METODO DI VISUALIZZAZIONE E CARATTERIZZAZIONE DEL SISTEMA NERVOSO MEDIANTE COLORAZIONE COMBINATA PER IMPREGNAZIONE METALLICA ED IMMUNOISTOCHIMICA
* ;Campo dell’invenzione ;L’invenzione à ̈ relativa ad un metodo di visualizzazione e caratterizzazione del sistema nervoso, ed in particolare del sistema nervoso centrale, mediante colorazione della stessa sezione istologica per impregnazione metallica ed immunocitochimica. Le sezioni istologiche doppiamente marcate sono quindi successivamente sottoposte ad analisi quali-quantitativa morfologica e antigenica e/o neurochimica mediante microscopia ottica convenzionale o microscopia confocale a scansione laser. ;Stato della tecnica ;Il metodo istologico di impregnazione metallica mediante applicazione di bicromato di potassio e nitrato d’argento, messo a punto da Camillo Golgi nel 1873, rappresenta ad oggi con tutte le sue successive variazioni un metodo di riferimento ed imprescindibile per l’analisi istologica del tessuto nervoso, in particolare del sistema nervoso centrale. Attualmente, l’impregnazione metallica più usata à ̈ quella proposta da Cox nel 1891, nota come impregnazione mercurica o metodo di Golgi-Cox o reazione nera, che prevede la sostituzione dell’argento nitrato con il mercurio cloruro. Tale tecnica à ̈ largamente impiegata per l’analisi qualitativa della morfologia dei neuroni e la determinazione quantitativa delle spine dendritiche, della lunghezza e della complessità delle ramificazioni dei dendriti. Un’altra tecnica di successo applicata alla visualizzazione e caratterizzazione di tessuti à ̈ l’immunoistochimica, tecnica che sfrutta la capacità di anticorpi marcati con opportuni marcatori, preferibilmente fluorescenti, di legare specifici antigeni con alta affinità . Questa tecnica à ̈ ampiamente essere usata per localizzare antigeni sia a livello cellulare che subcellulare ed ha anche questa un’ampia applicazione nel sistema nervoso centrale. ;Entrambe queste due metodologie di visualizzazione e caratterizzazione di tessuti sono state in anni recenti ottimizzate dall’applicazione alle stesse della microscopia confocale a scansione laser (“confocal laser scanning microscopy†CLSM) in modalità a riflessione, tecnica questa adatta alla modellizzazione ed alla ricostruzione in 3D di strutture cellulari, in particolari neuroni. Il recente larghissimo impiego della microscopia confocale a scansione laser applicata a queste tecniche à ̈ dovuto alla possibilità di ottenere da campioni preparati per un esame alla luce convenzionale o fluorescente immagini di altissima qualità . La microscopia confocale a riflessione permette, infatti, nel caso della tecnica di impregnazione mercurica di visualizzare i tessuti impregnati con le particelle metalliche in modo vantaggioso, poiché le particelle metalliche riflettono la luce del laser e non presentano il fenomeno del foto-sbiancamento. Nel caso, invece, dell’immunoistochimica tale metodo di analisi dei tessuti permette di controllare la profondità del campo, di ridurre il disturbo di sottofondo e di collezionare sezioni ottiche seriali del campione. Inoltre, la microscopia confocale a laser permette di rilevare fini dettagli che possono rappresentare informazioni sostanziali che andrebbero perse con la microscopia convenzionale. ;In passato sono stati fatti alcuni tentativi di combinare l’impregnazione metallica e la marcatura con l’immunoperossidasi. In proposito si possono ricordare le metodologie di impregnazione Golgi dopo trasporto retrogrado della perossidasi proposte inizialmente da Somogyi et al. e Freund e Somogyi applicate rispettivamente alla corteccia visiva del gatto (Somogyi P et al., 1983, Neuroscience, 9, 475-490) e della scimmia (Freund TF, Somogyi P, 1983, Neuroscience 9, 463-474). Tuttavia, le metodologie proposte sono notevolmente complesse e scarsamente riproducibili. ;Sono state proposte anche tecniche di perfusione e fissazione dei tessuti tali da rendere il metodo di Golgi, e le sue variazioni, più versatili a seconda degli scopi sperimentali. Circa la fissazione sono stati proposti vari tempi di fissazione dei tessuti in formalina da poche ore (Williams RS, 1983, J. Neuropath.Exp. Neurol. ;42, 210-212) a diversi anni (Goradz R et al., 2003, J. Neuroscience Meth. 131, 1-7). ;In nessuna caso à ̈ stata proposta, invece, la combinazione della doppia marcatura con il metodo di impregnazione mercurica di Golgi-Cox e l’immunofluorescenza. Ciò à ̈ dovuto presumibilmente al fatto che la reazione di impregnazione metallica e l’immunofluorescenza sono ritenute incompatibili per le significative differenze nelle procedure di perfusione e fissazione previste per le due tecniche (Lee KW et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 28, 103, 3399-3404). ;Sommario ;Pertanto per ovviare ai limiti dei metodi in uso, uno scopo della presente invenzione à ̈ la messa a punto di un metodo di visualizzazione e caratterizzazione dei tessuti del sistema nervoso, ed in particolare del sistema nervoso centrale, mediante colorazione della stessa sezione istologica per impregnazione metallica ed immunocitochimica. In particolare, lo scopo della presente invenzione à ̈ la messa a punto di un metodo di semplice eseguibilità e di elevata riproducibilità , che permetta nello stesso tempo di ottenere una amplificazione degli effetti delle due metodiche sulla visualizzazione delle conformazioni morfo-strutturali di tessuti nervosi ed un sinergismo tra le stesse, permettendo l’analisi delle stesse sezioni istologiche mediante microscopia ottica convenzionale o microscopia confocale a scansione laser. ;Il metodo qui di seguito descritto si basa, quindi, sulla combinazione delle due tecniche di marcatura istologica negli stessi campioni dei tessuti da analizzare, ovvero l’impregnazione metallica e l’immunoistochimica, associata all’analisi dei campioni così preparati con la microscopia ottica convenzionale o, preferibilmente, con la microscopia confocale a scansione laser. ;La soluzione individuata per superare l’incompatibilità tra le diverse procedure di impregnazione metallica, con particolare riferimento all’impregnazione Golgi-Cox, e l’immunoistochimica consiste sostanzialmente nelle modalità di fissazione dei tessuti da studiare che prevedono una fissazione ex vivo dei tessuti mediante paraformaldeide in opportune concentrazioni, opzionalmente pre-fissati con la stessa soluzione della fissazione ex vivo comprendente paraformaldeide. ;È oggetto quindi della presente invenzione un metodo di visualizzazione e caratterizzazione del sistema nervoso mediante colorazione combinata per impregnazione metallica ed immunocitochimica comprendente almeno le fasi di: ;- fissazione di campioni di tessuto nervoso con una soluzione acquosa comprendente paraformaldeide ad una concentrazione compresa tra 1 e 4% p/v; ;- impregnazione metallica dei campioni di tessuti fissati; ;- trattamento di sezioni dei tessuti impregnati con il metallo con gli opportuni reagenti per la colorazione immunoistochimica perseguita. Il metodo secondo l’invenzione trova applicazione in campo sperimentale e clinico per lo studio delle caratteristiche delle connessioni neuronali nel sistema nervoso centrale. ;Il metodo e le sue possibili realizzazioni, come pure i vantaggi dello stesso, saranno più chiari dalla descrizione dettagliata dell’invenzione che segue con l’ausilio delle figure allegate alla stessa. ;Breve descrizione delle figure ;Figura 1. La figura mostra il “volume rendering†di alcuni neuroni della Substantia Nigra compacta (SNc) impregnati con il metodo di Golgi-Cox (Golgi-C.) e positivi all’immunofluorescenza per la tirosina idrossilasi (TH-immunofluorescenza). Il pannello (a) mostra un neurone contemporaneamente impregnato col metodo di Golgi-Cox e positivo alla TH-immunofluorescenza. Nei panneli (b) e (c) sono riportati i risultati dei “rendering†separati rispettivamente per la TH-immunofluorescenza e l’impregnazione di Golgi-Cox. L’analisi della colocalizzazione (d) mostra chiaramente che l’impregnazione con Golgi-Cox à ̈ maggiormente dettagliata rispetto alla TH-immunofluorescenza. Infatti la ramificazione dendritica indicata dalla freccia nera nel pannello (c) non à ̈ visualizzata nel pannello (d). Dal pannello (e) à ̈ evidente che il profilo cellulare, la dimensione e la morfologia sono meglio apprezzabili con l’impregnazione Golgi-Cox rispetto all’immunofluorescenza; le frecce bianche indicano alcune strutture dendritiche “spines-like†visibili solo con l’impregnazione mercurica. Nel pannello (f) à ̈ visualizzato questo “stack†ruotato di 90° nell’asse delle x per valutare la penetrazione degli anticorpi primari e secondari anti TH per tutto lo spessore della scansione. ;Figura 2. La figura mostra neuroni del mesencefalo impregnati con il metodo Golgi-Cox, TH-positivi e immunofluorescenza puntiforme per la “Post-Synaptic-Density 95†(PSD95) rilevati con un algoritmo di “rendering†di superficie. Nella figura à ̈ visibile la distribuzione della immunofluorescenza della PSD-95 colocalizzata con neuroni TH-positivi (b, c, d), con neuroni impregnati con il metodo Golgi-Cox (b, c, d) e non co-localizzata (a, c, d). La freccia bianca indica profili cellulari non colorati ma individuabili attraverso la distribuzione della PSD-95. Per valutare il grado di penetrazione degli anticorpi anti PSD-95 (sia primari che secondari) lo “stack†à ̈ stato ruotato di 90° nell’asse z (d). Le immagini nei pannelli (c) e (d) sono state ottenute per rilevamento non selezionato dei canali per la TH-Immunofluorescenza e impregnazione di Golgi-Cox. ;Figura 3. La figura mostra nel pannello (a) il “surface rendering†di neuroni medi spinosi (MSN) dello striato impregnati con il metodo di Golgi-Cox adiacenti alla commissura anteriore (ACA) e circondati da una rete molto densa di fibre TH-positive. Questo “stack†à ̈ stato ruotato di 90° per mostrare l’orientamento prevalentemente caudo-rostrale delle fibre (d). Un ramo dendritico MSN (b) à ̈ incluso in una densa rete di fibre TH-positive che prendono stretti contatti con il tronco dendritico e il collo delle spine (c). ;Figura 4. La figura mostra in (a) il “surface rendering†di una branca dendritica di un MSN colorato con il metodo di Golgi-Cox e una doppia immunofluorescenza per la SynI e la PSD-95. L’analisi di co-localizzazione mostra che la PSD-95 à ̈ distribuita specialmente nella testa delle spine, ma anche nel loro collo e nel tronco dendritico (b, c, d, e). Quando à ̈ stata abbinata alla PSD-95, l’immunofluorescenza per la SynI indica sinapsi, sia simmetriche che asimmetriche col collo e la testa delle spine rispettivamente e il tronco dendritico (a, e). Anche nello striato à ̈ possibile rilevare profili cellulari di neuroni non colorati (freccia bianca). Il pannello (c) mostra lo stesso “dataset†ruotato di 90° sull’asse x senza il canale Synl. Nel pannello (e) alcuni punti Synl sono stati rimossi a mano per permettere una migliore comprensione delle relazioni tra elementi pre- e postsinaptici con il dendrite colorato con il metodo di Golgi-Cox. ;Descrizione dettagliata dell’invenzione ;Come noto e già in precedenza ricordato, la tecnica di impregnazione metallica di Golgi, inclusa la variante dell’impregnazione mercurica di Golgi-Cox, e la tecnica di immunofluorescenza non possono essere applicate nella stessa sezione di tessuto. Tale incompatibilità risiede essenzialmente nel fatto che per l’immunoistochimica il punto critico à ̈ la fase di fissazione dei tessuti, dovendosi evitare la denaturazione dei siti di riconoscimento degli anticorpi e la diffusione delle proteine dalla loro localizzazione iniziale per evidenti problemi connessi alla produzione di artefatti sperimentali e conseguente scarsa affidabilità del dato sperimentale. ;Per ovviare a questo problema tecnico gli inventori hanno messo a punto un metodo che prevede una fissazione ex vivo dei tessuti mediante paraformaldeide in opportune concentrazioni, opzionalmente pre-fissati con la stessa soluzione comprendente paraformaldeide. Di queste due fasi di fissazione, la seconda, ovvero la fissazione ex vivo, à ̈ la fase critica per la colorazione immunoistochimica, in quanto per un’adeguata colorazione dei tessuti gli anticorpi devono penetrare in tutta la profondità del tessuto e legarsi agli specifici antigeni nonostante la fissazione delle proteine. Le condizioni di esecuzione di questa fissazione sono quindi essenziali per l’ottenimento di una colorazione immunochimica efficace. In merito, pur essendo noto che il processo di fissazione delle proteine con formaldeide à ̈ lento e pressoché completo solo in 24 ore (Helander KG, 1994, Biotech. Histochem.69,177-179) non à ̈ scontato che la stessa permetta nel contempo anche una efficiente penetrazione degli anticorpi necessari per l’immunoistochimica ed un loro effettivo legame agli antigeni. ;Per il metodo di visualizzazione e caratterizzazione del sistema nervoso mediante colorazione combinata per impregnazione metallica ed immunocitochimica oggetto dell’invenzione la fase di fissazione à ̈ quindi tale da permettere sia la fissazione delle proteine che una efficiente penetrazione degli anticorpi per l’immunoistochimica. In particolare, la fissazione dei campioni di sistema nervoso prevede una fissazione di un campione di tessuto da esaminare con una soluzione acquosa comprendente paraformaldeide ad una concentrazione tra 1 e 2% p/v o una soluzione di paraformaldeide al 4% p/v in tampone fosfato di Sorensen (PBS 0.4M, pH 7.4). ;Tale metodo può essere realizzato, infatti, secondo due diversi protocolli, ossia due diverse realizzazioni dello stesso metodo, che in ogni caso prevedono una fissazione dei campioni da esaminare in una soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS (0.4M, pH 7.4) o in una composizione che comprende sia il fissativo, ovvero la paraformaldeide in concentrazione tra 1 e 2% p/v, sia i reagenti per l’impregnazione metallica secondo il noto metodo di Golgi-Cox, per immersione degli stessi alla temperatura di 4°C per almeno 8 ore e sino a 12h. ;Nel caso in cui invece, la fissazione sia eseguita con una soluzione acquosa comprendente paraformaldeide tra 1 e 2% p/v ed i reagenti per l’impregnazione metallica secondo Golgi-Cox, la fase di impregnazione metallica viene iniziata già nella fase di fissazione e la successiva fase di impregnazione viene eseguita per rinnovare i reagenti e massimizzare l’impregnazione. Sostanzialmente in questo secondo caso vengono sfruttate anche le proprietà fissative della soluzione dei sali per l’impregnazione mercurica Golgi-Cox, proprietà fissative che sono peraltro la base per l’impregnazione metallica stessa, combinate con le proprietà fissative della paraformaldeide. ;La composizione impiegabile per la fase combinata di fissazione ed impregnazione metallica consiste in una soluzione acquosa comprendente: ;- dicromato di potassio (K2Cr2O7) 5g ;- cloruro mercurico (HgCl2) 5g ;- cromato di potassio (K2CrO4) 3.2g ;- paraformaldeide 5-10 g ;- H2O 480 mL ;a pH 7.4. ;Opzionalmente, la fase di fissazione con paraformaldeide al 4% o con la composizione comprendente la paraformaldeide tra 1 e 2% ed i reagenti per l’impregnazione metallica può essere preceduta da una pre-fissazione per perfusione con la stessa soluzione comprendente paraformaldeide della successiva fase di fissazione ex vivo. ;Tale fase di perfusione e pre-fissazione à ̈ comunque non essenziale per il raggiungimento dello scopo dell’invenzione e può essere quindi omessa, permettendo così l’applicazione del metodo anche in campo clinico. ;Relativamente alla tecnica di impregnazione mercurica ed all’immunoistochimica, in entrambi i protocolli queste sono eseguite secondo modalità note ad un esperto del ramo. ;Pertanto come noto, l’impregnazione mercurica può essere ottenuta per: ;- immersione per 2 giorni in soluzione Golgi-Cox composta da: bicromato di potassio al 5%, cloruro mercurico al 5%, cromato di potassio al 5% (pH 6.5) (Glaser and van der Loos, 1981, J. Neuroscience Meth.4, 117-125) al buio; ;- sostituzione della soluzione di Golgi-Cox con soluzione fresca e mantenimento dei campioni in immersione al buio per 14 giorni. L’immunoistochimica, invece, viene effettuata su sezioni di campioni di tessuti impregnati e quindi dopo impregnazione mercurica il metodo comprende l’ulteriore fase di taglio dei campioni in fette di 50-100 µm di spessore con un criostato o un vibratomo. Le sezioni ottenute sono, quindi, sottoposte ai seguenti trattamenti prima dell’immuno-colorazione in “free floating†con gli opportuni reagenti: ;- trattamento delle fettine con una soluzione di ammoniaca al 30% per 40 minuti al buio a temperatura ambiente; ;- fissazione delle fette con un fissativo fotografico diluito 1:7 per 10 minuti. Nel caso che il tessuto sia sezionato in fettine con un criostato, lo stesso va trattato prima del taglio con una soluzione crio-protettiva di saccarosio al 30 % per immersione per due o tre giorni. Questo passaggio può essere saltato se si usa il vibratomo. Inoltre per il taglio con criostato la temperatura del campione à ̈ preferibilmente di -4°C e la temperatura della lama -14°C. In ogni caso le fette vengono raccolte in pozzetti contenenti H2O. ;Inoltre, come noto ad un esperto, il metodo oggetto dell’invenzione può comprende ulteriori fasi, ad esempio di lavaggio per rimuovere le tracce dei fissativi usati per l’impregnazione mercurica e per l’immunosistochimica. ;Tipicamente, quindi, per quanto in precedenza menzionato secondo una realizzazione applicabile in campo sperimentale, e quando si voglia avere una maggiore qualità della visualizzazione derivante dall’immunoistochimica, il metodo secondo l’invenzione comprende le fasi di: ;- fissazione ex vivo dei tessuti da esaminare per immersione in soluzione paraformaldeide al 4% in PBS (0.4M, pH 7.4) o una composizione acquosa comprendente paraformaldeide al 1-2% ed i reagenti per l’impregnazione metallica a 4°C per almeno 8 ore preventivamente pre fissati per perfusione con la stessa soluzione della fissazione comprendente paraformaldeide; ;- impregnazione metallica di Golgi-Cox sui campioni di tessuti fissati ottenuti; ;- trattamento di fettine di tali campioni di tessuti impregnati con gli anticorpi primari e secondari per la reazione di immunoistochimica perseguita. ;In entrambi i casi, come noto ad un esperto del settore, devono essere previsti anche ulteriori fasi di tra le fasi principali di fissazione, impregnazione metallica ed immunoistochimica in precedenza dettagliate. Tali fasi sono: ;- lavaggio dei cervelli in PBS per almeno 8h (5 lavaggi) per rimuovere ogni traccia di fissativo dopo la fissazione ex vivo; ;- lavaggio dei campioni con acqua dopo l’impregnazione metallica; ;- opzionalmente, prima dell’immuno-colorazione se il tessuto à ̈ sezionato in fettine con criostato, immersione per due o tre giorni in una soluzione crio-protettiva di saccarosio al 30 %; ;- taglio dei campioni di tessuto in fette coronali di 50-100 µm di spessore; ;con il criostato la temperatura del campione à ̈ preferibilmente di -4°C e la temperatura della lama -14°C; le fette vengono raccolte in pozzetti contenenti H2O; ;- dopo trattamento con ammoniaca lavaggio delle fette con acqua distillata per circa 10 minuti; ;- dopo trattamento con il fissativo fotografico, lavaggio delle fette in acqua distillata (10 minuti) collezionate successivamente in PBS per l’immuno-colorazione; ;- esame preliminare al microscopio della impregnazione di Golgi-Cox; i neuroni devono apparire neri su fondo chiaro; ;- dopo immuno-colorazione esame dei tessuti doppiamente colorati mediante microscopia ottica convenzionale e/o confocale a scansione laser. ;Dalla sperimentazione eseguita si à ̈ potuto verificare che il metodo di visualizzazione e caratterizzazione del sistema nervoso oggetto dell’invenzione à ̈ nei fatti un metodo semplice, facilmente riproducibile e dà risultati di elevata qualità e quindi adempie agli scopi fissati. ;I principali vantaggi offerti da questo metodo si possono così riassumere: ;- massima visualizzazione, al microscopio ottico, dei dettagli neuronali strutturali; ;- caratterizzazione degli antigeni con anticorpi specifici e caratterizzazione biochimica degli elementi neurali impregnati delle stesse sezioni istologiche; ;- visualizzazione delle interazioni anatomiche tra gli elementi neuronali evidenziati in fluorescenza e Golgi-Cox; ;- possibilità dell’utilizzo del microscopio confocale a scansione laser; ;- risparmio di animali da laboratorio (senza questo metodo le due procedure vanno eseguite separatamente su animali diversi). ;;PARTE SPERIMENTALE ;Materiali e metodi ;Per la ricerca di seguito descritta sono stati usati ratti maschi albini Sprague-Dawley forniti dalla Charles River (Como, Italia) del peso di 200-225 g. Tutti gli esperimenti sono stati condotti seguendo le direttive dell’EEC che regolamenta l’uso degli animali sperimentali (CEE N°86/609) e contiene le linee guida per la cura e l’utilizzo degli animali da laboratorio approvate dalla Società Italiana di Neuroscienze. Prima di qualsiasi trattamento gli animali erano anestetizzati profondamente con uretano (1.3g/kg) e perfusi per via intracardiaca con soluzione fisiologica (soluzione salina 0.9%) o con “Sorensen’s Phosphate Buffer†(PBS) 0.4M. ;L’impregnazione mercurica à ̈ stata eseguita con una soluzione di Golgi-Cox composta da: bicromato di potassio al 5%, cloruro mercurico al 5%, cromato di potassio al 5% (pH 6.5) (Glaser EM, van der Loos H, 1981, ref. cit.). ;Il metodo di doppia colorazione mediante impregnazione mercurica Golgi-Cox ed immunoistochimica à ̈ stato validato sulle vie nervose “meso-cortico-limbica†e “nigrostratale†contenenti neuroni e fibre positive alla tirosina idrossilasi (TH). A questo scopo sono stati quindi impiegati anticorpi primari commerciali poli- e monoclonali di coniglio e topo anti-tirosina idrossilasi (TH), anti “post-synapticdensity 95†(PSD95) e anti sinapsina I (SynI) forniti rispettivamente da Santa Cruz Biotechnology Inc. (anticorpi policlonali di coniglio anti-TH (r_anti-TH) e anti-SynI; anticorpi monoclonali di topo anti-PDS95) e Sigma-Aldrich (anticorpi monoclonali di topo anti-TH (m_anti-TH)). Gli anticorpi secondari impiegati sono stati: anti-topo IgM biotinilate di capra e fluoresceina-streptavidina (Vector Laboratories, Burlingame, CA), anti-coniglio Alexa Fluor 546 (1:200, Molecular Probes). ;Come procedura di controllo, tre ratti sono stati anestetizzati profondamente e perfusi per via intracardiaca con una soluzione salina allo 0,9%, come sopra. I cervelli sono stati immersi immediatamente nella soluzione Golgi-Cox secondo la procedura tradizionale senza nessuna fissazione e successiva post-fissazione con paraformaldeide (Fregerslev S et al., 1971, Histochemie, 26, 289-304). ;Il protocollo di fissazione e colorazione con impregnazione mercurica e immunoistochimica secondo il metodo oggetto dell’invenzione sono stati realizzati secondo le due diverse modalità di fissazione ex vivo con paraformaldeide al 4% e impregnazione mercurica in sequenza o fissazione e impregnazione metallica combinate descritte in dettaglio di seguito rispettivamente all’esempio 1 come metodo a) e all’esempio 2 come metodo b). ;Esempio 1: fissazione dei tessuti cerebrali con paraformaldeide 4% ed impregnazione mercurica eseguite in sequenza (metodo a). ;Ratti Sprague-Dawley Charles River, (Como, Italy) del peso di 200-225 g sono stati profondamente anestetizzati con idrato di cloralio. Si eseguiva quindi una perfusione intracardiaca con 400µl di soluzione fisiologica seguita da 200µl di soluzione di paraformaldeide al 4% in PBS (pH 7.4). I cervelli sono stati rimossi con cura dal cranio e posti nella stessa soluzione di fissazione a base di paraformaldeide a 4°C per la durata della notte. I cervelli sono stati poi lavati in PBS per almeno 8h (5 lavaggi) per rimuovere ogni traccia di fissativo. ;Successivamente, ciascun cervello à ̈ stato immerso nella soluzione di Golgi-Cox (in quantità sufficiente a coprire interamente i campioni) e mantenuto al buio due giorni. La soluzione à ̈ stata quindi sostituita con una soluzione Golgi-Cox fresca ed il cervello à ̈ stato mantenuto nella stessa per ulteriori 14 giorni sempre al buio. I campioni sono stati quindi lavati in H2O (3x5 min.) e trasferiti per due o tre giorni in una soluzione crio-protettiva di saccarosio al 30 %. I cervelli sono stati poi tagliati in fette coronali di 50-100 µm di spessore. Col criostato, la temperatura ottimale del campione à ̈ di -4°C e la temperatura ottimale della lama à ̈ -14°C. Le fette ottenute sono state raccolte in pozzetti contenenti H2O e trattate con una soluzione di ammoniaca al 30% per 40 min. al buio a temperatura ambiente. Le fette sono state sciacquate in acqua distillata per 10 min. e fissate per 10 min. con un fissativo fotografico (Kodak Fix for Paper) diluito 1:7. Le fette, infine, sono state sciacquate in acqua distillata (10 min.) e collezionate in PBS per la successiva immuno-colorazione in “free floating†. ;Per la colorazione immunoistochimica tutte le fette sono state lavate in PBS (3 x 10 min.) a temperatura ambiente e per prevenire legami non specifici, le fette sono state pre-incubate in una soluzione contente: siero di capra normale al 5%, albumina serica bovina al 5% e Triton- X-100 allo 0.5% in PBS a 4ºC per tutta la notte. Le fette sono state incubate quindi con gli anticorpi primari nelle seguenti combinazioni: ;a) visualizzazione dell’enzima tirosina idrossilasi in fette impregnate in Golgi-Cox: m_anti-TH (1:400) in PBS per 48 h. a 4ºC; ;b) visualizzazione dell’enzima tirosina idrossilasi e proteine della PSD-95 in fette impregnate in Golgi-Cox: miscela di r_anti-TH (1:1000) e anti PSD-95 di topo (1:1000) in PBS per 48 h a 4ºC; ;c) visualizzazione dell’enzima tirosina idrossilasi e proteine della sinapsina I in fette impregnate in Golgi-Cox: miscela di m_anti-TH (1:400) e anti-SynI di coniglio (1:1000) in PBS per 48 h a 4ºC; ;d) visualizzazione delle proteine della PSD-95 e proteine della sinapsina I in fette impregnate in Golgi-Cox: miscela anti-SynI di coniglio (1:1000) e anti PSD-95 di topo (1:1000) in PBS per 48 h a 4ºC. ;Tutte le sezioni sono state lavate 3 x 10 min. in PBS e quindi incubate con gli anticorpi secondari secondo il seguente schema: ;- le sezioni in a) anti-topo IgM biotinilate di capra (1:200) in PBS per 4 h, a temperatura ambiente; dopo questo passaggio le fette sono state lavate ulteriormente in PBS (3 x 10 min), e trattate con fluoresceinastreptavidina (1:200,) in PBS per 4h, a temperatura ambiente; ;- le sezioni in b), c) e d) anti-topo IgM biotinilate di capra (1:200) in PBS per 4 h, a temperatura ambiente; le fette sono incubate con una miscela di fluoresceina-streptavidina (1:200) e anti-coniglio Alexa Fluor 546 (1:200) in PBS per 4 h a temperatura ambiente. ;Alla fine delle incubazioni con anticorpi primari e secondari tutte le sezioni sono state lavate (3 x 10 min) in PBS e montate su vetrino e chiuse con Vectashield (Vector Laboratories, Burlingame, CA). ;Esempio 2: fissazione ed impregnazione metallica eseguite contemporaneamente (metodo b) ;Il metodo b) à ̈ il metodo che prevede la combinazione della fissazione con paraformaldeide ed impregnazione metallica e per questo metodo viene preparata la composizione già descritta in precedenza. La preparazione di tale composizione à ̈ descritta di seguito. ;Preparazione della composizione ;Si preparano separatamente le seguenti soluzioni acquose: ;A) K2Cr2O7al 5%; ;B) HgCl2al 5%; ;C) K2CrO4al 4%. ;Quindi i diversi componenti sono miscelati tra di loro lentamente e sotto agitazione continua come segue: ;1. a 80 mL della soluzione C) sono aggiunti 200mL di acqua; ;2. 100mL della soluzione A) sono miscelati con 100mL della soluzione B); 3. le miscele ottenute in 1 e 2 sono mescolate ed addizionate con 5-10 g di paraformaldeide. Quando si aggiunge la paraformaldeide la temperatura va controllata in quanto non deve superare i 60°C. Si controlla il pH della soluzione così ottenuta e se necessario si porta a pH 7.4. La composizione viene quindi mantenuta al buio per 5 giorni e quindi filtrata. ;Esecuzione del metodo ;Gli animali, l’anestesia e la perfusione sono come nell’esempio 1 con la differenza che in questo caso la pre-fissazione per perfusione à ̈ stata eseguita con la composizione comprendente la paraformaldeide e i reagenti per l’impregnazione metallica preparata come descritto qui sopra. Alla perfusione con la composizione à ̈ stata fatta seguire una fissazione dei cervelli ex vivo per immersione nella medesima composizione. La prosecuzione dell’impregnazione metallica e l’immunofluorescenza sono state eseguite come nell’esempio 1. ;Tutti i campioni dei tessuti (esempio 1 e 2) sono stati esaminati in microscopia di luce convenzionale per valutare la riuscita dell’impregnazione e in microscopia in fluorescenza e in microscopia confocale a scansione laser per valutare la riuscita della reazione di immunofluorescenza. ;Sia il metodo a) che il metodo b) secondo l’invenzione sono stati testati nella via dopaminergica meso-cortico-limbica, contenente vari nuclei cerebrali che vanno dal mesencefalo ai gangli della base sino alla corteccia frontale. Nel mesencefalo (area ventro-tegmentale e substantia nigra) si trovano i corpi cellulari dei neuroni contenenti dopamina (DA) che proiettano i loro assoni prevalentemente nei nuclei della base e nella corteccia frontale. I risultati attesi quindi sono per il mesencefalo: ;- visualizzazione dei neuroni DA-ergici nel mesencefalo evidenziati sia attraverso l’impregnazione mercurica (Golgi-Cox) che attraverso la reazione di immunofluorescenza contro la TH; ;- visualizzazione di neuroni non TH positivi attraverso la colorazione di Golgi-Cox; ;- visualizzazione delle proteine pre- e post-sinaptiche sia nei neuroni impregnati che positivi all’immunofluorescenza contro la TH. ;Per l’area nigro-striatale invece i risultati attesi sono: ;- visualizzazione delle fibre TH positive, almeno in parte provenienti dal mesencefalo; ;- visualizzazione in Golgi-Cox dei neuroni dello striato (“medium spiny neurons†), che sono le principali cellule bersaglio dei neuroni DA-ergici; - visualizzazione delle proteine pre-sinaptiche co-localizzate nei terminali TH-positivi (immunofluorescenza); ;- visualizzazione delle proteine post-sinaptiche co-localizzate nei neuroni medi spinosi (Golgi-Cox immunofluorescenza); ;- interazioni di tutti questi elementi tra loro. ;Risultati ;In prima istanza si à ̈ rilevato che la pre-fissazione e fissazione ex vivo in paraformaldeide al 4%, o la pre-fissazione per perfusione e fissazione ex vivo con la composizione comprendente sia paraformaldeide che i reagenti per l’impregnazione mercurica, dei tessuti cerebrali non mostra di avere effetti significativi sull’impregnazione mercurica standard di Golgi-Cox, né sulla colorazione immunoistochimica. ;Infatti, in tutti i preparati esaminati con la procedura di Golgi-Cox si à ̈ ottenuto una buona impregnazione degli elementi neurali che sono risultati omogeneamente distribuiti nel tessuto. Come di regola, à ̈ risultata colorata solo una porzione del numero totale di neuroni, pari a circa il 5-10%. Questi, distribuiti in modo casuale e uniforme, sono risultati completi di albero dendritico, spine dendritiche e assoni. Occasionalmente, sono stati colorati anche alcuni elementi gliali e il lume di qualche capillare sanguigno. In tutte le fette impregnate, esaminate al microscopio in luce bianca convenzionale, gli elementi colorati sono risultati di colore nero intenso su sfondo chiaro. La colorazione di immunoistochimica dei tessuti colorati con Golgi-Cox ha fatto apprezzare elementi fluorescenti molto luminosi e, come atteso, la penetrazione di tutti gli anticorpi à ̈ stata di circa 25-40 µm in entrambi i lati della fetta. Comunque, l’immunoreattività à ̈ stata trovata solo nelle sezioni provenienti da quei cervelli che sono stati perfusi e post-fissati con paraformaldeide, mentre nessuna fluorescenza à ̈ stata ottenuta in quei cervelli perfusi solo con soluzione salina e fissati con la sola soluzione di Golgi-Cox (ratti di controllo). ;In particolare, nel mesencefalo i neuroni impregnati con Golgi-Cox e quelli TH-positivi (fluorescenza) sono stati visualizzati simultaneamente col microscopio confocale a scansione laser (CLSM). Questi neuroni sono risultati, come di norma, distribuiti per tutto il tessuto e non sembravano aver risentito della precedente impregnazione. Infatti, in tutti i preparati, i neuroni sono risultati sempre completi di dendriti e assoni e la immunoreattività à ̈ stata sempre rilevata in maniera omogenea. ;La figura 1 mostra elementi neurali sia TH-positivi che impregnati col Golgi-Cox, nella Substantia Nigra compacta (SNc) e simultaneamente visualizzati col CLSM (1a). la figura mostra che l’applicazione della combinazione di queste due procedure non producono effetti negativi l’una su l’altra, ma al contrario, fornisce informazioni sulla natura neurochimica (TH-immuno-fluorescenza da sola, 1b) dei neuroni impregnati (solo impregnazione, 1c). In oltre, à ̈ stato possibile verificare che l’impregnazione Golgi-Cox offre una rappresentazione più dettagliata delle strutture nervose che la sola immunofluorescenza: infatti, come mostrato nel pannello c e d della figura 1, il dendrite (freccia nera) che appare nel pannello c non à ̈ apprezzabile con la TH-immuno-fluorescenza (1b) come dimostrato attraverso la co-localizzazione (1d). La profondità della scansione, in questo caso, à ̈ stata di 31.5 µm. Questa distanza à ̈ consistente con la possibilità di azione degli anticorpi (1f) e ciò supporta l’interpretazione del risultato. L’analisi vettoriale, mostrata nel pannello 1e, mostra che la procedura Golgi-Cox fornisce una migliore rappresentazione del profilo morfologico del neurone in generale come ad esempio le strutture simili a spine dendritiche (frecce bianche) come precedentemente osservato da Tepper et al. (Tepper JM et al., 1987, J. Neurosci. ;7, 2794-2806). In particolare, la ricerca eseguita dimostra (figure 1e) come le analisi morfologiche basate esclusivamente sulla immunofluorescenza per la TH possono mostrare una minore precisione. ;La distribuzione della immunoreattività alla PSD-95 nel mesencefalo à ̈ risultata non omogenea. La figura 2 mostra come la presenza di PSD-95 può essere visualizzata sia nei neuroni TH-positivi che in quelli TH-negativi e contemporaneamente impregnati col metodo di Golgi-Cox. In accordo con Nowicka et al. (Nowicka D et al., 2003, Acta Neurobiol. Exp. 63, 185-195), la PSD-95, nel pannello 2a e 2c rivela una colorazione densa e puntiforme che permette di individuare anche i profili di neuropili e dendriti di cellule non colorate (freccia bianca). ;Nello striato con la colorazione di Golgi-Cox e l’immunoistochimica per la TH sono stati osservati numerosi neuroni medi spinosi (MSN) impregnati e immersi in una densa rete di fibre TH-positive (figura 3a) provenienti dal mesencefalo. La “surface rendering analysis†ha mostrato, come atteso (Freund TF et al., 1984, Neuroscience 13, 1189-1215), che numerosi terminali assonici TH-positivi formano dei contatti putativi prevalentemente col collo delle spine e il tronco dendritico di MSN (figure 3c). ;Inoltre, nello striato l’immunoreattività con la PSD-95 e la SynI à ̈ stato rilevata in modo uniforme. Quando à ̈ stata eseguita la doppia immuno-colorazione con questi anticorpi in sezioni colorate con l’impregnazione di Golgi-Cox, à ̈ stato possibile rilevare le relazioni tra questi due antigeni nei dendriti e nelle spine dendritiche dei MSN (figura 4). In particolare, “clusters†di PSD-95 sono stati rilevati in associazione con la membrana dei MSN, mentre l’immunoreattività della SynI à ̈ stata sempre trovata al di fuori dei neuroni impregnati (figura 4a). ;In conclusione, i risultati ottenuti dimostrano che il metodo di visualizzazione e caratterizzazione del sistema nervoso oggetto dell’invenzione adempie gli scopi della stessa, essendosi rivelato un metodo semplice e poco costoso, adatto sia per la microscopia convenzionale che per quella confocale, che dà possibilità di abbinare due tecniche incompatibili tra di loro, ovvero l’impregnazione mercurica di Golgi-Cox e l’immunoistochimica. Queste due tecniche per lungo tempo incompatibili tra loro per un impiego simultaneo nelle stesse sezioni (Lee et al. ;2006, ref. cit.) hanno invece potuto essere invece essere combinate seguendo appropriate procedure di fissazione secondo il metodo oggetto dell’invenzione e nel contempo dando ottimi risultati ampiamente corrispondenti ai risultati attesi in base alle conoscenze nel campo. *