ES2911388T3 - Inhibidores de la quinasa 1 asociada con adaptador, composiciones que los comprenden y métodos para su uso - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de AAK1 y un fármaco antiinflamatorio, en donde el inhibidor de AAK1 es 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato: **(Ver fórmula)** o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

DESCRIPCIÓN

Inhibidores de la quinasa 1 asociada con adaptador, composiciones que los comprenden y métodos para su uso

1. Campo de la invención

Esta invención está dirigida a compuestos basados en pirazolo[1,5-a]pirimidina útiles como inhibidores de la quinasa 1 asociada con adaptador (AAK1), a composiciones que los comprenden y a métodos para su uso.

2. Antecedentes de la invención

La quinasa 1 asociada con adaptador (AAK1) es un miembro de la familia Ark1/Prk1 de las serina/treonina quinasas. El ARNm de AAK1 existe en dos formas de corte y empalme denominadas corta y larga. La forma predominante es la larga y se expresa abundantemente en el cerebro y el corazón (Henderson y Conner, Mol. Biol. Cell. 2007, 18, 2698­ 2706). AAK1 está enriquecida en preparaciones sinaptosómicas y se colocaliza con estructuras endocíticas en células en cultivo. AAK1 modula la endocitosis recubierta de clatrina, un proceso que es importante en el reciclaje de vesículas sinápticas y en la endocitosis mediada por receptor. AAK1 se asocia con el complejo AP2, un heterotetrámero que une la carga del receptor al recubrimiento de clatrina. La unión de la clatrina a AAK1 estimula la actividad quinasa de AAK1 (Conner et al., Traffic 2003, 4, 885-890; Jackson et. al., J. Cell. Biol. 2003, 163, 231-236). AAK1 fosforila la subunidad mu-2 de AP-2, que promueve la unión de mu-2 a los motivos de clasificación que contienen tirosina en los receptores de carga (Ricotta et al., J. Cell Bio. 2002, 156, 791-795; Conner y Schmid, J. Cell Bio. 2002, 156, 921-929). No es necesaria la fosforilación de Mu2 para la captación por el receptor, pero su fosforilación potencia la eficiencia de la internalización (Motely et. al., Mol. Biol. Cell. 2006, 17, 5298-5308).

Se ha identificado a AAK1 como un inhibidor de la señalización de Neurregulina-1/ERbB4 en células PC12. La pérdida de expresión de AAK1 a través de silenciamiento génico mediado por interferencia de ARN o tratamiento con el inhibidor de quinasa K252a (que inhibe la actividad quinasa de AAK1) da como resultado la potenciación del crecimiento de neuritas inducido por Neurregulina-1. Estos tratamientos dan como resultado una expresión aumentada de ErbB4 y una acumulación de ErbB4 en o próxima a la membrana plasmática (Kuai et. al., Chemistry and Biology 2011, 18, 891-906). NRG1 y ErbB4 son supuestos genes de susceptibilidad a la esquizofrenia (Buonanno, Brain Res. Bull. 2010, 83, 122-131). Se han asociado SNP en ambos genes con múltiples endofenotipos de esquizofrenia (Greenwood et. al., Am. J. Psychiatry 2011, 168, 930-946). Algunos modelos de ratón KO para neurregulina 1 y ErbB4 han demostrado cambios morfológicos para la esquizofrenia y fenotipos conductuales relevantes (Jaaro-Peled et. al., Schizophrenia Bulletin 2010, 36, 301-313; Wen et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010, 107, 1211-1216). Además, se ha asociado un polimorfismo de un único nucleótido en un intrón del gen AAK1 con la edad de aparición de la enfermedad de Parkinson (Latourelle et. al., BMC Med. Genet. 2009, 10, 98). Estos resultados sugieren que la inhibición de la actividad de AAK1 puede tener utilidad en el tratamiento de la esquizofrenia, déficits cognitivos en la esquizofrenia, enfermedad de Parkinson, trastorno bipolar y enfermedad de Alzheimer.

El documento WO2013/134228 desvela compuestos basados en pirazolo[1,5-a]pirimidina útiles como inhibidores de AAK1.

3. Sumario de la invención

Esta invención abarca 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato:

y sales farmacéuticamente aceptables y formas sólidas (por ejemplo, formas cristalinas) del mismo. La invención también abarca composiciones farmacéuticas y formas de dosificación que comprenden el compuesto.

Una realización de la presente invención abarca métodos para inhibir la quinasa 1 asociada con adaptador (AAK1) tanto in vitro como in vivo, que comprenden poner en contacto AAK1 con un compuesto de la invención.

Otra realización abarca métodos de tratamiento y manejo de enfermedades y trastornos mediados por la actividad de AAK1. Se cree que los ejemplos de tales enfermedades y trastornos incluyen enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson y esquizofrenia (incluyendo déficits cognitivos en la esquizofrenia).

4. Breve descripción de las figuras

Algunos aspectos de la invención se ilustran en las figuras.

La Figura 1 muestra los resultados obtenidos a partir de un modelo de dolor con formalina usando ratones de inactivación génica de AAK1 homocigotos (-/-) y sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+). Los ratones de inactivación génica AAK1 homocigotos (-/-) muestran una clara reducción tanto en la respuesta al dolor agudo como tónico en comparación con sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+).

La Figura 2 proporciona un espectro de difracción de rayos X de 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato cristalino. El difractograma se obtuvo usando un PANalytical X'Pert PRO (radiación Cu Ka) con un detector PIXcel Medipix2 (40 mA, 45 kV; tamaño de etapa de 0,0260 °20). La Figura 3 muestra los datos de la fase 1 de formalina obtenidos para el 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato en ratones macho C57, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La Figura 4 muestra los datos de la fase 2 de formalina obtenidos para el compuesto en ratones C57 macho, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La Figura 5 proporciona una representación gráfica de barras de los datos que se muestran en la Figura 4. La Figura 6 muestra el efecto dependiente de la dosis del compuesto en el ensayo de Chung en ratón.

5. Descripción detallada de la invención

Esta invención se basa, en parte, en el descubrimiento de que los ratones de inactivación génica AAK1 presentan una elevada resistencia al dolor. Este descubrimiento propició una investigación que, en última instancia, dio lugar al descubrimiento de inhibidores de AAK1, composiciones que los comprenden y métodos de su uso.

5.1. DEFINICIONES

A menos que se indique lo contrario, las expresiones "compuestos de la invención", "compuestos de la presente divulgación", y similares se refieren a compuestos desvelados en el presente documento.

A menos que se indique lo contrario, el término "incluyen" tiene el mismo significado que "incluyen, pero no se limitan a", y el término "incluye" tiene el mismo significado que "incluye, pero no se limita a". De forma similar, la expresión "tal como" tiene el mismo significado que el término "tal como, pero no limitado a".

A menos que se indique lo contrario, los términos "gestionar", "que gestiona" y "gestión" incluyen la prevención de la recurrencia de la enfermedad o trastorno especificado en un paciente que ya ha padecido la enfermedad o trastorno y/o la prolongación del tiempo que un paciente que ha padecido la enfermedad o trastorno permanece en remisión. Los términos incluyen la modulación del umbral, el desarrollo y/o la duración de la enfermedad o trastorno o cambiar la forma en que un paciente responde a la enfermedad o trastorno.

A menos que se indique lo contrario, una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto es una cantidad suficiente para proporcionar un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de una enfermedad o afección o para retrasar o minimizar uno o más síntomas asociados a la enfermedad o afección. Una "cantidad terapéuticamente eficaz" de un compuesto significa una cantidad de agente terapéutico, solo o en combinación con otras terapias, que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento o gestión de la enfermedad o afección. La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" puede abarcar una cantidad que mejora la terapia global, reduce o evita síntomas o causas de una enfermedad o afección o mejora la eficacia terapéutica de otro agente terapéutico.

A menos que se indique lo contrario, los términos "tratar", "que trata" y "tratamiento" contemplan una acción que se produce mientras un paciente padece la enfermedad o trastorno especificado, que reduce la gravedad de la enfermedad o trastorno o retrasa o ralentiza la progresión de la enfermedad o trastorno.

5.2. COMPUESTOS

Esta invención abarca 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato: y sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

Esta invención abarca además formas cristalinas de 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazin-1-carboxilato. En una realización, una forma cristalina tiene un punto de fusión de aproximadamente 182,5 °C según se determina mediante calorimetría diferencial de barrido. En este contexto, el término "aproximadamente" significa ± 2,0 grados centígrados.

En una realización, una forma cristalina del compuesto proporciona un patrón de difracción de rayos X en polvo (XRPD) que contiene máximos en uno o más de aproximadamente 12,7, 14,8, 18,7, 19,0, 19,7 y/o 25,1 grados 20 cuando se obtiene usando radiación Cu Ka. En este contexto, el término "aproximadamente" significa ± 0,2 grados 20. Como conocen los expertos en la materia, las intensidades relativas de los picos en un patrón de XRPD pueden variar dependiendo de cómo se prepara la muestra y cómo se recopilan los datos. Con esto en mente, en la Figura 2 se proporciona un ejemplo de un patrón de XRPD de esta forma.

Los compuestos de la invención pueden existir en diferentes formas conformacionales estables, que pueden ser separables. La asimetría de torsión debida a rotación restringida alrededor de un enlace simple asimétrico, por ejemplo debida a impedimento estérico o tensión en el anillo, puede permitir la separación de los diferentes confórmeros. La presente divulgación incluye cada isómero conformacional de estos compuestos y mezclas de los mismos.

Esta invención abarca isotopómeros o isómeros isotópicos, de los compuestos desvelados en el presente documento, en donde los isótopos de uno o más átomos dentro de un compuesto son diferentes de los que se producen de forma natural o generalmente. A modo de ejemplo general y sin limitación, los isótopos de hidrógeno incluyen deuterio y tritio. Los isótopos de carbono incluyen 13C y 14C. Los compuestos marcados isotópicamente de la invención pueden prepararse mediante técnicas convencionales conocidas por aquellos expertos en la materia (por ejemplo, usando un reactivo marcado isotópicamente apropiado en lugar del reactivo no marcado empleado de otra manera). Dichos compuestos pueden tener una diversidad de usos potenciales, por ejemplo, como patrones y reactivos para determinar la actividad biológica. En el caso de los isótopos estables, dichos compuestos pueden tener el potencial de modificar favorablemente las propiedades biológicas, farmacológicas o farmacocinéticas.

Los compuestos de esta invención pueden existir como sales farmacéuticamente aceptables. La expresión "sal farmacéuticamente aceptable", como se usa en el presente documento, representa sales o formas de iones híbridos de los compuestos de la presente divulgación que son solubles o dispersables en agua o aceite, que son, dentro del alcance del buen criterio médico, adecuadas para su uso en contacto con los tejidos de los pacientes sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, acorde con una relación beneficio/riesgo razonable y son eficaces para su uso previsto. Pueden prepararse las sales durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos o por separado haciendo reaccionar un átomo de nitrógeno adecuado con un ácido adecuado. Las sales de adición de ácido representativas incluyen acetato, adipato, alginato, citrato, aspartato, benzoato, bencenosulfonato, bisulfato, butirato, alcanforato, alcanforsulfonato; digluconato, dibromidrato, diclorhidrato, diyodhidrato, glicerofosfato, hemisulfato, heptanoato, hexanoato, formiato, fumarato, clorhidrato, bromhidrato, yodhidrato, 2-hidroxietanosulfonato, lactato, maleato, mesitilensulfonato, metanosulfonato, naftilensulfonato, nicotinato, 2-naftalenosulfonato, oxalato, palmoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartrato, tricloroacetato, trifluoroacetato, fosfato, glutamato, bicarbonato, paratoluensulfonato y undecanoato. Los ejemplos de ácidos que pueden emplearse para formar sales de adición farmacéuticamente aceptables incluyen ácidos inorgánicos tales como clorhídrico, bromhídrico, sulfúrico y fosfórico y ácidos orgánicos tales como oxálico, maleico, succínico y cítrico.

Las sales de adición básicas pueden prepararse durante el aislamiento y purificación finales de los compuestos haciendo reaccionar un grupo carboxi con una base adecuada tal como el hidróxido, carbonato o bicarbonato de un catión metálico o con amonio o una amina orgánica primaria, secundaria o terciaria. Los cationes de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen litio, sodio, potasio, calcio, magnesio y aluminio, así como cationes de aminas cuaternarias tales como amonio, tetrametilamonio, tetraetilamonio, metilamina, dimetilamina, trimetilamina, trietilamina, dietilamina, etilamina, tributilamina, piridina, N,N-dimetilanilina, N-metilpiperidina, N-metilmorfolina, diciclohexilamina, procaína, dibencilamina, N,N-dibencilfenetilamina y N,N'-dibenciletilendiamina. Otras aminas orgánicas representativas útiles para la formación de sales de adición de base incluyen etilendiamina, etanolamina, dietanolamina, piperidina y piperazina.

5.3. MÉTODOS DE USO

Cualquier referencia en la descripción a métodos de tratamiento se refiere a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico).

Una realización de la presente invención abarca métodos para inhibir la quinasa 1 asociada con adaptador (AAK1) tanto in vitro como in vivo, que comprenden poner en contacto AAK1 con un compuesto de la invención.

Otra realización abarca métodos de tratamiento y manejo de enfermedades y trastornos mediados por la actividad de AAK1. Las enfermedades y los trastornos mediados por la actividad de AAK1 son enfermedades y trastornos que tienen al menos un síntoma, cuya gravedad o manifestación se ve afectada por la actividad de AAK1. Se cree que los ejemplos de tales enfermedades y trastornos incluyen enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson y esquizofrenia (incluyendo déficits cognitivos en la esquizofrenia). Los métodos particulares comprenden administrar a un paciente (un ser humano u otro mamífero) que lo necesite una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención.

Otra realización de esta invención abarca un método para tratar o gestionar una enfermedad o trastorno, que comprende administrar a un paciente que lo necesite una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un compuesto de la invención, en donde la enfermedad o trastorno se selecciona de enfermedad de Alzheimer, trastorno bipolar, dolor, enfermedad de Parkinson o esquizofrenia (incluyendo déficits cognitivos en la esquizofrenia). Los tipos particulares de dolor incluyen dolor crónico, dolor agudo y dolor neuropático. Los tipos particulares de dolor neuropático incluyen fibromialgia y neuropatía periférica (por ejemplo, neuropatía diabética).

Cuando se usa para tratar o controlar una enfermedad o trastorno, los compuestos de la invención se administran preferentemente como parte de una composición farmacéutica que comprende uno o más vehículos, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

Las composiciones o formulaciones farmacéuticas, pueden presentarse en formas de dosis unitarias que contienen una cantidad predeterminada de principio activo por dosis unitaria. Los niveles de dosificación de entre aproximadamente 0,01 y aproximadamente 250 miligramos por kilogramo ("mg/kg") de peso corporal por día, preferentemente entre aproximadamente 0,05 y aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día de los compuestos de la presente divulgación son típicos en una monoterapia para la prevención y tratamiento de una enfermedad. Normalmente, las composiciones farmacéuticas de esta divulgación se administrarán de aproximadamente 1 a aproximadamente 5 veces al día o como alternativa, como una infusión continua. Dicha administración puede usarse como una terapia crónica o aguda. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales vehículo para producir una forma de dosificación unitaria variarán dependiendo de la afección que se esté tratando, la gravedad de la afección, el momento de administración, la vía de administración, la tasa de excreción del compuesto empleado, la duración del tratamiento y la edad, el género, el peso y el estado del paciente. Las formulaciones de dosificación unitaria preferidas son las que contienen una dosis o una subdosis diaria, como se ha citado anteriormente en el presente documento, o una fracción apropiada de la misma, de un principio activo. El tratamiento puede iniciarse con pequeñas dosis sustancialmente menores que la dosis óptima del compuesto. En lo sucesivo, se aumenta la dosificación en aumentos pequeños hasta que se alcanza el efecto óptimo en las circunstancias dadas. En general, el compuesto se administra de forma más deseable a un nivel de concentración que proporcionará generalmente resultados eficaces sin producir ningún efecto secundario perjudicial o dañino.

Los compuestos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos o profilácticos adicionales. Por ejemplo, cuando se usan para el tratamiento del dolor, posibles agentes adicionales incluyen agentes inmunosupresores y antiinflamatorios.

Los inmunosupresores adecuados para su uso en los métodos y las composiciones de esta invención incluyen aquellos conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen aminopterina, azatioprina, ciclosporina A, D-penicilamina, sales de oro, hidroxicloroquina, leflunomida, metotrexato, minociclina, rapamicina, sulfasalazina, tacrolimus (FK506) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Un inmunosupresor particular es el metotrexato.

Los ejemplos adicionales incluyen anticuerpos anti-TNF, tales como adalimumab, certolizumab pegol, etanercept e infliximab. Otros incluyen bloqueantes de interleucina-1, tales como anakinra. Otros incluyen anticuerpos anti-células B (CD20), tales como rituximab. Otros incluyen bloqueantes de la activación de células T, tales como abatacept.

Los ejemplos adicionales incluyen inhibidores de la inosina monofosfato deshidrogenasa, tales como micofenolato mofetilo (CellCept®) y ácido micofenólico (Myfortic®).

Los fármacos antinflamatorios adecuados para su uso en los métodos y las composiciones de la presente invención incluyen los conocidos en la técnica. Algunos ejemplos incluyen glucocorticoides y AINE.

Algunos ejemplos de glucocorticoides incluyen aldosterona, beclometasona, betametasona, cortisona, desoxicorticosterona, dexametasona, fludrocortisonas, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Algunos ejemplos de AINE incluyen salicilatos (por ejemplo, aspirina, amoxiprina, benorilato, salicilato de magnesio y colina, diflunisal, faislamina, salicilato de metilo, salicilato de magnesio, salicilato de salicilo y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilalcanoicos (por ejemplo, diclofenaco, aceclofenaco, acemetacina, bromfenaco, etodolaco, indometacina, nabumetona, sulindaco, tolmetina y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilpropiónicos (por ejemplo, ibuprofeno, carprofeno, fenbufeno, fenoprofeno, flurbiprofeno, cetoprofeno, cetorolaco, loxoprofeno, naproxeno, oxaprocina, ácido tiaprofénico, suprofeno y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), ácidos arilantranílicos (por ejemplo, ácido meclofenámico, ácido mefenámico y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), derivados de pirazolidina (por ejemplo, azapropazona, metamizol, oxifenbutazona, fenilbutazona, sulfinprazona y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), oxicams (por ejemplo, lornoxicam, meloxicam, piroxicam, tenoxicam y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos), inhibidores de COX-2 (por ejemplo, celecoxib, etoricoxib, lumiracoxib, parecoxib, rofecoxib, valdecoxib y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos) y sulfonanilidas (por ejemplo, nimesulida y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos).

Otros agentes usados en el tratamiento del dolor (incluyendo pero no limitado a dolor neuropático y dolor inflamatorio) incluyen agentes tales como pregabalina, lidocaína, duloxetina, gabapentina, carbamazepina, capsaicina y otros inhibidores de la recaptación de serotonina/norepinefrina/dopamina y opiáceos (tales como oxicontina, morfina y codeína).

En el tratamiento del dolor provocado por una enfermedad o afección conocida, tal como diabetes, infección (por ejemplo, herpes zóster o infección por VIH) o cáncer, los compuestos de la presente invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes terapéuticos o profilácticos dirigidos a la enfermedad o afección subyacente. Por ejemplo, cuando se usan para tratar la neuropatía diabética, los compuestos de la invención pueden administrarse en combinación con uno o más agentes antidiabéticos, agentes antihiperglucemiantes, agentes hipolipidémicos/reductores de lípidos, agentes antiobesidad, agentes antihipertensivos y supresores del apetito. Algunos ejemplos de agentes antidiabéticos incluyen biguanidas (por ejemplo, metformina, fenformina), inhibidores de la glucosidasa (por ejemplo, acarbosa, miglitol), insulinas (incluyendo secretagogos de la insulina y sensibilizantes de la insulina), meglitinidas (por ejemplo, repaglinida), sulfonilureas (por ejemplo, glimepirida, gliburida, gliclazida, clorpropamida y glipizida), combinaciones de biguanida/gliburida (por ejemplo, Glucovance), tiazolidinedionas (por ejemplo, troglitazona, rosiglitazona y pioglitazona), agonistas PPAR-alfa, agonistas de PPAR-gamma, agonistas de PPAR alfa/gamma dobles, inhibidores de glucógeno fosforilasa, inhibidores de proteína de unión a ácidos grasos (aP2), péptido-1 similar a glucagón (GLP-1) u otros agonistas del receptor de GLP-1, inhibidores de dipeptidil peptidasa IV (DPP4) e inhibidores de cotransportador de sodio y glucosa 2 (SGLT2) (por ejemplo, dapagliflozina, canagliflozina y LX-4211).

5.4. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS

Las formulaciones farmacéuticas pueden adaptarse para su administración por cualquier vía apropiada, por ejemplo, por la vía oral (incluyendo bucal o sublingual), rectal, nasal, tópica (incluyendo bucal, sublingual, o transdérmica), vaginal o parenteral (incluyendo subcutánea, intracutánea, intramuscular, intraarticular, intrasinovial, intraesternal, intratecal, intralesional, intravenosa o inyecciones o infusiones intradérmicas). Dichas formulaciones pueden prepararse mediante cualquier método conocido en la técnica de farmacia, por ejemplo, poniendo en asociación el principio activo con los vehículos o excipientes. Se prefieren la administración oral o la administración por inyección.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración oral pueden presentarse como unidades individuales, tales como cápsulas o comprimidos; polvos o gránulos; soluciones o suspensiones en líquidos acuosos o no acuosos; espumas o batidos comestibles; o emulsiones líquidas de aceite en agua o emulsiones de agua en aceite.

Por ejemplo, para la administración oral en forma de un comprimido o una cápsula, el componente de fármaco activo puede combinarse con un vehículo inerte oral, no tóxico, farmacéuticamente aceptable tales como etanol, glicerol, agua y similares. Los polvos se preparan triturando el compuesto hasta un tamaño fino adecuado y mezclándolo con un transportador farmacéutico triturado de forma similar, tal como un carbohidrato comestible, como, por ejemplo, almidón o manitol. También pueden estar presentes agentes aromatizantes, conservantes, dispersantes y colorantes.

Las cápsulas se producen preparando una mezcla en polvo, como se ha descrito anteriormente y rellenando vainas de gelatina formadas. Pueden añadirse agentes deslizantes y lubricantes tales como sílice coloidal, talco, estearato de magnesio, estearato de calcio o polietilenglicol sólido a la mezcla de polvo antes de la operación de relleno. Puede añadirse también un agente disgregante o solubilizante tales como agar-agar, carbonato de calcio o carbonato de sodio para mejorar la disponibilidad del medicamento cuando se ingiere la cápsula.

Por otro lado, cuando se desee o sea necesario, pueden incorporarse también aglutinantes, lubricantes, agentes disgregantes y agentes colorantes adecuados en la mezcla. Los aglutinantes adecuados incluyen almidón, gelatina, azúcares naturales tales como glucosa o beta-lactosa, edulcorantes de maíz, gomas naturales y sintéticas tales como goma arábiga, tragacanto o alginato de sodio, carboximetilcelulosa, polietilenglicol y similares. Los lubricantes usados en estas formas farmacéuticas incluyen oleato de sodio, cloruro sódico y similares. Los disgregantes incluyen, sin limitación, almidón, metilcelulosa, agar, bentonita, goma xantana y similares. Los comprimidos se formulan, por ejemplo, preparando una mezcla de polvo, granulando o aglomerando, añadiendo un lubricante y disgregante y prensando para formar comprimidos. Se prepara una mezcla de polvo mezclando el compuesto, triturado de forma adecuada, con un diluyente o base como se ha descrito anteriormente, y opcionalmente, con un aglutinante, tales como carboximetilcelulosa, un alginato, gelatina o polivinilpirrolidona, una solución retardante tal como parafina, un acelerador de la resorción tal como una sal cuaternaria y/o un agente de absorción tales como bentonita, caolín o fosfato dicálcico. La mezcla en polvo puede granularse humedeciéndola con un aglutinante tales como un jarabe, pasta de almidón, mucílago de acacia o soluciones de materiales celulósicos o poliméricos y forzándola a pasar a través de un tamiz. Como una alternativa a la granulación, la mezcla en polvo puede procesarse a través de la máquina compresora y el resultado son lingotes formados imperfectamente separados en gránulos. Los gránulos pueden lubricarse para impedir que se adhieran a las matrices para la formación de comprimidos mediante la adición de ácido esteárico, una sal de estearato, talco o aceite mineral. A continuación, la mezcla lubricada se comprime formando comprimidos. Los compuestos de la presente divulgación también pueden combinarse con un vehículo inerte de flujo libre y se comprimen en forma de comprimidos directamente sin pasar por las etapas de granulación o aglomeración. Puede proporcionarse un recubrimiento protector transparente u opaco que consiste en un recubrimiento sellador de goma laca, un revestimiento de azúcar o material polimérico y un revestimiento de cera pulida. Pueden añadirse colorantes a estos recubrimientos para distinguir las diferentes dosificaciones unitarias.

Pueden prepararse fluidos orales tales como soluciones, jarabes y elixires en formas de dosificación unitaria de tal manera que una cantidad dada contiene una cantidad predeterminada del compuesto. Pueden prepararse jarabes disolviendo el compuesto en una solución acuosa aromatizada adecuada, mientras que los elixires se preparan mediante el uso de un vehículo no tóxico. Pueden añadirse también solubilizantes y emulsionantes tales como alcoholes isoestearílicos etoxilados y éteres de sorbitol polioxietilenado, conservantes, aditivos de sabor tales como aceite de menta piperita o edulcorantes naturales o sacarina u otros edulcorantes artificiales y similares.

Cuando sea apropiado, las formulaciones de dosificación unitaria para la administración oral pueden microencapsularse. La formulación también puede prepararse para prolongar o mantener la liberación como, por ejemplo, recubriendo o embebiendo el material en partículas en polímeros, cera o similares.

Los compuestos de la invención pueden administrarse en forma de sistemas de administración de liposomas, tales como vesículas unilamelares pequeñas, vesículas unilamelares grandes y vesículas multilamelares. Los liposomas pueden formarse a partir de una diversidad de fosfolípidos, tales como colesterol, estearilamina o fosfatidilcolinas.

Los compuestos de la invención también pueden suministrarse mediante el uso de anticuerpos monoclonales como vehículos individuales a los cuales se acoplan las moléculas de compuesto. Los compuestos también pueden acoplarse con polímeros solubles como vehículos farmacológicos direccionables. Tales polímeros pueden incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamidafenol, polihidroxietilaspartamidafenol o polietilenoxidopolilisina sustituidos con restos de palmitoílo. Adicionalmente, los compuestos pueden acoplarse a una clase de polímeros biodegradables útiles para lograr una liberación controlada de un fármaco, por ejemplo, ácido poliláctico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxibutírico, poliortoésteres, poliacetales, polihidropiranos, policianoacrilatos y copolímeros de bloques de hidrogeles reticulados o anfipáticos.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración transdérmica pueden presentarse como parches discretos previstos para permanecer en contacto íntimo con la epidermis del receptor durante un periodo prolongado de tiempo. Por ejemplo, el principio activo puede suministrarse a través del parche mediante iontoforesis como se describe de forma general en Pharmaceutical Research 1986, 3(6), 318.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para la administración tópica pueden formularse como pomadas, cremas, suspensiones, lociones, polvos, soluciones, pastas, geles, pulverizadores, aerosoles o aceites.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración rectal pueden presentarse como supositorios o como enemas.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración nasal en donde el vehículo es un sólido incluyen un polvo grueso que tiene un tamaño de partícula, por ejemplo, en el intervalo de 20 a 500 micrómetros que se administran por aspiración por la nariz, es decir, mediante inhalación rápida a través de las fosas nasales desde un recipiente que contiene el polvo y que se sujeta cerca de la nariz. Las formulaciones adecuadas en donde el vehículo es un líquido, para su administración como aerosol nasal o gotas nasales, incluyen soluciones acuosas u oleaginosas del principio activo.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para su administración por inhalación incluyen partículas finas de polvo o nebulizaciones, que pueden generarse por medio de varios tipos de aerosoles, nebulizadores, o insufladores presurizados de dosis medida.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para administración vaginal pueden presentarse como óvulos vaginales, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o formulaciones en pulverizador.

Las formulaciones farmacéuticas adaptadas para la administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener antioxidantes, tampones, bacteriostáticos y solutos que hacen que la formulación sea isotónica con la sangre del destinatario previsto; y suspensiones acuosas y no acuosas estériles que pueden incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Las formulaciones pueden presentarse en recipientes de dosis unitaria o de múltiples dosis, por ejemplo, ampollas y viales sellados y pueden almacenarse en un estado criodesecado (liofilizado) que requiera solo la adición del vehículo líquido estéril, por ejemplo, agua para inyecciones, inmediatamente antes de su uso. Pueden prepararse soluciones y suspensiones para inyección extemporáneas a partir de polvos estériles, gránulos y comprimidos.

Debe entenderse que además de los ingredientes particularmente mencionados anteriormente, las formulaciones pueden incluir otros agentes convencionales en la técnica teniendo en cuenta el tipo de formulación en cuestión, por ejemplo aquellos adecuados para la administración oral pueden incluir agentes saborizantes.

5.5. Ejemplos

5.5.1. Ratones de inactivación génica para AAK1

Se prepararon ratones homocigóticos (-/-) para la alteración del gen AAK1 mediante dos métodos; atrapamiento génico y recombinación homóloga.

El atrapamiento génico es un método de mutagénesis insercional aleatoria que usa un fragmento de ADN que codifica un gen indicador o marcador de selección como un mutágeno. Los vectores de atrapamiento génico se han diseñado para integrarse en intrones o genes de una manera que permita que la maquinaria de corte y empalme celular corte y empalme los exones codificados en los vectores con ARNm celulares. Comúnmente, los vectores de atrapamiento génico contienen secuencias de marcadores de selección que están precedidas por secuencias aceptoras de corte empalme fuertes y no están precedidas por un promotor. Por lo tanto, cuando tales vectores se integran en un gen, la maquinaria de corte y empalme celular corta y empalma los exones del gen atrapado en el extremo 5' de la secuencia del marcador seleccionable. Normalmente, tales genes marcadores de selección solo pueden expresarse si el vector que codifica el gen se ha integrado en un intrón. Los sucesos de atrapamiento génico resultantes se identifican posteriormente mediante la selección de células que pueden sobrevivir en el cultivo de selección.

Se mutaron células madre embrionarias (células Lex-1 de la cepa obtenida de murino A129) mediante un proceso que implica la inserción de al menos una parte de una secuencia de vector genéticamente modificada en el gen de interés, las células madre embrionarias mutadas se microinyectaron en blastocistos que se introdujeron posteriormente en hospedadoras pseudopreñadas y se llevaron a término utilizando métodos establecidos. Véase, por ejemplo, "Mouse Mutagenesis", 1998, Zambrowicz et al., eds., Lexicon Press, The Woodlands, TX. Los animales quiméricos resultantes se criaron posteriormente para producir descendientes capaces de la transmisión por la estirpe germinal de un alelo que contiene la mutación modificada por ingeniería genética en el gen de interés.

También se prepararon ratones con alteración del gen AAK1 por recombinación homóloga. En este caso, el segundo exón codificante del gen AAK1 murino (véase número de referencia del GenBank NM_177762) se retiró por métodos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, las patentes de EE.UU. n.° 5.487.992, 5.627.059 y 5.789.215.

Se estudiaron los ratones homocigóticos (-/-) para la alteración del gen AAK1 junto con los ratones heterocigóticos (+/-) para la alteración del gen AAK1 y sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+). Durante este análisis, los ratones se sometieron a pruebas complementarias médicas usando un conjunto integrado de procedimientos de diagnóstico médico diseñados para evaluar la función de los principales aparatos y sistemas en un sujeto mamífero. Se estudiaron los ratones homocigóticos (-/-) "de inactivación génica" junto con sus compañeros de camada heterocigóticos (+/-) y de tipo silvestres (+/+). La alteración del gen AAK1 fue confirmada por análisis Southern. La expresión del homólogo murino de AAK1 se detectó mediante RT-PCR en cerebro murino; médula espinal; ojo; timo; bazo; pulmón; riñón; hígado; músculo esquelético; hueso; estómago, intestino delgado y colon; corazón; tejido adiposo; pulmón asmático; hígado LPS; sangre; corazón con banda; árbol aórtico; próstata; y glándula mamaria (virgen de 5 semanas, virgen madura, 12 DPC, 3 días posparto (lactante), 3 días después del destete (involución temprana) y 7 días después del destete (involución tardía).

Los homocigóticos para AAK1 (-/-) y sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+) se probaron usando la prueba de la pata con formalina como se describe a continuación en el Ejemplo 5.5.6 para evaluar sus respuestas nociceptivas agudas y tónicas.

Como se muestra en la Figura 1, los datos de fase 1 y fase 2 se obtuvieron usando ratones homocigóticos (-/-) hembra (n = 16), hembras de tipo silvestre (n = 15), ratones homocigóticos (-/-) macho (n = 9) y machos de tipo silvestre (n = 18). En todos los grupos y en ambas fases, los ratones AAK1 homocigotos (-/-) mostraron un retroceso de pata registrado significativamente menor que sus compañeros de camada de tipo silvestre (+/+).

5.5.2. Síntesis de 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato

Parte A. 3-bromo-5-clorop¡razolon.5-a1p¡rim¡d¡na. A una mezcla de 5-doropirazolo[1,5-a]pirimidina (30 g, 195 mmol) en acetonitrilo (600 ml) se añadió N-bromosuccinimida (38,3 g, 215 mmol). La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 1 hora. El producto sólido se filtró y se lavó con NaOH 1 N y agua. El filtrado de acetonitrilo y todos los lavados se concentraron al vacío y se suspendieron en NaOH 1 N. El producto sólido se filtró y se lavó con agua. Este producto se combinó con el sólido anterior y se secó durante la noche para obtener 44,2 g de 3-bromo-5-cloro-pirazolo[1,5-a]p¡r¡m¡d¡na. LRMS (ESI) m/z 232/234 [(M+H)]+, calc. para C6H3BrClN3: 232,47. CLEM (M+1, patrón bromo) = 233. RMN 1H (400 MHz, CDCla) 8: 6,82 (d, 1H), 8,15 (S ancho, 1H), 8,58 (d, 1H).

Parte B. 3-bromo-5-(p¡peraz¡n-1-¡l)p¡razolo[1.5-a1p¡r¡m¡d¡na. A una solución de 3-bromo-5-clorop¡razolo(1,5-a)p¡r¡m¡d¡na (25 g, 0,107 mol) en 1,4-dioxano (500 ml) se añadió trietilamina (43 g, 0,43 mol), seguido de piperazina (28 g, 0,322 mol). La mezcla de reacción se agitó a 90 °C durante 4 h. Después de completarse la reacción, se diluyó con acetato de etilo y se lavó con agua. La capa acuosa se volvió a extraer con acetato de etilo. La capa orgánica combinada se secó sobre sulfato sódico y se evaporó para obtener 35 g de 3-bromo-5-(p¡peraz¡na-1-¡l)p¡razolo(1.5-a^irimidina bruta. El producto podría recristalizarse en metanol pero generalmente se usa sin purificación adicional. RMN 1H (400 MHz, DMSO-d6) 82,74-2,81 (m, 4H), 3,55-3,69 (m, 4H), 6,75 (d, J=7,83 Hz, 1H), 7,94 (s, 1H), 8,62 (d, J=7,83 Hz, 1H). RMN 13C (100 MHz, DMSO-d6) 8 ppm 41,25, 42,16, 77,73, 97,78, 136,77, 144,01, 144,18, 155,53. LRMS (ESI) m/z 282,0/284,0 [(M+H)]+, calc. para C10H12BrN5:282,14.

Parte C. 3-(2-metoxipiridin-3-il)-5-(piperazin-1-il)pirazolo[1.5-a1pirimidina. La 3-bromo-5-(p¡peraz¡n-1-¡l)p¡razolo[1.5-alpirimidina (3,00 g, 10,64 mmol), ácido ^-metoxipiridin^-i^borónico (2,44 g, 15,96 mmol) y bis(di-ferc-butil(4-dimetilaminofenilfosfina^icloropaiadio^I) (0,23 g, 0,32 mmol) se pesaron en un matraz de fondo redondo de 200 ml. Después se añadieron 60 ml de dioxano, seguido de la adición de 30 ml de agua y después trietilamina (7,40 ml, 53,19 mmol). La mezcla resultante se calentó a 85 °C, después de 1,5 h la reacción se había completado. Después se concentró a sequedad en el rotavap. El residuo sólido se suspendió en agua y el pH se ajustó a aproximadamente 2 usando HCl. Se realizaron tres extracciones con EtOAc para retirar las impurezas. Después se ajustó el pH a aproximadamente 8 usando NaOH. La suspensión se enfrió en un baño de hielo durante aproximadamente 1 hora para mejorar la precipitación del producto deseado. El sólido se filtró y se secó para obtener 2,74 g (83 %) del compuesto del título como un sólido de color amarillo pálido. RMN 1H (400 MHz, METANOL-d4) 8 ppm 2,92 - 3,07 (m, 4 H), 3,72 - 3,84 (m, 4 H), 4,08 (s, 3 H), 6,73 (d, J=8,03 Hz, 1 H), 7,04 (dd, J=7,53, 5,02 Hz, 1 H), 7,95 (dd, J=4,89, 1,88 Hz, 1 H), 8,46 (d, J=8,03 Hz, 1 H), 8,53 (s, 1 H), 8,89 (dd, J=7,53, 1,76 Hz, 1 H). LRMS (ESI) m/z 311,1 [(M+H)]+, calc. para C¹⁶H¹⁸N⁶O: 310,4.

Parte D. Carbonato de 3-metiloxetan-3-ilo (4-nitrofenilo). La 3-oxetanona (7,00 g, 97,22 mol) disuelta en 200 ml de THF en un matraz de fondo redondo de 500 ml se enfrió a -20 °C mientras se agitaba sobre nitrógeno. Después, se añadieron lentamente 34,0 ml (105,08 mmol) de bromuro de metilmagnesio (solución de éter 3 M) durante un período de 15 minutos. (La reacción se vuelve espesa y un poco difícil de agitar). Se retiró el baño de enfriamiento y la reacción se dejó agitar y calentar a ta. Después de 2,5 h, la reacción se enfrió a 0 °C y se inactivó ralentizando la adición de 100 ml de disolución de NH4Cl ac. saturada y después se añadieron unas gotas de HCl 1 N para ajustar el pH a aproximadamente 6. Extraer dos veces con porciones de 200 ml de DCM. La capa orgánica combinada se secó sobre MgSO4. Se filtró y se concentró en el rotavap sin calor. Se obtuvo un aceite, 6,19 g que contenía un 81 % del producto deseado y un 19 % de THF basándose en el análisis de RMN de protones. El rendimiento estimado de la reacción fue (5,14 gramos) el 60 %. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 1,58 (s, 3H), 4,49 (d, J=7,28 Hz, 2H), 4,63 (d, J=6,53 Hz, 2H).

4,32 g de 3-metil-oxetan-3-ol (81 % p/p en THF, 39,77 mmol) disueltos en 40 ml de DCM se enfriaron a 0 °C. Se añadió la piridina, seguido de la adición del cloroformiato de 4-nitrofenilo en pequeñas porciones durante un período de 10 minutos. La solución se volvió turbia y se retiró el baño de hielo y se permitió que continuara la agitación en nitrógeno a temperatura ambiente. Después de 1 h, se obtuvo una solución de color amarillo pálido transparente. La reacción se interrumpió con agua y se extrajo dos veces con DCM. La capa orgánica se lavó con salmuera y se secó sobre MgSO4 y se concentró. Se cargó en una columna 330 usando un pequeño volumen de DCM y se sometió a separación en la ISCO usando solo DCM como disolvente para obtener 6,2 g (61 %) del producto deseado. RMN 1H (400 MHz, CLOROFORMO-d) 8 1,86 (s, 3H), 4,57 (d, J=8,03 Hz, 2H), 4,90 (d, J=7,53 Hz, 2H), 7,41 (d, J=6,51 Hz, 2H), 8,31 (d, J=6,42 Hz, 2H).

Parte E. 4-(3-(2-metox¡p¡r¡d¡n-3-¡l)p¡razolo[1.5-a1p¡r¡m¡d¡n-5-¡l)p¡peraz¡na-1-carbox¡lato de 3-metiloxetan-3-ilo. A una mezcla de metox¡-p¡r¡d¡n-3-¡l)-5-p¡peraz¡n-1-¡l-p¡razolo[1,5-a]p¡r¡m¡d¡na (1 g, 3,22 mmol) y carbonato de 3-metiloxetan 3-ilo (4-nitrofenilo) (979 mg, 3,87 mmol) en acetonitrilo se añadió DIEA (2,24 ml, 12,9 mmol). La mezcla se agitó a temp. ambiente durante 6 horas. La mezcla de reacción se diluyó con 50 ml de NaOH 1 N y se filtró. El sólido se lavó con NaOH 1 N, agua y heptano. El producto se recristalizó a partir de dioxano: agua y después se recristalizó nuevamente en acetonitrilo para producir 950 mg de 3-metiloxetan-3-il 4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1- carboxilato. RMN ¹H (700 MHz, DMSO-d⁶) 8 1,67 (s, 3H), 3,52 (s a, 2H), 3,58 (s a, 2H), 3,80 (s a, 4H), 4,01 (s, 3H), 4,43 (d, J=7,06 Hz, 2H), 4,67 (d, J=7,06 Hz, 2H), 6,84 (d, J=7,82 Hz, 1H), 7,09 (dd, J=7,34, 4,86 Hz, 1H), 7,99 (d, J=3,43 Hz, 1H), 8,52 (s, 1H), 8,77 (d, J=7,82 Hz, 1H), 8,82 (d, J=7,91 Hz, 1H). LRMS (ESI) m/z 425 [(M+H)]+, calc. para C²¹H²⁴N⁶O⁴: 424,46.

5.5.3. Ensayo de placa de filtro P81

Los compuestos se diluyeron en serie en una placa Labcyte LDV (Labcyte, n.° de cat. LP-0200) usando un Mutiprobe (PerkinElmer) y Biomek FX (Beckman Coulter) de tal manera que la concentración más alta de compuesto fuera de 96 |jM. A continuación, los compuestos se picaron (75 nl por pocillo) en una placa de reacción Greiner de 384 pocillos (Greiner, n.° 781076) usando un manipulador de líquidos ECHO 550 (Labcyte). A continuación, se añadió un total de 12 j l de tampón de reacción (tampón IMAP que contiene Tween y DTT, de Molecular Devices) a cada pocillo de las columnas 1 y 13 para los controles negativos y 12 j l de 2X AAK1 (proteína humana de longitud completa 0,2 nM, N.° de registro del NCBI NP_055726.2) se añadió a los pocillos restantes. A continuación, la enzima se preincubó con el compuesto durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las reacciones se iniciaron con la adición de Minitrak (PerkinElmer) de 12 j l de mezcla de sustrato que contenía 2X Mu2 (0,2 jM , proteína humana de longitud completa), 2x ATP frío (2 jM ) y 1,3 jC i de ³³P-ATP caliente. Las reacciones prosiguieron durante una hora a temperatura ambiente. Al mismo tiempo, se colocaron placas de filtro P81 de 384 pocillos Millipore (Millipore, n.° de catálogo MZPHN0W10) en un lavador de placas (Zoom ZW, de Titertek) y se humedecieron previamente con 50 j l de ácido fosfórico al 1 %. Las reacciones de la quinasa se detuvieron después tras la adición de 24 j l de ácido fosfórico al 2 % a cada pocillo y después se usó el Minitrak para transferir 40 j l de cada pocillo a las placas de filtración Millipore P81 de 384 pocillos prehumedecidos. Las mezclas de reacción se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente en las placas P81, seguido de cinco lavados con 100 jl/pocillo de ácido fosfórico al 1 % usando el filtro de lavado Zoom. El fondo de cada placa de filtro se selló seguido de la adición de 20 j l de Microscint 40 a cada pocillo, sellando la parte superior de las placas con la cubierta Flashplate y después esperando una hora hasta la lectura en el TopCount (PerkinElmer).

5.5.4. Ensayos basados en células HEK281

Se cultivaron células HEK293F en medio que contenía DMEM (Gibco, n.° de cat. 11965), FBS al 10 % (SAFC Biosciences, n.° de cat. 12103C), GPS 1X (glutamina, penicilina y estreptomicina). En el día uno, se sembraron las células en una placa de 10 cm, de tal manera que alcanzaron una confluencia de ~80 % en el momento de la transfección. Había aproximadamente 12 millones de células en una placa de 10 cm en el momento de la transfección. En el día dos, se transfectó cada placa con 48 ug de ADN y 144 ul de Lipofectamine 2000 (Invitrogen, n.° de cat.

11668-019). El ADN estaba compuesto por una mezcla (por cada placa de 10 cm) que contenía 3 ug de AAK1/HA/pIRES (humano de longitud completa, n.° de registro del NCBI NP_055726.2), 45 jg de Flag/AP2MI/ADNpc (humano de longitud completa) y 1,5 ml de OPTI-MEM. Lipofectamine 2000 está formado por una mezcla (por cada placa de 10 cm) que contiene 144 j l de Lipofectamine 2000 y 1,5 ml de OPTI-MEM. Cada mezcla se transfirió a tubos individuales de 15 ml y se incubó a TA durante 5 minutos y después, se combinaron las dos mezclas y se incubaron a TA durante 20 minutos. Después, se aspiró el medio de crecimiento de cada placa de 10 cm y se reemplazó con 10 ml de DMEM+FBS al 10 % (sin GPS). Finalmente, se añadieron 3 ml de mezcla de ADN/Lipofectamine a cada placa de 10 cm y se mezcló cuidadosamente, seguido de incubación de la placa durante una noche a 37 °C y CO² al 5 %.

El día tres, se diluyeron los compuestos en DMSO al 100 % a una concentración final de 1000X, seguido de diluciones seriadas 3 veces para obtener un total de 5 concentraciones analizadas. Se probaron cuatro compuestos por cada placa de 10 cm. Después, se pipeteó un ul de cada dilución de compuesto en una placa de 96 pocillos, de pocillos profundos, seguido de la adición de 500 j l de DMEM FBS al 0,5 % en cada pocillo hasta una concentración final de 2X de cada compuesto. Las células se resuspendieron en una placa de 10 cm mediante pipeteado sencillo (las células HEK293 se desprenden de la placa fácilmente en este punto) y después se transfieren a un tubo cónico de 50 ml y se sedimentaron por centrifugación a 1000 rpm durante 5 min. Después, se resuspendieron los sedimentos celulares en 2,75 ml de DMEM FBS al 0,5 % por cada placa de 10 cm y se transfirieron 100 j l de suspensión de células en cada pocillo de una placa TC de 96 pocillos. Finalmente, se añadieron 100 j l de compuesto diluido a 2X en DMEM FBS al 0,5 % FBS en pocillos que contenían suspensión celular hasta una concentración final de 1X. Después, las placas se incubaron a 37 °C y CO² al 5 % durante 3 horas seguido de la transferencia de las suspensiones de células de cada pocillo a tiras para PCR de 12 tubos. Las tiras para PCR se centrifugaron en un soporte para puntas a 1000 rpm durante 5 minutos para sedimentar las células y después se retiró el medio pipeteando sin alterar el sedimento de células.

Para preparar el análisis de transferencia Western, se resuspendieron los sedimentos celulares en 40 ul de tampón de muestra LDS-PAGE 1X (Invitrogen, n.° de cat. NP0008) fosfatasa Halt 2X y cóctel inhibidor de proteasa (Thermo Scientific, n.° de cat. 1861284), seguido de tratamiento con ultrasonidos con un emisor de ultrasonidos de micropuntas ajustado a 5 durante 8-10 segundos. Se añadieron cinco ul de agente reductor de muestras NuPage 10X (con TDT 50 mM) a cada muestra, seguido de desnaturalización térmica a 70 °C durante 10 min en la máquina de PCR. Se cargaron un total de 10 |jl por muestra en cada carril de un gel de 26 pocilios Criterion de T ris-glicina al 4-20 % (Biorad, n.° de cat. 345-0034) para la transferencia de fosfo-mu2 y 10 j l por carril en un gel de 26 pocillos NuPAGE de Bis-T ris al 4-12 % (+ tampón MES) (Invitrogen, n.° de cat. WG1403BX10) para la transferencia de mu2. Para los controles, se cargaron 2 ng de fosfo-mu2 o 20ng de proteínas mu2/Flag en el último pocillo de cada gel. Después de la SDS-PAGE, se transfirieron las muestras en cada gel a una membrana de PVDF usando un iBlot y se bloquearon las membranas durante una hora en TBST leche al 5 %, seguido de lavado 3X durante 5-10 min con TBST. Los geles Criterion se sondaron con anti-fosfo-mu2 (1:5000; un anticuerpo policlonal de conejo producido por New England Peptide y purificado por afinidad en Lexicon) en TBST BSA al 5 %, mientras que, los geles NuPAGE se sondaron con anti-Flag de ratón (1:500; Sigma, n.° de cat. F1804) en TBST leche al 5 % y estos anticuerpos primarios se incubaron durante una noche a 4 °C en un agitador.

En el día cuatro, se lavaron las transferencias de Western 3X durante 5-10 minutos con TBST, se sondaron con anticonejo-HRP (1:2000; BioRad, n.° de cat. 170-6515) o anti-ratón-HRP (1:2000; Biorad, n.° de cat. 170-6516) en TBST leche al 5 % durante 1 hora a TA, se lavaron 3X durante 10 minutos con TBST y se revelaron con reactivo ECL (GE Healthcare, n.° de cat. RPN2132) en un Versadoc. Finalmente, se configuró la cámara para tomar una fotografía cada 30 segundos durante 10 minutos y se conservó la mejor imagen con señal no saturada (cuando se satura la señal, las bandas se resaltarán en rojo) para cada transferencia. Se llevó a cabo un análisis de volumen en cada banda para obtener valores de densidad. Se calculó el porcentaje de inhibición para cada muestra normalizando en primer lugar con respecto a los niveles totales de expresión de Mu2 y después, se comparó con los controles del 0 % y 100 %. Después, se calcularon los valores de CI⁵⁰ usando el programa informático de ajuste Excel.

5.5.5. Datos in vitro

Los datos in vitro se obtuvieron datos para 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato usando los métodos descritos anteriormente. En el ensayo de P81, el compuesto midió 0,9 nM. En el ensayo basado en células HEK281, el compuesto midió 4,7 nM.

5.5.6. Ensayo de formalina

Se analizó la nocicepción de los ratones con analizadores automáticos de nocicepción (adquiridos del laboratorio Ozaki de la Universidad de California, San Diego). Se colocó una banda de metal alrededor de la pata trasera izquierda de cada ratón con superglue 30 minutos antes de la prueba. Después de un período de aclimatación de 30 minutos, se inyectaron por vía subcutánea 20 j l de formalina al 5 % en la superficie dorsal de la pata trasera izquierda. Los ratones se alojaron individualmente en cámaras cilíndricas durante 45 minutos. Se preparó una solución recién preparada de formalina al 5 % diluyendo formaldehído (Formalde-fresh al 20 %, Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ) con agua destilada. Los compuestos de investigación se administraron 30 minutos antes de la inyección de formalina.

Un programa informático registró las retiradas por minuto, retiradas totales para la Fase I (fase aguda = primeros 8 minutos) y retiradas totales para la Fase II (fase tónica entre los minutos 20 - 40) a través de un campo electromagnético. Véase Yaksh TL, Ozaki G, McCumber D, Rathbun M, Svensson C, Malkmus S, Yaksh MC. An automated flinch detecting system for use in the formalin nociceptive bioassay. J Appl Physiol., 2001; 90:2386-402.

La Figura 3 muestra los datos de la fase 1 obtenidos para el 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato en ratones macho C57, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo.

La Figura 4 muestra los datos de la fase 2 obtenidos para el compuesto en ratones C57 macho, con dosis de 1, 3, 10 y 30 mpk en comparación con el vehículo, en donde las estadísticas proporcionadas son ANOVA unidireccional P<0,01 de efecto de dosis, post-hoc de Dunnett: *P < 0,05, **P<0,01 frente al vehículo. El efecto dramático del compuesto es fácilmente evidente en el gráfico de barras de los datos proporcionados en la Figura 5.

5.5.7. Ensayo de Chung de ratón

El compuesto 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato se estudió en el ensayo de Chung. Véanse Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw, J Neurosci Methods 1994;53:55-63; Chung JM, Kim HK, Chung K., Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain, Methods Mol Med. 2004;99:35-45.

Los ratones macho híbridos de tipo silvestre (C57BL/6J-Tyr^{c' Brd} x 129S5/SvEvBrd) tenían entre 5 y 7 semanas de edad en el momento de la ligadura del nervio espinal mediante el protocolo de Chung convencional. La ligadura del nervio espinal se realizó de acuerdo con el procedimiento ideado por Kim y Chung con modificaciones. Brevemente, los ratones se anestesiaron con isoflurano (2 % a un caudal de oxígeno de 1 ml/min). Se hizo una incisión en la piel (1 cm) 1 mm a la izquierda de la línea media dorsal, usando el nivel de las crestas ilíacas como el punto medio de la incisión. Los músculos paraespinales se separaron sin rodeos medial a la cresta ilíaca para revelar procesos transversales entre el borde caudal de L4 y el borde rostral de L6 (o unión sacroilíaca en ratones que tenían sólo cinco LV). Este enfoque facilitó la identificación de los nervios espinales L4, L5 y/o L6. En un experimento inicial con ratones híbridos, las ubicaciones presuntivas del nervio espinal l5 y L6 se determinaron utilizando la unión sacroilíaca como punto de referencia para ubicar L6, como se describió previamente en modelos SNL en ratas y ratones. En experimentos de prueba compuestos usando ratones C57, la posición de los dos últimos procesos transversos lumbares en relación con la cresta ilíaca se usó para diferenciar ratones con cinco LV de aquellos con seis. Usando estos puntos de referencia óseos, el número de LV que posee un ratón se identificó con precisión en la mayoría de los casos. La identificación de los nervios espinales L4 y L5 se realizó no solo de acuerdo con su posición relevante para los procesos transversos, sino también mediante la observación macroscópica de los nervios: Los nervios espinales l3 y L4 se unieron exclusivamente en el campo quirúrgico mientras que L5 permaneció solo. Se aislaron los nervios espinales L4 y/o L5 izquierdos y se ligaron firmemente con sutura de seda 7-0. Para ligar L4, L4 se separó de L3 y se usó un gancho de vidrio para sacar la sutura debajo de L4. La ligadura de L5 se realizó pasando la sutura por debajo de L5 con un par de pinzas finas y tirando de la sutura desde el otro lado con otro par de pinzas finas. En casos muy raros cuando L3 y l4 se fusionaron bajo el proceso transversal L5, la ligadura de l4 puede realizarse en el nivel proximal al borde rostral del proceso transverso de L5. Por lo tanto, no hubo necesidad de extirpar el proceso transversal. En animales operados de forma simulada, el procedimiento quirúrgico fue idéntico al descrito anteriormente, excepto que los nervios espinales no fueron ligados. En las transecciones del nervio espinal realizadas en una cuarta cohorte de ratones, los nervios espinales L4 o L5 se cortaron usando tijeras microquirúrgicas finas al mismo nivel donde normalmente se colocarían las ligaduras. Una vez confirmada la hemostasia, la incisión se cerró en dos capas, con sutura de vicrilo 5-0 para la fascia dorsolumbar y clips para heridas para la piel. A los ratones se les administró una inyección de solución salina (1 ml) y buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg de ratón) inmediatamente después de la cirugía y buprenorfina nuevamente aproximadamente 12 y 24 horas después de la cirugía (para un total de 3 dosis) para aliviar el dolor inducido por la cirugía. Se usaron una almohadilla térmica y una lámpara de calor para mantener la temperatura corporal normal en el animal durante la cirugía. Los ratones se alojaron individualmente después del procedimiento y se controlaron hasta que se recuperaron por completo de la anestesia.

La alodinia táctil de Von Frey se evaluó probando la respuesta de quitar la pata trasera (quitarla, retirarla, lamerse) a un conjunto de filamentos de von Frey (numerados 2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 4,08 y 4,31 correspondientes aproximadamente a la fuerza de 0,04, 0,07, 0,16, 0,4, 1 y 2 gm, Stoelting Co. Wood Dale, IL) en un procedimiento arriba-abajo como lo describe Chaplan et al. Las pruebas de von Frey de referencia se llevaron a cabo antes de la cirugía y se repitieron una vez a la semana durante 3 a 6 semanas después de la cirugía, según el diseño experimental. Para las pruebas de von Frey, los ratones se colocaron en cilindros transparentes de polietilen tereftalato (25,4 cm [10"] de altura/10,79 cm [4,25"] de diámetro) con un piso de malla de alambre de %" para permitir que el experimentador aplicara el filamento de von Frey a la superficie plantar del ratón. Se probaron ambas patas. El primer filamento de von Frey aplicado fue 3,61. Si no se obtuvo respuesta, se presentó el siguiente filamento más fuerte. Si había una respuesta, se presentaba el siguiente filamento más débil. Hubo un total de seis presentaciones de filamentos de von Frey (si el animal no respondía al filamento más fuerte, 4,31, la prueba se terminó). El umbral de retirada del 50 % se calculó para cada pata usando el método de hacia arriba hacia abajo. Los ratones que exhibieron un umbral de retirada del 50 % por debajo de 2 en cualquier pata durante la prueba inicial se excluyeron de la cirugía y de una evaluación adicional. Los experimentadores de la prueba de Von Frey siempre estaban ciegos a la naturaleza de la cirugía y el tratamiento.

Para reducir la actividad locomotora exploratoria, los ratones se habituaron a las cámaras de prueba durante 60 minutos el día antes de la prueba de referencia previa a la cirugía y durante 30 minutos en las cámaras antes de la prueba de von Frey en la que se administró un compuesto. El ruido blanco estuvo encendido en la sala de pruebas durante todo el experimento.

Como se muestra en la Figura 6, el compuesto 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato exhibió un efecto dependiente de la dosis significativamente significativo en el ensayo de Chung. En términos generales, P<0,0001 en RM ANOVA; post-hoc de Dunnett: **P < 0,01, ***P<0,001 frente al vehículo.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un inhibidor de AAK1 y un fármaco antiinflamatorio, en donde el inhibidor de AAK1 es 3-metiloxetan-3-il-4-(3-(2-metoxipiridin-3-il)pirazolo[1,5-a]pirimidin-5-il)piperazina-1-carboxilato:

o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el inhibidor de AAK1 es cristalino.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 2, en donde el inhibidor de AAK1 tiene un punto de fusión de aproximadamente 182,5 °C.

4. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el fármaco antiinflamatorio es un glucocorticoide.

5. La composición farmacéutica de la reivindicación 4, en donde el glucocorticoide es aldosterona, beclometasona, betametasona, cortisona, desoxicorticosterona, dexametasona, fludrocortisonas, hidrocortisona, metilprednisolona, prednisolona, prednisona, triamcinolona o una sal farmacéuticamente aceptable de las mismas.

6. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, en donde el fármaco antiinflamatorio es un AINE.

7. La composición farmacéutica de la reivindicación 6, en donde el AINE es un salicilato, ácido arilalcanoico, ácido arilpropiónico, ácido arilantranílico, derivado de pirazolidina, oxicam, inhibidor de COX-2 o sulfonanilida.