CN103534571B

CN103534571B - 通过组合金属浸渍染色和免疫组化染色显现和表征神经系统的方法、组合物和试剂盒

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Publication number: CN103534571B
Application number: CN201280013271.XA
Authority: CN
Inventors: 萨托尼诺·斯皮加; 马可·戴安娜
Original assignee: SA Surrey Roehampton; Universita degli Studi di Cagliari
Current assignee: SA Surrey Roehampton; Universita degli Studi di Cagliari
Priority date: 2011-03-16
Filing date: 2012-03-14
Publication date: 2016-02-10
Anticipated expiration: 2032-03-14
Also published as: EP2686661A1; EP2686661B1; CN103534571A; ITPD20110081A1; WO2012123492A1; US20140295451A1

Abstract

描述了一种显现和表征神经系统的方法，其组合两种用于组织染色的技术，即汞浸渍和免疫组化。所公开的方法通过对经受充分固定程序的组织实施它们使得染色程序中的一种与另一种相容。因此，该方法使得组合可典型用汞浸渍实施的形态测定分析与可典型使用免疫组化获得的抗原和/或神经化学细胞表征是可行的。该方法被证明是简单、可靠、并同时适于传统的显微术和共聚焦激光扫描显微术。

Description

通过组合金属浸渍染色和免疫组化染色显现和表征神经系统的方法、组合物和试剂盒

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发明领域

本发明涉及通过金属浸渍和免疫组化染色相同的组织切片来显现和表征神经系统且更具体地中枢神经系统的方法。通过传统的光学显微术或共聚焦激光扫描显微术随后使得被双重染色的组织切片经受定性和定量的形态学和抗原和/或神经化学分析。

现有技术

由CamilloGolgi在1873年开发的通过应用重铬酸钾和硝酸银的金属浸渍的组织学方法伴随其所有的后续变化继续仍然代表现今参考的方法，且是神经组织更具体是中枢神经系统的组织分析所必需的方法。目前，最常用的金属浸渍是由Cox在1891年提出的方法，称为汞浸渍或Golgi-Cox方法或黑色反应，其预见了用氯化汞替代硝酸银。该技术被广泛用于神经元形态学的定性分析并用于确定树突棘数量、和树突分支的长度和复杂性。

被应用于显现和表征组织的另外的成功的技术是免疫组化，一种利用用适合的标记物优选为荧光标记物标记的抗体以高的亲和力结合特异性抗原的能力的技术。该技术被广泛用于在细胞和亚细胞水平定位抗原，且它也被广泛应用于中枢神经系统。

近年来，这两种显现和表征组织的方法通过应用使用反射模式的共聚焦激光扫描显微术（CLSM）都被改进，后者是一种适于细胞结构，特别是神经元的3D建模和重建的技术。应用至这些技术的共聚焦激光扫描显微术最近被非常广泛地利用是由于从制备用于在常规光线或荧光光线下检查的样本获得最高品质的图像的可能性。事实上，因为金属粒子反射激光光线且不会显示光漂白现象，共聚焦反射显微术允许在汞浸渍技术的情况下以有利的方式显现用金属粒子浸渍的组织。而在免疫组化的情况下，该组织分析方法允许控制景深以减少背景噪音并从样本收集连续的光学切片。此外，共聚焦激光扫描显微术允许调查可代表大量信息并将在传统显微术中被丢失的细小的细节。

在过去，已作出一些尝试来组合金属浸渍和用免疫过氧化物酶的酶的标记。就这一点而言，可被记住的是过氧化物酶逆行运输之后的Golgi浸渍方法，其最初由Somogyi等人和Freund与Somogyi提出，分别被应用至猫（SomogyiP等人,1983,Neuroscience,9,475-490）和猴（FreundTF,SomogyiP,1983,Neuroscience9,463-474）的视皮层。然而，所提出的方法是相当复杂且可重现差的。

这样的技术还被提出用于组织灌注和固定以使得Golgi的方法和其变化取决于实验目的是更多用途的。关于固定，组织在福尔马林中固定已经被提出了几次，从几个小时（WilliamsRS,1983,J.Neuropath.Exp.Neurol.42,210-212)到数年(GoradzR等人,2003,J.NeuroscienceMeth.131,1-7)。

而在任何情况下都还没有提出用Golgi-Cox汞浸渍方法和免疫荧光双重染色的组合。这可能由于以下事实：由于预见到了这两种技术的灌注和固定程序中的显著差异，金属浸渍反应和免疫荧光被视为是不相容的（LeeKW等人,2006,Proc.Natl.Acad.Sci.USA28,103,3399-3404)。

概述

因此，为了纠正该方法在使用中的弊端，本发明的目的是开发通过金属浸渍和免疫组化染色相同的组织切片显现和表征神经系统组织，且更具体地，显现和表征中枢神经系统的方法。特别是，本发明的目的是开发简单执行并高度可再现的方法，其允许科学家同时获得用于显现神经组织的形态-结构构象的两种方法的效果的放大和它们之间的协同作用，允许他们通过传统的光学显微术或共聚焦激光扫描显微术分析相同的组织切片。

因此，在下文描述的方法基于在待被分析的相同的组织样本中组合两种组织染色技术，即，金属浸渍和免疫组化，关联到用传统的光学显微术或优选用共聚焦激光扫描显微术对如此制备的样本的分析。

发现克服不同的金属浸渍程序、特别是关于Golgi-Cox浸渍但不限于该金属浸渍与免疫组化之间的不相容性的办法本质上在于待被研究的组织的固定程序，其预见到了使用合适浓度的多聚甲醛离体固定组织，任选使用同种包括多聚甲醛的离体固定溶液预固定。

因此，本发明的目的是通过组合金属浸渍染色和免疫组化染色显现和表征神经系统的方法，包括至少以下的步骤：

-用包括从1%至4%w/v浓度的多聚甲醛的水溶液固定神经组织样品；

-使被固定的组织样品经受金属浸渍；

-用适合用于打算的免疫组化染色的试剂处理被金属浸渍的组织的切片。

根据本发明的方法可应用于用于研究中枢神经系统中神经元连接的特征的实验和临床领域中。

本方法和其可能的实施方案、还有其优势将通过下面的本发明的详述并在其附加的附图的帮助下变得更加清楚。

附图简述

图1.该图显示用Golgi-Cox方法（Golgi-C.）浸渍并通过免疫荧光（TH-免疫荧光）检测对酪氨酸羟化酶阳性的黑质致密部（SNc）的一些神经元的体绘制（volumerendering）。图（a）显示同时用Golgi-Cox方法浸渍并检测对TH-免疫荧光阳性的神经元。TH-免疫荧光和Golgi-Cox浸渍的绘制的结果分别分开在图（b）和（c）中报道。共定位分析（d）清楚显示了用Golgi-Cox的浸渍比TH-免疫荧光更详细。事实上，图（c）中由黑色箭头指向的树突分支在图（d）中没有显现。从图（e）清楚显示了用Golgi-Cox浸渍可比用免疫荧光更好地鉴别了细胞轮廓、大小、和形态学；白色箭头指示仅通过汞浸渍明显的一些棘-样树突结构。图（f）中该堆栈（stack）在x轴被旋转了90°显示，以评价初级和第二抗-TH抗体沿着整个扫描跨度的渗入。

图2.该图显示用Golgi-Cox方法浸渍的中脑神经元，用面绘制算法调查了突触后密度（Post-Synaptic-Density）95蛋白（PSD-95）的TH-阳性和点状免疫荧光。在该图中，PSD-95的免疫荧光与TH-阳性神经元（b、c、d）共定位的分布是可见的，用Golgi-Cox方法浸渍的神经元（b、c、d）是未共定位的（a、c、d）。白色箭头指向未被染色但通过PSD-95的分布是可检测的细胞轮廓。为了评价抗-PSD-96抗体（初级和第二）的渗入程度，堆栈已在轴z上被旋转90°（d）。通过TH-免疫荧光和Golgi-Cox浸渍通道的未经选择的映射获得图（c）和（d）中的图像。

图3.该图显示图（a）中用Golgi-Cox方法浸渍的临近前连合（ACA）并被TH阳性纤维的非常致密的网包围的纹状体的中等多棘神经元（MSN）的面绘制。该堆栈已被旋转90°以主要显示喙尾（caudal-rostral）方向的纤维（d）。MSN树突分支（b）被包含在TH-阳性纤维的致密网中，这使得树突干（trunk）与棘（c）的颈部密切接触。

图4.该图显示用Golgi-Cox方法和抗-突触蛋白l（Synl）和PSD-95的双重免疫荧光染色的MSN的树突分支的面绘制。共定位分析显示PSD-95特别分布在棘的头部但也在它们的颈部和树突干中（b、c、d、e）。当其与PSD-95配对时，Synl的免疫荧光指示分别与棘的颈部和头部对称和不对称的突触，和树突干（a、e）。未染色的神经元的细胞轮廓也可以在纹状体中看出（白色箭头）。图（c）显示不具有Synl通道的情况下在x轴被旋转90°的相同的数据集。图（e）中，一些Synl点已被手动去除以允许更好的理解在用Golgi-Cox方法染色的树突的情况下突触前和突触后元素（element）之间的关系。

发明详述

如已知的并如先前已指出的，Golgi的金属浸渍技术包括Golgi-Cox的汞浸渍的变化形式，且免疫荧光技术不能够被应用在相同的组织切片中。这种不相容性本质上在于以下的事实：关于免疫组化，关键点为组织固定的步骤，因为必须防止用于抗体识别的位点变性和蛋白从它们的最初的定位扩散，以避免实验假象的产生和因此实验数据的差的可靠性。

为了解决这个技术问题，发明人已开发了预见到使用适合浓度的多聚甲醛的水溶液离体固定组织的方法，任选用包括多聚甲醛的相同的溶液预固定。这两个固定步骤中的第二步，即，离体固定，是用于免疫组化染色的关键步骤，因为为了充分染色组织，抗体必须渗入组织的整个深度并结合特异的抗原，尽管蛋白是固定的。实施该固定的条件因此是获得有效的免疫组化染色必不可少的。在这方面，尽管已知用甲醛的蛋白固定过程是缓慢的并只在24小时内几乎是完全的（HelanderKG,1994,Biotech.Histochem.69,177-179)，但没有预见到后者将同时还允许免疫组化必需的抗体的有效渗入及它们与抗原的实际结合。

关于通过组合金属浸渍染色和免疫组化染色显现和表征神经系统的方法，其是本发明的目的，因此这样的固定步骤允许蛋白的固定和用于免疫组化的抗体的有效渗入二者。更具体地，神经系统样本的固定预见到用包括在1%和2%w/v之间浓度的多聚甲醛的水溶液或Sorensen磷酸盐缓冲液（PBS0.4M,pH7.4）中4%w/v多聚甲醛固定待被检查的组织样本。

事实上，该方法可根据两种不同的方案，或更确切地说，相同方法的两种不同的实施方案被实施，其在任何情况下都预见到通过在4℃的温度将待检查的样本浸泡在PBS（0.4M,pH7.4）中的多聚甲醛溶液4%中至少8小时至最多12h，之后进行金属浸渍，或浸泡在包括固定剂，即，在1%和2%w/v之间浓度的多聚甲醛，和金属浸渍试剂的组合物中，优选根据已知的Golgi-Cox方法，固定待检验的样本。

在其中用包括1%和2%w/v之间的多聚甲醛和金属浸渍试剂的水溶液实施固定的情况下，金属浸渍步骤已经在固定步骤中开始，且实施随后的浸渍步骤以更新试剂并最大化浸渍。本质上，在这第二种情况中盐溶液的固定属性还被利用用于优选的Golgi-Cox汞浸渍，此外是金属浸渍本身的基础的固定属性与多聚甲醛的固定属性相组合。

可被用于组合的固定和金属浸渍步骤的组合物在于具有pH7.4的水溶液中，包括：

任选地，使用多聚甲醛4%或使用包括1%和2%之间的多聚甲醛和金属浸渍试剂的组合物的固定步骤之前可以是通过用后续离体固定步骤的包括多聚甲醛的相同的溶液灌注的预固定。然而，该灌注和预固定步骤不是达成本发明的目的所必需的并因此可被省略，从而允许本方法还在临床领域中应用。

关于金属浸渍技术和免疫组化，在两个方案中这些都根据本领域中的专家已知的方式执行。因此，如已知的，可通过以下获得汞浸渍：

-于黑暗中在由以下组成的Golgi-Cox溶液中浸泡2天：5%重铬酸钾、5%氯化汞、5%铬酸钾(pH6.5)(Glaser和vanderLoos,1981,J.NeuroscienceMeth.4,117-125)；

-用新鲜的溶液替代Golgi-Cox溶液并在黑暗中保持样本被浸泡14天。

而免疫组化对被浸渍的组织样本切片实施并随后在金属优选汞浸渍之后，该方法包括用低温恒温器或振动切片机将样本切成50-100μm厚的切片的另外的步骤。随后，使所获得的切片在具有合适的试剂的自由浮动中免疫-染色之前经受下面的处理：

-于室温在黑暗中用氨水溶液30%处理切片40分钟；

-用被1:7稀释的摄影固定剂固定切片10分钟。

在用低温恒温器将组织切成切片的情况下，在进行切片之前组织必须用低温保护蔗糖水溶液30%通过浸泡处理2或3天。如果使用振动切片机则可跳过该步骤。此外，当使用低温恒温器切割时，样本的温度优选为-4℃且刀片温度为-14℃。在任何情况下，都将切片收集在包含H₂O的凹槽（pit）中。

此外，如专家已知的，根据本发明的方法可包括另外的步骤，例如，冲洗以去除用于汞浸渍和用于免疫组化的固定剂的痕迹。

因此，典型地，关于之前提及的，根据实验领域可适用的实施方案并当追求从免疫组化获取的显现的更高质量时，根据本发明的方法包括以下步骤：

-通过于4℃在PBS(0.4M,pH7.4)中多聚甲醛溶液4%或在包括多聚甲醛1-2%和金属浸渍试剂的含水组合物中浸泡至少8小时离体固定待检验的组织样本，所述组织通过用包含多聚甲醛的相同的固定溶液灌注被事先预固定；

-使得被固定的样本经受金属浸渍，优选为Golgi-Cox浸渍；

-用用于打算的免疫组化反应的初级和第二抗体处理这些被浸渍的组织的样本的切片。

在没有预固定组织的情况下，根据本发明的方法的实施方案可被应用于临床领域。

在两种情况下，如本领域专家已知的，还必须预见到在主要固定步骤之间的另外的步骤，所述主要固定步骤即先前详细描述的金属浸渍和免疫组化。这些步骤为：

-离体固定后，在PBS中冲洗脑至少8h（优选5次冲洗）以去除任何固定剂痕迹；

-金属浸渍之后用水冲洗样本；

-任选地，如果用低温恒温器将组织切成切片，在免疫染色之前，在低温保护蔗糖水溶液30%中浸泡2或3天；

-将组织样本切为50-100μm厚的冠状切片；用低温恒温器，样本的温度优选为-4℃且刀片的温度为-14℃；将切片收集在包含H₂O的凹槽中；

-用氨处理之后，用蒸馏水冲洗切片约10分钟；

-用摄影固定剂处理之后，在蒸馏水中冲洗切片（10分钟），随后被收集在PBS中用于免疫-染色；

-在显微镜下初步检查金属浸渍；神经元应当在清晰的背景上呈现黑色；

-在免疫-染色之后，用传统的光学显微镜和/或共聚焦激光扫描显微镜检查被双重染色的组织。

从实施的实验已可能证实，根据本发明的显现和表征神经系统的方法，实际上是给出高质量的结果并因此实现既定目的的容易重现的简单的方法。

由该方法提供的主要优势可总结如下：

-在光学显微镜下最大化显现结构神经元细节；

-用特定的抗体表征抗原并生物化学表征相同组织切片的被浸渍的神经元素；

-显现在荧光和金属浸渍中突出的神经元素之间的解剖互作；

-使用共聚焦激光扫描显微镜的可能性；

-节约实验室动物和取样（在不采用此方法的情况下，必须在不同的动物/样品上分开实施这两个程序）。

实验部分

材料与方法

关于在下文中描述的研究，使用了由CharlesRiver(Como,Italy)提供的具有200-225g重量的Sprague-Dawley雄性白化大鼠。遵循管理实验动物的使用的U.E.的指导方针（CEEN°86/609）和由意大利神经科学学会（theItalianSocietyforNeuroscience）批准的实验室动物的照管和使用的指导方针执行所有实验。在任何处理之前，使用尿烷（1.3g/kg）深度麻醉动物并经受使用生理溶液（盐水溶液0.9%）或Sorensen磷酸盐缓冲液（PBS）0.4M的穿心灌注。用由以下组成的Golgi-Cox溶液实施金属浸渍：5%重铬酸钾、5%氯化汞、5%铬酸钾(pH6.5)(Glaser和vanderLoos,1981,参考引用）。

通过Golgi-Cox汞浸渍和免疫组化双重染色的方法已在包含神经元和酪氨酸羟化酶（TH）阳性纤维的“中脑-皮质-边缘”（“meso-cortico-limbic”）和“黑质纹状体”（“nigrostriatal”）神经通路上被验证。为了这个目的，使用了下面的试剂：商业的兔初级多克隆抗体和单克隆抗体、和抗-酪氨酸羟化酶（TH）小鼠、抗突触后密度95（PSD-95）、和抗-突触蛋白l(Synl)，分别由SantaCruzBiotechnologyInc.（多克隆兔抗体抗-TH（r_抗-TH）和抗-Synl；单克隆小鼠抗体抗-PDS95）和Sigma-Aldrich（单克隆小鼠抗体抗-TH（m_抗-TH））提供。使用的第二抗体为：抗-小鼠IgM生物素化的山羊和荧光素-链霉亲和素（VectorLaboratories,Burlingame,CA）、抗-兔AlexaFluor546（1:200,MolecularProbes）。

作为对照程序，深度麻醉三只大鼠并经受如以上的用盐水溶液0.9%的穿心灌注。根据传统程序将脑立即浸泡在Golgi-Cox溶液中，没有任何固定和后续用多聚甲醛的后固定（FregerslevS等人,1971,Histochemie,26,289-304）。

根据本发明的方法用汞浸渍和免疫组化的固定和染色方案已根据依次的用多聚甲醛4%离体固定和汞浸渍或组合的固定和金属浸渍两种方式被实施，下文分别在实施例1中作为方法a）和实施例2中作为方法b）详细描述。

实施例1：依次实施用多聚甲醛4%固定脑组织和汞浸渍（方法a）。

用水合氯醛深度麻醉具有200-225重量的Sprague-DawleyCharlesRiver大鼠（Como,Italy）。随后用400μl的生理溶液及之后用200μl的PBS（pH7.4）中的多聚甲醛溶液4%实施穿心灌注。将脑从头骨中小心移出并于4℃放置在相同的基于多聚甲醛的固定溶液中持续整个晚上。随后在PBS中冲洗脑至少8h（5次冲洗）以去除任何固定液的痕迹。

随后，将每一个脑都浸泡在Golgi-Cox溶液中（以足够完全覆盖样本的量）并在黑暗中保持2天。随后用新鲜的Golgi-Cox溶液替换该溶液并始终在黑暗中将脑保持在其中持续另外的14天。

随后用H₂O(3x5min.)冲洗样本并转移在低温保护蔗糖溶液30%中持续2或3天。随后将脑切成50-100μm厚的冠状切片。使用低温恒温器，样本的最适温度为-4℃且刀片的最适温度为-14℃。将获得的切片收集在包含H₂O的凹槽中并于室温在黑暗中用氨溶液30%处理40min.。用蒸馏水冲洗切片10min.并用1:7稀释的摄影固定剂（KodakFixforPaper）固定10min.。最后，在蒸馏水中冲洗切片（10min.）并收集在PBS中用于后续的在自由浮动中免疫-染色。关于免疫组化染色，于室温在PBS（3x10min.）中冲洗所有切片以防止非特异性结合，于4℃在PBS中包含：5%常规山羊血清、5%牛血清白蛋白（BSA）、和0.5%Triton-X-100的溶液中预孵育切片持续整个晚上。随后用以下面的组合的初级抗体孵育切片：

a）在Golgi-Cox中浸渍的切片中显现酪氨酸羟化酶：于4℃在PBS中m_抗-TH(1:400)48h；

b）在Golgi-Cox中浸渍的切片中显现酪氨酸羟化酶和PSD-95蛋白：于4℃在PBS中r_抗-TH(1:1000)和小鼠抗PSD-95(1:1000)的混合物中48h；

c）在Golgi-Cox中浸渍的切片中显现显现酪氨酸羟化酶和突触蛋白l蛋白：于4℃在PBS中m_抗-TH(1:400)和兔抗-Synl(1:1000)的混合物中48h；

d）在Golgi-Cox中浸渍的切片中显现PSD-95蛋白和突触蛋白l蛋白：于4℃在PBS中兔抗-Synl(1:1000)和小鼠抗PSD-95(1:1000)的混合物中48h。

在PBS中冲洗所有切片3x10min.并随后根据下面的方式与第二抗体一起孵育：

-a）中的切片：于室温在PBS中抗-小鼠IgM生物素化的山羊（1：200）中持续4小时；该步骤之后，在PBS中另外冲洗切片（3x10min）并于室温用PBS中荧光素-链霉亲和素（1:200）处理4h；

-b）、c）和d）中的切片：于室温在PBS中抗-小鼠IgM生物素化的山羊（1:200）中持续4h；于室温将切片与PBS中荧光素-链霉亲和素（1:200）和抗-兔AlexaFluor546(1:200)的混合物一起孵育4h。

用初级和第二抗体孵育结束时，在PBS中冲洗所有的切片（3x10min），放置在载玻片上，并用Vectashield（VectorLaboratories,Burlingame,CA）密封。

实施例2：同时实施固定和金属浸渍（方法b）

方法b）是预见到组合用多聚甲醛的固定和金属浸渍的方法，且关于此方法，制备了先前已经描述的组合物。在下文描述该组合物的制备。

组合物的制备

分开制备下面的水溶液：

A)K₂Cr₂O₇5%；

B)HgCl₂5%；

C)K₂CrO₄4%。

随后，按照下面将一个与另一个并在持续搅拌的情况下缓慢混合不同的组分：

1.将200mL水添加至80mL的溶液C）；

2.将100mL的溶液A)与100mL的溶液B)混合；

3.混合1和2获得的混合物并添加5-10g的多聚甲醛。当添加多聚甲醛时，必须监测温度，由于其不允许超过60℃。

控制因此获得的溶液的pH并，如果必要的话，将其调节至pH7.4。随后将组合物保持在黑暗中5天并随后过滤。

固定和浸渍方案

动物、麻醉、和灌注如实施例1中的，不同的是在这种情况下，用如前述制备的包括多聚甲醛和金属浸渍试剂的组合物实施通过灌注的预固定。用组合物灌注之后通过在相同的组合物中的浸泡离体固定脑。如实施例1中实施连续的金属浸渍和免疫荧光。

用传统的光学显微术检查所有组织样本（实施例1和2）以评价浸渍是否成功，并用荧光显微术和共聚焦激光扫描显微术检查以评价免疫荧光反应是否是成功的。

根据本发明的实施例1的方法a）和实施例2的方法b）已经在中脑-皮质-边缘多巴胺能通路中被检测，其包含从中脑出发至基底神经节至额叶皮质的数个脑核团。在中脑（腹侧被盖区和黑质）中是主要在基底核中和额叶皮质中伸出其轴突的包含多巴胺（DA）的神经元的细胞体。因此关于中脑的预期结果是：

-通过汞浸渍（Golgi-Cox）和针对TH的免疫荧光反应都突出了中脑中DA-能神经元的显现；

-通过Golgi-Cox染色显现非TH-阳性神经元；

-在被浸渍的神经元和针对TH免疫荧光阳性的神经元中都显现突触前和突触后蛋白。

而关于黑质纹状体区，预期的结果为：

-TH-阳性纤维的显现，至少部分来自中脑；

-纹状体的神经元（中等多棘神经元）在Golgi-Cox中显现，其是由DA-能神经元主要靶向的细胞；

-显现突触前蛋白共定位于TH-阳性末端（免疫荧光）；

-显现突触后蛋白共定位于中等多棘神经元（Golgi-Cox+免疫荧光）；

-这些元素一个与另一个的互作。

结果

首次调查了用多聚甲醛4%预固定和离体固定，或用包括多聚甲醛和用于脑组织汞浸渍的试剂二者的组合物通过灌注预固定和离体固定证明对标准的Golgi-Cox汞浸渍或对免疫组化染色没有显著影响。

事实上，在用Golgi-Cox程序检查的所有制备物中，获得了神经元素的好的浸渍，其证明均匀分布在组织中。通常，只有神经元的总数目的部分证明被染色了，等于约5-10%。这些神经元随机并一致分布，导致完整的树突树、树突棘和轴突。偶尔，还有一些神经胶质元素和一些毛细血管的腔被染色。在传统的白光显微镜下检查的所有被浸渍的切片中，被染色的元素在清晰的背景上呈现强烈的黑色颜色。用Golgi-Cox染色的组织的免疫组化染色显示非常明亮的荧光元素并如预期的，所有抗体在切片两面的渗入约25-40μm。然而，仅在来自被灌注并用多聚甲醛后固定的那些脑的切片中发现免疫反应性，而在仅用盐水溶液灌注并用仅Golgi-Cox溶液固定的那些脑（测试对照大鼠）中没有获得荧光。

特别地，在中脑中，用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）同时显现用Golgi-Cox浸渍的神经元和TH-阳性（荧光）的神经元。作为惯例，这些神经元被证明分布在所有的组织上，并表现为没有被先前的浸渍负面影响。事实上，在所有的制备物中，神经元通常导致完整的树突和轴突，且被调查的免疫反应性通常是均匀的。

图1显示黑质致密部（SNc）中TH-阳性神经元素和用Golgi-Cox浸渍的神经元素，并同时用CLSM显现（1a）。该图显示这两个程序组合的应用没有互相产生负面影响，但，相反，提供了被浸渍的神经元（仅浸渍，1c）的神经化学性质信息（单独的TH-免疫荧光，1b）。此外，证明Golgi-Cox浸渍比单独的免疫荧光提供更详细的神经结构表示是可能的：事实上，如在图1的图c和d中显示的，图c中呈现的树突（黑色箭头）未能够用TH免疫荧光（1b）鉴别，如通过共定位显示的（1d）。在这种情况下的扫描深度为31.5μm。该距离与抗体作用的可能性一致（1f），这支持该结果的解释。在图1e中示出的矢量分析显示，Golgi-Cox程序提供了整个神经元的形态学轮廓的更好的表示，如例如结构与树突棘（白色箭头）相似，如先前由Tepper等人观察到的(TepperJM等人,1987,J.Neurosci.7,2794-2806)。更具体地，实施的研究显示（图1e）专门基于TH免疫荧光的形态学分析如何能够显示较小的精度。

在中脑中对PSD-95的免疫反应性的分布导致不均匀。图2显示PSD-95的存在如何能够在同时用Golgi-Cox方法浸渍的TH-阳性神经元和TH-阴性神经元中都被显现。根据Nowicka等人(NowickaD等人,2003,ActaNeurobiol.Exp.63,185-195)，图2a和2c中的PSD-95揭示了还允许技术人员鉴定未染色的细胞（白色箭头）的神经纤维网和树突的轮廓的致密和点状染色。

在用Golgi-Cox染色和TH免疫组化的纹状体中，观察到许多被浸渍的中等多棘神经元（MSN）并浸入在来自中脑的TH-阳性纤维（图3a）的致密网中。面绘制分析如预期的（FreundTF等人,1984,Neuroscience13,1189-1215）显示许多TH-阳性轴突末端形成主要与棘的颈部和MSN的树突干接触的推定的突触（图3c）。

此外，检测PSD-95和Synl在纹状体中的免疫反应性是一致的。当用这些抗体在用Golgi-Cox浸渍染色的切片中实施双重免疫-染色时，调查MSN的树突中和树突棘中这两个抗原之间的关系是可能的（图4）。尤其，调查了与MSN的膜相关的PSD-95簇，而Synl的免疫反应性通常被发现在被浸渍的神经元的外部（图4a）。

总之，获得的结果显示作为本发明的目的的显现和表征神经系统的方法实现了它的目的，由于它已证明是适于传统的显微术和共聚焦显微术二者的简单并经济的方法，其满足配对不相容的两种技术，即Golgi-Cox汞浸渍和免疫组化的可能性。而其证明为了将它们同时用于相同的切片中，组合这两种长期不相容的技术是可能的（Lee等人2006，参考引用)，通过遵循根据作为本发明的目的的方法的合适的固定程序并同时给出广泛对应于基于本领域可得的知识的预期结果的最佳结果。

Claims

1.一种用于显现和表征神经系统的方法，其特征在于组合金属浸渍染色和免疫组化染色，所述方法包括至少以下的步骤：

-用包括从1％至4％w/v的浓度的多聚甲醛的水溶液固定神经组织样本；

-使得所述被固定的神经组织样本经受金属浸渍；

-用适合用于打算实施的免疫-组化染色的试剂处理所述被金属浸渍的组织样本的切片。

2.根据权利要求1所述的用于显现和表征神经系统的方法，其中用PBS0.4M,pH7.4中4％w/v多聚甲醛溶液实施所述固定。

3.根据权利要求1所述的用于显现和表征神经系统的方法，其中用具有pH7.4的包括以下的组合物实施所述固定：

4.根据权利要求1至3中的一项所述的用于显现和表征神经系统的方法，其中对用包括从1％至4％w/v浓度的多聚甲醛的、与实施固定相同的溶液预固定的组织实施所述固定。

5.一种组合物，包括：

具有pH7.4，用于根据权利要求1至4中的一项所限定的方法固定组织样本。

6.一种用于权利要求1-4中的一项所限定的通过组合金属浸渍染色和免疫组化染色显现和表征神经系统的方法的试剂盒，所述试剂盒至少包括具有以下的一个或多个容器：a)根据权利要求5所述的组合物；b)用于金属浸渍的试剂；和c)使用说明的活页。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，还包括一个或多个具有PBS中的多聚甲醛4％w/v的溶液的容器。