CN106103447B - 连接物关联激酶1的抑制剂、包含其的组合物、及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本文公开了连接物关联激酶1(AAK1)抑制剂4‑(3‑(2‑甲氧基吡啶‑3‑基)吡唑并[1,5‑a]嘧啶‑5‑基)哌嗪‑1‑甲酸3‑甲基氧杂环丁烷‑3‑基酯及其可药用盐和固体形式。本文也公开了用于治疗、管理和/或预防由AAK1活性介导的疾病和病症的包含所述化合物的组合物和它们的使用方法。

Description

连接物关联激酶1的抑制剂、包含其的组合物、及其使用方法
技术领域
本发明涉及适用作连接物关联激酶1(AAK1)的抑制剂的基于吡唑并[1,5-a]嘧啶的化合物、包含它们的组合物和它们的使用方法。
背景技术
连接物关联激酶1(AAK1)是丝氨酸/苏氨酸激酶的Ark1/Prk1家族的成员。AAK1mRNA以称为短形式和长形式的两种剪接形式存在。长形式占优势，并且在脑和心脏中高度表达(Henderson和Conner,Mol.Biol.Cell.2007,18,2698-2706)。AAK1富含于突触体制备物中，并且与胞吞结构共同定位在培养的细胞中。AAK1调节网格蛋白包覆性胞吞(clatherin coated endocytosis)，这是一种在突触囊泡再循环和受体介导的胞吞方面重要的过程。AAK1与作为使受体运载物(receptor cargo)连接于网格蛋白包覆物的异四聚体的AP2复合物缔合。网格蛋白与AAK1结合会刺激AAK1激酶活性(Conner等,Traffic 2003,4,885-890；Jackson等,J.Cell.Biol.2003,163,231-236)。AAK1使AP-2的mu-2亚基磷酸化，这促进了mu-2结合于运货受体上的含酪氨酸分选基序(Ricotta等,J.Cell Bio.2002,156,791-795；Conner和Schmid,J.Cell Bio.2002,156,921-929)。Mu2磷酸化不为受体摄取所需，但磷酸化使内化效率增强(Motely等,Mol.Biol.Cell.2006,17,5298-5308)。
AAK1已被鉴定为PC12细胞中神经调节蛋白-1(Neuregulin-1)/ErbB4信号传导的抑制剂。通过RNA干扰介导的基因沉默或用激酶抑制剂K252a(其抑制AAK1激酶活性)处理达成的AAK1表达损失导致神经调节蛋白-1诱导的轴突外生长增强。这些处理导致ErbB4表达增加以及ErbB4积累在质膜中或质膜附近(Kuai等,Chemistry and Biology 2011,18,891-906)。NRG1和ErbB4是推定的精神分裂症易感性基因(Buonanno,Brain Res.Bull.2010,83,122-131)。两种基因中的SNP均已与多种精神分裂症内在表型相关联(Greenwood等,Am.J.Psychiatry 2011,168,930-946)。神经调节蛋白1和ErbB4KO小鼠模型已显示精神分裂症相关形态变化和行为表型(Jaaro-Peled等,Schizophrenia Bulletin 2010,36,301-313；Wen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2010,107,1211-1216)。此外，AAK1基因的内含子中的单核苷酸多态性已与帕金森病(Parkinson’s disease)的发作年龄相关联(Latourelle等,BMC Med.Genet.2009,10,98)。这些结果表明抑制AAK1活性可能在治疗精神分裂症、精神分裂症中的认知缺陷、帕金森病、双极性病症和阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)方面具有效用。
发明概述
本发明涵盖4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯：
及其可药用盐和固体形式(例如结晶形式)。包含所述化合物的药物组合物和剂型也由本发明涵盖。
本发明的一个实施方式涵盖在体外和在体内均抑制连接物关联激酶1(AAK1)的方法，其包括使AAK1与本发明化合物接触。
另一实施方式涵盖治疗和管理由AAK1活性介导的疾病和病症的方法。据信所述疾病和病症的实例包括阿尔茨海默病、双极性病症、疼痛、帕金森病和精神分裂症(包括精神分裂症中的认知缺陷)。
附图说明
本发明的一些方面说明于附图中。
图1显示使用AAK1纯合性(-/-)敲除小鼠和它们的野生型(+/+)同窝仔畜，从福尔马林疼痛模型获得的结果。AAK1纯合性(-/-)敲除小鼠相较于它们的野生型(+/+)同窝仔畜显示急性疼痛响应与紧张性疼痛响应两者均明确降低。
图2提供结晶4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯的X射线衍射谱。使用具有PIXcelMedipix2检测器的PANalyticalX’Pert PRO(Cu Kα辐射)(40mA，45kV；0.0260°2θ步长)获得衍射图。
图3显示相较于媒介物，以1、3、10和30mpk的剂量在雄性C57小鼠中对4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯获得的福尔马林1期数据。
图4显示相较于媒介物，以1、3、10和30mpk的剂量在雄性C57小鼠中对化合物获得的福尔马林2期数据。
图5提供图4中所示的数据的柱状图示。
图6显示化合物在小鼠Chung测定中的剂量依赖性作用。
发明详述
本发明部分地基于发现AAK1敲除小鼠对疼痛展现高度抗性。该发现促使最终导致发现AAK1抑制剂、包含它们的组合物和它们的使用方法的研究。
定义(5.1.)
除非另外指示，否则短语“本发明化合物”、“本公开化合物”等是指本文公开的化合物。
除非另外指示，否则术语“包括”与“包括但不限于”具有相同含义。类似地，术语“诸如”与术语“诸如但不限于”具有相同含义。
除非另外指示，否则术语“管理”涵盖预防在已罹患疾病或病症的患者中指定疾病或病症的复发，和/或延长已罹患疾病或病症的患者保持缓解的时间。所述术语涵盖调节疾病或病症的阈值、发展和/或持续时间，或改变患者对疾病或病症起响应的方式。
除非另外指示，否则化合物的“治疗有效量”是足以在治疗或管理疾病或病状方面提供治疗益处，或足以使一种或多种与疾病或病状相关的症状延迟或减至最小程度的量。化合物的“治疗有效量”意指单独或与其它疗法组合的治疗剂的在治疗或管理疾病或病状方面提供治疗益处的量。术语“治疗有效量”可涵盖改进总体疗法，减轻或避免疾病或病状的症状或病因，或增强另一治疗剂的治疗功效的量。
除非另外指示，否则术语“治疗”涵盖在患者罹患指定疾病或病症时所发生的减轻疾病或病症的严重性，或延缓或减缓疾病或病症的进展的作用。
化合物(5.2.)
本发明涵盖4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯：
及其可药用盐。
本发明进一步涵盖4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯的结晶形式。在一个实施方式中，结晶形式具有约182.5℃的熔点，如通过差示扫描量热法所测定。在这个情形下，术语“约”意指±2.0摄氏度。
在一个实施方式中，当使用Cu Kα辐射获得时，化合物的结晶形式提供在约12.7、14.8、18.7、19.0、19.7和/或25.1度2θ中的一个或多个下含有峰的X射线粉末衍射(XRPD)图形。在这个情形下，术语“约”意指±0.2度2θ。如本领域技术人员所充分了解，XRPD图形中各峰的相对强度可视如何制备样品和如何收集数据而变化。为此，这个形式的XRPD图形的一实例提供于图2中。
本发明化合物可以以可分离的不同稳定构象形式存在。归因于围绕不对称单键的旋转受限(例如由于空间位阻或环应变)的扭转不对称性可允许分离不同构象异构体。本公开包括这些化合物的各构象异构体及其混合物。
本发明涵盖本文公开的化合物的同位素异构体，其中化合物内的一个或多个原子的同位素不同于天然或通常存在的那些。作为一般性实例并且不加限制地，氢的同位素包括氘和氚。碳的同位素包括13C和14C。本发明的同位素标记的化合物可通过为本领域技术人员所知的常规技术(例如通过使用适当经同位素标记的试剂而非否则采用的非标记的试剂)来制备。所述化合物可具有多种潜在用途，例如作为测定生物活性时的标准物和试剂。在稳定同位素的情况下，所述化合物可具有用于有利地改进生物学、药理学或药物动力学性质的潜力。
本发明化合物可以以可药用盐形式存在。如本文所用的术语“可药用盐”表示本公开化合物的水或油可溶性或可分散性盐或两性离子形式，其在合理医学判断范围内适用于与患者的组织接触而无过度毒性、刺激、过敏应答或其它问题或并发症，与合理益处/风险比相称，并且有效用于它们的预定用途。盐可在最终分离和纯化化合物期间制备或通过使适合氮原子与适合酸反应来单独制备。代表性酸加成盐包括乙酸盐、己二酸盐、海藻酸盐、柠檬酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐；二葡糖酸盐、二氢溴酸盐、二盐酸盐、二氢碘酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、甲酸盐、延胡索酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙烷磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、间三甲苯磺酸盐、甲烷磺酸盐、亚萘基磺酸盐、烟酸盐、2-萘磺酸盐、草酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、酒石酸盐、三氯乙酸盐、三氟乙酸盐、磷酸盐、谷氨酸盐、碳酸氢盐、对甲苯磺酸盐和十一酸盐。可用于形成可药用加成盐的酸的实例包括无机酸，诸如盐酸、氢溴酸、硫酸和磷酸；以及有机酸，诸如草酸、马来酸、丁二酸和柠檬酸。
碱加成盐可在最终分离和纯化化合物期间，通过使羧基与适合碱(诸如金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐)或与氨或有机伯胺、仲胺或叔胺反应来制备。可药用盐的阳离子包括锂、钠、钾、钙、镁和铝以及无毒季胺阳离子，诸如铵、四甲铵、四乙铵、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、二乙胺、乙胺、三丁胺、吡啶、N,N-二甲基苯胺、N-甲基哌啶、N-甲基吗啉、二环己胺、普鲁卡因、二苯甲胺、N,N-二苯甲基苯乙胺和N,N’-二苯甲基乙二胺。适用于形成碱加成盐的其它代表性有机胺包括乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌啶和哌嗪。
使用方法(5.3.)
本发明的一个实施方式涵盖在体外和在体内均抑制连接物关联激酶1(AAK1)的方法，其包括使AAK1与本发明化合物接触。
另一实施方式涵盖治疗和管理由AAK1活性介导的疾病和病症的方法。由AAK1活性介导的疾病和病症是具有至少一种其严重性或表现受AAK1活性影响的症状的疾病和病症。据信所述疾病和病症的实例包括阿尔茨海默病、双极性病症、疼痛、帕金森病和精神分裂症(包括精神分裂症中的认知缺陷)。特定方法包括将治疗或防治有效量的本发明化合物施用至有需要的患者(人或其它哺乳动物)。
本发明的另一实施方式涵盖一种治疗或管理疾病或病症的方法，其包括将治疗或防治有效量的本发明化合物施用至有需要的患者，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病、双极性病症、疼痛、帕金森病或精神分裂症(包括精神分裂症中的认知缺陷)。特定疼痛类型包括慢性疼痛、急性疼痛和神经病变性疼痛。特定神经病变性疼痛类型包括纤维肌痛和外周神经病变(例如糖尿病性神经病变)。
当用于治疗或管理疾病或病症时，本发明化合物优选地作为包含一种或多种可药用载体、稀释剂或赋形剂的药物组合物的一部分施用。
药物组合物或制剂可以以每个单位剂量含有预定量的活性成分的单位剂型呈现。每天每千克体重约0.01与约250毫克(“mg/kg”)之间，优选地每天每kg体重约0.05与约100mg之间的剂量水平的本公开化合物在用于预防和治疗疾病的单药疗法中是典型的。通常，本公开的药物组合物将被每天施用约1至约5次，或替代地，以连续输液形式施用。所述施用可用作慢性或急性疗法。可与载体物质组合以产生单一剂型的活性成分的量将视所治疗病状、病状的严重性、施用时间、施用途径、采用的化合物的排泄速率、治疗的持续时间、以及患者的年龄、性别、重量和状况而变化。优选单位剂量制剂是含有如上文叙述的每日剂量或亚剂量或其适当分数的活性成分的那些。治疗可以以实质上小于化合物的最优剂量的小剂量启始。此后，以小增量增加剂量直至达到在各情况下的最优效应。一般来说，化合物最合乎需要地在将通常提供有效结果而不导致任何不利或有害副作用的浓度水平下施用。
本发明化合物可与一种或多种额外治疗剂或防治剂组合施用。举例来说，当用于治疗疼痛时，可能的额外药剂包括免疫抑制剂和消炎剂。
适用于本发明的方法和组合物中的免疫抑制剂包括本领域中已知的那些。实例包括氨基蝶呤(aminopterin)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、环孢菌素A(cyclosporin A)、D-青霉胺(D-penicillamine)、金盐、羟氯奎(hydroxychloroquine)、来氟米特(leflunomide)、甲氨蝶呤(methotrexate)、米诺环素(minocycline)、雷帕霉素(rapamycin)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、他克莫司(tacrolimus)(FK506)及其可药用盐。一特定免疫抑制剂是甲氨蝶呤。
额外实例包括抗TNF抗体，诸如阿达木单抗(adalimumab)、聚乙二醇赛妥珠单抗(certolizumab pegol)、依那西普(etanercept)和英夫利昔单抗(infliximab)。其它包括白介素-1阻断剂，诸如阿那白滞素(anakinra)。其它包括抗B细胞(CD20)抗体，诸如利妥昔单抗(rituximab)。其它包括T细胞活化阻断剂，诸如阿巴西普(abatacept)。
额外实例包括单磷酸肌苷脱氢酶抑制剂，诸如霉酚酸吗啉乙酯(mycophenolatemofetil)和霉酚酸(mycophenolic acid)
适用于本发明的方法和组合物中的消炎药物包括本领域中已知的那些。实例包括糖皮质素和NSAID。
糖皮质素的实例包括醛固酮(aldosterone)、倍氯米松(beclometasone)、倍他米松(betamethasone)、可的松(cortisone)、脱氧皮质酮(deoxycorticosterone)、地塞米松(dexamethasone)、氟氢可的松(fludrocortisone)、氢化可的松(hydrocortisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、泼尼松龙(prednisolone)、泼尼松(prednisone)、曲安西龙(triamcinolone)及其可药用盐。
NSAID的实例包括水杨酸物(例如阿司匹林(aspirin)、阿莫西普林(amoxiprin)、贝诺酯(benorilate)、胆碱水杨酸镁(cholinemagnesium salicylate)、二氟尼柳(diflunisal)、菲斯胺(faislamine)、水杨酸甲酯(methyl salicylate)、水杨酸镁、水杨酸水杨酯及其可药用盐)、芳基烷酸(例如双氯芬酸(diclofenac)、乙酰氯芬酸(aceclofenac)、阿西美辛(acemetacin)、溴芬酸(bromfenac)、依托度酸(etodolac)、吲哚美辛(indometacin)、萘普酮(nabumetone)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)及其可药用盐)、芳基丙酸(例如布洛芬(ibuprofen)、卡洛芬(carprofen)、芬布芬(fenbufen)、非诺洛芬(fenoprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、酮洛芬(ketoprofen)、酮咯酸(ketorolac)、氯索洛芬(loxoprofen)、萘普生(naproxen)、奥沙普秦(oxaprozin)、噻洛芬酸(tiaprofenic acid)、舒洛芬(suprofen)及其可药用盐)、芳基邻氨基苯甲酸(例如甲氯灭酸(meclofenamic acid)、甲灭酸(mefenamic acid)及其可药用盐)、吡唑烷衍生物(例如阿扎丙酮(azapropazone)、安乃近(metamizole)、羟保泰松(oxyphenbutazone)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、磺吡酮(sulfinprazone)及其可药用盐)、昔康(oxicam)(例如氯诺昔康(lornoxicam)、美洛昔康(meloxicam)、吡罗昔康(piroxicam)、替诺昔康(tenoxicam)及其可药用盐)、COX-2抑制剂(例如塞来昔布(celecoxib)、依托昔布(etoricoxib)、罗美昔布(lumiracoxib)、帕瑞昔布(parecoxib)、罗非昔布(rofecoxib)、伐地昔布(valdecoxib)及其可药用盐)和磺酰苯胺(sulphonanilide)(例如尼美舒利(nimesulide)及其可药用盐)。
用于治疗疼痛(包括但不限于神经病变性和炎症性疼痛)的其它药剂包括诸如普加巴林(pregabalin)、利多卡因(lidocaine)、度洛西汀(duloxetine)、加巴喷丁(gabapentin)、卡马西平(carbamazepine)、辣椒素(capsaicin)以及其它血清素(serotonin)/去甲肾上腺素(norepinephrine)/多巴胺(dopamine)再摄取抑制剂和鸦片剂(诸如奥施康定(oxycontin)、吗啡(morphine)和可待因(codeine))的药剂。
在治疗由诸如糖尿病、感染(例如带状疱疹或HIV感染)或癌症的已知疾病或病状引起的疼痛时，本发明化合物可与一种或多种针对潜伏疾病或病状的额外治疗剂或防治剂组合施用。举例来说，当用于治疗糖尿病性神经病变时，本发明化合物可与一种或多种抗糖尿病剂、抗高血糖剂、降血脂剂/脂质降低剂、抗肥胖剂、抗高血压剂和食欲抑制剂组合施用。抗糖尿病剂的实例包括双胍(例如二甲双胍(metformin)、苯乙双胍(phenformin))、葡萄糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(acarbose)、米格列醇(miglitol))、胰岛素(包括胰岛素促分泌剂和胰岛素敏化剂)、氯茴苯酸(meglitinide)(例如瑞格列奈(repaglinide))、磺酰脲(例如格列美脲(glimepiride)、格列本脲(glyburide)、格列齐特(gliclazide)、氯磺丙脲(chlorpropamide)和格列甲嗪(glipizide))、双胍/格列本脲组合(例如库鲁泛斯(Glucovance))、噻唑烷二酮(例如曲格列酮(troglitazone)、罗格列酮(rosiglitazone)和匹格列酮(pioglitazone))、PPAR-α激动剂、PPAR-γ激动剂、PPARα/γ双重激动剂、糖原磷酸化酶抑制剂、脂肪酸结合蛋白(aP2)抑制剂、胰高血糖素样肽-1(GLP-1)或其它GLP-1受体激动剂、二肽基肽酶IV(DPP4)抑制剂和钠-葡萄糖共转运体2(SGLT2)抑制剂(例如达格列净(dapagliflozin)、卡格列净(canagliflozin)和LX-4211)。
药物组合物(5.4.)
药物制剂可适合于通过任何适当途径来施用，例如通过口服(包括经颊或舌下)、经直肠、经鼻、经表面(包括经颊、舌下或经皮)、经阴道或胃肠外(包括皮下、皮内、肌肉内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或皮内注射或输注)途径。所述制剂可通过制药领域中已知的任何方法来制备，例如通过使活性成分与载体或赋形剂缔合。口服施用或通过注射施用是优选的。
适合于口服施用的药物制剂可呈现为离散单元，诸如胶囊或片剂；粉剂或颗粒剂；于水性或非水性液体中的溶液或混悬液；可食用泡沫剂或打发剂(whip)；或水包油液体乳液或油包水乳液。
举例来说，对于以片剂或胶囊形式口服施用，可使活性药物组分与口服无毒可药用惰性载体诸如乙醇、甘油、水等组合。粉剂是通过将化合物粉碎成适合精细尺寸，并且与类似粉碎的药物载体诸如可食用碳水化合物(如例如淀粉或甘露糖醇)混合来制备。也可存在调味剂、防腐剂、分散剂和着色剂。
胶囊是通过如上所述制备粉末混合物，以及填充成形的明胶套来制备。助流剂和润滑剂诸如胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙或固体聚乙二醇可在填充操作之前添加至粉末混合物中。崩解剂或增溶剂诸如琼脂、碳酸钙或碳酸钠也可被添加以改进在胶囊被摄取时药剂的可用性。
此外，当需要或必要时，适合粘合剂、润滑剂、崩解剂和着色剂也可并入混合物中。适合粘合剂包括淀粉、明胶、天然糖诸如葡萄糖或β-乳糖、玉米甜味剂、天然和合成胶诸如阿拉伯胶、黄蓍胶或海藻酸钠、羧甲基纤维素、聚乙二醇等。用于这些剂型中的润滑剂包括油酸钠、氯化钠等。崩解剂包括不限于淀粉、甲基纤维素、琼脂、膨润土、黄原胶等。片剂是例如通过制备粉末混合物，粒化或造渣，添加润滑剂和崩解剂，以及压成片剂来配制。粉末混合物是通过将适合粉碎的化合物与如上所述的稀释剂或基质，以及任选地与粘合剂(诸如羧甲基纤维素、海藻酸盐、凝胶或聚乙烯吡咯烷酮)、溶解阻滞剂(诸如石蜡)、再吸收加速剂(诸如季盐)和/或和吸收剂(诸如膨润土、高岭土或磷酸二钙)混合来制备。粉末混合物可通过用粘合剂诸如糖浆、淀粉糊、阿拉伯胶浆(acadia mucilage)或纤维素或聚合物质的溶液湿润，以及迫使通过筛网来粒化。作为粒化的一替代方案，可使粉末混合物穿过压片机，并且所得物是成形不良的渣料，其被碎裂成颗粒。可借助于添加硬脂酸、硬脂酸盐、滑石或矿物油使颗粒润滑以防止粘着于片剂成形模具。接着将润滑的混合物压制成片剂。本公开化合物也可与自由流动的惰性载体组合并直接压制成片剂，而不经受粒化或造渣步骤。可提供透明或不透明的保护性包衣，其由虫胶密封包衣、糖或聚合物质包衣和蜡抛光包衣组成。可将染料添加至这些包衣中以区分不同单位剂量。
诸如溶液、糖浆和酏剂的口服液体可以以剂量单位形式制备以便给定量含有预定量的化合物。糖浆可通过将化合物溶解于经适合调味的水溶液中来制备，而酏剂是通过使用无毒媒介物制备。也可添加增溶剂和乳化剂(诸如乙氧基化异硬脂醇和聚氧化乙烯山梨糖醇醚)、防腐剂、风味添加剂(诸如胡椒薄荷油或天然甜味剂或糖精或其它人工甜味剂)等。
当适当时，可将用于口服施用的剂量单位制剂微囊封。制剂也可如例如通过于聚合物、蜡等中包覆或包埋颗粒物质来制备以延长或维持释放。
本发明化合物可以以脂质体递送系统诸如小单层囊泡、大单层囊泡和多层囊泡形式施用。脂质体可由多种磷脂诸如胆固醇、硬脂胺或磷脂酰胆碱形成。
本发明化合物也可通过使用单克隆抗体作为化合物分子与其偶联的个别载体来递送。也可使化合物与作为可靶向药物载体的可溶性聚合物偶联。所述聚合物可包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羟丙基甲基丙烯酰胺苯酚、聚羟乙基天冬酰胺苯酚或被棕榈酰基残基取代的聚氧化乙烯聚赖氨酸。此外，可使化合物偶联于适用于实现药物的控制释放的一类可生物降解的聚合物，例如聚乳酸、聚ε己内酯、聚羟基丁酸、聚原酸酯、聚缩醛、聚二氢吡喃、聚氰基丙烯酸酯和水凝胶的交联或两亲性嵌段共聚物。
适合于经皮施用的药物制剂可被呈现为意图持续延长时期保持与接受者的表皮亲密接触的离散贴片。举例来说，活性成分可通过离子电渗来从贴片递送，如于Pharmaceutical Research 1986,3(6),318中一般性所述。
适合于经表面施用的药物制剂可被配制成软膏剂、乳膏剂、混悬液、洗剂、粉剂、溶液、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油剂。
适合于经直肠施用的药物制剂可被呈现为栓剂或灌肠剂。
适合于经鼻施用，其中载体是固体的药物制剂包括具有例如在20至500微米的范围内的粒度的粗糙粉末，其以其中采用闻嗅的方式施用，即通过鼻部通道从靠近鼻子固持的具有粉末的容器快速吸入。适于以鼻用喷雾剂或滴鼻剂形式施用，其中载体是液体的制剂包括活性成分的水溶液或油溶液。
适合于通过吸入施用的药物制剂包括精细粒子粉尘剂或雾剂，其可借助于各种类型的计量化剂量加压喷雾器、雾化器或吹入器产生。
适合于经阴道施用的药物制剂可被呈现为阴道栓剂、棉塞、乳膏剂、凝胶剂、糊剂、泡沫剂或喷雾制剂。
适合于胃肠外施用的药物制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、制菌剂和致使制剂与预定接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌混悬液，其可包括混悬剂和增稠剂。制剂可被呈现于单剂量或多剂量容器例如密封安瓿和小瓶中，并且可以以冷冻干燥(冻干)状态储存，仅需要在使用之前即刻添加无菌液体载体例如注射用水。即时注射溶液和混悬液可由无菌粉剂、颗粒剂和片剂制备。
应了解除以上特别提及的成分之外，考虑到所论述的制剂类型，制剂也可包括本领域中常规的其它试剂，例如适于口服施用的制剂可包括调味剂。
实施例(5.5.)
AAK1敲除小鼠(5.5.1.)
通过以下两种方法制备对于AAK1基因的破坏来说是纯合性(-/-)的小鼠；即基因捕获和同源性重组。
基因捕获是一种随机插入诱变方法，其使用编码报道体或可选择标记基因的DNA片段作为诱变原。基因捕获载体已被设计来以允许细胞剪接机构将载体编码的外显子剪接于细胞mRNA的方式整合至内含子或基因中。通常，基因捕获载体含有前置有强力剪接接受体序列，并且不前置有启动子的可选择标记序列。因此，当所述载体整合至基因中时，细胞剪接机构从捕获的基因将外显子剪接于可选择标记序列的5'末端上。通常，所述可选择标记基因仅可在编码基因的载体已整合至内含子中时被表达。随后通过选择可存活于选择性培养的细胞来鉴定所得基因捕获事件。
通过包括将至少一部分遗传工程改造的载体序列插入目标基因中的方法来使胚胎干细胞(来自衍生的鼠类株系A129的Lex-1细胞)突变，将突变的胚胎干细胞显微注射至胚泡中，所述胚泡随后被使用确立的方法引入假妊娠雌性宿主中并养育至分娩。参见例如“Mouse Mutagenesis”,1998,Zambrowicz等,编,Lexicon Press,The Woodlands,TX。随后繁育所得嵌合动物以产生能够种系传递在目标基因中含有工程改造的突变的等位基因的后代。
也通过同源性重组制备AAK1基因被破坏的小鼠。在这个情况下，通过本领域中已知的方法来移除鼠类AAK1基因的第二编码外显子(参见GenBank登记号NM_177762)。参见例如美国专利号5,487,992、5,627,059和5,789,215。
将对于AAK1基因的破坏来说是纯合性(-/-)的小鼠与对于AAK1基因的破坏来说是杂合性(+/-)的小鼠和野生型(+/+)同窝仔畜联合进行研究。在这个分析期间，使用被设计以评估哺乳动物受试者中的主要器官系统的功能的医学诊断程序的集成套件，使小鼠经受医学检查。将纯合性(-/-)“敲除”小鼠与它们的杂合性(+/-)和野生型(+/+)同窝仔畜联合进行研究。通过Southern分析确认AAK1基因的破坏。通过RT-PCR来检测AAK1的鼠类同源物在鼠类脑；脊髓；眼；胸腺；脾；肺；肾；肝；骨骼肌；骨；胃、小肠和结肠；心脏；脂肪；哮喘肺；LPS肝；血液；捆绑的心脏；主动脉树；前列腺；和乳腺(5周处女鼠、成熟处女鼠、12DPC、分娩后3天(泌乳)、断奶后3天(早期退化)和断奶后7天(晚期退化))中的表达。
使用以下在实施例5.5.6中所述的福尔马林爪测试来测试AAK1纯合性(-/-)和它们的野生型(+/+)同窝仔畜以评估它们的急性和紧张性伤害感受性响应。
如图1中所示，使用纯合性(-/-)雌性小鼠(n＝16)、野生型雌性(n＝15)、纯合性(-/-)雄性小鼠(n＝9)和野生型雄性(n＝18)获得1期和2期数据。在所有组中以及在两个期中，AAK1纯合性(-/-)小鼠相比于它们的野生型(+/+)同窝仔畜都展现显著较少的记录到的爪畏缩。
合成4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯(5.5.2.)
部分A.3-溴-5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶。向5-氯吡唑并[1,5-a]嘧啶(30g，195mmol)于乙腈(600mL)中的混合物中添加N-溴丁二酰亚胺(38.3g，215mmol)。在室温下搅拌混合物1小时。滤除固体产物，并且用1N NaOH和水洗涤。在真空中浓缩乙腈滤液和所有洗涤物，并且混悬于1N NaOH中。过滤固体产物，并且用水洗涤。将这个产物与先前固体合并并干燥过夜以获得44.2g 3-溴-5-氯-吡唑并[1,5-a]嘧啶。LRMS(ESI)m/z 232/234[(M+H)]+,对C6H3BrClN3的计算值：232.47。LCMS(M+1,溴样式)＝233。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:6.82(d,1H),8.15(宽单峰,1H),8.58(d,1H)。
部分B.3-溴-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶。向3-溴-5-氯吡唑并(1,5-a)嘧啶(25g，0.107mol)于1,4-二噁烷(500ml)中的溶液中依次添加三乙胺(43g，0.43mol)和哌嗪(28g，0.322mol)。在90℃下搅拌反应混合物4小时。在反应完成之后，将它用乙酸乙酯稀释，并且用水洗涤。水层用乙酸乙酯反萃取。合并的有机层经硫酸钠干燥并蒸发以获得35g粗制3-溴-5-(哌嗪-1-基)吡唑并(1,5-a)嘧啶。产物可从甲醇重结晶，但通常不经进一步纯化即使用。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ2.74-2.81(m,4H),3.55-3.69(m,4H),6.75(d,J＝7.83Hz,1H),7.94(s,1H),8.62(d,J＝7.83Hz,1H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6) ppm 41.25,42.16,77.73,97.78,136.77,144.01,144.18,155.53.LRMS(ESI)m/z 282.0/284.0[(M+H)]+,对C10H12BrN5的计算值：282.14。
部分C.3-(2-甲氧基吡啶-3-基)-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶。将3-溴-5-(哌嗪-1-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶(3.00g，10.64mmol)、(2-甲氧基吡啶-3-基)硼酸(2.44g，15.96mmol)和双(二-叔丁基(4-二甲基氨基苯基)膦)二氯钯(II)(0.23g，0.32mmol)称入200mL圆底烧瓶中。接着添加60mL二噁烷，随后依次添加30mL水和三乙胺(7.40mL，53.19mmol)。加热所得混合物至85℃，在1.5小时之后，反应完成。接着将它在旋转蒸发器上浓缩至干燥。将固体残余物混悬于水中，并且使用HCl调整pH至约2。用EtOAc进行三次萃取以移除杂质。接着使用NaOH调整pH至约8。将混悬液在冰浴中冷却约1小时以增强所需产物的沉淀。过滤固体并干燥以获得2.74g(83％)呈浅黄色固体状的标题化合物。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δppm 2.92-3.07(m,4H),3.72-3.84(m,4H),4.08(s,3H),6.73(d,J＝8.03Hz,1H),7.04(dd,J＝7.53,5.02Hz,1H),7.95(dd,J＝4.89,1.88Hz,1H),8.46(d,J＝8.03Hz,1H),8.53(s,1H),8.89(dd,J＝7.53,1.76Hz,1H)。LRMS(ESI)m/z311.1[(M+H)]+,对C16H18N6O的计算值：310.4。
部分D.(4-硝基苯基)碳酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯。在伴随着氮气进行搅拌下将在500mL圆底烧瓶中的溶解于200mL THF中的3-氧杂环丁酮(7.00g，97.22mol)冷却至-20℃。接着，历经15分钟的时期缓慢添加34.0mL(105.08mmol)甲基溴化镁(3M乙醚溶液)。(反应变得粘稠，并且有点难以搅拌。)移除冷却浴，并且使反应搅拌并升温至室温。在2.5小时之后，冷却反应至0℃，并通过缓慢添加100mL饱和NH4Cl水溶液来淬灭，并且之后添加几滴1N HCl以调整pH至约6。用每份200mL DCM萃取两次。合并的有机层经MgSO4干燥。将它过滤并在不加热下于旋转蒸发器上浓缩。基于质子NMR分析，获得6.19g含有81％的所需产物和19％的THF的油状物。估计反应产率是(5.14克)60％。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ1.58(s,3H),4.49(d,J＝7.28Hz,2H),4.63(d,J＝6.53Hz,2H)。
将溶解于40mL DCM中的4.32g 3-甲基-氧杂环丁烷-3-醇(81％w/w于THF中，39.77mmol)冷却至0℃。添加吡啶，随后历经10分钟的时期以小份形式添加氯甲酸4-硝基苯酯。溶液变得混浊，并且移除冰浴，并在室温下在氮气下使搅拌继续。在1小时之后，获得澄清浅黄色溶液。反应用水淬灭并用DCM萃取两次。合并的有机层用盐水洗涤并经MgSO4干燥，并且浓缩。在使用小体积的DCM下将它装载于330管柱上，并且使它在ISCO上经受分离，仅使用DCM作为溶剂以获得6.2g(61％)所需产物。1H NMR(400MHz,氯仿-d)δ1.86(s,3H),4.57(d,J＝8.03Hz,2H),4.90(d,J＝7.53Hz,2H),7.41(d,J＝6.51Hz,2H),8.31(d,J＝6.42Hz,2H)。
部分E.4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲 基氧杂环丁烷-3-基酯。向甲氧基-吡啶-3-基)-5-哌嗪-1-基-吡唑并[1,5-a]嘧啶(1g，3.22mmol)和(4-硝基苯基)碳酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯(979mg，3.87mmol)于乙腈中的混合物中添加DIEA(2.24mL，12.9mmol)。在室温下搅拌混合物6小时。反应混合物用50mL1NNaOH稀释并过滤。固体用1N NaOH、水和庚烷洗涤。从二噁烷:水重结晶产物，接着从乙腈再次重结晶以提供950mg 4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯。1H NMR(700MHz,DMSO-d6)δ1.67(s,3H),3.52(br.s.,2H),3.58(br.s.,2H),3.80(br.s.,4H),4.01(s,3H),4.43(d,J＝7.06Hz,2H),4.67(d,J＝7.06Hz,2H),6.84(d,J＝7.82Hz,1H),7.09(dd,J＝7.34,4.86Hz,1H),7.99(d,J＝3.43Hz,1H),8.52(s,1H),8.77(d,J＝7.82Hz,1H),8.82(d,J＝7.91Hz,1H)。LRMS(ESI)m/z 425[(M+H)]+,对C21H24N6O4的计算值：424.46。
P81过滤板测定(5.5.3.)
使用Mutiprobe(PerkinElmer)和Biomek FX(Beckman Coulter)将化合物在Labcyte LDV板(Labcyte，目录号LP-0200)中连续稀释以使最高化合物浓度处于96μM。接着使用ECHO 550液体处理器(Labcyte)将化合物声脉冲(每孔75nL)至Greiner 384孔反应板(Greiner，编号781076)中。接着添加总计12μl反应缓冲液(含有吐温(Tween)和DTT的IMAP缓冲液，来自Molecular Devices)至用于阴性对照的第1和13列的各孔中，并且添加12μl2X AAK1(0.2nM全长人蛋白质，NCBI登记号NP_055726.2)至其余孔中。接着使酶与化合物一起在室温下预孵育10分钟。在用Minitrak(PerkinElmer)添加12μl含有2X Mu2(0.2μM，全长人蛋白质)、2x冷ATP(2μM)和1.3μCi热33P-ATP的底物混合物后引发反应。反应在室温下进行1小时。同时，将Millipore 384孔P81过滤板(Millipore，目录号MZPHN0W10)放置在板洗涤器(Zoom ZW，来自Titertek)上，并且用50μl 1％磷酸预湿润。接着在添加24μl 2％磷酸至各孔中后终止激酶反应，并且Minitrak接着用于将40μl从各孔转移至预湿润的Millipore384孔P81过滤板中。使反应混合物在P81板中在室温下孵育10分钟，随后使用Zoom过滤板洗涤器用100μl/孔的1％磷酸洗涤五次。将各过滤板的底部密封，随后添加20μl Microscint40至各孔中，用Flashplate盖密封板的顶部，接着等待1小时直至在TopCount(PerkinElmer)上读取。
基于HEK281细胞的测定(5.5.4.)
在含有DMEM(Gibco，目录号11965)、10％FBS(SAFC Biosciences，目录号12103C)、1X GPS(谷氨酰胺、青霉素和链霉素)的培养基中培养HEK293F细胞。在第1天，将细胞涂铺在10cm培养皿上以使它们在转染时是约80％汇合的。在转染时，10cm培养皿中有约1200万个细胞。在第2天，各培养皿用48ug DNA和144ul转脂胺2000(Lipofectamine 2000)(Invitrogen，目录号11668-019)转染。DNA包含在含有3ug AAK1/HA/pIRES(全长人，NCBI登记号NP_055726.2)、45μg Flag/AP2MI/pcDNA(全长人)和1.5ml OPTI-MEM的混合物(每个10cm培养皿)中。转脂胺2000由含有144μl转脂胺2000和1.5ml OPTI-MEM的混合物(每个10cm培养皿)组成。将各混合物转移至个别15ml管中，并且在室温下孵育5分钟，接着合并两种混合物并在室温下孵育20分钟。接着从各10cm板抽吸生长培养基，并且用10ml DMEM+10％FBS(无GPS)替换。最后，添加3ml DNA/转脂胺混合物至各10cm培养皿中并温和混合，随后将板在37℃和5％CO2下孵育过夜。
在第3天，以1000X最终浓度在100％DMSO中稀释化合物，随后进行3倍连续稀释以获得总计5个测试浓度。每个10cm培养皿测试4种化合物。接着将1ul各化合物稀释液吸移至深孔96孔板中，随后添加500μl DMEM+0.5％FBS至各孔中以获得各化合物的2X最终浓度。通过简单吸移(HEK293细胞此时容易从板脱落)将细胞再混悬于10cm培养皿中，接着转移至50ml锥形管中并通过在1000rpm下离心5分钟来集结。接着将每个10cm培养皿的细胞集结块再混悬于2.75mlDMEM+0.5％FBS中，并且将100μl细胞混悬液转移至96孔TC板的各孔中。最后，接着添加100μl于DMEM+0.5％FBS中稀释的2X化合物至含有细胞混悬液的孔中以获得1X最终浓度。接着将板在37℃和5％CO2下孵育3小时，随后将细胞混悬液从各孔转移至12管PCR条板中。将PCR条板在吸头盒中在1000rpm下旋转5分钟以集结细胞，并且接着在不扰动细胞集结块下通过吸移来移除培养基。
为准备用于Western印迹分析，将细胞集结块再混悬于40ul 1X LDS-PAGE样品缓冲液(Invitrogen，目录号NP0008)+2X Halt磷酸酶和蛋白酶抑制剂混合物(ThermoScientific，目录号1861284)中，随后用设置在5下的microtip超声发生器将各自超声处理8-10秒。向各样品中添加5ul 10X NuPage样品还原剂(具有50mM DTT)，随后在PCR仪上在70℃下热变性10分钟。将每个样品总计10μl装载至4-20％Tris-甘氨酸Criterion 26孔凝胶(Biorad，目录号345-0034)的各泳道中用于磷酸mu2印迹，并且将每个泳道10μl装载至4-12％Bis-Tris(+MES缓冲液)NuPAGE 26孔凝胶(Invitrogen，目录号WG1403BX10)中用于mu2印迹。对于对照，将2ng磷酸mu2或20ng mu2/Flag蛋白装载于各凝胶的末个孔中。在SDS-PAGE之后，利用iBlot将各凝胶上的样品转移至PVDF膜中，并且将膜于TBST+5％奶粉中阻断1小时，随后用TBST洗涤3次，每次5-10分钟。Criterion凝胶用TBST+5％BSA中的兔抗磷酸mu2(1:5000；一种由New England Peptide生产，并且在Lexicon进行亲和纯化的兔多克隆抗体)探测，而NuPAGE凝胶用TBST+5％奶粉中的小鼠抗Flag(1:500；Sigma，目录号F1804)探测，并且使这些一级抗体在摇荡器上在4℃下孵育过夜。
在第4天，Western印迹用TBST洗涤3次，每次5-10分钟，用TBST+5％奶粉中的抗兔HRP(1:2000；BioRad，目录号170-6515)或抗小鼠HRP(1:2000；Biorad，目录号170-6516)在室温下探测1小时，用TBST洗涤3次，每次10分钟，并且在Versadoc上用ECL试剂(GEHealthcare，目录号RPN2132)显色。最后，设置照相机以每30秒持续10分钟拍摄照片，并且保存各印迹的不具有饱和信号的最佳图像(当信号饱和时，条带将突显为红色)。对各条带进行体积分析以获得密度值。通过首先相对于总Mu2表达水平进行标准化，接着与0％和100％对照进行比较来计算各样品的抑制百分比。接着使用Excel拟合软件计算IC50值。
体外数据(5.5.5.)
使用上述方法获得4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯的体外数据。在P81测定中，化合物被测量为0.9nM。在基于HEK281细胞的测定中，化合物被测量为4.7nM。
福尔马林测定(5.5.6.)
用自动化伤害感受分析器(购自University of California,San Diego的Ozaki实验室)测试小鼠的伤害感受。在测试之前30分钟，用超强力胶水将金属带放置在各小鼠的左后爪周围。在30分钟适应时期之后，将20μl 5％福尔马林皮下注射在左后爪的背侧表面中。将小鼠个别地舍饲在圆柱形腔室中 45分钟。通过用蒸馏水稀释甲醛(20％Formalde-fresh，Fisher Scientific,Fair Lawn,NJ)来制备新鲜5％福尔马林溶液。在福尔马林注射之前30分钟施用调查化合物。
通过电磁场，计算机软件记录每分钟畏缩数、I期(急性期＝前8分钟)的总畏缩数和II期(紧张期，在20-40分钟之间)的总畏缩数。参见Yaksh TL,Ozaki G,McCumber D,Rathbun M,Svensson C,Malkmus S,Yaksh MC.An automated flinch detecting systemfor use inthe formalin nociceptive bioassay.J Appl Physiol.,2001；90:2386-402。
图3显示相较于媒介物，以1、3、10和30mpk的剂量在雄性C57小鼠中对4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯获得的1期数据。
图4显示相较于媒介物，以1、3、10和30mpk的剂量在雄性C57小鼠中对化合物获得的2期数据，其中提供的统计资料是单因素ANOVA P<0.01剂量效应，事后邓奈特氏检验(post-hoc Dunnett’s)：相对于媒介物，*P<0.05，**P<0.01。化合物的显著作用在图5中提供的数据柱状图中显而易见。
小鼠Chung测定(5.5.7.)
在Chung测定中研究化合物4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯。参见Chaplan SR,Bach FW,Pogrel JW,ChungJM,Yaksh TL.,Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw,J Neurosci Methods 1994；53:55-63；Chung JM,Kim HK,Chung K.,Segmental spinalnerve ligation model of neuropathic pain,Methods Mol Med.2004；99:35-45。
在通过常规Chung方案进行脊神经结扎时，野生型杂交(C57BL/6J-Tyrc-Brd×129S5/SvEvBrd)雄性小鼠在5-7周龄之间。根据由Kim和Chung设计的程序，在修改下进行脊神经结扎。简要来说，用异氟烷(2％，在1ml/min的氧流速下)使小鼠麻醉。使用髂嵴的水平面作为切口的中点，在背侧中线左侧1mm产生皮肤切口(1cm)。钝性分离髂嵴内侧的脊椎旁肌肉以揭示L4的尾边缘与L6的头边缘之间的横突(或仅具有5个LV的小鼠中的骶髂接合处)。这个方法有助于鉴定脊神经L4、L5和/或L6。在使用杂交小鼠的初始实验中，通过使用骶髂接合处作为用于定位L6的界标来确定脊神经L5和L6的推测位置，如先前在大鼠和小鼠的SNL模型中所述。在使用C57小鼠的化合物测试实验中，最后两个腰椎横突相对于髂嵴的位置用于区分具有5个LV的小鼠与具有6个LV的小鼠。使用这些骨界标，小鼠具有的LV的数目在大多数情况下得以准确鉴定。不仅根据它们相关于横突的位置，而且也通过对神经的以下总体观察结果来进行L4和L5脊神经鉴定：L3和L4脊神经仅在手术区域中彼此接合，而L5保持孤立。分离左侧L4和/或L5脊神经，并且用7-0丝缝合线紧密结扎。为结扎L4，使L4与L3分离，并且玻璃钩用于在L4下部将缝合线拉出。通过用一对精细镊使缝合线在L5下部穿过，以及用另一对精细镊将缝合线从另一侧拉出来对L5进行结扎。在L3和L4于L5横突下部汇合所处的极其罕见情况下，可在邻近于L5横突的头边缘的水平面处进行L4结扎。因此，不需要切除横突。在假手术动物中，手术程序与如上所述的手术程序相同，例外之处是不结扎脊神经。在对第四群组小鼠进行的脊神经横切中，使用精细显微手术剪在将通常放置结扎线所处的相同水平面上横向切割L4或L5脊神经。在确认止血之后，分两层使切口闭合，其中5-0薇乔缝合线(vicryl suture)用于背腰筋膜，并且伤口夹用于皮肤。在手术之后立刻对小鼠给与盐水(1ml)和丁丙诺啡(buprenorphine)(0.05-0.1mg/kg小鼠)注射，并且在手术后约12和24小时再次给与丁丙诺啡(总计3剂)以减轻手术诱发的疼痛。在整个手术期间，加温垫和加热灯用于维持动物的正常体温。在程序之后将小鼠个别地舍饲，并且监测直至从麻醉完全恢复。
通过在如由Chaplan等所述的上-下程序(up-down procedure)中测试对一组vonFrey丝状物(编号2.44、2.83、3.22、3.61、4.08和4.31，近似对应于0.04、0.07、0.16、0.4、1和2克的力，Stoelting Co.Wood Dale,IL)的后爪退缩响应(退缩、畏缩、舔吮)来评估VonFrey触觉异常性疼痛。在手术之前进行基线von Frey测试，并且视实验设计而定在手术之后一周一次持续3至6周进行重复。对于von Frey测试，将小鼠放置在具有1/4”丝网底板的透明聚对苯二甲酸乙二酯圆筒(10”高度/4.25”直径)中以允许实验者将von Frey丝状物施用于小鼠足底表面。测试两个爪。首先施用的von Frey丝状物是3.61。如果未引发响应，那么递呈下一更强丝状物。如果存在响应，那么递呈下一更弱丝状物。存在von Frey丝状物的总计6种递呈物(如果动物不对最强丝状物4.31起响应，那么终止测试)。使用上下法计算各爪的50％退缩阈值。在基线测试期间在任何爪中展现50％退缩阈值低于2的小鼠都从手术和进一步评估排除。Von Frey测试实验者始终不知道手术和治疗的性质。
为减少探究性运动活动，在手术前基线测试前一天使小鼠习惯于测试腔室60分钟，以及在其中给与化合物的von Frey测试之前在腔室中习惯30分钟。在整个实验期间，白噪声都存在于测试室中。
如图6中所示，化合物4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯在Chung测定中展现剂量依赖性显著重大作用。总之，在RM ANOVA中，P<0.0001；事后邓奈特氏检验；相对于媒介物，**P<0.01，***P<0.001。
以上引用的所有出版物(例如专利和专利申请)都以引用的方式整体并入本文。

Claims (11)

1.一种化合物，其是4-(3-(2-甲氧基吡啶-3-基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-5-基)哌嗪-1-甲酸3-甲基氧杂环丁烷-3-基酯：
或其可药用盐。
2.权利要求1的化合物，其是结晶。
3.权利要求2的化合物，其具有约182.5℃的熔点。
4.权利要求2的结晶化合物，其具有在约12.7、14.8、18.7、19.0、19.7和/或25.1度2θ处的峰的X射线粉末衍射图形。
5.权利要求1至4任一项的化合物在制备用于抑制连接物关联激酶1(AAK1)活性的药物中的应用。
6.一种药物组合物，其包含权利要求1至4任一项的化合物和可药用的赋形剂或稀释剂。
7.治疗有效量的权利要求1至4任一项的化合物或权利要求6的药物组合物在制备用于治疗或管理有需要的患者的由AAK1活性介导的疾病或病症的药物中的应用。
8.权利要求7的应用，其中所述疾病或病症是阿尔茨海默病、双极性病症、疼痛、帕金森病或精神分裂症。
9.权利要求8的应用，其中所述疼痛是神经病变性疼痛。
10.权利要求9的应用，其中所述神经病变性疼痛是纤维肌痛或外周神经病变。
11.权利要求10的应用，其中所述外周神经病变是糖尿病性神经病变。
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