KR20070046906A

KR20070046906A - 위장관 기질적 종양 치료를 위한 미도스타우린의 용도

Info

Publication number: KR20070046906A
Application number: KR1020077004952A
Authority: KR
Inventors: 장 쿨스
Original assignee: 노파르티스 아게
Priority date: 2004-08-31
Filing date: 2005-08-30
Publication date: 2007-05-03
Also published as: CA2576926C; JP4970262B2; WO2006024494A1; MX2007002415A; RU2410098C2; BRPI0514765A; US20090075972A1; EP1799226A1; AU2005279344A1; CN101010082A; AU2005279344B2; RU2007111754A; JP2008511572A; CA2576926A1

Abstract

본 발명은 위장관 종양의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 유리 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태의 미도스타우린의 용도, 및 상기 질환 또는 증상을 앓는 온혈동물, 바람직하게는 인간에게 치료적 유효량의 미도스타우린을 투여하는 것을 포함하는, 상기 동물의 치료 방법에 관한 것이다.

미도스타우린, 이마티니브, 위장관 종양.

Description

위장관 기질적 종양 치료를 위한 미도스타우린의 용도 {USE OF MIDOSTAURIN FOR TREATING GASTROINTESTINAL STROMAL TUMORS}

본 발명은 화합물 I에 대해 저항력이 있는 위장관 기질적 종양, 예를 들어 위장관 종양의 치료를 위한 제약 조성물의 제조에 있어서 유리 형태 또는 제약상 허용되는 염 형태의 미도스타우린의 용도, 및 상기 언급된 질환 또는 증상을 앓는 온혈동물, 바람직하게는 인간을 치료적 유효량의 미도스타우린으로 치료하는 방법에 관한 것이다.

도 1의 설명.

패널 B: KIT ΔWK557-558/T670I, PDGFRA D842V 또는 ΔDIM842-844 변이를 발현하는 Ba/F3 세포에 대한 이마티니브 또는 PKC412의 투여량 반응 곡선.

위장관 기질적 종양은 최근에 위장관에서 기원한 (모든 GIST 중 60 내지 70％가 위에서 기원한 것임) 간엽 신생물로 특성화된 부류이다. 과거에는, 이들 종양은 평활근종, 평활근모세포종 또는 평활근육종으로 다양하게 분류되었다. 그러나, 이제는 GIST가 이들의 독특한 분자적 발병기전 및 임상적 특성에 기초한 질환의 뚜렷한 임상병리적 세트를 나타낸다는 것이 명백해졌다.

GIST는 상대적으로 드문 증상으로, 측정된 발병률이 백만 명당 약 20 케이스이며, GIST는 위장관의 가장 흔한 간엽 신생물이다. 최근까지 적용가능한 요법은 외과적 절제술뿐이었다. 종래의 세포독성 화학요법 및 방사선 요법의 유용성은 제한되어 일정하게 진행하는 치명적인 증상인 진전된 GIST를 야기하며, 환자의 중앙 생존기간은 20개월 (예를 들어, 전이성 GIST)부터 1년 또는 그 미만 (예를 들어, 수술-후 재발)으로 다양하다.

대다수의 GIST에서 가장 큰 원인이 되는 종양형성 분자적 사건은 KIT 또는 혈소판-유도 성장인자 수용체 A, 약어로 PDGFRA의 활성화 변이이다. 이러한 결과로, 신호전달 경로는 세포 증식 및/또는 생존을 증진시키도록 활성화된다. 이마티니브 메실레이트는 수용체 티로신 키나제 PDGFR, KIT, ABL 및 ARG를 특이적으로 억제하며, GIST 환자에서 높은 반응률을 유도한다. 지금까지, 이마티니브 요법은 이 질환에 대해 유일하게 효과적이고, 전신적인 치료로 남아있다. 임상적이고 실험적인 관찰은, 종양에서 치료에 가장 민감한 KIT 엑손 11 변이를 갖는 KIT/PDGFRA 변이의 존재 및 유형에 대한 반응과 연결된다. 키나제 촉매 도메인에 영향을 미치는 KIT-D816V 및 PDGFRA-D842V 변이는 이마티니브의 결합을 막아, 약물이 일차적으로 비효율적이 되도록 한다. 대부분의 GIST 환자는 약물에 대한 초기 반응의 정도를 달리한 후, 요법을 받는 동안 내성이 발달한다. 이마티니브로 치료되는 다른 악성 종양, 예컨대 만성 골수성 백혈병 (CML), 또는 만성 호산구성 백혈병 (CEL)의 조사 결과, 이 억제제에 대한 내성이 뚜렷한 분자적 메커니즘에 의해 야기될 수 있다고 나타났다. 이마티니브-내성이 있는 대부분의 CML 환자는, 신규 변이체 BCR-ABL 대 립유전자를 보유하거나 BCR-ABL 증폭으로 인해 보다 높은 수준의 융합 단백질을 발현시키는 백혈병 세포의 클론 확장을 갖는다. CEL에서 이마티니브에 대한 내성의 발달은 FIPL1-PDGFRA 융합 단백질의 촉매 도메인 내의 2차 변이와 관련이 있을 수 있다. 질환의 이마티니브-내성 진행 단계인 GIST 환자에서의 예비 연구 결과, 대부분의 종양에서 KIT 활성화가 여전히 지속되어 기능적 역할을 수행하며, 환자의 일부집단에서 원인 인자로서 KIT 키나제 도메인에서의 획득된 변이 또는 KIT 유전자의 게놈 증폭을 갖는 것으로 나타났다.

이마티니브는 진전된 GIST 환자를 치료하는 데 있어서 최근에 가치가 알려진, 특정 티로신 키나제를 선택적으로 억제하는 소분자이다. GIST 치료에 대한 단일요법으로서의 이마티니브의 용도는 참고로 본원에 포함되는 PCT 공개 제WO 02/34727호에 기재되어 있다. 그러나, 이마티니브에 대한 1차 내성이 환자군, 예를 들어 한 연구에서는 환자의 13.7％에 존재하는 것으로 보고되었다. 또한, 다수의 환자는 이마티니브로 치료하는 것에 대해 내성을 획득한다. 더욱 일반적으로 이러한 내성은 일부 병변에서 부분적으로 진행되지만, 다른 병변에서는 질환 조절을 지속한다. 따라서, 이들 환자는 이마티니브 치료를 유지하지만, 추가 또는 대체적 요법에 대한 요구가 명백하다.

이마티니브는 하기 화학식 I의 4-(4-메틸피페라진-1-일메틸)-N-[4-메틸-3-(4-피리딘-3-일)피리미딘-2-일아미노)페닐]-벤즈아미드이다.

이마티니브의 제조, 및 특히 항-종양제로의 그의 용도는 1993년 10월 6일에 공개된 유럽 특허 출원 제EP-A-O 564 409호의 실시예 21, 및 다수의 다른 국가에서의 동등한 출원 및 특허, 예를 들어 전문이 참고로 본원에 포함되는 미국 특허 제5,521,184호 및 일본 특허 제2706682호에 기재되어 있다.

놀랍게도, 단백질 키나제 C 억제제인 미도스타우린이 위-장관 기질적 종양의 치료, 예를 들어 이마티니브-내성 위장관 기질적 종양의 치료에 유용한 치료적 특성을 갖는다는 것이 밝혀졌다.

단백질 키나제 C (본원에서 하기 PKC로 약칭됨)는 세포 신호 전달 경로에서 주요한 효소 중 하나이며, 세포 증식 및 분화의 조절에서 중추적 역할을 한다. PKC는 세린/트레오닌 키나제의 한 부류이다. 12가지 이상의 PKC의 동형 (isoform)이 확인되었으며, 이들은 통상적으로 구조 및 기질 요건에 기초하여 세 집단으로 나뉜다. PKC 발현은 정상 유방 조직과 비교하여 인간 유방 종양 생검에서 증가되는 것으로 밝혀졌고, 높은 PKC 발현은 인간 성상세포종에서 악성에 대한 생물학적 마커로 고려되어 왔다. PKC 동형 중 하나인 PKCθ는 T 세포에서 생존 신호전달의 양성 조절자이다. 흥미롭게도, PKCθ는 GIST에서 구조적으로 인산화된다. 따라서, PKCθ는 GIST에서 치료적 중재를 위한 잠재적 표적 키나제로 고려될 수 있다. 특히, PKC 억제제는 이마티니브 내성 GIST의 치료에 있어서 이점이 있다.

따라서, 본 발명은 GIST 환자, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST 환자에게 미도스타우린을 투여하는 것을 포함하는, GIST의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 미도스타우린은 화학식 II의 N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,1O,11,12,13-헥사히드로-10-메톡시-9-메틸-1-옥소-9,13-에폭시-1H,9H-디인돌로[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]피롤로[3,4-j][1,7]벤조디아조닌-11-일]-N-메틸벤즈아미드 또는 그의 염이며, 이하 "화학식 II의 화합물 또는 미도스타우린"으로 지칭한다.

화학식 II의 화합물 또는 미도스타우린 [국제 일반명; International Nonproprietary Name]은 PKC412로도 공지되어 있다.

미도스타우린은 자연 발생적인 알칼로이드 스타우로스포린의 유도체이며, 1988년 12월 21일자로 공개된 유럽 특허 제0 296 110호뿐만 아니라, 1992년 3월 3 일자로 공개된 미국 특허 제5,093,330호 및 일본 특허 제2 708 047호에 상세하게 기재되어 있다. 이들 문헌에 기재된 미도스타우린은 참고로 본원에 포함된다. 미도스타우린 및 그의 제조 방법은 당업자에게 익히 공지된 다수의 문헌에 상세하게 기재되어 있다.

각 경우에서, 특허 출원 또는 과학적 간행물에서 특히 미도스타우린에 대해 언급된 경우, 최종 생성물, 제약 제제 및 청구항의 주요-사항은 본원에 참고로 포함된다.

본원에서 사용된 용어 "이마티니브-내성있는 또는 이마티니브-내성"은 위장관 기질적 종양의 치료에서 이마티니브의 치료 효과의 결여, 감소 또는 손실을 나타낸다.

본 발명은 이하 약어 GIST로 지칭되는 위장관 기질적 종양, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료용 의약의 제조를 위한 PKC412로도 공지된 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도, 및 GIST의 치료가 필요한 인간을 비롯한 온혈동물에게 유효량의 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여함으로써 GIST를 앓는 상기 동물을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST 환자에게 미도스타우린을 투여하는 것을 포함하는, GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료 방법에 관한 것이다.

상기 언급된 질환 및 증상의 치료에 사용될 미도스타우린의 정확한 투여량은 숙주, 치료될 증상의 성질 및 중증도, 투여 방식을 비롯한 몇 가지 인자에 따라 달 라진다. 일반적으로, 미도스타우린이 비경구, 예를 들어 복막내, 정맥내, 근육내, 피하, 종양내 또는 직장에 투여되거나, 또는 장내, 예를 들어 경구 투여되고, 정맥내 또는 경구 투여되는 것이 바람직하고, 정맥내 투여되는 경우 1일 투여량이 체중 1 kg 당 0.1 내지 10 mg, 바람직하게는 체중 1 kg 당 1 내지 5 mg인 경우에 만족스러운 결과가 달성된다. 인간 실험에서, 1일 총투여량 225 mg이 생각컨대 최대 내성 용량 (Maximum Tolerated Dose; MTD)일 것이다. 바람직한 정맥내 1일 투여량은 체중 1 kg 당 0.1 내지 10 mg이거나, 대부분의 큰 영장류에 대해서는 1일 200 내지 300 mg이다. 전형적 정맥내 투여량은 1주에 3 내지 5회로 3 내지 5 mg/kg이다.

미도스타우린은 1일 약 300 mg까지의 투여량, 예를 들어 1일 100 내지 300 mg으로 경구 투여된다. 미도스타우린은 단일 투여 또는 1일 2 또는 3회, 바람직하게는 2회 용량으로 분할 투여된다. 특히 중요한 투여량은 1일 200 내지 225 mg, 특히 1일 100 mg씩 2회 (1일 총 200 mg)이다. 투여량의 상한은 부작용에 의해 정해지고, 치료될 환자에 대한 실험에 의해 결정될 수 있다.

본 발명은 또한 1 내지 6주 동안 1주에 7 내지 4회 또는 기간의 약 100％ 내지 약 50％ 동안 투여되고, 이어서 1 내지 3주 동안 제제를 투여하지 않는 이 주기를 1회 내지 수회 반복하여 치료적 유효량의 미도스타우린을 포유동물 대상체에게 투여하는 방법에 관한 것이다.

일반적으로, 소량의 투여량이 초기에 투여되고, 치료되는 숙주에 대해 최적의 투여량이 결정될 때까지 투여량은 점진적으로 증가된다. 투여량의 상한은 부작용에 의해 정해지고, 치료될 숙주에 대한 실험에 의해 결정될 수 있다.

미도스타우린은 1종 이상의 제약상 허용되는 담체, 및 임의로 1종 이상의 기타 종래의 제약 보조제와 합해질 수 있고, 정제, 캡슐제, 캐플릿제 등의 형태로 장, 예를 들어 경구투여되거나, 살균 주사가능한 용액 또는 현탁액의 형태로 비경구, 예를 들어 복막내 또는 정맥내 투여될 수 있다. 경구 및 비경구용 조성물은 종래의 수단에 의해 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 주입 용액은 바람직하게는 살균된다. 이는, 예를 들어 살균 여과막을 통한 여과에 의해 용이하게 달성될 수 있다. 액체 형태의 임의의 조성물의 무균 제제, 바이알의 무균 충전제 및/또는 무균 조건 하에 본 발명의 제약 조성물과 적당한 희석제를 합한 것은 당업자에게 익히 공지되어 있다.

미도스타우린은 상기 언급된 질환 및 증상을 치료하기에 효과적인 양의 활성 물질을 함유하는 경구 및 비경구용 제약 조성물로 제제화될 수 있으며, 그러한 조성물은 단위 투여 형태이며, 제약상 허용되는 담체를 포함할 수 있다.

유용한 조성물의 예는 유럽 특허 제0 296 110호, 동 제0 657 164호, 동 제0 296 110호, 동 제0 733 372호, 동 제0 711 556호, 동 제0 711 557호에 기재되어 있다.

바람직한 조성물은 1995년 6월 14일에 공개된 유럽 특허 제0 657 164호에 기재되어 있다. 기재된 제약 조성물은 포화 폴리알킬렌 글리콜 글리세리드 중 미도스타우린의 용액 또는 분산액을 포함하며, 여기서 글리콜 글리세리드는 글리세릴과 하나 이상의 C₈-C₁₈ 포화 지방산의 폴리에틸렌 글리콜 에스테르의 혼합물이다.

본 발명은 미도스타우린을 이마티니브와 함께, 순차적으로 또는 개별적으로 투여하지 않는 조건의 GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST 치료용 의약의 제조를 위한 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 이마티니브가 상기 GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료를 위해 사용되지 않는 것인, GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료를 위한 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 미도스타우린이 GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료용 항-종양제로 사용되는 것인, 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 추가로 GIST, 예를 들어 이마티니브-내성 GIST의 치료를 위한, 미도스타우린 또는 그의 염의 사용에 대한 지침을 포함하는 미도스타우린 패키지에 관한 것이다.

본 발명의 한 측면에서는, GIST의 치료가 필요한 온혈동물, 특히 인간에게 GIST에 대한 치료적 유효량으로 미도스타우린을 투여하는 것을 포함하는, GIST의 치료 방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 유효량의 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, GIST를 앓는 환자의 치료 방법을 제공한다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 GIST를 앓는 환자에게 유효량의 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, GIST를 앓는 환자의 치료 방법을 제공하며, 여기서 미도스타우린은 경구 제약 제제로 1일 100 내지 300 mg, 특히 1일 150 내지 250 mg, 가장 특히 1일 200 mg의 투여량으로 투여된다.

실시예 I: 미도스타우린 제약 제제

조성물 A:

겔루시르 (Gelucire) 44/14 (82 중량부)를 60℃로 가열하여 용융시켰다. 분말 미도스타우린 (18 중량부)을 용융된 물질에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 균질화시키고, 이로써 수득된 분산액을 다른 크기의 경질 젤라틴 캡슐에 넣어, 일부는 미도스타우린 25 mg의 투여량을 함유하고, 다른 것은 75 mg의 투여량을 함유하도록 하였다. 생성된 캡슐은 경구 투여에 적합하다.

조성물 B:

겔루시르 44/14 (86 중량부)를 60℃로 가열하여 용융시켰다. 분말 미도스타우린 (14 중량부)을 용융된 물질에 첨가하였다. 상기 혼합물을 균질화시키고, 이로써 수득된 분산액을 다른 크기의 경질 젤라틴 캡슐에 넣어, 일부는 미도스타우린 25 mg의 투여량을 함유하고, 다른 것은 75 mg의 투여량을 함유하도록 하였다. 생성된 캡슐은 경구 투여에 적합하다.

가테포세 (Gattefosse)에서 시판되는 겔루시르 44/14는 약 1500의 분자량을 갖는 폴리에틸렌 글리콜 및 글리세롤과 C₈-C₁₈ 포화 지방산의 에스테르의 혼합물이며, 지방산 성분의 조성물에 대한 상세설명은 중량 기준으로 4 내지 10％ 카프릴산, 3 내지 9％ 카프르산, 40 내지 50％ 라우르산, 14 내지 24％ 미리스트산, 4 내 지 14％ 팔미트산 및 5 내지 15％ 스테아르산이다.

겔루시르 제제의 바람직한 예는 다음과 같이 구성된다:

겔루시르 (44/14): 47 g

미도스타우린: 60 mL의 뒤틀림 플라스크 (Twist off flask)에 충전된 3.0 g

조성물 C: 연질 젤의 예는 하기 마이크로에멀젼을 함유할 것이다:

옥수수오일 글리세리드 85.0 mg

폴리에틸렌글리콜 400 128.25 mg

크레모퍼 (Cremophor) RH 40 213.75 mg

미도스타우린 25.0 mg

DL 알파 토코페롤 0.5 mg

무수 에탄올 33.9 mg

총 486.4 mg

실시예 2:

PKC412는 종래의 PKC, FLT3, PDGFR, VEGFR, KIT 및 CDK 1-사이클린 B 복합체의 ATP 결합 부위와 강하게 상호작용한다. 특히, PKC412는 난치성 CEL 환자에서 FIPL1-PDGFRA의 이마티니브-내성 T674I 변이체 형태에 대한 완전한 억제 활성을 나타냈다 (예를 들어, 문헌 [Cools J., et al., Cancer Cell 2003;3:459-469] 참조). 티로신 키나제의 촉매 부위는 고도로 보존되고, PDGFRA에서의 T674I 변이는 각각 진행중인 BCR-ABL 양성 CML 환자 및 KIT 변이 GIST 환자에서의 내성 변이인, ABL에서 T315I 변이 및 KIT에서 T670I 변이에 상응한다. 이마티니브로 다루기 어려운 GIST 환자 26명에서 이마티니브에 대한 내성의 메커니즘을 조사하고, 이들 환자에서 재발된 KIT-T670I 또는 -V654A, 및 PDGFRA-D842V 키나제 도메인 변이로 인한 이마티니브에 대한 임상적 내성을 극복하기 위한 PKC412의 용도를 탐구하였다.

물질 및 방법

환자: 루벤 대학 병원 종양학과 (Department of Oncology, University Hospital Leuven)에서 이마티니브로 치료된 환자 26명으로부터 진행중인 종양을 평가하였다. 그 대상은 평균 연령 53세 (37 내지 77세 범위)의 남성 20명 및 여성 6명이었다. 26명 중 22명의 환자가 1차 종양을 수술로 제거하였다. 이마티니브 치료 전에 화학요법 및/또는 방사선요법을 환자 13명에게 질환이 진전된 단계에서 적용하였다. 종양은 진행중이지만 그 외에는 우수한 임상적 증상을 보이는 환자에게는 1일 1000 mg까지 투여량을 증가시키는 것이 적합하였다. 투여량의 단계적 확대 결정은 4주 이상 치료된 환자로부터의 데이터에 기초하였다. 그 후부터 1달, 3달, 및 6달마다 병변을 재조사하였다. 진행은 임상적 조사 및 CT/PET 영상화에 기초하였으며, 이전에 공개된 기준에 따라 정의하였다 (예를 들어, 문헌 [Van Oosterom AT et al., Lancet 2001;358:1421-1423] 참조). 치료 동안 조직병리학적 및 분자적 변화를 일련의 종양 생검의 수단에 의해 동의하에 선택된 환자에서 평가하였다.

병리: 조직병리학 및 면역조직화학 분석은 파라핀 포매된 조직에서 수행하였다. CD117에 대한 다클론 항체 (A4502, 1/250 희석, DAKO, Denmark) 및 아비딘-비오틴-퍼옥시다제 복합체를 임의의 항원 복구 없이 사용하였다.

형광동소교잡법 (Fluorescence in situ hybridization; FISH): 이중-색깔 간 기 FISH 분석을 이마티니브 치료 전에 얻은 종양 생검의 4 μm 파라핀 포매된 조직 단편 (18 케이스), 또는 이마티니브-내성 병변의 새로운 생검으로부터의 촉진 표본 (모든 26 케이스)에서 수행하였다. KIT/4q12 (RP11-568A2) 또는 PDGFRA/4q12 (RP11-24O11)에 대한 디곡시제닌 (Digoxigenin) 또는 비오틴 표지된 BAC 콜론은 스펙트럼그린- 또는 스펙트럼오렌지-표지된 염색체 4 동원체 프로브 (CEP4, 비시스 인크. (Vysis Inc., Downers Grove, IL, USA))와 각각 상기 기술된 바와 같이 공동-교잡시켰다. FISH 데이터를 냉각된 흑색 및 백색 하전된 커플 장치 카메라 (포토메트릭스 (Photometrics, Tuscon, AZ))가 장착되고, 큅스 스마트캡쳐 (Quips SmartCapture) TM FISH 영상화 소프트웨어 (비시스 (Bergisch-Gladbach, Germany))로 작동되는 레이카 (Leica) DMRB (레이카 (Wetzlar, Germany)) 형광 현미경으로 수집하였다. 100개의 간기 핵을 측정하고, KIT/PDGFRA 대 CEP4의 비를 계산하였다. 비율이 2 이상이면 특정 KIT/PDGFRA 증폭으로 정의하였다.

서열 분석: 게놈 DNA를 고순도 PCR 주형 제조 키트 (로헤 (Roche, Mannheim, Germany))를 사용하여 동결-냉동된 조직으로부터 추출하였다. KIT의 엑손 9, 11, 13, 14, 15 및 17, 및 PDGFRA의 엑손 12 및 18을 이전에 기술된 바와 같이 폴리머라제 연쇄 반응 (PCR)에 의해 증폭시켰다 (예를 들어, 문헌 [Debiec-Rychter M et al., J Pathol 2004;202:430-438] 참조). PCR 생성물을 정제하고 (마이크로콘 PCR (Microcon PCR, Millipore, MA, USA)), 트랜스게놈 웨이브 DHPLC 시스템 (DHPLC; 트랜스게노믹, 인크. (Transgenomic, Inc., UK))에서 변성 고성능 액체 크로마토그래피로 변이에 대해 스크리닝하였다. 비정상 용리 프로파일을 나타내는 샘플을 재 증폭시키고, 시퀀싱하였다.

웨스턴-블랏팅: 세포 용해물을 제조하기에 충분한 동결-냉동된 종양 표본을 10개의 난치성 GIST로부터 얻을 수 있었다. 세포 용해, SDS-PAGE 및 면역블랏팅을 기재된 바와 같이 수행하였다 (21). 막 (아머샴 파마시아 바이오테크놀로지 (Amersham Pharmacia Biotechnology, UK))을 1:500으로 희석된 항-포스포-KIT (Y703) (지메드 (Zymed, San Francisco, CA)) 항체를 사용하여 밤새 면역블랏팅하였다. HRP-접합된 항-래빗 IgG를 1:2500으로 희석하여 사용하고, 증진된 화학발광 (Enhanced Chemiluminescence; 피어스 (Pierce))으로 가시화하였다. 이어서 막을 벗기고, 다시 블랏팅하여 항체 인식 총 KIT 단백질 (항-CD117, A4502, 다코 (DAKO, Glostrup, Denmark))을 사용하여 총 단백질 수준을 결정하였다.

1차 내성 GIST 세포 반응 분석: 이마티니브 메실레이트 및 PKC412, 결정질 화합물을 100％ DMSO (시그마 (Sigma)) 중 10 mM에서 용해시키고, 분취액을 -80℃로 유지시켰다. 10 mM 원액을 연속 희석시켜 실험을 수행하였다. 대조실험은 용매 (DMSO)를 희석시켜 수행하였다. 100-mm 세포 배양 접시 (Corning Inc., Corning, NY)에서 60-70％ 합류에서 시딩된 콜라게나제 분해된 진행중인 종양 표본으로부터 1차 세포를 얻고, 이를 10％ 태아 소 혈청, 0.1 mM 비필수 아미노산 및 1.0 mM 나트륨 피루베이트로 보충된 DMEM에서 3일 동안 배양하였다. 세포를 이마티니브 메실레이트, PKC412 또는 비히클 단독에 90분 동안 노출시키고, 차가운 PBS 10 ml로 세척하고, 완충액 [완전 프로테아제 억제제 칵테일 정제 (보에링거 만하임 게엠베하 (Boehringer Mannheim GmbH. Mannheim, Germany)) 및 0.2 mM 나트륨 오르 토바나데이트 (시그마 (St. Louis, MO))으로 보충된 1％ NP40, 50 mM 트리스-HCl pH 8.0, 150 mM NaCl]에서 용리시켰다.

작제: 변이체 PDGFRA 및 KIT cDNA를 진행중인 종양으로부터 단리된 RNA 상에서 RT-PCR에 의해 얻었다. cDNA를 레트로바이러스 벡터 pMSCV-푸로 (puro) (클론테크 (Clontech)로 클로닝하였다.

세포 배양: 293T 세포를 10％ FCS로 보충된 DMEM에서 배양하였다. Ba/F3 세포를 10％ FCS 및 인터루킨-3 (1 ng/ml)으로 보충된 RPMI-1640에서 배양하였다. 상기 기재된 바와 같이 바이러스를 생산하였다 (예를 들어, 문헌 [Cools J, et al., N Engl J Med 2003;348:1201-1214]).

상이한 작제물로 형질도입된 Ba/F3 세포를 푸로마이신 (2 μg/ml)으로 선택하였다. 인자 독립적 배양에 대한 시험을 위해, Ba/F3 세포를 PBS에서 3회 세척하고, 새로운 배양액으로 인터루킨-3의 부재 하에 초기화하였다. 인터루킨-3에 대해 독립적이 된 세포를 인터루킨-3의 부재 하에 유지하였다. 투여량-반응 곡선을 위해, Ba/F3 세포를 상이한 농도의 억제제와 함께 24-웰 플레이트에서 성장시켰다. 생존가능한 세포의 수는 아쿼오우스원 용액 (AqueousOne solution; 프로메가 (Promega))을 사용하여 시작할 때 및 24시간 후에 결정하였다.

결과: 이마티니브로 치료된 환자 26명으로부터의 진행중인 종양을 평가하였다. 진단에서 질환의 악성 증명까지의 평균 시간은 48주 (0 내지 265주 범위)이고, 진단에서 이마티니브 치료까지의 평균 시간은 91주 (6 내지 304주 범위)였다. 15명의 환자 (57.6％)에서 부분적 경감이 달성되었고, 10명의 환자 (38.4％)에서 이마티니브 치료 동안 무사고 생존의 평균 지속 기간이 48주 (16 내지 200주 범위)인 안정한 질환을 나타내었다.

조직병리학: 25개의 1차 GIST는 방추형 세포를 나타내고, 하나는 혼합된 형태를 가졌다. CD117 항원 발현은 각각의 1차 종양 및 24/26 (92％)개의 진행중인 생검에서 증명되었다. 2개의 이마티니브-내성 GIST는 이들의 조직학적 외형이 방추형에서 상피모양의 유형으로 전환되었고, 이들의 면역표현형은 CD117 음성이었다 (데이터는 제시되지 않음).

변이 분석: D-HPLC 및 직접적 시퀀싱의 조합은 기준-선 GIST 생검 25/26 (96.1％)에서 KIT 변이를 나타냈다 (표 1 참고). 19개의 종양은 엑손 11 막근접 (juxtamembrane) 변이를 보유하였고, 6개는 엑손 9 변이를 가졌다. 예비-치료 종양 표본은 PDGFRA에서의 변이 또는 KIT에서의 하나 이상의 변이를 갖지 않았다. 1개의 종양은 조사된 엑손에서 확인가능한 KIT 또는 PDGFRA 서열 변경을 갖지 않았다. KIT 키나제 도메인의 점 변이는 이마티니브 치료 전에 종양에서 검출되지 않았지만, 6개의 뚜렷한 2차 KIT 변이가 요법에서 평균 77주 (16 내지 188주 범위) 후, 진행시기에서 26명 중 12명의 환자 (48％)에서 확인되었다. 4명의 환자는 V654A를 가졌고, 3명의 환자는 T670I 치환을 가졌으며, 나머지 환자는 D716N, D816G, D820Y, D820E 또는 N822K 변이를 가졌다. 원래의 KIT G565R 변이가 있는 1명의 환자는 이 환자의 1차 종양에서 검출되지 않은 PDGFRA에서의 D842V 점 변이를 획득하였다.

FISH 분석: FISH 분석 결과, 진행중인 종양 26개 중 2개 (7 7％)에서 KIT의 증폭이 나타났다. 26명의 환자의 1차 비-반응성 종양에서, KIT 증폭은 PDGFRA의 동시적 증폭과 관련이 있다 (데이터는 제시되지 않음). KIT 또는 PDGFRA 변이는 치료 전이나 질환의 진행 동안에도 이 환자의 종양에서 발견되지 않았다. 한 환자에서, KIT 증폭 (5배까지)은 증가된 PDGFRA 복사 수와 관련이 없었다. 이 케이스는 1차 KIT 변이를 보유하지만, 2차 변이는 진행 동안 확인되지 않았다. 6개의 이마티니브-내성 표본에서, KIT/PDGFRA/CEP4 유전자좌의 손실은 간기 FISH 분석에 의해 나타났다. 종양 중 3개에서, 이 반접합체는 기준-선 종양 생검에서 이미 관찰된 한편, 다른 3개의 표본에서는 진행중인 병변에서만 존재하였다. 그러나, 후자 내에서 핵 당 KIT/CEP4 신호의 수에서의 현저한 이질성에 부딪혔다 (0 내지 4의 범위). 특히, 한 환자의 진행중인 종양 생검에서 23％의 세포는 KIT/PDGFRA/CEP4의 이-대립인자 손실을 나타냈다.

내성이 있는 GIST에서 KIT 활성화: 10개의 이마티니브-내성 GIST에서 KIT 활성화는 KIT 포스포티로신 Y703 및 총 KIT에 대한 항체로 웨스턴 블랏팅하여 평가하였다. 8개의 표본은 KIT 발현 및 다양한 수준의 구조적 KIT 자가인산화 (autophosphorylation)를 증명하였다. 이 8개 종양 중 4개는 2차 KIT 변이를 가졌으며, 나머지 4개에 대해서는 이마티니브-내성 종양 세포에서 KIT의 재-활성화에 대한 이유가 알려지지 않았다. 2개의 내성이 있는 전이성 종양은 전체적으로 KIT 발현이 결여되었는데, 이는 면역조직화학에 의한 CD117-양성도의 손실과 일치하였으며, 한 케이스에서는 KIT 유전자좌의 이-대립인자성 손실이 관찰되었다.

이마티니브 및 PKC412에 대한 내성 GIST의 생체외 반응: KITΔ557- 558/T670I 또는 KITInsAY502-503/V654A 변이체 동형을 보유한 배양된 이마티니브-내성 세포에서 KIT Y703 잔기의 자가인산화에 대한 이마티니브 및 PKC412의 효과를 웨스턴 블랏팅에 의해 결정하였다. 그 결과를 반접합성 KIT K642E 변이를 갖는 GIST882 세포와 비교하였다. 관찰은 항-KIT 항체를 사용하여 총 KIT 발현에 대해 표준화시켰다. KIT 단백질은 KITΔ557-558/T670I 및 KITIns503AY/V654A 둘 다에 내성이 있는 종양, 및 이들의 시험관내 배양된 세포 대응부 둘 다에서 상당한 수준으로 발현되고 인산화되었다. KIT의 자가인산화는 이마티니브에 대한 1차 세포주 (5 μM까지)의 노출에 의해 영향받지 않았다. 대조적으로, 0.5 μM PKC412는 변이체 KITΔ557-558/T670I 세포의 KIT 자가인산화를 감소시키고, 1 μM PKC412는 이를 전체적으로 억제하였다. 유사하게, 변이체 KITIns503AY/V654A의 KIT 자가인산화는 0.5 μM의 농도에서 PKC412에 의해 이미 감소되고, 약물의 10배 높은 농도에서 완전하게 억제되었다.

시험관내의 KIT 및 PDGFM 변이에 대한 이마티니브 및 PKC412의 효과: KIT Δ557-558/T670I, 및 PDGFRA ΔDIM842-844 및 D842V의 변이 형태는 Ba/F3 뮤린 세포에서 발현시켰다. Ba/F3 세포는 이들의 성장에 대해 IL3 의존성이지만, 다수의 활성화된 키나제, 예컨대 FIPIL1-PDGFRA 및 BCR-ABL의 발현에서는 IL3 독립적이 된다. Ba/F3 세포로 도입된 변이 KIT 및 PDGFRA 단백질은 인자 독립적인 성장을 부여하고, 구조적으로 인산화되어 이들이 활성화된 키나제임을 확인시켰다 (데이터는 제시되지 않음). 투여량 반응 곡선 및 KITΔ557-558/T670I의 인산화 상태의 이마 티니브로의 분석은 10 μM 이마티니브 (세포 IC₅₀ 약 5 μM)에서 완전히 억제되지 않은 인산화로 이마티니브에 대한 내성을 확인하였다. PDGFRA D824V 변이체는 보다 적은 범위 (세포 IC₅₀ 약 1 μM)에서도 이마티니브에 대한 내성을 나타냈다. PDGFRA ΔDIM842-844 변이체는 이 실험에서 대조군으로 작용하였다. 3개의 변이체 모두는 1 μM 미만의 농도에서 PKC412에 의해 억제되었으며, PDGFRA D842V가 약 200 nM의 가장 높은 세포성 IC₅₀ 값을 갖는다 (도 1 참조).

예비 연구는 이마티니브 내성의 두 카테고리: KIT-의존성 또는 KIT-독립성 메커니즘을 설명하였다 (15). 본 연구의 결과를 기준으로, 본 발명자들은 KIT의 재-활성화가 내성에 대한 가장 중요한 메커니즘이라고 결론을 내렸다. KIT는 진행중인 종양 8/10에서 인산화 (활성화)되는 것으로 밝혀졌으며, 이는 이마티니브 치료 동안 웨스턴 블랏팅에 의해 분석될 수 있다. 이 케이스의 50％에서, KIT의 재활성화는 2차 내성 변이의 결과인 한편, 다른 50％에서의 재활성화의 원인은 알려지지 않았다. 이들 샘플의 총체적 KIT 시퀀싱은 단백질이 이마티니브 치료에 대해 둔감해지도록 하는 KIT의 예상치 못한 영역에서 새로운 변이를 확인시킬 수 있다. 별법으로, 세포내 약물 전달 또는 제거에 영향을 미치는 인자는 부적절한 수용체 억제로 질환의 결과적 진행을 야기할 수 있다.

본 연구의 26명의 환자에서, 획득된 2차 KIT 변이는 이마티니브에 대한 내성을 설명하는 가장 빈번한 사건 (케이스의 48％)이었다. 6개의 뚜렷한 2차 KIT 변이를 진행중인 종양에서 확인하였다. 이들은 모두 단일 아미노산 치환이고, 모두 기준-선, 비-처리된 종양에서 확인된 활성화 KIT 변이에 부가적으로 존재하였다. 본 발명자의 지식으로는, 2개의 재발성 KIT 변이, V654A 및 T670I, 및 단일 케이스로 존재하는 세 개의 기타 변이인 D716N, D820E 및 D816G는 1차 GIST에서 이전에 보고된 적이 없었다. 이는 약물에 대한 내성이 발달한 이들 변이의 밀접한 관계를 지지한다. D82OY 및 N822K 변이는 이마티니브 비-치료된 GIST에서 이전에 기술되었다. 활성화 루프 변이, 예를 들어 D816G, D820E/Y, N822K는 이마티니브에 대한 내성을 직접 부여하는 KIT에서의 활성화 변이인 것으로 보인다. 전신성 비만세포종 환자 및 생식세포종 환자의 일부집단에서의 KIT D816V 변이는 이마티니브에 대한 1차 내성과 관련이 있다.

1차 KIT G565R 변이가 있는 1개의 종양은 2차 PDGFRA D842V 변이를 통해 이마티니브 내성을 획득하였다. D842V 변이는 GIST에서 가장 흔한 활성화 PDGFRA 변이이며, 이마티니브-내성도 증명되었다. 이 변이는 이마티니브에 대해 감소된 민감성을 나타내는 활성화 변이이다. 이마티니브에 대한 내성이 상이한 키나제, 예를 들어 PDGFRA의 변이를 통해 일어날 수 있다는 관찰은 이전에 기술되지 않은 내성의 메커니즘을 확인시켰다. 일반적으로, 소분자 억제제에 민감한 활성화된 키나제에 의존하는 종양의 내성은 이 억제제에 민감하지 않은 다른 키나제에서의 활성화 변이에 의해 생길 수 있다. 내성의 이러한 메커니즘이 GIST 및 기타 종양, 및 백혈병에서 보다 빈번하게 조작되고, 그것이 KIT에서 2차 게놈 변화를 확인할 수 없는 본 연구의 케이스에서의 내성의 원인인지는 결정되어야 할 것으로 남아있다.

본 연구의 2가지 케이스에서, 이마티니브-내성은 KIT 또는 KIT/PDGFRA 유전 자의 증폭과 관련이 있다. 후자에서, 환자는 진행중인 종양 덩어리가 성장하는 이마티니브 1차 내성을 나타내고, 결과적으로 이마티니브 투여 시작부터 5주 후에 사망하였다. 이 환자에서 질환의 악성 단계가 1년 이상 지속되고, 환자가 이마티니브 치료 전에 많은 투여량으로 화학- 및 방사선요법으로 예비 치료받았기 때문에, 증폭은 이마티니브 투여 전의 종양 세포에 이미 존재하였을 것이 분명하고, 추가로 약물의 존재 하에 선택되었다. 이러한 발견은 KIT 증폭이 1차 내성을 야기할 수 있음을 나타내고, GIST 환자에서 전형적 화학요법의 사용을 주의시키며, 이는 약물에 대한 반응에 영향을 미치는 유전자 변화의 발생을 가능하게 하는 질환 진행과 관련된 클론 다양성의 진화에 추가될 수 있다.

2개의 진행중인 종양은 KIT 발현을 완전히 상실하였고, 이는 내성의 KIT-독립적 메커니즘을 나타낸다.

간기 FISH 분석은 이들 종양 중 하나에서 표적화된 KIT/PDGFRA 유전자의 이-대립유전자 손실이 있는 세포의 선택적 성장을 나타내며, 이는 추가로 수용체 의존성으로부터 탈출할 수 있음을 암시한다. KIT/PDGFRA 반접합체로의 이동은 이마티니브에 대한 내성이 생긴 시기의 2개의 종양에서 관찰되었으며, 이는 2차 KIT 변이의 출현과 관련이 있다. 반접합체/동형접합체가 이마티니브에 대한 재발 변이체의 둔감성을 더하였는지는 불명확하며, 이는 추가 연구를 보증한다.

진행시기에서 종양 세포에 존재하는 통상적 KIT V654A 및 T670I 변이의 이마티니브 민감성을 정의하기 위한 시도에서, 이들 변이를 보유한 세포에서 리간드-독립적 KIT 인산화에 대한 이마티니브의 억제 효과는 생체외 분석을 이용하여 조사하 였다. 두 경우 모두에서, KIT 자가인산화는 생체내에서 달성될 수 있는 거의 최고 수준의 이마티니브인 5 μM까지의 이마티니브 농도에서 억제되지 않았다. PKC412, 대체적 KIT 및 PDGFR 억제제는 약물의 치료적 사용을 정당화하는 농도에서 두 변이체에서의 억제 효과를 발휘하였다. KIT T670I 변이체에서 이마티니브 및 PKC412에 대한 차별적 민감성을 변형된 Ba/F3 뮤린 세포를 사용하여 시험관 내에서 추가로 확인하였다. PKC412에 대한 다른 이마티니브-내성 변이의 민감성을 추가로 탐구하기 위해, 이마티니브-내성 PDGFRA D842V 변이체로 트랜스펙션된 Ba/F3 세포를 시험하였다. PKC412는, 상이한 이마티니브-내성 변이체 동형을 보유한 종양의 억제를 위한 약물의 시험관내 잠재성을 추가로 강조하는, 1 μM의 농도에서 PDGFRA D842V 변이체를 효과적으로 억제하였다. GIST 환자에서 이마티니브-내성의 KIT-의존적 및 독립적 메커니즘의 존재가 확인되었고, 신규 이마티니브-내성 KIT 변이체 동형이 나타났다. 이는 이마티니브-내성 PDGFRA 변이의 획득을 KIT 양성 종양에서 2차 내성의 원인으로 지적하고, KIT 증폭을 약물에 대한 2차 내성뿐만 아니라 1차 내성에 대한 가능한 설명으로 나타낸다. KIT T670I 및 V654A, 및 PDGFRA D6842V 변이의 PKC421에 대한 민감성이 증명되었다. 개별적 키나제 도메인 변이가 대체적 키나제 억제제에 대해 차별적 민감성을 나타낸다면, 내성의 근원적 메커니즘에 2차 요법을 정확하게 갖추는 것이 중요하다.

Claims

위장관 기질적 종양의 치료가 필요한 환자에게 유효량의 하기 화학식 (II)의 미도스타우린 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 위장관 기질적 종양을 앓는 환자의 치료 방법.

<화학식 II>
제1항에 있어서, 위장관 기질적 종양이 이마티니브-내성 위장관 기질적 종양인 방법.
제2항에 있어서, 미도스타우린이 1일 100 내지 300 mg의 투여량으로 투여되는 것인 방법.
제3항에 있어서, 투여량이 1일 150 내지 250 mg인 방법.
제4항에 있어서, 투여량이 1일 200 mg인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 미도스타우린이 이마티니브와 동시에, 개별적으로 또는 순차적으로 사용되지 않는 조건으로 환자에게 투여되는 것인 방법.
위장관 기질적 종양의 치료용 의약의 제조를 위한 미도스타우린의 용도.
제7항에 있어서, 위장관 기질적 종양이 이마티니브 요법에 대해 내성이 있는 것인 용도.
제8항에 있어서, 미도스타우린이 1일 150 내지 250 mg의 투여량으로 투여되어야 하는 것인 용도.
제9항에 있어서, 투여되어야 할 용량이 1일 200 mg인 것인 용도.
제1항 또는 제8항에 있어서, 미도스타우린이 경구 투여되는 것인 방법 또는 용도.