MX2007002415A - Uso de midostaurina para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere al uso de midostaurina, en forma libre o en forma de sal farmaceuticamente aceptable, en la fabricacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, y a un metodo de tratamiento de animales de sangre caliente, de preferencia seres humanos, en donde se administra una dosis terapeuticamente efectiva de midostaurina a un animal que sufra de esta enfermedad o condicion.

Description

USO DE MIDOSTAURINA PARA EL TRATAMIENTO DE TUMORES ESTROMALES GASTROINTESTINALES La presente invención se refiere al uso de midostaurina, en forma libre o en forma de sal farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, por ejemplo tumores gastrointestinales resistentes al Compuesto I , y a un método de tratamiento de animales de sangre caliente, de preferencia en seres humanos, en donde se administra una dosis terapéuticamente efectiva de midostaurina a un animal que sufra de la enfermedad o condición mencionada anteriormente. Descripción de la Figura 1 Panel B: Curvas de respuesta a la dosis de imatinib ó PKC412 para células Ba/F3 que expresan las mutaciones KIT ?WK557-558/T670I , PDGFRA D842V ó ?DIM842-844. Los tumores estromales gastrointestinales son una familia recientemente caracterizada de neoplasmas mesenquimales, que se originan a partir del tracto gastrointestinal, y del 60 al 70 por ciento de todos los tumores estromales gastrointestinales se originan a partir del estómago. En el pasado, estos tumores se clasificaban directamente como leiomioma, leiomioblastoma, o leiomiosarcoma. Sin embargo, ahora está claro que los tumores estrbmales gastrointestinales representan un conjunto qu ímico-patológico distinto de enfermedades, basándose en su patogénesis molecular única y en sus características clínicas. El tumor estromal gastrointestinal es una condición relativamente rara, y tiene una incidencia estimalda de aproximadamente 20 casos/millón; el tumor estromal gastrointestinal es el neoplasma mesenquimal más común del tracto gastrointestinal. Hasta recientemente, la única terapia disponible ha sido la refección quirúrgica. El valor limitado de la quimioterapia citotóxica convencional y la terapia de radiación, ha dado como resultado que I el tumor estromal gastrointestinal avanzado sea una condición invariablemente progresiva y fatal, variando la sobrevivencia media de los pacientes desde 20 meses, por ejemplo con el tumor estromal i gastrointestinal metastásico, hasta un año o menos, por ejemplo, en la recurrencia post-quirúrgica. El evento molecular oncogénico más probablemente caiusativo en la gran mayoría de tumores estromales gastrointestinales.ies una mutación activadora de KIT o el receptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas A, abreviado como PDGFRA. Como resultado, se activan las sendas de señalización que promueven la proliferación y/o sobrevivencia celular. El mesilato de imatinib inhibe específicamente las quinasas de tirosina receptoras PDGFRs, KIT, ABL, y ARG, e induce altos índices de respuesta en los pacientes con tumores estromales gastrointestinales. Hasta la fecha, la terapia con imatinib sigue siendo el único tratamiento sistémico efectivo para esta enfermedad. Las observaciones clínicas y experimentales ligaron la respuesta con la presencia y el tipo de mutaciones KIT/PDGFRA en el tumor, siendo aquéllas que llevan las mutaciones del exón 11 de KIT las más sensibles al tratamiento. Las mutjaciones KIT-D816V y PDGFRA-D842V, que afectan al dominio catalítico de quinasa, interfieren con el enlace de imatinib, y hacen ¡que el fármaco sea primordialmente inefectivo. La mayoría de los pacientes con tumor estromal gastrointestinal desarrollan resistencia dudante la terapia, después de diferentes grados de respuesta inicial al fármaco. La investigación de otras malignidades tratadas con imatiníb, tales como leucemia mieloide crónica (CML), o leucemia eosinofílica crónica (CEL), indica que la resistencia a este inhibidor puede ser causada por distintos mecanismos moleculares. La mayoría de los pacientes con leucemia mieloide crónic ¡a, con resistencia al imatinib, tienen una expansión clonal de células leucémicas que alojan a los novedosos alelos mutantes BCR-ABL, o que expresan niveles más altos de la proteína de fusión debido a la amplificación de BCR-ABL. El desarrollo de resistencia a imatinib en ¡ la leucemia eosinofílica crónica puede estar asociado cbn una mutación secundaria dentro del dominio catalítico de la proteína de I fusión FIPL1-PDGFRA. Los estudios preliminares en los pacientes con tumor estromal gastrointestinal, en una etapa de la enfe medad progresiva resistente al imatinib, indicaron que, en la mayoría de los tumores, la activación de kits todavía continuaba teniendo un papel funcional, con las mutaciones adquiridas del dominio de quinása KIT o la aplicación genómica del gen K/í como factores causativos en un subconjunto de pacientes.

El imatinib es una pequeña molécula que inhibe selectivamente las quinasas de tirosina específicas que han surgido recientemente como un tratamiento valioso para los pacientes con tumor estromal gastrointestinal avanzado. El uso de imatinib como una monoterapia para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal se ha descrito en la Publicación del TCP Número WO 02/34727, la cual se in¡corpora a la presente invención. Sin embargo, se ha reportado que está presente una resistencia primaria al imatinib en una población de pacientes, por ejemplo el 13.7 por ciento de los pacientes en un estudio. En adición, un número de pacientes adquieren resistencia al tratamiento con imatinib. Más generalmente, esta resistencia es parcial con progreso en algunas lesiones, pero continuando el control de la enfermedad en otras lesiones. Por consiguiente, estos pacientes siguen con el tratamiento de imatinib, pero con una clara necesidad de una terapia adicional o alternativa. El imatinib es la 4-(4-metil-piperazin-1 -il-metil)-N-[4-meltil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-il-amino)-fenil]-benzamida, que tielne la Fórmula I: La preparación de imatinib y el uso del mismo, en especial como un agente anti-tumoral, se describe en el Ejemplo 21 de la Solicitud de Patente Europea Número EP-A-0,564,409, la cual se publicó el 6 de octubre de 1993, y en la solicitudes y patentes equivalentes en otros numerosos países, por ejemplo en la Patente i de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,521,184, y en la Patente Japonesa Número 2706682, todas las cuales se incorporan a la presente como referencia. De una manera sorprendente, ahora se ha encontrado que la midostaurina, un inhibidor de quinasa C de proteína, posee propiedades terapéuticas que la hacen útil para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, por ejemplo para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales resistentes al imatinib. La quinasa C de proteína, abreviada posteriormente en la presente como PKC, es una de las enzimas claves en las sendas de transducción de señales celulares, y tiene un papel pivotal en el control de la proliferación y diferenciación celular. PKC es una familia de quinasas de serina/treonina. Se han identificado cuando menos 12 isoformas de PKC, y se dividen comúnmente en tres grupos, basándose en su estructura y en sus requerimientos de sustrato. Se ha encontrado que la expresión de PKC es elevada en las biopsias de tumor de mama humano, comparándose cpn los tejidos de mama normales, y se ha considerado una alta expresión de PKC como un marcador biológico para malignidad en los astrocitomas humanos. Una de las isoformas de PKC, PKCT, es un regulador positivo de la señalización de sobrevivencia en las células- T. Es interesante que PKCT se fosforila constitutivamente en el tumor estromal gastrointestinal. Por consiguiente, PKCT se puede considerar como una quinasa objetiva potencial para las intervenciones terapéuticas en el tumor estromal gastrointestinal. En particular, los inhibidores de PKC son benéficos en el tratamiento de los tumores estromales gastrointestinales resistentes al imati?ib. De conformidad con lo anterior, la presente invención se refiere a un método para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, el cual comprende administrar midostaurina, a un paciente cojn tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo con tumor estromal gastrointestinal resistente al imatinib. La midostaurina de acuerdo con la invención, es la N-[(9S,10R,11R,13R)-2,3,10,11,12,13-hexahídro-10-metoxi-9-metil-1-oxo-9,13-epoxi-1H,9H-di-indolo-[1,2,3-gh:3',2',1'-lm]-pirrolo-[3,4-j]-[1 ,7]-benzodiazonin-11 -il]-N-metil-benzamida de la Fórmula (II): o una sal de la misma, en lo sucesivo: "Compuesto de la Fórmula II ó midostaurina0 El compuesto de la Fórmula II o midostaurina [Nombre Internacional No Registrado], también se conoce como PKC412. La midostaurina es un derivado del alcaloide que se presenta naturalmente estaurosporina, y se ha descrito específicamente en la Patente Europea Número 0,296,110, publicada el 21 de diciembre de 1988, así como en la Patente de los Estados Unidos de Norteamérica Número 5,093,330 publicada el 3 de marzo de 1992, y en la Patente Japonesa Número 2,708,047. La midostaurina descrita en estos documentos se incorpora a la presente solicitud como referencia. La midostaurina y su proceso de fabricación se han descrito específicamente en muchos documentos, bien conocidos por el experto. En cada caso en donde se den citas de solicitudes de patente o de publicaciones científicas, en particular para la midostaurina, el asunto objeto de los productos finales, las preparaciones farmacéuticas, y las reivindicaciones, se incorporan a la presente solicitud por referencia a estas publicaciones. El término "resistente a imatinib o resistencia a imat¡n¡b\ como se utiliza en la presente, define una falta, una reducción, o una pérdida de efectividad terapéutica de imatinib en el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales. La invención se refiere al uso de midostaurina, también conocida como PKC412, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales, abreviados posteriormente en la presente como GIST, por ejemplo GIST resistente a imatinib, y a un método para el tratamiento de animales de sangre caliente, incluyendo seres humanos, que sufran de tumor estromal gastrointestinal, mediante la administración a este animal que necesite dicho tratamiento, de una cantidad efectiva de midos'taurina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma. La presente invención se refiere a un método para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo con tumor estromal gastrointestinal resistente a imatiníb, él cual comprende administrar midostaurina, a un paciente con tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo con tumor estromal gastrointestinal resistente a imatinib. La dosificación precisa de midostaurina que se va a emplear para el tratamiento de las enfermedades y condiciones mencionadas anteriormente en la presente, depende de varios factores, incluyendo el huésped, la naturaleza y la severidad de la condición que se esté tratando, el modo de administración. En general, se logran resultados satisfactorios cuando se administra la midostaurina parenteralmente, por ejemplo intraperitonealmente, intravenosamente, intramuscularmente, subcutáneamente, intratumoralmente, o rectalmente, o bien enteralmente, por ejemplo oralmente, de preferencia intravenosamente, o de una manera preferible oralmente; intravenosamente en una dosificación diaria de 0.1 a 10 miligramos/kilogramo de peso corporal, de preferencia de 1 a 5 miligramos/kilogramo de peso corporal. En los estudios con seres humanos, una dosis total de 225 miligramos/día fue más presumiblemente la Máxima Dosis Tolerada (MTD). Una dosificación intravenosa diaria preferida es de 0.1 a 10 miligramos/kilogramo de peso corporal, o para la mayoría de los primates supepores, una dosificación diaria de 200 a 300 miligramos. Una dosificación intravenosa típica es de 3 a 5 miligramos/kilogramo, de 3 a 5 veces por semana. La midostaurina se administra oralmente en dosificaciones hasta de aproximadamente 300 miligramos/día, por ejemplo de 100 a 300 miligramos/día. La midostaurina se administra como una sola dosis, o se divide en dos o tres dosis diarias, de preferencia dos dosis. Una dosis particularmente importante es de 200 a 225 miligramos/día, en particular 100 miligramos dos veces al día (200 miligramos/día en total). El límite superior de la dosificación es el impuesto por los efectos secundarios, y se puede det rminar mediante un estudio para el paciente que se esté tratando. La presente invención también se refiere a un método en donde se administra la cantidad terapéuticamente efectiva de midostaurina a un sujeto mamífero de 7 a 4 veces por semana, o de aproximadamente el 100 por ciento a aproximadamente 50 por ciento de los días, en el período de tiempo, durante un período de 1 a 6 semanas, seguido por un período de 1 a 3 semanas, en las que no se administra el agente, y este ciclo se repite de uno a varios ciclos. Usualmente, se administra inicialmente una dosis pequeña, y se aumenta gradualmente la dosificación hasta que se determine la dosificación óptima para el huésped. El límite superior de la dosificación es el impuesto por los efectos secundarios, y se puede determinar mediante un estudio para el huésped que se esté tratando. La midostaurina se puede combinar con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente, uno o más adyuvantes farmacéuticos convencionales, y se administran enteralmente, por ejemplo oralmente, en la forma de tabletas, cápsulas, caplets, etc., o parenteralmente, por ejemplo intraperitonealmente o intravenosamente, en la forma de soluciones o suspensiones inyectables estériles. Las composiciones entérales y parenterales se pueden preparar por medios convencionales. Las soluciones para infusión de acuerdo con la presente invención de preferencia son estériles. Esto se puede llevar a cabo fácilmente, por ejemplo, mediante filtración a través de membranas de filtración estériles. La formación aséptica de cualquier composición en una forma líquida, el llenado aséptico de frascos, y/o la combinación de una composición farmacéutica de la presente invención con un diluyente adecuado bajo condiciones asépticas, son bien conocidos por los expertos. La midostaurina se puede formular en composiciones farmacéuticas entérales y parenterales que contengan una cantidad de la sustancia activa que sea efectiva para el tratamiento! de las enfermedades y condiciones mencionadas anteriormente en la presente, estando estas composiciones en una forma de dosificación unitaria, y comprendiendo estas composiciones un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los ejemplos de las composiciones útiles se describen las Patentes Europeas Número 0,296,110, Número 0,657,164, Número 0,296,110, Número 0,733,372, Número 0,711,556, Número 0,711,557. Las composiciones preferidas se describen en la Patente Europea Número 0,657,164, publicada el 14 de junio de 1995. Las composiciones farmacéuticas descritas comprenden una solución o dispersión de midostaurina en un glicérido de polialquilenglicol saturado, en cuyo glicérido de glicol está una mezcla de esteres de glicerilo y polietilenglicol de uno o más ácidos saturados de 8 a 18 átomos de carbono. La presente invención se refiere al uso de midostaurina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo estromal gastrointestinal resistente a imatinib, con la condición de que la midostaurina no se administre junto, en secuencia, o por separado con imatinib. La presente invención también se refiere al uso de midostaurina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo estromal gastrointestinal resistente a imatinib, en donde el imatinib no se utiliza para el tratamiento de este tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo estromal gastrointestinal resistente a imatinib. La presente invención se refiere al uso de midostaurina o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, en do¡nde la midostaurina se utiliza como un agente anti-tumoral para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo tumor estromal gastrointestinal resistente a imatinib. La presente invención se refiere adicionalmente a una midostaurina empacada, que incluye instrucciones para utillizar la midostaurina, o sales de la misma, juntas para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, por ejemplo tumor estromal gastrointestinal resistente a imatinib. En un aspecto, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de tumor estromal gastrointestinal, el cual comprende administrar midostaurina en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva contra el tumor estromal gastrointestinal, a un animal de sangre caliente, en particular a un ser humano, que lo necesite. De una manera más particular, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un paciente que sufra de tumor estromal gastrointestinal, el cual comprende administrar una cantidad efectiva de midostaurina, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, al paciente. Más particularmente, la presente invención proporciona un método para el tratamiento de un paciente que sufra de tumor estromal gastrointestinal, el cual comprende administrar una midostaurina efectiva, o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, al paciente, en donde la midostaurina se administra en una dosis de 100 a 200 miligramos al día, en particular de 150a 250 miligramos al día, más particularmente de 200 miligramos al día, como una preparación farmacéutica oral. Eiemplo 1 : Preparaciones Farmacéuticas de Midostaurina Composición A: Gelucire 44/14 (82 partes) se funde mediante calentamiento a 60°C. Se agrega midostaurina en polvo (18 partes) al material fundido. La mezcla resultante se homogeneiza, y la dispersión obtenida se introduce en cápsulas de gelatina dura de diferentes tamaños, de tal manera que algunas contengan una dosificación de 25 miligramos, y otras contengan una dosificación de 75 miligramos de la midostaurina. Las cápsulas resultantes son adecuadas para administración oral. Composición B: Gelucire 44/14 (86 partes) se funde mediante calentamiento a 60°C. Se agrega midostaurina en polvo (14 partes) al material fundido. La mezcla se homogeneiza, y la dispersión obtenida se introduce en cápsulas de gelatina dura de diferentes tamaños, de tal manera que algunas contengan una dosificación de 25 miligramos, y que otras contenga una dosificación de 75 miligramos de la midostaurina. Las cápsulas resultantes son adecuadas para administración oral. Gelucire 44/14 está disponible comercialmente en Gattefossé; es una mezcla de esteres de ácidos grasos saturados de 8 a 18 átomos de carbono con glícerol y un polietilenglicol que tiene un peso molecular de aproximadamente 1,500, siendo las especificaciones para la composición del componente de ácido graso, en peso, del 4 al 10 por ciento de ácido caprílico, dell 3 al 9 por ciento de ácido cáprico, del 40 al 50 por ciento de ácido láurico, del 14 al 24 por ciento de ácido mirístico, del 4 al 14 por ciento de ácido palmítico, y del 5 al 15 por ciento de ácido esteárico. Un ejemplo preferido de la formulación de Gelucire consiste en: Gelucire (44/14): 47 gramos Midostaurina: 3.0 gramos llenados en un matraz de rosca de 60 mililitros. Composición C: Un ejemplo de gel blando contendrá la siguiente microemulsión: Glicoles de aceite de maíz 85.0 miligramos Polietilenglicol 400 128.25 miligramos Cremophor RH 40 213.75 miligramos Midostaurina 25.0 miligramos DL-alfa-tocoferol 0.5 miligramos Etanol absoluto 33.9 miligramos Total 486.4 miligramos Eiemplo 2: PKC412 interactúa fuertemente con los sitios de enlace de ATP de las PKCs convencionales, FLT3, PDGFRs, VEGFRs, KIT, y el complejo de CDK1-ciclina B. Notoriamente, se demostró que PKC412 exhibe una actividad inhibidora completa contra la forma mutante T6741 resistente a imatinib de FIPL1-PDGFRA en los pacientes con leucemia eosinofílica crónica refractaria, ver, por ejemplo, Cools J. y colaboradores, Cáncer Cell 2003; 3:459-469. Los sitios catalíticos de i las quinasas de tirosina están altamente conservados, y la mutación T6741 de PDGFRA corresponde a la mutación T3151 de ABL y a la mutación T670I de KIT, la mutación resistente en los pacientes con leucemia mieloide crónica positiva para BCR-ABL progresiva y en los pacientes con tumores estromales gastrointestinales del mutante KIT, respectivamente. Se investigaron los mecanismos de resistencia a imatinib en 26 pacientes con tumores estromales gastrointestinales refractarios al imatinib, y se exploró el uso de PKC412 para ¡superar la resistencia clínica al imatinib en esos pacientes, debido a las mutaciones del dominio de quinasa recurrentes 7T-T670I ó V654A, y PDGFRA-DE842M. Materiales y Métodos Pacientes: Se evaluaron tumores progresivos de 26 pacientes tratados con imatinib en el Departamento de Oncología del University Hospital Leuven. Fueron 20 hombres y 6 mujeres, con una edad media de 53 años (intervalo de 37 a 77 años). A 22 de los 26 pacientes se les removió quirúrgicamente el tumor primario. Se aplicó quimioterapia y/o radioterapia en la etapa avanzada de la enfermedad en 13 pacientes, antes del tratamiento con imatinib. Los pacientes cuyo tumor progresó pero que de otra manera estaban en una buena condición clínica, fueron elegibles para el aumento de la dosis hasta 1,000 miligramos al día. Las decisiones de escala de dosis se basaron en los datos de los pacientes tratados durante cuando menos cuatro semanas. Las lesiones se volvieron a'evaluar después de 1 mes, 3 meses, y cada 6 meses posteriormente. El i progreso se basó en el examen clínico y en la toma de imágenes de CT/PET, y se definió de acuerdo con los criterios previamente publicados, ver, por ejemplo, Van Oosterom AT y colaboradores, Lancet 2001; 358:1421-1423. Los cambios histopatológicos y moleculares durante el tratamiento se evaluaron en los pacientes seleccionados que consintieron, por medio de biopsias tumorales en serie. Patología: Se llevaron a cabo análisis histopatológicos e ¡nmunohistoquímícos en el tejido empotrado en parafima. Se utilizaron anticuerpos policlonales contra CD117 (A4502, dilución de 1/250, DAKO, Dinamarca) y complejos de avidina-biotiona-peroxidasa, sin recuperación del antígeno. Hibridación con fluorescencia in situ (FISH): El análisis FISH interfase de doble color se lleva a cabo en secciones de tejido empotradas en parafina de 4 mieras de las biopsias tumorales obtenidas antes del tratamiento con imatinib (18 pasos), o en preparaciones al tacto de biopsias frescas de lesiones resistentes a imatinib (los 26 casos). Los clones BAC marcados con digoxigenina o con biotina para KIT /4q12 (RP11-568A2) ó PDGFRA/4q12 (RP11-24011) se co-hibridaron con sondas centroméricas del cromosoma 4 marcadas con SpectrumGreen ó con SpectrumOrange (CEP4, Vysis Inc., Downers Grove, IL, EUA), respectivamente, como se describió anteriormente. Los datos FISH se recolectaron en un microscopio de fluorescencia Leica DMRB (Leica, Wetzlar, Alemania) equipado con una cámara de dispositivo acoplado cargado y enfriado, en blanco y negro (Photometrics, Tuscon, AZ), se ejecutaron mediante el Software de toma de imágenes FISH Quips SmartCapture R (Vysis, Bergísch-Gladbach, Alemania). Se evaluaron 100 núcleos ¡ntérfase, y se calculó la proporción de KIT/PDGFRA a CEP4. Una proporción de > 2 se define como la amplificación específica de KIT/PDGFRA. Análisis de secuencia: Se extrae el ADN genómico del tejido congelado instantáneamente, utilizando el Kit de Preparación de Plantillas de PCR High Puré (Roche, Mannheim, Alemania). Se amplifican los exones 9, 11, 13, 14, 15, y 17 del KIT, y los exbnes 12 y 18 de PDGFRA, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como se describe anteriormente, ver, por ejemplo, Debiec-Rychter M. y colaboradores, J. Pathol. 2004; 202:430-438. Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se purificaron (Microcon PCR, Millipore, MA, EUA) y se rastrearon para det'erminar las mutaciones mediante cromatografía de líquidos de alto rendimiento desnaturalizante, en un sistema Transgenomic WAVE DHPLC (DHPLC; Transgenomic, Inc., Reino Unido). Las muestras que exhibían un perfil de elución aberrante se volvieron a amplificar y se secuenciaron. Western-blot: Las muestras de tumor congeladas instantáneamente, suficientes para la preparación de los lisados celulares, estuvieron disponibles de 10 tumores estromales gastrointestinales refractarios. La lisis celular, SDS-PAGE, e inmunomanchado, se llevaron a cabo como se describe21. Las membranas (Amersham Pharmacia Biotechnology, Reino Unido) se inmunomancharon durante la noche utilizando un anticuerpo anti-fosfo-KIT (Y703) (Zymed, San Francisco, CA) a una dilución de 1:500. Se utilizo la IgG anti-conejo conjugada con HRP a una dilución de 1:2,500, y se visualizó con Quimiluminescencia Mejorada (Pierce). Entonces se rayaron las membranas y se volvieron a manchar para determinar los niveles de proteína totales, utilizando el KIT de proteína total de reconocimiento de anticuerpo (anti-CD117, A4502, DAKO, Glostrup, Dinamarca). Ensayo de respuesta de células de tumores estromales gastrointestinales resistentes primarios: El mesilato de imatinib y PKC412, que son los compuestos cristalinos, se disuelven a 10 mM en sulfóxido de dimetilo al 100 por ciento (Sigma), y se guardan alícuotas a -80°C. Los experimentos se llevan a cabo con diluciones en serie del suministro 10 mM. Los controles se llevan a cabo con diluciones en solvente (sulfóxido de dimetilo). Las células primarias se obtienen de muestras de tumor progresivo desagregadas de colagenasa, se siembran a una confluencia del 60 al 70 por ciento en platos de cultivo celular de 100 milímetros (Corning Inc., Corning, NY), y se cultivan durante 3 días en DMEM complementado con suero bovino fetal al 10 por ciento, aminoácidos no esencial 0.1 mM, y piruvato de sodio 1.0 mM. Las células se exponen al mesilato de ¡matinib, al PKC412, o al vehículo solo durante 90 minutos, se lavan con 10 mililitros de suero regulado con fosfato frío, y se lisan en el regulador [NP40 al 1 por ciento, Tris-HCl 50 mM, pH de 8.0, NaCI 150 mM, complementado con tabletas de cóctel inhibidor de proteasa completo (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Alemania), y orto-vanadato de sodio 0.2 M (Sigma, St. Louis, MO)]. Construcción: Los ADNc mutantes de PDGFRA y KIT se obtienen mediante reacción en cadena de la polímerasa con transcripción inversa sobre ARN aislado de tumores progresivos. Los ADNcs se clonan en el vector retroviral pMSCV-puro (Clontech). Cultivo celular: Se cultivan 293 células-T en DMEM complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento. Las células Ba/F3 se cultivan en RPMI-1640 complementado con suero fetal de becerro al 10 por ciento e interleucina-3 (1 nanogramo/mililitro). Los virus producidos se describen previamente, ver, por ejemplo, Cools J. y colaboradores, N. Engl. J. Med. 2003; 348:1201-1214. Las células Ba/F3 transducidas con las diferentes construcciones, se seleccionan con puromicina (2 microgramos/milílitro). Con el fin de probar el crecimiento independiente del factor, las células Ba/F3 se lavan tres veces en suero regulado con fosfato, y se inician nuevos cultivos en ausencia de interleucina-3. Las células que llegaron a ser independientes de la interleucina-3 se mantienen en ausencia de interleucina-3. Para las curvas de respuesta a la dosis, las células Ba/F3 se cultivan en placas de 24 pozos con diferentes concentraciones de inhibidor. El número de células viables se determina al principio y después de 24 horas, utilizando la solución AqueousOne (Promega). Resultados: Se evalúan los tumores progresivos de 26 pacientes tratados con imatinib. El tiempo medio desde el diagnóstico hasta la malignidad probada de la enfermedad es de 48 semanas (intervalo de 0 a 265 semanas), mientras que el tiempo medio desde el diagnóstico hasta el tratamiento con imatínib es de 91 semanas (intervalo de 6 a 304 semanas). Quince pacientes (57.6 por ciento) alcanzaron la remisión parcial, y 10 pacientes (38.4 por ciento) mostraron la enfermedad estable durante el tratamiento con imatinib, con una duración promedio de sobrevivencia sin eveintos de 48 semanas (intervalo de 16 a 200 semanas). Histopatología: 25 tumores estromales gastrointestinales primarios revelan células de uso, y uno tuvo una morfología mixta.

La expresión del antígeno CD117 se demuestra en cada' tumor primario, y en 24 de 26 (92 por ciento) biopsias progresivas. Dos tumores estromales gastrointestinales resistentes a imatinib invierten su apariencia histológica desde el tipo de huso hasta el tipo epíteloide, llegando a hacerse su inmunofenotipo CD117 negativo (no se muestran los datos). Análisis de mutación: Una combinación de D-HPLC y secuenciación directa reveló mutaciones de KIT en 25 de 26 (96.1 por ciento) biopsias de tumor estromal gastrointestinal de línea base, ver la Tabla 1. 19 tumores alojaron mutaciones de yuxtamembrana en el exón 11, y 6 llevaban mutaciones en el exón 9. Ninguna muestra de tumor previa al tratamiento tenía mutaciones en PDGFRA ó más de una mutación en KIT. Un tumor no tuvo ninguna alteración de secuencia de KIT ó PDGFRA identificable en los , exones examinados. Aunque no se detectaron mutaciones puntuales del dominio de quinasa KIT en los tumores antes del tratamiento con imatinib, se identifican seis mutaciones de KIT secundarías distintas en 12/26 (48 por ciento) pacientes en el tiempo del progreso, después de una media de 77 semanas (intervalo de 16 a 188) con terapia. Cuatro pacientes tuvieron una sustitución V654A, y tres pacientes tuvieron una sustitución T670I, mientras que los pacientes llevaban las mutaciones D716N, D816G, D820Y, D820E, ó N822K. Un paciente con una mutación original G565R de KIT adquirió una mutación puntual D842V en PDGFRA, no detectable en el tumor primario de este paciente. Análisis FISH: Los análisis FISH revelan la amplificación de KIT en 2 de 26 (7.7 por ciento) tumores progresivos. En el tumor no respondente primario del paciente 26, la amplificación de KIT está asociada con la amplificación simultánea de PDGFRA (no se muestran los datos). No se encuentran mutaciones de KIT ó PDGFRA en el tumor de este paciente, ni antes del tratamiento ni durante el progreso de la enfermedad. En un paciente, la amplificación de KIT (hasta 5 veces) no está asociada con un incremento en el número de copias de PDGFRA. Este caso alojó una mutación de KIT primaria, pero no se identificaron mutaciones secundarías durante el progreso. En seis muestras resistentes a imatinib, se revela la pérdida de los loci KIT/PDGFRA/CEP4 mediante el análisis FISH de interfase.

Aunque en tres de los tumores ya se observa esta hemicigosidad en las biopsias tumorales de la línea base, en otras tres muestras, y solamente está presente en las lesiones progresivas. Dentro de ésta última, sin embargo, se encuentra una notoria heterogeneidad en el número de señales de KIT/CEP4 por núcleo (intervalo de 0 a 4). Particularmente, el 23 por ciento de las células de las biopsias de tumor progresivo de un paciente mostraron una pérdida bialélica de KIT/PGDFRA/CEP4. Activación de KIT en tumores estromales gastrointestinales resistentes: Se evalúa la activación de KIT en 10 tumores estromales gastrointestinales resistentes a imatinib mediante Western blot con anticuerpos para fosfotirosina Y703 de KIT, y KIT total. Ocho muestras demuestran expresión de KIT y diferentes niveles de autofosforilación constitutiva de KIT. Cuatro de estos ocho tumores tienen mutaciones de KIT secundarias, y para las cuatro restantes, se desconoce la razón para la reactivación de KIT en las celulares tumorales resistentes a imatinib. Dos tumores metastásicos resistentes carecían totalmente de expresión de KIT, lo cual está en línea con la pérdida de positividad para CD117 mediante inmunohistoquímica, y la pérdida bialélica observada de los loci KIT en un caso. Respuesta ex-vivo de tumores estromales gastrointestinales resistentes a imatinib y a PKC412: Se determina el efecto de imatinib y PKC412 sobre la autofosforilación del residuo Y703 de KIT en células resistentes a imatinib cultivadas que alojaban las isoformas mutantes KIT?557-558/T670I ó KITInsAY502-503/V654A, mediante Western blot. Los resultados se comparan con las células GIST882, que llevan una mutación hemicigótica KIT K642E. Las observaciones se estandarizan para la expresión total de KIT utilizando el anticuerpo antí-KIT. La proteína KIT se expresa y se fosforila hasta un nivel significativo, tanto en los tumores KIT?557-558/T670I y KITIns503AY/V654A resistentes, como en sus contra-pa!rtes de células cultivadas in vitro. La autofosforilación de KIT no es afectada por la exposición de la línea celular primaria al imatinib (hasta 5 µM). En contraste, PKC412 0.5 µM reduce, y PKC412 1 µM inhibe totalmente la autofosforílación de KIT de las células mutantes KIT?557-558/T670I . De una manera similar, la autofosforilación de KIT del mutante KITIns503AY/V654A se reduce mediante PK412 ya en una concentración de 0.5 µM, y se inhibe completamente' en una concentración 10 veces más alta del fármaco. Efecto de imatinib y PKC412 sobre los mutantes KIT y PDGFRA in vitro: Las formas mutantes de KIT ?557-558/T670I y PDGFRA ?DIM842-844, y D842V, se expresan en células de murino Ba/F3. Las células Ba/F3 son dependientes de I L-3 para su crecimiento, pero llegan a ser independientes de I L-3 después de la expresión de muchas quinasas activadas, tales como FIPILI-PDGFRA y BGR-ABL. Las proteínas KIT y PDGFRA mutantes introducidas en las células Ba/F3, también confieren crecimiento independiente del factor, y se fosforilan de una manera constitutiva, confirmando que éstas son quinasas activadas (no se muestran los datos). Las curvas de respuesta a la dosis y el análisis del estado de fosforilación de KIT?557-558/T670I con imatiníb, confirmaron la resistencia al imatinib, con la fosforilación no inhiba completamente con imatinib 10 µM (IC50 celular aproximadamente 5 µM). El mutante PDGFRA D824V también muestra resistencia al imatinib, aunque hasta un menor grado) IC50 celular aproximadamente 1 µM. El mutante PDGFRA ?DIM842-844 sirve como un control en este experimento. Los tres mutantes son inhibidos por PKC412 en concentraciones debajo de 1 µM, teniendo PDGFRA D842V en valor IC50 celular más alto a aproximadamente 200 nM (Figura 1). Los estudios preliminares describieron dos categorías de resistencia a imatinib: Mecanismos dependientes de KIT ó independientes de KIT15. Basándonos en nuestros resultados, concluimos que la reactivación de KIT es el mecanismo más importante para la resistencia. Se encuentra que KIT está fosforilado (activado) en 8 de 10 tumores progresivos que se pudieron analizar mediante Western blot durante el tratamiento con imatinib. En el 50 por ciento de estos casos, la reactivación de KIT es la consecuencia de las mutaciones de resistencia secundaria, mientras que en el otro 50 por ciento, la causa para la reactivación sigue . siendo desconocida. Las secuenciación de KIT en su totalidad en estas muestras puede identificar las mutaciones novedosas en regiones inesperadas de KIT, que hacen que la proteína sea insensible al tratamiento con imatínib. De una manera alternativa, los factores que tienen influencia sobre el suministro de fármaco intracelular o su eliminación, podrían dar como resultado una inhibición inadecuada del receptor, con un progreso consecuente de la enfermedad.1 En los 26 pacientes de nuestro estudio, las mutaciones KIT secundarias adquiridas son el evento más frecuente (48 por ciento de los casos), que explica la resistencia al imatinib. Se identifican seis mutaciones KIT secundarias distintas en los tumores progresivos. Todas las sustituciones de un solo aminoácido están presentes en adición a las mutaciones KIT activadoras identificadas en los tumores no tratados de la línea base. Para nuestro conocimiento, no se han reportado previamente dos mutaciones KIT recurrentes, V654A y T670I, y otras tres, de 716N, D820E, y D816G, presentes en casos individuales, en los tumores estromales gastrointestinales primarios. Esto apoya la estrecha asociación de estas mutaciones con el desarrollo de resistencia al fármaco. Las I mutaciones D820Y y N822K se describen previamente en tumores estromales gastrointestinales no tratados con imatinib. Las mutaciones de ciclo de activación, por ejemplo D826G, D820E/Y, N822K, probablemente son mutaciones inactivadoras en KIT que también confieren directamente resistencia al imatinib. La mutación D816V en los pacientes con mastocitosis sistémica y en un subconjunto de seminomas, está asociada con la resistencia primaria al imatinib. Un tumor con una mutación primaria de KIT G565R adquiere resistencia al imatinib a través de una mutación secundaria PDGFRA D842V. La mutación D842V es la mutación de PDGFRA activadora más común en los tumores estromales gastrointestinales, y también i se ha probado que es resistente al imatinib. Esta mutación es una m liutación activadora que muestra una sensibilidad reducida al im l¡atinib. La observación de que se puede presentar resistencia al im l¡atinib a través de la mutación de una quinasa diferente, por ejemplo PDGFRA, identifica un mecanismo de resistencia previamente no descrito. En general, la resistencia de un tumor depende de una quinasa activada sensible a un inhibidor de moléculas pequeñas que podría presentarse mediante una mutación activadora en una quinasa diferente que no sea sensible a este inhibidor. Queda por determinar si este mecanismo de resistencia opera más frecuentemente en los tumores estjromales gastrointestinales y en otros tumores y leucemias, y si es la causa de resistencia en los casos de nuestro estudio, en donde somos incapaces de identificar los cambios genómicos secundarios en KIT.

En dos casos de este estudio, la resistencia a imatinib está asociada con la amplificación de los genes KIT ó KITfPDGFRA. En el último, el paciente mostró resistencia primaria a imatinib con el crecimiento tumoral progresivo masivo, y en consecuencia, murió cinco semanas después del inicio de la administración de ¡Imatinib. Debido a que la etapa maligna de la enfermedad en este paciente duró más de un año, y el paciente fue previamente tratado con una alta dosis de quimioterapia y radioterapia antes del tratamiento con imatinib, la amplificación más probablemente ya estaba presente en las células tumorales antes de la administración de imatinib, y además se seleccionó en la presencia del fármaco. Este descubrimiento indica que la amplificación de KIT puede causar i resistencia primaria, y previene sobre el uso de quimioterapia clásica en los pacientes con tumores estromales gastrointestinales, la cual puede agregarse a la evolución de la diversidad clonal asociada con el progreso de la enfermedad, con la posible generación de cambios genéticos que tengan influencia sobre la respuesta al fármaco. Dos tumores progresivos perdieron completamente la expresión de KIT, indicando el mecanismo de resistencia independiente de KIT. El análisis FISH interfases reveló un crecimiento selectivo de las células con la pérdida bialélica de los genes KIT/PDGFRA objetivos en uno de estos tumores, subrayando además el escape de la dependencia del receptor. El cambio hasta la hemicigosidad de ¡ KIT/PDGFRA se observa en dos tumores en el tiempo de la resistencia a imatinib, lo cual está asociado con la aparición de las mutaciones secundarias de KIT. No está claro el hecho de que se agregue hemicigosidad/homocigosidad a la insensibilidad de los mutantes recurrentes al imatinib, y esto garantiza un estudio adicional. En un intento por definir la sensibilidad a imatinibi de las mutaciones comunes de KIT V654A y T670I presentes en las células tumorales en el tiempo del progreso, se examina el efecto inhibidor de imatinib sobre la fosforilación de KIT independiente del ligando en células que alojan estas mutaciones, utilizando un ensayo ex vivo. En ambos casos, la autofosforilación de KIT no es inhibida en concentraciones de imatinib tan altas como de 5 µM, el cual es aproximadamente el máximo nivel de imatiníb que se puede alcanzar in vivo. PKC412, un inhibidor alternativo de KIT y PDGFR, ejerció un efecto inhibidor sobre ambos mutantes en las concentraciones que justifican el uso terapéutico del fármaco. La sensibilidad diferencial al imatiníb y PKC412 sobre el mutante de KIT T670I, es validada adicionalmente in vitro, utilizando células de murino Ba/F3 transformadas. Con el fin de explorar adicionalmente la sensibilidad de otras mutaciones resistentes a imatinib para PKC412, se prueban las células Ba/F3 transfectadas con el mutante PDGFRA D842V resistente a imatinib. PKC412 inhibe eficientemente al mutante de PDGFRA D842V en la concentración de 1 µM, enfatizando adicionalmente la potencia in vitro del fármaco para la inhibición de tumores que alojen diferentes isoformas mutantes resistentes a imatinib. La existencia de mecanismos dependiente e independientes de KIT de la resistencia a imatiníb en los pacientes con tumores estromales gastrointestinales, se confirma y revela las novedosas isoformas mutantes de KIT resistentes a imatinib. Señala hacia la adquisición de mutaciones de PGDFRA resistentes a imatin¡ib como una causa de la resistencia secundaria en un tumor positivo para KIT, e indica la amplificación de KIT como la posible explicación no solamente para una resistencia secundaria sino también primaria al fármaco. Se evidencia la sensibilidad de las mutaciones de KIT T670I y V654A, y de PGDFRA D6842V para PKC421. Dado que las mutaciones del dominio de quinasa individuales exhiben una sensibilidad diferencial a inhibidores de quinasa alternativos, es crucial hacer a la medida una terapia de segunda línea precisamente para el mecanismo de resistencia subyacente. Tabla 1. Pacientes con tumores estromales gastrointestinales del genotipo tumoral 26 de KIT y PDGFRA Abreviatu ras: WT - tipo silvestre; a - mutaciones detectadas encima de la isoforma mutante de la línea base; b - intervalo de señales de KIT por núcleo; d - hemicigótico mediante secuenciación .

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Un método para el tratamiento de un paciente que sufra de tumores estromales gastrointestinales, el cual comprende í administrar una cantidad efectiva de midostaurina de la Fórmula: I o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, al paciente que lo necesite.

2. El método de la reivindicación 1, en donde el tumor estromal gastrointestinal es un tumor estromal gastrointestinal resistente a imatinib.

3. Un método de la reivindicación 2, en donde la midostaurina se administra en una dosis de 100 a 300 miligramos al día. !

4. Un método de la reivindicación 3, en donde la dosis es de i 150 a 250 miligramos al día.

5. Un método de la reivindicación 4, en donde la dosis es de 200 miligramos al día.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la midostaurina se administra al paciente con la condición de que no se vaya a utilizar la midostaurina para utilizarse de una manera simultánea, separada, o en secuencia con imatinib.

7. El uso de midostaurina para la preparación de un medicamento para el tratamiento de tumores estromales gastrointestinales.

8. El uso de acuerdo con la reivindicación 8, en donde los tumores estromales gastrointestinales son resistentes a la terapia con imatinib.

9. El uso de la reivindicación 8, en donde la midostaiurina se va a administrar en una dosis de 150 a 250 miligramos al día.

10. El uso de la reivindicación 9, en donde la dosis que se va a administrar es de 200 miligramos al día.

11. Un método de la reivindicación 1, o el uso de la reivindicación 8, en donde la midostaurina se administra oralmente.