KR102221776B1 - 모시 세포의 활성 평가를 통한 항우울제의 스크리닝 방법 - Google Patents

모시 세포의 활성 평가를 통한 항우울제의 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

모시 세포의 활성 평가를 통한 항우울제의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 일 양상에 따른 스크리닝 방법은 새롭게 규명한 항우울제의 핵심적인 작용기작에 기초하여, 모시 세포의 신경 활성 수준을 평가 및 비교함으로써, 보다 간이하고 효과적으로 신규 항우울제를 발굴할 수 있다.

Description

모시 세포의 활성 평가를 통한 항우울제의 스크리닝 방법 {Screening method of antidepressant by evaluation of the activity of mossy cells}
모시 세포의 활성 평가를 통한 항우울제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
우울증은 객관적 상황과는 관계없이 일어나는 정서적 병리현상으로서 환자의 모든 생활이 우울한 기분으로 덮여있고, 흥미가 감소하여 무쾌감증 (anhedonia)이 되며, 정신운동의 저하, 염세감, 절망에 사로잡히게 되는 정신적 질병이다. 또한, 식욕저하, 불면증, 변비, 성욕감퇴, 면역기능 저하로 인하여 질병에 대한 감수성이 높아지며, 이 밖에도 다양한 신체적 증상을 보인다. 당업계에서는 중추신경계의 시냅스 (synapse)내에 모노아민 (monoamine)계 신경전달물질인 세로토닌 (serotonin), 노르에피네프린 (norepinephrin), 도파민 (dopamine) 등이 부족하게 되어 우울증이 유발된다는 것이 가장 유력한 가설로 여겨지고 있다.
이에 따라, 대부분의 항우울제는 세로토닌 또는 노르아드레날린 시냅스에서 신경전달물질의 농도를 높이는 약리작용을 가지고 있다. 보다 구체적으로, 항우울제는 신경전달물질의 농도를 높여주는 메카니즘에 따라 크게 삼환계 항우울제 (Tricyclic antidepressants: TCA), 모노아민 옥시다제 억제제 (Monoamine oxidase inhibitor: MAOI), 또는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 (Selective serotonin reuptake inhibitor: SSRI) 등이 주로 사용되고 있다. 페넬진 (phenelzine) 등과 같은 모노아민 옥시다제 억제제는 심장병 유발이라는 심각한 부작용이 있기 때문에 최근에는 잘 쓰이고 있지 않으며, 이미프라민 등과 같은 삼환계 항우울제 역시 항콜린성 부작용 및 진정작용, 심혈관계에 대한 부작용이 상당한 문제점으로 남아 있다. 따라서, 최근에는 이와 같은 부작용이 적은 항우울제로서 선택적 세로토닌 (5-HT) 재흡수 저해제를 이용한 우울증 치료제의 개발에 초점을 두고 있으며, 그 대표적인 약제로서 플루옥세틴 (fluoxetine, 제품명; 푸로작), 파로세틴 (paroxetine, 제품명; 세로자트), 세르트랄린 (sertraline, 제품명; 졸로푸트) 등이 개발되어 임상적으로 그 효능을 널리 인정받고 있다.
그러나, 이러한 세로토닌 재흡수 억제제 계열의 약물도, 전체 투약군 중에서 60% 정도의 환자에서만 효과가 있을 뿐, 나머지 30-40%정도의 환자에서는 치료적 효능을 나타내지 않고, 중추신경계 전체에 퍼져 있는 세로토닌계 시냅스 (serotonergic synapse)의 광범위한 영향으로 인해, 투약 환자에 따라 불필요한 부작용을 수반하는 문제점이 있다. 또한, 세로토닌계 약물반응에 있어서 대뇌 시냅스에서 세로토닌의 수준을 증가시키는데는 1시간이 채 걸리지 않지만, 실제로 환자의 기분을 개선 (mood elevation)에 이르는 치료적 효능을 나타내기까지는 최소 3주 이상의 장기간 약물 복용이 필요하다는 점에서 그 한계가 있다.
이러한 기술적 배경 하에서, 우울증의 발생기전과 우울증의 치료제인 항우울제의 작용기전에 대한 연구 및 이에 기초한 신규 항우울제의 개발이 필요한 실정이나 (한국 공개특허 10-2018-0024527), 아직은 미비한 실정이다.
일 양상은 피검 물질과 접촉시킨 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 모시 세포의 신경 활성 수준을 피검 물질과 접촉시키지 않은 대조군의 신경 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 항우울제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 피검 물질과 접촉시킨 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 모시 세포의 신경 활성 수준을 피검 물질과 접촉시키지 않은 대조군의 신경 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 항우울제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "항우울제"는 우울한 기분, 의욕, 관심, 정신 활동의 저하, 초조 (번민), 식욕 저하, 불면증, 지속적인 슬픔·불안 등의 우울증 증상을 치료 또는 완화시키는 물질로서, 삼환계 항우울제, 모노아민 옥시다제 억제제, 또는 선택적 세로토닌 재흡수 억제제 등을 포함할 수 있으며, 예를 들어, 선택적 세포토닌 재흡수 억제제 계열의 항우울제, 또는 상기 항우울증의 치료 효능을 향상시켜주는 치료용 보조제를 모두 포함할 수 있다.
일 실시예에 따르면, 치아 이랑 내 모시 세포의 신경 활성 변화는 항우울제 투여에 따른 신경발생적 및 행동학적 반응성에 영향을 미치며, 이러한 모시 세포의 신경 활성은 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 형성과 밀접한 관련성이 있음을 확인하였다. 따라서, 모시 세포의 신경 활성의 증가, 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 수준의 증가, 또는 모시 세포 내 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합 수준의 증가는 항우울제 후보물질의 반응성 또는 치료적 효능을 평가하는 지표로 활용될 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계는 모시 세포의 신경 활성 특이적 마커 (예를 들어, BrdU+ 증식 세포의 수)의 검출, 전기생리학적 분석, 및 이들의 조합에 의해 수행될 수 있고, 예를 들어, 자발적인 흥분 조절 속도 (firing rate)를 측정하여 수행될 수 있다. 이에 따라, 상기 방법은 상기 피검 물질과 접촉된 모시 세포의 신경 활성 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 상기 피검 물질을 항우울제로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 활성 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하는 것을 포함할 수 있다.
다른 구체예에 있어서, 상기 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계는 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준을 측정하거나 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합 수준을 측정하여 수행될 수 있고, 이는 당업계에 널리 알려진 방법을 통해 측정 (예를 들어, 면역침전분석)할 수 있다. 이에 따라, 상기 방법은 대조군과 비교하여, 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 형성을 촉진시키는 물질을 선별하는 단계, 즉 상기 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 형성 또는 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합을 증가시키는 물질을 항우울제로 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 수준의 변화는 활성 수준이 대조군에 비하여 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, 600%, 700%, 800%, 900% 및 1000% 이상 증가하는 것을 포함할 수 있다.
한편, 상기 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계는 세포 수준에서 평가될 수 있고, 또는 우울증 동물 모델을 대상으로 하여 개체 수준에서 평가될 수도 있다.
상기 스크리닝하는 방법에 있어서, 상기 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA (short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA (short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
상기 피검 물질, 해마 모시 세포 등은 검출 가능한 표지가 부착되어 있는 것일 수 있다. 상기 표지는 유전자 재조합 기술을 이용하여 뉴클레오티드 서열 내부에 연결되어 있는 것일 수 있다. 상기 결합 수준의 측정은 표지의 종류 또는 측정 방식에 따라 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법(co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석(co-localization assay), 섬광 근접 측정법(scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석(bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법(mass spectrometry: MS), NMR(nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법(fluorescence polarization assays,FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이(in vitro pull-down assay) 또는 이들의 조합으로 수행할 수 있다.
일 양상에 따른 스크리닝 방법은 새롭게 규명한 항우울제의 핵심적인 작용기작에 기초한 것으로, 모시 세포의 신경 활성 수준을 평가 및 비교함으로써, 보다 간이하고 효과적으로 신규 항우울제를 발굴할 수 있다.
도 1은 해마 모시 세포에서 p11 또는 Smarca3의 유전적 결실이 SSRI의 만성적인 투여에 의한 행동학적 반응에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) D2-Cre 형질전환 마우스의 해마에서, 모시 세포 특이적 Cre-재조합을 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸 모식도; (B) Cre-의존성 리포터 (mTomato, 붉은색)와 모시 세포 마커인 CRT (녹색, 채워진 화살표)를 공동-위치화 (Co-localization)시킨 결과; (C) 모시 세포 내 p11 유전자를 D2-Cre 드라이버 라인을 사용하여 유전적으로 결실시키는 과정을 나타낸 모식도; (D) p11 넉아웃 마우스를 대상으로 NFS 테스트를 실시한 결과 (이하, 본 명세서에서, SAL은 식염수 투여 군, FLX는 플루옥세틴 투여 군을 지칭함); (E) 대조군과 p11 cKO 그룹에서 사육 케이지 내 음식물 섭취 (HCF) 테스트를 통하여 굶주림의 수준을 평가한 결과; (F) 모시 세포 내 Smarca3 유전자를 D2- Cre 드라이버 라인을 사용하여 유전적으로 결실시키는 과정을 나타낸 모식도; (G) Smarca3 넉아웃 마우스를 대상으로 NFS 테스트를 실시한 결과; (H) 대조군과 Smarca3cKO 그룹에서 사육 케이지 내 음식물 섭취 (HCF) 테스트를 통하여 굶주림의 수준을 평가한 결과; (I) MC-Cre 형질전환 마우스의 해마에서, 모시 세포 특이적 Cre-재조합을 확인하기 위한 실험 과정을 나타낸 모식도; (J) Cre-의존성 리포터 (mTomato, 붉은색)와 모시 세포 마커인 CRT (녹색, 채워진 화살표)를 공동-위치화시킨 결과; (K) 모시 세포 내 Smarca3 유전자를 MC-Cre 드라이버 라인을 사용하여 유전적으로 결실시키는 과정을 나타낸 모식도; (L) Smarca3 넉아웃 마우스를 대상으로 NFS 테스트를 실시한 결과; 및 (M) 동일한 동물들의 세트를 대상으로 사육 케이지 내 음식물 섭취 (HCF) 테스트를 통하여 굶주림의 수준을 평가한 결과이다.
도 2는 모시 세포 특이적인 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 파괴가 SSRI의 만성적 치료에 의한 신경발생학적 및 행동학적 반응에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) p11/AnxA2/SMARCA3 복합체-저해성 펩티드 (PASIP)-AcGFP1 융합 단백질 (PASIP-AcGFP1) 및 대조군 구조물 (대조군 AcGFP1)을 나타낸 모식도; (B) PASIP-AcGFP1가 p11/AnxA2/SMARCA3 헤테로헥사머 복합체의 기능적 조립을 차단하는 과정을 나타낸 모식도; (C) PASIP-AcGFP1에 의한 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 파괴를 In vitro pull-down 분석을 통해 확인한 결과; (D) 대조군 AcGFP1 또는 PASIP-AcGFP1를 발현하는 재조합 AAV가 MC-Cre 형질전환 마우스의 치아 이랑에 정위적 주입되는 과정을 나타낸 모식도; 및 (E) 대조군 AcGFP1 또는 PASIP-AcGFP1 구조물의 모시 세포 특이적 발현을 나타내는 대표적인 면역 표지 이미지이다.
도 3은 해마의 rostro-caudal 축에 따라 대조군 AcGFP 또는 PASIP-AcGFP1 구조물의 모시 세포 특이적 발현을 확인한 것이다. (A) EF-1α 프로모터 제어 하에서 대조군 AcGFP1 및 PASIP-AcGFP1을 발현하는 이중-flox Cre-의존성 AAV 벡터를 나타낸 모식도; (B) 해마의 rostro-caudal 축에 따라 대조군 AcGFP 또는 PASIP-AcGFP1 구조물을 발현하는 Cre-의존성 AAV 벡터의 정위적 주입 과정을 나타낸 모식도 (Rostral : AP -2.1mm, ML ±1.4mm, DV -1.95mm. Caudal : AP -3.3mm, ML ±2.7mm, DV -3.6mm); (C) MC-Cre 마우스의 해마의 rostro-caudal 축에 따라 대조군 AcGFP 또는 PASIP-AcGFP1의 종적 발현을 나타내는 대표적인 이미지; (D) 대조군 AcGFP 또는 PASIP-AcGFP1 구조물의 모시 세포-특이적 발현을 GluR2/3 (모시 세포 마커), PV (바구니 세포 마커), NPY (HIPP 세포 마커)로 면역 염색하여 확인한 결과이다.
도 4는 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 모시 세포-특이적 저해가 기저 운동성 및 불안-관련 행동에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) 실험 과정을 개략적으로 나타낸 모식도; (B) α-BrdU로 면역 염색된 결과를 나타내는 대표적인 이미지; (C) 과립하 영역 (SGZ)에서 BrdU-양성 세포의 수를 정량화하여 비교한 결과; (D) NFS 테스트를 실시한 결과; (E) 사육 케이지 내 음식물 섭취 (HCF) 테스트를 통하여 굶주림의 수준을 평가한 결과; (F) 명/암 상자 테스트에서 불안 관련 행동 양상을 확인한 결과; 및 (G) 꼬리 매달기 테스트에서 절망 또는 우울-유사 행동 양상을 확인한 결과이다.
도 5는 p11/AnxA2/SMAR 복합체가 치아 이랑 내 문 모시 세포의 흥분성에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) 전기생리학적 기록을 위한 모시 세포의 AcGFP1-표지화 과정을 나타낸 모식도; (B) AAV-주사된 마우스에서 해마 절편 내 AcGFP-1으로 표지된 모시 세포의 대표적인 형광 이미지; (C-F) 식염수 또는 플루옥세틴이 처리된 치아 이랑 내 AcGFP1-표지된 모시 세포에 대하여 전기생리학적 활성을 기록한 결과로서, 만성 FLX 투여에 의한 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 (C-D) 대표적인 트레이스 및 최소-최대 플롯 (n=9 세포/그룹당 3마리 마우스, 스케일 막대: 1초, Student's t-test, * p < 0.05); 급성 FLX 투여에 의한 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 (E-F) 대표적인 트레이스 및 최소-최대 플롯 (n=9 세포/그룹당 3 마리 마우스, 스케일 막대: 1초, Student's t-test, * p < 0.05); (G-H) p11 cKO 마우스에서 모시 세포의 감소된 전기생리학적 활성을 나타낸 결과로서, 대조군 및 p11 cKO 마우스의 치아 이랑에서 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 (G-H) 대표적인 트레이스 및 최소-최대 플롯 (n = 10 세포/대조군에 대한 3 마리 마우스, n= 6 세포/p11 cKO에 대한 3 마리 마우스, 스케일 막대: 200ms, Student's t-test. * p < 0.05); 및 (I-J) Smarca3 KO 마우스에서 모시 세포의 감소된 전기생리학적 활성을 나타낸 결과로서, 대조군 및 Smarca3 cKO 마우스의 치아 이랑에서 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 대표적인 트레이스 및 최소-최대 플롯 (n=9 세포/그룹 당 3마리 마우스, 스케일 막대: 200ms, Student's t-test, * p < 0.05).
도 6은 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체를 저해하는 일련의 재조합 구조물을 나타낸 것이다. (A) 대조군 AcGFP1 (a), 저해성 재조합 구조물 (b, PASIP-AcGFP) 및 핵-표적화 저해성 재조합 구조물 (c, PASIP-AcGFP1-NLS)을 포함하는, 일련의 재조합 구조물을 나타낸 모식도; 및 (B) EF-1α 제어 하에서 대조군 AcGFP1 (a), PASIP-AcGFP1 (b) 또는 PASIP-AcGFP1-NLS (c)을 발현하는 이중- flox AAV 벡터를 나타낸 도이다.
도 7은 p11/AnxA2/SMAR 복합체가 치아 이랑 내 문 모시 세포의 흥분성에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) 상기 도 6의 AAV가 주입된 마우스의 치아 이랑에서 모시 세포 특이적 발현을 보여주는 면역 형광 이미지; (B) Hek 293 세포에서 상기 AAV 구조물의 발현 패턴을 보여주는 면역 형광 이미지; 및 (C-D) p11/AnxA2/SMARCA3 복합체가 파괴된 모시 세포의 감소된 전기생리학적 활성을 나타낸 것으로서, 각 구조물을 발현하는 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 대표적인 트레이스 및 최소-최대 플롯이다 (n=8 세포/3 마리 마우스), 스케일 막대: 200ms,. One-way ANOVA. F (2, 25) =12.25, **P<0.01, ***p<0.005).
도 8은 모시 세포의 Gi-DREADD-저해가 SSRI의 만성적인 치료에 의한 신경발생적 및 행동학적 반응에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) Gi-DREADD 시스템을 통하여 모시 세포의 활성을 침묵시키는 과정을 나타낸 모식도; (B) Gi-DREADD 시스템을 통한 모시 세포 특이적인 전달을 보여주는 대표적인 이미지; (C) Gi-DREADD 시스템을 적용하기 전 또는 후, 대조군 mCherry 또는 Gi-DREADD-mCherry (Gi-DREADD)를 발현하는 모시 세포의 자발적인 흥분 속도를 보여주는 대표적인 트레이스 (그룹 당 n=4. 스케일 막대: 200ms, Paired student's t-test. * p < 0.05); (D) 대표적인 점 플롯 (Dot plot) 결과; (E) 실험 과정을 개략적으로 나타낸 모식도; (F) α-BrdU 면역염색된 증식하는 신경 줄기세포를 가시화한 이미지 (BrdU, 녹색); (G) 과립하 부위의 BrdU+ 세포 (채워진 화살표)를 정량화한 결과; (H) 유사 분열 후 미성숙 뉴런을 α-doublecortin 항체를 통해 면역염색한 결과 (DCX, 녹색); 및 (I) Image J 소프트웨어를 사용하여 과립하 및 과립 영역 내 상대적인 DCX의 면역형광 강도 (Rel. DCX IF)를 정량화한 결과이다.
도 9는 해마의 rostral-caudal 축에 따라 대조군 또는 Gi-DREADD 구조물의 모시 세포 특이적 발현을 확인한 것이다. (A) 인간 Synapsin I (hSyn)의 제어 하에서 대조군 또는 Gi-DREADD 구조물을 발현하는 이중-Flox Cre-의존성 AAV 벡터를 나타낸 도; (B) 해마의 rostral-caudal 축에 따라 대조군 또는 Gi-DREADD를 발현하는 Cre-의존성 AAV를 정위적 주입하는 과정을 나타낸 모식도 (Rostral : AP -2.1mm, ML ±1.4mm, DV -1.95mm. Caudal : AP -3.3mm, ML ±2.7mm, DV -3.6mm); 및 D2-Cre 마우스의 해마의 rostral-caudal 축에 따라 대조군 또는 Gi-DREADD의 종적 발현을 나타내는 대표적인 이미지이다.
도 10은 모시 세포의 Gi-DREADD 저해가 SSRI의 만성적인 투여에 의한 행동학적 반응에 미치는 영향을 확인한 것이다. (A) Gi-DREADD을 통해 모시 세포의 활성을 저해시킨 후, NFS 테스트를 실시한 결과; (B) 대조군과 Gi-DREADD 그룹에서 사육 케이지 내 음식물 섭취 (HCF) 테스트를 통하여 굶주림의 수준을 평가한 결과; 및 (C) 꼬리 매달기 테스트에서 절망 또는 우울-유사 행동 양상을 확인한 결과이다.
도 11은 문 모시 세포의 활성 변화가 만성 SSRI 투여에 대한 신경발생학적 및 행동학적 반응에 미치는 영향을 개략적으로 나타낸 도이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험재료 및 실험준비
1-1. 동물 사육
행동학적 테스트 및 기타 동물 실험에 충분한, 다수의 동일-연령을 갖는 동물 모델을 생산하고자, 체외 수정 (IVF) 및 배아 이식 (ET) 기술을 이용하여 각 라인에 대한 자손 (progeny)을 생산하였다. 모든 동물 실험에서는 연령 (10-15주)과 성별 (남성)이 일치하는 한배 자손 (littermates)들을 사용하였다. BAC-[Drd2]-Cre Tg 마우스 (GENSAT, Clone #ER44) 및 MC-Cre ([Calcrl]-Cre 마우스 (JAX stock #023014)를 C57BL/6 마우스 (Taconics)와 교배시켜 반접합체 (hemizygotes)를 수득하였다. p11-Flox 마우스 및 Smarca3-Flox 마우스는 이전 연구에서 기술한 바와 같이, 플랭크된 (flanked) loxP 부위에 관련 유전자를 도입함으로써 제조되었다. 모든 실험 동물은 실온의 조건에서 (22±1℃), 12시간 명/암 사이클 주기로 사육되었으며, 표준의 식이를 제공하였고, 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 모든 실험에서는 수컷 마우스를 사용하였다.
1-2. 약물 치료
만성적인 약물의 투여를 위하여, 케이지 당 2-5 마리의 마우스를 수용시켰다. 플루옥세틴 하이드로클로라이드 (Fluoxetine hydrochloride; Spectrum Chemicals, USA)를 3주간 매일 복강 내 주사 (10 mg kg-1day-1)로 투여하였다. 상기 약물은 디메틸 설폭사이드 (50%)에 용해시킨 후, 식염수로 희석시켜 제조되었다. 대조군에 대해서는, 약물이 함유되지 않은 비히클 용액 (0.9% saline (식염수))을 매일 투여하였다. Gi-DREADD 마우스 실험을 위하여, 클로자핀-N-옥사이드 (Clozapine-N-oxide (CNO); Sigma-Aldrich, USA)를 0.9% 식염수 용액에 직접적으로 용해시켰다. CNO의 투여 용량은 0.3mg/kg이었고, 각각의 행동학적 테스트 2 시간 전, 체중 당 100μl/10g의 부피의 용액을 복강 내 주사하였다.
1-3. 플라스미드 구조물의 구축
PASIP (p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 저해성 펩티드) 서열은 AHNAK1 (아미노산, 5654-5671)와 p11/AxnA2 복합체간 결합 부위로부터 도출되었다. 이후, 본 발명자들은 하기와 같이 일련의 PASIP 구조물을 설계하였다: 1) 대조군 AcGFP1 (pAAV-Ef1α-DIO-AcGFP1-myc.hGH), 2) PASIP-AcGFP1c (pAAV-Ef1α-DIO-PASIP-AcGFP1-myc.hGH) 및 3) 핵을 타겟으로 하는 PASIP-AcGFP1-NLS (pAAV-Efla-DIO-PASIP-AcGFP1-myc-C3xNLS.hGH). 표준 유전자 합성 방법 (GENEWIZ, USA)을 사용하여 PASIP 구조물의 코딩 서열을 준비하였고, 두 개의 제한 효소 (NheI, AscI)에 의해 인식되는 절단 부위에 pAAV-Ef1α-DIO-EYFP 벡터 (Addgene, # 29056)를 서브클로닝하였다.
1-4. p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 면역침전
HEK293 세포 (CRL-1573, ATCC)를 CMV-Cre 플라스미드로 형질감염시키고, 이로부터 24시간 경과 후, 상기 세포에 대조군 AcGFP1 또는 PASIP-AcGFP1 구조물을 발현하는 AAV 전달체를 감염시켰다. 면역 침전은 α-SMARCA3 항체 (면역화된 펩티드로 제조된 토끼 다클론 항체)로 실시되었다. 면역 블롯팅은 표준 프로토콜에 따라 다음의 항체를 사용하여 실시되었다: α-p11 (마우스 단일클론성l, 1:1000, BD bioscience), α-p11 (염소 다클론성, 1:200, R&D systems), α-SMARCA3 (염소 다클론성, 1:200, NOVUS), α-AnxA2 (마우스 단클론성, Santa Cruz Biotech.), α-GFP (염소 다클론성, Santa Cruz Biotech.).
1-5. 입체정위시술 (Stereotaxic surgery)
마우스에 대한 AAV의 정위적 주입 (stereotaxic injection)은 Angle TwoTM stereotaxic frame (Leica, Buffalo Grove, IL, USA) 상에서 실시되었다 (Leica, Buffalo Grove, IL, USA). AAV의 정위적 주입 전, 마우스에 아버틴 (100㎎/㎏)을 복강 내 주사하여 마취시켰다. Cre-의존성 AAVs는 10μl 해밀턴 시린지 (33 gauge needle; Reno, NV, USA)를 사용하여, 치아 이랑의 등쪽 (dorsal) 및 배쪽 (ventral) 부위로 양방향에서 정위적 주입되었다 (등쪽에 대한 좌표: AP -2.1ML±1.4DV -1.95, 배쪽에 대한 좌표: AP-3.3ML±2.7DV-3.6). 유속 (0.2μl/min)은 나노펌프 제어기 (WPI, US)에 의해 조절되었다. 바이러스의 주입 후, 니들을 5분간 그 상태로 유지시켰고, 이후, 절개 부위를 닫았다. 마우스는 회복용 사육 케이지에 다시 넣었다. 모든 실험 동물들은 다음 실험 단계 전, 최소 2주간 휴식을 취하도록 하였다.
1-6. 행동학적 검사
모든 행동학적 테스트에서, 테스트를 실시하기 전 1 시간 내, 대상 마우스를 실험 장소로 옮겼다. 모든 테스트는 치료 및 유전자형에 대한 정보를 제공받지 않은 실험자에 의해 수행되었고, 상기 테스트는 명/암 사이클 주기 중에서 명 주기에 실시되었다.
(1) 미로 찾기 테스트 (Elevated plus maze: EPM)
해당 테스트에서는 플러스-형태의 미로 구조로서, 두 개의 개방형 팔과 두 개의 폐쇄형 팔 (30cm 길이 및 5cm 너비)을 갖는, 바닥으로부터 50cm 높이에 배치된 미로를 사용하였다. 마우스를 미로의 중앙에 위치시킨 후, 10분 동안 4개의 팔에 따라 자유롭게 움직일 수 있도록 하였다. 이러한 마우스의 행동을 비디오로 촬영하였고, 개방형 및 폐쇄형 팔에서 소용된 총 시간을 Ethovision?? 소프트웨어 (Noldus, USA)를 사용하여 기록하고 측정하였다.
(2) 개방형 필드 테스트 (Open field test: OF)
마우스를 개방형 필드 영역 (40Х40Х40cm, Plexiglas chamber)의 중앙에 위치시켰다. 마우스를 개방형 필드에서 1 시간 동안 자유롭게 움직일 수 있도록 하였다. 중심 및 주변에서의 지속 시간을 자동화된 Superflex?? software (Accuscan Instruments, Columbus, OH, USA)를 사용하여 측정하였다. 상기 측정은 31mm 간격으로, 바닥으로부터 20mm 및 50mm에 위치한 2열의 적외선 포토셀을 사용하여 자동화시켰다. 포토셀 광선의 중단은 Superflex?? software를 사용하여 기록하였다.
(3) 명암 상자 테스트 (Light and dark box test: LD box)
마우스를 개방형 필드 영역 (40Х40Х40cm)에 위치시켰다. 검은색 상자를 상기 개방형 필드에 삽입하였다. 마우스를 세션의 시작 부분을 명 구획에 위치시키고, 10분 동안 구획들 사이를 자유롭게 움직일 있도록 하였다. 각 구획에서의 소요시간 및 암 구획에 처음으로 들어갈 때까지의 시간을 자동화된 SuperflexTM software를 사용하여 측정하였다.
(4) 새로운 환경에서의 먹이섭취 억제성 테스트 (Novelty suppressed feeding test: NSF)
상기 테스트는 종전의 방식을 일부 변형하여 15분 동안 실시되었다. 행동학적 테스트를 실시하기 24시간 전, 사육 케이지에 제공되었던 모든 음식은 제거되었다. 실험의 마지막에 이르러, 단일 1.8cm 사각형의 음식 펠릿을 테스트 상자의 중앙에 위치한 백색 여과지 위에 두었다. 마우스를 개방형 필드의 모서리 부근에 위치시켰고, 스탑워치를 즉시 작동시켰다. 음식을 최초로 물을 때까지의 시간을 기록하였다. 이러한 실험 후 즉시, 마우스를 사육 케이지에 두었고, 이후 10분 동안의 음식 섭취량을 측정하였다.
(5) 꼬리 매달기 테스트 (Tail suspension test: TST)
마우스의 꼬리를 통해 마우스를 6분 동안 매달았다. 테스트 세션을 비디오로 촬영하고, 부동 상태를 Clever 시스템의 자동화된 TST 분석 소프트웨어 (Reston, VA, USA)를 사용하여 기록하였다. 마지막 4분 동안의 부동 시간 (초기 2분 동안의 부동 시간은 제외)을 산출하였다.
1-7. 면역 조직 화학
면역 염색은 표준 자유-부유법 (standard free-floating method)을 사용하여 실시하였다. 절편을 매회 10분 동안 PBS로 3회 세척하고, 이를 2% 정상 당나귀 혈청, 0.2% 소 혈청 알부민, 및 0.3% Triton-X100과 함께 인큐베이션하였다. 블로킹 단계 후, 절편을 블로킹 완충액으로 희석한 1차 항체와 함께 4 ℃에서 밤새도록 배양하였으며, 다음의 1차 항체가 사용되었다: α-doublecortin (염소 다클론성, 1:200, Santa Cruz Biotech.), α-calretinin (마우스 단일클론성, 1:500, SWANT), α-parvalbumin (토끼 다클론성, 1:1000, SWANT), α-neuropeptide Y (토끼 다클론성, 1:1000, Phoenix pharmaceutical), α-GluR2/3 (토끼 다클론성, 1:100, Millipore). 24시간 동안 이를 인큐베이션시킨 후, 절편을 10분 동안 0.2% Triton-X100 (PBS-T)를 함유하는 PBS로 3회 세척하고, 이를 AlexaTM-fluor- 접합된 2차 항체 (1 : 400, Life technologies, USA)와 함께 실온에서 3시간 동안 인큐베이션시켰다. 절편을 PBS-T로 실온에서 10분씩 3회 세척하고, ProlongTM Gold, anti-fading 구비 배지 (Life technologies, USA)로 덮었다.
1-8. BrdU 표지 및 신경발생 분석
마우스를 희생시키기 전, 3시간 동안 BrdU 용액 (200mg/kg)을 복강 내 투여하였다. 경심 관류 (transcardial perfusion) 후, 뇌 조직을 4% PFA로 밤새도록 고정시킨 후, Cryostat (CM3050S, Leica)를 사용하여 해마의 rostro-caudal 축을 따라 40-μm 두께의 관상 절편을 수집하였다. 절편은 자유-부유법을 사용하여 처리되었다. 해마에 걸쳐있는 6 번째 절편마다 BrdU 면역조직화학 염색을 실시하였다. 이후, 절편을 45℃에서 30분 동안 1M HCl로 전-인큐베이션시켜 DNA를 변성시켰고, 0.1M PBS로 3회 절편을 세척하여 중화시켰다. 면역 조직 화학은 α-BrdU (렛트 다클론성, 1:200, Abcam, Cambridge, MA, USA) 및 AlexaTM-fluor-접합된 2차 항체 (1:400, Life technologies, USA)를 사용하여 실시되었다. 슬라이드 코드에 대한 정보를 제공받지 못한 실험자는 개별 마우스로부터 유래한 총 12개의 절편에서, 치아 이랑 (dentate gyrus: DG)의 과립 세포층 (granule cell layer: GCL) 및 과립하 영역 (subgranular zone: SGZ)에 위치하는 BrdU-표지된 세포수를 계수하였다. 절편 당 BrdU-표지된 세포의 총 수를 측정하고, 여기에 6을 곱하여 치아 이랑 당 총 세포의 수를 산출하였다.
1-9. 해마 모시 세포의 전기생리학적 평가
(1) 모시 세포의 형광 표지
해마 슬라이스 내 모시 세포를 표지하고 가시화하기 위하여, 재조합 AAV 벡터 (AAV2.EF1α.DIO.AcGFP1-myc)를 MC-Cre ([Calcrl]-Cre) Tg 마우스의 배쪽 해마 치아 문에 양측으로 주사하였다. AcGFP1는 모시 세포에 선택적으로 발현되었다. 전기생리학적 평가를 기록하는 동안, 상기 모시 세포에 대한 형태, 막 전기 용량, 및 전기생리학적 특성 변화를 추가로 확인하였다.
(2) 슬라이스의 준비
12-15주령의 수컷 마우스를 CO2로 안락사시켰다. 이어서, 마우스의 뇌를 적출하고, 차가운 아이스 상의 N-Methyl-D-glucamine을 함유하는 절삭 용액 (93mM NMDG, 2.5mM KCl, 1.2mM NaH2PO4, 30mM NaHCO3, 25mM glucose, 20mM HEPES, 5mM sodium ascorbate, 3mM sodium pyruvate, 2mM thiourea, 0.5mM CaCl2, 10mM MgSO4. pH 7.4, 295-305mM mOsm)에 이를 두었다. 배쪽 해마를 함유하는 뇌 조직 슬라이스 (400μm 두께)는 VT1000 S Vibratome (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, IL, USA)을 사용하여 준비되었다. 절단 후, 슬라이스를 37 ℃에서 15분 동안 절삭 용액에서 회복시킨 다음, 전기생리학적 평가를 기록하기 전, 최소 1시간 동안, 이를 실온의 기록 용액으로 옮겨 두었다.
(3) 전기생리학적 기록
전기생리학적 기록은 이전에 기술 된 바와 같이 실시되었다. 기록하는 동안, 뇌조직 슬라이스는 직립 현미경 BX51WI (Olympus, Tokyo, Japen)의 고정 스테이지에 부착된 관류 챔버에 배치되었고, 이를 연속적으로 유동하는, 산화된 기록 용액에 담구었다. 상기 용액 내 함유된 성분들은 다음과 같다: 125mM NaCl, 25mM NaHCO3, 25mM 글루코스, 2.5mM KCl, 1.25mM NaH2PO4, 2mM CaCl2 및 1mM MgCl2, pH 7.4, 295-305mM mOsm. 뉴런은 근적외선 (IR)을 사용하여, 40x 대물 침지 렌즈 상에 가시화되었다. 전기생리학적 기록은 Multiclamp 700B/Digidata 1440A 시스템 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)을 사용하여 이루어졌다. 패치 전극은 내부 용액 (126mM K-글루코네이트, 10mM KCl, 10mM HEPES, 10mM 인산 크레아틴, 4mM ATP 및 0.3mM GTP, pH 7.3, 290mM mOsmol)으로 채워졌다. 전체 세포 패치-클램프 기록은 해마 슬라이드 내 모시 세포의 자발적인 활동 전위를 기록하는데 사용되었으며, 모든 기록은 37℃에서 수행되었다. 화학유전체적 실험에서, 모시 세포의 활동 전위를 기준에 따라 5분 동안 기록하였다. 또한, CNO (1mM)을 뇌 조직 슬라이스 상으로 관류시켜 Gi-DREADD의 효과를 확인하였다. 실험 데이터는 pClamp10 소프트웨어 (Molecular Devices), 및 GraphPad Prism 6 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA)에 의해 분석되었다.
1-10. 통계적 분석
모든 실험 데이터는 평균±표준편차로 나타내었다. 통계적 분석은 GraphPad Prism Version 7.0a를 사용하여 수행되었다. 두 그룹 사이의 비교는 two-tailed, unpaired Student's t test에 의해 수행되었다. 다수 그룹들 사이의 비교는 단방향 또는 양방향 ANOVA, 및 뒤이은 post hoc Bonferroni 테스트를 사용하여 평가되었다. 유의적 수준은 다음과 같다: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001.
실시예 2. 해마 모시 세포에서 p11 또는 Smarca3의 유전적 결실이 SSRI의 만성적인 투여에 의한 행동학적 반응에 미치는 영향
본 실시예에서는 항우울제의 작용에 대한 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 특이적 관련성에 대하여 확인하고자 하였다. 우선, 본 발명자들은 모시 세포에 특이적으로 p11 또는 Smarca3이 결실된 조건부 KO 마우스를 제조하여, 특정 세포 유형에서 3차원 복합체의 역할을 구체적으로 확인하였다. 항우울제의 작용과 관련하여, p11 및/또는 Smarca3의 모시 세포에 대한 특이적 기능성을 조사하기 위하여, 형질전환 Cre driver line을 사용하여 해마 모시 세포를 표적화하였다. 즉, 모시 세포에 특이적인 도파민 D2 수용체 프로모터 및 Cre 재조합 효소를 포함하는 D2-Cre ([Drd2]-Cre) driver 마우스 라인과 mTomato 리포터 라인을 교차시켜, 치아 이랑 내 모시 세포-특이적 방식으로 도파민 D2 수용체 프로모터 구동 Cre 재조합 효소의 발현을 검증하였다 (도 1A 및 1B 참고). 이후, p11 또는 Smarca3 flox 조건부 라인으로 교차시켜, 모시 세포 내 p11 또는 Smarca3의 특이적 결실을 유도하였다 (도 1C 및 1F 참고). p11 또는 Smarca3 조건부 KO (cKO) 라인에 SSRI를 만성적으로 투여한 후, 우울증 유사 상태의 여부를 조사하기 위하여 NFS 테스트를 실시하였다. 그 결과, 관련 유전자를 넉아웃시키지 않은 대조군에서는, 상기 SSRI의 투여에 따른 효과로서, 음식 펠렛으로 접근하기까지의 시간을 감소시켰다 (p11(f/f): SAL vs FLX, 351±38 vs 165±24, p < 0.001; 및 Smarca3(f/f): SAL vs FLX, 257±47 vs 104±12, p < 0.01). 그러나, p11 조건부 넉아웃 마우스 (p11(f/f);D2-Cre: SAL vs FLX, 364±46 vs 296±58; p=0.37), 또는 Smarca3 조건부 넉아웃 마우스 (Smarca3(f/f);D2-Cre: SAL vs FLX, 192±15 vs 232±32, p =0.24)에서는 이러한 감소 효과가 관찰되지 않았다 (도 1D 및 1G 참고). 또한, 사육 케이지로 돌아온 후, 이들의 음식 섭취량에는 변화가 없음을 확인하였다 (도 1E 및 1H 참고).
또한, 모시 세포에서 SMARCA3 유전자 결실에 의한 상기의 효과를 다른 종류의 모시 세포 특이적 Cre 마우스 라인, MC-Cre ([Calcrl]-Cre)를 사용하여 추가로 검증하였다. 상기 MC-Cre 라인은 해마에 매우 특이적이지만, 치아 이랑의 문 부근에 존재하는 모시 세포 및 CA3 영역의 피라미드성 세포 모두에서 폭넓은 활성을 나타낸다. 본 발명자들은 Smar3 flox 조건부 마우스 (smarca3(f/f))와 MC-Cre 마우스를 교차시킴으로써, Smarca3 유전자를 결실시켰고 (도 1K 참고), SSRI를 만성적으로 투여한 후, NSF 테스트를 실시하였다. 그 결과, 관련 유전자를 넉아웃시키지 않은 대조군에서는, 상기 SSRI의 투여에 따른 효과로서, 음식 펠렛으로 접근하기까지의 시간을 감소시켰다 (Smarca3(f/f): SAL vs FLX, 338±20 vs 229±40; p < 0.05). 그러나, Smarca3 조건부 넉아웃 마우스 (Smarca3(f/f);MC-Cre: SAL vs FLX, 405±88 vs 404±69, p=0.99, 또는 Smarca3(f/f);D2-Cre: SAL vs FLX, 192±15 vs 232±32, p=0.24)에서는 역시 이러한 감소 효과가 관찰되지 않았다 (도 1L 및 1M 참고).
이러한 실험 결과는 치아 이랑의 모시 세포에서 p11 또는 Smarca3의 선택적 결실은 항우울제의 반응에 영향을 미침을 나타낸다. 즉, 모시 세포 내 p11과 Smarca3은 만성 항우울제 치료에 대한 행동학적 반응에 직접적으로 관여함을 시사하는 것이다.
실시예 3. p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 세포-특이적 저해가 SSRI의 만성적인 투여에 의한 신경발생학적 및 행동학적 반응에 미치는 영향
상기 실시예 2에서는 모시 세포-특이적 KO 마우스를 이용하여 p11 또는 Smarca3의 유전적 결실이 항우울제 반응에 미치는 영향을 구체적으로 확인하였으나, 이러한 형질전환적 접근법은 전술한 효과가 cKO 마우스 내 p11 또는 Smarca3 유전자의 발달적인 결함 또는 오프-타겟 결실로 인한 행동학적 변화인 것인지를 배제시킬 수 없다. 따라서, 본 발명자들은 성체 마우스에서 모시 세포에 특이적인 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 저해가 신경발생학적 및 행동학적 영향에 미치는 효과를 추가로 조사하였다. 이를 위하여, 우선, p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 조립을 저해하는 재조합 구조물을 도출하였다. p11/AnxA2 헤테로테트라머는 매우 유사한 인식 원리에 따라, SMARCA3 또는 AHNAK1와 안정한 헤테로헥사머를 형성함을 보여주었다 (미도시). 또한, SMARCA3 또는 AHNAK1의 결합 부위 유래의 짧은 펩티드는 p11/AnxA2 헤테로테트라머 복합체 표면 상에 생성된 소수성 결합 포켓에 위치함으로써, p11/AnxA2 헤테로테트라머와 안정적인 복합체를 형성한다. 따라서, 3차원 복합체의 동시 결정화 구조에 관한 정보에 기초하여, p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 재조합 저해 구조물 (p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 저해성 펩티드-AcGFP1 융합 구조물; PASIP-AcGFP)을 비활성 대조군 (control AcGFP1)과 함께 제조하였다 (도 2A 참고). 본 발명자들은 이러한 재조합 저해 구조물은 결합 포켓 상에서 내인성 SMARCA3과 경쟁적으로 존재하며, 이를 통해 활성화된 삼차원 복합체, p11/AnxA2/SMARCA3 헤테로헥사머의 기능적 조립을 차단할 수 있을 것으로 추정하였다 (도 2B 참고). 실제로, 시험관 내 면역침전분석을 수행한 결과, 상기 재조합 PASIP-AcGFP1 구조물은 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 조립을 차단시킬 수 있음을 확인하였다 (도 2C 참고).
또한, 상기 PASIP-AcGFP1 구조물을 해마 모시 세포에 전달하기 위하여, Cre-의존성 AAV를 제조하였다. 상기 Cre-의존성 AAV는 MC-Cre 형질전환 마우스의 상측 (rostral) 및 후측 (caudal) 문 부위에 국소적으로 주사되었다 (도 2D, 3A, 및 3B 참고). MC-Cre 마우스는 치아 모시 세포 및 CA3 영역 내 일부 피라미드 아집단 모두에서 Cre-재조합 구조물을 전시(display)시키기 때문에, 재조합 AAV 용액을 문 부위의 중앙에 전달하여 바이러스 입자의 불필요한 확산을 막고자 하였다. 조직학적 분석에서 AcGFP1 신호는 신경세포 (soma)와 축색 섬유에 국소화되어 있는 문 및 내피층에서만 발견되었으며, 피라미드 세포가 존재하는 CA3 영역에서는 관찰되지 않았다 (도 3C 참고). 즉, 이러한 결과는 해마의 부위 특이적 전달을 보여주는 것이다. 또한, AcGFP1-융합 단백질 (대조군 AcGFP1, PASIP-AcGFP1)은 특이적으로 모시 세포에 발현되고, PV+ 바구니 세포, 및 NPY+ HIPP 세포를 포함하는 다른 GABA성 중간 뉴런에서는 발현되지 않았으며 (도 2E, 및 3D 참고), 이러한 결과는 치아 이랑 내 세포 특이적 발현을 나타내는 것이다.
PASIP-AcGFP1 구조물의 모시 세포 특이적 발현을 통해 p11/AnxA2/SMARCA3의 형성을 차단시킨 후, 본 발명자들은 SSRI의 만성적인 투여에 따른 신경발생학적 및 행동학적 변화를 조사하였다 (도 4A 참고). 만성 항우울제의 치료에 대한 반응으로서 치아 이랑 내 성체 신경발생이 유도됨이 알려져 있다. 이에, 대조군 및 PASIP-AcGFP1 마우스에서, 만성적으로 투여된 플루옥세틴에 의해 유도된, 신경 전구체의 증식 활성을 평가하였다. BrdU+ 증식 세포의 유의적인 증가는 만성적으로 플루옥세틴을 처리한 대조군 마우스에서 관찰되었으나 (SAL vs FLX, 173±16 vs 290±43; p< 0.05), 이러한 효과는 PASIP-AcGFP1 마우스에서는 관찰되지 않았다 (SAL vs FLX, 119±27 vs 129±13; p=0.73)(도 4B 및 4C 참고).
다음으로, 본 발명자들은 SSRI 투여에 의해 유도된 행동학적 변화와 관련된 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 기능적 역할을 조사하였다. 플루옥세틴을 만성적으로 투여한 후, 음식 섭취까지의 시간은 대조군 AcGFP1 마우스에서 감소하였으나 (SAL vs FLX, 296±48 vs 147±22; p<0.01), PASIP-AcGFP1 마우스의 경우에는 그러하지 않았다 (SAL vs FLX, 304±51 vs 293±54; p=0.88) (도 4D 참고). 플루옥세틴 처리 또는 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 저해는 모두 사육 케이지 내 음식 섭취량에 대하여 유의적 영향을 미치지 않았으며, 따라서, 이러한 행동학적 변화는 비교 집단간 서로 다른 굶주림 수준의 차이에 의한 결과가 아님을 보여준다 (도 4E 참고).
또한, 대조군 AcGFP1 마우스 및 PASIP-AcGFP1은 명/암 상자 테스트에서 유의적인 차이를 보였으며 (Control AcGFP1 vs PASIP-AcGFP1, 154±16 vs 94±13; p < 0.01) (도 4F 참고), NSF 테스트에서 관찰된, 항우울제에 의해 유도된 행동학적 변화와 마찬가지로, 꼬리 매달기 테스트 (TST)에서도 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 저해가 플루옥세틴 투여에 의한 효과를 감소시켰다 (도 4G 참고).
이러한 결과를 종합해 보면, 상기 결과는 모시 세포에서 형성된 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체는 SSRIs의 만성적인 치료 후, 행동학적 변화에 중요한 역할을 함을 나타내는 것이다.
실시예 4. p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 세포 특이적인 저해가 모시 세포의 신경 활성에 미치는 영향
본 실시예에서는 항우울제의 투여가 모시 세포의 신경 활성에 미치는 영향을 조사하였다. 모시 세포는 문 부위에서 신경적 흥분을 자발적으로 조절하는 뉴런이며, 이들의 활성은 치아 이랑의 신경 회로 및 기능을 조절한다. 모시 세포에 대한 전기생리학적 기록을 위하여, Cre-의존성 AcGFP1 AAVs를 모시 세포-특이적 Cre (MC-Cre) 마우스에 주사하여, 모시 세포를 형광 단백질인 AcGFP1로 표지하였다 (도 5A 참고). 그 결과, AcGFP1은 치아 이랑 내 모시 세포에 제한적으로 발현됨을 확인할 수 있었다 (도 5B 참고). 추가적으로, 상기 모시 세포에 대한 형태, 긴장성 흥분 패턴 및 막 용량 (50-100pF)의 변화를 추가로 확인하였다. 전기생리학적 기록에서, 플루옥세틴의 만성적인 치료는 모시 세포의 자발적인 흥분 조절 속도 (firing rate)를 유의적으로 향상시켰으나 (control: 2.36±0.41Hz, fluoxetine: 4.19±0.92Hz) (도 5C 및 5D), 상기 약물을 사용한 급성 치료 시에는 아무런 영향을 미치지 않았다 (control: *** Hz, Fluoxetine: ** Hz) (도 5E, 및 5F 참고).
또한, 모시 세포에서의 자발적인 활동 전위 빈도를 측정함으로써, p11 및 SMARCA3이 모시 세포 활성을 조절하는지 여부를 확인하였다. 그 결과, 모시 세포의 자발적인 흥분 조절 속도는 p11 cKO 마우스에서 현저하게 감소됨을 확인할 수 있었고 (control: 3.37±0.63 Hz, p11 cKO: 0.65±0.10Hz) (도 3G 및 3H), 모시 세포의 휴지기 막 전위 역시 p11 cKO 마우스에서 더욱 과분극화되었다 (control: -47.70±2.11 mV, p11 cKO: 56.01±0.63 mV). 이와 마찬가지로, 모시 세포의 자발적인 흥분 조절 속도는 Smarca3 cKO 마우스에서 유의적으로 감소되었다 (control: 3.67±0.48 Hz, Smarca3 cKO: 1.75±0.33 Hz) (도 5I 및 5J 참고). 이러한 실험 결과는 p11 및 SMARCA3이 모시 세포의 뉴런 활성을 조절하는데 중요한 역할을 함을 제시하는 것이다.
아울러, PASIP-AcGFP1 구조물의 발현에 의한 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 세포-특이적 저해가 모시 세포의 신경 활성에 미치는 영향을 추가로 조사하였다. 이전의 연구에 따르면, p11/AnxA2/SMARCA3 복합체는 유전자 전사를 조절하기 위하여, 핵 기질을 표적화한다. 따라서, 추가적인 핵 국소화 신호 (NLS)를 통해 특이적으로 모시 세포의 핵에 표적화시킨 PASIP-AcGFP1-NLS 구조물을 제조하였다 (도 6A 참고). 대조군 AcGFP1, PASIP-AcGFP1, 및 PASIP-AcGFP1-NLS을 포함하는 Cre-의존성 바이러스 벡터를 제조하였다 (도 6B 참고). 이후, 배양된 Hek 세포에 공동 형질감염시키고, 모시 세포-특이적 Cre (MC-Cre) 형질전환 마우스로의 정위적 주입을 통하여, PASIP-AcGFP1 구조물의 세포-유형 특이적 발현 및 PASIP-AcGFP1-NLS 구조물의 핵 특이적 발현을 검증하였다 (도 7A 및 7B 참고). 또한, 모시 세포의 흥분 조절 속도는 PASIP-AcGFP1 또는 PASIP-AcGFP1-NLS 발현에 의해, 대조군 AcGFP1에 비해 유의적으로 감소하였으며 (대조군: 3.58±0.56Hz, PASIP-AcGFP1: 0.64±0.10Hz, PASIP-AcGFP1-NLS: 1.39±0.36Hz) (도 7C 및 7D 참고), 상기와 마찬가지로, 모시 세포에서 휴지 막 전위는 PASIP-AcGFP1 또는 PASIP-AcGFP1-NLS에 의해 보다 과분극화되었다 (대조군: -47.33±1.77 mV, PASIP-AcGFP1: -54.33±1.32 mV, PASIP-AcGFP1-NLS: -56.30±1.20 mV).
종합하면, p11/AnxA2/SMARCA3 복합체는 모시 세포의 활성을 조절에 기여하고, 이에 따라 변화된 모시 세포의 활성은 항우울제의 반응성 또는 작용에 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
실시예 5. 모시 세포의 선택적 저해가 해마의 항우울제 작용에 미치는 영향
본 실시예에서는 모시 세포의 선택적 저해가 항우울제의 만성적인 치료에 다른 신경발생적 및 행동학적 효과에 미치는 영향을 조사하였다. 모시 세포의 활성을 조절하기 위하여, 본 발명자들은 DREADD 기술 (Designer Receptors Exclusively Activated by Designer Drug)을 적용하였다. Gi-DREADD 시스템을 모시 세포에 도입하기 위하여, 대조군 mcherry 또는 hM4D-Gi-mcherry (Gi-DREADD)를 발현하는 바이러스 벡터를 D2-Cre 형질전환 마우스의 rostral 및 caudal 문 부위에 주입하였다 (도 8A, 9A, 및 9B 참고). 이후, D2-Cre 마우스의 해마의 rostral-caudal 축에 따라 대조군 또는 Gi-DREADD의 종적 발현 (longitudinal expression)을 확인하였다 (도 9C 참고). 또한, mCherry-표지된 모시 세포에 대한 전기생리학적 기록을 사용하여, 모시 세포의 활성이 DREADD 시스템의 인공적인 작용제, 클로자핀-N-옥사이드 (CNO)의 처리에 의하여 침묵됨을 확인하였으며, 이러한 효과는 오직 Gi-DREADD 마우스에서만 관찰되었고, 대조군 마우스에서는 관찰되지 않았다 (도 8C 및 8D 참고).
Gi-DREADD 시스템을 사용하여, 본 발명자들은 만성 플루옥세틴 투여에 의해 유도된 신경발생적 및 행동학적 변화에서 모시 세포의 역할을 조사하였다 (도 8E 참고). BrdU 표지, 및 대조군과 Gi-DREADD 마우스의 조직학적 분석을 사용하여 성체 신경발생적 활성을 측정하였다. SSRI의 만성적 투여는 대조군 마우스의 치아 이랑의 과립하 영역 내 BrdU+ 증식 세포의 수를 유의적으로 증가시켰던 반면 (SAL vs FLX, 177±18 vs 337±37; p < 0.01), Gi-DREADD 마우스에서는 이러한 플루옥세틴의 처리에 의한 효과가 소실되었다 (SAL vs FLX, 172 ± 27 vs 232 ± 20; p=0.89) (도 8F 및 8G 참고). 아울러, 신경의 성숙 및 분화 과정에서 신생 유사 분열 후 세포의 특정 시점 (Snapshot)을 나타내는 미성숙 뉴런의 마커로서, 더블코르틴 (DCX)의 발현 수준을 분석하였다. 플루옥세틴의 만성적 투여는 신생 뉴런성 전구체의 생존을 향상시키고 성숙 뉴런으로의 분화를 촉진시켰으나, 모시 세포 활성이 저해된 경우, 유사 분열 이후 신생 세포의 생존 및/또는 분화를 유의적으로 감소시켰다 (도 8H 및 8I 참고). 즉, 이러한 실험 결과는, 상기 실시예 2의 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 저해에 따른 효과와 유사한 경향을 나타내는 것으로서, 모시 세포의 활성은 플루옥세틴 투여에 의해 유도된, 신경 전구체의 증식과 신생 과립 세포로의 분화 및 성숙을 조절함에 직접적으로 관여함을 알 수 있다.
아울러, 다양한 행동학적 테스트를 실시하여 일반적인 운동성 활동량 및 정서적 행동 변화를 모니터링하여 모시 세포 활성이 항우울제 작용에 미치는 영향을 조사하였다. 새로운 환경에서의 먹이섭취 억제성 테스트 (NSF)를 실시한 결과, 항우울제의 만성적 투여에 의해 유도된 행동학적 변화는 CNO에 의해 유도된 모시 세포의 활성 저해에 의해 영향을 받으며, 이에 따라 플루옥세틴에 의한 효과는 Gi-DREADD 마우스에서 상쇄됨을 알 수 있었다 (대조군: SAL vs FLX, 484±85 vs 238±40; p<0.05, Gi-DREADD: SAL vs FLX, 450±36 vs 365±40; p=14) (도 10A 참고). 또한, 사육 케이지 내 음식 섭취 수준은 Gi-DREADD 시스템 도입에 따른 영향을 받지 않았으므로, 이러한 행동학적 변화는 비교 집단들 사이의 굶주림 수준의 차이로 인한 것은 아님을 알 수 있었다 (도 10B 참고). 또한, 꼬리 매달기 테스트 (TST)에서, 비활동성에 대한 플루옥세틴의 효과는 대조군 마우스에서는 유의하게 감소하였으나 (SAL 대 FLX, 141 ± 9 대 110 ± 9; p <0.05), 상기와 마찬가지로, Gi-DREADD 마우스에서는 이러한 효과가 관찰되지 않았다 (SAL vs FLX, 128±9 vs 129±10, p= 0.94) (도 10C 참고). 종합하면, 치아 이랑에서 모시 세포 활성은 항우울제의 작용 및/또는 반응에 중요한 역할을 함을 알 수 있다.
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Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Glu Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Thr Gly 115 120 125 Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly Asn Lys Met Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ala His Asn Val Tyr Ile Met Thr Asp Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Tyr Phe Gly Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Ala Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu 225 230 235 240 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu 245 <210> 5 <211> 279 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AcGFP1-myc C-AHNAK1 <400> 5 Met Val Ser Lys Gly Ala Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Ile Leu 1 5 10 15 Ile Glu Leu Asn Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly 20 25 30 Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile 35 40 45 Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr 50 55 60 Leu Ser Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys 65 70 75 80 Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu 85 90 95 Arg Thr Ile Phe Phe Glu Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Arg Ala Glu 100 105 110 Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Thr Gly 115 120 125 Thr Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly Asn Lys Met Glu Tyr 130 135 140 Asn Tyr Asn Ala His Asn Val Tyr Ile Met Thr Asp Lys Ala Lys Asn 145 150 155 160 Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser 165 170 175 Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly 180 185 190 Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu 195 200 205 Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Ile Tyr Phe Gly Phe 210 215 220 Val Thr Ala Ala Ala Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Glu 225 230 235 240 Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Gly Asn Gly Asn Gly Asn Gly 245 250 255 Asn Gly Asn Gly Ser Gly Lys Val Thr Phe Pro Lys Met Lys Ile Pro 260 265 270 Lys Phe Thr Phe Ser Gly Arg 275 <210> 6 <211> 296 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> N-AHNAK1-AcGFP1-myc C3xNLS <400> 6 Gly Lys Val Thr Phe Pro Lys Met Lys Ile Pro Lys Phe Thr Phe Ser 1 5 10 15 Gly Arg Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu Ser Lys Gly Ala 20 25 30 Glu Leu Phe Thr Gly Ile Val Pro Ile Leu Ile Glu Leu Asn Gly Asp 35 40 45 Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala 50 55 60 Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu 65 70 75 80 Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Ser Tyr Gly Val Gln 85 90 95 Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys 100 105 110 Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Ile Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Glu 115 120 125 Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Ser Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp 130 135 140 Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Thr Gly Thr Asp Phe Lys Glu Asp 145 150 155 160 Gly Asn Ile Leu Gly Asn Lys Met Glu Tyr Asn Tyr Asn Ala His Asn 165 170 175 Val Tyr Ile Met Thr Asp Lys Ala Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe 180 185 190 Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His 195 200 205 Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp 210 215 220 Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Ala Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu 225 230 235 240 Lys Arg Asp His Met Ile Tyr Phe Gly Phe Val Thr Ala Ala Ala Ile 245 250 255 Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys Ser Gly Leu Arg Ser Arg Ala 260 265 270 Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 275 280 285 Asp Pro Lys Lys Lys Arg Lys Val 290 295 <210> 7 <211> 69 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> C3xNLS <400> 7 ccaaaaaaga 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Claims (11)

  1. 피검 물질과 접촉시킨 후, 해마 치아 이랑으로부터 분리된 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 모시 세포의 신경 활성 수준을 피검 물질과 접촉시키지 않은 대조군의 신경 활성 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 항우울제를 스크리닝하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계는 모시 세포의 신경 활성 특이적 마커의 검출, 전기생리학적 분석, 및 이들의 조합에 의해 수행되는 것인, 방법.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 피검 물질과 접촉된 모시 세포의 신경 활성 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 상기 피검 물질을 항우울제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 모시 세포의 신경 활성 수준을 측정하는 단계는 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준을 측정하여 수행되는 것인, 방법.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 피검 물질과 접촉된 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 상기 피검 물질을 항우울제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  6. 청구항 4에 있어서, 상기 단계는 모시 세포 내 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합 수준을 측정하는 것인, 방법.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합 수준은 투-하이브리드 방법, 공동면역침강 방법 (co-immunoprecipitation assay), 공동-국소화 분석 (co-localization assay), 섬광 근접 측정법 (scintillation proximity assay: SPA), UV 또는 화학적 가교 결합 방법, 이분자 상호작용 분석 (bimolecular interaction analysis: BIA), 질량 분석법 (mass spectrometry: MS), NMR (nuclear magnetic resonance), 형광 편광 분석법 (fluorescence polarization assays,FPA) 및 시험관내 풀-다운 에세이 (in vitro pull-down assay)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 방법에 의해 측정되는 것인, 방법.
  8. 청구항 6에 있어서, 상기 피검 물질과 접촉된 모시세포 내 p11/AnxA2 복합체와 SMARCA3간 결합 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 상기 피검 물질을 항우울제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.
  9. 청구항 1에 있어서, 상기 항우울제는 세로토닌 재흡수 억제제 계열 항우울제의 치료 효능을 향상시키는 것인, 방법.
  10. 피검 물질과 접촉시킨 후, 치아 이랑부터 분리된 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준을 측정하는 단계; 및
    상기 측정된 모시 세포 내 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준을 피검 물질과 접촉시키지 않은 대조군의 p11/AnxA2/SMARCA3 복합체 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 모시세포의 신경 활성화제를 스크리닝하는 방법.
  11. 청구항 10에 있어서, 상기 피검 물질과 접촉된 모시 세포 내p11/AnxA2/SMARCA3 복합체의 수준이 대조군에 비해 증가된 경우, 상기 피검 물질을 모시세포의 신경 활성화제로 결정하는 단계를 더 포함하는 것인, 방법.

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JP2014137282A (ja) 2013-01-17 2014-07-28 Meijo University うつ病マーカー、アッセイ方法、うつ病決定方法、うつ病薬のスクリーニング方法及びキット

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