JP2017507980A - アダプター関連キナーゼ１の阻害剤、それを含む組成物、及びその使用方法 - Google Patents

Abstract

アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）阻害剤である３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート：【化１】並びにその薬学的に許容可能な塩及び固体形態を開示する。本化合物を含む組成物及びＡＡＫ１活性により介在される疾患及び障害を治療、管理、及び／又は予防するためにそれらを使用する方法も開示する。【選択図】図１

Description

１． 発明の分野
本発明は、アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）の阻害剤として有用なピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン系化合物と、それを含む組成物と、それらを使用する方法とに関する。

２． 発明の背景
アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）は、セリン／スレオニンキナーゼのＡｒｋ１／Ｐｒｋ１ファミリーの成員である。ＡＡＫ１ ｍＲＮＡはショート及びロングと呼ばれる２種のスプライシング型で存在する。ロング型は脳及び心臓において優勢であり、強く発現する（非特許文献１）。ＡＡＫ１はシナプトソーム調製物に豊富に含まれ、培養細胞においてエンドサイトーシス構造と共局在化する。ＡＡＫ１は、シナプス小胞の再利用及び受容体媒介性のエンドサイトーシスに重要なプロセスであるクラスリン被覆エンドサイトーシスを調節する。ＡＡＫ１が、受容体のカーゴとクラスリン被覆とを連結するヘテロ四量体であるＡＰ２複合体に結び付く。クラスリンとＡＡＫ１との結合がＡＡＫ１キナーゼ活性を刺激する（非特許文献２、非特許文献３）。ＡＡＫ１は、ＡＰ−２のｍｕ−２サブユニットをリン酸化し、それによりｍｕ−２とカーゴ受容体上のチロシン含有ソーティングモチーフとの結合を促す（非特許文献４、非特許文献５）。Ｍｕ２のリン酸化は受容体の取込みに必要ではないが、リン酸化は内在化の効率を高める（非特許文献６）。

ＡＡＫ１はＰＣ１２細胞におけるニューレグリン−１／ＥｒｂＢ４シグナル伝達の阻害剤として特定されている。ＲＮＡ干渉媒介性の遺伝子サイレンシング又はキナーゼ阻害剤Ｋ２５２ａ（ＡＡＫ１キナーゼ活性を阻害する）での処理によるＡＡＫ１発現の喪失がニューレグリン−１誘導性の神経突起伸長の増強をもたらす。これらの処理により、細胞膜又はその付近でのＥｒｂＢ４の発現の増大及びＥｒｂＢ４の集積が起こる（非特許文献７）。ＮＲＧ１及びＥｒｂＢ４は推定統合失調症感受性遺伝子である（非特許文献８）。両遺伝子のＳＮＰが複合的な統合失調症の中間形質に関連している（非特許文献９）。ニューレグリン１及びＥｒｂＢ４ ＫＯマウスモデルは統合失調症関連の形態変化及び行動的表現型を示した（非特許文献１０、非特許文献１１）。加えて、ＡＡＫ１遺伝子のイントロンでの一塩基多型はパーキンソン病の発症年齢に関連していた（非特許文献１２）。これらの結果から、ＡＡＫ１活性の阻害が統合失調症、統合失調症における認知障害、パーキンソン病、双極性障害及びアルツハイマー病の治療に有用であり得ることが示唆される。

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３． 発明の概要
本発明は、３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート：

並びにその薬学的に許容可能な塩及び固体形態（例えば、結晶形態）を包含する。本化合物を含む医薬組成物及び剤形も本発明により包含される。

本発明の１つの実施の形態は、アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）を本発明の化合物と接触させることを含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でＡＡＫ１を阻害する方法を包含する。

別の実施の形態は、ＡＡＫ１活性によって媒介される疾患及び障害を治療及び管理する方法を包含する。このような疾患及び障害の例としては、アルツハイマー病、双極性障害、疼痛、パーキンソン病及び統合失調症（統合失調症における認知障害を含む）が挙げられると考えられる。

４． 図面の簡単な説明
本発明のいくつかの態様を図面に例示する。

ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）ノックアウトマウスとその野生型（＋／＋）同腹子とを用いたホルマリン疼痛モデルから得られた結果を示す図である。ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）ノックアウトマウスは、その野生型（＋／＋）同腹子と比較して急性及び持続性の（tonic）疼痛応答の両方において明らかな低減を示している。 結晶性３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートのＸ線回折スペクトルの図である。ディフラクトグラムはＰＩＸｃｅｌ Ｍｅｄｉｐｉｘ２検出器（４０ｍＡ、４５ｋＶ、０．０２６０度の２θステップサイズ）を備えたＰＡＮａｌｙｔｉｃａｌ Ｘ’Ｐｅｒｔ ＰＲＯ（Ｃｕ Ｋα放射線）を用いて得られた。 雄のＣ５７マウスにおいてビヒクルと比較した、１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、及び３０ｍｐｋの用量の３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートにおいて得られたホルマリン第１相のデータを示す図である。 雄のＣ５７マウスにおいてビヒクルと比較した、１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、及び３０ｍｐｋの用量の本化合物において得られたホルマリン第２相のデータを示す図である。 図４に示したデータの棒グラフ表示を示す図である。 マウスのChungアッセイにおける本化合物の用量依存的効果を示す図である。

５． 発明の詳細な説明
本発明は、ＡＡＫ１ノックアウトマウスが疼痛に高い耐性を示すという発見に一部基づくものである。この発見が研究を促し、最終的にＡＡＫ１阻害剤、それを含む組成物及びそれらを使用する方法の発見へと至った。

５．１． 定義
他に明示のない限り、「本発明の化合物」、「本開示の化合物」等の語句は、本明細書に開示の化合物を指す。

特に明示のない限り、「挙げられる（含む）（include）」という用語は、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」と同じ意味を有し、「挙げられる（含む）（includes）」という用語は、「挙げられる（含む）が、これらに限定されない」と同じ意味を有する。同様に、「等の（のような）（such as）」という用語は、「等の（のような）（ただし、これらに限定されない）」という用語と同じ意味を有する。

特に明示のない限り、「管理する（manage）」、「管理すること（managing）」及び「管理（management）」という用語は、特定の疾患若しくは障害に既に罹患した患者において疾患若しくは障害の再発を予防すること、及び／又は疾患若しくは障害に罹患している患者が寛解期にある時間を延長させることを包含する。この用語は、疾患若しくは障害の閾値、発症及び／又は継続期間を調節すること、又は患者の疾患若しくは障害に対する応答の仕方を変えることを包含する。

特に明示のない限り、化合物の「治療的に有効な量」は、疾患若しくは病態の治療若しくは管理において治療的利点をもたらすのに、又は疾患若しくは病態に関連した１つ若しくは複数の症状を遅延させる若しくは最小限に抑えるのに十分な量である。化合物の「治療的に有効な量」は、疾患又は病態の治療又は管理に治療的利点をもたらす、単独の又は他の療法と組み合わせた治療剤の量を意味する。「治療的に有効な量」という用語は、療法を全体的に改善するか、疾患若しくは病態の症状若しくは原因を低減させる若しくは回避するか、又は別の治療剤の治療的な有効性を高める量を包含し得る。

特に明示のない限り、「治療する（treat）」、「治療すること（treating）」及び「治療（treatment）」という用語は、疾患若しくは障害の重症度を低減させるか、又は疾患若しくは障害の進行を遅延若しくは減速させる、患者が特定の疾患又は障害に罹患している間に行う処置を意図する。

５．２． 化合物
本発明は、３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート：

及びその薬学的に許容可能な塩を包含する。

本発明は、３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの結晶形態を更に包含する。一実施形態において、結晶形態は、示差走査熱量測定により求められたように、約１８２．５℃の融点を有する。これに関して、「約」という用語は、±２．０セルシウス度を意味する。

一実施形態において、Ｃｕ Ｋα放射線を用いて得られる場合、本化合物の結晶形態は約１２．７度、１４．８度、１８．７度、１９．０度、１９．７度、及び／又は２５．１度の２θの１つ又は複数にピークを含有する粉末Ｘ線回折（ＸＲＰＤ）パターンとなる。これに関して、「約」という用語は±０．２度の２θを意味する。当業者であれば十分に理解されるように、ＸＲＰＤパターンにおけるピークの相対的強度は、サンプルをどのように作製するか、及びデータをどのように収集するかに応じて変化し得る。この点を考慮し、この形態のＸＲＰＤパターンの例を図２に挙げる。

本発明の化合物は、分離可能な異なる安定した立体配座型で存在し得る。非対称の単結合についての束縛回転に起因する、例えば立体障害又は環の変形（ring strain）による捻れ非対称（Torsional asymmetry）によって、異なる配座異性体の分離が可能となり得る。本開示はこれらの化合物の各立体配座異性体とそれらの混合物とを含む。

本発明は、本明細書に開示の化合物のアイソトポマー又は同位体異性体を包含するが、この場合、化合物内の１つ又は複数の原子の同位体は、天然又は一般に生じるものとは異なる。限定されない一般的な例として、水素の同位体は重水素及び三重水素を含む。炭素の同位体は^１３Ｃ及び^１４Ｃを含む。本発明の同位体で標識された化合物を、当業者に知られた従来の技法により（例えば、他で使用される非標識試薬の代わりに適切な同位体で標識された試薬を使用することにより）作製することができる。かかる化合物には多様な潜在用途、例えば生物活性を特定する際の標準及び試薬としての用途があり得る。安定した同位体の場合、かかる化合物には生物学的、薬理学的又は薬物動態的な特性を有利に変更する可能性があり得る。

本発明の化合物は薬学的に許容可能な塩として存在することができる。本明細書で使用される「薬学的に許容可能な塩」という用語は、正しい医学的判断の範囲内において過度の毒性、刺激、アレルギー反応、又は妥当なベネフィット／リスク比に相応する他の問題若しくは合併症を伴わずに、患者の組織に接触させて使用するのに適しており、その使用目的に対して効果的である、水又は油に可溶性又は分散性の本開示の化合物の塩又は両性イオン体を指す。塩は化合物の最終単離及び精製中に、又は好適な窒素原子と好適な酸とを反応させることにより別々に調製することができる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、アジピン酸塩、アルギン酸塩、クエン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、重硫酸塩、酪酸塩、樟脳酸塩（camphorate）、カンファースルホン酸塩；ジグルコン酸塩、二臭化水素酸塩、二塩酸塩、二ヨウ化水素酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、ギ酸塩、フマル酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、メシチレンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、ナフチレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、シュウ酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩（pectinate）、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、リン酸塩、グルタミン酸塩、重炭酸塩、パラ−トルエンスルホン酸塩、及びウンデカン酸塩が挙げられる。薬学的に許容可能な付加塩を形成するのに用いることができる酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸及びリン酸等の無機酸とシュウ酸、マレイン酸、コハク酸及びクエン酸等の有機酸とが挙げられる。

塩基付加塩は、カルボキシ基を、金属陽イオンの水酸化物、炭酸塩若しくは重炭酸塩等の好適な塩基、又はアンモニア若しくは有機の第一級アミン、第二級アミン若しくは第三級アミンと反応させることにより、化合物の最終単離及び精製中に調製することができる。薬学的に許容可能な塩の陽イオンとしては、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム及びアルミニウムと、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジエチルアミン、エチルアミン、トリブチルアミン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン、Ｎ−メチルピペリジン、Ｎ−メチルモルホリン、ジシクロヘキシルアミン、プロカイン、ジベンジルアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルフェネチルアミン及びＮ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン等の非毒性の第四級アミンの陽イオンとが挙げられる。塩基付加塩の形成に有用な他の代表的な有機アミンとしては、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペリジン及びピペラジンが挙げられる。

５．３． 使用方法
本発明の一実施形態は、アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）を本発明の化合物と接触させることを含む、ＡＡＫ１をｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で阻害する方法を包含する。

別の実施形態は、ＡＡＫ１活性によって媒介される疾患及び障害を治療及び管理する方法を包含する。ＡＡＫ１活性によって媒介される疾患及び障害は、ＡＡＫ１活性によって影響を受ける、少なくとも１つの症状、重症度又は徴候を有する疾患及び障害である。かかる疾患及び障害の例としては、アルツハイマー病、双極性障害、疼痛、パーキンソン病及び統合失調症（統合失調症における認知障害を含む）が挙げられると考えられる。特定の方法は、それを必要とする患者（ヒト又は他の哺乳動物）に、治療又は予防に有効な量の本発明の化合物を投与することを含む。

本発明の別の実施形態は、疾患又は障害を治療又は管理する方法であって、該方法はそれを必要とする患者に治療又は予防に有効な量の本発明の化合物を投与することを含み、上記疾患又は障害がアルツハイマー病、双極性障害、疼痛、パーキンソン病又は統合失調症（統合失調症における認知障害を含む）である、方法を包含する。特定のタイプの疼痛としては、慢性疼痛、急性疼痛及び神経因性疼痛が挙げられる。特定のタイプの神経因性疼痛としては線維筋痛症及び末梢神経障害（例えば糖尿病性神経障害）が挙げられる。

疾患又は障害を治療又は管理するのに使用する場合、本発明の化合物を、１つ又は複数の薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物の一部として投与するのが好ましい。

医薬組成物又は配合物を単位用量当たり所定量の有効成分を含有する単位用量形態で与えることができる。１日に付き体重１キログラム当たり約０．０１ミリグラム〜約２５０ミリグラム（「ｍｇ／ｋｇ」）、好ましくは１日に付き体重１ｋｇ当たり約０．０５ｍｇ〜約１００ｍｇの投与量レベルの本開示の化合物は、疾患の予防及び治療のための単剤療法において典型的なものである。典型的に、本開示の医薬組成物は１日に付き約１回〜約５回、又は代替的には持続注入として投与される。かかる投与は長期療法又は救急療法として使用することができる。単一剤形を作製するのに担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は治療する病態、病態の重症度、投与時間、投与経路、用いる化合物の排出率、治療期間、並びに患者の年齢、性別、体重及び状態によって変わる。好ましい単位投与量配合物は、本明細書の上記で述べられているように有効成分の１日量若しくは１日未満量（sub-dose）又はその適切な分量を含有するものである。治療は実質的に適量に満たない少量の化合物から開始してもよい。その後、その環境下で最適な効果が達成されるまで投与量を少しずつ増大させる。概して、化合物は一般的に悪い又は有害な副作用を引き起こすことなく効果的な結果が得られる濃度レベルで投与されるのが最も望ましい。

本発明の化合物は１つ又は複数の追加の治療剤又は予防剤と組み合わせて投与することができる。例えば、疼痛の治療に使用される場合、可能な追加の作用剤としては免疫抑制剤及び抗炎症剤が挙げられる。

本発明の方法及び組成物における使用に適した免疫抑制剤には当該技術分野で既知のものが含まれる。例としては、アミノプテリン、アザチオプリン、シクロスポリンＡ、Ｄ−ペニシラミン、金塩、ヒドロキシクロロキン、レフルノミド、メトトレキサート、ミノサイクリン、ラパマイシン、スルファサラジン、タクロリムス（ＦＫ５０６）及びそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。特定の免疫抑制剤はメトトレキサートである。

更なる例としては、アダリムマブ、セルトリズマブペゴール、エタネルセプト及びインフリキシマブ等の抗ＴＮＦ抗体が挙げられる。他には、アナキンラ等のインターロイキン−１遮断剤が挙げられる。他には、リツキシマブ等の抗Ｂ細胞（ＣＤ２０）抗体が挙げられる。他には、アバタセプト等のＴ細胞活性化遮断剤が挙げられる。

更なる例としては、ミコフェノール酸モフェチル（ＣｅｌｌＣｅｐｔ（商標））及びミコフェノール酸（Ｍｙｆｏｒｔｉｃ（商標））等のイノシン一リン酸脱水素酵素阻害剤が挙げられる。

本発明の方法及び組成物における使用に適した抗炎症薬には当該技術分野で既知のものが含まれる。例としてはグルココルチコイド及びＮＳＡＩＤが挙げられる。

グルココルチコイドの例としては、アルドステロン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、コルチゾン、デオキシコルチコステロン、デキサメタゾン、フルドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン及びそれらの薬学的に許容可能な塩が挙げられる。

ＮＳＡＩＤの例としては、サリチル酸塩（例えばアスピリン、アモキシプリン、ベノリレート、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、ファイスラミン、サリチル酸メチル、サリチル酸マグネシウム、サリチルサリチル酸及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、アリールアルカン酸（例えばジクロフェナク、アセクロフェナク、アセメタシン、ブロムフェナク、エトドラク、インドメタシン、ナブメトン、スリンダク、トルメチン及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、アリールプロピオン酸（例えばイブプロフェン、カルプロフェン、フェンブフェン、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、ケトプロフェン、ケトロラック、ロキソプロフェン、ナプロキセン、オキサプロジン、チアプロフェン酸、スプロフェン及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、アリールアントラニル酸（例えばメクロフェナム酸、メフェナム酸及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、ピラゾリジン誘導体（例えばアザプロパゾン、メタミゾール、オキシフェンブタゾン、フェニルブタゾン、スルフィンピラゾン及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、オキシカム（例えばロルノキシカム、メロキシカム、ピロキシカム、テノキシカム及びそれらの薬学的に許容可能な塩）、ＣＯＸ−２阻害剤（例えばセレコキシブ、エトリコキシブ、ルミラコキシブ、パレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ及びそれらの薬学的に許容可能な塩）及びスルホンアニリド（例えばニメスリド及びその薬学的に許容可能な塩）が挙げられる。

疼痛（神経因性疼痛及び炎症性疼痛を含むが、それらに限定されない）の治療に使用される他の作用剤としては、プレガバリン、リドカイン、デュロキセチン、ガバペンチン、カルバマゼピン、カプサイシン及び他のセロトニン／ノルエピネフリン／ドーパミン再取込み阻害剤、並びに鎮静剤（オキシコンチン、モルヒネ及びコデイン等）のような作用剤が挙げられる。

糖尿病、感染症（例えば帯状疱疹又はＨＩＶ感染症）又は癌等の既知の疾患又は病態によって引き起こされる疼痛の治療において、本発明の化合物を、根本的な疾患又は病態に向けた１つ又は複数の追加の治療剤又は予防剤と併せて投与することができる。例えば、糖尿病性神経障害の治療に使用する場合、本発明の化合物を、１つ又は複数の抗糖尿病剤、抗高血糖剤、抗高脂血症／脂質低下剤、抗肥満剤、抗高血圧剤及び食欲抑制剤と併せて投与することができる。抗糖尿病剤の例としては、ビグアニド（例えば、メトホルミン、フェンホルミン）、グルコシダーゼ阻害剤（例えば、アカルボース、ミグリトール）、インスリン（インスリン分泌促進物質及びインスリン増感剤を含む）、メグリチニド（例えば、レパグリニド）、スルホニル尿素（例えば、グリメピリド、グリブリド、グリクラジド、クロルプロパミド及びグリピジド）、ビグアニド／グリブリド複合薬（例えば、グルコバンス）、チアゾリジンジオン（例えば、トログリタゾン、ロシグリタゾン及びピオグリタゾン）、ＰＰＡＲ−αアゴニスト、ＰＰＡＲ−γアゴニスト、ＰＰＡＲ α／γデュアルアゴニスト、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、脂肪酸結合タンパク質（ａＰ２）の阻害剤、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、又はＧＬＰ−１受容体の他のアゴニスト、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰ４）阻害剤及びナトリウム−グルコース共輸送体２（ＳＧＬＴ２）阻害剤（例えば、ダパグリフロジン、カナグリフロジン及びＬＸ−４２１１）が挙げられる。

５．４． 医薬組成物
医薬配合物は、任意の適切な経路による、例えば経口（口腔又は舌下を含む）、直腸、鼻腔、局所（口腔、舌下又は経皮を含む）、膣内、又は非経口（皮下、皮内、筋内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病変内、静脈内又は皮内の注射又は注入を含む）の経路による投与に適合させることができる。かかる配合物は、薬学分野において知られる任意の方法によって、例えば有効成分を担体（複数の場合もある）又は賦形剤（複数の場合もある）と混ぜ合わせることによって調製することができる。経口投与又は注射による投与が好ましい。

経口投与に適合させた医薬配合物を、カプセル若しくは錠剤、粉末若しくは顆粒、水性液体若しくは非水性液体中の溶液若しくは懸濁液、食用のフォーム（foams）若しくはホイップ、又は水中油型液体エマルション若しくは油中水型エマルション等の不連続単位として与えることができる。

例えば、錠剤又はカプセルの形態での経口投与については、有効薬物成分をエタノール、グリセロール、水等の経口用の非毒性の薬学的に許容可能な不活性担体と組み合わせることができる。粉末は化合物を好適な微細サイズに粉砕して、食用の炭水化物、例えばデンプン又はマンニトール等の同様に粉砕した医薬担体と混合することによって調製される。香味剤、防腐剤、分散剤及び着色剤が存在していてもよい。

カプセルは、上記のように粉末混合物を調製して、形成されたゼラチンシースに充填することによって作製される。コロイドシリカ、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム又は固体のポリエチレングリコール等の滑剤及び滑沢剤を充填操作前に粉末混合物に添加することができる。カプセルが消化される際の薬剤のアベイラビリティを改善するのに、寒天（agar-agar）、炭酸カルシウム又は炭酸ナトリウム等の崩壊剤又は可溶化剤も添加することができる。

その上、所望又は必要とされる場合、好適な結合剤、滑沢剤、崩壊剤及び着色剤も混合物に組み込むことができる。好適な結合剤としては、デンプン、ゼラチン、グルコース又はβ−ラクトース等の天然糖、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウム等の天然ガム及び合成ガム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール等が挙げられる。これらの剤形に用いられる滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウム、塩化ナトリウム等が挙げられる。崩壊剤としては、デンプン、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、キサンタンガム等が挙げられるが、これらに限定されない。錠剤は、例えば粉末混合物を調製し、造粒又はスラッギング（slugging）を行い、滑沢剤及び崩壊剤を添加して、錠剤へと圧縮することによって配合される。粉末混合物は、好適に粉砕した化合物を、上記のような希釈剤又は基剤と、更に任意でカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン又はポリビニルピロリドン等の結合剤、パラフィン等の溶解遅延剤、第４級塩等の再吸収促進剤、及び／又はベントナイト、カオリン若しくはリン酸二カルシウム等の吸収剤と混合することによって調製される。粉末混合物は、シロップ剤、デンプン糊、アカディア粘液（acadia mucilage）等の結合剤、又はセルロース材料若しくはポリマー材料の溶液で湿潤させ、篩にかけることによって造粒することができる。造粒の代わりとして、粉末混合物を錠剤機に通し、その結果として不完全に形成されたスラッグ（slugs）が顆粒へと粉砕される。顆粒は、錠剤成形ダイへの貼り付きを抑えるために、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルク又は鉱油の添加によって潤滑化することができる。次いで潤滑化した混合物を錠剤へと圧縮成形する。本開示の化合物を自由流動不活性担体と組み合わせて、造粒工程又はスラッギング工程を通すことなく直接、錠剤へと圧縮成形することもできる。シェラックのシーリングコート（sealing coat）からなる透明な又は不透明な保護コーティング、糖又はポリマー材料のコーティング、及びワックスの研磨コーティングを提供することができる。染料をこれらのコーティングに添加して、異なる単位投与量を識別させることができる。

溶液、シロップ剤及びエリキシル剤等の経口流体を、所与の分量に所定量の化合物が含まれるように単位投与量形態で調製することができる。シロップ剤は好適に風味付けされた水溶液中に化合物を溶解することによって調製することができるが、エリキシル剤は非毒性ビヒクルの使用によって調製される。エトキシル化イソステアリルアルコール及びポリオキシエチレンソルビトールエーテル等の可溶化剤及び乳化剤、防腐剤、ペパーミントオイル若しくは天然甘味料等の香味用添加物、又はサッカリン若しくは他の人工甘味料等も添加することができる。

必要に応じて、経口投与用の単位投与量配合物をマイクロカプセル化することができる。配合物は、例えば粒子状材料をポリマー、ワックス等でコーティングするか又はそれらに包埋することによって放出を延長又は持続させるように調製することもできる。

本発明の化合物を、小型単ラメラ小胞、大型単ラメラ小胞及び多重ラメラ小胞等のリポソーム送達系の形態で投与することもできる。リポソームは、コレステロール、ステアリルアミン又はホスファチジルコリン等の多様なリン脂質から形成することができる。

本発明の化合物を、化合物分子が連結する個々の担体としてのモノクローナル抗体の使用によって送達することもできる。この化合物は標的化可能な薬物担体である可溶性ポリマーと連結することもできる。かかるポリマーには、ポリビニルピロリドン、ピランコポリマー、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドフェノール、ポリヒドロキシエチルアスパルトアミドフェノール、又はパリトイル（palitoyl）残基で置換されたポリエチレンオキシドポリリジンが含まれ得る。さらに、この化合物は、薬剤の制御放出を達成するのに有用な生分解性ポリマー群、例えばポリ乳酸、ポリイプシロンカプロラクトン、ポリヒドロキシ酪酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリジヒドロピラン、ポリシアノアクリレート、及びヒドロゲルの架橋又は両親媒性ブロックコポリマーに連結することができる。

経皮投与に適合させた医薬配合物を、長期間、レシピエントの表皮への密接な接触を維持することを目的とした個別のパッチとして与えることができる。例えば、有効成分をPharmaceutical Research 1986, 3(6), 318に概説されるようにイオントフォレーシスによってパッチから送達させることができる。

局所投与に適合させた医薬配合物を、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ジェル、噴霧剤、エアロゾル又はオイルとして配合することができる。

直腸投与に適合させた医薬配合物を坐剤又は浣腸剤として与えることができる。

担体が固体の鼻腔投与に適合させた医薬配合物には、嗅ぎタバコ（snuff）を摂取するように、すなわち鼻に近付けた粉末容器からの鼻腔を通した急速吸入によって投与される、粒径が例えば２０ミクロン〜５００ミクロンの範囲の粗粉末が含まれる。鼻噴霧剤又は点鼻剤として投与される担体が液体の好適な配合物には有効成分の水溶液又は油溶液が含まれる。

吸入による投与に適合させた医薬配合物には、様々なタイプの加圧式定量噴霧器、ネブライザ又は吸入器を用いて発生させることができる微細粒子の粉塵又は煙霧が含まれる。

膣内投与に適合させた医薬配合物を、ペッサリー、タンポン、クリーム、ジェル、ペースト、フォーム、又は噴霧配合物として与えることができる。

非経口投与に適合させた医薬配合物には、抗酸化剤、バッファー、静菌薬及び配合物を目的のレシピエントの血液と等張にする溶質を含有し得る水性及び非水性の滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。この配合物は単用量又は多用量の容器、例えば封止されたアンプル及びバイアル内に与えることができ、使用の直前に滅菌液体担体、例えば注射用水を添加するだけでよいフリーズドライ（凍結乾燥）条件で保存することができる。即席の注射溶液及び懸濁液を滅菌粉末、顆粒及び錠剤から調製することができる。

この配合物は、上記で特に言及される成分に加えて、対象となる配合物のタイプを考慮して当該技術分野において従来的な他の作用剤を含むことができる、例えば経口投与に適したものには香味剤が含まれ得ることを理解されたい。

５．５． 実施例
５．５．１． ＡＡＫ１ノックアウトマウス
ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するホモ接合型（−／−）マウスを遺伝子トラップ法及び相同組換えという２つの方法によって準備した。

遺伝子トラップ法は、突然変異原としてレポーター又は選択可能なマーカー遺伝子をコードするＤＮＡのフラグメントを使用するランダム挿入突然変異の方法である。遺伝子トラップベクターは、細胞スプライシング機構によって、ベクターでコードされたエクソンが細胞ｍＲＮＡへとスプライシングするようにイントロン又は遺伝子に組み込まれるように設計されている。一般的に遺伝子トラップベクターは、強いスプライスアクセプター配列が先行しプロモーターは先行していない、選択可能なマーカー配列を含有する。このため、かかるベクターが遺伝子に組み込まれると、細胞スプライシング機構によって、エクソンはトラップされた遺伝子から選択可能なマーカー配列の５’末端上へとスプライシングする。典型的に、かかる選択可能なマーカー遺伝子は、遺伝子をコードするベクターがイントロンに組み込まれている場合にのみ発現することができる。次いで得られる遺伝子トラップ事象は選択的培養物を生存させることができる細胞を選択することによって特定される。

胚性幹細胞（マウス派生株Ａ１２９由来のＬｅｘ−１細胞）は、遺伝子操作されたベクター配列の少なくとも一部を対象の遺伝子に挿入させることを含むプロセスによって突然変異させて、突然変異された胚性幹細胞を胚盤胞に微量注入して、次いでそれを偽妊娠雌性宿主に導入して、確立された方法を用いて出産させた。例えば、"Mouse Mutagenesis", 1998, Zambrowicz et al., eds., Lexicon Press, The Woodlands, TXを参照されたい。その後、得られるキメラ動物を繁殖させ、対象の遺伝子に遺伝子操作による突然変異を含有する対立遺伝子の生殖細胞系伝達が可能な子孫を産生した。

ＡＡＫ１遺伝子が破壊されたマウスは相同組換えによっても作製された。この場合、マウスＡＡＫ１遺伝子の第２のコーディングエクソン（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１７７７６２を参照されたい）を当該技術分野で既知の方法によって除去した。例えば、米国特許第５，４８７，９９２号、同第５，６２７，０５９号及び同第５，７８９，２１５号を参照されたい。

ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するホモ接合型（−／−）マウスを、ＡＡＫ１遺伝子の破壊に関するヘテロ接合型（＋／−）マウス及び野生型（＋／＋）同腹子とともに研究した。この分析の間、マウスに対して、哺乳動物の被験体において主な器官系の機能を評価するように設計された一連の統合医療診断法を用いる医学的精密検査を行った。ホモ接合型（−／−）「ノックアウト」マウスをそのヘテロ接合型（＋／−）及び野生型（＋／＋）の同腹子とともに研究した。ＡＡＫ１遺伝子の破壊をサザン分析によって確認した。ＡＡＫ１のマウスホモログの発現をマウスの脳、脊髄、眼、胸腺、脾臓、肺、腎臓、肝臓、骨格筋、骨、胃、小腸及び結腸、心臓、脂肪、喘息肺、ＬＰＳ肝臓、血液、輪状化した心臓、大動脈（aortic tree）、前立腺及び乳腺（５週齢の未交尾（virgin）、成体の未交尾、１２ＤＰＣ、産後３日目（授乳）、離乳後３日目（初期乳腺退縮）、及び離乳後７日目（後期乳腺退縮））においてＲＴ−ＰＣＲによって検出した。

ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）及びその野生型（＋／＋）同腹子に、以下の実施例５．５．６に記載のホルマリン脚試験を用いて試験を行い、急性及び持続性の侵害受容反応を評価した。

図１に示されるように、第１相及び第２相のデータは、ホモ接合型（−／−）雌性マウス（ｎ＝１６）、野生型雌性マウス（ｎ＝１５）、ホモ接合型（−／−）雄性マウス（ｎ＝９）、及び野生型雄性マウス（ｎ＝１８）を用いて入手した。全ての群及び両相において、ＡＡＫ１ホモ接合型（−／−）マウスは、その野生型（＋／＋）同腹子よりも記録された脚フリンチが大幅に少なかった。

５．５．２． ３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートの合成

パートＡ． ３−ブロモ−５−クロロピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。５−クロロピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（３０ｇ、１９５ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（６００ｍＬ）混合液に、Ｎ−ブロモスクシンイミド（３８．３ｇ、２１５ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温にて１時間撹拌した。固体生成物を濾去し、１Ｎ ＮａＯＨ及び水を用いて洗浄した。アセトニトリルの濾液及び全ての洗浄物を真空濃縮し、１Ｎ ＮａＯＨに懸濁させた。固体生成物を濾過し、水を用いて洗浄した。この生成物を先ほどの固体と混和させ、一晩乾燥させ、４４．２ｇの３−ブロモ−５−クロロ−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジンを得た。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２３２／２３４［（Ｍ＋Ｈ）］^＋，Ｃ_６Ｈ_３ＢｒＣｌＮ_３の実測値：２３２．４７。ＬＣＭＳ（Ｍ＋１，ブロモパターン）＝２３３。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ_３）δ：６．８２（ｄ，１Ｈ）、８．１５（ｂｒｏａｄＳ，１Ｈ）、８．５８（ｄ，１Ｈ）。

パートＢ． ３−ブロモ−５−（ピペラジン−１−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。３−ブロモ−５−クロロピラゾロ（１，５−ａ）ピリミジン（２５ｇ、０．１０７ｍｏｌ）の１，４−ジオキサン（５００ｍｌ）溶液に、トリエチルアミン（４３ｇ、０．４３ｍｏｌ）、次いでピペラジン（２８ｇ、０．３２２ｍｏｌ）を添加した。反応混合液を９０℃にて４時間撹拌した。反応が完了後、酢酸エチルを用いて反応混合液を希釈し、水を用いて洗浄した。酢酸エチルを用いて水層を逆抽出した。混和した有機層を硫酸ナトリウムにて乾燥させ、蒸発させ、３５ｇの粗製３−ブロモ−５−（ピペラジン−１−イル）ピラゾロ（１，５−ａ）ピリミジンを得た。この生成物をメタノールから再結晶化させることができるが、一般に、更に精製することなく使用した。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ２．７４〜２．８１（ｍ，４Ｈ）、３．５５〜３．６９（ｍ，４Ｈ）、６．７５（ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，１Ｈ）、７．９４（ｓ，１Ｈ）、８．６２（ｄ，Ｊ＝７．８３Ｈｚ，１Ｈ）。^１３Ｃ ＮＭＲ（１００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δｐｐｍ４１．２５、４２．１６、７７．７３、９７．７８、１３６．７７、１４４．０１、１４４．１８、１５５．５３。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ２８２．０／２８４．０［（Ｍ＋Ｈ）］^＋，Ｃ_１０Ｈ_１２ＢｒＮ_５の実測値：２８２．１４。

パートＣ． ３−（２−メトキシピリジン−３−イル）−５−（ピペラジン−１−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン。３−ブロモ−５−（ピペラジン−１−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（３．００ｇ、１０．６４ｍｍｏｌ）、（２−メトキシピリジン−３−イル）ボロン酸（２．４４ｇ、１５．９６ｍｍｏｌ）、及びビス（ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（４−ジメチルアミノフェニル）ホスフィン）ジクロロパラジウム（ＩＩ）（０．２３ｇ、０．３２ｍｍｏｌ）を２００ｍＬ容の丸底フラスコに量り取った。次いで、６０ｍＬのジオキサンを添加後、３０ｍＬの水及び次いでトリエチルアミン（７．４０ｍＬ、５３．１９ｍｍｏｌ）を添加した。得られた混合液を８５℃に加熱し、１．５時間後に反応が完了した。次いで、これをロータリーエバポレーターにおいて濃縮乾固させた。固体である残渣を水に懸濁させ、ＨＣｌを用いてｐＨを約２に調節した。ＥｔＯＡｃを用いて抽出を３回行い、不純物質を除去した。次いで、ＮａＯＨを用いてｐＨを約８に調節した。懸濁液を氷浴において約１時間冷却し、所望の生成物の析出を促進させた。固体を濾過し、乾燥させ、淡黄色の固体として２．７４ｇ（８３％）の表題化合物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，メタノール−ｄ_４）δｐｐｍ２．９２〜３．０７（ｍ，４Ｈ）、３．７２〜３．８４（ｍ，４Ｈ）、４．０８（ｓ，３Ｈ）、６．７３（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ）、７．０４（ｄｄ，Ｊ＝７．５３，５．０２Ｈｚ，１Ｈ）、７．９５（ｄｄ，Ｊ＝４．８９，１．８８Ｈｚ，１Ｈ）、８．４６（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，１Ｈ）、８．５３（ｓ，１Ｈ）、８．８９（ｄｄ，Ｊ＝７．５３，１．７６Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ３１１．１［（Ｍ＋Ｈ）］^＋，Ｃ_１６Ｈ_１８Ｎ_６Ｏの実測値：３１０．４。

パートＤ． ３−メチルオキセタン−３−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート。５００ｍＬ容の丸底フラスコにおいて２００ｍＬのＴＨＦに溶解させた３−オキセタノン（７．００ｇ、９７．２２ｍｏｌ）を窒素上で撹拌しながら−２０℃に冷却した。次いで、３４．０ｍＬ（１０５．０８ｍｍｏｌ）の臭化メチルマグネシウム（３Ｍのエーテル溶液）を１５分間にわたりゆっくり添加した（反応物の粘度が高まり、撹拌が少し困難となる）。冷却浴を取り外し、反応物を撹拌し、室温に加温した。２．５時間後、反応物を０℃に冷却し、１００ｍＬの飽和ＮＨ_４Ｃｌ水溶液をゆっくり添加することによりクエンチし、その後１Ｎ ＨＣｌを数滴添加し、ｐＨを約６に調節した。ＤＣＭを２００ｍＬずつ用いて２回抽出した。混和した有機層をＭｇＳＯ_４にて乾燥させた。それを濾過し、加熱せずにロータリーエバポレーターにおいて濃縮した。所望の生成物の８１％を含有する油６．１９ｇを得て、プロトンＮＭＲ分析に基づき１９％のＴＨＦが得られた。反応の収率の推定値は（５．１４グラム）６０％であった。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１．５８（ｓ，３Ｈ）、４．４９（ｄ，Ｊ＝７．２８Ｈｚ，２Ｈ）、４．６３（ｄ，Ｊ＝６．５３Ｈｚ，２Ｈ）。

４０ｍＬのＤＣＭに溶解させた４．３２ｇの３−メチル−オキセタン−３−オール（ＴＨＦ中８１％ｗ／ｗ、３９．７７ｍｍｏｌ）を０℃に冷却させた。ピリジンを添加後、少しずつクロロギ酸４−ニトロフェニルを１０分間にわたり添加した。溶液が混濁するようになり、氷浴を取り外し、窒素下において室温にて撹拌を継続した。１時間後、清澄な淡黄色溶液を得た。水を用いて反応物をクエンチし、ＤＣＭを用いて２回抽出した。ブラインを用いて混和有機層を洗浄し、ＭｇＳＯ_４において乾燥させ、濃縮した。それを少容量のＤＣＭを用いて３３０カラムに充填し、溶媒としてＤＣＭのみを用いてＩＳＣＯにて分離させ、６．２ｇ（６１％）の所望の生成物を得た。^１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，クロロホルム−ｄ）δ１．８６（ｓ，３Ｈ）、４．５７（ｄ，Ｊ＝８．０３Ｈｚ，２Ｈ）、４．９０（ｄ，Ｊ＝７．５３Ｈｚ，２Ｈ）、７．４１（ｄ，Ｊ＝６．５１Ｈｚ，２Ｈ）、８．３１（ｄ，Ｊ＝６．４２Ｈｚ，２Ｈ）。

パートＥ． ３−メチルオキセタン−３−イル４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート。メトキシ−ピリジン−３−イル）−５−ピペラジン−１−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン（１ｇ、３．２２ｍｍｏｌ）と３−メチルオキセタン−３−イル（４−ニトロフェニル）カーボネート（９７９ｍｇ、３．８７ｍｍｏｌ）とのアセトニトリル混合液に、ＤＩＥＡ（２．２４ｍＬ、１２．９ｍｍｏｌ）を添加した。混合液を室温にて６時間撹拌した。１Ｎ ＮａＯＨを５０ｍＬ用いて反応混合液を希釈し、濾過した。この固体を、１Ｎ ＮａＯＨ、水、及びヘプタンを用いて洗浄した。生成物をジオキサン：水から再結晶化させ、次いでアセトニトリルから再度再結晶化させ、９５０ｍｇの３−メチルオキセタン−３−イル４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートを得た。^１Ｈ ＮＭＲ（７００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ_６）δ１．６７（ｓ，３Ｈ）、３．５２（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）、３．５８（ｂｒ．ｓ．，２Ｈ）、３．８０（ｂｒ．ｓ．，４Ｈ）、４．０１（ｓ，３Ｈ）、４．４３（ｄ，Ｊ＝７．０６Ｈｚ，２Ｈ）、４．６７（ｄ，Ｊ＝７．０６Ｈｚ，２Ｈ）、６．８４（ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ，１Ｈ）、７．０９（ｄｄ，Ｊ＝７．３４、４．８６Ｈｚ，１Ｈ）、７．９９（ｄ，Ｊ＝３．４３Ｈｚ，１Ｈ）、８．５２（ｓ，１Ｈ）、８．７７（ｄ，Ｊ＝７．８２Ｈｚ，１Ｈ）、８．８２（ｄ，Ｊ＝７．９１Ｈｚ，１Ｈ）。ＬＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ４２５［（Ｍ＋Ｈ）］^＋，Ｃ_２１Ｈ_２４Ｎ_６Ｏ_４の実測値：４２４．４６。

５．５．３． Ｐ８１フィルタープレートアッセイ
化合物を、最大化合物濃度が９６μＭとなるようにＭｕｔｉｐｒｏｂｅ（PerkinElmer）及びＢｉｏｍｅｋ ＦＸ（Beckman Coulter）を用いてＬａｂｃｙｔｅ ＬＤＶプレート（Labcyte、カタログ番号ＬＰ−０２００）へと段階希釈させた。次いで化合物を、ＥＣＨＯ ５５０ Ｌｉｑｕｉｄ Ｈａｎｄｌｅｒ（Labcyte）を用いてＧｒｅｉｎｅｒ ３８４ウェル反応プレート（Greiner、番号７８１０７６）に分注した（pinged）（１ウェル当たり７５ｎＬ）。その後、合計１２μｌの反応バッファー（Molecular Devices製のＴｗｅｅｎとＤＴＴとを含有するＩＭＡＰバッファー）を陰性対照用のカラム１及びカラム１３の各ウェルに添加して、１２μｌの２×ＡＡＫ１（０．２ｎＭの完全長ヒトタンパク質、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５７２６．２）を残りのウェルに添加した。次に酵素を化合物と室温で１０分間プレインキュベートした。反応は、２×Ｍｕ２（０．２μＭ、完全長ヒトタンパク質）、２×低温ＡＴＰ（２μＭ）、及び１．３μＣｉの高温^３３Ｐ−ＡＴＰを含有する１２μｌの基質ミックスをＭｉｎｉｔｒａｋ（PerkinElmer）によって添加することで開始した。反応は室温で１時間進行させた。一方で、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ３８４ウェルＰ８１フィルタープレート（Millipore、カタログ番号ＭＺＰＨＮ０Ｗ１０）をプレートウォッシャー（plate washer）（Ｚｏｏｍ ＺＷ、Titertek製）に載せ、５０μｌの１％リン酸で予め湿潤させた。次いでキナーゼ反応は２４μｌの２％リン酸を各ウェルに添加することで停止した後、Ｍｉｎｉｔｒａｋを使用して、４０μｌを各ウェルから予め湿潤させたＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ３８４ウェルＰ８１フィルタープレートに移した。反応混合液をＰ８１プレートにおいて室温で１０分間インキュベートし、その後Ｚｏｏｍフィルターウォッシャー（filter washer）を用いて１００μｌ／ウェルの１％リン酸で５回洗浄した。各フィルタープレートの下部に封をした後、各ウェルに２０μｌのＭｉｃｒｏｓｃｉｎｔ ４０を添加して、プレートの上部にＦｌａｓｈｐｌａｔｅカバーで封をした後、ＴｏｐＣｏｕｎｔ（PerkinElmer）による読み取りまで１時間置いた。

５．５．４． ＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイ
ＨＥＫ２９３Ｆ細胞をＤＭＥＭ（Gibco、カタログ番号１１９６５）、１０％ ＦＢＳ（SAFC Biosciences、カタログ番号１２１０３Ｃ）、１×ＧＰＳ（グルタミン、ペニシリン及びストレプトマイシン）を含む培地中で培養した。細胞がトランスフェクション時に約８０％コンフルエントとなるように、１日目に細胞を１０ｃｍ径の皿の上でプレーティングした。およそ１２００万の細胞がトランスフェクション時の１０ｃｍ径の皿に存在していた。２日目、各皿を４８ｕｇのＤＮＡ及び１４４ｕｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（Invitrogen、カタログ番号１１６６８−０１９）でトランスフェクトした。ＤＮＡは、３ｕｇのＡＡＫ１／ＨＡ／ｐＩＲＥＳ（完全長ヒト、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＰ＿０５５７２６．２）、４５μｇのＦｌａｇ／ＡＰ２ＭＩ／ｐｃＤＮＡ（完全長ヒト）、及び１．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを含む混合液（１０ｃｍ径の皿１つ当たり）で構成されていた。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００は、１４４μｌのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００及び１．５ｍｌのＯＰＴＩ−ＭＥＭを含む混合液（１０ｃｍ径の皿１つ当たり）で構成されていた。各混合液を個々の１５ｍｌ容のチューブに移し、室温で５分間インキュベートした後、２つの混合液を混和して、室温で２０分間インキュベートした。次いで成長培地を各１０ｃｍ径のプレートから吸引して、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％ ＦＢＳ（ＧＰＳなし）と交換した。最後に、３ｍｌのＤＮＡ／Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅミックスを各１０ｃｍ径の皿に添加し、穏やかに混合した後、プレートを３７℃、５％ ＣＯ_２で一晩、インキュベートした。

３日目、化合物を１０００倍の最終濃度で１００％ ＤＭＳＯで希釈した後、合計５つの試験濃度となるように３倍の段階希釈を行った。１０ｃｍ径の皿１つ当たり４つの化合物を試験した。次いで１ｕｌの各化合物希釈液をディープウェルの９６ウェルプレートへとピペッティングした後、各化合物が２倍の最終濃度となるように５００μｌのＤＭＥＭ＋０．５％ ＦＢＳを各ウェルに添加した。細胞を１０ｃｍ径の皿において単純なピペッティングによって再懸濁させ（この時点でＨＥＫ２９３細胞がプレートから容易に剥がれ落ちる）、次いで５０ｍｌ容の円錐チューブに移し、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によってペレット化した。次いで細胞ペレットを１０ｃｍ径の皿１つ当たり２．７５ｍｌのＤＭＥＭ＋０．５％ ＦＢＳで再懸濁させ、１００μｌの細胞懸濁液を９６ウェルＴＣプレートの各ウェルに移した。次いで最後に、ＤＭＥＭ＋０．５％ ＦＢＳで希釈した１００μｌの２×化合物を１倍の最終濃度となるように細胞懸濁液の入ったウェルに添加した。その後プレートを３７℃及び５％ ＣＯ_２で３時間インキュベートした後、細胞懸濁液を各ウェルから１２チューブＰＣＲストリップへと移した。ＰＣＲストリップをチップラック内において１０００ｒｐｍで５分間スピンさせ、細胞をペレット化した後、培地をピペッティングによって細胞ペレットを破壊することなく取り除いた。

ウェスタンブロット分析の準備のために、細胞ペレットを４０ｕｌの１×ＬＤＳ−ＰＡＧＥサンプルバッファー（Invitrogen、カタログ番号ＮＰ０００８）＋２×Ｈａｌｔホスファターゼ及びプロテアーゼ阻害剤カクテル（Thermo Scientific、カタログ番号１８６１２８４）で再懸濁させた後、それぞれを５に設定されたマイクロチップソニケーターを用いて８秒〜１０秒超音波処理した。５ｕｌの１０×ＮｕＰａｇｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｒｅｄｕｃｉｎｇ Ａｇｅｎｔ（５０ｍＭ ＤＴＴを含む）を各サンプルに添加した後、ＰＣＲ機器において７０℃で１０分間熱変性させた。ホスホ−ｍｕ２ブロットについては、１サンプル当たり合計１０μｌを４％〜２０％ Ｔｒｉｓ−Ｇｌｙｃｉｎｅ Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ ２６ウェルゲル（Biorad、カタログ番号３４５−００３４）の各レーンに、及びｍｕ２ブロットについては１レーン当たり１０μｌを４％〜１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ（＋ＭＥＳバッファー）ＮｕＰＡＧＥ ２６ウェルゲル（Invitrogen、カタログ番号ＷＧ１４０３ＢＸ１０）に充填した。対照については、２ｎｇのホスホ−ｍｕ２又は２０ｎｇのｍｕ２／Ｆｌａｇタンパク質を各ゲルの最後のウェルに充填した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、各ゲル上のサンプルを、ｉＢｌｏｔを用いてＰＶＤＦ膜へと移し、膜はＴＢＳＴ＋５％ミルクで１時間ブロッキングした後、５分間〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄した。Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲルを、ＴＢＳＴ＋５％ ＢＳＡ中のウサギ抗ホスホ−ｍｕ２（１：５０００、New England Peptideにより作製され、Lexiconでアフィニティー精製されたウサギポリクローナル抗体）を用いてプローブした一方で、ＮｕＰＡＧＥゲルは、ＴＢＳＴ＋５％ミルク中のマウス抗Ｆｌａｇ（１：５００、Sigma、カタログ番号Ｆ１８０４）を用いてプローブして、これらの一次抗体はロッカーにおいて４℃で一晩インキュベートした。

４日目、ウェスタンブロット膜を５分間〜１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄して、ＴＢＳＴ＋５％ミルク中の抗ウサギ−ＨＲＰ（１：２０００、BioRad、カタログ番号１７０−６５１５）又は抗マウス−ＨＲＰ（１：２０００、Biorad、カタログ番号１７０−６５１６）を用いて室温で１時間プローブして、１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄して、ＶｅｒｓａｄｏｃにおいてＥＣＬ試薬（GE Healthcare、カタログ番号ＲＰＮ２１３２）を用いて発光させた（developed）。最後に、１０分間３０秒毎に撮影するようにカメラを設定して、各ブロットについて飽和シグナルのない最良の画像を保存した（シグナルが飽和すると、バンドが赤色に強調表示される）。各バンドの容量分析を行い、密度値を得た。各サンプルについてのパーセント阻害を、初めに総Ｍｕ２発現レベルに正規化した後、０％対照及び１００％対照と比較することによって算出した。次いでＩＣ_５０値を、エクセルのフィッティングソフトウェアを用いて算出した。

５．５．５． ｉｎ ｖｉｔｒｏデータ
上記の方法を用いて、３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートのｉｎ ｖｉｔｒｏデータを得た。Ｐ８１アッセイにおいて、化合物を０．９ｎＭ測定した。ＨＥＫ２８１細胞ベースアッセイにおいて、化合物を４．７ｎＭ測定した。

５．５．６． ホルマリンアッセイ
自動侵害受容分析器（サンディエゴ、カルフォルニア大学、オザキ研究室から購入）を用いてマウスの侵害受容を試験した。試験の３０分前にスーパーグルーを用いて各マウスの左後脚周囲に金属帯を取り付けた。３０分の順応期間後、２０μｌの５％ホルマリンを左後脚の背側表面に皮下注射した。マウスを個別に円筒状のチャンバーにて４５分間収容した。新しい５％ホルマリン溶液は、蒸留水を用いてホルムアルデヒド（Ｆｏｒｍａｌｄｅ−ｆｒｅｓｈ２０％、Fisher Scientific、ニュージャージ州、フェアローン）を希釈することによって調製された。被験化合物をホルマリン注射の３０分前に投与した。

電磁場を介した、１分間当たりのフリンチ回数、第Ｉ相（急性相＝最初の８分間）の総フリンチ回数、及び第ＩＩ相（２０分〜４０分間の持続性相）の総フリンチ回数をコンピュータソフトウェアに記録した。Yaksh TL, Ozaki G, McCumber D, Rathbun M, Svensson C, Malkmus S, Yaksh MC. An automated flinch detecting system for use in the formalin nociceptive bioassay. J Appl Physiol., 2001; 90:2386-402を参照されたい。

図３は、雄のＣ５７マウスにおいてビヒクルと比較した、１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、及び３０ｍｐｋの用量の３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートにおいて得られた第１相のデータを示す。

図４は、雄のＣ５７マウスにおいてビヒクルと比較した、１ｍｐｋ、３ｍｐｋ、１０ｍｐｋ、及び３０ｍｐｋの用量の本化合物において得られた第２相のデータを示し、この場合、用いた統計は一元配置ＡＮＯＶＡのＰ＜０．０１の用量効果、事後比較のダネット検定：ビヒクルに対して＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１である。本化合物の劇的な効果は図５に記載のデータの棒グラフにおいて容易に明らかである。

５．５．７． マウスChungアッセイ
Chungアッセイにおいて、本化合物の３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートを検討した。Chaplan SR, Bach FW, Pogrel JW, Chung JM, Yaksh TL., Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw, J Neurosci Methods 1994;53:55-63; Chung JM, Kim HK, Chung K., Segmental spinal nerve ligation model of neuropathic pain, Methods Mol Med. 2004;99:35-45を参照されたい。

従来のChungプロトコルによって脊髄神経を結紮したときの雄の野生型ハイブリッド（Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｙｒ^{ｃ−Ｂｒｄ}×１２９Ｓ５／ＳｖＥｖＢｒｄ）マウスは５週齢〜７週齢であった。脊髄神経結紮は、Kim及びChungによって考案された手法に変更を加えたものに従って行われた。つまり、マウスにイソフルラン（１ｍｌ／分の酸素流速にて２％）を用いて麻酔した。皮膚切開（１ｃｍ）は、切開の中点として腸骨稜の位置を用いて背側正中線の左１ｍｍに行われた。傍脊柱筋を腸骨稜の内側にて鈍的に分離し、Ｌ４の尾側末端とＬ６（又はＬＶが５つしかないマウスにおいては仙腸骨接合部）の吻側末端との間の横突起を確認した。このアプローチにより脊髄神経Ｌ４、Ｌ５、及び／又はＬ６の識別が容易となった。ハイブリッドマウスを用いた初期の実験では、ラット及びマウスのＳＮＬモデルにおいてこれまでに記載されているように、Ｌ６を見つける目印として仙腸骨接合部を用いて脊髄神経Ｌ５及びＬ６の推定位置を決定した。Ｃ５７マウスを用いた化合物試験の実験において、腸骨稜に関連する下方の２つの腰部の横突起の位置を用いて、５つのＬＶを有するマウスと６つのＬＶを有するマウスとを区別した。これらの骨の目印を用いて、大部分の例において一匹のマウスが保有するＬＶの数を正確に同定した。Ｌ４脊髄神経及びＬ５脊髄神経の同定は、横突起に関連した位置に従ってだけでなく、神経の肉眼的観察：術野においてＬ３脊髄神経及びＬ４脊髄神経のみが互いに接合するが、Ｌ５は単独のままであることによっても行われた。左側Ｌ４脊髄神経及び／又はＬ５脊髄神経を単離し、７−０シルク縫合糸を用いてきつく結紮した。Ｌ４を結紮するため、Ｌ４をＬ３から分離し、ガラスのフックを用いてＬ４の下に縫合糸を引き出した。Ｌ５の結紮は、１組の微細鉗子を用いてＬ５の下に縫合糸を通し、別の微細鉗子を用いて一方に縫合糸を引き出すことによって行われた。Ｌ３及びＬ４がＬ５横突起の下で癒着している非常に稀な場合では、Ｌ４結紮をＬ５横突起の吻側末端に近位の位置にて行うことができる。それゆえ、横突起の摘出は必要としなかった。偽手術を行った動物において、外科手術の手法は、脊髄神経を結紮しなかったことを除いて上記のものと同一であった。マウスの第４のコホートにおいて行われた脊髄神経離断において、Ｌ４脊髄神経又はＬ５脊髄神経を結紮糸が正常に位置している位置と同じ位置にて微細顕微鏡手術ハサミを用いて横に切断した。止血を確認後、切開部の２層を腰背筋膜用の５−０ｖｉｃｒｙｌ縫合糸及び皮膚用創傷クリップを用いて閉じた。外科手術直後に、マウスに生理食塩水（１ｍｌ）及びブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ〜０．１ｍｇ／ｋｇマウス）を注射し、術後およそ１２時間及び２４時間に再度ブプレノルフィンを注射し（合計３用量）、手術により誘発される疼痛を緩和させた。外科手術中、動物の正常体温を維持するため、加温パッド及び加熱ランプを使用した。施術後、マウスを個別に飼育し、麻酔から完全に回復するまでモニタリングを行った。

ｖｏｎ Ｆｒｅｙ式接触性アロディニアは、Chaplanらにより記載された上下法においてｖｏｎ Ｆｒｅｙ式フィラメント一式（およそ０．０４ｇｍ、０．０７ｇｍ、０．１６ｇｍ、０．４ｇｍ、１ｇｍ、及び２ｇｍの力に対応する２．４４番、２．８３番、３．２２番、３．６１番、４．０８番、及び４．３１番、Stoelting Co.、イリノイ州、ウッドデール）に対する後脚引込め反応（引込め（withdrawal）、フリンチング、肢舐め）を試験することによって評価した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験のベースラインとして手術前に試験を行い、実験計画に応じて術後週に１回を３週間〜６週間繰り返した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験において、マウスを１／４インチのワイヤメッシュの床の、透明なポリエチレンテレフタレート製の円筒（高さ１０インチ／径４．２５インチ）に入れ、実験者にマウスの足底面にｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを負荷させた。両脚を試験した。１回目のｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントの負荷は３．６１であった。反応を誘起しなかった場合、その上の硬いフィラメントを与えた。反応があった場合、その下の柔らかいフィラメントを与えた。ｖｏｎ Ｆｒｅｙフィラメントを合計６回与えた（動物が最も硬いフィラメントである４．３１に反応しなかった場合、試験を終了した）。上下法を用いて５０％引込め閾値を各肢に対して算出した。ベースライン試験中にいずれかの肢において２より低い５０％引込め閾値を示したマウスは、手術及び更なる評価から除外した。ｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験の実験では常に手術及び処置の内容は伏せられた。

予備的な自発運動を少なくするために、マウスを試験チャンバーに、術前のベースライン試験前日に６０分間及び化合物を与えるｖｏｎ Ｆｒｅｙ試験前に３０分間馴化させた。実験中試験室ではホワイトノイズが存在した。

図６に示されるように、化合物の３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレートは、Chungアッセイにおいて用量依存的に、有意に大きな効果を示した。全体、ＲＭ ＡＮＯＶＡではＰ＜０．０００１；事後比較のダネット検定：ビヒクルに対して＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。

上記に挙げられた全ての公報（例えば特許及び特許出願）はその全体が、引用することにより本明細書の一部をなす。

Claims (10)

1. ３−メチルオキセタン−３−イル−４−（３−（２−メトキシピリジン−３−イル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−５−イル）ピペラジン−１−カルボキシレート：
   

   

   である化合物又はその薬学的に許容可能な塩。
2. 結晶である、請求項１に記載の化合物。
3. 融点が約１８２．５℃である、請求項２に記載の化合物。
4. 約１２．７度、１４．８度、１８．７度、１９．０度、１９．７度、及び／又は２５．１度の２θにピークのある粉末Ｘ線回折パターンを有する、請求項２に記載の結晶性化合物。
5. アダプター関連キナーゼ１（ＡＡＫ１）と請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物とを接触させることを含む、ＡＡＫ１活性を阻害する方法。
6. 請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物と薬学的に許容可能な賦形剤又は希釈剤とを含む医薬組成物。
7. ＡＡＫ１活性によって媒介される疾患又は障害を治療又は管理する方法であって、それを必要とする患者に治療的に有効な量の請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物又は請求項６に記載の医薬組成物を投与することを含む、方法。
8. 前記疾患又は障害が、アルツハイマー病、双極性障害、疼痛、パーキンソン病又は統合失調症である、請求項７に記載の方法。
9. 前記疼痛が神経因性疼痛である、請求項８に記載の方法。
10. 前記神経因性疼痛が、線維筋痛症又は末梢神経障害（例えば糖尿病性神経障害）である、請求項９に記載の方法。

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