JP6462748B2 - 光により制御される中枢神経系（ｃｎｓ）機能不全 - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本願は、それぞれの内容の全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１０年１１月５日に提出された米国特許仮出願番号第６１／４１０，７４８号および２０１１年３月８日に提出された米国特許仮出願番号第６１／４６４，８０６号の優先権の利益を主張するものである。

本発明の背景
不安感は、目下の脅威が無い状況で、高まった心配が持続する状態であり、病的な状態では、非常に心身を衰弱させるものとなる。不安障害は、精神病のうちで最も一般的なものを代表し（２８％の生涯有病率を有する）、そして、大うつ病と物質乱用の原因論と関係づけられている。感情処理に重要な脳の領域である扁桃体が不安感について役割を担うと長らく仮定されてきたが、不安感を制御、仲介する神経メカニズムは未だ特定されていない。不安障害は高い有病率を持ち、そして、深刻であるにも関わらず、対応する神経回路基質の理解は不十分であり、安全で効果的な治療の開発を妨げている。利用可能な治療法は効果が一貫しない傾向にあり、または、ベンゾジアゼピン類の場合、常習性になり、認知障害や死を引き起こすこともありうる鎮静状態と呼吸抑制を含む顕著な副作用に直結する傾向がある。哺乳類の脳における不安感の制御機構のより深い理解が、副作用がより少ない、より効果的な治療法を開発するために必要である。自然の不安緩解の経路をリクルートする可能性が特に興味深く、そして、新しい。

基底外側扁桃体（ＢＬＡ）のグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含む動物であって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおけるオプシンの選択的な照明によって不安感が誘発される、または不安感が軽減される前記動物が本明細書において提供される。

ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンであって、光による過分極を誘導するオプシンである前記オプシンを含む動物であり、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が誘発される前記動物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する第２の光反応性オプシンであって、光による脱分極を誘導するオプシンである前記オプシンを前記動物はさらに含み、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記第２オプシンの選択的照明により前記動物の不安感が軽減される。いくつかの実施形態において、前記第２オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記第２オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記第２オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。

ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンであって、光による脱分極を誘導するオプシンである前記オプシンを含む動物であり、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が軽減される前記動物が本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。

個体のＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達するベクターであって、光反応性オプシンをコードし、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む前記ベクターもまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＣａＭＫＩＩαプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による脱分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を軽減する。いくつかの実施形態において、光による脱分極を誘導する前記オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による過分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を誘発する。いくつかの実施形態において、光による過分極を誘導する前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記個体はマウスまたはラットである。いくつかの実施形態において、前記個体はヒトである。

個体のＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達する方法であって、光反応性オプシンをコードする核酸であって、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む有効量のベクターを前記個体に投与することを含む前記方法もまた本明細書に提供される。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＣａＭＫＩＩαプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による脱分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を軽減する。いくつかの実施形態において、光による脱分極を誘導する前記オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による過分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を誘発する。いくつかの実施形態において、光による過分極を誘導する前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記個体はマウスまたはラットである。いくつかの実施形態において、前記個体はヒトである。

ＢＬＡ、ＣｅＬおよびＣｅＭを含み、前記ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて光反応性オプシンが発現する冠状断脳組織薄片もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による脱分極を誘導するオプシンである。いくつかの実施形態において、光による脱分極を誘導する前記オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記オプシンは光による過分極を誘導するオプシンである。いくつかの実施形態において、光による過分極を誘導する前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、前記組織はマウスまたはラットの組織である。

不安感を軽減する化合物をスクリーニングする方法であって、（ａ）光による過分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する前記オプシンを含む動物であり、ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する前記オプシンの選択的照明により誘発される不安感を有する前記動物に化合物を投与すること；および（ｂ）前記動物における不安感のレベルを判定することを含み、前記不安感のレベルの低下が、その化合物が不安感の治療に有効であり得ることを示す前記方法もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。

個体における不安感を軽減する方法であって、（ａ）光による脱分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する前記オプシンである光反応性オプシンをコードする核酸であって、ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む有効量のベクターを前記個体に投与すること；および（ｂ）不安感を軽減するためにＢＬＡ−ＣｅＬの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明することを含む前記方法もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＣａＭＫＩＩαプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、前記オプシンはＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１またはＤＣｈＲである。いくつかの実施形態において、前記オプシンは、配列番号８、９、１０または１１のアミノ酸配列を含むＣ１Ｖ１キメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、前記オプシンは配列番号６または７のアミノ酸配列を含む。

個体において不安感を誘発させる方法であって、（ａ）光による過分極を誘導するオプシンであって、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する前記オプシンをコードする核酸であり、ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む有効量のベクターを前記個体に投与すること；および（ｂ）不安感を誘発するためにＢＬＡ−ＣｅＬの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明することを含む前記方法もまた本明細書において提供される。いくつかの実施形態において、前記プロモーターはＣａＭＫＩＩαプロモーターである。いくつかの実施形態において、前記ベクターはＡＡＶベクターである。いくつかの実施形態において、前記オプシンはＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲまたはＧｔＲ３である。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲは配列番号１、２または３のアミノ酸配列を含む。

本明細書において記載される様々な実施形態の特質のうちの１つ、いくつか、または全てが組み合わされて、本発明の他の実施形態を作り出すことができると理解されるものとする。本発明のこれらの態様および他の態様が当業者に明らかとなる。

以下の説明と添付した図面に鑑みて、様々な例示的実施形態がより完全に理解され得る。
本開示の実施形態に一致する、脳の特定の投射の光遺伝学的ターゲティングをもたらすシステムを示す図である。 本開示の実施形態に一致する、不安感に基づく回路モデルの使用についてのフローチャートを示す図である。 ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の投射特異的興奮が急性可逆的不安緩解を引き起こしたことを示す図である。ａ）行動制御の前に少なくとも１週間、全てのマウスが高ストレス環境で１匹ずつ飼育された。そして、全てのライト・オン条件の間に２０Ｈｚで５ミリ秒の光パルスを受容する。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスはＣａＭＫＩＩプロモーターの制御下のＢＬＡニューロンにおけるＣｈＲ２のウイルス性形質導入を受け、そして、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明を可能にするために、ＢＬＡ細胞体から光を隠す、斜めに切ったカニューレが埋め込まれた。一方、対照グループはフルオロフォアのみを含むウイルスを受容したか（ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ）、ＢＬＡ細胞体を照明するように向けられた光ファイバーを受容した（ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループ）。（ｂ〜ｃ）ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウス（ｎ＝８）が高架式十字迷路法中のライト・オンエポックにＣｅＡ中のＢＬＡ末端に選択的照明を受け、このＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡの代表的なパス（ｂ）から分かるように、その選択的照明が、ライト・オフエポックおよびＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡ対照（ｎ＝９）およびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体対照（ｎ＝７）（ｃ）と比較して、ライト・オンエポックで壁がないアームにいる時間の５倍の増加、ならびに壁が無いアームへ入っていく確率の著しい増大（差込図を参照のこと）を誘導した。（ｄ〜ｆ）ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスはまた、この代表的なトレース（ｄ）から分かるように、ライト・オフエポックおよびＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡ対照およびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体対照（ｅ）と比較して、ライト・オンエポックにオープンフィールドチャンバーの中央で過ごす時間の増加を示すが、ライト・オンエポックで自発運動活性の著しい変化を示すことはなかった（ｆ）。 ｇ）定量に用いた領域を１２５μｍ×１２５μｍの正方形で示す、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスのＣｅＡ領域およびＢＬＡ領域を示す冠状薄片の共焦点イメージ。ｈ）領域を拡大したものが横の段にグループ毎に、そして、縦の段に脳の領域毎に並べてある。（ｉ〜ｋ）各領域の全てのグループについてのＤＡＰＩで同定された細胞全てのうちのＥＹＦＰ陽性およびｃ‐ｆｏｓ陽性ニューロンのパーセント。グループおよび領域毎の計数されたニューロンの数が凡例に示されている。グループ間でＥＹＦＰ陽性細胞の割合に検出可能な差異を示した領域は無かった。ｉ）ＥＹＦＰ陽性またはｃ‐ｆｏｓ陽性であったＢＬＡニューロンの割合。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ（ｐ＜０．０１）またはＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ（ｐ＜０．０５）と比較して、ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループではｃ‐ｆｏｓ陽性ＢＬＡニューロンの割合が著しく高かった（Ｆ_２，_９＝１０．１２、ｐ＜０．０１）。ｊ）ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ（ｐ＜０．０５）と比較して、ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループではなく、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループでＣｅＬ中のｃ‐ｆｏｓ陽性細胞の割合が著しく高かった。ｋ）ＣｅＭニューロンについての要約データは、グループ間で検出可能な差異を示していない。 ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の投射特異的興奮がＣｅＬニューロンを活性化し、ＣｅＭニューロンのフィードフォワード抑制を誘発することを示す図である。ａ）明視野像に重ね合わせた、全て同じ薄片から画像化された代表的光反応性ＢＬＡ細胞、ＣｅＬ細胞およびＣｅＭ細胞のライブ二光子画像。（ｂ〜ｆ）関連の代表的な電流固定トレース（Ｖ_ｍ＝約−７０ｍＶ）のレコーディングと照明部位の模式図。ｂ）ＣｈＲ２を発現するＢＬＡ錐体ニューロンの代表的なトレース。ＢＬＡ中のＣｈＲ２を発現する全てのＢＬＡニューロン全てが５ミリ秒のパルス毎にスパイクを発した（ｎ＝４）。ｃ）ＢＬＡ投射ニューロンの末端領域中のＣｅＬニューロンの代表的なトレース（ｎ＝１６）。光刺激に対する閾値下と閾値上の両方の興奮性反応を示す。差込図（左）：２０Ｈｚの４０パルストレインでの各パルスのスパイキングの平均確率についての集団要約。点線は平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を示す。差込図（右）：２０Ｈｚで送達された５ミリ秒の光パルスの個々の細胞スパイキングフィデリティを示す頻度ヒストグラム。Ｙ軸は５％毎のビン当たりの細胞の数である。ｄ）電流ステップ（約６０ｐＡ；黒で表される）に反応したＣｅＭニューロンスパイキングの６スイープおよびＣｅＬ中のＢＬＡ末端の２０Ｈｚの照明によるスパイキングの抑制。差込図：ＣｅＬニューロンの光刺激の間はスパイク頻度が著しく低下した（ｎ＝４）。（ｅ〜ｆ）ＣｅＭが広範囲に照明されたとき、興奮性シナプス後電流（ＥＰＳＣ）の潜時は抑制性シナプス後電流（ＩＰＳＣ）の潜時よりも著しく短く、ＥＰＳＣとＩＰＳＣの振幅には顕著な差が無かった（ｎ＝１１；＊はｐ＝０．０４である。差込図を参照のこと）ことが電位固定要約により示される。同じＣｅＭニューロン（ｎ＝７）は、ＣｅＭの照明を受けた時に正味の興奮（ｅ）かＣｅＬの選択的照明を受けた時に正味の抑制（ｆ）のどちらかを示した。 同上。 光誘導性抗不安効果はＢＬＡ−ＣｅＬシナプスだけの活性化に起因したことを示す図である。（ａ〜ｂ）１８個の染色ＢＬＡニューロンの２光子Ｚスタック画像が再構成された。そして、それらのＣｅＬおよびＣｅＭへの投射が、（ｂ）に示されるそれらの画像と共に（ａ）において要約され、それらの画像中で、赤はＣｅＬへの投射を示し、青はＣｅＭへの投射を示し、そして紫はＣｅＬおよびＣｅＭの両方への投射を示す。ｃ）レコーディング部位および光点の位置の模式図。細胞体から視認される軸索上および軸索上ではない方向の両方に光点を１００μｍずつずらし、その光点の各位置で全細胞レコーディングが行われた。ｄ）細胞体から様々な距離で送達された２０Ｈｚのトレインに対するスパイクフィデリティの正規化された電流固定要約。細胞体から約３００μｍ離れた位置での軸索末端の照明の結果が低い（５％未満）スパイクフィデリティであることを示す。ｅ）細胞体からの距離毎の、照明を受けて細胞体に見られる脱分極性電流の正規化された電位固定要約。 （ｆ〜ｉ）各薄片標本（ｎ＝７）の様々な位置での約１５０μｍの直径の光点による照明を受けた時の代表的な電流固定トレース。細胞体の照明が高フィデリティスパイキングを誘発する（ｆ）。ＣｅＬ中のＢＬＡ末端の照明がシナプス後ＣｅＬニューロンで強い閾値下および閾値上興奮性反応を誘発するが（ｇ）、ＢＬＡニューロンそのものでは逆方向性スパイキングを誘発せず（ｈ）、そして、軸索外に送達された光が光散乱についての対照として比較のために示される（ｉ）。（ｋ〜ｊ）別のグループのＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＬマウス（ｎ＝８）のそれぞれについて高架式十字迷路法とオープンフィールドテストが二回行われ、一方のセッション（赤）は生理食塩水のＣｅＡ内点滴で始まり、他方のセッションはグルタミン酸受容体アンタゴニストであるＮＢＱＸおよびＡＰ５で始まった（紫）。その順序についてカウンターバランスをとるようにした。ｋ）ＣｅＡでのグルタミン酸受容体の遮断によって、ライト・オフエポックでのパフォーマンスが損なわれることなく、高架式十字迷路法での壁がないアームで過ごす時間ならびに壁がないアームに入っていく確率（差込図）の両方の光誘導性の増加が減退した。ｊ）局所的グルタミン酸受容体拮抗作用によって、オープンフィールドテストでの中央で過ごす時間の光誘導性増加が著しく減退した。差込図は結果をまとめた要約を示す。 ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的抑制が不安感の急性可逆的増大を誘発したことを示す図である。ａ）すべてのマウスが低ストレス環境下において集団で飼育され、ライト・オンエポックに５９１ｎｍの連続光を両側的に受容した。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウス（ｎ＝９）がＣａＭＫＩＩプロモーターの制御下でｅＮｐＨＲ３．０の両側性ウイルス性形質導入をＢＬＡニューロンに受け、そして、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明を可能にするために、ＢＬＡ細胞体から光を隠す、斜めに切ったカニューレが埋め込まれた。一方、対照グループはフルオロフォアのみの両側性ウイルス性形質導入を受容したか（ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡ ｂｉｌグループ；ｎ＝８）、ＢＬＡ細胞体を照明するように向けられた光ファイバーを受容した（ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ細胞体グループ；ｎ＝６）。ｂ）ｅＮｐＨＲ３．０で処理されたマウスのＢＬＡおよびＣｅＡの共焦点イメージ。（ｃ〜ｅ）以下の不安感測定に用いられた同じ動物での、ＥＹＦＰグループ（＊はｐ＜０．０５である）と比較して著しく高い、ｅＮｐＨＲ３．０グループのｃ‐ｆｏｓを発現するＣｅＭ中のニューロンの割合（ｅ）。ｆ）ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明中に高架式十字迷路法で壁がないアームを探査することが減少する、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスの代表的なパス。ｇ）ｅＮｐＨＲ３．０マウスは、対照と比較して、光刺激中に壁がないアームで過ごす時間および壁がないアームに入っていく確率（差込図）の減少を示した。ｈ）オープンフィールドテストでのまとめたライト・オフエポックおよびライト・オンエポックでの、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスの代表的なパス。ｉ）対照と比較して、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループについての、ライト・オフエポックではなく、ライト・オンエポック中でのオープンフィールドチャンバーの中央にいる時間の著しい減少。（ｊ〜ｌ）ｅＮｐＨＲ３．０発現ＢＬＡ末端の選択的照明はカルバコールの存在下で自発的なシナプス小胞放出を低減させるのに充分である。ｅＮｐＨＲ３．０を発現したＢＬＡニューロンを含む急速薄片調製物のＣｅＬニューロンの代表的なトレース（ｊ）は、ＢＬＡ細胞体から約３００μｍ離れたＢＬＡ末端が照明されると、シナプス後ＣｅＬニューロンで見られるｓＥＰＳＣの振幅（ｋ）と周波数（ｌ）が減少することを示す。５〜６０秒の様々な長さの照明を受けたときのＣｅＬニューロン（ｎ＝５）で記録されたｓＥＰＳＣの振幅（ｋ）と周波数（ｌ）の累積頻度分布。差込図は、照明前、照明中および照明後の互角の時間のエポックにおけるそれぞれの平均値＋ＳＥＭを示す（＊＊はｐ＜０．０１である；＊＊＊はｐ＜０．００１である）。（ｍ〜ｐ）ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡ末端の選択的照明が、ＢＬＡでの電気的刺激により誘起されたシナプス小胞放出を抑制する。ｍ）刺激電極、記録電極および約１５０μｍの直径の光点の位置を示す模式図。ｎ）ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡ末端の選択的照明の前（オフ_１）、照明中（オン）および照明後（オフ２）のＣｅＬニューロンにおけるＥＰＳＣの代表的なトレース。ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡニューロンを含む薄片調製物（ｎ＝７）および非形質導入対照（ｎ＝５）に由来する正規化されたＥＰＳＣ振幅の要約データ（ｏ）および個々の細胞のデータ（ｐ）が、ＣｅＬ中のＢＬＡ末端を選択的に照明することにより、シナプス後ＣｅＬニューロンにおいて電気的に誘起されたＥＰＳＣの振幅が著しく低減する（＊はｐ＝０．００６である）ことを示す。 同上。 同上。 ４７３ｎｍの光で処理されたマウスの組織学的に確認された配置を示す図解を示す図である。ウイルス注射針（円）と斜めに切ったカニューレの先端（ｘ）の片側配置が示されており、半球についてカウンターバランスがとられている。色は処理グループを示す。凡例を参照のこと。ＢＬＡおよびＣｅＡを含む冠状切片がここに示され、数はブレグマからの前後方向の座標を示す (Aravanis et al., J Neural Eng, 4:S143-156, 2007)。 斜めに切ったカニューレおよび照明プロファイルの設計を示す図である。ａ）水中のフルオレセインで満たされたキュベットに対して４７３ｎｍの光を放射するそのままのファイバーに由来する光円錐。光円錐の角度はおよそ１２度である。ｂ）斜めに切ったカニューレの中に覆われた同じファイバーと光に由来する光円錐。斜めに切ったカニューレが、垂直方向の光の通過は検出可能なほど変えずに、片側への光の送達を妨害する。ｃ）斜めに切ったカニューレを用いるＣｅＡへの光ファイバーを介した光の送達の図解。ｄ）ファイバーの先端で見られる光パワー密度が７ｍＷ（約９９ｍＷ／ｍｍ^２）であったときの、マウス脳組織においてファイバーの先端から様々な距離で見られる推定された光パワー密度を示す図。差込図：構成を示すイラスト。光ファイバーはマウス脳組織に対して垂直であり、パワーメーターの中央に狙いをつけた。ｅ）標準的パワーメーターにより測定された光パワー（ｍＷ）ならびにＣｅＬ（脳組織での約０．５〜０．７ｍｍの深度）およびＣｅＭ（脳組織での約１．１ｍｍの深度）にあるファイバーの先端で見られる推定光パワー密度（ｍＷ／ｍｍ^２）を示す表。 斜めに切ったカニューレがＢＬＡへの光の送達を妨げたこと、および行動試験に用いた光パワーでのＢＬＡスパイキングを示す図である。ａ）光ファイバーによるＣｅＡへの光送達とＢＬＡ中の記録電極（赤）の構成を示す模式図。ｂ）斜めに切ったカニューレ（ｎ＝４部位）を用いて、および、用いずにＣｅＡに送達された様々な光パワーでのＢＬＡにおけるレコーディングの散布図要約。各部位について、斜めに切ったカニューレを用いて、および用いずに交互に反復してレコーディングを行った。Ｘ軸はファイバーの先端での光パワー密度（黒）とＣｅＬでの推定光パワー密度（灰色）の両方を示す。青い垂直または陰になった領域は行動試験に用いられた光パワー密度の範囲を示す（約７ｍＷ；ファイバーの先端で約９９ｍＷ／ｍｍ^２）。この光パワー密度の範囲ではＢＬＡニューロンからの確実な反応は観察されなかった。ｃ）ＣｅＡ中の同じ記録部位での７ｍＷで２０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス光刺激（ファイバーの先端で約９９ｍＷ／ｍｍ^２；ＣｅＬで約５．９ｍＷ／ｍｍ^２）を用いるＢＬＡレコーディングの代表的なトレース。ｄ）光の単一パルスに反応した集団スパイク波形によって、１２ｍＶもの高パワー（ファイバーの先端で約１７０ｍＷ／ｍｍ^２；ＣｅＬで約１０．１ｍＷ／ｍｍ^２）での実質的な光制限が示される。 ウイルス性形質導入が介在細胞クラスターを除外したことを示す図である。ａ）以下の共焦点画像で示される介在細胞の模式図。（ｂ〜ｄ）行動制御に用いられたＢＬＡへのｂ）ＥＹＦＰ、ｃ）ｅＮｐＨＲ３．０およびｄ）ＣｈＲ２の注入を受けたマウスの介在細胞の代表的な画像。介在細胞クラスターではウイルスの発現は観察されなかった。（ｅ〜ｆ）行動試験に用いられた６グループ全てについて介在細胞クラスターで非常に低い（２％未満）レベルのＹＦＰ発現があった。ｃ‐ｆｏｓ発現においてはグループ間で統計学的に有意な差は無かった。 グルタミン酸アンタゴニストの片側ＣｅＡ内投与が自発運動活性を変化させなかったことを示す図である。オープンフィールドテストの前のＮＢＱＸとＡＰ５の投与は、生理食塩水の点滴と比較して、自発運動活性（平均速度により測定された）を減じることがなかった（Ｆ_１，７７＝２．３４、ｐ＝０．１２３９）。 グルタミン酸アンタゴニストのバス適用が、光により誘起されたシナプス伝達を遮断したことを示す図である。野生型マウスのＢＬＡへのＡＡＶ５−ＣａｍＫＩＩ−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰのＢＬＡ内点滴の４〜６週間後に、我々は、グルタミン酸受容体アンタゴニストであるＮＢＱＸとＡＰ５がグルタミン酸作動性伝達を遮断する能力を調べた。ａ）ＣｈＲ２を発現するＢＬＡ末端への２０Ｈｚのトレインで４７３ｎｍの光の照明を受けたときの代表的なＣｅＬニューロンの代表的な電流固定（上）と電位固定（下）トレース。ｂ）ＮＢＱＸとＡＰ５のバス適用後の同じ細胞の反応がスパイキングおよびＥＰＳＣの消失を示す。ｃ）投薬前の反応に対して正規化された、ＮＢＱＸとＡＰ５のバス適用の前後に見られる脱分極性電流の集団要約（ｎ＝５）。 ５９４ｎｍの光で処理されたマウスの組織学的に確認された配置を示す図解を示す図である。ウイルス注射針（円）と斜めに切ったカニューレの先端（ｘ）の両側配置が示されている。色は処理グループを示す。凡例を参照のこと。ＢＬＡおよびＣｅＡを含む冠状切片が示され、数はブレグマからの前後方向の座標を示す (Aravanis et al., J Neural Eng, 4:S143-156, 2007)。 ｅＮｐＨＲ３．０末端抑制実験に用いられる光刺激パラメータは細胞体でのスパイキングを妨げないことを示す図である。（ａ〜ｃ）光点の位置と記録部位の模式図、および、それらに対応する、中間のエポック（黄色の水平の棒で示される）の間に各位置での黄色光による照明と対になった、スパイクトレインの期間続く電流ステップでの代表的なトレース。ａ）直接に照明を受けたときのｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡニューロンの代表的な電流固定トレースにより、細胞体の照明中のスパイキングの強力な抑制が示される。ｂ）軸索を照明することなく、細胞体から約３００μｍ離れて約１２５μｍの直径の光点を提供したときの、ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡニューロンの代表的な電流固定トレース。ｃ）細胞体から約３００μｍ離れて約１２５μｍの直径の光点を提供して軸索を照明したときの、ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡニューロンの代表的な電流固定トレース。ｄ）細胞体の直接的照明が、他の条件全てで顕著であったスパイキングの完全な抑制を誘導したが（Ｆ_３，９＝８１．５０、ｐ＜０．０００１；１条件当たりｎ＝３以上）、ｅＮｐＨＲ３．０を発現するＢＬＡニューロンの細胞体から約３００μｍ離れた遠位照明の条件と照明光が無い条件の間では顕著な差は無かった（Ｆ_２，７＝０．７９、ｐ＝０．４９）。このことは、遠位の照明が細胞体でのスパイキングを顕著に抑制することがなかったことを示す。ｅ）右に示される集団要約に関係する、記録部位に相対的な光点の位置を示す模式図。集団要約は、軸索側枝上および軸索側枝外の（ｎ＝５）、細胞体からの光点の距離毎に細胞体から記録された、正規化された過分極電流を示す。 ＢＬＡ末端の選択的照明が、逆方向性活動電位を確かに誘発することなく、ＣｅＬニューロンに対しシナプス小胞放出を誘導したことを示す図である。模式図と説明は下記のトレースについて言及したものであり、トレースの色は細胞種を示す。光照明パターンは両方のシリーズのトレースで同一である。左列：細胞あたり４０パルス光トレインの３回の上書きスイープについてのＣｅＬトレース（ｎ＝８）。ここで、時間的に同期したＥＰＳＣがシナプス前ＣｈＲ２発現ＢＬＡ末端からのシナプス小胞放出を示すのみならずまた、全てのシナプス後ＣｅＬ細胞について、光パルスの１００％に対して興奮性反応があった。右列：細胞あたり４０パルスの３回の上書きスイープについてのＢＬＡトレース（ｎ＝９）と閾値上逆方向性活動電位（５．４％±２％、平均値±ＳＥＭ）をもたらす軸索末端に送達された光パルスの平均数。 ｅＮｐＨＲ３．０グループと対照グループで光刺激が自発運動活性を変化させなかったことを示すグラフである。グループ間で、または光エポック間で自発運動活性に検出可能な差は無かった（Ｆ_１，２０＝０．０２３、ｐ＝０．３８９２；Ｆ_{１，１００}＝３．０８、ｐ＝０．０８６）。

詳細な説明
本開示は、本明細書において記載されるような、不安感および不安症状を伴う障害などの神経系障害の制御に関連する。本開示は、必ずしも、これらの状況に限定されないが、これらの状況および他の状況を用いて実施例を考察することにより、本発明の様々な態様を理解することができる。

本開示の様々な実施形態が、神経回路の時間的制御を測定可能な評価指数と関係づける光遺伝学的システムまたは方法に関連する。例えば、様々な不安感の症状を示す神経障害に様々な評価指数または症状を関連づけることができる。光遺伝学的システムは患者の神経回路をその選択的制御のために標的とする。光遺伝学的システムは、神経障害に関連する評価指数または症状を求めて患者をモニターすることを含む。この方法で、光遺伝学的システムは神経回路、その機能および／または神経障害についての詳細な情報を提供することができる。

本明細書において考察される実施形態と一致するが、特定の実施形態が傷害の研究と厳密な調査に関連する。他の実施形態は表現型およびエンドフェノタイプの特定および／または研究に関連する。さらに他の実施形態は治療標的の特定に関連する。

本開示の態様は、本来は健康である動物での不安感の研究のために、人工的に誘発した不安状態を用いることを対象とする。これは、理解が不十分であり、そして、生きている動物で正確にモデル化することが本来難しい症状および態様をモニターするのに特に有用であり得る。例えば、不安状態を示す入手可能な動物が無いため、不安状態の試験および／または研究が困難であることがある。さらに、ある実施形態は可逆的な不安状態を考慮に入れており、それは、不安状態を示しているときと不安状態を示していないときの同じ動物の試験および／またはその同じ動物への治療の効果の試験のためのベースライン／対照点を構築するのに特に有用であり得る。ある実施形態の可逆的な不安状態はまた、同じ動物への異なる治療の効果の試験と試験の間にベースラインにリセットすることを考慮にいれることが可能である。

本開示のある態様は、生きている動物での不安感および／または不安症状の制御に関連した方法を対象とする。あるさらに特異的な実施形態において、症状のモニタリングにはまた、不安症状の緩和における刺激の有効性を評価することも含まれる。他の様々な方法および応用が存在し、それらのいくつかは本明細書においてより詳細に考察される。

本発明において使用され得る光反応性オプシンには、光によってニューロンで過分極を誘導するオプシン、および光によってニューロンで脱分極を誘導するオプシンが挙げられる。オプシンの例は下記の表１および２に示される。
表１は、可視光のスペクトルでの細胞活性の抑制に働く特定されたオプシンを示す。
表２は、可視光のスペクトルでの興奮と変調に働く特定されたオプシンを示す。

本明細書において使用される場合、光反応性オプシン（ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲ、ＧｔＲ３、Ｍａｃ、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１、ＤＣｈＲおよびＣｈＥＴＡなど）には天然型タンパク質および機能性異型体、断片、断片または全長タンパク質を含む融合タンパク質が含まれる。例えば、シグナルペプチドを欠失することが可能である。異型体は天然型タンパク質の配列と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％のいずれかだけ同一であるアミノ酸配列を有することが可能である。機能性異型体は天然型タンパク質と同じ、または類似の過分極機能または脱分極機能を有し得る。

いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲはｅＮｐＨＲ３．０またはｅＮｐＨＲ３．１である（www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.htmlを参照のこと）。いくつかの実施形態において、光反応性オプシンはＣ１Ｖ１キメラタンパク質またはａＣ１Ｖ１−Ｅ１６２（配列番号１０）、Ｃ１Ｖ１−Ｅ１２２（配列番号９）、またはＣ１Ｖ１−Ｅ１２２／Ｅ１６２（配列番号１１）変異キメラタンパク質である（Yizhar et al, Nature, 2011, 477(7363):171-78および www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.htmlを参照のこと）。いくつかの実施形態において、光反応性オプシンはＳＦＯ（配列番号６）またはＳＳＦＯ（配列番号７）である（Yizhar et al, Nature, 2011, 477(7363):171-78; Berndt et al., Nat. Neurosci., 12(2):229-34 および www.stanford.edu/group/dlab/optogenetics/sequence_info.htmlを参照のこと）。

いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％同一なアミノ酸配列を含むＮｐＨＲオプシンである。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンはシナプス小胞体（ＥＲ）搬出シグナルおよび／または膜輸送シグナルをさらに含む。例えば、ＮｐＨＲオプシンは、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列とシナプス小胞体（ＥＲ）搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列はリンカーを介してＥＲ搬出シグナルと連結される。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＦＸＹＥＮＥを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＶＸＸＳＬを含み、Ｘは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態において、ＥＲ搬出シグナルはアミノ酸配列ＦＣＹＥＮＥＶを含む。いくつかの実施形態において、ＮｐＨＲオプシンは、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナルおよび膜輸送シグナルを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、ＥＲ搬出シグナルおよび膜輸送シグナルを含む。他の実施形態において、ＮｐＨＲオプシンは、Ｎ末端からＣ末端に向けて、配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列、膜輸送シグナルおよびＥＲ搬出シグナルを含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはヒト内向き整流性カリウムチャンネルＫ_ｉｒ２．１のアミノ酸配列に由来する。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはアミノ酸配列ＫＳＲＩＴＳＥＧＥＹＩＰＬＤＱＩＤＩＮＶを含む。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはリンカーによって配列番号１に示される配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列に連結される。いくつかの実施形態において、膜輸送シグナルはリンカーを介してＥＲ搬出シグナルに連結される。リンカーは、５、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００または５００アミノ酸のいずれかの長さのアミノ酸を含み得る。リンカーは蛍光タンパク質、例えば、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質、または青色蛍光タンパク質をさらに含み得る。いくつかの実施形態において、光活性化オプシンはＮ末端シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、光活性化オプシンは配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化タンパク質は配列番号３のアミノ酸配列を含む。

いくつかの実施形態において、光活性化オプシンは、ボルボックス・カルテリ（Volvox carteri）のＶＣｈＲ１とコナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardti）のＣｈＲ１に由来するキメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、キメラタンパク質は、ＶＣｈＲ１の少なくとも第１および第２膜貫通ヘリックスがＣｈＲ１の対応する第１および第２膜貫通ヘリックスで置換されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、キメラタンパク質は、ＶＣｈＲ１の少なくとも第１および第２膜貫通ヘリックスがＣｈＲ１の対応する第１および第２膜貫通ヘリックスで置換されたアミノ酸配列を含み、そして、ＣｈＲ１の対応する部分によって置換される第２および第３膜貫通ヘリックスの間に位置する細胞内ループドメインの少なくとも一部をさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ光活性化タンパク質の第２および第３膜貫通ヘリックスの間の細胞内ループドメイン全体がＣｈＲ１の対応する細胞内ループドメインによって置換され得る。いくつかの実施形態において、光活性化キメラタンパク質は、シグナルペプチド配列を持たない配列番号８に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、光活性化キメラタンパク質は、配列番号８に示される配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含む。前記キメラポリペプチドのＶＣｈＲ１部分のレチナール結合ポケット内の重要な位置での特定のアミノ酸置換を有することができるＣ１Ｖ１キメラ光活性化オプシン。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号８のアミノ酸残基Ｅ１２２に変異を有する。いくつかの実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号８のアミノ酸残基Ｅ１６２に変異を有する。他の実施形態において、Ｃ１Ｖ１タンパク質は配列番号８のアミノ酸残基Ｅ１６２とＥ１２２の両方に変異を有する。いくつかの実施形態において、本開示の変異型Ｃ１Ｖ１キメラタンパク質のそれぞれが、光に反応した動物の細胞膜の脱分極に使用される特定の性質と特徴を有し得る。

本明細書において使用される場合、ベクターは、本明細書において記載される光反応性オプシンをコードする核酸であって、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発言を制御するプロモーターに機能的に連結した前記核酸を含む。核酸のグルタミン酸作動性錐体ニューロンへの送達に有用な任意のベクターを使用することができる。ベクターには、ＡＡＶベクター、レトロウイルス性ベクター、アデノウイルス性ベクター、ＨＳＶベクター、およびレンチウイルス性ベクターなどのウイルス性ベクターが含まれる。ＡＡＶベクターの例はＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＶ１４、ＡＡＶ１５およびＡＡＶ１６である。ＣａＭＫＩＩαプロモーターおよび前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの発現を制御することができる他の任意のプロモーターを使用することができる。

「個体」はヒトなどの哺乳類動物である。哺乳類動物には、家畜、競技用動物、愛玩動物（ネコ、イヌ、ウマなど）、霊長類、マウスおよびラットも含まれる。「動物」は非ヒト哺乳類動物である。

本明細書において使用される場合、「治療（treatment）」または「治療すること（treating）」または「軽減（alleviation）」は、臨床結果を含み、好ましくは臨床結果である有益な、または所望の結果を得るためのアプローチのことである。本発明の目的にとって、有益な、または所望の臨床結果には、これらに限定されないが、次のもののうちの１つ以上が含まれる：観察可能および／または測定可能な前記疾患の１つ以上の徴候（不安感など）の軽減を示すこと、前記疾患の結果生じる症状を減らすこと、前記疾患を患う人の生活の質を向上させること、前記疾患を治療するために必要な他の医薬の用量を低下させること、および／または前記疾患の進行を遅滞させること。

本明細書において使用される場合、薬品、化合物または医薬組成物の「有効投薬量」または「有効量」は有益な、または所望の結果をもたらすのに充分である量である。治療上の使用について、有益な、または所望の結果には、前記疾患の結果生じる１つ以上の症状を減らすこと、前記疾患を患う人の生活の質を向上させること、前記疾患を治療するために必要な他の医薬の用量を低下させること、ターゲティングを介するなどにより別の医薬の効果を向上させること、および／または前記疾患の進行を遅滞させることなどの臨床結果が含まれる。臨床上の背景で理解されるように、薬品、化合物、または医薬組成物の有効投薬量は別の薬品、化合物、医薬組成物、または別の治療と併せて到達してもしなくてもよい。したがって、１つ以上の治療薬または治療を施す上で、「有効投薬量」が考慮される場合があり、所望の結果が達成され得る、または達成される場合、１つ以上の他の薬剤と併せて、有効量の単一の薬剤が投与されたと考えることができる。

上記の大要は、本開示の説明される実施形態の各々または全ての実施の記載を意図するものではない。

詳細な説明および例示的実験実施形態
本開示は不安状態および／または不安症状の制御に有用であると考えられる。本発明の具体的な応用は、不安状態および／または不安症状に関係した神経回路の時間的制御、空間的制御および／または細胞種的制御を関連付ける光遺伝学的システムまたは方法に関連する。本明細書において開示される例示的実施形態の多くの態様がこの分野のこれまでの発展に関連し、顕著にもそれをもとにしているので、実施例において見いだされるものを含む、発明の実施の詳細と変更を引き出し得る基礎と基礎をなす教示についてのしっかりとした理解をもたらすために、次の考察でそのようなこれまでの発展について概要を述べる。この文脈で、以下の考察が提供され、参考文献の教示が参照により本明細書に組み込まれる。本発明は必ずしもそのような応用に限定されるものではないが、この文脈を用いて、様々な例の考察を通して本発明の様々な態様が理解され得る。

不安感は、目下の脅威が無い状況で、高まった心配が持続する状態であり、病的な状態では、非常に心身を衰弱させるものとなる。本開示の実施形態は、不安感関連の行動の基礎をなす神経回路に関連した治療法を研究開発するために、二光子顕微鏡法、電気生理学および不安感測定法を有する細胞種特異的光遺伝学的ツールのうちの１つ以上を使用することを対象とする。

本開示の態様は、精神病に関連のある神経回路機能の研究における、細胞種よりはむしろ脳の特定の投射を標的とする光遺伝学に関連する。

本開示の特定の実施形態と一致するが、可逆的な抗不安効果をもたらすために、扁桃体中心核（ＣｅＡ）中の基底外側扁桃体（ＢＬＡ）末端に時間的に正確な光遺伝学的刺激を用いる。その光遺伝学的刺激は、ＣｈＲ２などの光反応性オプシンでのＢＬＡのウイルス性形質導入とそれに続く、下流に位置するＣｅＡの限定的な照明によって実施され得る。

本開示の他の実施形態と一致するが、不安感関連の行動を増加させるために、扁桃体中心核（ＣｅＡ）中の基底外側扁桃体（ＢＬＡ）末端の光遺伝学的抑制を用いる。その光遺伝学的刺激は、ｅＮｐＨＲ３．０などの光反応性オプシンでのＢＬＡのウイルス性形質導入とそれに続く、下流に位置するＣｅＡの限定的な照明によって実施され得る。

ＢＬＡ細胞体の直接的な光遺伝学的制御を用いて不安感に基づく効果が観察されなかったので、本開示の実施形態は神経細胞集団の特異的なターゲティングを対象とする。例えば、回路の要素としての特異的なＢＬＡ−ＣｅＡ投射のターゲティングが哺乳類の脳での内在性の不安感制御に充分であることが実験的に示されている。

本開示の実施形態と一致するが、回路の要素としての特異的なＢＬＡ−ＣｅＡ投射のターゲティングは以後より詳細に考察される数多くの因子に基づいている。扁桃体は、複雑な相互接続性を有する機能的および形態的に異質の亜核から構成される。扁桃体の主要な細区画は基底外側扁桃体複合体（ＢＬＡ）であり、それは外側（ＬＡ）扁桃体核、基底外側（ＢＬ）扁桃体核および基底内側（ＢＭ）扁桃体核（ＢＬＡニューロンの約９０％がグルタミン酸作動性である）を包含する。対照的に、扁桃体中心核（ＣｅＡ）は、外側中心（ＣｅＬ）核および正中中心（ＣｅＭ）核から構成されるが、主として（約９５％）ＧＡＢＡ作動性中型有刺ニューロンからなる。ＢＬＡは、ＣｅＡの局所性インターニューロンおよび中型有刺ニューロンの両方と機能的に異なるＧＡＢＡ作動性介在細胞（ＩＴＣ）の密集した束の中に覆われている。扁桃体の主要な出力核はＣｅＭであり、化学的または電気的に興奮させられると、それは、恐怖や不安感に関係した自律的で行動に関する反応を脳幹への投射により仲介すると考えられている。ＣｅＭは、環境情報と認知情報が集中する主要な扁桃体の部位（ＬＡ）によって直接制御されてはいないが、ＬＡとＢＬＡのニューロンがＧＡＢＡ作動性ＣｅＬニューロンを興奮させ、それがＣｅＭ「出力」ニューロンへのフィードフォワード抑制をもたらし、そして、扁桃体の出力を低減させることが可能である。ＢＬＡ−ＣｅＬ−ＣｅＭは、恐怖の鎮静化ではなく条件付け抑制に関与すると示唆されている、あまり特徴が明らかではない経路である。おそらくは緊張とショックの明確な対不形成のため、恐怖の発現の抑制が、ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの増強に関連すると示唆される。

ＢＬＡ細胞は、分界条床核（ＢＮＳＴ）、側坐核、海馬および皮質への投射を含む、脳全体に渡って乱雑な投射を有する。本開示の態様は、他のＢＬＡ投射の情動／制御がほとんどまたは全く無い、ＣｅＬ中のＢＬＡ末端の選択的制御法に関連する。オプシン遺伝子の発現をＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定することにより、そして、光の送達をＣｅＡに限定することにより、ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの優先的なターゲティングが促進され得る。

例えば、ＣａＭＫＩＩαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクターを用いることでＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成され得る。ＢＬＡ内では、ＣａＭＫＩＩαはグルタミン酸作動性錐体ニューロンだけで発現し、局所性インターニューロンまたは介在細胞では発現しない。

図１は、本開示の実施形態に一致する、脳の特定の投射の光遺伝学的ターゲティングを提供するシステムを示す。例えば、光の方向を定めるために、例えば、ＢＬＡへの光の送達を防ぎ、そして、ＣｅＡの選択的照明を可能にするために、斜めに切ったガイドカニューレを使用することができる。この光のＣｅＡ投射への優先的な送達は、ＣｅＬへの埋め込みと共に定位ガイダンスを用いて達成され得る。その結果の光の分布についての幾何的および機能的特質は、ＢＬＡ細胞体ではなくＢＬＡ末端の選択的制御についての光パワーパラメータを判定するために、インビトロとインビボの両方で、例えば、インビボ電気生理学的レコーディングを用いて定量され得る。そのような選択的な興奮または抑制が顕著で即時の、そして、可逆的な不安感に基づく効果をもたらすことが実施例に記載されるものなどの実験結果によって確認される。

本開示の実施形態は、本明細書において特定された解剖学的標的、機能的標的、構造的標的および回路標的の様々なものに適用される、上記の現実化を対象とする。例えば、不安感についての精神疾患の治療法を開発するために回路標的を研究することができる。これらの治療法は、非限定的な例として、薬理学的治療法、電気的治療法、磁気的治療法、外科的治療法および光遺伝学的治療法、または他の治療法を含むことができる。

図２は、本開示の実施形態に一致する、不安感に基づく回路モデルの使用についてのフローチャートを示す。ウイルス性送達装置などの光遺伝学的送達装置が作製される２０２。標的細胞に光反応性オプシンを導入するようにこの送達装置を設計することができ、そして、この送達装置は特定の細胞種用に標的化プロモーターを含むことができる。その後、その送達装置がＢＬＡに定位的に（または他の状態で）注入され得る２０４。その後、光送達装置が外科的に移植され得る２０６。この光送達装置は、標的への照明をもたらすように設計され得る（例えば、指向性光学素子を使用して）。その後、標的領域が照明される２０８。標的領域は、例えば、ＢＬＡ−ＣｅＡであり得る。その後、その効果がモニターおよび／または評価され得る２１０。これは、治療または薬品スクリーニングに関連して使用されることも可能である。

本開示の様々な実施形態は不安感の新しい治療法をスクリーニングするための特定されたモデルの使用に関連する。例えば、本明細書において考察される方法を用いて不安感を人工的に誘発または抑制することができ、その後、薬理学的治療法、電気的治療法、磁気的治療法、外科的治療法または光遺伝学的治療法を適用し、評価する。本開示の他の実施形態において、特定された回路のインビトロ近似法またはシミュレーションを開発するために、モデルを使用することができ、その後、それらは装置、試薬、ツール、技術、方法およびアプローチのスクリーニングに、および不安感と関連の障害の研究と厳密な調査に使用されることができる。この研究は、必ずしも限定されるものではないが、表現型、エンドフェノタイプおよび治療標的の特定を対象とすることができる。

本開示の実施形態は、不安感の無条件付け発現を二方向に調節するための内在性神経基質としてＢＬＡ−ＣｅＬ経路をモデル化することを対象とする。ある実施形態は、不安感の発現または不安感関連行動におけるそれらの役割のため、ＢＮＳＴへのＣｅＡ投射などの他の下流回路を対象とする。例えば、ＢＮＳＴのコルチコトロピン放出ホルモン（ＣＲＨ）ネットワークは、ＣｅＬがＢＮＳＴへのＣＲＨの主要な放出源であるため、不安感関連行動の調節に決定的に関与し得ると考えられている。セロトニン、ドーパミン、アセチルコリン、グリシン、ＧＡＢＡおよびＣＲＨを含む、他の神経伝達物質および神経調節物質が、分散型神経回路への効果を調節またはゲート開閉することができる。さらに他の実施形態は、ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの並列回路または下流回路が不安感表現型の調節または発現に寄与すると考えられているので、この経路に合流し、そして、この経路から分出する神経回路網を対象とする。さらに、扁桃体の上流では、ＢＬＡおよびＣｅＬへの強固な神経支配をもたらす前辺縁皮質、下辺縁皮質および島皮質を含む、恐怖と不安感を処理するのに重要な領域からのトップダウン皮質制御によってリクルートされるのに、この微小回路は良い位置につけている。

ＣｅＬおよびＣｅＭニューロンに投射するＢＬＡニューロンの集団は大部分が重複していないことがＢＬＡ解剖学的構造に基づく実験結果から示唆される。自然状態では、ＣｅＬ投射ＢＬＡニューロンは微小回路ホメオスタシス機構においてＣｅＭ投射ＢＬＡニューロンを興奮させることができ、それで、回路のバランスを歪めて無抑制のＣｅＭ活性化を可能にするシナプスの変化が存在するとき、潜在的な不安障害を研究するためにその回路を使用することができる。

本明細書において考察される実施形態と特定の応用（実施例を含む）は、上記の態様、実施形態および実施との、ならびに図面に示され、以下に説明されるものとの関連で実施され得る。下記の実施例を参照することができ、それは参照により完全に本明細書に組み込まれる。方法論、装置および物質を含む、光反応性分子および／またはオプシンに関するより詳細について、以下の背景的刊行物を参照することもできる：Zhangらの“System for Optical Stimulation of Target Cells” という表題の米国特許出願公開第２０１０／０１９０２２９号；Zhangらのやはり“System for Optical Stimulation of Target Cells”という表題の米国特許出願公開第２０１０／０１４５４１８号；Boydenらの“System for Optical Stimulation of Target Cells” という表題の米国特許出願公開第２００７／０２６１１２７号；および“Light Sensitive Ion Passing Molecules”という表題の国際出願公開第ＷＯ２０１１／１１６２３８号。これらの出願は特許書類の一部を形作り、参照により完全に本明細書に組み込まれる。これらの刊行物と一致するが、標的細胞の光学的刺激と制御をもたらすために、多数のオプシンを哺乳類細胞においてインビボおよびインビトロで使用することができる。例えば、ニューロンなどの電気的に興奮させることができる細胞にＣｈＲ２が導入されると、ＣｈＲ２チャネルロドプシンの光活性化によりその細胞の興奮および／または発火がもたらされ得る。ニューロンなどの電気的に興奮させることができる細胞にＮｐＨＲが導入される場合では、ＮｐＨＲオプシンの光活性化によりその細胞の発火の抑制がもたらされ得る。先に参照した特許出願の開示のこれらの態様および他の態様は本開示の様々な態様の実施に有用であり得る。

本開示は様々な修飾および変更形態を受け入れることができるが、その詳細は図面における例により示されており、そして、さらに詳細が説明される。説明される特定の実施形態および／または応用に本開示を限定することを意図するものではないことが理解されるものとする。逆に、本開示の精神と範囲の内にある全ての修飾、同等物および代替物を包含することが意図される。

序論
不安感は、目下の脅威が無い状況で、高まった心配が持続する状態であり、病的な状態では、非常に心身を衰弱させるものとなる^１。不安障害は、精神病のうちで最も一般的なものを代表し（２８％の生涯有病率を有する）^２、そして、大うつ病と物質乱用の原因論と関係づけられている^３〜５。感情の処理に重要な脳の領域である扁桃体^９〜１７が不安感に役割を担うと長らく仮定されてきたが^{１８〜２３}、不安感を制御、仲介する神経メカニズムは未だ特定されていない。本明細書で、我々は、不安感関連行動の根底にある神経回路を特定するために、細胞種特異的光遺伝学的ツールを二光子顕微鏡法、電気生理学および自由に動くマウスでの不安感測定法と組み合わせる。細胞種だけではなく細胞間の特定の結合を制御するために光遺伝学のユニークな能力^{２４〜２６}を利用して、我々は、ＣｈＲ２によるＢＬＡのウイルス性形質導入とそれに続く下流ＣｅＡでの限定的な照明により分析されて、扁桃体中心核（ＣｅＡ）中の基底外側扁桃体（ＢＬＡ）末端の時間的に正確な光遺伝学的刺激が甚大で即時の、そして、可逆的な抗不安効果を及ぼすことを観察した。逆に、ｅＮｐＨＲ３．０^２５を用いる同じ限定された投射の選択的光遺伝学的抑制が不安感関連行動を強力に、迅速に、そして、可逆的に増加させた。重要なことに、これらの効果はＢＬＡ細胞体そのものの直接的光遺伝学的制御では観察されなかった。まとめると、これらの結果は、回路の要素としての特定のＢＬＡ−ＣｅＡ投射が哺乳類の脳における内在性の不安感制御に必要であると共に充分であることを意味し、そして、細胞種よりもむしろ特定の投射を光遺伝学的に標的とすることの精神疾患に関連の神経回路機能の研究における重要性を示す。

不安障害は高い有病率を持ち、そして、深刻^１であるにも関わらず、対応する神経回路基質の理解は不十分であり、安全で効果的な治療の開発を妨げている。利用可能な治療法は効果が一貫しない傾向にあり、または、ベンゾジアゼピン類の場合、常習性になり、認知障害と死を引き起こすこともありうる鎮静状態と呼吸抑制を含む、顕著な副作用に直結する傾向がある^{２７、２８}。哺乳類の脳における不安感の制御機構のより深い理解^{２９、３０}が、副作用がより少ない、より効果的な治療法を開発するために必要である。特に関心があり、そして、新しいのは、不安緩解の生来の経路をリクルートする可能性である。

扁桃体は神経刺激と正のアウトカムまたは負のアウトカムの間の関係を処理することに決定的に関与し、無条件付け情緒状態の処理に関係があるとされてもいる。扁桃体微小回路は恐怖条件付けとの関連で機能的に分析されているが、扁桃体の関与が無条件付け不安感を含む多数の他の機能および情緒状態と関係があるとされている。扁桃体は、複雑な相互接続性を有する機能的および形態的に異質の亜核から構成される。扁桃体の主要な細区画は基底外側扁桃体複合体（ＢＬＡ）であり、それは外側（ＬＡ）、基底外側（ＢＬ）および基底内側（ＢＭ）扁桃体核（ＢＬＡニューロンの約９０％がグルタミン酸作動性である）を包含する^{３３、３４}。対照的に、扁桃体中心核（ＣｅＡ）は、外側中心（ＣｅＬ）核および正中中心（ＣｅＭ）核から構成されるが、主として（約９５％）ＧＡＢＡ作動性中型有刺ニューロンからなる^３５。ＢＬＡは、ＣｅＡの局所性インターニューロンおよび中型有刺ニューロンの両方と機能的に異なるＧＡＢＡ作動性介在細胞（ＩＴＣ）の密集した束の中に覆われている^{３６、３７}。扁桃体の主要な出力核はＣｅＭであり^{３２、３５、３８〜４０}、化学的または電気的に興奮させられると、それは、恐怖や不安感に関係した自律的で行動に関する反応を脳幹への投射により仲介すると考えられている^{６、１２、３２、３５}。ＣｅＭは、環境情報と認知情報が集中する主要な扁桃体の部位（ＬＡ）によって直接制御されてはいないが^{１２、３８、４１}、ＬＡとＢＬＡのニューロンがＧＡＢＡ作動性ＣｅＬニューロンを興奮させ^４２、それがＣｅＭ「出力」ニューロンへのフィードフォワード抑制^{４０、４６}をもたらし、そして、扁桃体の出力を低減させることが可能である。ＢＬＡ−ＣｅＬ−ＣｅＭは、恐怖の鎮静化ではなく条件付け抑制、すなわち、緊張とショックの明確な対不形成が原因の、ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの増強が原因の恐怖の発現の抑制に関与すると示唆されている、あまり特徴が明らかではない経路である^４７。恐怖は外的手がかりにより引き起こされる一過性の状態であると特徴づけられおり、一方、不安感は外的なきっかけが無い状態で起こり得る持続的状態であるが、我々は、恐怖の条件付け抑制を調節する回路がまた不安感の条件付け抑制の調節にも関与するだろうかと思った。

材料と方法
対象：実験法開始エポックで４〜６週齢のオスＣ５７ＢＬ／６マウスを反転型１２時間明暗サイクル、自由飲食条件で飼育した。図３、４および５に示される動物（ＣｈＲ２末端グループ、ＥＹＦＰ末端グループおよびＣｈＲ２細胞体グループのマウス）は、不安感のベースラインレベルを上昇させるために典型的な高トラフィックマウス飼育施設に全て１匹ずつ飼育された。マウスはそれぞれ１つの処理グループに属した。図６に示される動物（両側性ＥＹＦＰグループおよびｅＮｐＨＲ３．０グループ）は、不安感のベースラインレベルを低下させるために特別な低トラフィックマウス飼育施設に集団で飼育された。我々の動物の動物管理と実験操作の全ての態様は米国国立衛生研究所のガイドラインに準拠しており、そして、スタンフォード機関内動物実験委員会のメンバーにより認可されたものである。

光強度の測定：手早く殺処理したマウスに由来する脳組織のブロックを用いて光透過測定を行った。その後、その組織をパワーメーター（Ｔｈｏｒ Ｌａｂｓ、ニュートン、ニュージャージー州）の光検出器の上に置き、その組織を通過したレーザーの光強度を測定した。直径３００μｍの光ファイバーの先端が４７３ｎｍブルーレーザー（ＯＥＭ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、イーストランシング、ミシガン州）に連結された。斜面の反対側への光透過の特徴を調べるために、斜めに切ったカニューレとパワーメーターの光検出器を並置した。光円錐を視覚化するために、我々は、キュベット中に入れた約５ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネート−デキストラン（ＦＤ１５０ｓ；Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を用い、斜めに切ったカニューレのシールド付きの光ファイバーか斜めに切ったカニューレが無い光ファイバーをフルオレセイン溶液に対して垂直に向けた。光ファイバーから光を円錐状に出力することによる強度のわずかな減少と組織での光散乱による光の減少の両方を考慮して、特定の深度でのパワー密度を計算した (Aravanis et al., J Neural Eng, 4:S143-156, 2007) (Gradinaru et al., J Neurosci, 27:14231-14238, 2007)。出力光の角発散を決めるマルチモード光ファイバーの発散半角θ_ｄｉｖは、
であり、ｎ_ｔｉｓは灰白質の屈折率 (１．３６、Vo-Dinh T 2003, Biomedical Photonics Handbook (Boca Raton, FL: CRC Press)) であり、ＮＡ_ｆｉｂ（０．３７）は光ファイバーの開口数である。ファイバーの末端からの距離（ｚ）での光を円錐状に出力することによる強度のわずかな減少は、ｒが光ファイバーの半径（１００μｍ）である三角法
を用いて計算された。

光散乱が原因の減少後の光のわずかな伝達が、経験的な測定値とクベルカ・ムンクのモデルを用いて双曲線関数としてモデル化された^１、２。そして、ファイバーの先端でのパワー密度と円錐状の光の出力および光の散乱が原因のわずかな変化を組み合わせたものにより、ファイバーの下の特定の深度でのパワー密度の数値がもたらされる。

ウイルスの構築とパッケージング：ＡＡＶ_５コートタンパク質を用いて組換えＡＡＶベクターの血清型を調べ、そして、ノースカロライナ大学のウイルスベクターコアにより組換えＡＡＶベクターがパッケージされた。ウイルスのタイターはＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ｈＣｈＲ２（Ｈ１３４Ｒ）−ＥＹＦＰ、ＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰおよびＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰについてそれぞれ２ｘ１０^１２粒子／ｍＬ、３ｘ１０^１２粒子／ｍＬ、４ｘ１０^１２粒子／ｍＬであった。ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＡＡＶ骨格にＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰをクローニングすることによりｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰプラスミドを構築した。同様に、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位を用いてＡＡＶ骨格にＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰをクローニングすることによりｐＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＥＹＦＰプラスミドを構築した。マップはオンラインによりwww.optogenetics.orgで入手可能であり、それらは参照により本明細書に組み込まれる。

定位的注射および 光ファイバーの設置：全ての外科手術は定位ガイダンス下、麻酔条件下で行われた。１．５〜３．０％イソフルランを用いてマウスを麻酔した。座標は全てｍｍ^３単位でブレグマに相対的である。全ての実験、インビボとインビトロの両方で、ウイルスはＢＬＡにのみ送達され、そして、ＣｅＡでのどのようなウイルスの発現も全ての実験からの排除ということになった。ＣｅＡに照明を限定するためにガイドカニューレが４５〜５５°の角度になるように斜めに切られた。斜めに切ったガイドカニューレの短い側が前内側に配置され、斜めに切ったカニューレの長い側が光円錐の後外側部分を隠し、ウイルスの注射針と向きが逆であった。ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスを優先的に標的とするために、我々はオプシン遺伝子の発現をＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定し、そして、光送達をＣｅＡに限定した。ＣａＭＫＩＩαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクターを用いてＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成された。ＢＬＡ内で、ＣａＭＫＩＩαは局所性インターニューロンではなくグルタミン酸作動性錐体ニューロンで発現するのみである^４。ＣｈＲ２末端グループおよびＥＹＦＰ末端グループのマウスは光ファイバー用の斜めに切ったカニューレの片側の埋め込みを受けたが（半球についてカウンターバランスがとられた）、ｅＮｐＨＲ３．０グループまたはそれぞれのＥＹＦＰグループのマウスはＣｅＡへの斜めに切ったカニューレの両側の埋め込みを受けた（前後方向（ＡＰ）に−１．０６ｍｍ；内外方向（ＭＬ）に±２．２５ｍｍ；および背腹方向（ＤＶ）に−４．４ｍｍ；Ｐｌａｓｔｉｃｓ Ｏｎｅ、ロアノーク、バージニア州）^３。ＣｈＲ２細胞体グループのマウスはＢＬＡの（−１．６ｍｍ ＡＰ；±３．１ｍｍ ＭＬ；−４．５ｍｍ ＤＶ）の位置に長期にわたって埋め込み可能なＤｏｒｉｃパッチコードファイバー（ＮＡ＝０．２２；Ｄｏｒｉｃｌｅｎｓｅｓ、ケベック、カナダ）の片側埋め込みを受けた^３。全てのマウスについて、ウイルスの注入をＢＬＡに限定するために後外側に面した斜めに切った３３ゲージまたは３５ゲージの金属製ニードルを用いて、０．５μｌの精製したＡＡＶ_５をＢＬＡの片側または両側性に注射した（±３．１ｍｍ ＡＰ、１．６ｍｍ ＭＬ、−４．９ｍｍ ＤＶ）^３。マイクロシリンジポンプ（ＵＭＰ３；ＷＰＩ、サラソタ、フロリダ州）とその制御器（Ｍｉｃｒｏ４；ＷＰＩ、サラソタ、フロリダ州）を用いて濃縮されたＡＡＶ溶液を送達するために、１０μｌ用Ｈａｍｉｌｔｏｎマイクロシリンジ（ｎａｎｏｆｉｌ；ＷＰＩ、サラソタ、フロリダ州）を用いた。そして、１分あたり０．１μｌの流速で各部位に０．５μｌのウイルス溶液を注入した。注入が完了した後にニードルを０．１ｍｍ持ち上げ、そして、さらに１０分間とどめ、その後、ゆっくりと引き抜いた。ファイバーガイドシステムを頭蓋骨に固定するために一層の粘着セメント（Ｃ＆Ｂメタボンド；Ｐａｒｋｅｌｌ、エッジウッド、ニューヨーク州）と次に頭蓋可塑性セメント（デンタルセメント；Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ、ウッドデール、イリノイ州）を用いた。２０分後に組織接着剤（Ｖｅｔｂｏｎｄ；Ｆｉｓｈｅｒ、ピッツバーグ、ペンシルバニア州）を用いて切り口を閉じた。麻酔から回復するまで動物を保温パッド上に保った。ダミーのキャップ（ラット：Ｃ３１２Ｇ、マウス：Ｃ３１３Ｇ）を挿入してガイドカニューレの開存性を保った。ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間後に行動試験および電気生理学的実験を行った。

インビボレコーディング：以前に記述されたように (Gradinaru et al., J Neurosci, 27:14231-14238, 2007)、以前に（４〜６週間前に）ＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩａ−ＣｈＲ２−ｅＹＦＰウイルスコンストラクトでＢＬＡに形質導入された成獣のオスマウスについての中央扁桃体（ＣｅＡ）の光刺激と基底外側扁桃体（ＢＬＡ）の電気的レコーディングが同時に行われた。動物は開頭のまえにイソフルランで深く麻酔され、足指をつまんでも反応しなかった。マウスを定位的に配置し扁桃体に対して背側の頭蓋骨をおよそ３ｍｍ^２外科的に除去した後に。マウスが４〜６週齢のとき外科手術を受け、マウスが８〜１０週齢のとき実験が行われるので、頭蓋骨と脳の成長を考慮して座標が調節され（−１．５ｍｍ ＡＰ、±２．７５ｍｍ ＭＬに中心をとった）^３、１ＭΩで０．００５インチの細胞外タングステン電極（Ａ−Ｍ ｓｙｓｔｅｍｓ）を開頭した脳のＢＬＡの上の領域に定位的に挿入した（−１．６５ｍｍ ＡＰ、±３．３５ｍｍ ＭＬ、−４．９ｍｍ ＤＶ）^３。これとは別に、０．２Ｎ．Ａ．でコア部の直径が２００μｍのファイバー光ケーブル（Ｔｈｏｒ Ｌａｂｓ）がＣｅＡの背側の脳に定位的に挿入された（−１．１ｍｍ ＡＰ、±２．２５ｍｍ ＭＬ、−４．２ｍｍ ＤＶ）^３。光誘起反応の取得の後に、２秒の長さの刺激エポック（２０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅）の間に光の強度を変えるため、電圧ランプを用いた。光誘起シグナルの取得の後に、ファイバーの正確な位置が記録され、脳からファイバーが取り除かれ、ファイバーが自作の斜めに切ったカニューレに挿入され、同じ位置に再挿入され、そして、同じプロトコルが繰り返された。ほとんどの試験で、その後、ファイバー／カニューレが脳から抜き取られ、カニューレが外され、そして、そのままのファイバーが再挿入されて誘起されたシグナルを発信するニューロンの集団のフィデリティを確保した。記録されたシグナルが３００Ｈｚと２０ｋＨｚの間のバンドパスフィルターにかけられ、１０００倍か１００００倍のどちらかのＡＣ増幅にかけられ（Ａ−Ｍ Ｓｙｓｔｅｍｓ １８００）、そして、デジタル化され（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｄｉｇｉｄａｔａ １３２２Ａ）、その後にＣｌａｍｐｅｘソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）を用いて記録された。Ｃｌａｍｐｅｘソフトウェアはフィールドシグナルの記録とオプトロードに連結した４７３ｎｍの（ＯＥＭ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ）ソリッドステートレーザーダイオード源の制御の両方に使用された。ファイバーの先端からの光パワーを１ｍＷ未満（約１４ｍＷ／ｍｍ^２）と２８ｍＷ（約３９６ｍＷ／ｍｍ^２）の間で量を決め、そして、標準的光パワーメーター（Ｔｈｏｒ Ｌａｂｓ）を使用して光パワーを測定した。イソフルラン麻酔を１％の定常レベルにまで下げた後にＢＬＡに対しておよそ１ｍｍ背側で電気生理学的レコーディングを開始した。約０．１ｍｍずつ腹側にオプトロードを下げて光誘起シグナルの位置を特定した。

行動試験法：行動試験について使用された全ての動物はＢＬＡニューロンのウイルス性形質導入と片側性（ＣｈＲ２グループと対照について）または両側性（ｅＮｐＨＲ３．０グループと対照について）の光送達を可能にする埋め込みを受けた。行動試験について、光をＣｅＡに限定するために、斜めに切ったカニューレの長片よりも短いが斜めに切ったカニューレの短辺よりも長い最適な長さにマルチモード光ファイバーｓ（ＢＦＬ３７−３００、開口数：０．３７、コア部の直径：３００μｍ；ＴｈｏｒＬａｂｓ、ニュートン、ニュージャージー州）を正確に切断した。光刺激のために、ＦＣ／ＰＣアダプターを介してファイバーを４７３ｎｍまたは５９４ｎｍのレーザーダイオード（ＯＥＭ Ｌａｓｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ、イーストランシング、ミシガン州）に連結した。４７３ｎｍの光実験について２０Ｈｚ、５ミリ秒のパルス幅の光トレイン、そして、５９４ｎｍの光実験について連続光を送達するために、Ｍａｓｔｅｒ−８パルス刺激機（Ａ．Ｍ．Ｐ．Ｉ．、エルサレム、イスラエル）を用いてレーザー出力を制御した。実験に含まれるすべての動物はＢＬＡに位置するウイルス注射中心を有したが、時には隣接する領域または穿刺経路に沿って漏れがあった。ＣｅＡ中でウイルスのどんな発現でも検出できたどんな場合でも、その動物は排除された。統計的に有意な光の効果すべてが考察され、考察されなかった比較は検出可能な差異を示さなかったものである。

高架式十字迷路法はプラスチック製であり、そして、プラス型に中央部のプラットフォーム（５×５×５ｃｍ）から９０度の角度で伸びる２本の明灰色のアーム（３０×５ｃｍ）と２本の黒色の壁があるアーム（３０×５×３０ｃｍ）から構成された。迷路は床から３０ｃｍ上に設置された。個体ごとにマウスが中央部に置かれた。セッションの開始前、操作からの回復に１〜５分が見込まれた。マウスの位置、速度および頭、身体および尾の動きの観察記録をとるために、ビデオトラッキングソフトウェア（ＢｉＯｂｓｅｒｖｅ、フォート・リー、ニュージャージー州）を使用した。表示される測定値は全てマウスの身体に相対的であった。グループごとに光刺激プロトコルが明記される。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡマウスと対応する対照グループ（ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡおよびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体）は不安感測定の前、少なくとも１週間、高ストレス環境に１匹ずつ飼育された：４７３ｎｍの光パルストレイン（２０Ｈｚで５ミリ秒のパルス）の７〜８ｍＷ（ファイバーの先端で約１０６ｍＷ／ｍｍ^２、ＣｅＬで約６．３ｍＷ／ｍｍ^２およびＣｅＭで約２．４ｍＷ／ｍｍ^２）でのＣｅＡ中のＢＬＡ末端の片側照明。ＣｈＲ２細胞体グループについて、７〜８ｍＷの照明は発作活性を誘発するので、ＢＬＡニューロンはより低い光パワーで直接照明され、ＢＬＡニューロンが４７３ｎｍの光パルストレイン（２０Ｈｚで５ミリ秒のパルス）の３〜５ｍＷ（約５７ｍＷ／ｍｍ^２）での片側性照明を受けた。ｅＮｐＨＲ３．０と対応するＥＹＦＰグループについて、全てのマウスが集団で飼育され、そして、両側性ウイルス注射、および５分のライト・オンエポックを通じて５９４ｎｍの連続光の照明の４〜６ｍＷ（ファイバーの先端で約７１ｍＷ／ｍｍ^２、ＣｅＬで約４．７ｍＷ／ｍｍ^２およびＣｅＭで約１．９ｍＷ／ｍｍ^２）でのＣｅＡ中のＢＬＡ末端の両側性照明を受けた。１５分のセッションが３回の５分のエポックに分けられ、第１エポックでは光刺激が無く（オフ）、第２エポックでは先に明記されたように光が送達され（オン）、そして、第３エポックでは光刺激が無かった（オフ）。

オープンフィールドチャンバー（５０×５０ｃｍ）とオープンフィールドが中央フィールド（中央部、２３×２３ｃｍ）および外側のフィールド（辺縁部）に分けられた。個々のマウスがフィールドの辺縁部に置かれ、そして、ビデオカメラによりその動物のパスが記録された。同じビデオトラッキングソフトウェアであるＶｉｅｗｅｒ^２（ＢｉＯｂｓｅｒｖｅ、フォート・リー、ニュージャージー州）を用いることにより総歩行距離が分析された。高架式十字迷路試験の直後にオープンフィールド評価試験が行われた。オープンフィールドテストは３分のエポックが６回ある１８分のセッションからなる。エポックはライト・オフエポックで始まり、無光時間と光刺激時間の間で交互に反復した。「オフ」条件および「オン」条件とのみ示される全ての分析およびチャートについて、３回の「オフ」エポックがまとめられ、そして、３回の「オン」エポックがまとめられた。

グルタミン酸受容体アンタゴニスト操作について、２２．０ｍＭのＮＢＱＸと３８．０ｍＭのＤ−ＡＰＶ（Ｔｏｃｒｉｓ、エリスビル、ミズーリ州）からなるグルタミン酸アンタゴニスト溶液は生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）に溶けたものである。不安感測定の５〜１５分前に、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎ注射筒（ｎａｎｏｆｉｌ；ＷＰＩ、サラソタ、フロリダ州）に連結された、光ファイバーを介した光送達に用いられるのと同じガイドカニューレに挿入された内部点滴用ニードルにより０．３μｌのグルタミン酸アンタゴニスト溶液がＣｅＡに点滴された。シリンジポンプ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ、マサチューセッツ州）により流速（０．１μｌ／分）が制御された。ウイルス注射、ガイドカニューレおよび長期にわたり埋め込まれたファイバーの配置は図７および１０に示されるように組織学的に確認された。

二光子光遺伝学的回路マッピングおよび生体外電気生理的レコーディング：マウスは４週齢の時にＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。ＢＬＡとＣｅＡの間の機能的接続性を調べるためにＢＬＡおよびＣｅＡを含む冠状薄片が調製された。（ｍＭ単位で）１２６ ＮａＣｌ、２６ ＮａＨＣＯ_３、２．５ ＫＣｌ、１．２５ ＮａＨ_２ＰＯ_４、１ ＭｇＣｌ_２、２ＣａＣｌ_２および１０ グルコースを含む人工脳脊髄液（ａＣＳＦ）の連続灌流下で二光子画像が撮られ、そして、電気生理的レコーディングがなされた。レコーディングは全て３２℃でなされた。パッチ電極（４〜６ＭΩ）が（ｍＭ単位で）：１０ ＨＥＰＥＳ、４ Ｍｇ−ＡＴＰ、０．５ ＭｇＣｌ_２、０．４ Ｎａ_３−ＧＴＰ、１０ ＮａＣｌ、１４０ グルコン酸カリウムおよび８０ Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５９４ヒドラジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、ユージーン、オレゴン州）で満たされた。二光子イメージング、全細胞レコーディングと光遺伝学的刺激が同時に行われ得るが、ＢＬＡ、ＣｅＬおよびＣｅＭニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われ、およそ３０分間、細胞が満つるに任された後に改変型二光子顕微鏡（Ｐｒａｉｒｉｅ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅｓ、マジソン、ウィスコンシン州）で画像が取得された。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。別途、言及されない限り、約７ｍＷ／ｍｍ^２で４７３ｎｍのＬＥＤ（Ｔｈｏｒｌａｂｓ、ニュートン、ニュージャージー州）を使用して青色光のパルスが引き出された。コヒーレント・チタンサファイアレーザーを用いてＣｈＲ２−ＹＦＰ（９４０ｎｍ）とＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５９４（８００ｎｍ）の両方を画像化した。両分子の放射光を分けるためにフィルター６３０／６９とフィルター５４２／２７（Ｓｅｍｒｏｃｋ、ロチェスター、ニューヨーク州）と共にＦＦ５６０ダイクロイックもまた使用した。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）を使用して全ての画像を撮影した。ＣｅＬへ投射する線維をＢＬＡから単離し、そして、ＣｅＭ内での反応を調べるために、先に説明したように、ＢＬＡが証明を受けない様にして薄片を調製した。対物レンズからＣｅＬにねらいを定めて照明してＣｅＭ中で全細胞レコーディングを行った。ＢＬＡからＣｅＬへの末端の活性化が選択的であることをさらに確実にするために、ＣｅＬの中心の周り、直径約１２５μｍに照明が限定された。ここで、シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を４７０／３フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いて青色光のパルスを誘発した。機能マッピングについて、我々はまずＣｈＲ２を発現するＢＬＡニューロンから記録をとり、同時に電気生理的レコーディングをとり、そして、二光子イメージングを可能にするために細胞をＡｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ５９４ヒドラジドダイで満たした。ダイを満たしたＢＬＡニューロンの軸索に沿った複数の位置で二光子Ｚスタックを収集した。次に、我々はＣｅＬ核に投射するＢＬＡニューロンの軸索に注目し、そして、ＢＬＡ末端フィールド中のＣｅＬニューロンからの記録をとった。次に、我々は同時にＣｅＬニューロンからの記録をとり、ダイで細胞を満たし、そして、二光子ライブイメージングを行った後にＣｅＭへのＣｅＬニューロン性軸索に関心を移した。そして、我々はＣｅＭニューロンでこの手順を繰り返したが、ＣｅＬ中の末端フィールドへと光を戻し、インビボで行われたのと同じ刺激パラメータでのＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの優先的な照明を模倣した。ＥＰＳＣを分離するために−７０ｍＶ、ＩＰＳＣを分離するために０ｍＶの両方で電位固定レコーディングを行った。それぞれ、ＥＰＳＣはグルタミン酸受容体アンタゴニストであるＮＢＱＸ（２２μＭ）とＡＰ５（３８μＭ）のバス適用（ｎ＝５）を介してＥＰＳＣであると確認され、ＩＰＳＣはＩＰＳＣを消失させるビククリンのバス適用（１０μＭ；ｎ＝２）を介してＩＰＳＣであると確認された。細胞が約−７０ｍＶで静止しているとき、我々はまた電流固定レコーディングを行った。

ＢＬＡ軸索末端での光遺伝学駆動性の逆方向性刺激の特性解析について、４週齢で動物がＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。我々はａＣＳＦに０．１ｍＭピクロトキシン、１０μＭ ＣＮＱＸおよび２５μＭ ＡＰ５（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、ミズーリ州）を添加した。全細胞パッチクランプレコーディングがＢＬＡニューロンで行われ、そして、およそ３０分間、いっぱいになるにまかされた後に二光子イメージングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）を使用して全ての画像を撮影した。シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を４７０／３０フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いて青色光のパルスを誘発した。ダイを満たしたＢＬＡニューロンの軸索に沿った複数の位置で二光子Ｚスタックを収集した。ＣｅＬ核を向いた約３００μｍを超える直径にわたってその軸索が可視化可能であったニューロンのみが実験に含まれ、そして、あらゆる方向に向かう突起を持つニューロンはまた排除された。約１２５μｍの直径の青色光点に対して薄片を移動させることにより軸索上／外での刺激がなされた。正確な発現に薄片を較正するために、ＣｅＬ細胞上で全細胞パッチクランプが行われ、そして、ＢＬＡ末端からＣｅＬニューロンへのシナプス性放出が信頼できるものであることを確実にするために、約１２５μｍの直径の点青色パルスが用いられた。

ＣｅＭへの直接投射および間接投射の分解のため、４週齢で動物がＡＡＶ_５−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）により光が送達された。ＣｅＭ核での全細胞パッチクランプの前にＣｅＬ核の位置が、そこを再訪するために、記録され、光点がこの領域に限定された。ＣｅＭニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を４７０／３０フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いて青色光のパルスを誘発した。ＣｅＭレコーディング中にＣｅＡ中のＢＬＡ末端の、そして、２０Ｈｚで２秒間の５ミリ秒の光トレインでの広範囲の照明（約４２５−４５０μｍの直径）が適用された。ＥＰＳＣとＩＰＳＣを分離するために、それぞれ、７０ｍＶと０ｍＶで電位固定レコーディングが行われた。電流固定レコーディングもまた行われた。次に、直径が約１２５μｍである限定された光点を用いて照明をＣｅＬへと移動させた。我々はもう一度、−７０ｍＶと０ｍＶで電位固定レコーディングを行い、そして、２０Ｈｚで２秒間の５ミリ秒の光トレインを用いた。電流固定で行うＣｅＭニューロンスパイキング抑制実験について、我々は、スパイキングの誘発に必要な最小電流ステップ（約６０ｐＡ）を適用し、そして同時にＣｅＬ中のＣｈＲ２発現ＢＬＡ末端の２０Ｈｚで２秒間の５ミリ秒の光トレイン（細胞あたり平均６スイープ超）での優先的照明を適用した。ＣｅＭの中央に位置するＢＬＡ末端フィールドの広範囲の照明をＢＬＡ−ＣｅＬ末端の選択的照明と比較する実験について、同じＣｅＭ細胞（ｎ＝７）でこれらの条件が繰返し交互に行われた。

末端抑制が細胞体のスパイキングを変化させないことを確認するために、４週齢で動物がＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。全細胞パッチクランプレコーディングがＢＬＡニューロンで行われ、そして、およそ３０分間、いっぱいになるにまかされた。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）により光が送達された。ＢＬＡニューロンについて全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を５８９／２４フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いて黄色光のパルスを誘発した。パッチング後、非限定的な光点（約４２５〜４５０μｍの直径）をＢＬＡ細胞体上に配置し、そして、１秒のパルスを適用した。記録された電流が６００ｐＡの過分極電流よりも低く、軸索がＣｅＬ核に向かって約３００μｍを超えて伸びていなかったとき、細胞が排除された。その後、約１２５μｍの直径に光点が限定された。軸索上および軸索外電位固定レコーディングを１秒の光パルスを用いて取った。電流固定レコーディングについて、パッチピペットを介して細胞体に２５０ｐＡの電流を適用することにより活動電位を発生させた。

ｅＮｐＨＲ３．０発現ＢＬＡ末端の選択的照明が自発的シナプス小胞放出の確率を低減させることを示すために、４週齢で動物がＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。外側中心ニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）により光が送達された。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を５８９／２４フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いて黄色光のパルスを誘発した。約１２５μｍの直径に光点が限定された。カルバコールを２０μＭの濃度でバスに添加した。ＣｅＬニューロンでｓＥＰＳＣ活性が上昇した後に５秒から３０秒の時間範囲で光パルスが適用された。

ｅＮｐＨＲ３．０発現ＢＬＡ末端の選択的照明が電気的刺激によるシナプス小胞放出の確率を低減させ得ることを示すために、４週齢で動物がＡＡＶ５−ＣａＭＫＩＩα−ｅＮｐＨＲ３．０−ＥＹＦＰで注射され、ウイルスの発現を考慮に入れて、４〜６週間で急速薄片調製のために殺処理された。薄片の調製は上記と同様であった。二極性同心刺激プローブ（ＦＨＣ、ボードイン、メイン州）をＢＬＡに設置した。ＣｅＬニューロンで全細胞パッチクランプレコーディングが行われた。４０Ｘ／．８ＮＡ ＬＵＭＰｌａｎ ＦＬ／ＩＲ対物レンズ（Ｏｌｙｍｐｕｓ、センター・バレー、ペンシルバニア州）により光が送達された。ピペットの直列抵抗は通常１０〜２０ＭΩであった。シャッター（Ｕｎｉｂｌｉｔｚ、ロチェスター、ニューヨーク州）に連結されたＸＣｉｔｅハロゲン光源（ＥＸＰＯ、ミシサガ、オンタリオ州）を５８９／２４フィルターと共に６．５ｍＷ／ｍｍ^２で用いてコハク色光のパルスを誘発した。約１２５μｍの直径に光点が限定された。４０秒間、電気パルスが送達され、そして、光の送達は１０秒で開始され、そして、中ごろの３０秒で終了した。

解剖学的追跡実験について、追跡した軸索が切断されていると観察されたとき、そのニューロンが排除される。そして、解剖的測定に含まれる全てのＢＬＡニューロン（図５ａ〜ｉ）が電流ステップでＢＬＡ錐体ニューロンに典型的なスパイキング^１８を示した。

薄片の免疫組織化学：インビボ光刺激の終了後１００〜１１０分後に氷冷したＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラフォルムアルデヒド（ＰＦＡ）を用い、麻酔したマウスを経心的に灌流した。脳を４％ＰＦＡ中に一晩固定し、その後、ＰＢＳ中の３０％ショ糖で平衡化した。凍結ミクロトームで４０μｍ厚の冠状切片を切り出し、そして、凍結保護剤中に４℃で免疫組織化学に進むまで保存した。ＰＢＳで自由浮遊切片を洗浄し、その後、０．３％Ｔｘ１００および３％正常ロバ血清（ＮＤＳ）中で３０分間保温した。一次抗体とのインキュベーションを３％ＮＤＳ／ＰＢＳ（ウサギ抗ｃ‐ｆｏｓ抗体（１：５００）、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ラホーヤ、カリフォルニア州；マウス抗ＣａＭＫＩＩ抗体（１：５００）、Ａｂｃａｍ、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）中で４℃一晩行った。その後、切片を洗浄し、そして、Ｃｙ３またはＣｙ５と複合体化した二次抗体（１：１０００）（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウエストグローブ、ペンシルバニア州）と室温で３時間インキュベートした。ＤＡＰＩ（１：５０，０００）との２０分間のインキュベーションの後、切片を洗浄し、ＰＶＤ−ＤＡＢＣＯを用いて顕微鏡用スライドグラスに切片を貼りつけた。

共焦点顕微鏡法および分析：２０Ｘ／０．７０ＮＡ対物レンズまたは４０Ｘ／１．２５ＮＡ油浸対物レンズを用いるＬｅｉｃａ ＴＣＳ ＳＰ５走査レーザー顕微鏡で共焦点蛍光画像を取得した。同等の環境を用い、複数の切片を通して１０μｍの深度にわたる連続スタック画像が取得された。バックグランドレベルより上のｃ‐ｆｏｓ免疫反応性に閾値をとり、そして、核の輪郭を描くためにＤＡＰＩ染色を用いることにより、Ｖｏｌｏｃｉｔｙ画像解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ／Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、ワルトハム、マサチューセッツ州）が視野あたりのｃ‐ｆｏｓ陽性細胞の数を計算した。実験条件に盲目的に全てのイメージングと分析が行われた。

統計学：行動試験と生体外電気生理学のデータについて、ノンパラメトリック・ブートストラップｔ検定（対合または適切な場合非対合）を用いて一対比較が検定されたが^５、線形対比を用いて２つよりも多くのグループの平均値が係わる仮説が検定された（それぞれ、Ｒ^６の「ブート」パッケージおよび「ｌｍｅ４」パッケージを用いる）。後者は線形混合効果モデル（「二元反復測定ＡＮＯＶＡ」）の係数間の対比として公式化され、固定効果は遺伝学的または薬理学的操作および光処理（オンまたはオフ）であった。全ての仮説の検定は演繹的に定められた。対象はランダム効果としてモデル化された。ｃ‐ｆｏｓの定量比較について、我々は、一元配置ＡＮＯＶＡと続いてテューキーの多重比較検定を使用した。

データのプロットは観察値の平均と観察値の分散の間の関係を明確に示す（すなわち、それらは不均一分散性である、例えば図３ｅおよび図５ｊを参照のこと）。標準平方根変換がこのこととよく相関していることを我々は見出した。さらに、ｅＮｐＨＲ３．０の高架式十字迷路法（ＥＰＭ）データは、時間の経過に伴う探索行動の減少を説明するために、時間経過に対する線形適合によるトレンド除去を必要とした。二元線形混合効果モデル（二元反復測定ＡＮＯＶＡとしても知られる）に標準的なことではあるが、我々はｉｊ番目の細胞でのｋ番目の観察値（ｙ_ｉｊｋ）（の平方根値）を
とモデル化し、式中、
μは全ての細胞での総平均であり（観察値の収集におけるｉｊ番目の「細胞」とはｉ番目の条件、ｊ番目の処理に対応する）
ｃ_ｉは（複数の）処理でのｉ番目の動物条件に起因する固定効果（例えば、遺伝学的操作）であり、
ｔ_ｊは（複数の）条件でのｊ番目の処理に起因する固定効果（例えば、ライト・オンまたはライト・オフ）であり、
（ｃ：ｔ）_ｉｊはｉｊ番目の細胞でのｉ番目の条件とｊ番目の処理の相互作用に起因する固定効果であり、
ｂ_ｊは（複数の）処理で用いられる動物に対応するランダム効果であり、そして、
ｅ_ｉｊｋは、平均値が０で分散がσ^２であり、全てのｊについてｂ_ｊに独立した、独立同分布（ｉ．ｉ．ｄ．）ランダム正規外乱である。

固定効果を二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）計画行列Ｘ∈Ｒ^ｎｘｐに集め、疎マトリックスＺ∈Ｒ^ｎｘｑ中のランダム効果をダミーコードし、そして、
とし、行列形式を
と表現することができ、y∈Ｒ^ｎ、ｂ∈Ｒ^ｑおよびｅ∈Ｒ^ｎはそれぞれ変数Y、Βおよびｅの観察値であり、我々のモデルは
と仮定し、式中、Ｎ（μ，Σ）は平均ベクトルがμであり分散共分散行列がΣであるときの多変量ガウス分布であり、そして、⊥は２つの変数が独立であることを示す。係数ベクトルβ∈Ｒ^ｐ、ｂ∈Ｒ^ｑ、および分散パラメータσおよび低密度（ブロック対角化）相対的分散共分散行列Σ∈Ｒ^ｑｘｑを推定するために、我々は、Ｄｏｕｇｌａｓ ＢａｔｅｓおよびＭａｒｔｉｎ Ｍａｅｃｈｌｅｒにより書かれたＲのｌｍｅ４パッケージを用い、それはまず、ランダム効果を「球面」にする座標の線形変化を見つけ出し、次に、ペナルティ付き反復加重最小二乗法を用いてβ、σおよびΣの最尤推定値を見つけ出し、計算速度を増すためにランダム効果行列の稀薄性を利用する。さらなる詳細については、http://www.r-project.org/のアドレスのｌｍｅ４リポジトリ中のパッケージに付随する文書を参照のこと。

最尤推定値を求めるために、等式２の中の計画行列Ｘは全列ランクでなくてはならない。これは（等式１におけるように）切片を有する全因子計画行列には当てはまらないことは周知であり、したがって、固定効果係数が推定可能であるためには、Ｘの列を定義するために線形結合（「比較」）を用いなくてはならない。我々の計画は釣り合いが取れている（ほぼ釣り合いが取れている）ので、我々は、主原文で報告されているように、ライト・オフ条件と比較したライト・オンに関連の係数、対照条件と比較した末端刺激などの間で直交（またはほぼ直交）ヘルマー対比を用いた。そのような対比により我々はまとめたデータを反復測度デザイン内で互いに対して比較することができ、改善されたパラメータ推定とテストパワーがもたらされ、一方、動物内の相関が説明される。

結果
ＢＬＡ細胞は、分界条床核（ＢＮＳＴ）、側坐核、海馬および皮質への投射を含む、脳全体に渡って乱雑な投射を有する^{３８、４３}。ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスが必然的に不安感に関与し得るかどうか試験するために、したがって、他のＢＬＡ投射を直接影響することなくＣｅＬ中のＢＬＡ末端を選択的に制御する方法を開発することが必要であった。ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスを優先的に標的とするために、我々はオプシン遺伝子の発現をＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンに限定し、そして、光送達をＣｅＡに限定した。ＣａＭＫＩＩαプロモーターの制御下にある光活性化光遺伝学的制御遺伝子を有するアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ５）ベクターを用いてＢＬＡグルタミン酸作動性投射ニューロンの制御が達成された。ＢＬＡ内では、ＣａＭＫＩＩαはグルタミン酸作動性錐体ニューロンだけで発現し、局所性インターニューロンまたは介在細胞では発現しない^４８。ＣｅＡ投射へ光を優先的に送達するために、ＢＬＡへの光送達を防ぎ、そして、ＣｅＡの選択的照明を可能にするためにＣｅＬ上に斜めに切ったガイドカニューレを埋め込むと共に、定位ガイダンスの下、ＢＬＡにウイルスを片側的に送達した（図７および８）。その結果の光の分布についての幾何的および機能的特質は、ＢＬＡ細胞体ではなくＢＬＡ末端の選択的制御についての光パワーパラメータを判定するために、インビトロとインビボの両方で、インビボ電気生理学的レコーディングを用いて定量され得る（図９）。

ＢＬＡ−ＣｅＡ経路は不安緩解のための内在性機構を実施することができるという仮説を検討するために、我々は、２つの異なる、そして、よく検証された不安感測定法である高架式十字迷路法およびオープンフィールドテストで投射特異的光遺伝学的制御下にある自由に動くマウスを厳密に調査した（図３ａ〜ｆ）。壁が無いまたは丸見えの空間にさらされるとマウスは不安感関連行動を示し、したがって、高架式十字迷路法の壁が無いアームまたはオープンフィールドチャンバーの中央で過ごした時間の増加が不安感の減少を示す^{４９、５０}。関連の行動の誘導と反転の両方を試験するため、我々はまず３回の５分のエポックの間、マウスに高架式十字迷路法を受けさせ、第２エポックのみに光が送達された。

我々が観察した抗不安効果はＣｅＡ中のＢＬＡ末端の活性化に特異的であり、一般のＢＬＡ細胞に特異的ではないことを判定するために、我々は、投射特異的制御を受けた（ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループの；図３ａ）マウスを対照ウイルスでの形質導入を受け、同じパターンの照明を受けた陰性対照グループ（ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡ）およびＢＬＡにＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰウイルスを形質導入され、ＢＬＡ上に直接ファイバーを埋め込まれた陽性対照グループ（ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体）と比較した。このグループ（ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体）について、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ（図３ｂおよびｃ）で観察された不安緩解を光刺激が誘発することはなかった。実際、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループは、対照（ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループおよびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループ）と比較して、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の光誘導性活性化中に、壁がないアームで有意により長い時間を過ごした（ｔ（４２）＝８．３１２；ｐ＜０．００００１；図３ｂ、ｃ）。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡマウスはまた、迷路の中央の選択点から、壁があるアームよりはむしろ壁がないアームへ入っていく確率の上昇を示した（図３ｃ差込図）。これは、通常不安を惹起する環境を選択する確率の上昇を意味する。

我々は、オープンフィールドアレーナ上で６回の３分のエポックの間、マウスを厳密に調べ、無光条件（オフ）と光刺激条件（オン）の間を交互に繰り返すことにより可逆性を再度試験した。オープンフィールドチャンバーの中央にいる時間で評価したように、試験（ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡ）マウスは中程度で強固であり、可逆的な光誘導性抗不安反応を示したが（図３ｄおよびｅ）、ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループおよびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループのマウスは示さなかった（図３ｅ）。光刺激が自発運動活性（図３ｆ）を著しく変えることはなかった。オフ条件ではグループ間に検出可能な差異はなかったが、オン条件の間、ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループまたはＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループと比較してＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのマウスがオープンフィールドの中央で過ごす時間の有意な増加があった（ｔ（１０５）＝４．９６１７８；各対照についてｐ＜０．０００１）。ＢＬＡ細胞体ではなくＣｅＡへのＢＬＡ投射の選択的刺激が急性で急速に反転しうる抗不安効果をもたらし、ＢＬＡ−ＣｅＬ−ＣｅＭ経路が不安感制御の天然の微小回路であり得るという仮説を裏付けると我々は結論した。

我々は次にこの光誘導性抗不安効果の生理的基礎を研究した。ＢＬＡ中のグルタミン酸作動性ニューロンは強固な興奮性投射をＣｅＬニューロンならびにＣｅＭニューロンに送り込む^３８。しかしながら、光源から離れたＣｅＭシナプス（図８）ばかりかこれらのＣｅＭニューロンの任意の残存性直接刺激も、抗不安効果というよりもむしろ不安惹起効果を引き起こすと期待される^１２。しかし、ＣｅＬニューロンはこれらの脳幹投射ＣｅＭ出力ニューロンに対して強い抑制をもたらし^３２、３５、^４０、それ故、我々は、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の照明がＢＬＡ−ＣｅＬニューロンを活性化することができ、それによって、ＣｅＭニューロンへのフィードフォワード抑制を誘発し、観察された抗不安減少を実施することができると仮説を立てた。

この光遺伝学的に限定された投射の活動を確認するために、我々は、行動試験で送達されたものに光送達プロトコルを合わせたインビボ実験を行い、そして、ニューロンの活性化のパターンを確認するためのリードアウトとして活性依存性最初期遺伝子（ｃ‐ｆｏｓ）の発現解析（図３ｇ〜ｋ）を行った。我々は盲検条件下で、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ、ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループおよびＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループについて、ＥＹＦＰを発現する、またはｃ‐ｆｏｓ免疫反応性を示すＢＬＡ、ＣｅＬおよびＣｅＭ中のニューロンの割合を定量した（図３ｉ〜ｋ）。ＢＬＡでのＣａＭＫＩＩαプロモーター制御下のウイルスの発現はグルタミン酸作動性ニューロンを標的とし^４７、我々は局所性インターニューロンと介在細胞の両方でＥＹＦＰの発現を観察しなかった（図１０）。各領域内のＥＹＦＰ陽性細胞の割合にグループ間で有意な差は認められなかったが（図３ｇ〜ｋ）、ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループまたはＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループと比較してＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループでｃ‐ｆｏｓ陽性ＢＬＡ細胞の有意に高い割合を我々は見出した（図３ｉ；それぞれｐ＜０．０１およびｐ＜０．０５）。ＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループとＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループの間にはｃ‐ｆｏｓについて検出可能な差は無く、斜めに切ったカニューレの遮蔽がＢＬＡ細胞体への直接照明を効果的に防いでいることを示した。ＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループではなく、ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡグループ（ｐ＜０．０５）と比較してＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループで有意に高い割合のＣｅＬニューロンがｃ‐ｆｏｓを発現した（図３ｊ）。したがって、ＣｅＡ中のＣｈＲ２を発現するＢＬＡ末端の選択的照明によりＢＬＡ細胞体を活性化することなくＣｅＬニューロンを活性化することになった。ＣｅＭについて、我々はＣｈＲ２：ＢＬＡ−ＣｅＡグループよりもＣｈＲ２：ＢＬＡ細胞体グループで２倍多い（総ニューロンに対する）ｃ‐ｆｏｓ陽性のニューロンを見出したが（図３ｋ）、ＬＡニューロンはＣｅＬニューロンを選択的に神経支配し、扁桃体のＢＬ核およびＢＭ核のニューロンはＣｅＬとＣｅＭの両方に単シナプス性投射を有するので^{３８、４３、５１}、この発見は解剖学的投射とあう。まとめると、これらのデータは、急性抗不安行動表現型を引き起こすインビボ照明がＢＬＡ細胞体を活性化することがないＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの選択的照明を満たすことを示している。

ＣｅＬ中のＢＬＡ末端の選択的照明がＣｅＭ出力ニューロンのフィードフォワード抑制を誘導するという仮説を検定するために、我々は全細胞パッチクランプレコーディングをライブ二光子イメージングと組み合わせて、微小回路を可視化すると同時に投射特異的光遺伝学的制御中のこれらの細胞間での機能的相互関係を厳密に調査した（図４ａ〜ｆ）。インビボで用いられる光刺激パラメータは光ファイバーを介して送達され、我々の生体外実験で用いられるパラメータは急速薄片に送達されるが、我々は我々の標的位置での光パワー密度を約６ｍＷ／ｍｍ^２に合わせた。ＢＬＡ−ＣｅＬ−ＣｅＭ回路の二光子画像は図４ａに示されるが、３細胞全てが同じ薄片から画像化された（図４ａ）。ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現するＢＬＡニューロンは４７３ｎｍの光の２０Ｈｚ、５ミリ秒のパルスでの直接照明に対して強固で高フィデリティのスパイキングを示した（図４ｂ）。ＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現するＢＬＡニューロンの末端フィールドの照明中に記録されたＣｅＬニューロンからの代表的なトレースはＣｅＬで見られる典型的な興奮性反応を示し（図４ｃ）、集団要約は、スパイキングフィデリティが４０パルス光トレインを通じて安定していたこと、および、反応している細胞には弱く興奮したＣｅＬ細胞および強く興奮したＣｅＬ細胞が含まれること（ｎ＝１６；図４ｃ）を明らかにしている。ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの照明がＣｅＬニューロンからの強固なフィードフォワード抑制によりＣｅＭ細胞でスパイキングを妨げる程機能的に充分であるかどうか検討するために、我々はＢＬＡ−ＣｅＬシナプスを選択的に照明している間にＣｅＭニューロンからの記録をとった（図４ｄ）。実際に、我々はＣｅＬ中のＢＬＡ末端の光刺激によるＣｅＭでの強力なスパイキング抑制（Ｆ_２、１１＝１５．３５、ｐ＝０．００４４）を観察した（図４ｄ；１秒当たりのスパイク：照明前（４９±９．０）、照明中（１．５±０．８７）および照明後（３３±８．４）；平均値±ＳＥＭ）。次に、図４ｅはＣｈＲ２−ＥＹＦＰを発現するＣｅＭでのＢＬＡニューロンの末端フィールドの照明中に記録されたＣｅＭの反応、および興奮性入力と抑制性入力を組み合わせたものを示す。予想されたように、ＥＰＳＣの潜時は２シナプス性ＩＰＳＣの潜時よりも短く、そして、平均ＩＰＳＣ振幅は平均ＥＰＳＣ振幅よりも大きい（それぞれ、０ｍＶおよび−７０ｍＶで記録された；図４ｅ）ことが電位固定レコーディングの集団要約により示された。重要なことに、まさに同じＣｅＭニューロン（ｎ＝７）が、部位間で交互に反復可能な様式で、ＣｅＭへのＢＬＡ入力の広範囲の照明により正味の興奮を引き起こしたが（図４ｅ）、ＣｅＬへのＢＬＡ入力の選択的照明により正味の抑制を示した（図４ｆ）。このことは、ＢＬＡからＣｅＭへの直接入力および間接入力のバランスがＣｅＭ出力を調節することができることを示している。まとめると、それによりＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明がＢＬＡ−ＣｅＬシナプスを活性化し、そうしてＣｅＬニューロンから脳幹投射ＣｅＭニューロンへのフィードフォワード抑制を上昇させる、構造的および機能的に特定された生理的微小回路をこれらのデータは明らかにしている。

この抗不安効果の基礎をなす扁桃体性微小回路をさらに説明するために、我々はこの現象を支配する解剖学的および機能的特質を注意深く分析した。ラットでＣｅＡ中のＢＬＡ側枝の投射をマップする努力がいくつかなされてきたが、我々は、重複する集団または別個の集団のＢＬＡニューロンがＣｅＬおよびＣｅＭに投射するのか先験的な方法で検討した（図５ａ、ｂ）。注目に値する警告を述べると、我々は約３５０μｍ厚の冠状切片中のこれらのニューロンを可視化しており、軸索が切断されたニューロンを排除するようにいろいろと試みたが、我々はこれが起きている可能性を排除できないし、これがＣｅＡにより近いＢＬＡニューロンへの標本抽出バイアスをいくらか誘導したことを否定することができない。図５ａは、標本抽出されたＢＬＡニューロン（ｎ＝１８）の解剖学的投射を要約し、そして、ニューロンの４４％がＣｅＬだけに投射し、１７％がＣｅＭだけに投射していたことを示す。しかしながら、少数のＢＬＡ細胞（ｎ＝１；６％）はＣｅＬとＣｅＭの両方に投射し、ＣｅＬおよびＣｅＭに別々の側枝を送るものもあり、および、分枝をＣｅＬおよびＣｅＭに送る側枝を送るものもあった。図５ｂは標本抽出された細胞試料の２光子画像を示し、それらの全てが電流ステップでＢＬＡ錐体ニューロンに典型的なスパイキングパターンを示した。

次に、我々のｃ‐ｆｏｓ測定が、ＣｅＬ中のＢＬＡ末端の照明はＢＬＡニューロンそのものではなくＣｅＬニューロンを興奮させるのに充分であることを示唆したので、我々はこの仮説を全細胞レコーディングにより確認しようとした。電気的刺激によって、軸索末端の脱分極が細胞体での逆方向性スパイキングを引き起こす。しかしながら、光遺伝学的に誘導された脱分極は異なる機構を介して機能する証拠が存在している。この扁桃体性微小回路での光遺伝学的に誘導された末端刺激の特性を評価するために、我々はＣｈＲ２を発現するＢＬＡ錐体ニューロンから記録をとり、そして、光点を（約１２０μｍの直径）細胞体から視認された軸索側枝への方向と軸索が無い方向の両方向に１００μｍずつ移動させた（図５ｃ）。細胞体からそれぞれの距離で２０Ｈｚの光トレインを受けたＢＬＡニューロンのスパイクフィデリティが図５ｄに要約され、脱分極性電流が図５ｅに要約される。全ての調製物について、我々は、ＢＬＡ細胞体での高フィデリティスパイキング（図５ｆ）およびシナプス後ＣｅＬニューロンのレコーディングにより示されるようなＢＬＡ末端での確実なシナプス小胞放出（図５ｇ；図１５）を誘発するのに、使用された光刺激パラメータは充分であることを確認した。対照的に、細胞体から３００μｍ離れた光点を用いて同じＢＬＡニューロンをレコーディングしたとき、我々が軸索（図５ｈ）に注目しているか、していないか（図５ｉ）に関わらず、我々は確実な活動電位の誘導を観察しなかった。この逆方向性スパイキングの欠如はＧＡＢＡ受容体アンタゴニストおよびＡＭＰＡ受容体アンタゴニストのバス適用（ｎ＝７）を受けても観察されたが、したがって、局所的な抑制性制約の寄与の可能性を排除する。ＢＬＡ錐体ニューロンで逆方向性刺激が無いときに光遺伝学的に誘導されたシナプス小胞放出が起こり得ることを我々は示しているが、我々がここで使用した光パワー密度（約６ｍＷ／ｍｍ^２）よりも大きい光パワー密度で逆方向性刺激が達成され得る可能性がある。これまで、我々は、ＣｅＬとＣｅＭに投射するＢＬＡニューロンの集団は大部分が別個のものであり、そして、ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの照明がＢＬＡ細胞体それ自体を強く活性化することなくシナプス小胞放出とＣｅＬの興奮を引き起こすことを示してきた。

最後に、我々は、投射特異的光遺伝学的制御の環境でインビボ薬理学的分析を用いて機構をさらに探究した。我々が観察した抗不安効果はＢＬＡ−ＣｅＬシナプスのみの選択的活性化によるものであり得、ＣｅＡを通過するＢＬＡ線維によるものでも、その後、あらゆるＢＬＡ投射標的領域を神経支配するＢＬＡ細胞体への活動電位の逆行性伝播にもるものでもないことを判定するために、我々は、局所的なグルタミン酸受容体拮抗作用が光誘導性抗不安効果を減退させるかどうか検討した。不安感を変化させるＣｅＡでの傷害が、ＣｅＡを通過するＢＮＳＴへのＢＬＡ投射^６の切除の可能性によって混乱させられるので、この問題は十分に興味深い。我々は、前述のようにＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明を実施するために、ＡＡＶ−ＣａＭＫＩＩα−ＣｈＲ２−ＥＹＦＰでＢＬＡニューロンを片側的に形質導入し、そして、斜めに切ったカニューレを埋め込み（ｎ＝８；図８）、そして、高架式十字迷路法およびオープンフィールドテストでマウスを試験した。しかしながら、この場合では、我々は同じ動物の異なる試験で光ファイバーガイドカニューレを用いてグルタミン酸アンタゴニストであるＮＢＱＸおよびＡＰ５が生理食塩水対照のどちらかを注入し、試験は順番についてカウンターバランスをとった。通過する線維の制御よりもむしろ局所的シナプス性機構を確認すると、同じマウスと光刺激パラメータについて、ＣｅＡでの局所的グルタミン酸受容体拮抗作用が高架式十字迷路法（図５ｋ）とオープンフィールドテスト（図５ｊ）の両方での不安感の光誘導性減少を消失させた。重要なことに、対照実験では、薬品処理によって自発運動活性は損なわれず（図１１）、そして、急速切片においてＮＢＱＸおよびＡＰ５のバス適用を受けて時間的に同期した光誘起興奮性反応が消失した（図１２）。まとめると、これらのデータは、我々が観察した光誘導性抗不安効果はＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの活性化が引き起こしたものであり、ＣｅＡを通過する遠位標的へのＢＬＡ投射に起因するものではないことを示している。

最終シリーズの実験において、選択的にこの経路を抑制することにより内在性の不安感軽減プロセスが妨害され得るか判定するために、我々は、これらの光遺伝学的に限定されたシナプスが可逆的に不安感を増大させ得るか検討した。我々は、両方ともＢＬＡでＣａＭＫＩＩαプロモーターの下にある、コハク色の光での照明を受けてニューロンの膜を過分極する光活性化塩素ポンプであるｅＮｐＨＲ３．０^２５、またはＥＹＦＰのみのどちらかの両側的ウイルス性形質導入を行い、そして、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的照明を可能にするために斜めに切ったガイドカニューレを両側的に埋め込んだ（図６ａ；図１３）。ｅＮｐＨＲ３．０の発現はＢＬＡ中のグルタミン酸作動性ＣａＭＫＩＩα陽性ニューロンに限定された（図６ｂ）。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループのみが、ＥＹＦＰ：ＢＬＡ−ＣｅＡ ｂｉｌグループおよびｅＮｐＨＲ３．０：細胞体グループと比較して、ＣｅＭでのｃ‐ｆｏｓ発現レベルの著しい上昇（ｐ＜０．０５；図６ｃ〜ｅ）を示したが、これは、ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的抑制がＣｅＬニューロンからＣｅＭニューロンへのフィードフォワード抑制を抑制し、そうしてＣｅＭ興奮性を増大させ、そして、下流のプロセスが不安感表現型を増大させることになることと一致する。重要なことに、ＢＬＡ細胞体の抑制が不安惹起反応を誘導しなかったが、直接的ＢＬＡ−ＣｅＭ興奮性入力の同時的減少が原因のようである。我々はまた、ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループは、ＥＹＦＰグループおよび細胞体グループと比較して、高架式十字迷路法でライト・オフエポックではなくライト・オンエポック中に壁がないアームで過ごす時間および壁がないアームに入っていく確率の著しい減少を示したが（図６ｆ、ｇ）、自発運動活性は変化しなかった（図１６）。ｅＮｐＨＲ３．０：ＢＬＡ−ＣｅＡグループはまた、ＥＹＦＰグループおよび細胞体グループと比較して、５９４ｎｍの光での照明を受けて中央にいる時間の著しい減少を示した（統計、ｐ＝０．００２；図６ｈ、ｉ）。最後に、我々はまた、ｅＮｐＨＲ３．０発現軸索末端の選択的照明が、細胞体でのスパイキングを妨げることなく（図１４）、自発生起的シナプス小胞放出（図６ｊ〜ｌ）および誘起的シナプス小胞放出（図６ｍ〜ｐ）の確率を減少させ得ることを示す。ＣｅＡ中のＢＬＡ末端の選択的抑制が不安感様行動の急性の増加を誘導することをこれらのデータは示す。

結論：これらの実験において、我々は不安感の無条件付け発現を両方向に調節するための内在性の神経基質としてＢＬＡ−ＣｅＬ経路を特定した。我々はＣｅＬを通過するＢＬＡ線維よりもむしろＢＬＡ−ＣｅＬ経路を重要な基質として特定しているが、ＢＮＳＴへのＣｅＡ投射などの他の下流回路が不安感の発現または不安感関連行動に重要な役割を果たす可能性が有る^{４、６、１３}。実際、我々の発見は、ＣｅＬがＢＮＳＴへのＣＲＨの主要な放出源であるので^５３、ＢＮＳＴ中のコルチコトロフィン放出ホルモン（ＣＲＨ）ネットワークが不安感関連行動の調節に決定的に関与し得る^６、５２という考えを裏付け得る。

セロトニン^{５４、５５}、ドーパミン^５６、アセチルコリン^５７、グリシン^５８、ＧＡＢＡ^１３およびＣＲＨ^５９を含む、他の神経伝達物質および神経調節物質が分散型神経回路への効果を調節またはゲート開閉することができる。ＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの並列回路または下流回路が不安感表現型の発現を調節するために役に立つようなので^６、５６、この経路に合流し、そして、この経路から分出する神経回路網が多くの機会を調節的制御に提供する。さらに、扁桃体の上流では、ＢＬＡおよびＣｅＬへの強固な神経支配をもたらす前辺縁皮質、下辺縁皮質および島皮質を含む、恐怖と不安感を処理するのに重要な領域からのトップダウン皮質制御によってリクルートされるのに、この微小回路は良い位置につけている^{４、１３、２３、６０}。

我々のＢＬＡ解剖学の検討により、ＣｅＬニューロンおよびＣｅＭニューロンに投射するＢＬＡニューロンの集団は大部分が重複していないことが示唆される。自然状態では、ＣｅＬ投射ＢＬＡニューロンは微小回路ホメオスタシス機構においてＣｅＭ投射ＢＬＡニューロンを興奮させることができる。これはまた、回路のバランスを歪めて無抑制のＣｅＭ活性化を可能にするシナプスの変化が存在するとき、不安障害の基礎をなす潜在的な機構を表す可能性もある。

まとめると、本明細書で提示されたデータは、哺乳類の脳での内在性の不安緩解の発現に必須であると共に充分である重要な回路要素としてのＢＬＡ−ＣｅＬシナプスの特定を裏付け、不安感への見識の新しい源ならびに新しい種類の治療標的を提供し、そして、精神疾患に関連する神経回路機能の研究において特定の投射の解明の重要性を示す。

明確な理解を目的として、前述の発明が例証と例示をもって幾分詳細に説明されてきたが、説明と例示は本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。

本明細書において開示される全ての参考文献、刊行物および特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれる。

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例示的な実施形態
１． ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含む動物であって、前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンであり、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が誘発される、動物。
２． 前記オプシンが、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３からなる群より選択される、実施形態１に記載の動物。
３． ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する第２の光反応性オプシンをさらに含み、前記第２オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであり、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記第２オプシンの選択的照明により不安感が軽減される、実施形態１に記載の動物。
４． 前記第２オプシンが、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１およびＤＣｈＲからなる群より選択される、実施形態３に記載の動物。
５． ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含む動物であって、前記オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであり、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明により不安感が軽減される、動物。
６． 前記オプシンが、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１およびＤＣｈＲからなる群より選択される、実施形態５に記載の動物。
７． 個体のＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達するためのベクターであって、光反応性オプシンをコードし、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含む、ベクター。
８． 前記オプシンをコードする前記核酸がＣａＭＫＩＩαプロモーターに機能的に連結した、実施形態７に記載のベクター。
９． 前記ベクターがＡＡＶベクターである、実施形態７に記載のベクター。
１０． 前記オプシンが光による脱分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を軽減する、実施形態７に記載のベクター。
１１． 前記オプシンが、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１およびＤＣｈＲからなる群より選択される、実施形態１０に記載のベクター。
１２． 前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンであって、ＢＬＡ−ＣｅＬにおける前記オプシンの選択的照明が不安感を誘発する、実施形態７に記載のベクター。
１３． 前記オプシンが、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３からなる群より選択される、実施形態１２に記載のベクター。
１４． 前記個体がマウスまたはラットである、実施形態７に記載のベクター。
１５． 個体のＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンに核酸を送達する方法であって、光反応性オプシンをコードし、前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を前記個体に投与することを含む、方法。
１６． ＢＬＡ、ＣｅＬおよびＣｅＭを含む冠状断脳組織薄片であって、前記ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて光反応性オプシンが発現する、冠状断脳組織薄片。
１７． 不安感を軽減する化合物をスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現するオプシンの選択的照明により誘発される不安感を有する動物に化合物を投与すること、このとき前記動物はＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現する光反応性オプシンを含み、前記オプシンが光による過分極を誘導するオプシンである；および
（ｂ）前記動物における不安感のレベルを判定すること
を含み、前記不安感のレベルの低下が、その化合物が不安感の治療に有効であり得ることを示す、方法。
１８． 前記オプシンが、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３からなる群より選択される、実施形態１７に記載の方法。
１９． 個体における不安感を軽減する方法であって、
（ａ）光反応性オプシンをコードし、ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を個体に投与すること、このとき前記オプシンがＢＬＡの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光による脱分極を誘導するオプシンである；および
（ｂ）不安感を軽減するためにＢＬＡ−ＣｅＬの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明すること
を含む、方法。
２０． 前記オプシンが、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１およびＤＣｈＲからなる群より選択される、実施形態１９に記載の方法。
２１． 個体において不安感を誘発させる方法であって、
（ａ）オプシンをコードし、ＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結した核酸を含むベクターの有効量を個体に投与すること、このとき前記オプシンが前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光による脱分極を誘導するオプシンである；および
（ｂ）不安感を誘発するためにＢＬＡ−ＣｅＬの前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける前記オプシンを選択的に照明すること
を含む、方法。
２２． 不安感を治療または研究するためのＢＬＡ−ＣｅＭの修飾活性に関連する装置または方法。
２３． 修飾活性がＢＬＡ−ＣｅＬの選択的刺激を含む、実施形態２２に記載の装置または方法。
２４． 修飾活性が光反応性オプシンのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおける標的発現によるＢＬＡ−ＣｅＬの選択的刺激を含む、実施形態２２に記載の装置または方法。
２５． 修飾活性が、ＢＬＡ細胞体の照明に対して、ＣｅＡの選択的照明をさらに含む、実施形態２４に記載の装置または方法。
２６． ＢＬＡへの光の送達を妨げ、そして、ＣｅＡの選択的照明を可能にするために斜めに切ったガイドカニューレをＣｅＬに埋め込むことをさらに含む、実施形態２４に記載の装置または方法。
２７． 薬理学的薬剤、電気刺激、磁気刺激、外科的手段または光遺伝学的刺激のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない治療法をスクリーニングすることをさらに含む、実施形態２２に記載の装置または方法。
２８． ＢＬＡ−ＣｅＭ回路を標的とする治療法であって、薬理学的薬剤、電気刺激、磁気刺激、外科的手段または光遺伝学的刺激のうちの１つ以上を含むが、これらに限定されない前記方法を提供することをさらに対象とする、実施形態２２から２７のいずれか１項に記載の装置または方法。
２９． 不安感および／または関連の障害の研究および厳密な調査のための本開示の回路モデルを使用する装置または方法。
３０． 表現型を特定すること、エンドフェノタイプを特定することおよび治療標的を特定することのうちの１つ以上をさらに含む、実施形態２２から２９のいずれか１項に記載の装置または方法。
３１． 実施例に記載される実施形態を含む、本開示の実施形態のいずれか１つに記載の装置または方法。

Claims (6)

1. マウスまたはラットにおいて不安感を誘発させるための方法であって、
   （ａ）マウスまたはラットに、オプシンをコードする核酸を含むベクターを投与することであって、このとき前記核酸が、基底外側扁桃体（ＢＬＡ）のグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結しており、前記オプシンが前記グルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光により過分極を誘導するものであること、および
   （ｂ）外側中心核（ＣｅＬ）を選択的に照明して、不安感を誘発すること
   を含む、方法。
2. 前記の光による過分極を誘導するオプシンが、ＮｐＨＲ、ＢＲ、ＡＲおよびＧｔＲ３からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記の光による過分極を誘導するオプシンが、配列番号１または配列番号４と９０％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の方法。
4. マウスまたはラットにおいて不安感を軽減するための方法であって、
   （ａ）マウスまたはラットに、光反応性オプシンをコードする核酸を含むベクターを投与することであって、このとき前記核酸が、基底外側扁桃体（ＢＬＡ）のグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおけるオプシンの特異的な発現を制御するプロモーターに機能的に連結しており、前記オプシンがＢＬＡのグルタミン酸作動性錐体ニューロンにおいて発現し、光による脱分極を誘導するものであること、および
   （ｂ）外側中心核（ＣｅＬ）を選択的に照明して、不安感を軽減すること
   を含む、方法。
5. 前記の光による脱分極を誘導するオプシンが、ＣｈＲ２、ＶＣｈＲ１およびＤＣｈＲからなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記の光による脱分極を誘導するオプシンが、配列番号５または配列番号８と９０％を超える同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の方法。