominentes aguas arriba de PAK incluyen, aunque sin limitación: PDK1, PDK2, PI3K y/o los NMDAR.

Ácido nucleico: Tal como se utiliza en la pre01sente memoria, el término "ácido nucleico", en su sentido más amplio, se refiere a cualquier compuesto y/o sustancia que esté o pueda estar incorporado en una cadena de oligonucleótidos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es un compuesto y/o sustancia que está o puede estar incorporado en una cadena de oligonucleótidos a través de un enlace fosfodiéster. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a los residuos individuales de ácidos nucleicos (por ejemplo, nucleótidos y/o nucleósidos). En algunas realizaciones, "ácido nucleico" se refiere a una cadena de oligonucleótidos que comprende los residuos individuales de ácidos nucleicos. Como se usa en la presente memoria, los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" se pueden utilizar indistintamente. En algunas realizaciones, "ácido nucleico" incluye RNA así como DNA y/o cDNA monocatenarios y/o bicatenarios. Además, los términos "ácido nucleico", "DNA", "RNA" y/o términos similares incluyen análogos de ácidos nucleicos, es decir, análogos que tienen una cadena principal distinta de la de fosfodiéster. Por ejemplo, los denominados "ácidos nucleicos peptídicos", que son conocidos en la técnica y tienen en la cadena principal enlaces peptídicos en lugar de enlaces fosfodiéster, se consideran dentro del alcance de la presente invención. El término "secuencia de nucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos" incluye todas las secuencias de nucleótidos que son versiones degeneradas de cada una y/o codifican la misma secuencia de aminoácidos. Las secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y/o RNA pueden incluir intrones. Los ácidos nucleicos pueden purificarse a partir de fuentes naturales, producirse utilizando sistemas de expresión recombinantes y opcionalmente ser purificados, sintetizados químicamente, etc. Cuando sea apropiado, por ejemplo, en el caso de moléculas químicamente sintetizadas, los ácidos nucleicos pueden comprender análogos de nucleósidos, tales como los análogos que tienen bases o azúcares modificados químicamente, modificaciones en la cadena principal, etc. Una secuencia de ácido nucleico se presenta en la dirección 5 ' a 3' a menos que se indique lo contrario. El término "segmento de ácido nucleico" se usa en la presente memoria para referirse a una secuencia de ácidos nucleicos que es una porción de una secuencia de ácidos nucleicos más larga. En muchas realizaciones, un segmento de ácidos nucleicos comprende al menos 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. En algunas realizaciones, un ácido nucleico es o comprende nucleósidos naturales (por ejemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina); análogos de nucleósidos (por ejemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo-pirimidina, 3-metil-adenosina, 5-metilcitidina, C-5-propinil-citidina, C5-propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5-yodouridina, C5-propinil-uridina, C5propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2-aminoadenosina, 7-desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8oxoguanosina, O(6)-metilguanina y 2-tiocitidina); bases químicamente modificadas; bases biológicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas); bases intercaladas; azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluoro-ribosa, ribosa, 2'-desoxi-ribosa, arabinosa y hexosa); y/o grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y los enlaces 5'-N-fosforamidita). En algunas realizaciones, la presente invención está dirigida específicamente a "ácidos nucleicos sin modificar", expresión que significa ácidos nucleicos (por ejemplo, polinucleótidos y residuos, incluyendo los nucleótidos y/o nucleósidos) que no se han modificado químicamente con el fin de facilitar o lograr su administración.

Actividad de PAK: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "actividad de PAK" se refiere a cualquier actividad y/o función de quinasa activada por p21. Ejemplos de "actividad de PAK" incluyen, aunque sin limitación: unión de PAK a otras sustancias, actividad de quinasa de PAK, autofosforilación, translocación, etc. "Actividad de PAK" se usa indistintamente con "función de PAK."

Modulador de PAK: Como se usa en la presente memoria, el término "modulador de PAK" se refiere a cualquier sustancia que directa y/o indirectamente cambie, afecte, altere, aumente y/o disminuya la actividad y/o niveles de PAK. Los moduladores de PAK pueden modular el nivel del mRNA y/o de la proteína PAK; una actividad de PAK; la semivida del mRNA y/o de la proteína PAK y/o la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales (por ejemplo, un sustrato para una quinasa PAK, una proteína Rac, una proteína Cdc42 y/o FMRP), como se mide utilizando métodos estándares. Los "inhibidores de PAK" puede inhibir, disminuir y/o eliminar el nivel del mRNA y/o de la proteína PAK; una actividad de PARK; la semivida del mRNA y/o de la proteína PAK y/o la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales (por ejemplo, un sustrato para una quinasa PAK, una proteína Rac, una proteína Cdc42 y/o FMRP), como se mide utilizando métodos estándares. Los "activadores de PAK" pueden activar y/o aumentar el nivel del mRNA y/o de la proteína PAK; una actividad de PAK; la semivida del mRNA y/o de la proteína PAK y/o la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales (por ejemplo, un sustrato para una quinasa PAK, una proteína Rac, una proteína Cdc42 y/o FMRP), como se mide utilizando métodos estándares. Los niveles de expresión de mRNA se pueden determinar usando ensayos estándares de protección de la RNasa y/o ensayos de hibridación in situ y/o el nivel de proteína se puede determinar utilizando el análisis de Western y/o inmunohistoquímico. Los niveles de fosforilación de las proteínas de transducción de señales aguas abajo de la actividad de PAK pueden medirse usando ensayos estándares. Los moduladores de PAK pueden modular la unión entre PAK y FMRP. Los "inhibidores de PAK" pueden reducir, suprimir y/o eliminar el enlace entre estas dos entidades y los "activadores de PAK" pueden aumentar y/o fortalecer la unión entre estas dos entidades. Por lo tanto, la unión entre PAK y FMRP es más fuerte en ausencia del inhibidor que en su presencia y es más débil en ausencia del activador que en su presencia. Dicho de otra manera, un inhibidor de PAK aumenta la Km de la unión entre PAK y FMRP y un activador de PAK disminuye la Km de la unión entre PAK y FMRP. Alternativa o adicionalmente, los moduladores de PAK pueden inhibir y/o activar la actividad quinasa de PAK. En particular, los inhibidores y/o activadores de PAK pueden modular la capacidad de PAK para fosforilar FMRP. Los moduladores de PAK pueden ser inorgánicos y/u orgánicos. Los moduladores de PAK pueden comprender uno o más de los siguientes: proteínas, péptidos, anticuerpos, ácidos nucleicos, entidades inductoras de RNAi, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas pequeñas, glicoproteínas, proteoglicanos, virus, lípidos y/o carbohidratos. Los moduladores de PAK pueden estar en forma de monómeros, dímeros, oligómeros y/o de un complejo. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, un "modulador de PAK" es una sustancia que modula todas las isoformas de PAK. En un caso, tal como se utiliza en la presente memoria, un "modulador de PAK" es una sustancia que modula una sola isoforma de PAK. En otro caso, tal como se utiliza en la presente memoria, un "modulador de PAK" es una sustancia que modula dos o más isoformas de PAK. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, un "modulador de PAK" es una sustancia que modula un subconjunto de isoformas de PAK. En otro caso, tal como se utiliza en la presente memoria, un "modulador de PAK" es una sustancia que modula cualquiera de las isoformas de PAK.

Proteína PAK: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína PAK" se refiere a una proteína que pertenece a la familia de las proteínas serina/treonina quinasas PAK. Estas incluyen isoforma de mamíferos identificadas, por ejemplo, PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6 y/o PAK7; y/o isoformas eucarióticas inferiores, tales como la Ste20 de levadura (Leberter et al., 1992, EMBO J., 11:4805) y/o las quinasas de cadena pesada de miosina I de una sola cabeza de Dictyostelium (Wu et al., 1996, J. Biol. Chem., 271:31787). Los ejemplos representativos de secuencias de aminoácidos de PAK, representadas en las Figuras 2, 3, 4 y 5, incluyen, aunque sin limitación: PAK1 humana (número de acceso al GenBank AAA65441), PAK2 humana (número de acceso al GenBank AAA65442), PAK3 humana (número de acceso al GenBank AAC36097), PAK4 humana (números de acceso al GenBank NP_005875 y CAA09820), PAK5 humana (números de acceso al GenBank CAC18720 y BAA94194), PAK6 humana (números de acceso al GenBank NP-064553 y AAF82800), PAK7 humana (número de acceso al GenBank Q9P286), PAK de C. elegans (número de acceso al GenBank BAA11844), PAK de D. melanogaster (número de acceso al GenBank AAC47094) y PAK1 de rata (número de acceso al GenBank AAB95646). Los ejemplos representativos de los genes PAK que codifican las proteínas PAK incluyen, aunque sin limitación: PAK1 humano (número de acceso al GenBank U24152), PAK2 humano (número de acceso al GenBank U24153), PAK3 humano (número de acceso al GenBank AF068864), PAK4 humano (número de acceso al GenBank AJ011855), PAK5 humano (número de acceso al GenBank AB040812) y PAK6 humano (número de acceso al GenBank AF276893). En algunas realizaciones, una proteína PAK comprende cualquier secuencia de aminoácidos que comparta alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 95% o mayor de 95% de identidad de secuencia con las secuencias de números de acceso al GenBank AAA65441, AAA65442, AAC36097, NP_005875, CAA09820, CAC18720, BAA94194, NP_064553, AAF82800, Q9P286, BAA11844, AAC47094 y/o AAB95646. En algunas realizaciones, un gen PAK comprende cualquier secuencia de nucleótidos que comparta alrededor de 60%, alrededor de 70%, alrededor de 80%, alrededor de 90%, alrededor de 95% o mayor de 95% de identidad de secuencia con las secuencias de números de acceso al GenBank U24152, U24153, AF068864, AJ011855, AB040812 y/o AF276893. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, "PAK" se refiere a todas las isoformas de PAK. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, "PAK" se refiere a una sola isoforma de PAK. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, "PAK" se refiere a dos o más isoformas de PAK. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, "PAK" se refiere a un subconjunto de isoformas de PAK. En algunas realizaciones, tal como se utiliza en la presente memoria, "PAK" se refiere a cualquiera de las isoformas de PAK.

Proteína: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "proteína" se refiere a un polipéptido (es decir, una cadena de al menos dos aminoácidos unidos entre sí por enlaces peptídicos). Las proteínas pueden incluir otros restos de aminoácidos (por ejemplo, pueden ser glicoproteínas, proteoglicanos, etc.) y/o se pueden transformar o modificar de otro modo. Los expertos en la técnica apreciarán que una "proteína" puede ser un polipéptido de cadena completa como la producida por una célula (con o sin una secuencia de señal) o puede ser una de sus porciones características. Los expertos apreciarán que una proteína puede incluir a veces más de una cadena polipeptídica, por ejemplo enlazadas por uno o más enlaces disulfuro o asociadas por otros medios. Los polipéptidos pueden contener L-aminoácidos, D-aminoácidos, o ambos y pueden contener cualquiera de una variedad de modificaciones de aminoácidos o análogos conocidos en la técnica. Las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación, amidación terminales, etc. En algunas realizaciones, las proteínas pueden comprender aminoácidos naturales, aminoácidos no naturales, aminoácidos sintéticos y sus combinaciones. El término "péptido" se utiliza generalmente para referirse a un polipéptido que tiene una longitud de menos de alrededor de 100 aminoácidos.

Molécula pequeña: En general, se entiende en la técnica que una "molécula pequeña" es una molécula orgánica que tiene un tamaño menor de alrededor de 5 kilodaltons (Kd). En algunas realizaciones, la molécula pequeña es menor de alrededor de 4 Kd, 3 Kd, alrededor de 2 Kd o alrededor de 1 Kd. En algunas realizaciones, la molécula pequeña es menor de alrededor de 800 daltons (D), alrededor de 600 D, alrededor de 500 D, alrededor de 400 D, alrededor de 300 D, alrededor de 200 D o alrededor de 100 D. En algunas realizaciones, una molécula pequeña es menor de alrededor de 2000 g/mol, menor de alrededor de 1500 g/mol, menor de alrededor de 1000 g/mol, menor de alrededor de 800 g/mol o menor de alrededor de 500 g/mol. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas no son polímeras. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas no son proteínas, péptidos ni aminoácidos. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas no son ácidos nucleicos ni nucleótidos. En algunas realizaciones, las moléculas pequeñas no son sacáridos ni polisacáridos.

Sujeto: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sujeto" o "paciente" se refiere a cualquier organismo al que pueda ser administrada una composición de esta invención, por ejemplo, para fines experimentales, de diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, primates no humanos y seres humanos; insectos, gusanos; etc.).

Sustancialmente: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sustancialmente" se refiere a la condición cualitativa de presentar extensión o grado total o casi total de una característica o propiedad de interés. Un experto en las técnicas biológicas entenderá que los fenómenos biológicos y químicos rara vez, o nunca, transcurren hasta su terminación y/o prosiguen hasta completarse o conseguir o evitar un resultado absoluto. El término "sustancialmente" se usa por lo tanto en este documento, para abarcar la posible falta de terminación inherente a muchos fenómenos biológicos y químicos.

Que padece: A una persona "que padece" el FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico se le ha diagnosticado o presenta uno o más de los síntomas del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Propenso : Un individuo que es "propenso a" FXS no le ha sido diagnosticado FXS y/o puede no presentar síntomas del FXS pero puede estar caracterizado por uno o más de los siguientes: (1) una mutación en el gen FMR1 (la secuencia de nucleótidos que codifica FMRP); (2) expresión defectuosa del gen FMR1; (3) aumento y/o disminución de la expresión del gen FMRP; (4) función defectuosa del gen FMRP; (5) aumento y/o disminución de la expresión de parejas de unión naturales de FMRP; (6) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para unirse a sus parejas de unión naturales; (7) disminución o ausencia de metilación de la arginina de FMRP; (8) aumento de la metilación de repeticiones de CpG de FMR1 en 5' UTR del exón 1; (9) error de localización o expresión errónea de FMRP en la célula o en el organismo; (10) modulación de la función de los factores de transcripción Sp1 y/o NRF1 de FMR1; (11) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP de asociarse con polisomas; (12) pérdida de la función de FXR1 y/o FXR2, que son homólogos a FMR1 y pueden compensar la pérdida de la función de FMR1;

(13) disminución de la capacidad de FMRP para reconocer estructuras secundarias del RNA que FMRP normalmente reconoce (tal como el cuartete G intramolecular y/o el "complejo del beso" de FMRP); (14) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para interaccionar con los miRNA y/o miembros de la vía de los miRNA; (15) aumento y/o disminución de la capacidad de FMRP para interaccionar con sus RNA diana conocidos, tales como los RNA que codifican Racl, la proteína 1B asociada a microtúbulos, la proteína asociada al citoesqueleto de actividad regulada y/o la alfa-proteína quinasa II dependiente de calcio/calmodulina; (16) aumento y/o disminución de la capacidad de la fosfatasa PP2A para actuar sobre FMRP (se cree que la PP2A produce la actividad de represión de la traducción del gen FMRP); (17) aumento y/o disminución de la actividad de los mGluR, que se sabe disminuyen la actividad de la fosfatasa PP2A; (18) señalización exagerada en las vías de los mGluR (Bear et al., 2004, Trends Neurosci., 27:370); (19) interrupción de un dominio KH de FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK y/o (20) una mutación I304N en FMRP, que disminuye la capacidad de FMRP para interaccionar con PAK. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso al FXS desarrollará FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. En algunas realizaciones, un individuo que es propenso al FXS no desarrollará FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Sustancia de ensayo: Como se usa en la presente memoria, la frase "sustancia de ensayo" se refiere a cualquier sustancia que pueda ser utilizada en los sistemas, métodos, valoraciones y/o composiciones descritos en la presente memoria. Una "sustancia de ensayo" puede referirse a uno o más de las siguientes: (1) una proteína PAK, un ácido nucleico que codifica PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; (2) una pareja de unión natural de PAK, un ácido nucleico que codifica una pareja de unión natural de PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; y/o (3) una proteína FMRP, un ácido nucleico que codifica FMRP y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; (4) un sustrato de la quinasa PAK, un ácido nucleico que codifica un sustrato de PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; y/o (5) una sustancia relacionada con la transducción de señales de PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados. En algunas realizaciones, una sustancia de ensayo es una proteína; ácido nucleico; molécula pequeña; carbohidrato; lípido; quimioteca; colección y/o un conjunto de cualquiera de éstos y/o la combinación de cualquiera de estos.

Cantidad terapéuticamente eficaz: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "cantidad terapéuticamente eficaz" significa una cantidad de modulador de PAK de la invención que es suficiente, cuando se administra a un sujeto que padece o es propenso al FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico, para tratar, diagnosticar, prevenir y/o retrasar la aparición del FXS y/u otros trastornos, síntoma(s) y/o estado(s) del desarrollo neurológico.

Agente terapéutico: Como se usa en la presente memoria, la expresión "agente terapéutico" se refiere a cualquier agente que, cuando se administra a un sujeto, tiene un efecto terapéutico y/o provoca un efecto biológico y/o farmacológico deseado.

Tratamiento: Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "tratar" o "tratamiento" se refiere a cualquier método utilizado para aliviar, mejorar, atenuar, inhibir, prevenir, retrasar el inicio, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia parcial o completamente de uno o más síntomas o características de una determinada enfermedad, trastorno y/o estado (por ejemplo, FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico). El tratamiento puede ser administrado a un sujeto que no muestre signos de una enfermedad y/o muestre sólo los signos tempranos de la enfermedad con el propósito de disminuir el riesgo de desarrollar la patología asociada con la enfermedad.

Vector: Como se usa en la presente memoria, "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. En alguna realización, los vectores son capaces de replicación y/o expresión extracromosómica de ácidos nucleicos a los que están enlazados en una célula hospedante, tal como una célula eucariota y/o procariota. Los vectores capaces de dirigir la expresión de genes unidos operativamente se denominan en la presente memoria "vectores de expresión".

Descripción detallada de ciertas realizaciones preferidas de la invención

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona inhibidores de PAK para uso en el tratamiento del síndrome del cromosoma X frágil (FXS) y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Se incluyen composiciones que comprenden al menos un inhibidor de PAK y un excipiente farmacéuticamente aceptable. En ciertas realizaciones, los moduladores de PAK actúan inhibiendo la interacción entre PAK y la proteína del retraso mental debido al cromosoma X frágil (FMRP).

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona métodos para identificar inhibidores de PAK útiles para el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo métodos de cribado de alta productividad. En otro ejemplo, los métodos incluyen ensayos in vitro e in cyto.

Quinasa activada por p21 (PAK)

La PAK es una familia de serina/treonina quinasas que está compuesta de al menos tres miembros, PAK1, PAK2 y/o PAK3, actúa aguas abajo de las pequeñas GTPasas Rac y/o Cdc42 para regular múltiples funciones celulares, incluyendo motilidad, morfogénesis, angiogénesis y/o apoptosis (Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743; y Hofmann et al., 2004, J. Cell Sci., 117:4343). Rac unida a GTP y/o Cdc42 se unen a PAK inactiva, liberando las restricciones estéricas impuestas por un dominio autoinhibidor de PAK y/o permitiendo la auto-fosforilación y/o activación de PAK. Se han identificado numerosos sitios de autofosforilación que sirven como marcadores para PAK activada.

Como se usa en la presente memoria, "PAK" se refiere a todas las isoformas de PAK (por ejemplo, PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6, PAK7, etc.). Como se usa en la presente memoria, "PAK" puede referirse a una sola isoforma de PAK. Como se usa en la presente memoria, "PAK" puede referirse a dos o más isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, "PAK" puede referirse a un subconjunto de isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, "PAK" puede referirse a cualquiera de las isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, "PAK" puede ser una sustancia que es al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a cualquiera y/o todas de PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6 y/o PAK7.

Dianas prominentes situadas aguas abajo de PAK de mamífero incluyen, aunque sin limitación: sustratos de la quinasa PAK, como la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK); cadena ligera reguladora de miosina (R-MLC); cadena pesada de la miosina I; cadena pesada de la miosina II; miosina VI; caldesmón; desmina; Op18/estatmina; merlina; filamina A; LIM-quinasa (LIMK); Ras; Raf; Mek; p47phox; BAD; caspasa 3; receptores de estrógenos y/o progesterona; RhoGEF; GEF-H1; NET1; Gaz; fosfoglicerato-mutasa-B; RhoGDI; prolactina; p41Arc y/o Aurora-A (Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743; y Hofmann et al., 2004, J. Cell Sci., 117:4343). Otras sustancias que se sabe que se unen a PAK en las células incluyen CIB; esfingolípidos; G-proteína �y/o subunidades y; PIX/COOL; GIT/PKL; Nef; paxilina; NESH; proteínas que contienen SH3 (por ejemplo, Nck y/o Grb2); quinasas (por ejemplo, Akt, PDK1, PI3-quinasa/p85, Cdk5, Cdc2, Src quinasas, Abl y/o la proteína quinasa A (PKA)); y/o fosfatasas (por ejemplo, fosfatasa PP2A, POPX1 y/o POPX2).

Efectores prominentes situados aguas arriba de PAK incluyen, aunque sin limitación: PDK1, PDK2, PI3K y/o los NMDAR.

La presente invención comprende el reconocimiento de que las anomalías en la morfología espinal cortical de pacientes con FXS y/o ratones FMR1 KO son sustancialmente opuestas a los encontradas en los ratones transgénicos en los que está inhibida la actividad de quinasa activada por p21 (PAK) por su forma negativa dominante (ratones dnPAK TG), por ejemplo, en el cerebro anterior postnatal.

Inhibidores de PAK

En la técnica se han descrito inhibidores de PAK como posibles sustancias para su uso en el tratamiento de cáncer, endometriosis, trastornos urogenitales, macropinocitosis, infección viral, permeabilidad vascular, enfermedades de las articulaciones, activación de linfocitos, contracción muscular y/o diabetes (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.863.532, 6.191.169 y 6.248.549; las solicitudes de patentes de EE.UU. 2002/0045564, 2002/086390, 2002/106690, 2002/142325, 2003/124107, 2003/166623, 2004/091992, 2004/102623, 2004/208880, 2005/0203114, 2005/037965, 2005/080002 y 2005/233965; la publicación de patente europea EP 1492871; Kumar et al., 2006, Nat. Rev. Cancer, 6:459; Eswaren et al., 2007, Structure, 15:201).

También se han descrito en la técnica inhibidores de PAK como posibles sustancias para uso en el tratamiento de trastornos neurológicos caracterizados por lesión de los nervios y/o la neurodegeneración. Tales trastornos incluyen enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, enfermedades relacionadas con priones, neurofibromatosis, lesión de los nervios inducida por derrame cerebral y/o enfermedades asociadas con lesiones de nervios debidas a isquemia y/o anoxia (véanse, por ejemplo, las patentes de EE.UU. 5.952.217 y 6.046.224; la solicitud de patente de EE.UU. 2006/088897; y las publicaciones del PCT WO 99/02701 y WO 04/07507).

Sin embargo, en la técnica no han sido previamente descritos los inhibidores de PAK como posibles sustancias para uso en el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico, incluyendo aunque sin limitación: FXS, insuficiencia ovárica prematura (POF), síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil (FXTAS), diversas formas de retraso mental y/o trastornos del espectro autista (ASD). La presente invención abarca el uso de inhibidores de PAK en el tratamiento de FXS, POF, FXTAS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Un inhibidor de PAK puede referirse a una sustancia, en donde la sustancia puede ser inorgánica y/u orgánica; un efector biológico y/o un ácido nucleico que codifica un agente, tal como un efector biológico; una proteína, polipéptido o péptido, incluyendo, aunque sin limitación: una proteína estructural, una enzima, una citoquina (tal como, un interferón y/o una interleuquina), un antibiótico, un anticuerpo policlonal o monoclonal y/o una parte eficaz del mismo, tal como un fragmento Fv, anticuerpo o parte del mismo que puede ser natural, sintético o humanizado, una hormona peptídica, un receptor, una molécula de señalización y/u otras proteínas, un ácido nucleico, tal como se define a continuación, incluyendo, aunque sin limitación un oligonucleótido y/o un oligonucleótido modificado, una entidad inductora de RNAi, un oligonucleótido antisentido y/o un oligonucleótido antisentido modificado, cDNA, DNA genómico, un cromosoma artificial y/o natural (por ejemplo, un cromosoma artificial de levadura, cromosoma artificial bacteriano, etc.) y/o una de sus porciones, RNA, incluyendo mRNA, tRNA, rRNA y/o una ribozima y/o un ácido nucleico peptídico (PNA); un virus o partícula similar a virus; un nucleótido, ribonucleótido y/o uno de sus análogo sintéticos que pueden estar modificados o no modificados; un aminoácido y/o uno de sus análogos, que puede estar modificados o sin modificar; una hormona no peptídica (por ejemplo, esteroides); una glicoproteína; un proteoglicano; un lípido y/o un carbohidrato. Están incluidas moléculas pequeñas, incluyendo productos químicos inorgánicos y/u orgánicos, que se unen y/u ocupan el sitio activo del polipéptido haciendo el sitio catalítico inaccesible al sustrato de manera que se impide la actividad biológica normal. Un inhibidor de PAK puede estar en solución y/o en suspensión (por ejemplo, en forma cristalina, coloidal u otra forma de partícula). Un inhibidor de PAK puede estar en forma de un monómero, dímero, oligómero, etc., y/o en un complejo.

Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba todas las isoformas de PAK (por ejemplo, PAK1. PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6, PAK7, etc.). Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba una sola isoforma de PAK. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba dos o más isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba un subconjunto de isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba cualquiera de las isoformas de PAK. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba cualquiera de PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6 y/o PAK7. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba cualquier subconjunto de PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6 y/o PAK7. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba todas las PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6, PAK7. Como se usa en la presente memoria, un "inhibidor de PAK" puede ser una sustancia que inhiba cualquier entidad que sea al menos 60%, al menos 70%, al menos 80%, al menos 90%, al menos 95% o al menos 98% idéntica a cualquiera y/o todas de PAK1, PAK2, PAK3, PAK4, PAK5, PAK6 y/o PAK7.

Los inhibidores candidatos de PAK pueden ser aislados de fuentes naturales, tales como animales, bacterias, hongos, plantas y/o muestras marinas. Se entenderá que los inhibidores candidatos de PAK se pueden obtener y/o sintetizarse a partir de composiciones químicas y/o sustancias manufacturadas.

Diseño racional de los fármacos

Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "sustancia candidata" se refiere a cualquier sustancia que pueda inhibir potencialmente el FXS y/o inhibir la actividad de PAK. Una sustancia candidata puede ser una proteína, un ácido nucleico, una molécula pequeña, un lípido, un carbohidrato, una glicoproteína, un proteoglicano, sus combinaciones y/o sus porciones características. Puede ser el caso de que las sustancias candidatas más útiles sean las sustancias que están estructuralmente relacionados con FMRP, PAK, sus parejas de unión, sus efectores aguas arriba y/o sus efectores aguas abajo (por ejemplo, sustancias mimetizadoras). El uso de compuestos cabezas de serie para ayudar a desarrollar mejores compuestos se conoce como "diseño racional de fármacos" e incluye no solamente las comparaciones con inhibidores y/o activadores conocidos, sino también las predicciones relativas a la estructura de sustancias diana.

El diseño racional de fármacos se puede utilizar para predecir y/o producir análogos estructurales de moduladores conocidos de PAK biológicamente activos (es decir, "materiales de partida de moduladores de PAK"). Mediante la creación de dichos análogos, es posible diseñar agentes terapéuticos que puedan ser más activos y/o estables que el material de partida del modulador de PAK, puedan tener diferente propensión a la alteración y/o puedan afectar a la función de diversos materiales de partida del modulador de PAK. En algunas realizaciones, se podría generar una estructura tridimensional para una sustancia candidata conocida y/o una de sus porciones características. En algunas realizaciones, esto se logra mediante cristalografía de rayos X, modelado por ordenador y/o por una combinación de estas propuestas.

Se pueden usar anticuerpos para determinar la estructura de un material de partida de moduladores de PAK. En principio, esta propuesta produce un núcleo de fármaco sobre el cual puede basarse el diseño posterior de fármacos. Es posible evitar por completo la cristalografía de proteínas mediante la generación de anticuerpos antiidiotípicos para un anticuerpo funcional farmacológicamente activo. Como una imagen especular de una imagen especular, se espera que el sitio de unión del anticuerpo anti-idiotipo sea un análogo del antígeno original. El antiidiotipo podría utilizarse luego para identificar y/o aislar péptidos de bancos de péptidos químicamente y/o biológicamente producidos. Los péptidos seleccionados servirían luego como núcleos de fármacos. Los anti-idiotipos pueden ser generados utilizando los métodos descritos en la presente memoria para producir anticuerpos, usando un anticuerpo como antígeno.

Se pueden formular otras sustancias estéricamente similares para mimetizar las porciones claves de la estructura de los moduladores de PAK diseñados racionalmente. Dichas sustancias pueden ser utilizadas de la misma manera que el material de partida del modulador de PAK o de una manera diferente.

Quimiotecas

Las quimiotecas de sustancias candidatas pueden ser empleadas en los métodos y/o composiciones descritos en este documento. La frase "quimioteca de sustancias candidatas”, como se usa en la presente memoria, se refiere a una colección y/o conjunto de múltiples especies de sustancias que consisten en subunidades y/o miembros seleccionados sistemáticamente y/o al azar. El cribado de quimiotecas de sustancias candidatas es una forma rápida y/o eficiente para analizar un gran número de sustancias relacionadas y/o no relacionadas por su actividad. Las propuestas combinatorias conducen a la rápida evolución de fármacos potenciales por la creación de sustancias de segunda, tercera, cuarta, etc., generación modeladas de sustancias activas, pero por lo demás indeseables.

Pueden ser cribadas para una actividad quimiotecas combinatorias (también conocidas como "colecciones químicas combinatorias"), quimiotecas de moléculas pequeñas, péptidos y/o compuestos miméticos de péptidos, entidades químicas definidas, oligonucleótidos y/o quimiotecas de productos naturales. En algunas realizaciones, una quimioteca de sustancias candidatas pueden comprender una quimioteca combinatoria sintética (por ejemplo, una colección química combinatoria), un extracto celular, un fluido corporal (por ejemplo, orina, sangre, lágrimas, sudor y/o saliva) u otra mezcla de sustancias sintéticas y/o naturales (por ejemplo, una quimioteca de moléculas pequeñas y/o una mezcla de fermentación).

Las quimiotecas de sustancias candidatas pueden incluir, por ejemplo, proteínas (por ejemplo, péptidos, polipéptidos, anticuerpos, aminoácidos, etc.), ácidos nucleicos (por ejemplo, DNA, RNA, oligonucleótidos, entidades inductoras de RNAi, ácidos nucleicos antisentido, ribozimas, ácidos nucleicos peptídicos, aptámeros, etc.), carbohidratos (por ejemplo, monosacáridos, disacáridos, polisacáridos, etc.), moléculas pequeñas (por ejemplo, moléculas pequeñas orgánicas, moléculas pequeñas inorgánicas, etc.) sus combinaciones y/o sus porciones características. Cada miembro de una quimioteca puede ser singular y/o puede ser una parte de una mezcla (por ejemplo, una "quimioteca comprimida"). Una quimioteca puede comprender sustancias sustancialmente purificadas y/o puede ser "sucia" (es decir, que contiene una cantidad significativa de impurezas).

Las sustancias candidatas pueden ser utilizadas en un cribado inicial en lotes (por ejemplo, lotes de los tipos de sustancias). Las sustancias de los lotes que muestran mejora y/o reducción de la actividad que se ensaya, pueden posteriormente ser analizadas de modo individual.

Las quimiotecas pueden ser adquiridas a diversas fuentes comerciales en un esfuerzo para "forzar" la identificación de sustancias útiles. Quimiotecas comercialmente disponibles se pueden obtener en Affymetrix, ArQuIe, Neose Tecnologies, Sarco, Ciddco, Oxford Asymmetry, Maybridge, Aldrich, Panlabs, Pharmacopeia, Sigma y/o Tripose. Una revisión completa de quimiotecas combinatorias, en particular, su construcción y/o usos se proporciona en el trabajo de Dolle et al., (1999, J. of Comb. Chem., 1:235). Se hace referencia a protocolos de quimiotecas combinatorias de péptidos en el texto de Cabilly, ed., Methods in Molecular Biology, Humana Press, Totowa, NJ, 1998.

Otras referencias que describen quimiotecas combinatorias, su producción y/o su uso incluyen las disponibles en la URL http://www.netsci.org/Science/Combichem/, que incluyen The Chemical Generation of Molecular Diversity. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, división de Eli Lilly (Publicado en julio de 1995); Combinatorial Chemistry: A Strategy for the Future—MDL Information Systems analiza el papel de su Project Library en gestionar quimiotecas de la diversidad (Publicado en julio de 1995); Solid Support Combinatorial Chemistry in Lead Discovery and SAR Optimization, Adnan M. M. Mjalli y Barry E. Toyonaga, Ontogen Corporación (Publicado en julio de 1995); Non-Peptidic Bradykinin Receptor Antagonists From a Structurally Directed Non-Peptide Library. Sarvajit Chakravarty, Babu J. Mavunkel, Robin Andy, Donald J. Kyle*, Scios Nova Inc. (Publicado en julio de 1995); Combinatorial Chemistry Library Design using Pharmacophore Diversity, Keith Davies y Clive Briant, Chemical Design Ltd. (Publicado en julio de 1995); A Database System for Combinatorial Synthesis Experiments—Craig James y David Weininger, Daylight Chemical Information Systems, Inc. (Publicado en julio de 1995); An Information Management Architecture for Combinatorial Chemistry, Keith Davies y Catherine White, Chemical Design Ltd (Publicado en julio de 1995); Novel Software Tools for Addressing Chemical Diversity, R. S. Pearlman, Laboratory for Molecular Graphics and Theoretical Modeling, College of Pharmacy, University of Texas (Publicado en junio/julio de 1996); Opportunities for Computational Chemists Afforded by the New Strategies in Drug Discovery: An Opinion, Yvonne Connolly Martin, Computer Assisted Molecular Design Project, Abbott Laboratories (Publicado en junio/julio de 1996); Combinatorial Chemistry and Molecular Diversity Course at the University of Louisville: A Description, Arno F. Spatola, Department of Chemistry, University of Louisville (Publicado en junio/julio de 1996); Chemically Generated Screening Libraries: Present and Future. Michael R. Pavia, Sphinx Pharmaceuticals, división de Eli Lilly (Publicado en junio/julio de 1996); Chemical Strategies for Introducing Carbohydrate Molecular Diversity into the Drug Discovery Process. Michael J. Sofia, Transcell Technologies Inc. (Publicado en junio/julio de 1996); Data Management for Combinatorial Chemistry. Maryjo Zaborowski, Chiron Corporation y Sheila H. DeWitt, Parke-Davis Pharmaceutical Research, división de Warner Lambert Company, (Publicado en noviembre de 1995); y/o The Impact of High Throughput Organic Synthesis on R&D in Bio-Based Industries, John P. Devlin (Publicado en marzo de 1996).

Se conocen en la técnica protocolos de selección para aislar los miembros deseados de grandes quimiotecas. Los protocolos de selección pueden implicar técnicas de presentación en fagos. Dichos sistemas, en los que diversas secuencias peptídicas se muestran en la superficie de bacteriófagos filamentosos, han demostrado ser útiles para crear quimiotecas de fragmentos de anticuerpos (y las secuencias de nucleótidos que los codifican) para selección y/o amplificación in vitro de fragmentos de anticuerpos específicos que se unen a un antígeno diana. Las secuencias de nucleótidos que codifican las regiones VH y/o VL están enlazadas a fragmentos de genes que codifican señales delanteras que los dirigen al espacio periplásmico de E. coli y, como resultado, los fragmentos de anticuerpos resultantes se presentan en la superficie del bacteriófago, típicamente como fusiones con proteínas de la cubierta del bacteriófago (por ejemplo, pIII y/o pVIII). Alternativa o adicionalmente, los fragmentos de anticuerpos se presentan externamente sobre cápsidas de fago lambda (fagocuerpos). Una ventaja de los sistemas de presentación basados en fagos es que, debido a que son sistemas biológicos, los miembros de la quimioteca seleccionados se pueden amplificar cultivando simplemente el fago que contiene el miembro seleccionado de la quimioteca en células bacterianas. Además, puesto que la secuencia de nucleótidos que codifica el miembro de la quimioteca polipeptídica está contenida en un fago y/o vector fagémido, la secuenciación, la expresión y/o la manipulación genética posterior son relativamente sencillas.

Los métodos para la construcción de quimiotecas de presentación de anticuerpos en bacteriófagos y/o quimiotecas de expresión de fagos lambda son bien conocidos en la técnica (Kang et al., 1991. Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 88:4363; Clackson et al., 1991, Nature, 352:624; Lowman et al., 1991, Biochemistry, 30:10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res., 19:4133; Chang et al., 1991, J. Immunol., 147:3610; Breitling et al., 1991, Gene, 104:147; Hawkins et al., 1992, J. Immunol., 22:867; Marks et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:16007; y Lerner et al., 1992, Science, 258:1313). Dichas técnicas pueden ser modificadas si es necesario para la expresión generalmente de las quimiotecas de polipéptidos.

Una propuesta ha sido el uso de fagotecas de scFv (Bird et al., 1988, Science, 242:423; Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 85:5879; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87:1066; y Chiswell et al., 1992, Trends Biotech., 10:80). Se han descrito diversas realizaciones de fagotecas de scFv presentadas en proteínas de la cubierta de bacteriófagos. Se conocen mejoras de las propuestas de presentación en fagos, por ejemplo como se describe en las publicaciones del PCT WO 92/01047, WO 96/06213 y WO 97/08320.

Las tecnologías alternativas de selección de fagotecas incluyen sistemas de expresión del bacteriófago lambda, que pueden ser cribados directamente como placas de bacteriófagos y/o como colonias de lisógenos, como se describió previamente (Huse et al., 1989, Science, 246:1275; Caton et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87; Mullinax et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:8095; y Persson et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:2432) y son de uso. Estos sistemas de expresión pueden utilizarse para cribar un gran número de diferentes miembros de una fagoteca, del orden de alrededor de 106 o más.

Los sistemas de cribado pueden basarse, por ejemplo, en la síntesis química directa de los miembros de la quimioteca. Un método implica la síntesis de péptidos sobre un conjunto de patillas (pins) y/o varillas, tal como se describe en la publicación del PCT WO 84/03564. Un método similar que implica la síntesis de péptidos sobre perlas, que forma una quimioteca de péptidos en la que cada perla es un miembro de la quimioteca individual, se describe en la patente de EE.UU. 4.631.211 y un método relacionado se describe en la publicación del PCT WO 92/00091. Una mejora significativa de los métodos basados en perlas implica marcar cada perla con una etiqueta identificadora única, tal como un oligonucleótido, con el fin de facilitar la identificación de la secuencia de aminoácidos de cada miembro de la quimioteca. Estos métodos mejorados basados en perlas se describen en la publicación del PCT WO 93/06121.

Otro método de síntesis química implica la síntesis de matrices o chips de péptidos (o compuestos miméticos de péptidos) sobre una superficie de manera que coloca cada miembro de la quimioteca distinto (por ejemplo, la secuencia de péptido única) en un lugar discreto, predefinido en el chip. La identidad de cada miembro de la quimioteca se determina por su ubicación espacial en el chip. Las localizaciones en el chip en donde se determina que se producen las interacciones de unión entre una molécula determinada (por ejemplo, un receptor) y miembros reactivos de la quimioteca, identifican así las secuencias de los miembros reactivos de la quimioteca sobre la base de la localización espacial. Estos métodos se describen en la patente de EE.UU. 5.143.854; las publicaciones del PCT WO 90/15070 y WO 92/10092; Fodor et al., 1991, Science, 251:767; y Dower et al., 1991, Ann. Rep. Med. Chem., 26:271.

Otros sistemas para generar quimiotecas de polipéptidos o nucleótidos implican el uso de maquinaria enzimática libre de células para la síntesis in vitro de los miembros de la quimioteca. En un método, se seleccionan las moléculas de RNA por rondas alternas de selección contra un ligando diana y amplificación por PCR (Tuerk et al., 1990, Science, 249: 505; y Ellington et al., 1990, Nature, 346:818). Se puede utilizar una técnica similar para identificar secuencias de DNA que se unen a un factor de transcripción humano predeterminado (Thiesen et al., 1990, Nucleic Acids Res., 18:3203; Beaudry et al., 1992 Science, 257:635; y las publicaciones del PCT WO 92/05258 y WO 92/14843). De una manera similar, puede usarse traducción in vitro para sintetizar polipéptidos como un método para generar grandes quimiotecas. Estos métodos que comprenden generalmente complejos de polisoma estabilizados, se describen además en las publicaciones del PCT WO 88/08453, WO 90/05785, WO 90/07003, WO 91/02076, WO 91/05058 y WO 92/02536. Sistemas alternativos de presentación que no están basados en fagos, tales como los descritos en las publicaciones del PCT WO 95/22625 y WO 95/11922 utilizan los polisomas para mostrar polipéptidos para selección.

Una propuesta combinatoria en uso se basa en una estrategia que implica la síntesis de quimiotecas que contienen una estructura diferente en cada partícula del soporte en fase sólida, la interacción de la quimioteca con una sustancia de ensayo soluble, la identificación de la "perla" que interacciona con la sustancia de ensayo y la determinación de la estructura llevada por la "perla" identificada (Lam et al., 1991, Nature, 354:82). Una alternativa a esta propuesta es la liberación secuencial de partes alícuotas definidas de las estructuras desde el soporte sólido, con la posterior determinación de la actividad en solución, la identificación de la partícula de la que fue liberada de la estructura activa y la elucidación de su estructura por secuenciación directa (Salmon et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:11708) y/o mediante la lectura de su código (Kerr et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:2529; Nikolaiev et al., 1993, Pept. Res., 6:161; y Ohlmeyer et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:109221).

Se pueden sintetizar quimiotecas combinatorias aleatorias solubles usando un principio sencillo para la generación de mezclas equimolares de péptidos que fue descrito por primera vez por Furka et al., (1988, Xth International Symposium of Medicinal Biochemistry, Budapest, 1988; Furka et al., 1988, 14th International Congress of Biochemistry, Praga 1988; y Furka et al., 1991, Int. J. Peptide Protein Res., 37:487). Se ha descrito la construcción de quimiotecas solubles para cribado iterativo (Houghten et al., 1991, Nature, 354:84). Lam et al., describen la nueva e inesperadamente potente técnica usando quimiotecas combinatorias aleatorias insolubles. Lam sintetizó quimiotecas combinatorias aleatorias sobre soportes en fase sólida, de modo que cada soporte tenía un compuesto de ensayo de estructura molecular uniforme y se cribaron las quimiotecas sin la retirada previa de los compuestos de ensayo del soporte mediante protocolos de unión en fase sólida (Lam et al., 1991, Nature, 354:82).

Se pueden usar quimiotecas especiales llamadas "archivos de diversidad" para evaluar la especificidad, fiabilidad y/o reproducibilidad de los nuevos métodos. Los archivos de diversidad contienen un gran número de compuestos (por ejemplo, 1000 o más moléculas pequeñas) representativos de muchas clases de compuestos que potencialmente podrían dar como resultado la detección no específica en un ensayo. Los archivos de diversidad están comercialmente disponibles y/o se pueden ensamblar a partir de sustancias individuales que están disponibles comercialmente.

La presente invención proporciona el cribado de quimiotecas de sustancias candidatas. Dichas quimiotecas pueden ser expuestas a una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) con o sin FMRP y se puede(n) llevar a cabo el(los) ensayo(s) pertinente(s) descrito(s) en detalle más adelante. Estas quimiotecas pueden usarse en el(los) ensayo(s) in vitro, in cyto y/o in vivo descritos con detalle más adelante.

Proteínas y péptidos inhibidores de PAK

Los inhibidores de PAK pueden comprender proteínas y/o péptidos. Los péptidos pueden ser proteínas que tienen menos de alrededor de 100 aminoácidos. Los péptidos pueden tener una longitud que varía desde alrededor de 5 a alrededor de 100, desde alrededor de 5 a alrededor de 50, desde alrededor de 5 a alrededor de 40, desde alrededor de 5 a alrededor de 35, desde alrededor de 5 a alrededor de 30, desde alrededor de 5 a alrededor de 25, o desde alrededor de 20 a alrededor de 25 aminoácidos. Una secuencia peptídica puede estar basada en la secuencia de una proteína. Una secuencia peptídica puede ser una disposición aleatoria de aminoácidos. Se pueden utilizar péptidos de paneles de péptidos que comprenden secuencias aleatorias y/o secuencias que han sido variadas sistemáticamente para proporcionar un panel de péptidos de máxima diversidad.

Los inhibidores peptídicos de las proteína-quinasas, como la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK) y/o CAM quinasa, son bien conocidos en la técnica (Kemp et al., 1991, Methods in Enzymology, 201:287; Saitoh et al., 1987,

J. Biol. Chem., 262:7796; Nakanishi et al., 1992, J. Biol. Chem., 267:2157; y Strauss et al., 1992, Am. J. Physiol, 262:C1437). Muchas proteínas quinasas se autorregulan a través de autoinhibición intermolecular (por ejemplo, Johnson et al, 1996, Cell, 85:149; y Kemp et al., 1994, Trends in Biochem. Sci., 19:440), en los que la inhibición se logra a través de la interacción de las secuencias de aminoácidos dentro de la quinasa que actúan como seudosustratos que bloquean el dominio catalítico de la quinasa. La quinasa permanece bloqueada hasta que uno unos residuos de Ser, Thr y/o Tyr específico(s) situado(s) en el seudosustrato es fosforilado (autofosforilación) y/o hasta que la interacción con un efector elimina la unión del seudosustrato. En el caso de PAK, la autofosforilación se produce después de la unión de Cdc42/Rac1 y los cambios de la conformación subsiguientes debidos a esta interacción. Las regiones alrededor de estos sitios de fosforilación son dominios reguladores que se unen en el sitio de unión al sustrato y la autofosforilación abre completamente el sitio catalítico. Por lo tanto, los moduladores peptídicos de PAK pueden comprender péptidos que tienen al menos una secuencia de aminoácidos correspondiente a al menos uno de estos dominios reguladores, pero con el residuo fosforilable reemplazado por otro aminoácido que no es fosforilable, de tal manera que el péptido actúa como un seudosustrato con "extremo muerto" y modula la actividad de PAK. Los aminoácidos utilizados para reemplazar los residuos fosforilables pueden ser Asp, Glu y/o Ala. Puesto que PAK no puede fosforilar dichos péptidos, éstos actúan como inhibidores competitivos.

Las sustancias candidatas pueden comprender proteínas FMRP y/o sus porciones características. En consecuencia, cuando se aplican a las células a altas concentraciones, es decir, en exceso de la cantidad de FMRP endógena, los péptidos de FMRP pueden actuar como competidores y se unen a PAK endógena, inhibiendo de ese modo la unión y/o la fosforilación de FMRP endógena. El experto en la técnica sabe cuánta cantidad de un péptido inhibidor competitivo debe añadir de modo que el péptido se añada "en exceso" a las células y/o lisados celulares.

Los péptidos moduladores de PAK se sintetizan en base a sustratos de PAK, bien exógenos (por ejemplo, quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK); cadena ligera reguladora de miosina (R-MLC); cadena pesada de la miosina I; cadena pesada de la miosina II; miosina VI; caldesmón; desmina; Op18/estatmina; merlina; filamina A; LIM-quinasa (LIMK); Ras; Raf; Mek; p47phox; BAD; caspasa 3; receptores de estrógenos y/o progesterona; RhoGEF; GEF-H1; NET1; Gaz; fosfoglicerato-mutasa-B; RhoGDI; prolactina; p41Arc; y/o Aurora-A, y/o intramoleculares (por ejemplo, sitios de autofosforilación y/o autoinhibición). En ciertas realizaciones, los péptidos moduladores de PAK comprenden péptidos que compiten con las parejas de unión naturales de PAK (por ejemplo, FMRP, Cdc42 y/o Rac1) para la unión a la proteína PAK. En algunas realizaciones, un péptido que comprende la secuencia Pro-Pro-Val-Ile-Ala-Pro-Arg-Pro-Glu-His-Thr-Lys-Ser-Val-Tyr-Thr-Arg-Ser (es decir, el resto que interacciona con PIX rico en Pro de PAK) interrumpe la interacción PIX-PAK y reduce la autofosforilación de PAK (Maruta et al., 2002, Methods Mol. Biol., 189:75). Los péptidos moduladores de PAK pueden ser análogos no fosforilables y/o seudosustratos de sustratos de PAK.

Las proteínas inhibidoras de PAK comprenden compuestos miméticos de péptidos. Como se usa en la presente memoria, el término "compuestos miméticos de péptidos" se refiere a estructuras que sustituyen a los péptidos en las interacciones con parejas de unión naturales, receptores y/o enzimas. El compuesto mimético de péptido puede poseer afinidad, eficacia y/o función de sustrato. Un compuesto mimético de péptido puede actuar como un péptido particular, sin restricción de estructura. Los compuestos miméticos de péptidos pueden incluir residuos de aminoácidos y/u otros restos químicos que proporcionen las características funcionales deseadas. Los compuestos miméticos de péptidos incluyen análogos de restos estructurales, tales como el sitio de autofosforilación de PAK, el sitio de unión al (a los) sustrato(s) de PAK, el o los sitios de unión de parejas de unión naturales a PAK y/o el sitio de unión a FMRP de PAK.

Las proteínas inhibidoras de PAK pueden comprender una proteína FMRP, incluyendo los mutantes descritos en la presente memoria, un compuesto mimético de péptido, una sustancia que se une a una proteína FMRP y/o una de sus porciones características. Un inhibidor de PAK puede comprender una proteína PAK, incluyendo los mutantes descritos en la presente memoria, un compuesto mimético de péptido y/o un agente que se une a una proteína PAK. Dichos agentes se pueden identificar mediante, por ejemplo, ensayos de unión directa, tales como ensayos con dos híbridos, ensayos desplegables con glutatión-S-transferasa (GST), etc., descritos en detalle más adelante.

Las proteínas moduladoras de PAK de la invención (o sus porciones características) pueden ser producidas, por ejemplo, mediante la utilización de un sistema de célula hospedante modificado por ingeniería genética para expresar un ácido nucleico que codifica un modulador de PAK de la invención.

Se puede utilizar cualquier sistema para producir inhibidores de la proteína PAK (y/o sus porciones características), tales como huevos, baculovirus, células de plantas, células de hongos (por ejemplo, células de levadura), células de insectos (por ejemplo, células SFM, células Sf21, células Sf9, células de Schneider, células S2, etc.), células de aves (por ejemplo, fibroblastos de embrión de pollo, etc.), células de mamíferos (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), células HeLa, células de riñón canino Madin-Darby (MDCK), células de riñón de cría de hámster (células BHK), células NSO, células MCF-7, células MDA-MB-438, células U87, células A172, células HL60, células A549, células SP10, células DOX, células DG44, células HEK 293, SHSY5Y, células Jurkat, células BCP-1, células COS, células Vero (riñón de mono verde africano), células GH3, células 9L, células 3T3, células MC3T3, células C3H-10T1/2, células NIH-3T3, células C6/36, etc.) y/o células híbridas. Alternativa o adicionalmente, los inhibidores de la proteína PAK (y/o sus porciones características) se pueden expresar en células utilizando técnicas recombinantes, tales como por el uso de un vector de expresión (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Las proteínas inhibidoras de PAK (y/o sus porciones características) se pueden producir en el contexto de virus intactos ya sean de tipo natural, atenuados de otro modo, muertos, etc. Las proteínas inhibidoras de PAK (y/o sus porciones características) se pueden producir en el contexto de partículas similares a virus. Por ejemplo, el virus puede ser cultivado en huevos, como huevos de gallina embrionados, en cuyo caso el producto de la cosecha es típicamente fluido alantoideo. Alternativa o adicionalmente, el virus puede proceder de cualquier método que use cultivo de tejidos para cultivar el virus. Sustratos celulares adecuados para el crecimiento de virus incluyen, por ejemplo, células de riñón canino, tales como MDCK y/o células de un clon de MDCK, células similares a MDCK, células de riñón de mono, tales como células AGMK incluyendo células Vero, células epiteliales cultivadas como líneas celulares continuas, células 293T, células BK-21, células CV-1 y/o cualquier otro tipo celular adecuado para la producción de virus (por ejemplo, células disponibles en ATCC, Rockville, MD). Los sustratos celulares adecuados para el cultivo de virus incluyen células humanas, tales como células MRC-5. Los sustratos celulares adecuados no se limitan a líneas de células, por ejemplo se incluyen células primarias, tales como fibroblastos de embrión de pollo.

Alternativa o adicionalmente, las proteínas inhibidoras de PAK de acuerdo con la presente invención pueden ser preparadas fácilmente por técnicas estándares bien establecidas, tales como la síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS) como se describe por Stewart et al., (Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd ed., Pierce Chemical Company, Rockford, IL, 1984) y como se describe por Bodanszky et al., (The Practice of Peptide Synthesis, Springer-Verlag, New York, NY, 1984).

Se apreciará, por supuesto, que as proteínas inhibidoras de PAK pueden incorporar residuos de aminoácidos que estén modificados sin afectar a la actividad. Por ejemplo, los extremos pueden ser derivatizados para incluir grupos de bloqueo, es decir, sustituyentes químicos adecuados para proteger y/o estabilizar los N- y/o C-terminales de una "degradación indeseable", una expresión que abarca cualquier tipo de descomposición química, enzimática y/o bioquímica de la proteína en sus extremos, que probablemente afecta a la función de la proteína, es decir, degradación secuencial del compuesto en uno de sus extremos terminales.

Los grupos de bloqueo incluyen grupos protectores utilizados convencionalmente en la técnica de la química de proteínas que no afectarán negativamente a las actividades in vivo de la proteína. Por ejemplo, los grupos de bloqueo del N-terminal adecuados se pueden introducir por alquilación y/o acilación del N-terminal. Ejemplos de grupos bloqueantes de N-terminal incluyen grupos alquilo C1-C5 ramificados y/o no ramificados, grupos acilo, tales como formilo, y/o grupos acetilo, así como sus formas sustituidas, tales como el grupo acetamidometilo (Acm). Análogos desaminados de aminoácidos son grupos de bloqueo del N-terminal útiles que pueden estar acoplados al N-terminal de la proteína y/o usarse en lugar del residuo N-terminal. Los grupos de bloqueo del C-terminal adecuados, en lo que el grupo carboxilo del C-terminal puede o no puede ser incorporado, incluyen ésteres, cetonas y/o amidas. Los grupos alquilo formadores de ésteres y/o cetonas (por ejemplo, grupos alquilo inferior, tales como metilo, etilo y/o propilo) y/o grupos amino formadores de amidas (por ejemplo, aminas primarias (-NH2) y/o grupos mono- y/o di-alquilamino (por ejemplo, metilamino, etilamino, dimetilamino, dietilamino, metiletilamino, etc.) son ejemplos de grupos de bloqueo del C-terminal. Los análogos de aminoácidos descarboxilados, tales como agmatina son grupos de bloqueo del C-terminal útiles y pueden ser acoplados a cualquier residuo C-terminal de la proteína y/o usarse en lugar de ella. Además, se apreciará que los grupos amino y/o carboxilo libres en los extremos pueden ser retirados por completo de la proteína para producir sus formas desaminadas y/o descarboxiladas sin afectar negativamente a la actividad de la proteína.

Se pueden incorporar otras modificaciones sin afectar negativamente a la actividad, las cuales incluyen, aunque sin limitación: la sustitución de uno o más de los aminoácidos en la forma L-isómera natural por los aminoácidos en la forma D-isómera. Así, una proteína puede incluir uno o más residuos D-aminoácido(s) y/o puede comprender aminoácidos que estén todos en la forma D. Se contemplan las formas retroinversas de proteínas de acuerdo con la presente invención, por ejemplo, proteínas invertidas en las que todos los aminoácidos están sustituidos por formas de D-aminoácidos.

Para asegurarse de que una proteína obtenida por técnicas sintéticas químicas y/o biológicas es la proteína deseada, se debe llevar a cabo el análisis de la proteína. Dicho análisis de composición de aminoácidos se puede realizar usando espectrometría de masas de alta resolución para determinar el peso molecular de la proteína. Alternativa o adicionalmente, el contenido de aminoácidos de la proteína puede ser confirmado por hidrólisis de la proteína en ácido acuoso y separación, identificación y/o cuantificación de los componentes de la mezcla mediante HPLC y/o un analizador de aminoácidos. Se pueden utilizar secuenciadores de proteínas, que degradan secuencialmente la proteína e identifican los aminoácidos en su orden para determinar definitivamente la secuencia de la proteína. Antes de su uso, la proteína se purifica generalmente para eliminar los contaminantes. A este respecto, se apreciará que la proteína se purifica frecuentemente con el fin de cumplir las normas establecidas por las agencias reguladoras apropiadas. Se puede emplear uno cualquiera de diversos procedimientos de purificación convencionales para lograr el nivel requerido de pureza incluyendo, por ejemplo, cromatografía de líquidos a alta presión en fase inversa (HPLC) usando una columna de sílice alquilada, tal como C4-, C8- y/o C18-sílice. Se utiliza generalmente una fase móvil en gradiente de contenido orgánico creciente para conseguir la purificación, por ejemplo, acetonitrilo en un tampón acuoso, que generalmente contiene una pequeña cantidad de ácido trifluoroacético. Se puede usar la cromatografía de intercambio iónico para separar las proteínas basándose en su carga.

Están descritas sales de adición de ácido de los péptidos. Así, es adecuada para uso en la invención una proteína tratada con un ácido inorgánico (por ejemplo, clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico, etc.) y/o un ácido orgánico (por ejemplo, acético, propiónico, glicólico, pirúvico, oxálico, málico, malónico, succínico, maleico, fumárico, tartárico, cítrico, benzoico, cinámico, mandélico, metanosulfónico, etanosulfónico, p-toluenosulfónico, salicílico, etc.) para proporcionar una sal soluble en agua de la proteína.

Están incluidas las variantes de la secuencia de las proteínas inhibidoras de PAK. Las variantes pueden diferir de las proteínas de origen natural por diferencias conservadoras en la secuencia de aminoácidos y/o por modificaciones que no afecten a la secuencia. Por ejemplo, se pueden hacer cambios conservadores de aminoácidos, que aunque alteren la secuencia primaria de una proteína, normalmente no alteren su función. En algunas realizaciones, se pueden realizar, sin ningún efecto adverso sobre la función de las proteínas, alrededor de 1 a alrededor de 2, alrededor de 3, alrededor de 4, alrededor de 5, alrededor de 10, o más de alrededor de 10 cambios conservadores de aminoácidos. En algunas realizaciones, las variantes de las proteínas moduladoras de PAK son aproximadamente 60% idénticas, aproximadamente 70% idénticas, aproximadamente 80%, idénticas, aproximadamente 90% idénticas, aproximadamente 95%, o más de aproximadamente 95% idénticas a una proteína moduladora dada de PAK .

Las modificaciones que no alteran normalmente la secuencia primaria de aminoácidos incluyen derivatización química de polipéptidos in vivo y/o in vitro, por ejemplo, acetilación y/o carboxilación. Se contemplan modificaciones de glicosilación, por ejemplo, las realizadas por modificación de los patrones de glicosilación de un polipéptido durante su síntesis, procesamiento y/o en etapas de procesamiento adicionales, por ejemplo, exponiendo el polipéptido a enzimas que efectúan la glicosilación (por ejemplo, enzimas glicosilantes y/o desglicosilantes de mamíferos). Se contemplan secuencias que tienen residuos de aminoácidos fosforilados (por ejemplo, fosfotirosina, fosfoserina y/o fosfotreonina). En algunas realizaciones, las modificaciones útiles incluyen, por ejemplo, acetilación, amidación, lipidación, fosforilación, glicosilación, acilación, farnesilación, sulfatación terminales, etc.

Se contemplan proteínas y/o sus porciones características que se han modificado utilizando técnicas ordinarias de biología molecular con el fin de mejorar su resistencia a la degradación proteolítica y/o para optimizar las propiedades de solubilidad y/o para hacerlas más adecuadas como agentes terapéuticos. Los homólogos de tales proteínas incluyen los residuos que contienen L-aminoácidos distintos de los de origen natural, por ejemplo, Daminoácidos y/o aminoácidos sintéticos de origen no natural. Las proteínas de la invención no se limitan a productos de cualquiera de los procesos específicos ilustrativos enumerados en la presente memoria.

La proteína sustancialmente pura obtenida como se describe en la presente memoria se puede purificar siguiendo procedimientos conocidos para purificación de proteínas, en donde se utiliza un ensayo inmunológico, enzimático y/o de otro tipo para monitorizar la purificación en cada etapa del procedimiento. Los métodos de purificación de proteínas son bien conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en el trabajo de Deutscher et al., (ed., Guide to protein purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego, CA, 1990).

En algunas realizaciones, los inhibidores de PAK comprenden anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos monoclonales y/o policlonales, anticuerpos de una sola cadena, anticuerpos quiméricos y/o anticuerpos injertados en CDR) que se unen a PAK (es decir, un anticuerpo anti-PAK), un modulador de PAK, una pareja de unión natural de PAK (por ejemplo, FMRP) y/o un elemento aguas arriba y/o aguas abajo de PAK para inhibir y/o activar una interacción entre PAK y/o un modulador de PAK, una pareja de unión natural, un elemento aguas arriba y/o un elemento aguas abajo.

Los anticuerpos generados de acuerdo con la presente invención pueden incluir, aunque sin limitación: anticuerpos policlonales, monoclonales quiméricos (es decir, "humanizados") y/o de una sola cadena (por ejemplo, recombinantes). Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir anticuerpos con una reducción de las funciones efectoras y/o moléculas biespecíficas. Los anticuerpos de la presente invención pueden incluir fragmentos Fab y/o fragmentos producidos por una quimioteca de expresión de Fab. En la producción de anticuerpos, el cribado del anticuerpo deseado puede realizarse por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, ELISA (ensayo con inmunosorbente ligado a enzimas).

Los anticuerpos dirigidos contra las proteínas pueden ser generados usando métodos que son bien conocidos en la técnica. La patente de EE.UU. 5.436.157 describe métodos para la producción de anticuerpos para péptidos. Para la producción de anticuerpos, pueden ser inmunizados por inyección con un polipéptido o uno de sus fragmentos peptídicos diversos animales hospedantes, incluyendo aunque sin limitación: conejos, ratones, ratas, ovejas, cabras, pollos, huevos de pollo y cobayas. Para aumentar la respuesta inmunológica, se pueden utilizar varios adyuvantes dependientes de la especie hospedante, incluyendo aunque sin limitación: adyuvantes en emulsión de aceite y en emulsionante (por ejemplo, adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, MF59 [Novartis], SAF, etc.), adyuvantes de tipo gel (por ejemplo, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, fosfato de calcio, etc.), adyuvantes microbianos (por ejemplo, secuencias de DNA inmunomoduladoras que incluyen restos CpG; endotoxinas, tales como monofosforil-lípido A; exotoxinas, tales como la toxina del cólera, la toxina lábil al calor de E. coli y la toxina pertussis; muramil-dipéptido, BCG [bacilo de Calmette-Guerin], Corynebacterium, etc.), adyuvantes en forma de partículas (por ejemplo, liposomas, microesferas biodegradables, saponinas, etc.), adyuvantes sintéticos (por ejemplo, copolímeros de bloques no iónicos, análogos de muramil-péptidos, polifosfazenos, polinucleótidos sintéticos, etc.), polímeros (por ejemplo, los polifosfazenos descritos en la patente de EE.UU. 5.500.161, polioles Pluronics; polianiones; etc.), QS21, escualeno, tetraclorodecaóxido, lisolecitina, péptidos, hemocianinas de la lapa bocallave, dinitrofenol, etc. y/o sus combinaciones.

La generación de anticuerpos policlonales se lleva a cabo inoculando al animal deseado el antígeno y/o aislando los anticuerpos que se unen específicamente a dicho antígeno.

Para la preparación de anticuerpos monoclonales se puede utilizar cualquier técnica que proporcione la producción de moléculas de anticuerpo por líneas celulares continuas en cultivo. Por ejemplo, se pueden emplear para producir anticuerpos monoclonales la técnica del hibridoma (Kohler et al., 1975, Nature, 256:495), la técnica de trioma, la técnica del hibridoma de linfocitos B (Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:72) y/o la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al., 1985, en Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc.). En algunas realizaciones, se producen anticuerpos monoclonales en animales libres de gérmenes utilizando la tecnología descrita en la Publicación del PCT WO 90/13678.

Un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal obtenido usando los procedimientos descritos en este documento puede ser clonado y/o secuenciado usando la tecnología que está disponible en la técnica (véase, por ejemplo, Wright et al., 1992, Critical Rev. Immunol., 12:125 y las referencias citadas en dicho documento).

El término "anticuerpo" se refiere a cualquier inmunoglobulina, ya sea natural o producida total o parcialmente de modo sintético, y a sus derivados y porciones características. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. Un anticuerpo puede ser un miembro de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD e IgE.

Como se usa en este documento, un fragmento de anticuerpo (es decir, una porción característica de un anticuerpo) se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga menos longitud que el anticuerpo completo. En general, un fragmento de anticuerpo retiene al menos una porción significativa de la capacidad de unión específica del anticuerpo de longitud completa. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, aunque sin limitación: Fab, Fab', F(ab')2, scFv, Fv, diacuerpo dsFv y fragmentos Fd.

Un fragmento de anticuerpo puede ser producido por cualquier medio. Por ejemplo, un fragmento de anticuerpo puede ser producido enzimáticamente o químicamente por la fragmentación de un anticuerpo intacto y/o puede ser producido de forma recombinante a partir de un gen que codifica la secuencia parcial del anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede ser total o parcialmente producido de modo sintético. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un fragmento de anticuerpo de una sola cadena. Alternativa o adicionalmente, un fragmento de anticuerpo puede comprender múltiples cadenas que están unidas entre sí, por ejemplo, por enlaces disulfuro. Un fragmento de anticuerpo puede comprender opcionalmente un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional comprenderá típicamente al menos alrededor de 50 aminoácidos y más típicamente comprenderá al menos alrededor de 200 aminoácidos.

Los anticuerpos pueden incluir anticuerpos quiméricos (por ejemplo, "humanizados") y de una sola cadena (recombinantes). Los anticuerpos pueden tener reducidas las funciones efectoras y/o las moléculas biespecíficas. Los anticuerpos pueden incluir fragmentos producidos por una quimioteca de expresión de Fab.

Los Fv de una sola cadena (scFv) son fragmentos de anticuerpos recombinantes que consisten en sólo la cadena ligera variable (VL) y la cadena pesada variable (VH) covalentemente unidas entre sí por un polipéptido enlazador. Cualquiera de VL o VH puede comprender el dominio NH2-terminal. El polipéptido enlazador puede ser de longitud y composición variables, siempre que los dos dominios variables estén unidos por puentes sin interferencia estérica significativa. Típicamente, los enlazadores comprenden principalmente tramos de residuos de glicina y serina con algún residuos de ácido glutámico o lisina intercalados para solubilidad.

Los diacuerpos son scFv dímeros. Los diacuerpos tienen típicamente enlazadores peptídicos más cortos que la mayoría de los scFv y frecuentemente muestran una preferencia para asociarse como dímeros.

Un fragmento Fv es un fragmento de anticuerpo que consta de un dominio VH y un dominio VL unidos por interacciones no covalentes. El término "dsFv" como se utiliza en la presente memoria se refiere a un Fv con un enlace disulfuro intermolecular obtenido por ingeniería genética para estabilizar la pareja VH-VL.

Un fragmento F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido a partir de inmunoglobulinas por digestión con una enzima pepsina a pH 4,0-4,5. El fragmento puede ser producido de forma recombinante.

Un fragmento Fab' es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por reducción del puente disulfuro o puentes que unen las dos piezas de la cadena pesada en el fragmento F(ab')2. El fragmento Fab' puede ser producido de forma recombinante.

Un fragmento Fab es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por digestión de inmunoglobulinas con una enzima (por ejemplo, papaína). El fragmento Fab puede producirse de manera recombinante. El segmento de la cadena pesada del fragmento Fab es la pieza Fd.

Un anticuerpo y/o una de sus porciones características producidos en un sujeto no humano pueden ser reconocidos en diversos grados como extraños cuando el anticuerpo se administra a un sujeto humano y puede ser generada en el sujeto una respuesta inmunitaria contra el anticuerpo. Una propuesta para minimizar y/o eliminar este problema es producir derivados de anticuerpos quiméricos y/o humanizados, es decir, moléculas de anticuerpos que comprendan porciones que se deriven de anticuerpos no humanos y/o porciones que se deriven de anticuerpos humanos. Las moléculas de anticuerpos quiméricos pueden incluir, por ejemplo, la región variable de un anticuerpo de un ratón, rata y/o de otras especies, con regiones constantes humanas. Se ha descrito una variedad de propuestas para la fabricación de anticuerpos quiméricos (Morrison et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 81:6851; Takeda et al., 1985, Nature, 314:452; Patentes de EE.UU. 4.816.397 y 4.816.567; las publicaciones europeas EP 0173494 y EP 171496 y la patente del Reino Unido GB 2177096B). Los anticuerpos humanizados pueden tener sólo los dominios hipervariables de la región variable de origen no humano y tener otras partes de la región variable del anticuerpo, especialmente las regiones del armazón conservadas del dominio de unión al antígeno, de origen humano. Tales anticuerpos humanizados pueden ser preparados por cualquiera de varios métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, Teng et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 80:7308; Kozbor et al., 1983, Immunology Today, 4:727; y Olsson et al., 1982, Meth. Enzymol, 92:3) y pueden ser preparados de acuerdo con las enseñanzas de las publicación del PCT WO 92/06193 y/o la publicación europea EP 0239400. Los anticuerpos humanizados se pueden producir comercialmente, por ejemplo, por Scotgen Limited (Twickenham, Gran Bretaña); Antitope (Cambridge, Reino Unido); Fusion Antibodies (Irlanda del Norte) y Genentech (South San Francisco, CA).

Las técnicas descritas para la producción de anticuerpos de una sola cadena, por ejemplo, recombinantes (patente de EE.UU. 4.946.778) se pueden adaptar para producir anticuerpos de una sola cadena específicos de proteínas. Las técnicas descritas para la construcción de quimiotecas de expresión de Fab (por ejemplo, Huse et al., 1989, Science, 246:1275) se pueden utilizar para permitir la identificación rápida y/o fácil de fragmentos Fab monoclonales que poseen una especificidad deseada.

Los fragmentos de anticuerpos que contienen el idiotipo de la molécula de anticuerpo pueden generarse por técnicas conocidas. Por ejemplo, dichos fragmentos incluyen aunque sin limitación: un fragmento F(ab')2 que puede ser producido por la digestión con pepsina de la molécula de anticuerpo; los fragmentos Fab' que pueden generarse reduciendo los puentes disulfuro del fragmento F(ab')2; los fragmentos Fab que pueden generarse tratando la molécula de anticuerpo con papaína y/o un agente reductor; y/o los fragmentos Fv.

Para generar una quimioteca de anticuerpos de fagos se obtiene por primera vez una genoteca de cDNA a partir de mRNA que se aísla de las células (por ejemplo, hibridomas) que expresan una proteína deseada (por ejemplo, un anticuerpo deseado) para ser expresada en la superficie del fago. Las copias de cDNA del mRNA se producen usando transcriptasa inversa. El cDNA que especifica los fragmentos de inmunoglobulina se obtiene por PCR y el DNA resultante se clona en un vector bacteriófago adecuado para generar una genoteca de DNA del bacteriófago que comprende DNA que especifica los genes de inmunoglobulina. Los procedimientos para obtener una genoteca de bacteriófagos que comprende DNA heterólogo se conocen bien en la técnica y se describen en el texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Se puede diseñar un bacteriófago que codifique un anticuerpo deseado de modo que el anticuerpo se presente en su superficie de tal manera que esté disponible para la unión a su proteína de unión correspondiente (por ejemplo, el antígeno contra el que se dirige el anticuerpo). Así, cuando el bacteriófago que expresa un anticuerpo específico se incuba en presencia de una célula que expresa el antígeno correspondiente, el bacteriófago se unirá a la célula. El bacteriófago que no expresa el anticuerpo no se unirá a la célula. Tales métodos de ronda de cribados son bien conocidos en la técnica.

Los procesos tales como los descritos anteriormente, se han desarrollado para la producción de anticuerpos humanos utilizando la presentación en el bacteriófago M13 (Burton et al., 1994, Adv. Immunol., 57:191). Esencialmente, se genera una genoteca de cDNA a partir de mRNA obtenido de una población de células productoras de anticuerpos. El mRNA codifica genes de inmunoglobulina transpuestos y, por tanto, el cDNA que los codifica. El cDNA amplificado se clonó en vectores de expresión de M13 creando una fagoteca que expresan fragmentos Fab humanos en su superficie. Los fagos que exhiben el anticuerpo de interés se seleccionan por la unión al antígeno y se propagan en bacterias para producir Fab de inmunoglobulina humana soluble. Así, en contraste con la síntesis convencional de anticuerpos monoclonales, este procedimiento inmortaliza el DNA que codifica inmunoglobulina humana en lugar de las células que expresan inmunoglobulina humana.

Los procedimientos que se acaban de presentar describen la generación de fagos que codifican la porción Fab de una molécula de anticuerpo. Sin embargo, la invención no debe interpretarse como limitada solamente a la generación de fagos que codifican Fab de anticuerpos. Más bien, los fagos que codifican anticuerpos de una sola cadena (fagotecas de anticuerpos scFv/fago) están incluidos en la invención. Las moléculas Fab comprenden la totalidad de la cadena ligera de Ig, es decir, comprenden la región variable y la región constante de la cadena ligera, pero incluyen sólo la región variable y/o el dominio de la primera región constante de la cadena pesada. Las moléculas de anticuerpo de una sola cadena comprenden una sola cadena de proteína que comprende el fragmento Fv de Ig. Un fragmento Fv de Ig incluye sólo las regiones variables de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo, no conteniendo la región constante. Las fagotecas que comprenden DNA de scFv se pueden generar siguiendo los procedimientos descritos en el trabajo de Marks et al. (1991, J. Mol. Biol., 222:581). La ronda de cribados de fagos así generados para el aislamiento de un anticuerpo deseado se lleva a cabo de una manera similar a la descrita para las fagotecas que comprenden DNA de Fab.

Se incluyen fagotecas sintéticas de presentación de modo que se puedan sintetizar regiones de cadena pesada y ligera variables de manera que incluyan casi todas las especificidades posibles (Barbas, 1995, Nature Med., 1:837; y de Kruifet et al., 1995, J. Mol. Biol., 248:97.

Las preparaciones de anticuerpos para uso terapéutico, pueden ser incapaces de fijar el complemento y/o inducir otras funciones efectoras. La fijación del complemento puede ser impedida por la deleción de la porción Fc del anticuerpo, utilizando un isotipo de anticuerpo que no sea capaz de fijar el complemento y/o mediante el uso de un anticuerpo fijador del complemento en combinación con un fármaco que inhiba la fijación del complemento. Alternativa o adicionalmente, los residuos de aminoácidos dentro de la región Fc que están implicados en la activación del complemento (véanse, por ejemplo, Tan et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:162; y Duncan et al., 1988, Nature, 332:738) pueden ser mutados para reducir y/o eliminar la capacidad de activación del complemento de un anticuerpo intacto. Del mismo modo, los residuos de aminoácidos dentro de la región Fc que están implicados en la unión de la región Fc a los receptores de Fc (véanse, por ejemplo, Canfield et al., 1991, J. Exp. Med., 173:1483; y Lund et al., 1991, J. Immunol., 147:2657) pueden ser mutados para reducir y/o eliminar la unión al receptor de Fc si se va a utilizar un anticuerpo intacto.

Los anticuerpos pueden ser fragmentados utilizando técnicas convencionales y los fragmentos cribados para determinar la utilidad de la misma manera que para los anticuerpos completos. Por ejemplo, pueden ser generados fragmentos F(ab')2 por tratamiento del anticuerpo con pepsina. El fragmento F(ab')2 puede ser tratado para reducir los puentes disulfuro para producir fragmentos Fab'.

Ácidos nucleicos inhibidores de PAK

Ácidos nucleicos inhibidores de PAK útiles en la presente invención incluyen, aunque sin limitación: agentes inductores de RNAi, por ejemplo, los pequeños RNA de interferencia ("siRNA"), los RNA de horquilla corta ("shRNA"), etc.; los DNA y/o RNA antisentido; ribozimas; DNA para terapia génica; fragmentos virales, incluyendo el DNA y/o RNA viral; DNA y/o RNA quiméricos; mRNA; plásmidos; cósmidos; DNA genómico; cDNA; fragmentos de genes; diversas formas estructurales de DNA incluyendo DNA monocatenario, DNA bicatenario, DNA superenrollado y/o DNA de triple hélice; Z-DNA; etc.

La presente invención incluye ácidos nucleicos que codifican proteínas inhibidoras de PAK y/o sus porciones características. En algunas realizaciones, la invención proporciona ácidos nucleicos que son complementarios a los ácidos nucleicos que codifican proteínas moduladoras de PAK y/o sus porciones características.

En algunas realizaciones, los inhibidores de PAK comprenden ácidos nucleicos, incluyendo aunque sin limitación: agentes inductores de RNAi específicos de PAK, ácidos nucleicos antisentido y/o ribozimas.

La invención incluye ácidos nucleicos que se hibridan con ácidos nucleicos que codifican PAK y/o inhibidores de PAK y/o sus porciones características. Dichos ácidos nucleicos pueden utilizarse, por ejemplo, como cebadores y/o como sondas. Para dar sólo unos pocos ejemplos, dichos ácidos nucleicos pueden ser utilizados como cebadores en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como sondas para la hibridación (incluyendo hibridación in situ) y/o como cebadores para la transcripción inversa-PCR (RT-PCR).

La interferencia de RNA (RNAi) es un proceso conservado evolutivamente en el que la presencia de al menos una molécula de RNA parcialmente bicatenaria en una célula eucariota conduce a la inhibición específica de secuencia de la expresión génica. El RNAi se describió originalmente como un fenómeno en el que la introducción de dsRNA largo (típicamente cientos de nucleótidos) en una célula da como resultado la degradación del mRNA que contiene una región complementaria a una cadena del dsRNA (Patente de EE.UU. 6.506.559; y Fire et al., 1998, Nature, 391:806). Estudios posteriores en D. melanogaster mostraron que los dsRNA largos son procesados por una enzima similar a la RNasa III intracelular llamada Dicer en dsRNA más pequeños compuestos principalmente de dos cadenas de aproximadamente 21 nucleótidos (nt) que forman un dúplex de 19 pares de bases con salientes de 2 nucleótidos en el extremo 3' y grupos 5'-fosfato y 3'-hidroxilo (véanse, por ejemplo, la publicación del PCT WO 01/75164; las publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. 2002/0086356 y 2003/0108923; Zamore et al., 2000, Cell, 101:25; y Elbashir et al., 2001, Genes Dev., 15:188).

Los dsRNA cortos que tienen estructuras tales como esta, denominados siRNA, silencian la expresión de genes que incluyen una región que es sustancialmente complementaria a una de las dos cadenas. Esta cadena se conoce como la cadena "antisentido" o "guía", denominándose la otra cadena frecuentemente cadena con "sentido". El siRNA se incorpora en un complejo de ribonucleoproteína denominado complejo silenciador inducido por RNA (abreviadamente RISC) que contiene miembro(s) de la familia de las proteínas Argonauta. Tras la asociación del siRNA con el RISC, una actividad helicasa desenrolla la doble hélice, lo que permite un dúplex alternativo para formar la cadena guía y un mRNA diana que contiene una porción sustancialmente complementaria a la cadena guía. Una actividad endonucleasa asociada con la(s) proteína(s) Argonauta presente(s) en RISC es responsable de "cortar" el mRNA diana, que luego es más degradado por la maquinaria celular.

Se lograron considerables progresos en la aplicación práctica de RNAi con el descubrimiento de que la introducción exógena de los siRNA en células de mamíferos puede reducir eficazmente la expresión de genes diana de una manera específica de secuencia mediante el mecanismo descrito anteriormente. Una estructura típica de siRNA incluye aproximadamente una porción bicatenaria de 19 nucleótidos, que comprende una cadena guía y una cadena con sentido. Cada cadena tiene un saliente de 2 nucleótidos en el extremo 3'. Típicamente, la cadena guía del siRNA es perfectamente complementaria a su gen diana y al mRNA transcrito sobre al menos 17 a 19 nucleótidos contiguos y típicamente las dos cadenas del siRNA son perfectamente complementarias entre sí en la porción dúplex. Sin embargo, como apreciará un experto en la técnica, no se requiere la perfecta complementariedad. En su lugar, frecuentemente se tolera uno o más desapareamientos en el dúplex formado por la cadena guía y el mRNA diana, particularmente en ciertas posiciones, sin reducir la actividad de silenciamiento por debajo de los niveles útiles. Por ejemplo, puede haber 1, 2, 3 o incluso más desapareamientos entre el mRNA diana y la cadena guía (sin tener en cuenta los salientes). Así, como se usa en este documento, dos porciones de ácido nucleico, tal como una cadena guía (sin tener en cuenta los salientes) y una porción de un mRNA diana que son "sustancialmente complementarias" pueden ser perfectamente complementarias (es decir, se hibridan entre sí para formar un dúplex en el que cada nucleótido es un miembro de un par de bases complementarias) o pueden tener un menor grado de complementariedad suficiente para que ocurra la hibridación. Un experto en la técnica apreciará que las dos cadenas del dúplex de siRNA no necesitan ser perfectamente complementarias. En algunas realizaciones, al menos 80%, al menos 90%, o más de los nucleótidos de la cadena guía de un siRNA eficaz son complementarios al mRNA diana a través de al menos alrededor de 19 nucleótidos contiguos. El efecto de los desapareamientos en silenciar la eficacia y los lugares en los que los desapareamientos pueden ser tolerados más fácilmente son campos de estudio activo (véase, por ejemplo, Reynolds et al., 2004, Nat. Biotechnol., 22:326).

Se apreciará que las moléculas que tienen la estructura y el grado de complementariedad adecuados de un gen diana exhibirán una gama de diferentes eficiencias de silenciamiento. Se han desarrollado una variedad de criterios de diseño adicionales para ayudar en la selección de secuencias eficaces de siRNA. Se encuentran disponibles numerosos programas informáticos que pueden ser utilizados para elegir las secuencias de siRNA que se predicen para ser particularmente eficaces en silenciar un gen diana de elección (véanse, por ejemplo Yuan et al., 2004, Nucl. Acids. Res., 32:W130; y Santoyo et al., 2005, Bioinformatics, 21:1376).

Como apreciará un experto en la técnica, el RNAi puede ser eficazmente mediado por moléculas de RNA que tengan una variedad de estructuras que difieran en uno o más aspectos de los descritos anteriormente. Por ejemplo, la longitud de los dúplex se puede variar (por ejemplo, desde alrededor de 17-29 nucleótidos); los salientes no necesitan estar presentes y, si están presentes, puede variar su longitud y la identidad de los nucleótidos (aunque comúnmente se emplean la mayoría de los salientes simétricos dTdT en los siRNA sintéticos).

Otras estructuras, conocidas como RNA de horquilla corta (shRNA), son capaces de mediar la interferencia de RNA. Un shRNA es una sola cadena de RNA que contiene dos regiones complementarias que se hibridan entre sí para formar una doble cadena de "tallo", estando conectadas las dos regiones complementarias por un bucle de una sola cadena. Los shRNA son procesados intracelularmente por la enzima Dicer para formar una estructura de siRNA que incluya una cadena guía y una cadena con sentido. Aunque los shRNA pueden ser suministrados de forma exógena a las células, más típicamente se logra la síntesis intracelular de los shRNA mediante la introducción de un plásmido

o un vector que contenga un promotor unido operativamente a un molde para la transcripción del shRNA en la célula, por ejemplo, para crear una línea celular estable o un organismo transgénico.

Aunque la escisión específica de secuencia de mRNA diana es actualmente el método más ampliamente utilizado para lograr el silenciamiento de genes por el suministro exógeno de entidades inductoras de RNAi a las células, se conocen otros mecanismos de silenciamiento específico de secuencia mediados por entidades cortas de RNA. Por ejemplo, puede producirse el silenciamiento de genes después de la transcripción mediado por entidades inductoras de RNAi por mecanismos que implican la represión de la traducción. Ciertas moléculas de RNA expresadas endógenamente forman estructuras de horquilla que contienen una porción dúplex imperfecta en la que el dúplex está interrumpido por uno o más desapareamientos y/o bultos. Estas estructuras de horquilla se procesan para producir intracelularmente especies de RNA monocatenario denominado microRNA (miRNA), que median la represión de la traducción de un transcrito diana al que se hibridan con una complementariedad menor de la perfecta. Las moléculas similares a siRNA diseñadas para imitar la estructura de los precursores de miRNA han demostrado que dan como resultado la represión de la traducción de los genes diana cuando se administran a células de mamíferos.

Por tanto, el mecanismo exacto por el cual una entidad inductora de RNAi inhibe la expresión de genes parece depender, al menos en parte, de la estructura de la porción dúplex de la entidad inductora del RNAi y/o de la estructura del híbrido formado por una cadena de la entidad inductora del RNAi y han sido ampliamente revisados los mecanismos del RNAi transcrito diana y la estructura de diversas moléculas de RNA que se sabe median el RNAi, por ejemplo, siRNA, shRNA, miRNA y sus precursores (véanse, por ejemplo, Dykxhhorn et al., 2003, Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 4:457; Hannon et al., 2004, Nature, 431:3761; y Meister et al., 2004, Nature, 431:343). Es de esperar que los futuros desarrollos revelen mecanismos adicionales por los que se pueda conseguir el RNAi y revelen otras entidades inductoras del RNAi corto. Cualesquiera entidades inductoras del RNAi conocidas actualmente o que se descubran posteriormente están dentro del alcance de la presente invención.

Se puede diseñar una entidad inductora de RNAi que se administre de acuerdo con los métodos de la invención y/o esté presente en una composición de la invención para silenciar cualquier gen eucariota. El gen puede ser un gen de mamífero, por ejemplo, un gen humano. El gen puede ser un gen de tipo natural, un gen mutante, un alelo de un gen polimórfico, etc. En ciertas realizaciones, un modulador de PAK es una entidad inductora de RNAi que dirige la expresión de PAK. Las siguientes secuencias se pueden utilizar para diseñar entidades inductoras de RNAi que dirigen la expresión de PAK de acuerdo con las directrices que se describen en este documento: números de acceso al GenBank U24152, U24153, AF068864, AJ011855, AB040812, AF276893 y/o ácidos nucleicos que codifican las proteínas de número de acceso al GenBank AAA65441, AAA65442, AAC36097, NP_005875, CAA09820, CAC18720, BAA94194, NP_064553, AAF82800, Q9P286, BAA11844, AAC47094, AAB95646. Las entidades inductoras de RNAi se pueden utilizar para inducir la supresión específica de isoformas de la expresión de PAK. Las entidades inductoras de RNAi pueden ser utilizadas para inducir la supresión de todas las isoformas de PAK.

Un ácido nucleico inhibidor de PAK puede comprender una molécula antisentido que se una a un sitio de iniciación de la traducción, un sitio de iniciación de la transcripción y/o una junta de empalme. Las propuestas antisentido implican el diseño de oligonucleótidos (por ejemplo, DNA y/o RNA) que son complementarios al mRNA de PAK. Los oligonucleótidos antisentido se unen típicamente al mRNA de PAK y/o evitan la traducción. Alternativa o adicionalmente, un oligonucleótido antisentido puede unirse al DNA de un gen PAK, tal como, por ejemplo, un elemento regulador. Un oligonucleótido antisentido puede o no exhibir complementariedad absoluta. Como se usa en la presente memoria, una secuencia "complementaria" a una porción de un ácido nucleico se refiere a una secuencia que tenga suficiente complementariedad para ser capaz de hibridarse con el RNA y/o formar un dúplex estable. En el caso de ácidos nucleicos antisentido bicatenarios, puede por tanto ser analizada una sola cadena del DNA dúplex y/o valorada la formación de tríplex. La capacidad de hibridación dependerá del grado de complementariedad y/o de la longitud de los ácidos nucleicos antisentido. Generalmente, cuanto mayor sea el ácido nucleico que se hibrida, más desapareamientos de bases con un RNA puede contener y todavía formar un dúplex estable (o tríplex, según sea el caso). Un experto en la técnica puede determinar un grado tolerable de desapareamiento mediante el uso de métodos estándares para determinar el punto de fusión del complejo hibridado.

Los oligonucleótidos que son complementarios con el extremo 5' del mRNA de PAK (por ejemplo, la secuencia 5' no traducida hasta el codón de iniciación AUG e incluyéndolo) pueden inhibir la traducción. Los oligonucleótidos que son complementarios con las secuencias 3' no traducidas del mRNA de PAK pueden inhibir la traducción (Wagner, 1994, Nature, 372:333). Por lo tanto, los oligonucleótidos complementarios con las regiones no codificantes del extremo 5' y/o 3' no traducidos de un gen PAK pueden utilizarse en una propuesta antisentido para inhibir la traducción del mRNA endógeno dPAK. Los oligonucleótidos complementarios con la región 5 'no traducida del mRNA pueden incluir el complemento del codón de iniciación AUG. Los oligonucleótidos antisentido complementarios con las regiones codificantes del mRNA son generalmente inhibidores de la traducción menos eficientes pero pueden ser utilizados de acuerdo con la invención. Si se diseñan para hibridarse con cualquiera de las regiones antes mencionadas de un ácido nucleico dPAK o un ácido nucleico antisentido descritos en este documento comprenden al menos alrededor de 6 nucleótidos y pueden comprender alrededor de 6 a alrededor de 50 nucleótidos. Un ácido nucleico antisentido puede comprender al menos alrededor de 10 nucleótidos, al menos alrededor de 17 nucleótidos, al menos alrededor de 25 nucleótidos o al menos alrededor de 50 nucleótidos.

Las moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente transcritos de mRNA de PAK pueden ser usadas para prevenir la traducción del mRNA de PAK y/o la expresión de PAK (véanse, por ejemplo, la publicación del PCT WO 90/11364; y Sarver et al., 1990, Science, 247:1222). Las ribozimas descritas en la presente memoria pueden escindir mRNA en secuencias de reconocimiento específicas de sitios con el fin de destruir los mRNA de PAK. Alternativamente, las ribozimas pueden comprender ribozimas en forma de cabeza de martillo, que escinden los mRNA en ubicaciones dictadas por regiones flanqueantes que forman pares de bases complementarias con el mRNA diana. Cuando se emplean ribozimas en forma de cabeza de martillo, el mRNA diana puede tener la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y/o la producción de ribozimas en forma de cabeza de martillo es bien conocida en la técnica y se describen más detalladamente en el trabajo de Haseloff et al. (1988, Nature, 334:585). Hay numerosos sitios de escisión de ribozimas potenciales en forma de cabeza de martillo dentro de la secuencia de nucleótidos del cDNA de PAK humano. Una ribozima se modifica por ingeniería genética de modo que el sitio de reconocimiento de escisión esté situado cerca del extremo 5' del mRNA de PAK, es decir, para aumentar la eficiencia y/o minimizar la acumulación intracelular de transcritos de mRNA no funcionales.

Las ribozimas pueden comprender endo-ribonucleasas de RNA (en lo sucesivo "ribozimas de tipo Cech"), como la que se produce naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como la IVS y/o L-19 IVS RNA) y que ha sido extensamente descrita por Thomas Cech y colaboradores (Zaug et al., 1984, Science, 224:574; Zaug et al., 1986, Science, 231:470; Zaug et al., 1986, Nature, 324:429; publicación del PCT WO 88/04300; y Been et al., 1986, Cell, 47:207). Las ribozimas de tipo Cech tienen un sitio activo de ocho pares de bases que se hibrida con una secuencia de RAN diana tras lo cual tiene lugar la escisión del RNA diana.

Alternativa o adicionalmente, la expresión endógena del gen PAK se puede disminuir dirigiendo secuencias de desoxirribonucleótidos complementarias a la región reguladora del gen PAK (es decir, promotor de PAK, potenciadores, etc.) para formar estructuras de triple hélice que impidan la transcripción del gen PAK (véanse, en general, Helene, 1991, Anticancer Drug Des., 6:569; Helene et al., 1992, Ann, NY Acad. Sci, 660:27; y Maher, 1992, Bioassays, 14:807).

Las moléculas de ácido nucleico que han de ser utilizadas en la formación de triple hélice para la inhibición de la transcripción pueden ser monocatenarias y/o compuestas de desoxirribonucleótidos. La composición de bases de estos oligonucleótidos puede promover la formación de triple hélice a través de las reglas de emparejamiento de bases de Hoogsteen, que generalmente requieren que estén presentes tramos considerables de purinas o pirimidinas en una cadena de un dúplex. Las secuencias de nucleótidos pueden ser de bases pirimidínicas, que darán como resultado tripletes TAT y/o CGC a lo largo de las tres cadenas asociadas de la triple hélice resultante. Las moléculas ricas en bases pirimidínicas proporcionan complementariedad de bases con una región monocatenaria rica en bases purínicas de una sola cadena del dúplex en una orientación paralela a esa cadena. En algunas realizaciones, pueden elegirse moléculas de ácido nucleico que sean ricas en bases purínicas, por ejemplo, que contengan un tramo de residuos de G. Estas moléculas forman típicamente una triple hélice con un dúplex de DNA que es rico en pares GC, en el que se encuentran la mayoría de los residuos de bases purínicas en una sola cadena de los dúplex diana, dando como resultado tripletes CGC a lo largo de las tres cadenas del tríplex.

Alternativa o adicionalmente, se pueden aumentar las potenciales secuencias que pueden ser dirigidas a la formación de triple hélice mediante la creación de una denominada molécula "en forma de zigzag" de ácido nucleico. Las moléculas en forma de zig-zag se sintetizan en un manera alternante 5'- 3', 3'- 5', de tal modo que aparean las bases primero con una cadena de un dúplex y luego con la otra, eliminando la necesidad de que esté presente un tramo considerable de bases de purina o pirimidina en una cadena de un dúplex.

Como se analizó anteriormente, los ácidos nucleicos inhibidores de PAK pueden dirigirse directamente a PAK. Sin embargo, se entenderá que los ácidos nucleicos inhibidores de PAK pueden dirigirse directamente a PAK, pero en su lugar, podrían dirigirse a los efectores de PAK situados aguas abajo de PAK, a activadores de PAK situados aguas arriba y/o a parejas de unión naturales de PAK. Por ejemplo, un inhibidor de PAK puede ser una entidad inductora de RNAi que se dirige a uno o más de los siguientes: quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK); cadena ligera reguladora de miosina (R-MLC); cadena pesada de la miosina I; cadena pesada de la miosina II; miosina VI; caldesmón; desmina; Op18/estatmina; merlina; filamina A; LIM-quinasa (LIMK); Ras; Raf; Mek; p47phox; BAD; caspasa 3; receptores de estrógenos y/o progesterona; RhoGEF; GEF-H1; NET1; Gaz; fosfoglicerato-mutasa-B; RhoGDI; prolactina; p41Arc; Aurora-A (Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743; y Hofmann et al., 2004,

J. Cell Sci., 117:4343); CIB; esfingolípidos; G-proteína �y/o subunidades y; PIX/COOL; GIT/PKL; Nef; paxilina; NESH; proteínas que contienen SH3 (por ejemplo, Nick y/o Grb2); quinasas (por ejemplo, Akt, PDK1, PI3quinasa/p85, Cdk5, Cdc2, Src quinasas, Abl y/o la proteína quinasa A (PKA)); fosfatasas (por ejemplo, fosfatasa PP2A, POPX1 y/o POPX2); PDK1, PDK2, PI3K y/o los NMDAR.

Los ácidos nucleicos inhibidores de PAK pueden dirigirse a FMRP. Un inhibidor de PAK puede ser una entidad inductora de RNAi que dirige la expresión de FMR1. Se pueden utilizar las siguientes secuencias para diseñar entidades inductoras de RNAi que dirigen la expresión de FMR1 de conformidad con las directrices descritas en la presente memoria: números de acceso al GenBank AF305881, L29074, U25165, U31501 y/o ácidos nucleicos que codifican las proteínas de números de acceso al GenBank AAG22045, AAB18829, AAC50155 y AAC50292.

Un inhibidor de PAK puede ser una entidad inductora de RNAi, oligonucleótido antisentido, ribozima y/o agente inductor de triple hélice que se dirige a uno o más genes que se ha demostrado que regulan positivamente la expresión de PAK y/o FMRP. Por ejemplo, un inhibidor de PAK puede ser una entidad inductora de RNAi que se dirige a factores de transcripción, factores de traducción, factores de procesamiento del RNA, factores estabilizantes de proteínas, etc., que están implicados en la regulación positiva de PAK y/o la expresión de FMRP.

Un ácido nucleico candidato (por ejemplo, agente inductor de RNAi, oligonucleótido antisentido, ribozima y/o agente inductor de triple hélice) puede comprender un oligonucleótido a-anómero. Un oligonucleótido a-anómero forma híbridos bicatenarios específicos con RNA complementario en los que, al contrario de las habituales �-unidades, las cadenas corren paralelas entre sí (Gautier et al., 1987, Nuc. Acids Res., 15:6625.). El oligonucleótido es un 2'-Ometil-ribonucleótido (Inoue et al., 1987, Nuc. Acids Res., 15:6131) y/o un análogo quimérico RNA-DNA (Inoue et al., 1987, FEBS Lett, 215:327).

Se pueden realizar primeramente estudios in vitro para cuantificar la capacidad de un ácido nucleico candidato (por ejemplo, agente inductor de RNAi, oligonucleótido antisentido, ribozima y/o agente inductor de triple hélice) de inhibir la expresión del gen PAK. Estos estudios pueden utilizar controles que distingan entre la inhibición del gen debida al ácido nucleico candidato y los efectos biológicos no específicos de ácidos nucleicos. Estos estudios pueden comparar los niveles del RNA diana y/o de la proteína con los de un RNA y/o proteína de control interno. Los resultados obtenidos utilizando el ácido nucleico candidato pueden compararse con los obtenidos utilizando un ácido nucleico de control. Un ácido nucleico de control puede tener aproximadamente la misma longitud que el ácido nucleico candidato y/o la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico candidato difiere del ácido nucleico de control no más de lo necesario para evitar la hibridación específica a la secuencia diana.

Un ácido nucleico candidato (por ejemplo, agente inductor de RNAi, oligonucleótido antisentido, ribozima y/o agente inductor de triple hélice) se puede suministrar a las células que expresan PAK in vivo y/o in vitro. Se han desarrollado cierto número de métodos para suministrar ácidos nucleicos a las células. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser inyectados directamente en el sitio del tejido. Alternativa o adicionalmente, se pueden administrar sistémicamente los ácidos nucleicos, diseñados para dirigirse a las células deseadas (por ejemplo, enlazados a péptidos y/o anticuerpos que se unen específicamente a receptores y/o antígenos expresados sobre una superficie de la célula diana).

Puesto que puede ser difícil lograr concentraciones intracelulares de un ácido nucleico candidato (por ejemplo, un agente inductor de RNAi, oligonucleótido antisentido, ribozima y/o agente inductor de triple hélice) suficientes para inhibir la expresión del gene PAK, se puede utilizar una construcción de DNA recombinante en la que el ácido nucleico candidato se coloque bajo el control de un promotor fuerte de pol III y/o pol II. El uso de tal construcción para transfectar, por ejemplo, las células diana en un paciente, puede dar como resultado la transcripción de cantidades suficientes de RNA monocatenarios que formarán pares de bases complementarias con transcritos de PAK endógenos y por lo tanto impedir la traducción del mRNA de PAK. Por ejemplo, se puede introducir un vector in vivo, de tal modo que sea captado por una célula diana y/o dirija la transcripción de un ácido nucleico candidato. Dicho vector puede permanecer episomal y/o llegar a integrarse cromosómicamente, siempre que pueda transcribirse para producir el ácido nucleico candidato deseado. Dichos vectores pueden construirse por métodos estándares de tecnología de DNA recombinante conocidos en la técnica. Los vectores pueden ser plasmídicos, virales y/u otros conocidos en la técnica, que se utilizan para la replicación y/o expresión en células de mamífero. La expresión de la secuencia que codifica el ácido nucleico candidato puede ser por cualquier promotor conocido en la técnica para actuar en células neuronales de mamíferos (por ejemplo, seres humanos). Dichos promotores pueden ser inducibles y/o constitutivos. Tales promotores incluyen, aunque sin limitación: la región promotora temprana de SV40 (Bernoist et al., 1981, Nature, 290:304), el promotor contenido en la repetición terminal larga 31 del virus del sarcoma de Rous (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22:787), el promotor de timidina quinasa de herpes (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 78:1441), las secuencias promotoras y/o reguladoras del gen FMR1, etc. Cualquier tipo de vector plasmídico, cósmido, YAC y/o viral se puede usar para preparar la construcción de DNA recombinante que puede introducirse directamente en un sitio del tejido.

Un ácido nucleico inhibidor de PAK puede comprender DNA, RNA, sus mezclas quiméricas, derivados, porciones características y/o versiones modificadas. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser monocatenarios y/o bicatenarios. Un ácido nucleico puede ser modificado en un resto de base, un resto de azúcar y/o la cadena principal de fosfato, por ejemplo, para mejorar la estabilidad de la molécula, la hibridación, etc. Un ácido nucleico puede incluir otros grupos adjuntos, tales como agentes que faciliten el transporte a través de la membrana celular (véanse, por ejemplo, Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 86:6553; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 84:648; y la publicación del PCT WO 88/09810).

Los ácidos nucleicos inhibidores de PAK de la presente invención (incluyendo los agentes inductores de RNAi, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, agentes inductores de triple hélice, etc.) se pueden preparar de acuerdo con cualquier técnica disponible incluyendo, aunque sin limitación: síntesis química, síntesis enzimática, escisión enzimática o química de un precursor más largo, etc. Los métodos de sintetizar los RNA son conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Gait, MI. (ed.) Oligonucleotide synthesis: a practical approach, Oxford [Oxfordshire], Washington, DC: IRL Press, 1984; y Herdewijn, P. (ed.) Oligonucleotide synthesis: Methods and Applications, Methods in Molecular Biology, v. 288 (Clifton, NJ.) Totowa, NJ.: Humana Press, 2005).

Los ácidos nucleicos inhibidores de PAK pueden comprender nucleósidos de origen natural, nucleósidos modificados, nucleósidos de origen natural con enlazadores hidrocarbonados (por ejemplo, un alquileno) o un enlazador de poliéter (por ejemplo, un PEG enlazador) insertados entre uno o más nucleósidos, nucleósidos con enlazadores hidrocarbonados o PEG insertados entre uno o más nucleósidos o una de sus combinaciones. Los nucleótidos o los nucleótidos modificados de un ácido nucleico pueden ser reemplazados por un enlazador hidrocarbonado o un enlazador de poliéter siempre que la afinidad de unión, la selectividad y/o otras características funcionales del ácido nucleico no sean sustancialmente reducidas por la sustitución.

Los expertos en la técnica apreciarán que los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender nucleótidos enteramente de los tipos que se encuentran en los ácidos nucleicos de origen natural, o en su lugar pueden incluir uno o más análogos de nucleótidos o tener una estructura que de otro modo difiere de la de un ácido nucleico natural. Las patentes de EE.UU. 6.403.779; 6.399.754; 6.225.460; 6.127.533; 6.031.086; 6.005.087; 5.977.089 y las referencias contenidas en las mismas, describen una amplia variedad de análogos de nucleótidos específicos y modificaciones que se pueden utilizar. Véanse Crooke, S. (ed.) Antisense Drugs Technology Principles, Strategies and Applications (1st ed.), Marcel Dekker; ISBN: 0824705661; 1st edition (2001) y las referencias contenidas en dicho texto. Por ejemplo, las modificaciones en 2' incluyen grupos halo, alcoxi y aliloxi. En algunas realizaciones, el grupo 2'-OH se sustituye por un grupo seleccionado de H, OR, R, halo, SH, SR1, NH2, NHR, NR2 o CN, en donde R es alquilo, alquenilo o alquinilo C1-C6 y halo es F, Cl, Br o I. Los ejemplos de enlaces modificados incluyen enlaces de fosforotioato y 5'-N-fosforamidita.

Los ácidos nucleicos que comprenden una variedad de diferentes análogos de nucleótidos, cadenas principales modificadas, enlaces internucleosídicos de origen no natural pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden incluir nucleósidos naturales (es decir, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiguanosina y desoxicitidina) o nucleósidos modificados. Ejemplos de nucleótidos modificados incluyen nucleósidos modificados en las bases (por ejemplo, aracitidina, inosina, isoguanosina, nebularina, pseudouridina, 2,6-diaminopurina, 2-aminopurina, 2tiotimidina, 3-desaza-5-azacitidina, 2'-desoxiuridina, 3-nitropirrol, 4-metilindol, 4-tiouridina, 4-tiotimidina, 2aminoadenosina, 2-tiotimidina, 2-tiouridina, 5-bromocitidina, 5-yodouridina, inosina, 6-azauridina, 6-cloropurina, 7desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-aza-adenosina, 8-azidoadenosina, bencimidazol, M1-metiladenosina, pirrolo-pirimidina, 2-amino-6-cloropurina, 3-metil-adenosina, 5-propinilcitidina, 5-propiniluridina, 5-bromouridina, 5fluorouridina, 5-metilcitidina, 7-desaza-adenosina, 7- desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8-oxoguanosina, O(6)metilguanina y 2-tiocitidina), bases química o biológicamente modificadas (por ejemplo, bases metiladas), azúcares modificados (por ejemplo, 2'-fluoro-ribosa, 2'-amino-ribosa, 2'-azido-ribosa, 2'-O-metil-ribosa, nucleósidos enantiómeros de L-arabinosa y hexosa), grupos fosfato modificados (por ejemplo, fosforotioatos y los enlaces de 5'N-fosforamidita) y sus combinaciones. Los monómeros de nucleótidos naturales y modificados por la síntesis química de ácidos nucleicos se encuentran fácilmente disponibles. En algunos casos, los ácidos nucleicos que comprenden tales modificaciones muestran propiedades mejoradas con respecto a los ácidos nucleicos que consisten solamente en nucleótidos de origen natural. En algunas realizaciones, las modificaciones de ácidos nucleicos descritas en este documento se utilizan para reducir y/o prevenir la digestión por nucleasas (por ejemplo, exonucleasas, endonucleasas, etc.). Por ejemplo, la estructura de un ácido nucleico puede ser estabilizada mediante la inclusión de análogos de nucleótidos en el extremo 3' de una o ambas cadenas para reducir la digestión.

Los ácidos nucleicos modificados no necesitan ser modificados de manera uniforme a lo largo de toda la longitud de la molécula. Pueden existir diferentes modificaciones de nucleótidos y/o estructuras de cadena principal en varias posiciones en el ácido nucleico. Un experto en la técnica apreciará que los análogos de nucleótidos u otra(s) modificación(es) pueden estar situadas en cualquier posición de un ácido nucleico, de tal modo que la función del ácido nucleico no se vea sustancialmente afectada. La región modificada puede estar en el extremo 5' y/o el extremo 3' de una o ambas cadenas. Por ejemplo, se han empleado ácidos nucleicos modificados en los que aproximadamente 1 a aproximadamente 5 residuos en el extremo 5' y/o 3' de cualquiera de las dos cadenas son análogos de nucleótidos y/o tienen una modificación de la cadena principal. La modificación puede ser una modificación 5' o 3' terminal. Una o ambas cadenas de ácido nucleico pueden comprender al menos 50% de nucleótidos no modificados, al menos 80% de nucleótidos no modificados, al menos 90% de nucleótidos no modificados o 100% de nucleótidos no modificados.

Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden, por ejemplo, comprender una modificación en un azúcar, nucleósido o enlace internucleosídico, tales como las descritas en las publicaciones de patentes de EE.UU. 2003/0175950, 2004/0192626, 2004/0092470, 2005/0020525 y 2005/0032733. La presente invención abarca el uso de cualquier ácido nucleico que tenga una o más de las modificaciones descritas en este documento. Por ejemplo, se han descrito un número de conjugados terminales, por ejemplo, lípidos tales como colesterol, ácido litocólico, ácido alúrico o cadenas largas de alquilo ramificados para mejorar la captación celular. Los análogos y modificaciones pueden ser analizados, por ejemplo, usando cualquier ensayo adecuado conocido en la técnica. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden comprender uno o más enlaces de nucleósidos no naturales. Uno o más nucleótidos internos en el extremo 3', el extremo 5', o ambos extremos 3' y 5', del ácido nucleico son invertidos para producir enlaces, tales como un enlace 3'-3' o un enlace 5'-5'.

Los ácidos nucleicos que comprenden enlaces internucleosídicos modificados pueden sintetizarse usando reactivos y/o métodos que son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, los métodos para la síntesis de ácidos nucleicos que contienen enlaces internucleosídicos de fosfonato, fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato metoxietilfosforamidato, formacetal, tioformacetal, diisopropilsililo, acetamidato, carbamato, sulfuro de dimetileno (-CH2-S-CH2), sulfóxido de dimetileno (-CH2-SO-CH2), dimetilen-sulfona (-CH2-SO2-CH2), 2'-O-alquil y/o 2'-desoxi-2'-fluorofosforotioato son bien conocidos en la técnica (Uhlmann et al., 1990, Chem. Rev., 90:543; Schneider et al., 1990, Tetrahedron Lett., 31:335, y las referencias citadas en dichos documentos).

Un ácido nucleico puede comprender enlaces fosfodiéster y/o enlaces modificados, tales como enlaces de fosfotriéster, fosforamidato, siloxano, carbonato, carboximetiléster, acetamidato, carbamato, tioéter, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforamidato puenteado, fosfonato de metileno puenteado, fosforotioato, metilfosfonato, fosforoditioato, fosforotioato puenteado y/o sulfona y/o combinaciones de dichos enlaces.

Además, se entenderá que, cuando un polipéptido heterólogo se ha de expresar en una célula hospedante, frecuentemente será deseable utilizar secuencias de ácido nucleico que codifiquen el polipéptido que se han ajustado para acomodarse a las preferencias de codones de la célula hospedante y/o enlazar las secuencias codificantes con elementos reguladores activos en la célula hospedante. Los ácidos nucleicos de la presente invención pueden ser elegidos para tener codones, que pueden o no pueden ser preferidos para un sistema de expresión particular. Por ejemplo, el ácido nucleico puede ser uno en el que al menos un codón, o en los que han sido alterados al menos 1%, al menos 5%, al menos 10% o al menos 20% de los codones, de tal manera que la secuencia esté optimizada para la expresión en la célula hospedante.

Las variantes de ácidos nucleicos pueden ser de origen natural, tales como variantes alélicas (mismo locus), homólogas (diferente locus) y/u ortólogas (diferente organismo) y/o pueden ser de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden obtenerse por técnicas de mutagénesis, incluyendo las aplicadas a polinucleótidos, células y/u organismos. Las variantes pueden contener sustituciones, deleciones, inversiones e inserciones de nucleótidos. La variación puede ocurrir en las regiones codificantes y/o en las regiones no codificantes. Las variaciones pueden producir sustituciones conservadoras y/o sustituciones no conservadoras de aminoácidos (en comparación con el producto codificado).

No se pretende que la presente invención esté limitada por la naturaleza del ácido nucleico empleado. Los ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención pueden no ser sintéticos y pueden ser entidades de origen natural que han sido aisladas de su medio ambiente natural. Un ácido nucleico puede ser un ácido nucleico de origen natural y/o de origen no natural (por ejemplo, sintetizado químicamente, artificial, manufacturado, etc.)

Los ácidos nucleicos pueden proceder y/u obtenerse de fuentes naturales (por ejemplo, fuentes virales, fúngicas, bacterianas, animales y/o vegetales). Alternativa o adicionalmente, los ácidos nucleicos de la presente invención se pueden preparar por cualquier medio convencional típicamente usado para preparar ácidos nucleicos en gran cantidad. Por ejemplo, los DNA y/o los RNA pueden sintetizarse químicamente usando reactivos y/o sintetizadores disponibles comercialmente por métodos que son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Gait, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford, Inglaterra, 1985). Los RNA se pueden producir con alto rendimiento por transcripción in vitro usando cualquiera de una variedad de plásmidos conocidos en la técnica que son adecuados para la transcripción in vitro, tal como pSP72 (Promega Corporation, Madison, WI), pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), etc.

Los ácidos nucleicos se pueden purificar mediante cualquier medio adecuado, como es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser purificados por HPLC de fase inversa y/o de intercambio iónico, cromatografía de exclusión por tamaño molecular y/o electroforesis en gel. Por supuesto, el experto en la técnica reconocerá que el método de purificación dependerá en parte del tamaño del ácido nucleico que ha de ser purificado.

Moléculas pequeñas inhibidoras de PAK

En algunas realizaciones, los inhibidores de PAK pueden comprender moléculas pequeñas. Por ejemplo, la solicitud de patente de EE.UU. 2004/007504 describe derivados heterobicíclicos del pirazol que inhiben PAK4 o PAK5 y pueden ser utilizados para tratar la enfermedad de Alzheimer. Los derivados heterobicíclicos de pirazol se pueden analizar para su uso en el tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

En algunas realizaciones, la emodina es una molécula pequeña que se puede utilizar en el tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico (véase, por ejemplo, el Ejemplo 12). La emodina (también conocida como 1,3,8-tri-hidroxi-6-metil-antra-quinona; 6-metil-1,3,8-tri-hidroxi-antra-quinona; Emodol y Frangula-emodina) es un miembro de una gran familia de antraquinonas de origen natural y un ingrediente activo en la medicina china de origen vegetal. La emodina inhibe la actividad de HER-2/neu tirosina quinasa (Zhang et al., 1999, Clin. Cancer Res., 5:343) y por lo tanto tiene efectos anticancerígeno sobre las células de cáncer de mama que sobre-expresan HER2/neu (Jayasuriya et al., 1992, J. Nat. Prod., 55:696). Más recientemente, se ha demostrado que la emodina 40 μM inhibe la migración de células de cáncer humano al interferir con la formación de un complejo Cdc42/Rac1 y PAK activo (Huang et al., 2005, Cell. Mol. Life Sci., 62:1167).

En algunas realizaciones, OSU-03012 (Figuras 6 y 7) es una molécula pequeña que se puede utilizar en el tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico (véase, por ejemplo, el Ejemplo 12). OSU-03012 (Zhu et al., 2004, Cancer Res., 64:4309, también conocido como 2-amino-N-{4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1Hpirazol-1-il]-fenil}acetamida) se deriva del celecoxib. El celecoxib, comercializado por Pfizer bajo la marca CELEBREX®, es un fármaco anti-inflamatorio no esteroide que actúa a través de la inhibición de la ciclooxigenasa-2 (COX-2). El celecoxib puede utilizarse para el tratamiento de muchos estados incluyendo, aunque sin limitación: osteoartritis, artritis reumatoide, analgesia, poliposis adenomatosa familiar y cáncer. A diferencia del celecoxib, su análogo OSU-03012 no es un inhibidor de la COX-2, sino que inhibe la proteína quinasa-1 dependiente de 3fosfoinositida (PDK-1) y PAK (Porchia et al., 2007, Mol. Pharmacol., 72:1124). OSU-03012 inhibe directamente la actividad quinasa de PAK. Aunque no se desea estar vinculado a ninguna teoría, la inhibición se produce probablemente a través de la inhibición competitiva de la unión con ATP, con un valor de la CI50 de alrededor de 500 nM - 1 μM (Brader and Eccles, 2004, Tumori., 90:2). OSU-03013 es otro derivado del celecoxib que es estructuralmente similar a OSU-03012. Aunque se ha demostrado que OSU-03013 inhibe la actividad de PAK, es tóxico in vivo y, por lo tanto, no es deseable para su uso como agente terapéutico (Brader and Eccles, 2004, Tumori., 90:2).

Actividades de los inhibidores de PAK

En algunas realizaciones, los inhibidores de PAK se dirigen directamente a PAK. En algunas realizaciones, los moduladores de PAK se dirigen indirectamente a PAK. Por ejemplo, los moduladores de PAK podrían dirigirse a los efectores aguas abajo de PAK, a los efectores aguas arriba de PAK y/o a las parejas de unión naturales de PAK.

PAK participa en múltiples vías de señalización

Se sabe que PAK participa en una variedad de vías de señalización. Para dar sólo un ejemplo, la Figura 8 (Klann y Dever, 2004, Nat. Rev. Neurosci., 5:931) muestra cómo PAK encaja dentro del contexto de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) y las vías de señalización de fosfoinositida-3-quinasa (PI3K). PAK se encuentra aguas abajo de PDK1, PDK2 y PI3K. PAK se encuentra aguas arriba de Ras, Raf, MEK, ERK y Mnk.

Aunque no se muestra en la Figura 8, PAK se encuentra aguas arriba de la quinasa de cadena ligera de miosina (MLCK), cadena ligera reguladora de miosina (R-MLC), cadena pesada de la miosina I, cadena pesada de la miosina II, miosina VI, caldesmón, desmina, Op18/estatmina, merlina, filamina A, LIM-quinasa (LIMK), p47phox, BAD, caspasa 3, receptores de estrógenos y/o progesterona, RhoGEF, GEF-H1, NET1, Gaz, fosfoglicerato-mutasa-B, RhoGDI, prolactina, p41Arc y/o Aurora-A (Bokoch et al., 2003, Annu. Rev. Biochem., 72:743 y Hofmann et al., 2004,

J. Cell Sci., 117:4343). Los siguientes factores se unen a PAK en las células y puede estar aguas abajo de PAK; CIB; esfingolípidos; G-proteína � y/o subunidades y; PIX/COOL; GIT/PKL; Nef; paxilina; NESH; proteínas que contienen SH3 (por ejemplo, Nck y/o Grb2); quinasas (por ejemplo, Akt, PDK1, PI3-quinasa/p85, Cdk5, Cdc2, Src quinasas, Abl y/o la proteína quinasa A (PKA)); y/o fosfatasas (por ejemplo, fosfatasa PP2A, POPX1 y/o POPX2). Cualquiera de estos factores puede ser diana de los moduladores de PAK.

La presente invención comprende el reconocimiento de que los moduladores de PAK pueden modular indirectamente la actividad de ERK. Por ejemplo, teniendo en cuenta que PAK actúa aguas arriba de ERK, la activación aberrante de PAK (Figura 9) podría causar la activación constitutiva de las quinasas de la vía de ERK. La sub-regulación de los reguladores negativos de la vía de ERK, tales como las proteínas activadas por mitógenos (MAP) quinasas fosfatasas (MKP) y las proteínas Sprouty, también darían lugar a la activación constitutiva de la ERK (véase, por ejemplo, Kohno y Pouyssegur, 2006, Annals Med., 38:200).

Como se indica anteriormente, ratones FMR1 KO muestran un aumento de la fosforilación basal de ERK (y presumiblemente de la actividad) (Hou et al., 2006, Neuron, 51:41), mientras que ERK es fosforilada y activada por PAK al menos en células no neuronales (Eblen et al. 2002, Mol Cell Biol, 22:6023). La ERK está implicada en la regulación de la morfología espinal, la plasticidad sináptica y la conducta (Selcher et al., 2001, Learn Mem, 8:11; y Kelleher et al., 2004, Cell, 116:467), por lo tanto, es posible que la inhibición de PAK vuelva a los niveles de fosfo-ERK en ratones FMR1 KO de tipo natural, con lo que se invierten los fenotipos en ratones FMR1 KO.

Como se muestra en la Figura 9, la cascada de señalización de ERK, partiendo de Ras y en dirección aguas abajo, comprende Ras, Raf, MEK y ERK. PAK ha demostrado fosforilar y activar tanto MEK-1 (Frost et al., 1997, EMBO J., 16:6426) como Raf-1 (King et al, 1998, Nature, 396:80; y Chaudhary et al., 2000, Curr. Biol., 10:551).

Por lo tanto, la presente invención abarca el reconocimiento de que la inhibición de cualquier miembro de la vía de señalización de ERK (por ejemplo, ERK, MEK, Ras, Raf) puede ser útil para el tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. En un caso de la presente descripción, un tratamiento del FXS y/o otros trastornos del desarrollo neurológico comprende administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un inhibidor de la vía de ERK (o una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de la vía ERK) a un paciente propenso, que padece y/o que presenta uno o más síntomas del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. La descripción general de los moduladores de PAK se puede aplicar también a los inhibidores de la vía de ERK. Para dar un solo ejemplo, los inhibidores de la vía de ERK pueden ser proteínas, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas, glicoproteínas, proteoglicanos, lípidos y/o carbohidratos, tal como se describe en la presente memoria.

La actividad de señalización de Ras depende de su asociación con la cara interna de la membrana plasmática y esta asociación depende de una modificación posterior a la traducción que sitúa a un grupo farnesilo en un residuo de cisteína cerca del C-terminal de Ras. Esta modificación es catalizada por la farnesil-transferasa (FTasa). En consecuencia, se han desarrollado inhibidores de la FTasa como compuestos anti-Ras. En un caso, los moduladores de la vía de ERK pueden ser inhibidores de la FTasa. Ejemplos de inhibidores de la FTasa incluyen, aunque sin limitación: FTI-276, FTI-2148, L-739,750 y BZA-2B (Sebti and Der, 2006, Nat. Rev. Cancer, 3:945; Zhu et al., 2003, Curr. Opin. Investig. Drugs, 4:1428); AZD-3409 (AstraZeneca; Lavelle, 1998, Exp. Opin. Invest. Drugs, 7:1015; Williams, 1998, Curr. Opin. Ther. Pat., 8:553; Singh adn Lingham, 2002, Curr. Opin. Drug Discov. Develop., 5:225; Wilson et al., 2004, Eur. J. Cancer. Suppl., 2: Abstract 354; Smethurst et al., 2004, Eur. J. Cancer Suppl., 2: Abstract 376; Kelly et al., 2005, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 46: Abstract 5962); Tipifarnib (R-115777, Zarnestra™; End et al., 2001, Cancer Res., 61:131; Cunningham et al., 2002, Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., 21: Abstract 502; Lancet et al., 2004, Blood, 104: Abstract 874; y Adjei et al., 2001, Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., 20: Abstract 320) y/o lonafarnib (Schering-Plough; Sch-66336, Sarasar™; Yang et al., 2005, Proc. Amer. Soc. Clin. Oncol., 24: Abstract 5565; Long et al., 2005, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 46: Abstract 5968; y Oh et al., 2005, Proc. Amer. Assoc. Cancer Res., 46: Abstract 5967).

Los moduladores de la vía de ERK pueden ser inhibidores antisentido de Raf (véanse, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071; y Sridhar et al., 2005, Mol. Cancer. Ther., 4:677, y las referencias contenidas en dichos documentos). Por ejemplo, Raf antisentido ISIS-5132 (ISIS Pharmaceuticals/Novartis) fue diseñado como un oligonucleótido de fosforotioato de 20 meros para inhibir la traducción del RNA mensajero de Raf1 a la proteína (Lau et al., 1998, Oncogene, 16:1899; Koller et al., 2000, Tr. Pharm. Sci., 21:142; Monia et al., 1996, Nature Med. 2:668; y Monia et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:15481). Para superar la degradación y mejorar el suministro intracelular de ISIS-5132, se encuentra en investigación una formulación liposomal (es decir, LErafAON).

Los moduladores de la vía de ERK incluyen la quinasa Raf (véase, por ejemplo, Sridhar et al., 2005, Mol. Cancer. Ther., 4:677 y las referencias citadas en dicho trabajo). Los oxindoles incluyen, aunque sin limitación: geldanamicina y MCP1.

Los moduladores de la vía de ERK incluyen moléculas pequeñas inhibidoras de MEK (véase, por ejemplo, Kohno and Pouyssegur, 2006, Annals Med., 38:200). Las moléculas pequeñas inhibidoras de MEK incluyen, aunque sin limitación: PD98059, U0126, PD184352 (CI-1040), PD0325901 y/o ARRY-14886

Los moduladores de la vía de ERK pueden ser ureas (véase, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo). Las ureas pueden ser derivatizadas de un modo que las haga adecuadas como moduladoras de la vía de ERK de conformidad con la presente invención. En un caso, las ureas pueden ser, por ejemplo, biaril-ureas, difenil-ureas, heteroaril-ureas, quinolinil-ureas, isoquinolinil-ureas, piridinil-ureas, etc. Las ureas ilustrativas que pueden ser utilizadas como moduladores de la vía de ERK incluyen, aunque sin limitación: 3-tienil-urea, isoxazol, pirazol y/o BAY 43-9006. La BAY 43-9006 (también conocida como sorafenib), una nueva biaril-urea, inhibe in vitro la actividad de quinasa Raf-1. La estructura cristalina del complejo Raf/BAY 43-9006 reveló que el inhibidor se une a la cavidad del trifosfato de adenosina (ATP) e interacciona con los residuos del bucle de activación de la quinasa de las proteínas Raf. Esta interacción evita la activación del bucle y que los residuos catalíticos adopten una conformación que es competente para unirse a sustratos y fosforilarlos (Wan et al., 2004, Cell, 116:855). Las ureas que pueden ser utilizadas como moduladores de la vía de ERK pueden ser derivados de urea (por ejemplo bencil-ureas, piridopirimidinonas, diaril-ureas sustituidas con heteroarilo, ureas anilladas, etc.).

Las ureas incluyen bioisósteros de urea (véase, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo). Los bioisósteros de urea incluyen, aunque sin limitación: compuestos en los que se han insertado restos de metileno y/o carbonilo en la funcionalidad urea; glicinamidas en las que ha sido introducido un resto metileno en la urea; oxamidas que tienen un segundo grupo carbonilo añadido a la urea; malonamidas que tienen tanto un carbonilo como un resto de metileno insertado en la funcionalidad urea; diacilhidrazinas; derivados de 2-amino-bencimidazol y/o pirrolcarboxamidas.

Los moduladores de la vía de ERK incluyen bis-aril-imidazoles y estructuras relacionadas (véanse, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo). En algunas realizaciones, los bis-aril-imidazoles incluyen, aunque sin limitación: SB-203580, L-779,450, SB-590885, piridil-naftilimidazoles y/o sus derivados.

Los moduladores de la vía de ERK incluyen benzamidas (véanse, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo). Las benzamidas incluyen, aunque sin limitación: ZM336372, imatinib, AMN-107 y/o sus derivados.

Los moduladores de la vía de ERK incluyen oxindoles (véanse, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo l). En algunas realizaciones, los oxindoles incluyen, aunque sin limitación: GW-5074.

Los moduladores de la vía de ERK incluyen PTK-787, tienopirimidinas, estireno (véanse, por ejemplo, Smith et al., 2006, Curr. Topics Med. Chem., 6:1071 y las referencias citadas en dicho trabajo incorporado en la presente memoria como referencia).

Alternativa o adicionalmente, PAK es activada por PDK vía de señalización de PI3K, y la señalización de PI3K está implicada en la síntesis de proteínas (Hou and Klann, 2004, J. Neurosci., 24:6352). Por lo tanto, la presente invención abarca el reconocimiento de que un modulador de PAK puede ser un inhibidor de la vía PI3K/PDK.

Actividades biológicas de los inhibidores de PAK

Las sustancias que se sabe que modulan la actividad de serina/treonina-quinasa pueden en consecuencia modular la actividad de la quinasa PAK, incluyendo aunque sin limitación: estaurosporina, PD098059, genisteína, tirfostina B42, HA1077, K252a, H-7: (1(5-isoquinolina-sulfonil)-2-metilpiperazina), CEP-1347, etc., incluyendo sus análogos, derivados y/o compuestos miméticos, que conservan la capacidad de modular la actividad de PAK.

La Tabla 1 está adaptada del trabajo de Kumar y la Tabla 2 del trabajo de Eswaren, citados en el párrafo siguiente.

Los inhibidores de PAK, tales como los descritos en el trabajo de Eswaren et al. (2007, Structure, 15:201) y Kumar et al., (2006, Nat. Rev. Cancer, 6:459) se utilizan para tratar el FXS y/ u otros trastornos del desarrollo neurológico. Véanse, por ejemplo, la Tabla 1 (adaptada de Eswaren et al.) y la Tabla 2 (adaptada de Kumar et al.):

Tabla 1. Moduladores de PAK ilustrativos

Desviación de la Tm (°C)

% de Actividad a 10 μM

Nombre del compuesto

Estructura química PAK4 PAK5 PAK6 PAK4 PAK5 PAK6

Inhibidor de Cdk1

7,0 ± 1,5 7,1 ± 0,3 7,0 ± 0,3 56 12 23

Inhibidor III de Cdk1/2

6,5 ± 0,2 5,6 ± 0,3 5,6 ± 0,8 62 7,0 18

Purvalanol A

5,0 ± 0,3 4,5 ± 0,2 5,4 ±0,5 20 24 48

K252a

4,5 ± 0,3 5,9 ± 0,3 8,6 ± 1,0 16 22 16

Estaurospurina

13,1 ± 1,5 12,5 ± 0,3 16,6 ± 0,5 0 0 0

SU 11652

6,4 ± 1,2 5,3 ±0,2 5,3 ±0,3 34 43 75

Tabla 2. Inhibidores de PAK1 ilustrativos

Inhibidor

Modo de acción Referencias

hPIP

Se une al dominio regulador y bloquea la actividad de quinasa Xia et al., 2001, Proc. Natl Acad. Sci., USA, 98:6174

merlina

Se une a PBD e incluye las adhesiones focales Kissil et al., 2003, Mol. Cell, 12:841

nischarina

Se une al dominio de quinasa e inhibe su actividad Alahari et al., 2004, EMBO J., 23:2777

P35/CDK5

Fosforila PAK e inhibe la actividad de quinasa Nikolic et al., 1998, Nature, 395:194; y Rashid et al., 2001, J. Biol. Chem., 276:49043

CDC2

Fosforila xPAK2 e inhibe la actividad de quinasa Cau et al, 2000, J. Biol. Chem., 275:2367

p 110C

Se une a la parte del dominio de quinasa e inhibe la actividad de quinasa Chen et al., 2003, J. Biol. Chem., 278:20029

POPX1, POPX2

Desfosforilación de T422 en el bucle de activación de quinasa Koh et al., 2002, Curr. Biol., 12:317

CRIPak

Se une al dominio regulador y bloquea la actividad de quinasa Talukder et al., 2006, Oncogene, 25:1311

Péptido de 89 -143 aa de PAK1

Inhibidor competitivo Zhao et al., 1998, Mol. Cell. Biol., 18:2153

CEP-1347

Molécula pequeña – antagonista de ATP Nheu et al., 2002, Cancer J., 8:328

GL-2003

Inhibidor de ERK que bloquea la activación de PAK Hirokawa et al., 2006, Cancer Lett.

CDC2, ciclo de división celular 2; CDK5, quinasa dependiente de ciclina 5; CRIPak, inhibidor de PAKI rico en cisteina; ERK, quinasa regulada por señales extracelulares; hPIP, proteína que interacciona con PAK/PLC humana 1; PBD, dominio de unión a p21

Los inhibidores de PAK pueden afectar a la capacidad de PAK para interaccionar con sus parejas de unión naturales, incluyendo aunque sin limitación FMRP. En ciertas realizaciones, dicha unión bloquea la interacción entre 5 PAK y sus parejas de unión naturales (por ejemplo, la interacción entre PAK y FMRP). En algunas realizaciones, dicha unión promueve la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales. Sin embargo, un inhibidor de PAK no tiene que unirse por necesidad directamente a un sitio catalítico y/o de unión y puede unirse, por ejemplo, a un sitio adyacente, tal como un sitio adyacente, en el polipéptido PAK. Un inhibidor de PAK puede incluso unirse a otra sustancia (por ejemplo, proteína, lípido, carbohidrato, etc., que forma un complejo con la enzima), siempre que su

10 unión module la actividad de PAK.

La presente invención incluye el descubrimiento de que la integridad de los dominios KH de FMRP facilita la interacción de FMRP con PAK. Los inhibidores de PAK pueden afectar la integridad de uno o más dominios KH de FMRP y modular su capacidad para unirse a PAK.

Un inhibidor de PAK se puede unir a una pareja de unión natural de PAK e inhibir y/o promover la interacción de

15 PAK con su pareja de unión natural. En otro aspecto, un inhibidor de PAK se une a PAK e inhibe y/o promueve la interacción de una pareja de unión natural de PAK con PAK. Algunos moduladores que regulan la función de PAK de esta manera han sido descritos en la técnica. Por ejemplo, la solicitud de Patente de EE.UU. 2004/0208880 describe compuestos que inhiben la función de PAK1 por modulación de su interacción con inhibidores de la cadena ligera de dineína 1/proteína de óxido nítrico sintasa (DLC1/PIN). La solicitud de Patente de EE.UU. 2006/0172360 describe

20 compuestos que inhiben PAK4 por modulación de su interacción con MKK7. La solicitud de Patente de EE.UU. 2004/0091907 describe compuestos que inhiben PAK4 por modulación de su interacción con GEF/H1 (usados para tratar el cáncer). La solicitud de Patente de EE.UU. 2002/0106690 describe inhibidores que actúan alterando la interacción entre PAK y la subunidad beta de los receptores acoplados a la proteína G. La solicitud de Patente de EE.UU. 2006/0088897 describe sustancias que modulan PAK alterando la interacción entre PAK y las proteínas que contienen el dominio SH3. Las patentas de EE.UU. 6.013.500 y 6.667.168 describen agentes que se unen al dominio de unión a GTP de PAK4 y evitan la unión de PAK4 a las proteínas de unión a GTP y agentes que se unen al dominio de unión a cdc42 de PAK4 y evitan la interacción de PAK4 con cdc42.

Un inhibidor de PAK puede unirse y/o competir por uno o más sitios en una molécula pertinente, por ejemplo, un sitio catalítico y/o un sitio de unión de PAK. El inhibidor de PAK puede interferir y/o inhibir la unión de FMRP a PAK. El inhibidor de PAK puede competir por una región de unión a FMRP de PAK. El inhibidor de PAK puede competir por una región de unión a PAK de FMRP.

Cuando se refiere a inhibidores de una enzima, tal como PAK, un inhibidor puede incluir un sustrato de quinasa PAK y/o su porción característica que sea capaz de unirse a PAK. Alternativa o adicionalmente, la totalidad del sustrato, o sus porciones, aislado de una fuente biológica (por ejemplo, purificado a partir de tejidos y/o células) y/u obtenido por síntesis química, puede ser utilizado para competir con el sustrato por los sitios de unión en la enzima. Alternativa o adicionalmente, se puede utilizar un anticuerpo capaz de unirse a PAK. Un inhibidor de PAK puede incluir un péptido u otra molécula pequeña que sea capaz de modular la interacción de unión.

Los inhibidores de PAK incluyen sustancias que se unen y/o bloquean el dominio de quinasa de PAK y/o el dominio de unión a p21 de PAK, y/o los sitios de autofosforilación de PAK. Los inhibidores de PAK pueden ser péptidos cortos que comprenden secuencias de PAK que tienen actividad negativa dominante (Kiosses et al., 2002, Circ. Res., 90:697). Estos péptidos pueden no bloquear la actividad quinasa de PAK per se, pero pueden desplazar PAK de sitios de acción dentro de la célula, lo que indirectamente puede inhibir la actividad de PAK.

Los inhibidores de PAK pueden actuar alterando la capacidad de PAK para fosforilar sus sustratos. Por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.383.734 describe agentes que inhiben la función de PAK mediante la inhibición de la capacidad de PAK para fosforilar Raf. Las patentes de EE.UU. 6.013.500 y 6.667.168 describen agentes que bloquean el dominio de unión a ATP de PAK4 con el fin de inhibir la función quinasa de PAK4.

Los inhibidores de PAK pueden actuar alterando la actividad y/o la expresión de los activadores de PAK. Por ejemplo, la patente de EE.UU. 6.046.224 describe agentes que inhiben la función de PAK mediante el bloqueo de los receptores 12(S)HETE. Los 12(S)HETE estimulan la actividad de PAK, de modo que el bloqueo de la función de 12(S)HETE inhibe indirectamente la función de PAK.

Los inhibidores de PAK de la invención pueden comprender fosfatasas que inhiben la función de PAK mediante la eliminación de grupos fosfato de las dianas que son fosforiladas por la quinasa PAK. Alternativa o adicionalmente, los inhibidores de PAK de la invención pueden comprender quinasas que activen indirectamente la función de PAK por fosforilación de las dianas que son fosforiladas por la quinasa PAK.

Los inhibidores de PAK pueden comprender el dominio autoinhibidor de PAK, que puede bloquear y/o reducir la actividad de PAK. La sustancia candidata puede ser una región autoinhibidora de la proteína PAK, tal como un péptido que comprende al menos 25, 50, 75, 100, 125 o 150 aminoácidos contiguos de PAK. La proteína puede incluir al menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200 o 300 de los aminoácidos del N-terminal de la proteína PAK. Los inhibidores de PAK pueden comprender una proteína PAK negativa dominante (por ejemplo, una porción mutante y/o característica de la proteína PAK).

Los inhibidores de PAK pueden actuar modulando la expresión, la estabilidad y/o los niveles celulares de PAK. Por ejemplo, las solicitudes de patentes de EE.UU. 2004/0102326 (PAK1), 2002/0142325 (PAK2), 2004/0009935 (PAK2) y 2005/0191672 (PAK4) describen inhibidores nucleotídicos de la expresión de PAK que dirigen la degradación del mRNA de PAK.

Alternativa o adicionalmente, los inhibidores de PAK de la invención afectan los niveles de PAK aumentando y/o disminuyendo la transcripción y/o traducción de PAK, de sustratos de PAK y/o de parejas de unión naturales de PAK. Los inhibidores de PAK pueden afectar a la semivida del RNA y/o de la proteína, por ejemplo, afectando directamente a la estabilidad del mRNA y/o de la proteína. Los inhibidores de PAK de la invención pueden hacer que el mRNA y/o la proteína sean más y/o menos accesibles y/o susceptibles a las nucleasas, proteasas y/o el proteosoma.

Los inhibidores de PAK de la invención pueden afectar al tratamiento de los mRNA que codifican PAK, los sustratos de PAK y/o las parejas de unión naturales de PAK. Por ejemplo, los moduladores de PAK pueden actuar sobre el nivel de empalme del pre-mRNA, la formación del extremo 5' (por ejemplo, protegiéndolo), el procesamiento del extremo 3' (por ejemplo, por escisión y/o poliadenilación), la exportación nuclear y/o la asociación con la maquinaria de traducción y/o los ribosomas en el citoplasma.

Los inhibidores de PAK de la invención pueden afectar al control de la traducción y/o a la modificación posterior a la traducción de PAK, de los sustratos de PAK y/o de las parejas de unión naturales de PAK. Por ejemplo, los inhibidores de PAK pueden actuar en el nivel de iniciación de la traducción, alargamiento, terminación y/o reciclamiento. En algunas realizaciones, los moduladores de PAK pueden actuar en la etapa de plegamiento de las proteínas en las estructuras secundaria, terciaria y/o cuaternaria. Alternativa o adicionalmente, los moduladores de PAK pueden actuar en el nivel de transporte intracelular (por ejemplo, transporte de ER (retículo endoplasmático) al aparato de Golgi, transporte interno en el aparato de Golgi, transporte del aparato de Golgi a la membrana plasmática y/o secreción de la célula). Los inhibidores de PAK pueden actuar en el nivel de modificación posterior a la traducción (por ejemplo, la escisión de secuencias de señal y/o la adición de entidades, tales como grupos metilo, fosfatos, restos de glicano, etc.)

Un inhibidor de PAK puede ser una molécula orgánica sintética purificada y/o no purificada y/o una molécula orgánica de origen natural.

Los inhibidores de PAK de la invención pueden hacer que el nivel de mRNA y/o proteína de PAK, una actividad de la proteína PAK, la semivida del mRNA y/o proteína de PAK, la unión de mRNA y/o proteína de PAK a sus parejas de unión naturales, y/o el nivel y/o la actividad de una sustancia que fosforila una quinasa PAK disminuyan al menos alrededor de 5%, al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95% o sustancialmente 100%.

Los inhibidores de PAK se pueden utilizar solos y/o en combinación con otras sustancias que afecten la actividad de PAK. Otros ejemplos de inhibidores de PAK serán evidentes para los expertos en la técnica.

Identificación y/o caracterización de inhibidores de PAK

La presente invención proporciona métodos para identificar inhibidores de PAK útiles para el tratamiento de trastornos del desarrollo neurológico. Los métodos de la invención criban nuevos inhibidores de PAK mediante la identificación de sustancias que mejoran y/o tratan los síntomas del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. En algunas realizaciones, los métodos de la invención identifican nuevos inhibidores de PAK mediante la identificación de sustancias que afectan la capacidad de PAK para interaccionar con sus parejas de unión naturales (por ejemplo, FMRP). En algunas realizaciones, los métodos de la invención identifican nuevos inhibidores de PAK mediante la identificación de sustancias que inhiben la actividad quinasa de PAK. En algunas realizaciones, los métodos de la invención identifican inhibidores de PAK mediante la identificación de sustancias que inhiben la expresión y/o los niveles de PAK.

Los métodos de la invención pueden identificar sustancias que se sabe que tienen una función particular, pero no se sabía previamente que actuaban como moduladores de PAK. Los métodos de la invención pueden identificar sustancias que se han identificado y/o sintetizado, pero a las que no se les ha atribuido ninguna función particular. Los métodos de la invención pueden identificar nuevas sustancias que nunca habían sido identificadas y/o sintetizadas antes.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "sustancia de ensayo" se refiere a: (1) una proteína PAK, un ácido nucleico que codifica PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; (2) una pareja de unión natural de PAK, un ácido nucleico que codifica una pareja de unión natural de PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; (3) una proteína FMRP, un ácido nucleico que codifica FMRP y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados; y/o (4) un sustrato de quinasa PAK, un ácido nucleico que codifica un sustrato de PAK y/o uno de sus homólogos, porciones, variantes, mutantes y/o derivados. En algunas realizaciones, una sustancia de ensayo es una proteína y/o una de sus porciones características que comprende una porción de unión a FMRP de PAK. En algunas realizaciones, una sustancia de ensayo es una proteína y/o una de sus porciones características que comprende una porción que se une a PAK de FMRP.

La eficacia de una sustancia candidata puede evaluarse generando curvas de dosis-respuesta a partir de los datos obtenidos utilizando diversas concentraciones de la sustancia candidata. Además, se puede realizar un ensayo de control para proporcionar una línea base para comparación. En el ensayo de control, éste se realiza en ausencia de una sustancia candidata

Los inhibidores de PAK de la invención inhiben la actividad de PAK en al menos alrededor de 10%, al menos alrededor de 20%, al menos alrededor de 30%, al menos alrededor de 40%, al menos alrededor de 50%, al menos alrededor de 60%, al menos alrededor de 70%, al menos alrededor de 80%, al menos alrededor de 90% o más de alrededor de 90% en comparación con la actividad observada en condiciones por lo demás idénticas pero que carecen de una sustancia candidata.

Se entenderá, por supuesto, que todos los métodos de cribado de la presente invención son útiles por sí mismos a pesar de que no puedan encontrarse inhibidores de PAK eficaces. La invención proporciona métodos para el cribado de inhibidores de PAK candidatos, no exclusivamente métodos para encontrarlos.

Cribado

Se puede emplear el cribado de inhibidores de PAK. Se puede emplear el cribado de alta productividad para inhibidores de PAK. Dicho cribado puede identificar sustancias que se unen a PAK. Típicamente, se inmoviliza un gran número de sustancias candidatas sobre un sustrato sólido. Las sustancias candidatas inmovilizadas se ponen en contacto con PAK y se lavan. La PAK unida se detecta entonces por métodos bien conocidos en la técnica.

Usando ensayos de alta productividad, es posible cribar hasta varios miles de sustancias candidatas en un solo día. Cada pocillo de una placa de microtitulación puede utilizarse para realizar un ensayo separado frente a una sustancia candidata seleccionada, o, si se deben observar los efectos de concentración y/o tiempo de incubación, cada 5 - 10 pocillos pueden analizar una sola sustancia candidata. Por lo tanto, una sola placa de microtitulación estándar puede valorar hasta 96 sustancias candidatas. Si se utilizan placas de 1536 pocillos, a continuación una sola placa puede valorar hasta 1536 sustancias candidatas. Es posible analizar muchas placas al día; es posible cribar hasta alrededor de 6.000, alrededor de 20.000, alrededor de 50.000 o más de alrededor de 100.000 sustancias candidatas diferentes utilizando sistemas de alta productividad de acuerdo con la presente invención.

Para reacciones en estado sólido, se puede unir una sustancia candidata al componente en estado sólido, directa o indirectamente, por medio de un enlace covalente y/o no covalente, por ejemplo, por medio de una etiqueta. Una etiqueta puede comprender cualquiera de una variedad de componentes. En general, una sustancia que se une a la etiqueta (un ligante de etiquetas) se fija a un soporte sólido y la sustancia candidata etiquetada se une al soporte sólido por interacción de la etiqueta y/o el ligante de etiquetas.

Se pueden usar varias etiquetas y/o ligantes de etiquetas, basándose en las interacciones moleculares conocidas bien descritas en la bibliografía. Por ejemplo, cuando una etiqueta tiene un agente ligante natural, por ejemplo, biotina, proteína A y/o proteína G, puede usarse junto con ligantes de etiquetas apropiados (avidina, estreptavidina, neutravidina, la región Fc de una inmunoglobulina, etc.). Los anticuerpos para moléculas con agentes ligantes naturales, tales como biotina y/o ligantes de etiquetas adecuados están ampliamente disponibles (Sigma Immunochemicals, St. Louis, MO).

De manera similar, se puede usar cualquier compuesto hapténico y/o antigénico en combinación con un anticuerpo apropiado para formar la pareja etiqueta/ligante de etiqueta. Miles de anticuerpos específicos están disponibles comercialmente y muchos anticuerpos más están descritos en la bibliografía. Por ejemplo, en una configuración usual, la etiqueta es un primer anticuerpo y el ligante de etiqueta es un segundo anticuerpo que reconoce al primer anticuerpo. Además de las interacciones anticuerpo-antígeno, son apropiadas como parejas etiqueta y/o ligante de etiqueta las interacciones receptor-ligando, incluyendo aunque sin limitación: transferrina, c-kit, ligandos de receptores virales, receptores de citoquinas, receptores de quimioquinas, receptores de interleuquinas, receptores de inmunoglobulinas y/o anticuerpos, la familia de las cadherinas, la familia de las integrinas, la familia de las selectinas, etc. (véase, por ejemplo, Pigott et al., The Adhesion Molecule Facts Book I, 1993). De manera similar, pueden interaccionar con diversos receptores celulares toxinas y/o venenos; epítopos virales; hormonas (por ejemplo, opiáceos, esteroides, etc.); receptores intracelulares (por ejemplo, que median los efectos de diversos ligandos pequeños, incluyendo esteroides, hormona tiroidea, retinoides, vitamina D y/o péptidos); fármacos; lectinas; carbohidratos; ácidos nucleicos (configuraciones de polímeros lineales y/o cíclicas); proteínas; fosfolípidos; y/o anticuerpos.

Los polímeros sintéticos, tales como poliuretanos, poliésteres, policarbonatos, poliureas, poliamidas, polietileniminas, poli(sulfuros de arileno), polisiloxanos, poliimidas y/o poliacetatos pueden formar etiquetas apropiadas y/o ligantes de etiquetas. Otras muchas parejas de etiqueta/ligante de etiqueta son útiles en sistemas de ensayo descritos en la presente memoria, como será evidente para un experto en la técnica.

Enlazadores usuales, tales como péptidos, poliéteres y similares, pueden servir como etiquetas y pueden incluir secuencias de polipéptidos, tales como secuencias de poli-Gly, de entre alrededor de 5 y 200 aminoácidos. Dichos enlazadores flexibles son conocidos por los expertos en la técnica. Por ejemplo, enlazadores de polietilenglicol están disponibles de Shearwater Polymers, Inc. (Huntsville, AL). Estos enlazadores tienen opcionalmente enlaces amida, enlaces sulfhidrilos y/o enlaces heterofuncionales.

Los ligantes de etiquetas se fijan a sustratos sólidos utilizando cualquiera de una variedad de métodos disponibles en la actualidad. Los sustratos sólidos son comúnmente derivatizados y/o funcionalizados por exposición de todo y/o una porción del sustrato a un reactivo químico que fije un grupo químico a la superficie que es reactiva con una porción del ligante de etiqueta. Por ejemplo, grupos que son apropiados para la unión a una porción de cadena más larga incluyen grupos amino, hidroxilo, tiol y/o carboxilo. Se pueden usar aminoalquilsilanos y/o hidroxialquilsilanos para funcionalizar una variedad de superficies, tales como superficies de vidrio. La construcción de dichas matrices de biopolímeros en fase sólida está bien descrita en la bibliografía (véanse, por ejemplo, Merrifield, 1963, J. Am. Chem. Soc., 85:2149, que describe la síntesis en fase sólida de, por ejemplo, péptidos; Geysen et al., 1987, J. Immun. Meth., 102:259, que describen la síntesis de componentes en fase sólida en las varillas; Frank et al., 1988, Tetrahedron, 44:6031, que describen la síntesis de diversas secuencias peptídicas en discos de celulosa; Fodor et al., 1991, Science, 251:767; Sheldon et al, 1993, Clinical Chemistry, 39 (4):718; y Kozal et al., 1996, Nature Medicine, 2:753; describiendo todos matrices de biopolímeros fijadas a sustratos sólidos). Las propuestas no químicas para la fijación de ligantes de etiquetas a sustratos incluyen otros métodos habituales, tales como calor, reticulación por radiación ultravioleta y similares.

Ensayos in vitro

Los ensayos in vitro se pueden realizar con frecuencia rápidamente y/o en grandes cantidades, lo que aumenta la cantidad de información que se puede obtener en un corto período de tiempo. Se pueden utilizar una variedad de recipientes para realizar los ensayos, incluyendo tubos de ensayo, placas, cápsulas, placas de microtitulación y/u otras superficies, tales como tiras reactivas y/o perlas. Algunos ensayos in vitro e in cyto han sido descritos, por ejemplo, en la Publicación del PCT WO 06/029337.

La presente invención proporciona métodos in vitro para el cribado de inhibidores de PAK. Por ejemplo, los métodos pueden comprender las etapas de: (1) proporcionar una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características); (2) proporcionar al menos una sustancia candidata; y (3) medir y/o detectar la influencia de la sustancia o sustancias candidatas sobre la sustancia de ensayo.

En algunas realizaciones, se proporciona una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) y se pone directa y/o indirectamente en contacto con una sustancia candidata (por ejemplo, en forma de una quimioteca). Entonces, se detecta y/o mide la influencia de la sustancia candidata sobre la sustancia de ensayo. A continuación, se pueden aislar y/o analizar inhibidores de PAK adecuados. Para el cribado de quimiotecas, se contempla el uso de ensayos de alta productividad que se describen en la presente memoria.

Los ensayos in vitro pueden comprender ensayos de unión. La unión de una sustancia candidata a una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) puede, por sí misma, ser inhibidora, debido a las interacciones estéricas, alostéricas y/o de carga-carga. La sustancia de ensayo puede estar libre en solución, fijada a un soporte y/o expresada en la superficie de una célula y/o sobre ella. La sustancia de ensayo y/o la sustancia candidata pueden ser marcadas, permitiendo así la detección de la unión. La sustancia de ensayo es con frecuencia la especie marcada, disminuyendo la probabilidad de que el marcaje interfiera con la unión y/o la potencia. Los formatos de unión competitivos se pueden realizar de modo que una de las sustancias se marque y otra puede medir la cantidad de marcador libre frente al marcador unido para determinar los efectos sobre la unión.

Los ensayos de unión pueden implicar, por ejemplo, la exposición de una sustancia de ensayo a una sustancia candidata y la detección de la unión entre la sustancia de ensayo y la sustancia candidata. Un ensayo de unión puede llevarse a cabo in vitro (por ejemplo, en un tubo de ensayo, que contenga sustancialmente sólo los componentes mencionados; en extractos libres de células; y/o en componentes sustancialmente purificados). Alternativa o adicionalmente, los ensayos de unión se pueden realizar in cyto y/o in vivo (por ejemplo, dentro de una célula, un tejido, un órgano y/o un organismo; descrito con más detalle a continuación).

Al menos una sustancia candidata se puede poner en contacto con una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) y detectar un efecto. Una sustancia candidata se puede poner en contacto con la proteína PAK y analizarse la unión a la proteína PAK. Un ensayo puede implicar poner en contacto una sustancia candidata con una porción característica de la proteína PAK, incluyendo aunque sin limitación una porción de unión de FMRP de PAK. Se detecta la unión de la sustancia candidata al péptido PAK. Se apreciará que se pueden emplear fragmentos, porciones, homólogos, variantes y/o derivados de PAK, siempre que comprendan la actividad de unión a FMRP.

Los ensayos pueden implicar proporcionar una sustancia de ensayo (por ejemplo, inmovilizada sobre un soporte sólido) y una sustancia candidata no inmovilizada. Se determina el grado en el que la sustancia de ensayo y la sustancia candidata se unen entre sí. Alternativamente, la sustancia candidata puede estar inmovilizada y la sustancia de ensayo no. Dichos ensayos se pueden utilizar para identificar sustancias candidatas capaces de unirse a PAK y/o uno de sus fragmentos, porciones, homólogos, variantes y/o derivados.

Un anticuerpo que reconoce la sustancia de ensayo (por ejemplo, un a anticuerpo de PAK) se puede inmovilizar en un soporte sólido (por ejemplo, perlas de proteína-A). El anticuerpo se pone en contacto con la sustancia de ensayo, que se une al anticuerpo inmovilizado. El complejo resultante se pone entonces en contacto con la sustancia candidata (proteína purificada, extracto celular, quimioteca combinatoria, etc.). Si la sustancia candidata interacciona con la sustancia de ensayo, la sustancia candidata será indirectamente inmovilizada en el soporte sólido. La presencia de la sustancia candidata sobre el soporte sólido se puede evaluar mediante cualquier técnica estándar conocida (incluyendo, aunque sin limitación, la transferencia de Western). Este tipo de ensayo es conocido en la técnica como ensayo de "inmunoprecipitación".

Una sustancia de ensayo (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) se puede inmovilizar sobre un soporte sólido (por ejemplo, perlas de agarosa). La sustancia de ensayo se puede expresar como una proteína de fusión con GST en bacterias, levadura, células de insectos y/o línea de células eucariotas superiores y/o extractos de células purificados o en bruto utilizando perlas de glutatión-agarosa. Como control, se determina la unión de la sustancia candidata, que no es una proteína de fusión con GST, a la proteína PAK inmovilizada en ausencia de la proteína PAK. A continuación se determina la unión de la sustancia candidata a la proteína PAK inmovilizada. Este tipo de ensayo es conocido en la técnica como un ensayo "desplegable con GST". Alternativa o adicionalmente, la sustancia candidata puede estar inmovilizada y la sustancia de ensayo no.

Es posible realizar este tipo de ensayo utilizando diferentes sistemas de purificación por afinidad para inmovilizar uno de los componentes, por ejemplo componentes etiquetados con agarosa Ni-NTA y/o histidina.

La unión de una sustancia de ensayo a la sustancia candidata se puede determinar por una variedad de métodos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el componente no inmovilizado se puede marcar (con, por ejemplo, un marcador radiactivo, una etiqueta epitópica y/o un conjugado enzima-anticuerpo). Alternativa o adicionalmente, la unión se puede determinar por técnicas de detección inmunológica. Por ejemplo, la mezcla de reacción se puede someter a transferencia de Western y sondarse la transferencia con un anticuerpo que detecte el componente no inmovilizado. Alternativa o adicionalmente, se puede utilizar ensayo con inmunosorbente ligado a enzimas (ELISA) para analizar la unión.

Los métodos de cribado de la presente invención pueden comprender: (1) la obtención de una sustancia candidata;

(2) la puesta en contacto de la sustancia candidata con PAK (y/o una de sus porciones características) y FMRP; y (3) la detección de la inhibición y/o activación de la unión entre PAK y FMRP en presencia y/o ausencia de la sustancia candidata.

Los métodos de cribado de la presente invención pueden comprender: (1) la obtención de una sustancia candidata; y (2) la puesta en contacto de la sustancia candidata con un complejo PAK preformada (y/o una de sus porciones características)-FMRP; y (3) la determinación de si la sustancia candidata afecta al complejo PAK (y/o una de sus porciones características)-FMRP.

En algunas realizaciones, los métodos de cribado de la presente invención comprenden: (1) la obtención de una sustancia candidata; (2) la puesta en contacto de la sustancia candidata con PAK (y/o una de sus porciones características) y una pareja de unión natural; y (3) la detección de si la sustancia candidata puede competir con la interacción de unión entre PAK (y/o una de sus porciones características) y la pareja de unión natural.

En algunas realizaciones, se determina que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado una disminución de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado una disminución de al menos el doble de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado una disminución de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces, al menos 10.000 veces o mayor de 10.000 veces de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado una disminución de al menos 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1000% o mayor de 1000% de la unión entre PAK y la pareja de unión natural.

Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado un aumento de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado un aumento de al menos el doble de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado un aumento de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces, al menos

10.000 veces o mayor de 10.000 veces de la unión entre PAK y la pareja de unión natural. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural se obtiene como resultado un aumento de al menos 25%, 50%, 75%, 100%, 200%, 500%, 1000% o mayor de 1000% de la unión entre PAK y la pareja de unión natural.

La actividad de los inhibidores de PAK de la presente invención se puede determinar, por ejemplo, analizando la actividad de quinasa de PAK. En dichos ensayos PAK y/o una de sus porciones características producidas por medios recombinantes, como se ha descrito antes, se pueden poner en contacto con un sustrato en presencia de un donador de fosfato adecuado (por ejemplo, ATP) que contenga fosfato radiomarcado y medirse la incorporación dependiente de PAK del radiomarcador en el sustrato. Por "sustrato" se entiende cualquier sustancia que contenga un resto hidroxilo adecuado que actúa como aceptor del grupo y-fosfato transferido desde una molécula donadora, tal como ATP, en una reacción catalizada por PAK. Un sustrato puede ser un sustrato endógeno de PAK, es decir, una sustancia de origen natural que está fosforilada en células no modificadas por PAK de origen natural y/o cualquier otra sustancia que normalmente no está fosforilada por PAK en una situación fisiológica, pero que puede estar fosforilada por PAK en las condiciones de reacción empleadas. Un sustrato puede ser una proteína o péptido, y la reacción de fosforilación puede tener lugar en un residuo de serina y/o treonina como sustrato. Es bien sabido por los expertos en la técnica que los sustratos no naturales pueden actuar como sustratos adecuados en los ensayos de quinasa, tal como se ha descrito anteriormente.

Es bien sabido por los expertos en la técnica que la detección de la fosforilación en sustrato dependiente de quinasa se puede efectuar por diversos medios distintos a la medida de la incorporación de fosfato radiomarcado en el sustrato. Por ejemplo, la incorporación de grupos fosfato puede afectar a las propiedades fisicoquímicas del sustrato, tales como la movilidad electroforética, la absorbancia de la luz, la fluorescencia y/o fosforescencia, las propiedades cromatográficas, etc. Dichas alteraciones de las propiedades fisicoquímicas del sustrato pueden ser medidas fácilmente por los expertos en la técnica y ser utilizadas como indicador de la actividad de quinasa.

Alternativa o adicionalmente, es bien sabido que pueden ser generados anticuerpos monoclonales o policlonales que reconocen selectivamente las formas fosforiladas del sustrato y por consiguiente el grado de unión de dichos anticuerpos al sustrato posterior a la reacción con quinasa se puede utilizar como método indirecto para determinar la actividad de quinasa. Además, se sabe que muchas quinasas, incluyendo las quinasas PAK, poseen la capacidad de fosforilar residuos sobre la misma molécula de quinasa. Dichas reacciones de fosforilación se denominan autofosforilación y por consiguiente puede utilizarse la medida de la incorporación de fosfato en PAK catalizada por sí misma para monitorizar la actividad de PAK. Los ensayos de quinasa, tales como los descritos anteriormente, se pueden realizar utilizando PAK parcialmente recombinante purificada y/o PAK que es purificada en las células que expresan de forma natural la proteína por procedimientos de purificación, tales como los descritos anteriormente.

Se pueden realizar ensayos basados en ELISA para cribar nuevos sustratos de PAK. Uno de dichos ensayos emplea péptidos biotinilados aleatoriamente que pueden ser fosforilados por una quinasa, tal como PAK. Anticuerpos específicos para PAK se inmovilizan en los pocillos de una placa de microtitulación y muestras que contienen la proteína PAK se pueden diluir en un tampón de reacción y añadirse posteriormente a los pocillos de la placa. Las reacciones son iniciadas, por ejemplo, por adición de los sustratos peptídicos biotinilados a la muestra de PAK. Las reacciones son detenidas retirando las mezclas y lavando a continuación las placas. Después del lavado, se añade estreptavidina conjugada con peroxidasa de rábano silvestre (HRP). A continuación, se separa estreptavidina-HRP no unida, la reacción de color de la peroxidasa se inicia por adición del sustrato de peroxidasa y se mide la densidad óptica en un densitómetro adecuado.

Una sustancia candidata de la que se sospecha que modula la unión entre FMRP y PAK puede ser una sustancia candidata de la que se sospecha que modula la fosforilación de FMRP por PAK. Por ejemplo, la sustancia candidata puede ser una sustancia de la que se sospecha que promueve la fosforilación de FMRP por PAK. Una sustancia candidata de la que se sospecha que modula la fosforilación de FMRP por PAK puede referirse a una sustancia candidata de la que se sospecha que inhibe la fosforilación de FMRP por PAK.

Alternativa o adicionalmente, la actividad de PAK se puede medir analizando su actividad de quinasa, su capacidad para interaccionar con sus parejas de unión naturales y/o por la detección de eventos que conducen y/o son consecuencia de la actividad de PAK en células intactas, en lisados de células y/o en sistemas en los que los eventos de señalización son reconstituidos in vitro. Por ejemplo, se sabe que las proteínas PAK se unen a proteínas de unión a GTP, tales como Rac y/o Cdc42, y son activadas por ellas. Por tanto, se puede utilizar la detección de la interacción de PAK con activadores que existen en la naturaleza, tal como Rac/Cdc42 y/o sustratos como indicador de la actividad de PAK.

Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y a un sustrato se obtiene como resultado una disminución de la capacidad de PAK para fosforilar el sustrato. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y al sustrato se obtiene como resultado una disminución al menos el doble de la capacidad de PAK para fosforilar el sustrato. Se puede determinar que una sustancia candidata es un inhibidor de PAK si al administrar la sustancia candidata a PAK y al sustrato se obtiene como resultado una disminución de al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 10 veces, al menos 20 veces, al menos 50 veces, al menos 100 veces, al menos 200 veces, al menos 500 veces, al menos 1000 veces, al menos 10.000 veces, o mayor de 10.000 veces de la capacidad de PAK para fosforilar el sustrato.

Ensayos in cyto

En la presente memoria se describen métodos para el cribado de moduladores de PAK en los que una sustancia candidata se pone en contacto con una célula. En la célula pueden analizarse entonces diversos parámetros asociados con la actividad de PAK. Por ejemplo, los parámetros asociados con la actividad de PAK incluyen, aunque sin limitación: la capacidad de PAK para interaccionar con sus parejas de unión naturales (por ejemplo, FMRP) y/o la capacidad de PAK para fosforilar sus sustratos.

En las células se puede determinar directamente la unión entre FMRP y PAK. Para evaluar la unión son muy conocidas por los expertos en la técnica los métodos inmunohistoquímicos, métodos confocales y/u otros métodos. En algunas realizaciones, se analiza una célula para determinar la fosforilación de FMRP por PAK. Se pueden utilizar diversas líneas celulares para dichos ensayos de cribado, incluyendo células específicamente modificadas genéticamente para este fin. Ejemplos de células usadas en los ensayos de cribado incluyen células neuronales y/o células dendríticas. La célula puede ser una célula estimulada, tal como una célula estimulada con un factor de crecimiento. Los expertos en la técnica entenderán que la invención descrita en la presente memoria contempla una amplia variedad de ensayos in cyto para medir los parámetros correlacionados con la actividad de PAK.

Dependiendo del ensayo, se puede requerir una célula y/o un cultivo de tejidos. Una célula se puede examinar por cualquiera de varios ensayos fisiológicos diferentes, como se ha estudiado antes para la unión entre FMRP y PAK. Alternativa o adicionalmente, se pueden realizar análisis moleculares, incluyendo, aunque sin limitación: transferencia de Western para controlar la expresión de la proteína y/o ensayo de las interacciones proteínaproteína; transferencia de Northern, presentación diferencial de RNA y/o análisis en micromatrices para controlar la expresión de mRNA; ensayos de quinasa para monitorizar la fosforilación; espectrometría de masas para monitorizar otras modificaciones químicas; etc.

En la presente memoria se describen métodos para la identificación de sustancias que se unen a PAK y, por lo tanto, pueden modular la actividad de PAK. Un método in cyto de identificación de sustancias que se unen a PAK es el ensayo de sistemas de dos híbridos (Fields et al., 1994, Trends in Genetics, 10:286; y Colas et al., 1998, TIBTECH, 16:355). En este ensayo, las células de levadura expresan una primera proteína de fusión que comprende una sustancia de ensayo de acuerdo con la presente invención (por ejemplo, proteína PAK, gen PAK y/o una de sus porciones características) y un dominio de unión a DNA de un factor de transcripción, tales como GAL4 y/o LexA. Las células contienen además un gen indicador cuyo promotor contiene sitios de unión para el correspondiente dominio de unión a DNA. Por transformación de las células con un vector que exprese una segunda proteína de fusión que comprende una sustancia candidata fusionada a un dominio de activación (por ejemplo, a partir de Gal4 y/o virus del herpes simplex VP16) se puede aumentar la expresión del gen indicador, si la sustancia candidata interacciona con la sustancia de ensayo. Por consiguiente, este ensayo se puede utilizar para el cribado de sustancias que modulan una interacción entre PAK y cualquier número de sustancias candidatas. De esta manera, es posible identificar rápidamente nuevos moduladores de PAK.

Los ensayos pueden implicar proteínas PAK unidas a fases sólidas y la detección de sus interacciones con una o más sustancias candidatas. Por lo tanto, una sustancia de ensayo (por ejemplo, la proteína PAK y/o una de sus porciones características) puede contener un marcador detectable, tal como un marcador radiactivo, fluorescente y/o luminiscente. Además, las sustancias candidatas se pueden acoplar a sustancias que permitan la detección indirecta (por ejemplo, mediante el empleo de una enzima que utiliza un sustrato cromógeno y/o mediante la unión de un anticuerpo detectable). Se pueden detectar los cambios en la conformación de PAK como resultado de una interacción con una sustancia candidata, por ejemplo, por el cambio en la emisión del marcador detectable. Alternativa o adicionalmente, los complejos de proteína unida a una fase sólida se pueden analizar por espectrometría de masas.

Los ensayos pueden implicar la monitorización de las actividades de los efectores aguas abajo de PAK. Por ejemplo, los ensayos que implican la monitorización de la actividad de los miembros de la vía de ERK y/o de los miembros de la vía de PDK. La actividad quinasa se puede analizar mediante cualquier método conocido en la técnica. Como ejemplo, la actividad quinasa se puede analizar utilizando anticuerpos fosfo-específicos, puesto que el estado de fosforilación de los miembros de estas vías indica si la proteína es activa. Por ejemplo, se puede realizar una transferencia de Western para fosfoERK1/2 y se puede obtener la cuantificación de los cambios en la actividad de la vía por normalización hasta los niveles totales de BRK1/2. Alternativa o adicionalmente, también se puede determinar la actividad de los miembros aguas abajo de la vía de señalización de ERK (por ejemplo, factores de iniciación de la traducción S6, eIF4E, 4EBP1, etc.) con transferencias de Western sondadas con anticuerpos fosfoespecíficos contra estas proteínas (Kelleher et al., 2004, Cell, 116:467). La actividad de las vías de PI3K se pueden monitorizar por la detección de PDK fosforilada o de las proteínas de señalización Akt y PDK1 aguas abajo.

Los ensayos de cribado pueden analizar la actividad de PAK mediante la monitorización de los efectos celulares aguas abajo de la actividad de PAK. Estos efectos incluyen, aunque sin limitación, la formación de microespigas de actina periférica y/o la pérdida asociada de fibras de estrés (Zhao et al., 1998, Mol. Cell. Biol., 18:2153) y/u otras respuestas celulares, tales como crecimiento, detención del crecimiento, diferenciación y/o apoptosis. Se pueden utilizar células de levadura para este tipo de ensayo de cribado. Por ejemplo, en un ensayo funcional de PAK de levadura, cuando se cultivan en medio que contiene glucosa, las células de PAK de levadura crecen como células de levadura normales. Por exposición a galactosa, sin embargo, es inducida la expresión intracelular de PAK, provocando la muerte de las células de levadura. Las sustancias que inhiben la actividad de PAK se identifican por su capacidad para evitar que mueran las células de levadura.

Los niveles de PAK se pueden determinar midiendo los niveles de proteína y/o mRNA. Los niveles de proteína PAK y/o una de sus porciones características se miden usando inmunoensayos, tales como transferencia de Western y/o ELISA con anticuerpos que se unen selectivamente a PAK. Para la medición de mRNA se pueden utilizar amplificación (por ejemplo, usando la reacción en cadena de la polimerasa [PCR], reacción en cadena de la ligasa [LCR], etc.) y/o ensayos de hibridación (por ejemplo, hibridación de Northern, protección de la RNAsa, transferencia de mancha, etc.). Los niveles de proteína y/o mRNA se pueden detectar utilizando agentes de detección marcados directa y/o indirectamente, por ejemplo, ácidos nucleicos marcados fluorescencente y/o radiactivamente, anticuerpos marcados radiactiva y/o enzimáticamente, etc., como se describe en la presente memoria.

Alternativa o adicionalmente, la expresión de PAK se puede medir usando un sistema de gen indicador. Dicho sistema se puede diseñar utilizando un promotor de la proteína PAK enlazado operativamente a un gen indicador, tal como cloranfenicol acetiltransferasa, luciferasa de luciérnaga, luciferasa bacteriana, O-galactosidasa, fosfatasa alcalina, etc. Además, se puede utilizar PAK como agente indicador indirecto por medio de la unión a un segundo indicador, tal como proteína fluorescente roja y/o verde (véase, por ejemplo, Mistili et al., 1997, Nature Biotech., 15:961). La construcción indicadora típicamente se transfecta en una célula. Después del tratamiento con una sustancia candidata, se mide la cantidad de transcripción, traducción y/o actividad del gen indicador de acuerdo con técnicas estándares conocidas por los expertos en la técnica.

En la presente memoria se describen métodos para determinar si PAK puede inducir la fosforilación de FMRP in vivo. En dichos métodos, las células son transfectadas con vectores que expresan PAK y/o FMRP constitutivamente activas. Los extractos celulares se preparan en momentos especificados después de la transfección y se analiza el grado de fosforilación de FMRP por análisis de transferencia de Western. Ratones FMR1 KO y pacientes con FXS muestran fenotipos de conducta similares y/o anomalías similares en morfología sináptica en el cerebro. Sus cerebros tienen más espinas dendríticas y/o una proporción mayor de espinas más largas y/o más delgadas en comparación con los de los individuos normales. Además, muestran una función sináptica anómala, tal como una mayor depresión a largo plazo (LTD) mediada por el receptor metabotrópico de glutamato en el hipocampo y/o menor potenciación a largo plazo (LTP) en la corteza. Por lo tanto, el ratón FMR1 KO sirve como un modelo preciso de FXS y el ratón FMR1 KO exhibe varios fenotipos cuantificables. Dichos fenotipos incluyen conducta, morfología sináptica y/o función sináptica.

En algunas realizaciones, los métodos de cribado de la presente invención pueden medir los síntomas conductuales. Dichos síntomas conductuales pueden incluir hiperactividad, estereotipia, conducta perseverante, ansiedad, hipoansiedad, convulsiones, conducta social deteriorada y/o retraso cognitivo. En algunas realizaciones, los síntomas conductuales se pueden medir usando un ensayo en campo abierto. En un ensayo en campo abierto, se permite que un sujeto corra libremente en un espacio abierto (por ejemplo, cámara monitora de la actividad VersaMax de Accuscan Instruments) y se analizan ciertas conductas. Estas conductas incluyen, aunque sin limitación: (1) la hiperactividad, determinada midiendo la distancia recorrida por el sujeto y/o el tiempo transcurrido;

(2) la estereotipia, determinada midiendo el número de conductas repetidas exhibidas por el sujeto; (3) la hipoansiedad, determinada midiendo la cantidad de tiempo que el sujeto permanece en el centro del campo con relación al tiempo transcurrido en las esquinas del campo; y/o (4) sus combinaciones.

En algunas realizaciones, los síntomas conductuales se pueden medir utilizando una tarea de condicionamiento del miedo vestigial. Por ejemplo, se coloca un sujeto en una cámara de entrenamiento (Cámara A), donde suena un tono, seguido por un tiempo en blanco (también llamado miedo vestigial) y a continuación una descarga eléctrica. La secuencia se repite varias veces para que el sujeto aprenda la asociación entre el tono y la descarga eléctrica a través del lapso de tiempo. Para examinar si el sujeto recuerda esta asociación, en diferentes momentos después del condicionamiento, el sujeto es colocado en una nueva cámara (Cámara B) con una forma y un olor diferentes a los de la Cámara A y se monitoriza su respuesta al tono. Si el sujeto aprende y recuerda qué tono está asociado a la descarga eléctrica, se quedará inmóvil (llamado "congelación"). Estudios anteriores han demostrado que los estímulos y/o las lesiones que distraen la atención de la corteza prefrontal y/o el hipocampo pueden interferir con el condicionamiento del miedo vestigial. Por lo tanto, se pueden medir la atención del sujeto y/o la memoria asociativa comparando el grado de congelación de ambos pre- y post-condicionamientos, frecuentemente con relación a un sujeto de control. Los ensayos conductuales pertinentes pueden incluir el ensayo del laberinto de ocho brazos y/o el ensayo de sensibilización a la estereotipia inducida por anfetaminas para la estereotipia y la conducta perseverante. Los ensayos conductuales pertinentes pueden incluir un laberinto elevado en cruz, la transición de luz-oscuridad y/o el ensayo de alimentación sin golosinas para la ansiedad, convulsiones audiogénicas, interacción social y/o aprendizaje social para conductas sociales. Los ensayos conductuales pertinentes pueden incluir el laberinto de agua de Morris (incluyendo la versión inversa) y/o el condicionamiento del miedo para el aprendizaje y la memoria.

Los síntomas conductuales se pueden medir por un ensayo de convulsiones audiogénicas (AGS). Los seres humanos y los ratones con cromosoma X frágil son propensos a sufrir convulsiones a edades tempranas. Los ratones con cromosoma X frágil muestran un fenotipo robusto en un ensayo de AGS. Aunque los ratones de tipo natural de 19-21 días (p19-21) suelen tener convulsiones en esta tarea, la mayoría de los ratones con cromosoma X frágil tienen convulsiones. El ensayo de AGS se puede realizar esencialmente como ha sido descrito (Yan et al, 2005, Neuropharmacol, 49:1053). En resumen, los ratones se habitúan a una cámara de conducta y luego se exponen a una sirena de alta intensidad con un máximo de frecuencia de 1800 Hz - 6300 Hz a un nivel medio de presión de sonido por encima de 120 dB a aproximadamente 10 cm durante 5 minutos. Las conductas de los ratones pueden ser monitorizadas después de la administración de sonido. Los ratones con cromosoma X frágil generalmente (1) corren excitadamente, (2) tienen convulsiones y/o (3) mueren. Los ratones de tipo natural no presentan normalmente estas respuestas. Se puntuó un fenotipo de AGS basándose en el momento final del animal.

Los síntomas conductuales se pueden medir mediante cualquiera de los diversos ensayos de interacción social. La conducta en jaula doméstica y la interacción social se pueden evaluar por una variedad de ensayos (Kwon et al., 2006, Neuron, 50:377; Spencer et al., 2005, Genes Brain Behav., 4:420; y Lijam et al., 1997, Cell, 90:895). Por ejemplo, los ratones se pueden mantener en observación en sus jaulas domésticas por videograbación y puntuarse las diversas conductas no sociales y/o conductas sociales (por ejemplo, acicalamiento, apareamiento, tirado de la cola y olfateo).

La interacción social directa se puede evaluar mediante la exposición de los ratones a un nuevo ratón conespecífico y la observación de las conductas de aproximación y olfateo. Se puede registrar el porcentaje de tiempo dedicado a la interacción. Normalmente, esto se repite alrededor de 3 días más tarde con los mismos ratones. Los ratones de control por lo general presentan una disminución de la interacción social la segunda vez, lo que indica un reconocimiento del ratón conocido y/o un aprendizaje social normal. Los ratones FMR KO normalmente no muestran una disminución de la interacción social la segunda vez, lo que indica una disminución del aprendizaje, la memoria y/o la conducta social. Este ensayo se puede realizar en un entorno nuevo o conocido, puesto que se han observado diferencias significativas entre los ratones FMR KO y los de tipo natural en los ensayos de interacción social en función del grado de familiaridad con el entorno. En este ensayo se pueden monitorizar otras conductas sociales incluyendo conductas activas (por ejemplo, ataques agresivos, amenazas laterales y/o persecución) y conductas pasivas (por ejemplo, la recepción del olfateo de otro ratón y/o que no muestre signos de conducta sumisa y/o defensiva).

Antes de un ensayo de interacción social indirecta, los ratones pueden ser alojados individualmente durante 4 días. Las tareas de interacción social indirecta suelen tener lugar normalmente en una jaula dividida en dos por un tabique perforado transparente. La tarea se realiza de dos modos diferentes: uno implica un entorno conocido, por la exposición previa a la cámara de ensayo, mientras que el otro implica un entorno nuevo. Los ratones de ensayo pueden ser expuestos a ratones nuevos o conocidos. Normalmente, los ratones FMR KO se comportan de manera similar a los ratones de tipo natural en un entorno nuevo, pero se comportan significativamente diferentes en una jaula conocida. El tiempo que permanecen en el tabique se puede registrar a intervalos de 2 a 5 minutos durante un ensayo de 20 minutos. Los ratones FMR KO tienden a permanecer significativamente menos tiempo interaccionando (es decir, en el tabique) en los primeros minutos y permanecen más en la primera aproximación al tabique que los ratones de tipo natural. En contraste, los ratones FMR KO suelen permanecer más tiempo en el tabique durante los últimos intervalos de tiempo que los ratones de control.

En algunos experimentos, el ensayo de interacción social indirecta se lleva a cabo en una cámara dividida en tres recintos. El recinto central - que está conectado a dos recintos independientes unos de otros, uno a la izquierda y otro a la derecha - está vacío. El recinto de la izquierda contiene una jaula vacía (es decir, un objeto novedoso y/o un objetivo inanimado), mientras que el recinto de la derecha contiene una jaula similar que encierra un nuevo ratón (es decir, un objetivo social). Esta tarea implica una elección entre pasar el tiempo con un objetivo social o con un objetivo inanimado, por lo que se llama un ensayo de preferencia social. Se puede registrar el porcentaje de tiempo total que los ratones interaccionan con cada objetivo. Los ratones FMR KO pueden pasar una cantidad de tiempo significativamente diferente (por ejemplo, más o menos) interaccionando con el objetivo social que los ratones de control.

Se puede realizar un ensayo de dominancia social en un tubo de aproximadamente 30 cm de largo y 3 cm - 4 cm de diámetro. Se colocan los ratones en los extremos opuestos del tubo y se liberan simultáneamente. Un ratón se declara "ganador" cuando su oponente se retira completamente. Los ratones FMR1 KO ganan significativamente menos partidos contra los ratones de tipo natural desconocidos que los esperados por probabilidad. Cuando un ratón FMR1 KO compite con otro de tipo natural no compañero de jaula, el ratón de tipo natural es el ganador en aproximadamente el 73% de los partidos (Kwon et al, 2006, Neuron, 50:377; Spencer et al., 2005, Genes Brain Behav., 4:420; y Lijam et al., 1997, Cell, 90:895). La modulación de la actividad de PAK por medio de la administración de un modulador de PAK puede mejorar este fenotipo.

Puesto que los ratones FMR1 KO han demostrado que presentan algunas conductas sociales anómalas, la presente invención abarca el reconocimiento de que la conducta social en jaulas domésticas, incluyendo la conducta en la construcción de la ratonera y en el sueño, puede alterarse en los ratones FMR1 KO. Se evaluaron los modelos de anidación colocando una porción de algodón enclavada en una jaula de aproximadamente dos, tres o cuatro ratones del mismo genotipo (por ejemplo, de tipo natural, FMR1 KO, etc.) que reciben tratamientos con fármacos idénticos. Después de aproximadamente 30 minutos a 1 hora, se puede retirar la ratonera y medirse su altura. Los ratones de tipo natural construyen ratoneras con profundidades medias de 20 mm a 50 mm. Los ratones que presentan una conducta social anómala, tales como los ratones FMR1 KO, construyen frecuentemente ratoneras menos profundas (por ejemplo, < 20 mm).

Las posiciones para dormir de los ratones en sus jaulas domésticas se pueden grabar dos a cuatro veces al día durante cinco días consecutivos. Los ratones de tipo natural duermen acurrucados en las ratoneras suaves y bien formadas que construyen. Las observaciones determinaron que los ratones FMR1 KO duermen en patrones dispersos aleatorios, no construyen ratoneras completas, o duermen en la parte superior del material enclavado intacto. La presente invención abarca el reconocimiento de que, si los ratones FMR1 KO presentan fenotipos anómalos, pueden mejorar dichos fenotipos después de la modulación de la actividad de PAK.

Los síntomas conductuales, tal como el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo se pueden evaluar utilizando el ensayo clásico en el laberinto de agua de Morris. Los ratones FMR1 KO, al igual que los ratones de control de tipo natural, aprenden a encontrar la plataforma visible u oculta con disminución de las puntuaciones de latencia durante el transcurso del protocolo de entrenamiento estándar. Sin embargo, algunos grupos observan un fenotipo anómalo en una prueba inversa, un ensayo en el que se transfiere la plataforma al cuadrante opuesto al cuadrante de entrenamiento inicial. En particular, los ratones FMR1 KO presentan un aumento de la latencia y la longitud de la trayectoria de escape, lo que sugiere que tienen una flexibilidad de respuesta baja o interferencia de memoria alta (véase, por ejemplo, D'Hooge et al., 1997, Neuroscience, 76:367).

La plasticidad sináptica en el hipocampo se puede evaluar utilizando un protocolo estándar para mGluR-LTD (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5 para un protocolo más detallado). Se pueden preparar cortes del hipocampo de ratones FMR KO y de compañeros de camada de control por procedimientos estándares. Todos los experimentos se realizan generalmente a ciegas al genotipo. Se estimulan las fibras colaterales de Schaffer y se miden los potenciales de campo extracelulares en el estrato radiado de CA1. La LTD dependiente de mGluR es provocada tanto electrofisiológicamente (por pares de estímulos suministrados a 1 Hz durante 15 minutos a 20 minutos; "PP-LFS") como farmacológicamente (por aplicación en un baño de 3,4-dihidroxifenilglicina (DHPG) 50 μM a 100 μM durante 5 minutos). La pendiente inicial del potencial de campo se registra como un indicador de la fuerza sináptica. Los cortes de hipocampo de los ratones FMR1 KO muestran mejor mGluR-LTD respecto a los ratones de control (véanse, por ejemplo, Huber et al., 2002, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 99:7746; y Nosyreva and Huber, 2006, J. Neurophysiol., 95:3291).

La potenciación cortical a largo plazo (LTP) se reduce en cortes de ratones FMR1 KO (véase la Figura 14). Los cortes del cerebro coronal que contienen la corteza temporal se preparan a partir de miembros de la camada machos de dos a tres meses y se dejan que se recuperen durante al menos 1 hora antes del registro en líquido cefalorraquídeo artificial caliente (30°C) oxigenado (95% de O2 y 5% de CO2) que contiene NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 26 mM, dextrosa 10 mM. Los potenciales de campo (FP) en las capas II/III provocados por estimulación de la capa IV se miden como se ha descrito anteriormente y las respuestas se cuantifican como la amplitud de FP en la corteza. La LTP es inducida por TBS, que consistía en ocho ráfagas breves (cada una con 4 pulsos a 100 Hz) de estímulos suministrados cada 200 milisegundos. La inhibición genética de PAK restaura la LTP cortical reducida en los ratones FMR1 KO y la presente invención abarca el reconocimiento de que la inhibición farmacológica puede tener el mismo efecto (Hayashi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci., USA., 104:11489).

Los métodos pueden incluir la medida de la morfología sináptica. Se puede contar el número de espinas dendríticas. El número de espinas se puede examinar en neuronas piramidales de las capas II/III teñidas con la técnica de Golgi de la corteza temporal. Por ejemplo, se pueden obtener cortes en serie del cerebro siguiendo la técnica de Golgi-Cox. Las neuronas piramidales de las capas II/III se visualizan por microscopía (por ejemplo, bajo un microscopio Olympus BX61 en posición vertical con la platina XY motorizada usando el programa informático Neurolucida/estereología [Microbrightfield]). En cada rama dendrítica apical primaria, se analizan los segmentos de tamaño regular (por ejemplo, diez segmentos dendríticos consecutivos de 10 μm de largo) para cuantificar la densidad de espinas (por ejemplo, el numero de espinas por segmento dendrítico de 10 μm de largo). En algunas realizaciones, se miden la longitud y/o anchura de las espinas dendríticas. En algunas realizaciones, se mide la longitud de la espina desde las neuronas teñidas por la técnica de Golgi.

El tamaño de la cabeza de la espina dendrítica se puede examinar por análisis de microscopía electrónica de la longitud de la densidad postsináptica (PSD). Las cabezas de la espina dendrítica se pueden examinar realizando análisis de microscopía electrónica de la proporción de sinapsis perforadas más grandes. Por ejemplo, para la microscopía electrónica, se anestesian y perfunden los sujetos. Se insertan bloques de corteza temporal, de los cuales se preparan cortes (por ejemplo, de 1 μm de espesor) y se tiñen con azul de toluidina (por ejemplo, diluido al 1%) para guiar el recorte adicional para aislar las capas II/III de la corteza temporal. A continuación se preparan cortes ultrafinos (por ejemplo, de 90 nm) y se tiñen con acetato de uracilo y citrato de plomo. Se fotografían zonas del neuropilo seleccionadas aleatoriamente (por ejemplo, con 10.000 aumentos con un microscopio electrónico JEOL 1200EX) y se escanean y analizan los negativos de las imágenes.

Las neuronas pueden ser marcadas por proteínas fluorescentes (directamente o por tinción indirecta) en un animal y/o en un cultivo establecido a partir de un animal. Se puede utilizar microscopía fluorescente para visualizar las neuronas y medir el número, la longitud y/o el tamaño de las espinas. Se puede medir el tamaño de los terminales presinápticos. El tamaño de los terminales presinápticos puede ser examinado realizando un análisis de microscopía electrónica del número de vesículas sinápticas y/o vesículas acopladas. Los terminales presinápticos pueden ser marcados por proteínas fluorescentes y se utiliza microscopía de fluorescencia para visualizar los terminales presinápticos y medir sus tamaños.

Los métodos pueden implicar la medición de la función sináptica. La depresión a largo plazo (LTD) mediada por el receptor de glutamato metabotrópico (mGluR) se puede medir en el hipocampo. Por ejemplo, se preparan cortes de hipocampo y se dejan que se recuperen antes del registro en el líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF) oxigenado. Los potenciales de campo (FP) en el estrato radiado de la zona CA1 son provocados por un impulso de corriente a los axones colaterales de Schaffer. Las respuestas estables en la línea de base se recogen regularmente por una intensidad de estimulación (10 !A - 30 μA) produciendo 50% - 60% de la respuesta máxima. La mGluR-LTD puede ser inducida por aplicación del agonista de mGluR 3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG; por ejemplo, a 100 μM) y/o utilizando una estimulación de baja frecuencia de pulsos emparejados que consiste en 900 pares de estímulos suministrados a 1 Hz en presencia del antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) ácido D-(-)-2-amino-5fosfono-pentanoico (D-APV; por ejemplo, a 50 μM). DHPG es un compuesto quiral y mGluR-LTD puede ser inducida por aplicación de RS-DHPG y S-DHPG, pero normalmente no por aplicación de R-DHPG.

La potenciación a largo plazo (LTP) se puede medir en la corteza. Por ejemplo, se preparan cortes del cerebro coronal que contienen corteza y se dejan que se recuperen antes del registro en ACSF oxigenado. Se miden los FP en las capas II/III provocados por estimulación de la capa IV y se cuantifican las respuestas como la amplitud del FP. La LTP cortical puede ser inducida por estimulación de ráfagas zeta (TBS), que consiste en ráfagas breves de estímulos suministrados a intervalos regulares (por ejemplo, ocho ráfagas breves, cada una con 4 pulsos a 100 Hz, de estímulos suministrados cada 200 milisegundos).

Se pueden medir en la corteza corrientes sinápticas mediadas por receptores de ácido a-amino-3-hidroxi-5metilisoxazol-4-propiónico (AMPAR) y/o NMDAR. Por ejemplo, para la medida de una corriente postsináptica excitadora en miniatura (mEPSC) mediada por AMPAR, se añaden en un baño de ACSF tetrodotoxina, APV y bicuculina. Se recogen trazos continuos (por ejemplo, 30 milisegundos - 60 milisegundos) a intervalos regulares (por ejemplo, cada 8 segundos) y se filtran (por ejemplo, a 2 KHz). Se descartan las células con resistencia en serie por encima de un cierto nivel umbral (por ejemplo, � 13 mO). La medida de la relación NMDAR-EPSC/AMPAR-EPSC se realiza normalmente en ACSF que contiene Mg2+, bicuculina y glicina. Las respuestas dependiente de NMDAR y dependiente de AMPAR se discriminan basándose en sus diferentes cinética y dependencia del voltaje. Así, la respuesta mediada por NMDAR se valora como las corrientes registradas a +40 mV y se mide 100 milisegundos después de la aparición de la respuesta. La respuesta mediada por AMPAR se toma de la respuesta de amplitud máxima registrada a -80 mV.

También se describen los métodos que implican la medida de la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales. Se determina la sustancia candidata para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico, si la sustancia candidata modula la interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales. Se puede determinar la sustancia candidata para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico, si la sustancia candidata modula la interacción entre PAK y FMRP. La interacción entre PAK y sus parejas de unión naturales se puede medir utilizando métodos estándares, que se describen en la presente memoria y en el texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

También se describen métodos de cribado que implican medir la actividad quinasa de PAK en una célula, tejido, en presencia y/o ausencia de la sustancia candidata. Una sustancia candidata se determina para tratar, aliviar.... (sic)

En la presente memoria se describen métodos de cribado para determinar si una sustancia candidata es útil para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de un FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico en un mamífero que implican medir el nivel de fosforilación de FMRP en una célula, tejido, en presencia y/o ausencia de la sustancia candidata. Se determina la sustancia candidata para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico, si la sustancia candidata disminuye el nivel de fosforilación de FMRP.

Los métodos de cribado de la presente invención puede implicar la medida de mRNA de PAK y/o los niveles de proteína en una célula, tejido, en presencia y/o ausencia de la sustancia candidata. Se determina la sustancia candidata para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características de FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico, si la sustancia modula mRNA de PAK y/o los niveles de proteína. El mRNA de PAK y/o los niveles de proteína se pueden medir utilizando métodos estándares, que se describen en la presente memoria y en el texto de Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001).

Se puede utilizar una raza de C. elegans que se caracteriza por un fenotipo de esterilidad y/o letalidad embrionaria y/o una migración defectuosa de las gónadas y que alberga una función PAK deteriorada y/o ausente. La raza de C. elegans utilizada podría ser obtenible y/o podría obtenerse por uno o más de los métodos para la generación de C. elegans que tenga dichos fenotipos. Dicho modelo puede ser utilizado, entre otras cosas, para la caracterización de las vías de señalización relacionadas con PAK. Dicho modelo puede ser utilizado para la identificación de sustancias que interfieren y/o interaccionan con una o más proteínas que forman parte de una vía de señalización relacionada con PAK. Dicho modelo puede ser utilizado para la identificación de un modulador de PAK usando cualquiera de los ensayos in vivo descritos en la presente memoria.

Métodos de uso

La presente invención proporciona inhibidores de PAK para uso en métodos de tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico (por ejemplo, POF, FXTAS, varias formas de retraso mental y/o trastornos del espectro autista (ASD)). Dichos métodos implican la inhibición de la actividad de PAK. La actividad de PAK se puede inhibir mediante la interrupción de su capacidad para interaccionar con FMRP y/o para fosforilar FMRP.

La invención incluye composiciones farmacéuticas que comprenden al menos un inhibidor de PAK y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. Una composición farmacéutica que comprende una sustancia candidata puede ser administrada a una célula, tal como de un paciente que padece y/o es propenso a FXS y/o a otros trastornos del desarrollo neurológico.

Los inhibidores de PAK en una instancia de la presente descripción, pueden ser útiles en el tratamiento de la formación sináptica anómala. La formación sináptica anómala es causada por FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. La PAK de la invención puede ser útil en el tratamiento de espinas dendríticas inapropiadamente formadas. Las espinas dendríticas se pueden caracterizar como "inapropiadamente formadas" cuando un individuo posee un número anómalamente elevado de espinas dendríticas. Las espinas dendríticas se pueden caracterizar como "inapropiadamente formadas" cuando un individuo posee espinas que son anómalamente largas y/o delgadas. Las espinas dendríticas inapropiadamente formadas son originadas por FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Los inhibidores de PAK de la invención se pueden utilizar en el tratamiento de un aumento de la depresión a largo plazo (LTD) mediada por el receptor de glutamato metabotrópico en el hipocampo y/o de una reducción de la potenciación a largo plazo (LTP) en la corteza. El aumento de la depresión a largo plazo (LTD) defectuosa mediada por el receptor de glutamato metabotrópico en el hipocampo y/o la reducción de la potenciación a largo plazo (LTP) deteriorada en la corteza son causados por FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Los inhibidores de PAK de la presente invención pueden ser útiles en el tratamiento de uno o más de los siguientes síntomas: hiperactividad, estereotipia, ansiedad, convulsiones, conducta social alterada y/o retraso cognitivo provocados por FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Se describen métodos para el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico que comprenden las etapas de: (1) proporcionar un paciente que presente síntomas, padezca y/o sea propenso a FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico y (2) administrar una sustancia que inhiba la capacidad de PAK para interaccionar con sus parejas de unión naturales.

Se describen métodos para el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico que comprenden las etapas de: (1) proporcionar un paciente que presente síntomas, padezca y/o sea propenso a FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico y (2) administrar una sustancia que inhiba y/o interrumpa la unión de PAK y FMRP.

Se describen métodos para el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico que comprenden las etapas de: (1) proporcionar un paciente que presente síntomas, padezca y/o sea propenso a FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico y (2) administrar una sustancia que module la actividad quinasa de PAK.

Se describen métodos para el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico que comprenden las etapas de: (1) proporcionar un paciente que presente síntomas, padezca y/o sea propenso a FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico y (2) administrar una sustancia que module la capacidad de PAK para fosforilar FMRP.

Se describen métodos para el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico que comprenden las etapas de: (1) proporcionar un paciente que presente síntomas de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico y (2) administrar una sustancia que module los niveles del mRNA y/o proteína de PAK.

En algunas realizaciones, los inhibidores de PAK de la invención pueden ser utilizados para tratar enfermedades del desarrollo neurológico, estados y/o trastornos distintos de FXS, tales como, retraso mental, trastornos del espectro autista, insuficiencia ovárica prematura y ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil. Por ejemplo, algunas mutaciones de FMR1 no causan FXS, sino que provocan otros trastornos. Los "alelos" del gen FMR1 están definidos por el número de repeticiones de CGG y/o por el estado de metilación del locus de FMR1. FMR1 normalmente tiene entre 7-52 repeticiones de CGG (más frecuentemente 30 repeticiones) situadas en la región 5' no traducida del exón

1. Estas secuencias no están normalmente metiladas, pero puede tener lugar la metilación en cada C de las repeticiones del dinucleótido CG, que silencia la expresión de FMR1.

Una "mutación completa" se caracteriza por > 200 repeticiones de CGG que están metiladas. Todos los machos y el 50% de las hembras que posean la mutación completa desarrollarán FXS. En contraste, una “premutación" se caracteriza por 55 a 200 repeticiones de CGG que no están metiladas. Estos individuos probablemente no desarrollarán FXS, pero las hembras presentan mayor gemelación y/o una mayor incidencia de insuficiencia ovárica prematura (POF).

Además, la premutación puede conducir a ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil (FXTAS), especialmente en machos. FXTAS se caracteriza por temblor deliberado, ataxia, deterioro cognitivo y/o atrofia cerebral y se cree que está relacionado con los niveles de RNA.

La premutación puede ocasionar efectos cognitivos. Por ejemplo, un coeficiente intelectual del portador de una premutación puede estar en el intervalo medio, pero es probable que esté en el extremo inferior del intervalo medio. Existen pruebas de efectos socio-emocionales, incluyendo mayor timidez y/o ansiedad social.

Así, la expresión y/o actividad inadecuada del gen FMR1 puede conducir a enfermedades, trastornos y/o estados distintos del FXS.

Composiciones farmacéuticas

La presente invención proporciona inhibidores de PAK útiles en el tratamiento de FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden inhibidores de PAK y al menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o varios inhibidores de PAK de la invención adecuadamente formulados para la administración a un sujeto que padece y/o es propenso a FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. Dichas composiciones farmacéuticas pueden comprender opcionalmente una o más sustancias adicionales terapéuticamente activas.

La invención abarca la preparación y/o el uso de composiciones farmacéuticas que comprenden, como ingrediente activo, inhibidores de PAK para su uso en el tratamiento del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. Dicha composición farmacéutica puede consistir en el ingrediente activo solo, en una forma adecuada para la administración a un sujeto, o la composición farmacéutica puede comprender el ingrediente activo y uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables, uno o más ingredientes adicionales y/o una combinación de éstos. El ingrediente activo puede estar presente en la composición farmacéutica en la forma de un éster y/o sal fisiológicamente aceptable, tal como en combinación con un catión y/o aniónico fisiológicamente aceptable, como es bien conocido en la técnica.

Aunque las descripciones de composiciones farmacéuticas proporcionadas en la presente memoria están dirigidas principalmente a composiciones farmacéuticas que son adecuadas para su administración a seres humanos, los expertos en la técnica entenderán que dichas composiciones son en general adecuadas para su administración a animales de todo tipo. La modificación de composiciones farmacéuticas adecuadas para su administración a seres humanos con el fin de hacer que dichas composiciones sean adecuadas para su administración a diversos animales es bien conocida y el farmacólogo veterinario experto en la técnica puede diseñar y/o realizar, si es necesaria, dicha modificación sólo con una experimentación habitual. Los pacientes a los que está destinada la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen, aunque sin limitación: seres humanos y/u otros primates; mamíferos, incluyendo mamíferos de interés comercial, tales como ganado bovino, cerdos, caballos, ovejas, gatos y/o perros; y/o aves, incluyendo aves de interés comercial, tales como pollos, patos, gansos y/o pavos.

Las composiciones farmacéuticas como se describen en la presente memoria se pueden preparar por cualquier método conocido o desarrollado en el futuro en la técnica farmacéutica. En general, dichos métodos preparatorios incluyen la etapa de asociar el ingrediente activo con uno o más excipientes y/o uno o más ingredientes accesorios y, a continuación, si es necesario y/o deseable, conformar y/o envasar el producto en una unidad unidosis o multidosis deseada.

Una composición farmacéutica de la invención se puede preparar, envasar y/o vender a granel, como una sola dosis y/o como una pluralidad de unidosis. Como se usa en la presente memoria, una "unidosis" es una cantidad diferenciada de la composición farmacéutica que comprende una cantidad predeterminada del ingrediente activo. La cantidad del ingrediente activo es generalmente igual a la dosificación del ingrediente activo que sería administrada a un sujeto y/o una fracción conveniente de dicha dosificación tal como, por ejemplo, la mitad o un tercio de dicha dosificación.

Las cantidades relativas del ingrediente activo, el(los) excipiente(s) farmacéuticamente aceptable(s) y/o cualquiera de los ingredientes adicionales en una composición farmacéutica de la invención variarán, dependiendo de la identidad, tamaño y/o estado del sujeto tratado y dependiendo además de la vía por la cual se ha de administrar la composición. A modo de ejemplo, la composición puede comprender entre 0,1% y 100% (p/p) de ingrediente activo.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención pueden comprender adicionalmente un excipiente farmacéuticamente aceptable que, como se usa en la presente memoria, incluye cualquier y todos los disolventes, medios de dispersión, diluyentes u otros vehículos líquidos, adyuvantes de la dispersión o suspensión, agentes tensioactivos, agentes isotónicos, agentes espesantes o agentes emulsionantes, conservantes, aglutinantes sólidos, lubricantes y similares, adecuados a la forma de dosificación particular deseada. En el texto de Remington The Science and Practice of Pharmacy, 21st edition, AR Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) se describen diversos excipientes utilizados en la formulación de composiciones farmacéuticas y las técnicas conocidas para su preparación. Excepto cuando cualquier excipiente convencional sea incompatible con una sustancia o sus derivados, tal como produciendo un efecto biológico indeseable o interaccionando de manera perjudicial con cualquier otro u otros componentes de la composición farmacéutica, su uso está contemplado dentro del alcance de esta invención.

El excipiente farmacéuticamente aceptable puede tener una pureza de al menos 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o 100%. El excipiente puede estar aprobado para su uso en seres humanos y para uso veterinario. El excipiente puede estar aprobado por la Food and Drug Administration de EE.UU. El excipiente puede ser de calidad farmacéutica. El excipiente puede cumplir las normas de la Farmacopea de Estados Unidos (USP), la Farmacopea Europea (EP), la Farmacopea Británica y/o la Farmacopea Internacional.

Los excipientes farmacéuticamente aceptables utilizados en la fabricación de las composiciones farmacéuticas incluyen, aunque sin limitación: diluyentes inertes, agentes dispersantes y/o granulantes, agentes tensioactivos y/o emulsionantes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes tampón, agentes lubricantes y/o aceites. Dichos excipientes se pueden incluir opcionalmente en las formulaciones de la invención. Excipientes tales como manteca de cacao y ceras para supositorios, agentes colorantes, agentes de recubrimiento, edulcorantes, aromatizantes y agentes perfumantes pueden estar presentes en la composición, según el criterio del formulador.

Ejemplos de diluyentes incluyen, aunque sin limitación: carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, fosfato dicálcico, sulfato de calcio, hidrogenofosfato de calcio, fosfato de sodio, lactosa, sacarosa, celulosa, celulosa microcristalina, caolín, manitol, sorbitol, inositol, cloruro de sodio, almidón seco, almidón de maíz, azúcar en polvo, etc., y sus combinaciones.

Ejemplos de agentes granulantes y/o dispersantes incluyen, aunque sin limitación: almidón de patata, almidón de maíz, almidón de tapioca, almidón glicolato sódico, arcillas, ácido algínico, goma guar, pulpa de cítricos, agar-agar, bentonita, celulosa y productos de madera, esponja natural, resinas de intercambio catiónico, carbonato de calcio, silicatos, carbonato de sodio, poli(vinilpirrolidona) reticulada (crospovidona), carboximetilalmidón sódico (almidón glicolato sódico), carboximetilcelulosa, carboximetilcelulosa sódica reticulada (croscarmelosa), metilcelulosa, almidón pregelatinizado (almidón 1500), almidón microcristalino, almidón insoluble en agua, carboximetilcelulosa cálcica, silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM), laurilsulfato de sodio, compuestos de amonio cuaternario, etc., y sus combinaciones.

Ejemplos de agentes tensioactivos y/o emulsionantes incluyen, aunque sin limitación: emulsionantes naturales (por ejemplo, goma arábiga, agar-agar, ácido algínico, alginato de sodio, goma tragacanto, chondrux, colesterol, goma de xantano, pectina, gelatina, yema de huevo, caseína, lanolina, colesterol, cera y lecitina), arcillas coloidales (por ejemplo, bentonita [silicato de aluminio] y VEEGUM [silicato de aluminio y magnesio]), derivados de aminoácidos de cadena larga, alcoholes de alto peso molecular (por ejemplo, alcohol estearílico, alcohol cetílico, alcohol oleílico, monoestearato de triacetina, diestearato de etilenglicol, monoestearato de glicerilo y monoestearato de propilenglicol, poli(alcohol vinílico)), carbómeros (por ejemplo, carboxipolimetileno, poli(ácido acrílico), polímero de ácido acrílico y polímero de carboxivinilo), carragenina, derivados celulósicos (por ejemplo, carboximetilcelulosa sódica, celulosa en polvo, hidroximetilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, metilcelulosa), ésteres de ácidos grasos de sorbitán (por ejemplo, monolaurato de sorbitán polioxietilenado [Tween®20], sorbitán polioxietilenado [Tween®60], monooleato de sorbitán polioxietilenado [Tween®80], monopalmitato de sorbitán [SPAN®40], monoestearato de sorbitán [SPAN®60], triestearato de sorbitán [SPAN®65], monooleato de glicerilo, monooleato de sorbitán [SPAN®80]), ésteres de polioxietileno (por ejemplo, monoestearato de polioxietileno [MYRJ®45], aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado, aceite de ricino polietoxilado, estearato de polioximetileno y SOLUTOL), ésteres de ácidos grasos y sacarosa, ésteres de ácidos grasos y polietilenglicol (por ejemplo, CREMOPHOR), polioxietileno-éteres (por ejemplo, polioxietileno lauril éter [BRIJ®30]), poli(vinilpirrolidona), monolaurato de dietilenglicol, oleato de trietanolamina, oleato de sodio, oleato de potasio, oleato de etilo, ácido oleico, laurato de etilo, laurilsulfato de sodio, PLURONIC®F 68, POLOXAMER 188, bromuro de cetrimonio, cloruro de cetilpiridinio, cloruro de benzalconio, docusato sódico, etc., y/o sus combinaciones.

Ejemplos de agentes de unión incluyen, aunque sin limitación: almidón (por ejemplo, almidón de maíz y pasta de almidón); gelatina; azúcares (por ejemplo, sacarosa, glucosa, dextrosa, dextrina, melazas, lactosa, lactitol, manitol); gomas naturales y sintéticas (por ejemplo, goma arábiga, alginato de sodio, extracto de musgo de Irlanda, goma panwar, goma ghatti, mucílago de cáscaras de isapol, carboximetilcelulosa, metilcelulosa, etilcelulosa, hidroxietilcelulosa, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, celulosa microcristalina, acetato de celulosa, poli(vinilpirrolidona), silicato de aluminio y magnesio (VEEGUM) y arabinogalactano de alerce); alginatos; poli(óxido de etileno); polietilenglicol; sales inorgánicas de calcio; ácido silícico; polimetacrilatos; ceras; agua; alcohol; etc.; y sus combinaciones.

Conservantes ilustrativos pueden incluir: antioxidantes, agentes quelantes, conservantes antimicrobianos, conservantes antifúngicos, conservantes alcohólicos, conservantes ácidos y otros conservantes. Antioxidantes ilustrativos incluyen, aunque sin limitación: alfa tocoferol, ácido ascórbico, palmitato de ascorbilo, hidroxianisol butilado, hidroxitolueno butilado, monotioglicerol, metabisulfito de potasio, ácido propiónico, galato de propilo, ascorbato de sodio, bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio y sulfito de sodio. Agentes quelantes ilustrativos incluyen: ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido cítrico monohidrato, edetato disódico, edetato dipotásico, ácido edético, ácido fumárico, ácido málico, ácido fosfórico, edetato de sodio, ácido tartárico y edetato trisódico. Conservantes antimicrobianos ilustrativos incluyen, aunque sin limitación: cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio, alcohol bencílico, bronopol, cetrimida, cloruro de cetilpiridinio, clorhexidina, clorobutanol, clorocresol, cloroxilenol, cresol, alcohol etílico, glicerina, hexetidina, imidurea, fenol, fenoxietanol, alcohol feniletílico, nitrato fenilmercúrico, propilenglicol y timerosal. Conservantes antifúngicos ilustrativos incluyen, aunque sin limitación: butil parabeno, metil parabeno, etil parabeno, propil parabeno, ácido benzoico, ácido hidroxibenzoico, benzoato de potasio, sorbato de potasio, benzoato de sodio, propionato de sodio y ácido sórbico. Conservantes alcohólicos ilustrativos incluyen, aunque sin limitación: etanol, polietilenglicol, fenol, compuestos fenólicos, bisfenol, clorobutanol, hidroxibenzoato y alcohol feniletílico. Conservantes ácidos ilustrativos incluyen, aunque sin limitación: vitamina A, vitamina C, vitamina E, beta-caroteno, ácido cítrico, ácido acético, ácido deshidroacético, ácido ascórbico, ácido sórbico y ácido fítico. Otros conservantes incluyen, aunque sin limitación: tocoferol, acetato de tocoferol, mesilato de deteroxima, cetrimida, hidroxianisol butilado (BHA), hidroxitolueno butilado (BHT), etilendiamina, laurilsulfato de sodio (SLS), lauril éter sulfato sódico (SLES), bisulfito de sodio, metabisulfito de sodio, sulfito de potasio, metabisulfito de potasio, GLYDANT Plus®, PHENONIP®, metilparabeno, GERMALL®115, GERMABEN®II, NEOLONE™, KATHON y EUXYL. En ciertas realizaciones, el conservante es un antioxidante. En otras realizaciones, el conservante es un agente quelante.

Ejemplos de agentes tampón incluyen, aunque sin limitación: soluciones tampón de citrato, soluciones tampón de acetato, soluciones tampón de fosfato, cloruro de amonio, carbonato de calcio, cloruro de calcio, citrato de calcio, glubionato de calcio, gluceptato de calcio, gluconato de calcio, ácido D-glucónico, glicerofosfato de calcio, lactato de calcio, ácido propanoico, levulinato de calcio, ácido pentanoico, fosfato de calcio dibásico, ácido fosfórico, fosfato de calcio tribásico, hidróxido fosfato de calcio, acetato de potasio, cloruro de potasio, gluconato de potasio, mezclas de potasio, fosfato de potasio dibásico, fosfato de potasio monobásico, mezclas de fosfato de potasio, acetato de sodio, bicarbonato de sodio, cloruro de sodio, citrato de sodio, lactato de sodio, fosfato de sodio dibásico, fosfato de sodio monobásico, mezclas de fosfato de sodio, trometamina, hidróxido de magnesio, hidróxido de aluminio, ácido algínico, agua exenta de pirógenos, solución salina isotónica, solución de Ringer, alcohol etílico, etc., y sus combinaciones.

Ejemplos de agentes lubricantes incluyen, aunque sin limitación: estearato de magnesio, estearato de calcio, ácido esteárico, sílice, talco, malta, behenato de glicerilo, aceites vegetales hidrogenados, polietilenglicol, benzoato de sodio, acetato de sodio, cloruro sódico, leucina, laurilsulfato de magnesio, laurilsulfato de sodio, etc., y sus combinaciones.

Los ejemplos de aceites incluyen, aunque sin limitación: aceites de almendra, semilla de albaricoque, aguacate, babasú, bergamota, semilla de “black current”, borraja, enebro, manzanilla, colza, alcaravea, carnauba, ricino, canela, manteca de cacao, coco, hígado de bacalao, café, maíz, semilla de algodón, emú, eucalipto, onagra vespertina, pescado, linaza, geraniol, calabaza, semilla de uva, avellana, hisopo, miristato de isopropilo, jojoba, nuez de kukui, lavandín, lavanda, limón, litsea cubeba, nuez de macadamia, malva, semilla de mango, semilla de hierba de la pradera, visón, nuez moscada, oliva, naranja, pez reloj anaranjado, palma, nuez de palma, hueso de melocotón, cacahuete, semilla de amapola, semilla de calabaza, semilla de colza, salvado de arroz, romero, azafrán, sándalo, camelia sasquana, savoury, espino cerval de mar, sésamo, manteca de karité, silicona, soja, girasol, árbol del té, cardo, tsubaki, vetiver, nuez y germen de trigo. Los ejemplos de aceites incluyen, aunque sin limitación: estearato de butilo, triglicérido caprílico, triglicérido cáprico, ciclometicona, sebacato de dietilo, dimeticona 360, miristato de isopropilo, aceite mineral, octildodecanol, alcohol oleico, aceite de silicona y sus combinaciones.

Las formas farmacéuticas líquidas para administración oral y parenteral incluyen, aunque sin limitación: emulsiones, microemulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además del (de los) ingrediente(s) activo(s), las formas farmacéuticas líquidas pueden comprender diluyentes inertes usados comúnmente en la técnica, tales como, por ejemplo, agua u otros disolventes, agentes solubilizantes y emulsionantes, tales como alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilenglicol, 1,3-butilenglicol, dimetilformamida, aceites (en particular, aceites de semilla de algodón, cacahuete, maíz, germen de trigo, oliva, ricino y sésamo), glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilenglicoles y ésteres de ácidos grasos de sorbitán y sus mezclas. Además de los diluyentes inertes, las composiciones orales pueden incluir también adyuvantes tales como agentes humectantes, agentes emulsionantes y de suspensión, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes y perfumantes. En ciertas realizaciones para la administración parenteral, un ingrediente activo se puede mezclar con agentes solubilizantes, tales como Cremophor, alcoholes, aceites, aceites modificados, glicoles, polisorbatos, ciclodextrinas, polímeros y sus combinaciones.

Las preparaciones inyectables, por ejemplo, las suspensiones inyectables estériles acuosas u oleaginosas se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida usando agentes dispersantes o humectantes y agentes de puesta en suspensión adecuados. Una preparación inyectable estéril puede ser una solución inyectable estéril, una suspensión o emulsión en un diluyente o disolvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo en forma de una solución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, solución de Ringer, solución de cloruro sódico USP e isotónica. Además, se emplean convencionalmente, como medio disolvente o de suspensión, aceites fijos estériles. Para este propósito se puede emplear cualquier aceite fijo blando incluyendo mono- o di-glicéridos sintéticos. Además, en la preparación de inyectables se usan ácidos grasos, tales como ácido oleico.

Las formulaciones inyectables pueden ser esterilizadas, por ejemplo, por filtración a través de un filtro de retención de bacterias o incorporando agentes esterilizantes en forma de composiciones sólidas estériles que pueden disolverse o dispersarse en agua estéril u otro medio inyectable estéril antes de su uso.

Con el fin de prolongar el efecto de un fármaco es deseable frecuentemente ralentizar la absorción del fármaco por inyección subcutánea o intramuscular. Esto se puede lograr mediante el uso de una suspensión líquida de material cristalino o amorfo con escasa solubilidad en agua. La velocidad de absorción del fármaco depende entonces de su velocidad de disolución que, a su vez, puede depender del tamaño del cristal y la forma cristalina. Alternativamente, la absorción retardada de una forma de fármaco administrado parenteralmente se logra disolviendo o poniendo en suspensión el fármaco en un vehículo oleoso.

Las composiciones para administración rectal o vaginal son típicamente supositorios que pueden prepararse mezclando los ingredientes activos de esta invención con excipientes no irritantes adecuados, tales como manteca de cacao, polietilenglicol o una cera para supositorios que sean sólidos a temperatura ambiente, pero líquidos a la temperatura corporal y por lo tanto que se fundan en el recto o en la cavidad vaginal y liberen el ingrediente activo.

Las formas farmacéuticas sólidas para administración oral incluyen: cápsulas, comprimidos, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas farmacéuticas sólidas, el ingrediente activo se mezcla con al menos un excipiente inerte farmacéuticamente aceptable, tal como citrato de sodio o fosfato dicálcico y/o (a) cargas o extendedores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (b) aglutinantes tales como, por ejemplo, carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y goma arábiga; (c) humectantes, tales como glicerol; (d) agentes disgregantes, tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos y carbonato sódico; (e) agentes retardantes de la solución, tales como parafina; (f) aceleradores de la absorción, tales como compuestos de amonio cuaternario; (g) agentes humectantes tales como, por ejemplo, alcohol cetílico y monoestearato de glicerol; (h) absorbentes, tales como caolín y arcilla de bentonita; y/o (i) lubricantes, tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilenglicoles sólidos, laurilsulfato de sodio y sus mezclas. En el caso de las cápsulas, los comprimidos y las píldoras, la forma de dosificación puede comprender agentes tampón.

Composiciones sólidas de un tipo similar se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina blandas y duras rellenas, utilizando excipientes, tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similares. Las formas sólidas de dosificación de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Dichos recubrimientos pueden comprender opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que liberen el(los) ingrediente(s) activo(s) sólo, o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de relleno que pueden ser utilizadas incluyen sustancias polímeras y ceras. Composiciones sólidas de un tipo similar se pueden emplear como cargas en cápsulas de gelatina blandas y duras rellenas, utilizando excipientes tales como lactosa o azúcar de leche, así como polietilenglicoles de alto peso molecular y similar.

Los ingredientes activos pueden estar en forma micro-encapsulada con uno o más excipientes, como se indicó anteriormente. Las formas farmacéuticas sólidas de comprimidos, grageas, cápsulas, píldoras y gránulos se pueden preparar con recubrimientos y cubiertas, tales como recubrimientos entéricos, recubrimientos controladores de la liberación y otros recubrimientos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. En tales formas farmacéuticas sólidas, el ingrediente activo puede mezclarse con al menos un diluyente inerte, tal como sacarosa, lactosa o almidón. Tales formas farmacéuticas pueden comprender, como es práctica normal, sustancias adicionales distintas de los diluyentes inertes, por ejemplo, lubricantes de compresión y otros adyuvantes de compresión, tales como estearato de magnesio y celulosa microcristalina. En el caso de cápsulas, comprimidos y píldoras, las formas farmacéuticas pueden comprender agentes tampón. Dichos recubrimientos pueden comprender opcionalmente agentes opacificantes y pueden ser de una composición tal que libere(n) el(los) ingrediente(s) activo(s) sólo, o preferentemente, en una cierta parte del tracto intestinal, opcionalmente, de manera retardada. Ejemplos de composiciones de relleno que pueden ser utilizadas incluyen sustancias polímeras y ceras.

Las formas farmacéuticas para la administración tópica y/o transdérmica de una composición de esta invención pueden incluir pomadas, pastas, cremas, lociones, geles, polvos, soluciones, pulverizaciones, inhalaciones y/o parches. En general, un ingrediente activo se mezcla en condiciones estériles con un excipiente o cualquier conservante farmacéuticamente aceptable y/o tampones que puedan ser necesarios. Además, la presente invención contempla el uso de parches transdérmicos, que frecuentemente tienen la ventaja añadida de proporcionar liberación controlada de un ingrediente activo en el cuerpo. Tales formas farmacéuticas se pueden preparar, por ejemplo, por disolución y/o dispensación del ingrediente activo en el medio apropiado. Alternativa o adicionalmente, la velocidad puede ser controlada proporcionando una membrana controladora de la velocidad y/o dispersando el ingrediente activo en una matriz y/o gel de polímero.

Los dispositivos adecuados para uso en el suministro de composiciones farmacéuticas intradérmicas descritas en la presente memoria incluyen dispositivos de aguja corta, tales como los descritos en las patentes de EE.UU. 4.886.499; 5.190.521; 5.328.483; 5.527.288; 4.270.537; 5.015.235; 5.141.496; y 5.417.662. Las composiciones intradérmicas se pueden administrar mediante dispositivos que limitan la longitud de penetración eficaz de una aguja en la piel, tales como los descritos en la publicación del PCT WO 99/34850 y sus equivalentes funcionales. Son adecuados los dispositivos de inyección de chorro que suministran vacunas líquidas a la dermis a través de un inyector de chorro líquido y/o mediante una aguja que perfora el estrato córneo y produce un chorro que alcanza la dermis. Los dispositivos de inyección de chorro se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. 5.480.381; 5.599.302; 5.334.144; 5.993.412; 5.649.912; 5.569.189; 5.704.911; 5.383.851; 5.893.397; 5.466.220; 5.339.163; 5.312.335; 5.503.627; 5.064.413; 5.520.639; 4.596.556; 4.790.824; 4.941.880; 4.940.460; y las publicaciones del PCT WO 97/37705 y WO 97/13537. Son adecuados dispositivos balísticos de administración de polvos/partículas que utilizan gas comprimido para acelerar la vacuna en forma de polvo a través de las capas externas de la piel hasta la dermis. Alternativa o adicionalmente, se pueden usar jeringas convencionales en el método clásico de administración intradérmica de Mantoux.

Las formulaciones adecuadas para administración tópica incluyen, aunque sin limitación: preparaciones líquidas y/o semilíquidas, tales como linimentos, lociones, emulsiones de aceite en agua y/o de agua en aceite, tales como cremas, pomadas y/o pastas y/o soluciones y/o suspensiones. Las formulaciones administrables por vía tópica pueden comprender, por ejemplo, desde alrededor de 1,0% a alrededor de 10% (p/p) de ingrediente activo, aunque la concentración del ingrediente activo puede ser tan alta como el límite de solubilidad del ingrediente activo en el disolvente. Las formulaciones para administración tópica pueden comprender además uno o más de los excipientes y/o ingredientes adicionales descritos en esta memoria.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse y/o venderse en una formulación adecuada para administración pulmonar a través de la cavidad bucal. Tal formulación puede comprender partículas secas que comprenden el ingrediente activo y que tienen un diámetro en el intervalo de alrededor de 0,5 μM a alrededor de 7 μM o de alrededor de 1 μM a alrededor de 6 μM. Tales composiciones están convenientemente en forma de polvos secos para administración usando un dispositivo que comprende un depósito de polvo seco al que se puede dirigir una corriente de propulsor para dispersar el polvo y/o usando un recipiente de dispensación de disolvente/polvo autopropulsor, tal como un dispositivo que comprende el ingrediente activo disuelto y/o en suspensión en un propulsor de bajo punto de ebullición en un recipiente estanco. Tales polvos comprenden partículas en donde al menos 98% de las partículas en peso tienen un diámetro mayor de 0,5 μM y al menos 95% en número de las partículas tienen un diámetro inferior a 7 μM. Alternativamente, al menos 95% en peso de las partículas tienen un diámetro mayor de 1 μM y al menos 90% en número de las partículas tienen un diámetro inferior a 6 μM. Las composiciones de polvo seco pueden incluir un diluyente sólido en polvo fino, tal como azúcar, y se proporcionan convenientemente en una forma de unidosis.

Los propulsores de bajo punto de ebullición incluyen generalmente propulsores líquidos que tienen un punto de ebullición inferior a 18,3ºC (65ºF) a la presión atmosférica. Generalmente, el propulsor puede constituir del 50% al 99,9% (p/p) de la composición, y el ingrediente activo puede constituir de 0,1% a 20% (p/p) de la composición. El propulsor puede comprender además ingredientes adicionales tales como un tensioactivo líquido no iónico y/o sólido aniónico y/o un diluyente sólido (que puede tener un tamaño de partículas del mismo orden que las partículas que comprenden el ingrediente activo).

Las composiciones farmacéuticas de la invención formuladas para administración pulmonar pueden proporcionar el ingrediente activo en forma de gotitas de una solución y/o suspensión. Dichas formulaciones pueden prepararse, envasarse y/o venderse en forma de soluciones acuosas y/o alcohólicas diluidas y/o suspensiones, opcionalmente estériles, que comprenden el ingrediente activo, y pueden administrarse convenientemente usando cualquier dispositivo de nebulización y/o atomización. Tales formulaciones pueden comprender además uno o más ingredientes adicionales incluyendo, aunque sin limitación: un agente aromatizante, tal como sacarina sódica, un aceite volátil, un agente tampón, un agente tensioactivo y/o un conservante, tal como hidroxibenzoato de metilo. Las gotitas proporcionadas por esta vía de administración pueden tener un diámetro medio en el intervalo de alrededor de 0,1 μM a alrededor de 200 μM.

Las formulaciones descritas en la presente memoria como útiles para administración pulmonar son útiles para la administración intranasal de una composición farmacéutica de la invención. Otra formulación adecuada para administración intranasal es un polvo grueso que comprende el ingrediente activo y que tiene un tamaño de partículas medio de alrededor de 0,2 μM a 500 μM. Tal formulación se administra de la manera en que se toma el tabaco rapé, es decir, por inhalación rápida a través del conducto nasal desde un recipiente del polvo mantenido cerca de los orificios nasales.

Las formulaciones adecuadas para la administración nasal pueden comprender, por ejemplo, de alrededor de tan poco como 0,1% (p/p) y tanto como 100% (p/p) del ingrediente activo, y pueden comprender uno o más de los excipientes y/o ingredientes adicionales descritos en la presente memoria. Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse y/o venderse en una formulación adecuada para administración bucal. Dichas formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de comprimidos y/o pastillas formuladas por métodos convencionales, y pueden contener, por ejemplo, de 0,1% a 20% (p/p) de ingrediente activo, comprendiendo el resto una composición soluble y/o degradable por vía oral y, opcionalmente, uno o más de los excipientes y/o ingredientes adicionales descritos en esta memoria. Alternativamente, las formulaciones adecuadas para la administración bucal pueden comprender un polvo y/o una solución y/o suspensión en aerosol y/o atomizada que contenga el ingrediente activo. Tales formulaciones en polvo y/o en aerosol, cuando se dispersan, pueden tener un tamaño medio de partículas y/o de gotas en el intervalo de alrededor de 0,1 μM a alrededor de 200 μM, y pueden comprender además uno o más de los excipientes y/o ingredientes adicionales descritos en la presente memoria.

Una composición farmacéutica de la invención puede prepararse, envasarse y/o venderse en una formulación adecuada para administración oftálmica. Dichas formulaciones pueden, por ejemplo, estar en forma de gotas para los ojos, incluyendo, por ejemplo, una solución y/o suspensión de 0,1%/1,0% (p/p) del ingrediente activo en un excipiente líquido acuoso u oleoso. Tales gotas pueden comprender además agentes tampón, sales y/o uno o más de los otros excipientes y/o ingredientes adicionales que se describen en la presente memoria. Otras formulaciones oftálmicamente administrables que son útiles incluyen las que comprenden el ingrediente activo en forma microcristalina y/o en una preparación en liposomas. Tales formulaciones también pueden ser gotas para los oídos.

Se pueden encontrar consideraciones generales sobre la formulación y/o la fabricación de agentes farmacéuticos, por ejemplo, en la obra de Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21st ed., Lippincott Williams & Wilkins, 2005.

Administración

Por tanto, las composiciones farmacéuticas que contienen uno o más inhibidores de PAK pueden ser administradas a uno o más individuos que padecen, son propensos y/o presentan los síntomas del FXS.

Una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de PAK puede ser administrada a un sujeto y/o organismo antes, simultáneamente y/o después del diagnóstico del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. Una cantidad terapéutica de una composición farmacéutica se puede administrar a un paciente y/u organismo antes, simultáneamente y/o después de la aparición de los síntomas del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico. La cantidad de composición farmacéutica puede ser suficiente para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar usando cualquier cantidad y cualquier vía de administración eficaz para el tratamiento. La cantidad exacta requerida variará de sujeto a sujeto, dependiendo de la especie, la edad y el estado general del sujeto, la gravedad de la infección, la composición particular, su modo de administración, su modo de actividad y similares. Las composiciones de la invención se formulan típicamente en formas farmacéuticas unidosis para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. Se entenderá, sin embargo, que el uso diario total de las composiciones de la presente invención será decidido por el médico encargado del caso dentro del alcance del criterio médico fundado. El nivel de dosis terapéuticamente eficaz para cualquier sujeto u organismo particular dependerá de una variedad de factores incluyendo el trastorno a tratar y la gravedad del trastorno, la actividad del ingrediente activo específico empleado; la composición específica empleada; la edad, el peso corporal, la salud general, el sexo y la dieta del sujeto; el tiempo de administración, la vía de administración y la velocidad de excreción del ingrediente activo específico empleado; la duración del tratamiento; los fármacos utilizados en combinación o coincidentes con el ingrediente activo específico empleado; y factores similares bien conocidos en las técnicas médicas.

Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por cualquier vía. Las composiciones farmacéuticas pueden ser administradas por una variedad de vías, incluyendo: oral, intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intramedular, intratecal, parenteral, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (por ejemplo, por polvos, pomadas, cremas, geles y/o gotas), transdérmica, mucosal, nasal, bucal, enteral, sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o por inhalación; y/o como una pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol. Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía intravenosa. Las composiciones de la invención se pueden administrar por vía oral. Las composiciones de la invención se pueden administrar por goteo intravenoso continuo. Las composiciones de la invención se pueden administrar por inyección retro-orbital.

Las composiciones de la invención se pueden administrar usando una bomba. Una bomba que se utiliza de acuerdo con la invención puede ser una bomba externa. Una bomba que se utiliza de acuerdo con la invención puede ser una bomba que se implanta dentro del cuerpo de un sujeto. Una bomba que se utiliza de acuerdo con la invención puede ser una bomba mecánica y/o una bomba osmótica.

En general, la vía más adecuada de administración dependerá de una variedad de factores, incluyendo la naturaleza de la composición (por ejemplo, su estabilidad en el entorno del tracto gastrointestinal), el estado del sujeto (por ejemplo, si el sujeto es capaz de tolerar la administración oral), etc.

Una composición se puede administrar en cantidades que van desde alrededor de 0,001 mg/kg a alrededor de 100 mg/kg, desde alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 50 mg/kg, desde alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 40 mg/kg, desde alrededor de 0,5 mg/kg a alrededor de 30 mg/kg, desde alrededor de 0,01 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg, desde alrededor de 0,1 mg/kg a alrededor de 10 mg/kg o de alrededor de 1 mg/kg a alrededor de 25 mg/kg de peso corporal del sujeto al día, una o más veces al día, para obtener el efecto terapéutico deseado. La dosis deseada se puede administrar tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, cada dos días, cada tres días, cada semana, cada dos semanas, cada tres semanas o cada cuatro semanas. La dosis deseada se puede administrar utilizando múltiples administraciones (por ejemplo, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce o más administraciones).

Se apreciará que los agentes terapéuticos y composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden emplear en terapias de combinación. Por ejemplo, composiciones de la invención que comprenden "cócteles terapéuticos". La combinación particular de terapias (agentes terapéuticos o procedimientos) a emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos deseados y/o los procedimientos y el efecto terapéutico que se desea alcanzar. Se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo propósito. Por ejemplo, un inhibidor de PAK puede administrarse junto con otro agente que se usa para el tratamiento de los síntomas del FXS y/u otro trastorno del desarrollo neurológico. Las terapias empleadas pueden lograr diferentes efectos (por ejemplo, control de cualesquiera efectos secundarios adversos).

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar solas o en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos. Por la frase "en combinación con", no se pretende dar a entender que los agentes deben ser administrados al mismo tiempo y/o formulados para la administración conjunta, aunque estos métodos de administración están dentro del alcance de la invención. Las composiciones se pueden administrar simultáneamente, antes o después, que uno o más de otros agentes terapéuticos o procedimientos médicos deseados. En general, cada agente se administrará en una dosis y/o en un programa de tiempo determinado para ese agente. Adicionalmente, la invención abarca la administración de las composiciones farmacéuticas de la invención en combinación con agentes que pueden mejorar su biodisponibilidad, reducir y/o modificar su metabolismo, inhibir su excreción y/o modificar su distribución en el cuerpo.

La combinación particular de terapias (agentes terapéuticos y/o procedimientos) a emplear en un régimen de combinación tendrá en cuenta la compatibilidad de los agentes terapéuticos y/o procedimientos deseados y/o el efecto terapéutico deseado a conseguir. Se apreciará que las terapias empleadas pueden lograr un efecto deseado para el mismo trastorno (por ejemplo, un agente de la invención se puede administrar simultáneamente con otro agente terapéutico usado para tratar el mismo trastorno) y/o pueden conseguir efectos diferentes (por ejemplo, control de cualesquiera efectos secundarios adversos). Las composiciones de la invención se pueden administrar con un segundo agente terapéutico que esté aprobado por la Food and Drug Administration de EE.UU.

Además, se apreciará que los agentes terapéuticamente activos utilizados en combinación se pueden administrar juntos en una sola composición o por separado en diferentes composiciones.

En general, se espera que los agentes utilizados en combinación sean utilizados a niveles que no excedan los niveles en los que se utilizan individualmente. En algunas realizaciones, los niveles utilizados en combinación serán más bajos que los utilizados individualmente.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden administrar solas y/o en combinación con otros agentes que se utilizan para tratar los síntomas del FXS. En algunas realizaciones, dichos agentes pueden tratar convulsiones y/o inestabilidad del estado de ánimo, incluyendo, aunque sin limitación: carbamazepina (TEGRETOL®), ácido valproico, Divalproex (DEPAKOTE®), carbonato de litio, gabapentina (NEURONTIN®), lamotrigina (LANUCTAL®), topiramato (TOPAMAX®), tiagabina (GABITRIL®), vigabatrina (SABRIL®), fenobarbital, primidona (MYSOLINE®) y/o fenitoína (DILANTIN®).

En algunas realizaciones, dichos agentes pueden ser estimulantes del sistema nervioso central, incluyendo aunque sin limitación: metilfenidato (RITALIN®), dextroanfetamina (DEXEDRINE®; ADDERALL®), ditropan (CONCERTA®), Lacetil-carnitina, venlafaxina (EFFEXOR®), nefazodona (SERZONE®), amantadina (SYMMETREL®), bupropión (WELLBUTRIN®), desipramina, imipramina y/o buspirona (BUSPAR®).

En algunas realizaciones, dichos agentes pueden ser fármacos antihipertensores, incluyendo aunque sin limitación clonidina (CATAPRES®) y/o guanfacina (TENEX®).

En ciertas realizaciones, dichos agentes pueden incluir ácido fólico.

En algunas realizaciones, tales agentes pueden ser inhibidores seleccionados de la recaptación de serotonina, incluyendo aunque sin limitación: fluoxetina (PROZAC®), sertralina (ZOLOFT®) y/o citalopram (CELEXA®).

Dichos agentes pueden ser antipsicóticos, incluyendo aunque sin limitación: risperidona (RISPERIDAL®), olanzepina (ZYPREXA®) y/o quetiapina (SEROQUEL®).

Dichos agentes pueden ser utilizados para tratar trastornos del sueño, incluyendo aunque sin limitación: desirel (TRAZODONE®) y/o melatonina.

Además se apreciará que los agentes terapéuticamente activos utilizados en combinación se pueden administrar juntos en una sola composición o por separado en diferentes composiciones.

Los inhibidores de PAK de la invención se pueden administrar en combinación con uno o más de otros moduladores de PAK.

Kits

En la presente memoria se describen una variedad de kits que comprenden uno o más de los inhibidores de PAK, por ejemplo, kits que comprenden al menos un inhibidor de PAK e instrucciones de uso. Un kit puede comprender múltiples y diferentes inhibidores de PAK. Un kit puede comprender cualquiera de una serie de componentes adicionales o reactivos en cualquier combinación.

Un kit puede incluir, por ejemplo, (i) un inhibidor de PAK; (ii) las instrucciones para la administración del inhibidor de PAK a un sujeto que padece, es propenso y/o presenta los síntomas del FXS y/u otros trastornos del desarrollo neurológico para tratar, aliviar, mejorar, atenuar, retrasar la aparición, inhibir la progresión, reducir la gravedad y/o reducir la incidencia de uno o más síntomas o características del FXS y/u otros trastorno del desarrollo neurológico en el ratón.

Los kits incluyen típicamente instrucciones para el uso de inhibidores de PAK de la invención. Las instrucciones pueden, por ejemplo, comprender los protocolos y/o describir las condiciones para la identificación de inhibidores de PAK, la administración de inhibidores de PAK a un sujeto que lo necesite, etc. Los kits incluyen generalmente uno o más envases o recipientes para que todos o algunos de los componentes individuales y reactivos puedan ser alojados por separado. Los kits también pueden incluir un medio para encerrar envases individuales en confinamiento relativamente estanco para la venta comercial, por ejemplo, una caja de plástico, en la que puedan estar contenidas las instrucciones, materiales de envasado, tales como espuma de poliestireno, etc. En el kit, o en uno o más de los envases o recipientes incluidos en dicho kit, pueden estar presentes un identificador, por ejemplo, un código de barras, una etiqueta identificadora por radiofrecuencia (ID), etc. Se puede utilizar un identificador, por ejemplo, para identificar de forma única el kit con fines de control de calidad, control de inventarios, seguimiento, movimiento entre los puestos de trabajo, etc.

Ejemplificación

Los ejemplos representativos que siguen están destinados a ayudar a ilustrar la invención, y no pretenden ni deben interpretarse como limitativos del alcance de la invención. En efecto, diversas modificaciones de la invención y de muchas de sus realizaciones adicionales, además de las mostradas y descritas en la presente memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de los contenidos completos de este documento, incluyendo los ejemplos que siguen y las referencias a la literatura científica y de patentes citadas en esta memoria.

Los siguientes ejemplos contienen información adicional importante, ilustración y directrices que pueden ser adaptadas a la práctica de esta invención en sus diversas realizaciones y sus equivalentes. Se apreciará, sin embargo, que estos ejemplos no limitan la invención.

Los estudios previos han asociado sistemáticamente con retraso mental anomalías en el número y tamaño de las sinapsis. En pacientes con FXS y en ratones FMR1 KO, las neuronas corticales muestran más espinas dendríticas postsinápticas y una mayor proporción de espinas más largas y más delgadas en comparación con las de los individuos normales. Los ratones FMR1 KO presentan LTP cortical reducida en comparación con los ratones de tipo natural. Sorprendentemente, las anomalías en la morfología y la plasticidad sináptica cortical de ratones FMR1 KO son opuestas a las observadas en ratones transgénicos (dnPAK TG) en los que la actividad de quinasa activada por p21 (PAK) es inhibida por su forma negativa dominante (dnPAK), específicamente en el cerebro anterior postnatal. En los ratones dnPAK TG, se encontró que las neuronas corticales muestran menos espinas dendríticas y una proporción inferior de espinas más largas y más delgadas en comparación con las de los ratones de tipo natural (Hayashi et al., 2004, Neuron, 42:773). Estos ratones transgénicos presentan un aumento de LTP cortical, en contraste con la reducción de la LTP cortical en ratones FMR1 KO. Una hipótesis que pueden explicar estos resultados es que las vías de señalización mediadas por PAK y FMR1 pueden antagonizarse entre sí para regular la morfología y la función sináptica, y esta hipótesis fue analizada en los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1: La inhibición de PAK restaura las anomalías morfológicas espinales en ratones FMR1 KO.

Materiales y métodos

Análisis de Golgi

Siguiendo la técnica de Golgi-Cox (Ramón-Moliner, 1970, Contemporary Research Methods in Neuroanatomy, Springer, Berlin, Heidelberg, New York) se obtuvieron cortes en serie de 120 μm de espesor de cerebros de ratones machos de dos meses de la misma camada. Los portaobjetos que contenían estos cortes fueron codificados antes del análisis cuantitativo y el código de los tubos se eliminó solamente después de completarse el análisis. Las neuronas piramidales de las capas II/III de la corteza temporal fueron visualizadas bajo un microscopio Olympus BX61 en posición vertical con la platina XY motorizada usando el programa informático Neurolucida/estereología (Microbrightfield). En cada rama dendrítica apical primaria se analizaron diez segmentos dendríticos consecutivos de 10 μm de largo para cuantificar la densidad espinal. Para asegurar la consistencia del muestreo entre el análisis de Golgi y los experimentos de electrofisiología, los análisis de la corteza temporal se realizaron todos en cortes o secciones correspondientes a las Figuras 62 - 67 del atlas del cerebro de ratón (Franklin et al., The mouse brain in stereotaxic coordinates, Academic, San Diego, CA, 1997).

Microscopía electrónica

Se anestesiaron dos ratones machos de dos meses de la misma camada y se perfundieron de acuerdo con métodos estándares. Luego se insertan bloques de corteza temporal, de los cuales se prepararon cortes de 1 μm de espesor y se tiñeron con azul de toluidina al 1% para guiar el recorte adicional para aislar las capas II/III de la corteza temporal. Luego se prepararon cortes ultrafinos de 90 nm y se tiñeron con acetato de uracilo y citrato de plomo. Se fotografiaron con 10.000 aumentos zonas del neuropilo seleccionadas aleatoriamente con un microscopio electrónico JEOL 1200EX. Los negativos de las imágenes se escanearon a 1200 puntos por pulgada (dpi) y se analizaron con el programa Open Lab (Improvision). Las espinas que llevaban sinapsis excitadoras fueron definidas por la presencia de una densidad postsináptica (PSD) nítida frente a al menos tres vesículas presinápticas. Se analizaron las micrografías que cubrían regiones del neuropilo de 500 μm2 - 1000 μm2 de cada ratón y se usaron para cuantificación. Se cuantificaron la longitud y porcentaje de las PSD de las sinapsis perforadas de la misma población de sinapsis. Las medidas fueron realizadas por un experimentador desconocedor del genotipo.

Resultados

Puesto que la anomalía espinal es una característica patológica distintiva en pacientes con el FXS y en los ratones FMR1 KO, se examinó en el nivel celular la morfología dendrítica espinal midiendo la densidad espinal en las dendritas apicales de las neuronas piramidales de las capas II/III por análisis de tinción de Golgi de la corteza temporal de ratones dMT, así como de sus compañeros de camada, dnPAK TG, FMR1 KO y ratones de tipo natural. Se cuantificó el número de espinas por cada 10 μm de segmentos dendríticos dispuestos próximos a la parte distal del soma neuronal. En segmentos dendríticos próximos, la densidad espinal fue menor en ratones dnPAK TG comparada con la de ratones de tipo natural, mientras que fue superior en ratones FMR1 KO comparada con la de ratones de tipo natural (Figuras 10 y 11). En contraste, la densidad espinal en ratones dMT fue comparable a la de los ratones de control de tipo natural en todos los segmentos dendríticos, excepto en los segmentos 7 y 8 (Figura 11). Cuando se halló la media de todos los segmentos, la densidad espinal media en ratones dMT fue significativamente inferior a la de los ratones FMR1 KO y significativamente superior a la de los ratones dnPAK TG (Figura 12). Estos resultados indican que la inhibición de PAK restaura parcialmente la anomalía de la densidad espinal en ratones FMR1 KO.

Además de una mayor densidad espinal, las neuronas corticales de pacientes con FXS y ratones FMR1 KO presentan una mayor longitud espinal (Hinton et al., 1991, Am. J. Med. Genet., 41:289; Comery et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 94:5401; Irwin et al., 2001, Am. J. Med. Genet., 98:161; y McKinney et al., 2005, Am. J. Med. Genet. B. Neuropsychiatr. Genet., 136:98). Para investigar si dnPAK puede también restaurar esta anomalía, se midió en cuatro genotipos la longitud espinal (la distancia radial desde la punta de la cabeza de la espina al árbol dendrítico) de neuronas piramidales por análisis de tinción de Golgi. En gráficos de frecuencias acumulativas, las neuronas de ratones FMR1 KO exhibieron un desplazamiento significativo en la distribución espinal global hacia las espinas de mayor longitud en comparación con el de las neuronas de tipo natural, mientras que las neuronas de ratones dnPAK TG exhibieron el desplazamiento opuesto hacia las espinas más cortas (Figura 13). En contraste, la distribución de longitudes espinales de las neuronas dMT se solapaba bien con la de las neuronas de tipo natural (Figura 13), lo que indica que la inhibición de PAK es suficiente para restaurar la anomalía de la longitud espinal cortical en ratones FMR1 KO.

Ejemplo 2: La inhibición de PAK restaura la LTP cortical reducida en ratones FMR1 KO.

Materiales y métodos

Electrofisiología

Se prepararon cortes microscópicos del cerebro coronal de ratones machos de tres meses de la misma camada, que contenían la corteza temporal y se dejaron recuperar, al menos 1 hora antes del registro en líquido cefalorraquídeo artificial caliente (30°C) oxigenado (95% de O2 y 5% de CO2) que contenía NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 26 mM y dextrosa 10 mM. Los potenciales de campo (FP) en las capas II/III provocados por estimulación de la capa IV se midieron como se ha descrito anteriormente (Hayashi et al., 2004, Neuron 42:773) y las respuestas se cuantificaron como la amplitud de FP en la corteza. La LTP fue inducida por TBS, que consistía en ocho ráfagas breves (cada una con 4 pulsos a 100 Hz) de estímulos suministrados cada 200 milisegundos.

Resultados

Se ha demostrado que la potenciación cortical a largo plazo (LTP) está reducida en ratones FMR1 KO, mientras que está aumentada en ratones dnPAK TG (Li et al., 2002, Mol. Cell. Neurosci., 19:138; Zhao et al., 2005, J. Neurosci., 25:7385; y Hayashi et al., 2004, Neuron, 42:773). Para determinar el efecto de la inhibición de PAK sobre la transmisión y plasticidad sinápticas corticales en ratones FMR1 KO, se llevaron a cabo registros del campo extracelular en las sinapsis de las capas II/III de la corteza temporal al mismo tiempo que se estimulaba la capa IV. La transmisión sináptica basal, como se mide por las respuestas al potencial de campo para una gama de intensidades de estímulos, no difería entre los cuatro genotipos (Figura 14A). Sin embargo, como era de esperar, la administración de estimulación por ráfagas zeta (TBS) a 100 Hz produjo una LTP de magnitud inferior en ratones FMR1 KO que en ratones de tipo natural y una LTP de magnitud superior en ratones dnPAK TG que en ratones de tipo natural (Figura 14B). En contraste, la magnitud de LTP fue indistinguible entre ratones dMT y los ratones de control de tipo natural en diversos momentos después de la aplicación del estímulo (Figura 14B). Esto demuestra que la inhibición de PAK restaura los defectos de la LTP en ratones FMR1 KO.

Ejemplo 3: La inhibición de PAK restaura múltiples defectos conductuales en ratones FMR1 KO.

Materiales y Métodos

Ensayo en campo abierto

Se sometieron al ensayo en campo abierto a ratones machos de dos meses de la misma camada de acuerdo con métodos estándares. Cada ratón corrió durante 10 minutos en una cámara con monitor de actividad VersaMax (Accuscan Instruments). La actividad en campo abierto se detectó por interrupción de rayos de luz y se analizó por el programa informático VersaMax. Se registró la estereotipia cuando el ratón interrumpió repetidamente el mismo rayo (o conjunto de rayos). El recuento de estereotipia es el número de interrupciones de rayos que ocurre durante este periodo de actividad estereotípica.

Tarea de condicionamiento del miedo vestigial

Se sometieron ratones machos de tres meses de la misma camada a condicionamiento del miedo vestigial como se ha descrito previamente (Zhao et al., 2005, J. Neurosci., 25:7385). En el día 1, los ratones se colocaron en la cámara de entrenamiento (Cámara A, de Coulbourn Instruments) durante 60 segundos antes de la iniciación de un tono blanco de 15 segundos (estímulo condicionado o CS). 30 segundos más tarde, los ratones recibieron una descarga eléctrica de 1 segundo (intensidad 0,7 mA; estímulo no condicionado o US). Por tanto, una prueba se compone de tono (CS), tiempo en blanco de 30 segundos (también llamado "tiempo vestigial") y luego descarga eléctrica (US). Se realizaron siete pruebas con un intervalo entre pruebas (ITI) de 210 segundos para permitir que los ratones aprendieran la asociación entre tono y descarga eléctrica a través de un periodo de tiempo. Para examinar si los ratones recordaban esta asociación, el día 2 los ratones fueron colocados en una nueva cámara (Cámara B) con una forma y olor diferentes de los de la Cámara A. Después de 60 segundos, se repitió siete veces un tono de 15 segundos con un ITI de 210 segundos. Se digitalizaron las imágenes de video y se analizaron los porcentajes del tiempo de congelación durante cada ITI por el programa informático Image FZ (O’Hara & Co). La congelación se definió como la ausencia de todos los movimientos, excepto el movimiento respiratorio, durante un periodo de 1 segundo.

Resultados

La inhibición de PAK restaura múltiples defectos conductuales en ratones FMR1 KO.

Para analizar si la restauración parcial de la morfología espinal y la restauración completa de la LTP cortical por inhibición de PAK podían mejorar los déficits conductuales presentes en ratones FMR1 KO, dichos ratones de diversos genotipos se sometieron a una serie de tareas conductuales. En un ensayo en campo abierto en el que los ratones se colocan en una caja y se les permite correr libremente durante diez minutos, los ratones FMR1 KO exhibieron tres conductas anómalas en comparación con las de los ratones de tipo natural (Peier et al., 2000, Hum. Mol. Genet., 9:1145). (1) Hiperactividad: los ratones se desplazaron una mayor distancia y se movieron durante un mayor periodo de tiempo (Figura 15); (2) estereotipia: los ratones exhibieron un mayor número de conductas repetidas (Figura 15); y (3) hipoansiedad: los ratones permanecieron en el campo central durante un mayor periodo de tiempo y en las esquinas del campo durante un periodo más corto de tiempo (Figura 15). En las tres conductas, los ratones dMT presentaron una prestación comparable a la de los ratones de control de tipo natural (Figura 15). Esto indicó que la inhibición de PAK en ratones FMR1 KO restaura la locomoción, la conducta repetida y la ansiedad a los niveles de los de tipo natural.

Para examinar adicionalmente si la inhibición de PAK puede restaurar las conductas anómalos dependientes de la corteza se realizó la tarea de condicionamiento del miedo vestigial, que es un ensayo que depende de la integridad de la corteza prefrontal y es sensible a los estímulos que distraen la atención (McEchron et al., 1998, Hippocampus, 8:638; y Han et al., 2003, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 100:13087). Se había mostrado previamente que los ratones FMR1 KO están alterados en esta forma de condicionamiento, que puede relacionarse con los déficits de atención de los pacientes con FXS (Zhao et al., 2005, J. Neurosci., 25:7385). En esta tarea, una prueba de condicionamiento estaba compuesta de un tono (como estímulo condicionado o CS), luego un periodo de tiempo de 30 segundos (también llamado "tiempo vestigial") y finalmente una descarga eléctrica (como estímulo no condicionado o US). Se hicieron siete pruebas para permitir que los ratones aprendieran la asociación entre el tono y la descarga eléctrica en el periodo de tiempo de 30 segundos. Los ratones que aprenden y recuerdan esta asociación permanecerán inmóviles (o "congelados") en respuesta al tono, incluso cuando se colocan en una nueva cámara con una forma y olor diferentes comparados con los de la cámara de entrenamiento. Durante el entrenamiento, los cuatro genotipos exhibieron cantidades comparables de congelación en todas las pruebas de condicionamiento (Figura 16), lo que sugiere una adquisición normal de la memoria. Sin embargo, cuando se colocaron en una nueva cámara 24 horas después del entrenamiento, tanto los ratones FMR1 KO como los ratones dnPAK TG exhibieron una reducción significativa en la congelación inducida por el tono en comparación con la de los ratones de control de tipo natural (Figura 16), lo que indica una memoria del miedo vestigial alterada en estos dos genotipos. Los ratones dMT también mostraron déficits de congelación durante las primeras sesiones del tono (sesiones 1 a 4) comparados con los de los controles de tipo natural (Figura 16), aunque los déficits durante estas sesiones fueron, por término medio, menos pronunciados comparados con los de los ratones dnPAK TG o FMR1 KO (Figura 17). Sin embargo, con sesiones de tonos adicionales (sesiones 5 a 7), la congelación por dMT llegó a la de los ratones de tipo natural mientras que su diferencia de los ratones FMR1 KO casi alcanzó significación estadística (p = 0,07, Figura 17). Por tanto los ratones dMT son lentos en expresar la memoria y/o requieren una repetición de la entrada de memoria (tono), pero finalmente (después de 5 sesiones de tono) recuperan la memoria al nivel que no es significativamente diferente del nivel de los ratones de tipo natural.

Ejemplo 4: La PAK 1 y FMRP interaccionan físicamente.

Materiales y métodos

Manipulación de animales, diseño experimental y análisis de datos

Todos los ratones son de la raza C57BL6. Los ratones FMR1 KO se obtuvieron del Dr. Steven Warren. Los ratones dnPAK TG fueron generados previamente (Hayashi et al., 2004, Neuron, 42:773). El mantenimiento de los ratones y todos los métodos experimentales se realizaron cumpliendo con las directrices del National Institute of Health de EE.UU. Todos los experimentos se realizaron de un modo ciego. A menos que se especifique otra cosa, los datos fueron analizados con el programa informático Statview (SAS) usando el ensayo ANOVA de una vía seguido por el ensayo post hoc de la diferencia significativa menos protegida de Fisher (PLSD). Los valores se representan como los valores medios ± el error típico de la media (SEM).

lnmunoprecipitación y transferencia de Western

Se homogeneizaron cerebros de ratones en tampón de homogeneización enfriado con hielo (sacarosa 0,32 M; Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 5 mM; tabletas de cóctel inhibidor de proteasa completo (Roche)) y se centrifugaron a 1.000 x g durante 10 minutos a 4ºC. El líquido sobrenadante se recogió y se centrifugó a 21.000 x g durante 15 minutos a 4ºC. El sedimento se volvió a poner en suspensión en tampón TE (Tris-HCl 10 mM, pH 7,4; EDTA 5 mM) y se añadió una novena parte del volumen del tampón DOC frío (Tris-HCl 500 mM, pH 9,0; desoxicolato sódico al 10%). La mezcla se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 30 minutos mientras se agitaba y mezclaba con la novena parte de un volumen de tampón T (Triton X-100 al 1%; desoxicolato sódico al 1%; Tris-HCl 500 mM, pH 9,0). El extracto de membrana se dializó contra el tampón de unión/diálisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4; Triton X-100 al 0,1%) a 4ºC durante una noche.

Para la inmunoprecipitación, el extracto de membrana dializado se pre-clarificó con perlas de proteína A-Sepharose, luego se incubó con a-PAK1 (N-20 de Santa Cruz Biotech) o un suero de control de conejo (Sigma) en tampón de unión/diálisis durante 3 horas, y luego se incubó con perlas de proteína A-Sepharose durante la noche a 4ºC. Para analizar la especificidad de unión, se incubó también a-PAK1 con su correspondiente péptido de bloqueo (Santa Cruz Biotech) antes de la incubación con el extracto de membranas. Las perlas se lavaron tres veces con el tampón de unión/diálisis.

Las proteínas que se unen a las perlas se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a análisis de transferencia de Western. Para las transferencias de Western de PAK1, la membrana se bloqueó en leche al 10%, después se incubó con un anticuerpo a-PAK1 diluido a 1:1000, luego se incubó con peroxidasa de rábano silvestre (HRP, Sigma) conjugada con a-inmunoglobulina de conejo diluida a 1:1000, y luego se desarrolló con el kit de aumento de la quimioluminiscencia (ECL) Renaissance (New England Nuclear). Para las transferencias de Western de FMRP, la membrana se procesó con el sistema de amplificación de transferencias Blast (Perkin Elmer) con un a-anticuerpo de FMRP (Chemicon) diluido a 1:1000, a-anticuerpo biotinilado de ratón diluido a 1:1000 y estreptavidina-HRP diluido a 1:1000.

Ensayos desplegables con GST

Se compró a Pharmacia el plásmido GEX6p-1 que codifica la GST. El plásmido GST-PAK1 se obtuvo del Dr. Joe Kissil (Kissil et al., 2003, Mol. Cell, 12:841). Los plásmidos que codifican FMRP y sus mutantes se obtuvieron del Dr. Edouard Khandjian (Mazroui et al., 2003, Hum. Mol. Genet., 12:3087). Las proteínas GST y GST-PAK1 se expresaron en E. coli BL21, se purificaron en perlas de glutatión-Sepharose 4B (GS4B) (Pharmacia) y se dializaron con PBS durante una noche. La FMRP y sus mutantes se tradujeron in vitro con el kit del sistema de lisado de reticulocitos acoplado a TNT (Promega) y se marcaron con tRNA Transcend (Promega). La GST o GST-PAK1 se incubó con FMRP o sus mutantes en tampón de unión (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5; NaCl 120 mM; MgCl210 mM; glicerol al 5%; Triton X-100 al 1%) durante 3 horas. Se añadieron perlas de GS4B y se incubaron durante 1 hora. Las perlas se lavaron tres veces con el tampón de unión. Las proteínas que se unieron a las perlas se separaron por SDS-PAGE, se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa y se sometieron a análisis de transferencia de Western. Para detectar FMRP o sus mutantes traducidos in vitro, se bloqueó la membrana, se incubó con estreptavidina-HRP, se lavó y se reveló con el kit ECL Renaissance.

Resultados

Los datos morfológicos, electrofisiológicos y conductuales presentados en los Ejemplos 1 a 3 demuestran que la inhibición de PAK restaura (al menos parcialmente) múltiples anomalías en ratones FMR1 KO. Para comenzar a entender el mecanismo subyacente, se determinó si PAK1 y FMRP interaccionan físicamente a través de inmunoprecipitación seguida por análisis de transferencia de Western. Puesto que PAK1 y FMRP están ambas localizadas en las sinapsis (Weiler et al., 1997, Proc. Natl. Acad Sci., USA., 94:5395; y Hayashi et al., 2004, Neuron, 42:773) se preparó un extracto de membranas enriquecidos en sinapsis a partir de cerebro de ratón y el extracto se sometió a inmunoprecipitación con un anticuerpo de PAK1 (a-PAK1). Las proteínas que puedan co-precipitar por su interacción directa o indirecta con PAK1 se separaron por SDS-PAGE y se sometieron a análisis de transferencia de Western con un anticuerpo FMRP. Se observó inmuno-reactividad con FMRP en inmunoprecipitados de PAK1 pero no en los inmunoprecipitados del suero de control (Figura 18). Esta interacción es específica, ya que no se produce cuando el anticuerpo de PAK1 se pre-incubó con un péptido de bloqueo, que compite con PAK 1 para la unión al anticuerpo de PAK1, antes de la inmunoprecipitación (Figura 18). Este resultado muestra que las PAK1 y FMRP endógenas interaccionan, directa o indirectamente, en el cerebro.

Para examinar si PAK1 interacciona directamente con FMRP, se realizó un ensayo desplegable con glutatión-Stransferasa (GST) en el cual se incubó FMRP traducida in vitro con GST o PAK1 etiquetada con GST (GST-PAK1). La GST-PAK1, pero no la GST sola, se unió a FMRP (Figuras 19 y 20), lo que sugiere una interacción directa entre PAK1 y FMRP. FMRP contiene un sitio de fosforilación primario en la Ser 499 y tres dominios de unión a RNA (KH1, KH2 y RGG) que se conservan entre especies (Figura 21; O'Donnell and Warren, 2002, Annu. Rev. Neurosci., 25:315; y Ceman et al., 2003, Hum. Mol. Genet., 12:3295). Para cartografiar la región de unión a PAK1 en FMRP, se utilizó una serie de mutantes por deleción o puntuales de FMRP en el ensayo desplegable con GST. Un mutante de FMRP sin la caja RGG (LRGG) o dominio de fosforilación que contiene la Ser 499 (LS499) todavía era capaz de unirse a PAK1, mientras que un mutante de FMRP sin dominios KH (LKH) o con una mutación puntual en el dominio KH2 encontrada previamente en un ser humano con FXS grave (1304N; Feng et al., 1997, Mol. Cell, 1:109) era incapaz de unirse a PAK1 (Figuras 20 y 21). Estos resultados muestran que PAK1 se une directamente a FMRP y esta interacción requiere la integridad de los dominios KH de FMRP.

Ejemplo 5: LTD mediada por mGluR en el hipocampo

La depresión a largo plazo (LTD) mediada por los receptores de glutamato metabotrópicos (mGluR) se puede medir en el hipocampo. Se prepararon cortes del hipocampo en tampón de disección enfriado con hielo (sacarosa 212 mM, KCl 2,6 mM, NaH2PO4 1,25 mM, NaHCO3 26 mM, MgCl2 5 mM, CaCl2 0,5 mM y dextrosa10 mM) y se dejaron recuperar durante 1 hora - 5 horas antes del registro en líquido cefalorraquídeo artificial (ACSF, NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 26 mM, dextrosa 10 mM) caliente a 30ºC y oxigenado (95% de O2 y 5% de CO2). Los potenciales de campo (FP) en el estrato radiado de la zona CA1 son provocados por un pulso de corriente de 200 μsegundos a los axones colaterales de Schaffer. Las respuestas estables en la línea base se recogieron cada 30 segundos para una intensidad de estimulación (10 !A - 30 μA) que produce un 50% - 60% de la respuesta máxima. La mGluR-LTD es inducida por una aplicación de 5 minutos del agonista de mGluR 3,5-dihidroxifenilglicina (DHPG; a 100 μM) y/o mediante el uso de estimulación de baja frecuencia con pulsos emparejados que consiste en 900 pares de estímulos suministrados a 1 Hz en presencia del antagonista del receptor N-metil-D-aspartato (NMDAR) ácido D-(-)-2-amino-5-fosfono-pentanoico (D-APV; a 50 μM). El DHPG es un compuesto quiral y mGluR-LTD puede ser inducido por aplicación de RS-DHPG y S-DHPG, pero típicamente no por aplicación de R-DHPG. La pendiente inicial del potencial de campo se registra como un indicador de la fuerza sináptica.

Ejemplo 6: Corrientes sinápticas mediadas por AMPAR o NMDAR en la corteza

Las corrientes sinápticas mediadas por los receptores de AMPA (AMPAR) y/o los NMDAR se pueden medir en la corteza. Para la medición de la corriente postsináptica en miniatura (mEPSC) mediada por AMPAR se añaden a un baño de ACSF tetrodotoxina 1 μM, APV 100 μM y bicuculina 10 μM. Las células se mantienen a -80 mV y los registros se hacen a 30ºC. Se recogen trazados continuos de 30 milisegundos - 60 milisegundos intervalos de 8 segundos y se filtran a 2 KHz. Las células con resistencia en serie � 13 se desechan. La medición de la relación NMDAR-EPSC/AMPAR-EPSC se realiza en ACSF que contiene Mg2+ 2mM, bicuculina 10 μM y glicina 50 μM. Las respuestas dependientes de NMDAR y las respuestas dependientes de AMPAR son discriminadas sobre la base de sus diferentes cinéticas y dependencia del voltaje. Así, la respuesta mediada por NMDAR se valora como las corrientes registradas a +40 mV y se midió 100 milisegundos después de la iniciación de la respuesta. La respuesta mediada por AMPAR se toma de la respuesta de amplitud máxima registrada a -80 mV.

Ejemplo 7: Morfología espinal en ratones dnPAK TG y FMR1 KO.

La morfología espinal en ratones dnPAK TG, FMR1 KO (ratones "dMT") es en gran medida normal en comparación con la de los ratones de tipo natural, lo que indica que las vías de señalización mediadas por PAK y FMRP se antagonizan entre sí para regular la morfogénesis espinal. Se sabe que FMRP se une al mRNA que codifica Rac1, el activador situado aguas arriba de PAK, y antagoniza el efecto de Rac1 en el desarrollo dendrítico en Drosophila. Si en el ratón FMRP se une y posteriormente reprime la traducción del mRNA de Rac1, la eliminación de FMR1 daría como resultado mayores niveles de Rac1 y un aumento de la señalización mediada por Rac1/PAK. Por tanto, en ratones dMT, la señalización mediada por Rac1/PAK se invertiría al nivel de la del ratón de tipo natural por eliminación de FMR1 y la inhibición de PAK simultáneas, lo que conduce a dinámicas de actina y morfogénesis espinal normales.

Ejemplo 8: Análisis de FMRP en la represión de la traducción de mRNA de Rac1, PAK1, PAK2 y/o PAK3.

Además de una interacción de señalización indirecta entre PAK y FMRP, posiblemente a través de la capacidad de FMRP para unirse y reprimir la traducción del mRNA de Rac1, FMRP puede unirse directamente y reprimir la traducción de los mRNA que codifican las PAK, tales como PAK1, PAK2 y/o PAK3. En este caso, la eliminación de FMR1 daría como resultado mayores niveles de PAK total, incluyendo PAK activa. Por lo tanto, en ratones dMT, los niveles de PAK activa se invertirían al nivel del de los ratones de tipo natural.

Ejemplo 9: Análisis para determinar si PAK compite con el RNA para unirse a los dominios KH de FMRP

La PAK puede unirse y regular negativamente la actividad de FMRP. El Ejemplo 4 muestra que los dominios KH de unión a RNA de FMRP median la unión de FMRP a PAK1. Por tanto, PAK puede competir con los RNA para unirse a los dominios KH de FMRP, atenuando así la actividad de FMRP para reprimir la traducción de estos RNA. Para determinar si PAK puede competir con los RNA para unirse a los dominios KH de FMRP, se pueden realizar los ensayos de unión (tales como inmunoprecipitación y el ensayo desplegable con GST, que se describe en la presente memoria) en presencia de una sustancia que pueda competir con PAK para unirse a los dominios KH de FMRP.

En tales ensayos, FMRP puede estar libre en solución, fijada a un soporte y/o expresada en y/o sobre la superficie de una célula. Los RNA candidatos y/o PAK pueden estar marcados, permitiendo así la detección de la unión. Se pueden realizar formatos de unión competitivos en los que se marca una de las sustancias y se puede medir la cantidad de marcador libre frente al marcador unido para determinar el efecto del competidor sobre la unión. Por ejemplo, PAK puede estar marcada y los RNA candidatos pueden estar sin marcar con el fin de detectar la capacidad de los RNA candidatos de competir con PAK para la unión a FMRP.

Ejemplo 10: Ensayo para determinar si PAK fosforila FMRP

La PAK es una serina/treonina-quinasa, puede fosforilar FMRP. En el cerebro, FMRP se fosforila en Ser 499 y su estado de fosforilación afecta a su asociación con el RNA y los poli-ribosomas. Otros supuestos sustratos de quinasa en el cerebro de ratón incluyen Thr 454, Ser 496, Thr 501, Ser 503, Thr 517 (Ceman et al., 2003, Hum. Mol. Genet., 12:3295; y Mazroui et al., 2003, Hum. Mol. Genet., 12:3087). Se pueden realizar ensayos de quinasas con el fin de determinar si PAK fosforila FMRP. En tales ensayos PAK y/o una de sus porciones características se pone en contacto con FMRP y/o una de sus porciones características en presencia de un donador de fosfato adecuado, tal como ATP, que contiene fosfato radiomarcado, y se mide en FMRP la incorporación del radiomarcador dependiente de PAK.

La fosforilación de FMRP dependiente de PAK se puede medir monitorizando las propiedades fisicoquímicas de FMRP que pueden ocurrir como resultado de la incorporación de grupos fosfato. Tales propiedades pueden incluir la movilidad electroforética, la absorbancia de luz, la fluorescencia y/o fosforescencia, las propiedades cromatográficas, etc. Dichas alteraciones de las propiedades fisicoquímicas del sustrato pueden medirse fácilmente por un experto en la técnica y se utilizan como un indicador de la actividad de la quinasa.

Alternativa o adicionalmente, se pueden generar anticuerpos monoclonales o policlonales que reconozcan selectivamente las formas fosforiladas de FMRP, y por lo tanto se puede usar el grado de unión de dichos anticuerpos a FMRP después de la reacción con la quinasa como un método indirecto para determinar la capacidad de PAK para fosforilar FMRP. Los ensayos de quinasa se pueden realizar usando PAK y/o FMRP parcialmente recombinantes y/o PAK y/o FMRP purificadas que se purifican a partir de células que expresan de forma natural la proteína usando procedimientos de purificación estándares, tales como los descritos en la presente memoria.

Ejemplo 11: Moduladores de PAK y autismo

Los pacientes con el FXS constituyen �5% de la población de los pacientes con autismo, un trastorno multigénico complejo caracterizado por problemas de comunicación alterada, interacciones sociales alteradas y conductas e intereses repetitivos. Debido a la dificultad en identificar los loci y genes cromosómicos susceptibles, se sabe poco sobre las causas y la patogénesis del autismo. La asociación entre el FXS y el autismo sugiere que estos dos trastornos pueden compartir factores genéticos comunes y mecanismos fisiopatológicos subyacentes. Por tanto, los moduladores e PAK, pueden representar un nuevo tratamiento para ciertos tipos de autismo. En apoyo de esta idea, el gen PAK3 se localiza en el locus cromosómico Xq22, una región relacionada con el autismo. Se podría, por lo tanto, determinar si los genes PAK3 y/u otros genes PAK están mutados en pacientes autistas. Para probar directamente la relación entre la modulación de PAK y el autismo, se podrían cruzar ratones dnPAK TG con modelos disponibles de ratones con autismo (Lijam et al., 1997, Cell, 90:895; Moretti et al., 2005, Hum. Mol. Genet., 14:205; y Kwon et al., 2006, Neuron, 50:377) para examinar si la conducta social se invierte al nivel de la de los ratones de tipo natural en los mutantes dobles.

Ejemplo 12: Tratamiento de ratones FMR KO con moléculas pequeñas inhibidoras de PAK

Preparación de soluciones madre

La emodina (también conocida como 1,3,8-tri-hidroxi-6-metil-antra-quinona; 6-metil-1,3,8-tri-hidroxi-antra-quinona; Emodol; Frangula-emodina) se obtiene de Sigma-Aldrich (Nº E7811). La emodina es un polvo de color naranja soluble en DMSO, etanol o amoniaco acuoso diluido 1 N. Se prepara una solución madre de 1 mg/ml - 50 mg / ml y se conserva a -20ºC.

El OSU-03012 (también conocido como 2-amino-N-{4-[5-(2-fenantrenil)-3-(trifluorometil)-1H-pirazol-1-il]-fenil} acetamida) se obtiene de Cayman Chemicals (Nº 10008005; Figuras 6 y 7). El OSU-03012 es un sólido blanco soluble en disolventes orgánicos tales como DMSO, etanol y DMF. Se prepara una solución madre de 30 mg/ml 100 mg/ml y se conserva a -20 ºC.

Administración de moléculas pequeñas terapéuticas a ratones FMR KO.

Los efectos de los fármacos se optimizan mediante la determinación del método de administración, la dosis, el volumen y la posología ideales. Se compara el nivel de exposición al fármaco y la duración en las regiones del cerebro, así como en otros órganos y la sangre mediante diferentes métodos de administración de fármacos.

Las moléculas pequeñas terapéuticas que incluyen, aunque sin limitación, emodina y/u OSU-03012, pueden administrarse a ratones FMR KO por inyección, y en los ratones inyectados se puede evaluar su eficacia terapéutica. Los estudios se realizan frecuentemente utilizando ratones macho, pero también se pueden utilizar de acuerdo con la invención ratones hembra heterocigóticos y/o homocigóticos. Los estudios se realizan frecuentemente utilizando ratones adultos, pero también se pueden utilizar de acuerdo con la presente invención ratones prenatales, infantiles y/o ratones jóvenes.

Los fenotipos conductuales varían ligeramente con la raza del ratón. En algunas realizaciones se puede utilizar, una raza modificada genéticamente C57BL6 para estudios de moléculas pequeñas inhibidoras de PAK. En algunas realizaciones, se puede usar una raza modificada genéticamente FVB/NJ (FVB) para estudios de moléculas pequeñas inhibidoras de PAK. En algunas realizaciones, se pueden utilizar los híbridos F1 producidos por el cruce de un ratón macho FVB con un FMR1 KO hembra heterocigótica C57BL6 para estudios de moléculas pequeñas inhibidoras de PAK. En algunas realizaciones, los híbridos F1 producidos por el cruce de un ratón macho C57BL6 con un ratón hembra heterocigótico FVB pueden ser utilizados para estudios de moléculas pequeñas inhibidoras de PAK.

En general, las moléculas pequeñas moduladoras de PAK son frecuentemente solubles en disolventes orgánicos, pero no en soluciones acuosas. Se analiza una variedad de diferentes disolventes para conseguir máximos efectos terapéuticos y mínimos efectos secundarios adversos. Por ejemplo, las moléculas pequeñas terapéuticas C57BL (por ejemplo, emodina y/u OSU-03012) se formularon con agua, solución salina (por ejemplo, solución salina tamponada con fosfato), 2-hidroxipropil-beta-ciclodextrina, Tween, metil-celulosa, polietilenglicol, Cremophor EL (Sigma), aceites (por ejemplo, aceite vegetal) y/o Maalox. La molécula pequeña terapéutica se puede formular como una solución homogénea o una dispersión coloidal.

A los ratones FMR KO se les administra una variedad de cantidades de emodina y/u OSU-03012. Por ejemplo, se pueden administrar por cada dosis, alrededor de 5 μl, alrededor de 10 μl, alrededor de 20 μl, alrededor de 50 μl, alrededor de 100 μl, alrededor de 500 μl, alrededor de 1000 μl, alrededor de 2000 μl y/o alrededor de 3000 μl de emodina y/u OSU-03012. Típicamente, se utilizan dosificaciones de alrededor de 50 μl a alrededor de 1,0 ml.

La emodina y/o el OSU-03012 se pueden administrar en concentraciones de alrededor de 0,5 mg/kg, alrededor de 1 mg/kg, alrededor de 2 mg/kg, alrededor de 3 mg/kg, alrededor de 4 mg/kg, alrededor de 5 mg/kg, alrededor 6 mg/kg, alrededor de 7 mg/kg, alrededor de 8 mg/kg, alrededor de 9 mg/kg, alrededor de 10 mg/kg, alrededor de 11 mg/kg, alrededor de 12 mg/kg, alrededor de 13 mg/kg, alrededor de 14 mg/kg, alrededor de 15 mg/kg, alrededor de 20 mg/kg, alrededor de 50 mg/kg, alrededor de 100 mg/kg, alrededor de 250 mg/kg o alrededor de 500 mg/kg por dosis (mg/kg corresponde a Nº de mg de emodina y/o de OSU-03012 por kg de sujeto animal).

Se utiliza una variedad de programas de dosificación para emodina y/u OSU-03012. La emodina y/o el OSU-03012 se administran una sola vez y/o se administran varias veces (por ejemplo, a intervalos regulares). Por ejemplo, la emodina y/o el OSU-03012 se pueden administrar una vez al mes, dos veces al mes, una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, en días alternos, una vez al día, dos veces al día, tres veces al día y/o cuatro veces al día.

La emodina y/o el OSU-03012 se pueden administrar por administración oral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intramedular, intratecal, parenteral, subcutánea, intraventricular, transdérmica, interdérmica, rectal, intravaginal, intraperitoneal, tópica (por ejemplo, polvos, pomadas, cremas, geles y/o gotas), transdérmica, mucosal, nasal, bucal, enteral y/o sublingual; por instilación intratraqueal, instilación bronquial y/o inhalación; y/o en forma de una pulverización oral, pulverización nasal y/o aerosol. En algunas realizaciones, la emodina y/o el OSU-03012 pueden ser administrados por un goteo continuo. En algunas realizaciones, la emodina y/o el OSU-03012 se pueden administrar por inyección retro-orbital.

El tiempo transcurrido entre la última dosis y los análisis bioquímicos o conductuales varía entre 15 minutos y 2 días. Por ejemplo, el lapso de tiempo entre la última dosis y los análisis bioquímicos o conductuales puede ser aproximadamente 15 minutos, aproximadamente 30 minutos, aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, aproximadamente 5 horas, aproximadamente 6 horas, aproximadamente 9 horas, aproximadamente 12 horas, aproximadamente 15 horas, aproximadamente 18 horas, aproximadamente 24 horas, aproximadamente 30 horas, aproximadamente 36 horas, aproximadamente 42 horas, aproximadamente 48 horas, aproximadamente 60 horas o aproximadamente 72 horas.

Programa de dosificación ilustrativa nº 1

Se administró placebo o inhibidor de PAK a ratones FMR1 KO machos adultos de la misma camada (1 mg/kg, 10 mg/kg, 30 mg/kg, 100 mg/kg o 300 mg/kg) en un volumen total de 200 μl a través de una sonda oral. Los ratones se monitorizaron para detectar signos de toxicidad o deterioro de la salud. En varios momentos (1 hora, 4 horas, 12 horas o 24 horas) tras la administración de solo el fármaco, se sacrifican los animales. Para cada una de 48 condiciones se usan por lo menos dos ratones. En algunos experimentos se utilizan entre dos y diez ratones. En algunos experimentos se utilizan más de 10 ratones. En algunas pruebas experimentales solo se lleva a cabo un subconjunto de estas condiciones. En el momento del sacrificio se recogen sangre, orina y órganos. Los cerebros se diseccionan en subregiones, incluyendo hipocampo, corteza y cerebelo. El análisis de la concentración de fármaco y la eficacia en diversos fluidos y tejidos se utiliza para informar futuros estudios para los que se sugieren las concentraciones y programas óptimos de dosificación de fármacos.

Programa de dosificación ilustrativa nº 2

Ratones FMR1 KO machos adultos de la misma camada se trataron con un inhibidor de PAK (por ejemplo, una molécula pequeña, tal como emodina y/u OSU-03012) durante 3 días, 1 semana, 2 semanas o 4 semanas antes del análisis conductual. Los ratones de cada genotipo se dividieron aleatoriamente en tres grupos de dosificación con al menos dos ratones en cada grupo: tratados con vehículo de control y con fármaco (10 mg/kg o 100 mg/kg; u otra dosis que se encontró que era la óptima en el experimento piloto descrito previamente). En algunos experimentos se utilizan alrededor de cinco ratones. En algunos experimentos se utilizan alrededor de diez ratones. En algunos experimentos se utilizan más de 10 ratones. Todos los fármacos se administran una vez al día en un volumen total de 200 μl por sonda oral. En algunas pruebas experimentales, sólo se lleva a cabo un subconjunto de estas condiciones. Los experimentos conductuales - incluyendo los experimentos en campo abierto, el condicionamiento del miedo vestigial y/o de interacción social - se llevan a cabo 12 a 18 horas después de la última dosificación (o en otro momento que resultó ser el óptimo en el experimento de dosificación anterior). Los ratones se sacrifican inmediatamente después del ensayo conductual final y se recogen y conservan las subregiones del cerebro, así como otros órganos y la sangre.

Programa de dosificación ilustrativa nº 3

Se tratan crías machos de ratones FMR1 KO de la misma camada para ser usadas en experimentos de convulsiones audiogénicas (AGS) con inhibidor de PAK (por ejemplo, una molécula pequeña, tal como emodina y/u OSU-03012) durante 1 día, 3 días, 5 días o 7 días inmediatamente antes del día 20 posnatal, p20), momento en el que se realiza el ensayo conductual. Por lo tanto, los tratamientos con inhibidores de PAK comienzan cuando las crías están en los días p13, p15, p17 o p19. Se les administra dos veces al día inyecciones subcutáneas de placebo o de inhibidor de PAK (1 mg/kg, 3 mg/kg o 10 mg/kg) en un volumen total de 50 μl/g de peso corporal. Para cada una de las 16 condiciones (combinaciones de días de administración y dosis del fármaco) se utilizan 6-8 crías de ratones FMR1 KO y 2 compañeros de camada de control. En algunas pruebas experimentales sólo se lleva a cabo un subconjunto de estas condiciones. Los experimentos conductuales se realizan 48 horas después de la inyección final.

Un experto en la técnica reconocerá fácilmente que estos son programas de dosificación ilustrativos y no pretenden ser limitativos. Un experto en la técnica reconocerá cómo las condiciones de estos programas de dosificación ilustrativos pueden ser modificadas con el fin de optimizar la dosificación. Tales optimizaciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención.

Análisis bioquímicos posteriores al tratamiento

Después del tratamiento, los ratones son sometidos a una serie de análisis bioquímicos para evaluar la eficacia del tratamiento con las moléculas pequeñas. Típicamente, las muestras biológicas que se utilizan en los análisis bioquímicos se obtienen post-mortem. Sin embargo, los análisis bioquímicos se pueden realizar utilizando muestras biológicas obtenidas de ratones vivos.

Después de la administración final del compuesto, los ratones son sometidos a una serie de análisis bioquímicos con el fin de evaluar la biodisponibilidad y eficacia del tratamiento con las moléculas pequeñas. Los ratones se sacrifican 1 hora, 2 horas, 6 horas, 12 horas, 24 horas o 48 horas después de la administración final del fármaco, ya sea por dislocación cervical o sobredosis de anestesia (por ejemplo, avertina o isoflurano) e inmediatamente después se les recoge sangre por punción cardiaca en tubos heparinizados. El plasma sanguíneo se separa por centrifugación (por ejemplo, 20.000 x g), se congela y se conserva a -80ºC hasta su análisis. El líquido cefalorraquídeo (CSF) de los ventrículos, se centrifuga brevemente para sedimentar los residuos celulares, se congela y se conserva a - 80ºC hasta su análisis. Para determinar la vía y la velocidad de eliminación del compuesto, se recoge la orina de la vejiga, se centrifuga brevemente para sedimentar los residuos celulares y el líquido sobrenadante se congela y se conserva a -80ºC hasta su análisis. Utilizando disección, se recogen los tejidos, incluyendo hígado, riñón, bazo, ganglios linfáticos, corazón, pulmones, músculo, piel, médula espinal y cerebro, que pueden ser subdivididos en múltiples zonas, incluyendo aunque sin limitación: corteza cerebral, hipocampo y cerebelo. La emodina, el OSU-03012 y sus metabolitos se extraen de los tejidos utilizando metanol.

Para la determinación de las concentraciones de emodina y metabolitos, las muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo, CSF, orina y extractos en metanol de tejidos) se someten a cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) usando como fase sólida una columna C18 y como fase móvil 88% de metanol:12% de ácido fosfórico al 0,1% (agua) o ácido fosfórico 0,1 M:metanol 40:60. La emodina se detecta por absorbancia UV a 220 nm. Las muestras se impurifican con una cantidad conocida de emodina antes de la HPLC como patrón interno. La cantidad de emodina en la muestra se determina por comparación con la cantidad conocida de patrón interno o con muestras obtenidas de ratones no tratados impurificadas con una cantidad conocida de emodina. La concentración de emodina se determina por tanto sobre una base de cantidad por ml (plasma sanguíneo/orina) o sobre una base de cantidad por mg (muestra), respecto a la cantidad de muestra utilizada para el procedimiento.

Para la determinación de concentraciones de OSU-03012 y sus metabolitos, las muestras (por ejemplo, plasma sanguíneo, CSF, orina y extractos en metanol de tejidos) se someten a cromatografía de líquidos de alta eficacia (HPLC) usando como fase sólida una columna C18 y como fase móvil un gradiente lineal de acetonitrilo/acetato de amonio 0,025 M, pH 4,5 (20:80) a acetonitrilo/acetato de amonio 0,025 M, pH 4,5 (60:40). El OSU-03012 y sus metabolitos se detectan por absorbancia UV a 240 nm o por fluorescencia con excitación a 240 nm y emisión a 380 nm. Las muestras se impurifican con una cantidad conocida de OSU-03012 antes de la HPLC como un patrón interno. La cantidad de OSU-03012 en la muestra se determina por comparación con la cantidad conocida de patrón interno, o con muestras obtenidas de ratones no tratados impurificadas con cantidades conocidas de OSU-03012. La concentración de OSU-03012 se determina por tanto sobre una base de cantidad por ml (plasma sanguíneo/orina) o sobre una base de cantidad por mg (muestra), respecto a la cantidad de muestra utilizada para el procedimiento.

El análisis farmacocinético incluye representar gráficamente las concentraciones medias en plasma, en CSF y/o en orina del fármaco en función del tiempo y calcular el área bajo la curva (AUC) a diferentes tiempos después de la inyección. La semivida de los inhibidores de PAK se determina fijando la curva de concentración-tiempo después de que se hayan alcanzado los niveles máximos hasta una exponencial simple. Para cada fármaco, se determinan los niveles máximos de moléculas pequeñas inhibidoras de PAK en los fluidos recogidos, la dosis y la combinación de tiempos.

De manera similar, se pueden recoger y analizar sangre y orina a intervalos fijos durante todo el régimen de dosificación. Por ejemplo, se puede utilizar el seno peri-orbital como fuente de sangre venosa y se pueden recoger de modo seguro en un tubo capilar aproximadamente 0,25 ml de sangre a intervalos semanales bajo anestesia. De manera similar, se puede utilizar la punción venosa de la vena caudal para recoger pequeños volúmenes de sangre (típicamente unas pocas gotas) de ratones inmovilizados.

Se recogen post mórtem varios tejidos y se analizan los fármacos y sus metabolitos asociados (como se ha descrito para las muestras de sangre, CSF y orina) y la eficacia de la inhibición de PAK. Los tejidos recogidos incluyen hígado, riñón, bazo, ganglios linfáticos, corazón, pulmones, músculo, piel, médula espinal y cerebro, que pueden ser subdivididos en múltiples zonas, incluyendo aunque sin limitación: corteza cerebral, hipocampo y cerebelo. La eficacia del tratamiento con fármacos en el cerebro se determina por la homogeneización del tejido cerebral, seguido por electroforesis en gel y transferencia de Western para monitorizar las actividades de PAK y sus efectores aguas abajo por medio del uso de fosfoanticuerpos específicos.

Las transferencias de Western se realizan como se ha descrito previamente (Hayashi et al, 2004, Neuron, 42:773, y Kelleher et al., 2004, Cell, 116:467). Explicado brevemente, la corteza cerebral, el hipocampo y el cerebelo de ratón se diseccionan y homogeneízan en tampón RIPA frío (por ejemplo, 4ºC) (Tris-HCl 50 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, NP-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS 0 mM o 1 mM) con inhibidores de proteasas (por ejemplo, algunos

o todos de Roche Complete®, Mini Complete®, cócteles de inhibidores de las proteasas I, II y III Calbiochem®) e inhibidores de fosfatasa (por ejemplo, algunos o todos de los cócteles de inhibidores de fosfatasa I, II y III Calbiochem®). Los homogeneizados se centrifugan para eliminar los residuos y se determinan las concentraciones de proteína (por ejemplo, el ensayo Biorad Bradford, el ensayo Biorad Rc-Dc o protocolos de Molecular Probes NanoOrange de acuerdo con las instrucciones del fabricante). En algunos casos, se realiza una centrifugación adicional a través de un gradiente de sacarosa y tratamiento con detergentes para fraccionar los extractos, lo que permite el enriquecimiento de las fracciones de membrana, las fracciones de sinaptosomas y las fracciones de densidad postsinápticas. Estas fracciones se someten a análisis de transferencia de Western usando anticuerpos (por ejemplo, obtenibles de Cell Signallig) que reconocen formas fosfoespecíficas de PAK y proteínas de señalización aguas abajo, incluyendo el anticuerpo p-PAK1 Thr 423 (reconoce las formas fosforiladas de PAK1, PAK2 y PAK3), p-ERK1/2 doblemente fosforilado, p-S6 (S235/S236), p-eIF4E (S209), p-4E-BP1 (S65) y p-Akt (S473). Alternativa o adicionalmente, estas fracciones se sometieron a análisis de transferencia de Western utilizando un anticuerpo de p-vimentina (S56; Medical & Biological Laboratories). Las manchas de transferencia se extienden en bandas y se vuelve a sondar con anti-sueros contra PAK1 (Santa Cruz), PAK3 (Upstate), ERK1/2 (Cell Signalling), S6 (Cell Signalling), eIF4E (Cell Signalling), 4E-BP1 (Cell Signalling) y Akt (Cell Signalling) totales. Los resultados se cuantifican con un programa informático (por ejemplo, NIH Image J o Li-Cor Odyssey).

Alternativa o adicionalmente, se determinó el grado en que las moléculas pequeñas inhibidoras como emodina y OSU-03012 inhiben la actividad catalítica endógena de PAK en el cerebro de ratón usando un ensayo de quinasa in vitro, tal como se describe en Hayashi et al., 2004, Neuron, 42:773 y Zenke et al, 1999, J. Biol. Chem., 274:32565). Explicado brevemente, la actividad catalítica de PAK puede ser estimulada por GTP-yS-Rac en homogeneizados totales de cerebro anterior y medida por la cantidad de proteína básica mielina (MBP) fosforilada.

Por transferencia de Western y ensayos de quinasa PAK in vitro, se monitoriza el nivel de actividad de PAK (los niveles de fosfoproteína para todas las proteínas antes mencionadas en relación con el estado sin fármaco o el nivel de actividad catalítica de PAK in vitro con respecto al estado sin fármaco) en función de la dosis y la duración de dosificación.

Las mediciones de la toxicidad del fármaco se llevan a cabo mediante la monitorización de pérdida de peso, muerte, actividad motora (por ejemplo, ensayo en campo abierto) y/o la coordinación (por ejemplo, en el ensayo de la varilla rotatoria) para todas las dosis de los fármacos mencionadas y para todos los programas de dosificación.

En algunas realizaciones, la concentración óptima de PAK que se ha de utilizar para los experimentos conductuales y electrofisiológicos es aproximadamente la más pequeña de la cantidad más baja de inhibidor requerida para alcanzar la máxima inhibición de la actividad de PAK (por ejemplo, por estudios de transferencia de Western y/o ensayo de quinasa) o la cantidad más baja de inhibidor que causa efectos tóxicos adversos (por ejemplo, pérdida de peso, muerte, diferencia de actividad motora, problemas de coordinación, etc.).

Típicamente, se sacrifica un grupo de ratones y se utiliza en experimentos bioquímicos (por ejemplo, para determinar el nivel de inhibición de la actividad quinasa de PAK en el cerebro para diferentes programas de dosificación, tiempos después de la administración final, etc.) y se utiliza un grupo separado de ratones para los análisis conductuales. Un ratón puede ser utilizado para un solo ensayo o una batería de ensayos conductuales. Si se utiliza un solo ratón para múltiples ensayos conductuales, los ensayos se realizan normalmente en el siguiente orden: en campo abierto, de interacción social, de condicionamiento del miedo vestigial y análisis de convulsiones audiogénicas.

Análisis morfológicos posteriores al tratamiento

Después del tratamiento, los ratones son sometidos a una serie de análisis histológicos y/o morfológicos para evaluar la eficacia del tratamiento con moléculas pequeñas. Más adelante se describen unos cuantos análisis histológicos y/o morfológicos ilustrativos que se explicaron con más detalle en el Ejemplo 1.

Puesto que las anomalías de las espinas dendríticas son una característica de pérdida de FMRP, tanto en seres humanos como en ratones, se realiza un análisis de Golgi en ratones FMR KO después de la administración de inhibidor de PAK usando la técnica de Golgi-Cox. Se mide la densidad de espinas dendríticas en las zonas de la corteza, tal como las neuronas piramidales de las capas II/III de la corteza temporal, en cada rama dendrítica primaria o secundaria apical o basal en segmentos dendríticos de 10 μm de largo. Se cuantifican y comparan el número de espinas por cada segmento de 10 μm y la densidad media de espinas en los segmentos (como en las Figuras 11 y 12). Los ratones FMR KO muestran un aumento de la densidad de las espinas con respecto a sus compañeros de camada de tipo natural. Este fenotipo es restaurado o parcialmente restaurado por la inhibición de PAK en ratones FMR KO.

La preparación de Golgi se usa para cuantificar y comparar la longitud de las espinas dendríticas. Se observa en ratones FMR KO un aumento de la longitud de las espinas y quizás la simultánea disminución del tamaño de las sinapsis de las neuronas piramidales teñidas por la técnica de Golgi y pueden ser restauradas por la inhibición de la actividad de PAK (como en la Figura 13). La longitud de las espinas se mide como la distancia radial desde la punta de la cabeza de la espina al árbol dendrítico (véanse, por ejemplo, Hayashi et al, 2007, Proc. Natl. Acad. Sci, USA., 104:11489; y Ramón-Moliner, 1970, Contemporary Research Methods in Neuroanatomy, Springer, Berlin).

Las anomalías de las espinas dendríticas se observan también en las neuronas marcadas en la corteza con la proteína fluorescente verde (GFP), tal como en las neuronas de la capa V de la corteza barril o corticales en cultivo. Las neuronas se marcan con GFP mediante el uso de un vector viral inyectado en la corteza de un ratón transgénico que expresa esta proteína fluorescente en algunas neuronas corticales. Las neuronas fluorescentes se visualizan en secciones de cerebro fijadas o en cultivos primarios utilizando un microscopio láser de exploración de dos fotones. La longitud de las espinas y su densidad se cuantifican como se describe anteriormente. Las neuronas de los ratones FMR KO muestran una mayor longitud de espinas y un mayor densidad de espinas, como fenotipo que puede ser restaurado por la inhibición de la actividad quinasa de PAK (véanse, por ejemplo, Nimchinsky et al, 2001,

J. Neurosci, 21:5139; y Livet et al., 2007, Nature, 450: 56).

Análisis de las LTP y LTD después del tratamiento

En algunas realizaciones, la plasticidad sináptica del hipocampo se evaluó a través de un protocolo estándar para mGluR-LTD (véase, por ejemplo, el Ejemplo 5 para un protocolo más detallado). Se preparan por procedimientos estándares cortes del hipocampo de ratones FMR KO y compañeros de camada de control. Todos los experimentos se realizan desconociendo el genotipo. Se estimulan las fibras colaterales de Schaffer y se miden los potenciales de campo extracelulares en el estrato radiado de CA1. Se provoca LTD dependiente de mGluR tanto electrofisiológicamente (por pares de estímulos suministrados a 1 Hz durante 15 minutos a 20 minutos; "PP-LFS") como farmacológicamente (por aplicación del baño de 3,4-dihidroxifenilglicina (DHPG) 50 μM a 100 μM durante 5 minutos). Se registra la pendiente inicial del potencial de campo como indicador de la fuerza sináptica. Cortes de hipocampo de ratones FMR1 KO muestran una mGluR-LTD potenciada respecto a los ratones de control (véanse, por ejemplo, Huber et al, 2002, Proc. Natl. Acad .Sci. USA., 99:7746; y Nosyreva and Huber, 2006, J . Neurophysiol., 95:3291).

La potenciación a largo plazo (LTP) cortical está reducida en cortes de ratones FMR1 KO (véase la Figura 14). Se preparan cortes del cerebro coronal que contienen la corteza temporal de compañeros de camada machos de dos a tres meses, y se dejan recuperar durante al menos 1 hora antes del registro en líquido cefalorraquídeo artificial que contiene NaCl 124 mM, KCl 5 mM, NaH2PO4 1,25 mM, MgCl2 1 mM, CaCl2 2 mM, NaHCO3 26 mM y dextrosa 10 mM caliente (30ºC) y oxigenado (95% de O2 y 5% de CO2). Se miden, como se ha descrito anteriormente, los potenciales de campo (FP) en las capas II/III provocados por estimulación de la capa IV y las respuestas se cuantifican como la amplitud de FP en la corteza. La LTP es inducida por TBS, que consistía en ocho ráfagas breves (cada una de 4 pulsos a 100 Hz) de estímulos suministrados cada 200 milisegundos. La inhibición genética de PAK restaura la LTP cortical reducida en los ratones FMR1 KO, y la presente invención incluye el reconocimiento de que la inhibición farmacológica puede tener el mismo efecto (Hayashi et al., 2007, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 104:11489).

Análisis conductuales posteriores al tratamiento

Se someten ratones con el cromosoma X frágil y compañeros de camada tratados con un inhibidor de PAK o placebo a diversas tareas de conducta para determinar si la inhibición farmacológica de PAK puede mejorar los síntomas del síndrome del cromosoma X frágil en el modelo de ratón. El experimentador desconoce el genotipo y el tratamiento farmacológico previo.

Ensayo en campo abierto

Como se describe en esta memoria descriptiva, el ensayo en campo abierto registra parámetros tales como actividad horizontal y vertical, tiempo de permanencia en el centro y estereotipia. A los ratones se les permite correr libremente en un espacio abierto (por ejemplo, en una cámara de monitorización de actividad VersaMax de AccuScan Instruments). Los ratones se dejan correr alrededor de 5 minutos, alrededor de 10 minutos, alrededor de 15 minutos, alrededor de 20 minutos, alrededor de 30 minutos o alrededor de 1 hora. Después de dejar correr a los ratones se analizan las conductas incluyendo: (1) hiperactividad, determinada por la medición de la distancia recorrida y/o el tiempo consumido por el sujeto; (2) estereotipia determinada midiendo el número de conductas repetidas exhibidas por el sujeto; (3) hipo-ansiedad, determinada por la medición de la cantidad de tiempo que el sujeto permanece en el centro del campo en relación con el tiempo de permanencia en las esquinas del campo; y (4) combinaciones de estos.

En algunos experimentos, la actividad en campo abierto se puede detectar por medio de interrupciones de rayos de luz y analizar por el programa informático VersaMax. Las actividades medidas son la cantidad de tiempo que el ratón pasa en el centro del campo, el número de veces que el ratón presenta conductas repetidas ("estereotipia") y la distancia total recorrida por el ratón.

Ensayo de convulsiones audiogénicas (AGS)

Los seres humanos y los ratones afectados por el síndrome del cromosoma X frágil son propensos a sufrir convulsiones en edades tempranas. Los ratones con el cromosoma X frágil muestran un fenotipo robusto en un ensayo de convulsiones audiogénicas (AGS). Aunque en esta tarea los ratones de tipo natural de 19 -21 días (p1921) no suelen tener convulsiones, la mayoría de los ratones con el cromosoma X frágil si tienen convulsiones.

El AGS se realiza esencialmente como se describe (Yan et al., 2005, Neuropharmacol., 49:1053). Explicado brevemente, los ratones se habitúan a una cámara de conducta y luego se exponen a una sirena de alta intensidad de una frecuencia máxima de 1800 Hz - 6300 Hz a un nivel medio de presión de sonido por encima de 120 dB a aproximadamente 10 cm durante 5 minutos. Las conductas de los ratones se monitorizan después de la administración del sonido. Los ratones con el síndrome del cromosoma X frágil típicamente (1) corren excitadamente, (2) tienen convulsiones y/o (3) mueren. Los ratones de tipo natural normalmente no muestran estas respuestas. Un fenotipo AGS se puntúa basándose en el momento final del animal.

Condicionamiento del miedo vestigial

Los ratones se someten a la tarea de condicionamiento del miedo vestigial de acuerdo con procedimientos estándares. En el día 1 ("condicionamiento"), los ratones se colocan en una cámara de entrenamiento durante ~60 segundos antes del comienzo de un tono de ruido blanco de ~15 segundos. ~30 segundos más tarde, los ratones reciben una descarga eléctrica de ~1 segundo (de intensidad ~ 0,7 mA). Por lo tanto, una prueba se compone de tono, 30 segundos tiempo en blanco (también llamado "tiempo vestigial") y a continuación una descarga eléctrica. Se realizan entre cinco y diez pruebas con un intervalo entre pruebas (ITI) de 210 segundos. Para examinar si los ratones recuerdan esta asociación, el día 2 ("ensayo de tono"), los ratones se colocan en una nueva cámara con una forma y olor diferentes de los de la primera cámara. Después de ~60 segundos, se repite un tono de ~15 segundos durante cinco a diez veces con un ITI de 210 segundos. Las imágenes de vídeo se digitalizan y se analiza el porcentaje de tiempo de congelación durante cada ITI (por ejemplo, por el programa Image FZ). La congelación se define como la ausencia de todo movimiento, excepto el movimiento respiratorio, durante un período de 1 segundo. Véase, por ejemplo, Zhao et al. (2005, J. Neurosci., 25:7385).

Ensayos de interacción social

Se evalúan la conducta en jaula doméstica y la interacción social con una variedad de ensayos (Kwon et al, 2006, Neuron, 50:377; Spencer et al, 2005, Genes Brain Behav., 4:420, y Lijam et al., 1997, Cell, 90:895). Por ejemplo, los ratones se pueden observar en su jaula doméstica por videograbación y puntuar sus diversas conductas no sociales y/o conductas sociales (por ejemplo, acicalamiento, apareamiento, tirado de la cola y olfateo).

La interacción social directa se evaluó mediante la exposición de los ratones a un nuevo ratón coespecífico y las conductas de aproximación y olfateo. Se registra el porcentaje de tiempo pasado interaccionando. Esto se repite alrededor de 3 días más tarde con los mismos ratones. Los ratones de control presentan una disminución de la interacción social la segunda vez, lo que indica reconocimiento del ratón conocido y/o aprendizaje social normal. Los ratones FMR KO no presentan una disminución en la interacción social, la segundo vez, lo que indica problemas de aprendizaje social, de memoria y/o de conducta. Este ensayo puede llevarse a cabo en un entorno nuevo o conocido, puesto que se han observado diferencias significativas entre ratones FMR KO y ratones de tipo natural en los ensayos de interacción social en función del grado de conocimiento del entorno. En este ensayo se pueden monitorizar otras conductas sociales, incluyendo conductas activas (por ejemplo, ataques agresivos, amenazas laterales y/o persecución) y conductas pasivas (por ejemplo, la recepción de olfateo de otro ratón y/o que no muestre signos de conducta sumisa y/o defensiva).

Antes de un ensayo de interacción social indirecta los ratones se alojan individualmente durante 4 días. Las tareas de interacción social indirecta suelen tener lugar en una jaula dividida en dos por un tabique perforado transparente. La tarea se ejecuta de dos modos diferentes: una implica un entorno conocido por pre-exposición a la cámara de ensayo, mientras que el otro implica un nuevo entorno. Los ratones de ensayo se exponen a ratones nuevos o conocidos. Por lo general, los ratones FMR KO se comportan de manera similar a los ratones de tipo natural en un nuevo entorno, pero se comportan de manera significativamente diferente en una jaula conocida. Se registra el tiempo que permanecen en el tabique a intervalos de 2 a 5 minutos durante un ensayo de 20 minutos. Los ratones FMR KO pasan mucho menos tiempo interaccionando (es decir, en el tabique) en los primeros minutos y tardan más en aproximarse al tabique que los ratones de tipo natural. En contraste, los ratones FMR KO pasan más tiempo que los ratones de control en el tabique durante los últimos intervalos de tiempo.

En algunos experimentos, la prueba indirecta de interacción social se lleva a cabo en una cámara dividida en tres recintos. El recinto central - que está conectado a dos recintos independientes unos de otros, uno a la izquierda y otra a la derecha - está vacío. El recinto de la izquierda contiene una jaula vacía (es decir, un objeto novedoso y/o un objetivo inanimado), mientras que el recinto de la derecha contiene una jaula similar que encierra un ratón nuevo (es decir un objetivo social). Esta tarea implica una elección entre pasar tiempo con un objetivo social o con un objetivo inanimado, por lo que se llama un ensayo de preferencia social. Se registra el porcentaje de tiempo total de interacción con cada objeto. Los ratones FMR KO pueden pasar una cantidad significativa de tiempo diferente (por ejemplo, más o menos) interaccionado con el objetivo social que los ratones de control.

Se realiza un ensayo de dominancia social en un tubo de aproximadamente 30 cm de largo y 3 cm - 4 cm de diámetro. Se colocan los ratones en los extremos opuestos del tubo y se liberan simultáneamente. Un ratón se declara "ganador" cuando su oponente se retira completamente. Los ratones FMR1 KO ganan significativamente menos partidos contra los ratones de tipo natural desconocidos que los esperados por probabilidad. Cuando un ratón FMR1 KO compite con otro de tipo natural no compañero de jaula, el ratón de tipo natural es el ganador en aproximadamente el 73% de los partidos (Kwon et al, 2006, Neuron, 50:377; Spencer et al., 2005, Genes Brain Behav., 4:420; y Lijam et al., 1997, Cell, 90:895). La inhibición de PAK por administración de una molécula pequeña inhibidora puede mejorar este fenotipo.

Puesto que los ratones FMR1 KO han demostrado que presentan algunas conductas sociales anómalas, la conducta social en jaulas domésticas, incluyendo la conducta en la construcción de la ratonera y en el sueño, puede alterarse en los ratones FMR1 KO. Se evaluaron los modelos de anidación colocando una porción de algodón enclavada en una jaula de aproximadamente dos, tres o cuatro ratones del mismo genotipo (por ejemplo, de tipo natural, FMR1 KO, etc.) que reciben tratamientos con fármacos idénticos. Después de aproximadamente 30 minutos a 1 hora, se puede retirar la ratonera y medirse su altura. Los ratones de tipo natural construyen ratoneras con profundidades medias de 20 mm a 50 mm. Los ratones que presentan una conducta social anómala, tales como los ratones FMR1 KO, construyen frecuentemente ratoneras menos profundas (por ejemplo, < 20 mm).

En otro ensayo, las posiciones para dormir de los ratones en sus jaulas domésticas se pueden grabar dos a cuatro veces al día durante cinco días consecutivos. Los ratones de tipo natural duermen acurrucados en las ratoneras suaves y bien formadas que construyen. Las observaciones determinaron que los ratones FMR1 KO duermen en patrones dispersos aleatorios, no construyen ratoneras completas, o duermen en la parte superior del material enclavado intacto. Si los ratones FMR1 KO presentan fenotipos anómalos, pueden mejorar dichos fenotipos después de la inhibición de PAK usando moléculas pequeñas inhibidoras, tales como emodina y/u OSU-I-03012.

Ensayo en el laberinto de ocho brazos

Los pacientes con FXS tienen déficits cognitivos (por ejemplo, deterioro de la memoria a corto plazo) y/o lenguaje y movimientos perseverantes. Los pacientes con FXS frecuentemente se vuelven ansiosos con cualquier quebrantamiento de su rutina diaria normal. El laberinto radial de 8 brazos es una tarea utilizada para ver si también está presente un fenotipo similar en el modelo de ratón de la enfermedad. El laberinto consiste de un espacio central rodeado por ocho puertas que protegen las entradas de ocho brazos del laberinto. Entradas distales prominentes rodean el laberinto. Una bola de comida está oculta en el extremo distal de los brazos y sirve como recompensa. En una versión de la tarea específicamente diseñada para analizar la memoria de trabajo, los 8 brazos están cebados con una bola de comida. En cada prueba, el ratón debe visitar cada uno de los 8 brazos sólo una vez para consumir el alimento de recompensa. Una segunda visita a un brazo se considera un error de la memoria de trabajo. Los ratones con mala memoria a corto plazo cometen más errores que los ratones de tipo natural. En la versión de memoria de referencia de la tarea, sólo están cebados 4 brazos. En este caso, se ceban cada día los mismos 4 brazos durante el periodo de entrenamiento (que dura típicamente de 10 a 16 días con 1 a 3 pruebas por día). Una entrada en un brazo sin cebo se considera un error de memoria de referencia. Al igual que en la versión anterior de la tarea, una segunda entrada en cualquier brazo se considera un error de memoria de trabajo. Una vez que los ratones han aprendido la tarea, comienza una fase de inversión en la que los brazos previamente sin cebo tienen ahora las 4 bolas de alimento y los brazos previamente cebados no contienen ningún alimento de recompensa. Los ratones con déficit de flexibilidad de memoria son incapaces de aprender la nueva tarea y siguen visitando los brazos cebados en la fase de entrenamiento. Los errores se registran y se comparan entre ratones RMF KO que reciben inhibidor de PAK, placebo o ningún tratamiento.

Ensayo en el laberinto de agua de Morris

Se determina el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo usando el clásico ensayo del laberinto de agua de Morris. Los ratones FMR1 KO, al igual que los controles de tipo natural, aprenden a encontrar la plataforma visible u oculta con puntuaciones de latencia decrecientes durante el transcurso del protocolo de entrenamiento estándar. Sin embargo, algunos grupos observan un fenotipo anómalo en una prueba inversa, una prueba en la que la plataforma se transfiere al cuadrante situado enfrente del cuadrante de entrenamiento inicial. En particular, los ratones FMR1 KO presentan un aumento de la latencia de escape y de la longitud de la trayectoria, lo que sugiere que tienen una baja flexibilidad de respuesta o alta interferencia de memoria (véase, por ejemplo, D'Hooge et al., 1997, Neuroscience, 76:367).

Equivalentes y alcance

En las reivindicaciones, los artículos como "un", "uno", "una" y "el" pueden significar uno o más de uno a no ser que se indique lo contrario o que sea de otro modo evidente por el contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyan "o" entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechas si uno, más de uno, o todos los miembros del grupo están presentes o son empleados, o son de otra manera relevantes para un producto o proceso determinado dado a menos que se indique lo contrario o sea de otro modo evidente por el contexto.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Al menos un inhibidor de quinasa activada por p21 (PAK) para uso en el tratamiento de un trastorno del desarrollo neurológico.

2. 2.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1, en donde el trastorno del desarrollo neurológico se selecciona de síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental, trastornos del espectro autista, insuficiencia ovárica prematura

   o síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil.

3. 3.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 2, en donde el síndrome del cromosoma X frágil está asociado con la potenciación a largo plazo (LTP) reducida en la corteza o la depresión a largo plazo (LTD) potenciada.

4. 4.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 3, en donde la administración del inhibidor a un sujeto da como resultado una disminución de la depresión a largo plazo (LTD) en el hipocampo o un aumento de la potenciación a largo plazo (LTP) en la corteza.

5. 5.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor se administra en forma de una dosis por vía oral.

6. 6.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PAK inhibe la interacción de PAK con FMRP

7. 7.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PAK es emodina, OSU-03012, estaurosporina, PD098059, genisteina, tirfostina B42, HA 1077, K252a, 1(5-isoquinolin-sulfonil)-2metilpiperazina (H-7), CEP-1347, hPIP, merlina, nischarina, P35/CDK5, CDC2, p 11OC, POPX1, POPX2, CRIPak, los aminoácidos 89 -143 de PAK1, GL-2003, SUl 1652 o purvalanol A.

8. 8.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PAK es un RNA de interferencia corto (siRNA) o un RNA de horquilla corta (shRNA).

9. 9.

   El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PAK es un anticuerpo.

10. 10.

    El inhibidor para el uso de la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde el inhibidor de PAK se administra en combinación con un agente terapéutico adicional, por ejemplo, un agente anti-convulsionante, un estabilizador del estado de ánimo, un estimulante del sistema nervioso central, un agente antihipertensor, ácido fólico, un inhibidor seleccionado de la recaptación de la serotonina o un agente antisicóptico.

11. 11.

    Un método de cribado de una sustancia candidata útil para tratar un trastorno del desarrollo neurológico, que incluye el síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental, trastornos del espectro autista, insuficiencia ovárica prematura o síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil, que comprende las etapas de:

    proporcionar quinasa activada por p21 (PAK); proporcionar una pareja de unión natural de PAK o un sustrato de fosforilación de PAK; administrar al menos una sustancia candidata a PAK y a la pareja de unión natural o al sustrato de fosforilación; y medir el efecto de al menos una sustancia candidata sobre la interacción de unión, medir la capacidad de al menos una sustancia candidata para competir con la interacción de unión entre PAK y la pareja de unión natural o medir el efecto de al menos una sustancia candidata sobre la capacidad de la PAK para fosforilar el sustrato, e identificar así una sustancia que inhibe PAK y es útil para tratar un trastornos del desarrollo neurológico incluyendo el síndrome del cromosoma X frágil, el retraso mental, trastornos del espectro autista, insuficiencia ovárica prematura o síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil.

12. 12.

    Uso de al menos un inhibidor de quinasa activada por p21 (PAK) en la fabricación de un medicamento para tratar un trastorno del desarrollo neurológico.

13. 13.

    El uso de la reivindicación 12, en donde el trastorno del desarrollo neurológico se selecciona de síndrome del cromosoma X frágil, retraso mental, trastornos del espectro autista, insuficiencia ovárica prematura o síndrome de ataxia y temblor asociados al cromosoma X frágil.